TW200302107A

TW200302107A - Combination of an IL-1/18 inhibitor with a TN F inhibitor for the treatment of inflammation

Info

Publication number: TW200302107A
Application number: TW091134617A
Authority: TW
Inventors: Christopher Allen Gabel; Mark Anthony Dombroski
Original assignee: Pfizer Prod Inc
Priority date: 2001-11-30
Filing date: 2002-11-28
Publication date: 2003-08-01
Also published as: MXPA04002565A; US20030143230A1; AU2002341321A1; JP2005510542A; WO2003045400A1; TW200412991A; CA2468706A1; BR0214810A; EP1487457A1

Description

200302107 ⑴ 玖、發明說明 L l兄明應敘明··發明所屬之技術領域、先前技術、内容、實施方式及圖式簡單說明技術領域本备明通常係關於介白素-1 (IL-1)及/或18 (IL-18)抑制劑與月重瘤壞处i因子（TNF)抑制劑的組合。這類組合是有效的醫藥組入你斗、了用來治療炎症’包括風濕性關節炎。先前技術炎症是身體對傷害的防禦反應，像是由機械損傷、感染或抗原刺激所引起的那些。當藉著不適當的刺激，像是自身抗原，誘導炎症時，可以病理學之方式表現炎症反應，以誇大的方式表現，或是在移除有害製劑之後仍持續。在這些條件下，可以慢性地表現炎症。諸如敗血性休克之類的急性炎症疾病，和諸如風濕性關節炎和炎症性腸病之類的k性炎症疾病的調解，已經與IL-1、IL_18和TOF的引致發炎（pro-inflammatory)活性連結在一起。 IL-1、IL-18和TNF是天然存在的物種，通常將其稱為細胞激動素。細胞激動素是細胞外的蛋白質，其修改細胞的行為，特別是那些在緊鄰細胞激動素合成和釋放之處的細胞。 IL-1疋已經發現取有潛力的炎症性細胞激動素之一，並在許多疾病和醫學狀況中’被視為關鍵性的調解者。（雖然不元全疋）由巨°莖細胞/單核細胞系統製造的IL-1，以兩種形式產製’ IL-Ια (IL-la)和IL-Ιβ (IL-Ιβ)，它們早已在炎症反應中’扮演關鍵性的角色（關於回顧’參見C A. DinareU〇, B1〇〇d， 87:2095-2147 (1996)及其中的參考文獻）。兩種蛋白質均被製成 200302107 發明說明續頁 (2) 31 kDal的細胞内前驅物蛋白質，將其切開並分泌，產生具有生物活性的成熟羧基-終端17 kDal片段。在IL-Ιβ的案例中，該切開作用涉及細胞内半胱胺酸蛋白酶，稱為ICE，其為從無活性之前驅物中釋放活性片段所必需的。IL-la的前驅物則是有活性的。 IL-la和IL-Ιβ藉著與在幾乎所有細胞類型上發現的細胞表面受體（IL-lr)結合，而產生作用，並單獨或與其他分泌因子一起誘發一連_的反應。這一連_的反應引起（例如纖維母細胞、T細胞的）增殖、細胞凋零（例如A375黑色素瘤細胞）、細胞激動素誘導（例如TNF、IL-1、IL-8)、受體激活作用（例如E-選擇蛋白（selectin))、類廿碳酸的產製（例如PGE2)，以及降解酵素的分泌（例如膠原酶）。欲達成這件事，IL-1激活諸如NF-κΒ和AP-1之類的轉錄因子。咸相信經由亦已經與細胞緊迫有關之激酶級聯的激活作用，像是緊迫激活的MAP 激酶JNK/SAPK和p38，調節數個作用在標靶細胞上的IL-1活性。已經使用可溶的IL-1受體（IL-lsr)作為治療劑，與IL-1結合並使其失活，像是在美國專利第5,081,228號；5,180,812號； 5,767,064號；和再發證的RE 35,450 ;以及歐洲專利公開案EP 460,846。亦已經發現IL-1家族的第三個成員，其係藉著與IL-1受體結合，而作為IL-la和IL-Ιβ的天然拮抗劑，但不轉導細胞内信號或生物學反應。已經將該蛋白質稱為IL-lm(IL-l受體拮 200302107 (3) 發3启說明續頁 Λ Λ λ 已經在各種專利和公開案中，描述了涉及投予IL-Ira多肽的治療，像是：加拿大專利申請案第2039458號和2039458號’ 美國專利第 5,508,262 號；5,880,096 號；5,861，476 號；5,786,331 號； 5,767,234 號；5,608,035 號；WO 97/28828; WO 99/11292; WO 95/20973 ;WO 97/28828 和 WO 98/24477。許多研究使用IL-lra多肢、可溶性IL-lr(衍生自第1型IL-lr 的細胞内功能部位）、對IL-la或β之抗體，以及這些基因的基因轉殖之基因剔除者，已經確定地顯示IL-1家族在許多病理生理學上，扮演著關鍵性的角色（關於回顧，參見C.A· Dinarello，Blood 87:2095_2147 (1996)。例如，已經顯示 IL-lra 多肽在敗血性休克、風濕性關節炎、移植物對宿主的疾病、坪發、心臟局部缺血的動物模式中是有效的，且目前在進行這些適應症的臨床試驗。參見Ohlsson等人，1990，”介白素-1 受體拮抗劑降低了來自内毒素休克的死亡率（Interleukin-1 receptor antagonist reduced mortality from endotoxin shock)M，Nature 348:550-551 ;Aium等人，1991，”介白素-1受體拮抗劑在革蘭氏-陽性敗血性休克的兔子模式中，阻斷了低血壓（Interleukin-1 receptor antagonist blocks hypotension in rabbit model of gram·positive septic shock)’’， Cytokine 4:498 ; Fischer等人，1991，n在靈長動物中，在投予介白素-Ια和亞致死性内毒素血症之間的比較（A comparison between effects of interleukin- la administration and sublethal endotoxemia in primates)’’，Am· J. Physiol. 261 :R444 ; Waage 和 Espevik，1988，n 在老鼠中，介白素-1 增強了腫瘤壞死因子/惡病質素（cachectin)的致死影響 (Interleukin-1 potentiates the lethal effect of tumor necrosis factor/cachectin in 200302107 發明說明續頁 (4) mice)’，，J· Exp· Med· 1678:1987; Fischer等人，”介白素-1 受體的阻斷作用，改善了大腸桿菌敗血性休克的存活和血液動力之效率... (Interleukin-1 Receptor Blockade Improves Survival and Hemodynamic Performance in E. coli Septic Shock...),f, J. Clin. Invest. 89:1551-1557 ； Granowitz ψ 人，1992，”人類重組的介白素-1受體拮抗劑，在健康人類中的藥物動力學、安全性、免疫調節影響（Pharmacokinetics, Safety,

Immunomodulatory Effects of Human Recombinant Interleukin-1 Receptor Antagonist in Healthy Humans)’’，Cytokine 4(5):353-360 ; Bloedow 等人，1992 ，’’在健康的志願者中，介白素-1受體拮抗劑的靜脈内配置(Intravenous Disposition of Interleukin-1 Receptor Antagonist in Healthy Volunteers)丨’，Amer_ Soc. Clin· Pharm. and Therapeutics，Orlando, Florida(摘要）。此外，IL-la和β已經顯示作為造血幹細胞刺激劑，以及作為放射性-和化學保護劑的某些潛力。

人類介白素-18 (IL-18)為最近已經確認出的介白素家族之其他成員。IL-18是以無活性的193個胺基酸前驅物蛋白質之形式合成的細胞激動素（Ushio等人，J. Immunol. 15 6:4274，1996) 。藉著例如卡斯蛋白酶（caspase)-l或卡斯蛋白酶-4切開該前驅物蛋白質，釋放156個胺基酸的成熟蛋白質（Gu等人， Science 275:206，1997 ; Ghayur 等人，Nature 386:619, 1997)，其顯示出包括共同刺激T細胞增殖、提高NK細胞細胞毒性、藉著T 細胞和NK細胞誘導IFN-γ產製，以及增強T協助者第1型（Th 1) 分化的生物活性（Okamura等人，Nature 378:88, 1995 ; Ushio等人， J. Immunol· 156:4274，1996; Micallef 等人，Eur. J. Immunol. 26:1647, 1996 ;Kohno 等人 ’ J· Immunol. 158:1541, 1997 ; Zhang 等人，Infect. Immunol. 200302107 發明^明續頁 (5) 65:3594，1997 ; Robinson 等人，Immunol 7:571，1997) 〇此外，IL-18 是人類單核細胞前炎症介體，包括IL-18、腫瘤壞死因子-α和前列腺素Ε2 (PGE2)的有效謗導物（Ushio，S.等人，J. Immunol· 156:4274-4279, 1996 ; Puren，A.J.等人，J. Clin. Invest. 10:711-721，1997)。

最近，亦已經確認先前選殖的IL-1受體-相關蛋白質（IL-1 Rrp)(Pamet等人，J· Biol. Chem. 271:3967，1996)，為 IL-18 受體的亞單元（Kd 二 18nM)(Torigoe 等人，J. Biol. Chem. 272:25737，1997)。IL-18 受體的第二個亞單元，對已經命名為AcPL (輔助類-蛋白質）的IL-1受體輔助蛋白質，顯露出同種性。IL-18誘導NF-κΒ和 JNK的激活作用，需要IL-1 Rrp和AcPL兩者的表現（Bom等人， J. Biol· Chem. 273:29445，1998)。除了 NF-κΒ 和 JNK 之外，IL-18 亦經由IL-1受體-關聯激酶（IRAK)、p561ck (LCK)和促細胞分裂劑-激活之蛋白質激酶（MAPK)來發送信號（Micallef等人，Eur.J· Immunol. 26:1647 ; Matsumoto 等人，Biophys Biochem. Res. Comm. 234:454, 1997; Tsuji-Takayama 等人，Biochem.Biophys. Res. Comm. 237:126,1997)。

Th 1細胞，其產生前炎症細胞激動素，像是IFN-7、IL-2和 TNF-α (Mosmann 等人，J. Immunol. 136:2348, 1986)，已經涉及調節許多自體免疫疾病，包括多發性硬化症（MS)、風濕性關節炎 (RA)、胰島素依賴性糖尿病（IDDM)、炎症性腸病（IBD)和牛皮癬（Mosmann和 Sad, Immunol. Today 17:138，1996)。因此，預期 Thl-促進細胞激動素的结抗劑，像是IL-18，抑制了疾病的發展。可使用IL-18專一的mAbs作為拮抗劑。已經確認出IL-18的許多其他受體、拮抗劑和抗體。此外，亦對這類受體的可溶形式進行調查，判定其抑制IL-18活 -10- 200302107 (6) 發明說明續頁性，並改善任何歸因於IL-18發送信號的炎症及/或自體免疫疾病，達到什麼程度，參見，例如國際專利公開案WO 99/37772。亦已經確認出一系列的二芳基磺醯脲（"DASUs")，其為IL-1 之刺激-結合轉譯後加工的可能抑制劑，以及IL-18的抑制劑。在1997年12月29日申請之PCT申請案WO 98/32733中描述這些化合物並提出申請，在1999年8月16曰以申請案第09/341,782 號進入美國國家階段，將其完整揭示内容以引用的方式併入本文中。因為IL-1和IL-18是炎症的重要介體，且在疾病的動物模式中，抑制其功能提供了治療的減輕（Cominelli, F. 等人，J. Clin. Invest. 86:972-980 (1990) ; Akeson，A丄·等人，J· Biol· Chem. 271:30517-30523 (1996) ; Caron，J.P.等人 Arthritis Rheum. 39:1535-1544(1996) ;Okamura，H.等人 Nature 378:88-91 (1995) ; Rothwell，N.J· Clin. Invest· 100:2648-2652(1997))，瓦解刺激-結合轉譯後加工之過程的製劑，將可用來治療患有由炎症介體支持之病症的人類和動物。這些包括風濕性關節炎、骨關節炎、氣喘、炎症性腸病、潰瘍性結腸炎、神經退化、動脈粥樣硬化和牛皮癬。 TNFs是不同種類的細胞激動素，並由許多細胞-類型產製，包括單核細胞和巨嗟細胞。先前已經描述了至少兩種 TNF’s，尤其是TNFa(TNF-a)和TNFp(TNF-p或淋巴細胞毒素）。在未經刺激的細胞中，TNF-a結合在細胞中。TNF-a轉變酵素（TACE)負責切開與TNF-a結合的細胞。公認TNF-a涉及許多傳染病和自體免疫疾病（W. Friers，FEBS Letters, 285，199 (1991))。此外，已經顯示TNF-a是在敗血症和敗血性休克中所見之 200302107 (7) 發明說明績頁

炎症反應的主要介體（Spooner等人，clinical Immunology and Immunopathology，62 Sll(1992))。有兩種形式的 TNF-α，藉著專一的蛋白水解切開作用，從與蛋白質結合的細胞中，產製相對分子量26,000 (26 kD)之第II型膜蛋白和可溶性的17 kD形式。由細胞釋放TNF-α的可溶性17 kD形式，並與TNF-α的有害影響有關連。該形式的TNF-a亦能夠作用在遠離合成位置的位置上。因此，TACE的抑制劑預防可溶性TNF-a的形成，並預防該可溶性因子的有害影響（參見1998年11月3日發證的美國專利第5,830,742號、1997年1月14曰發證的美國專利第 5,594,106號，以及1997年10月2日發表之國際專利公開案WO 97/35538)。已經證實了可溶性TNF受體（TNFsr)在改善炎症上的效果，參見例如艾坦賽特（etanercept)。在美國專利第5,395,760號、 5,712，155 號、5,945,397 號、5,344,915 號，和再發證的 RE 36/755 中描述了艾坦賽特。已知TNF或TNFr的抗體可用來治療炎症，並包括因福西美 (infliximab)(瑞密塞德 ®(Remicade®))、CDP-870 和艾得理默 (adalimumab) (D2E7)。在美國專利第 5,698，195 號和 5,656,272 號中描述了因福西美。在國際專利公開案WO 97/29131中描述了艾得理默。在歐洲專利公開案120,694、460,167和516,785中描述了產製諸如CDP-870之類的人類化抗體的方法。 1999年8月12日申請，標題為”在骨關節炎的治療中，聚集蛋白聚糖酶（aggrecanase)之選擇性抑制劑（Selective Inhibitors of Aggrecanase in Osteoarthritis Treatment) ’’ 的美國 ^ 時專利申凊案’才疋 -12- 200302107 ⑻ ㈣魏續胃及某些小分子TACE抑制劑，和製備異經辟酸的額外方法。 1999年8月12日申請，標題為nTACE抑制劑（TACE Inhibitors)”的美國非-臨時申請案，提及雜環的異謹肟酸。將上文提及的公開案和中請案，分別完整地以引用的方式併入本文中。

W〇93/21946描述由IL-1或TNF調節之病況的組合治療。該治療使用與30 kDa TNF抑制劑混合的IL-1抑制劑，尤其是IL-lra 。然而，未混合IL-1加工和釋放抑制劑，IL-18抑制劑或TACE 抑制劑。現在已經發現，抑制IL-1/18增殖之製劑與TNF抑制劑（最好是TACE抑制劑）的本發明組合，提供了勝過各別製劑單獨的協同益處。發明内容本發明提供組合物，包括一定含量之IL-1及/或18抑制劑

，與一定含量之腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑混合，其中這兩種成分的含量對於治療炎症是有效的，以及在藥學上可接受的載劑。本發明亦提供治療方法，包括投予這類組合。上文提及之組合物和方法組合的特定具體實施例，是其中將一定含量之IL-1抑制劑與一定含量之腫瘤壞死因子 (TNF)抑制劑混合，其中這兩種成分的含量對於治療炎症是有效的，以及在藥學上可接受之載劑的那些組合。上文提及之組合物和方法組合的其他特定的具體實施例，是其中將一定含量之IL· 18抑制劑與一定含量之腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑混合，其中這兩種成分的含(量對於治療炎症是有效的，以及在藥學上可接受之載劑的那些組合。 -13- 200302107 發明裁明續頁 (9) 上文提及之組合物和方法組合的其他特定的具體實施例，是其中將一定含量之IL-1抑制劑和IL-18抑制劑與一定含量之腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑混合，其中這兩種成分的含量對於治療炎症是有效的，以及在藥學上可接受之載劑的那些組合。

上文提及之組合物和方法组合的其他特定的具體實施例，是其中將一定含量之雙重的IL-1和IL-18抑制劑與一定含量之腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑混合，其中這兩種成分的含量對於治療炎症是有效的，以及在藥學上可接受之載劑的那些組合。上文提及之組合物和方法組合的其他特定的具體實施例，是其中該IL-1抑制劑為IL-lra(最好是安納金雷（anakinra)) 的那些組合。

上文提及之組合物和方法組合的其他特定的具體實施例，是其中該IL-1/18抑制劑選自由IL-1加工和釋放抑制劑所組成之群的那些組合。上文提及之組合物和方法組合的其他特定的具體實施例，是其中該IL-1/18抑制劑為可溶性IL-lr或IL-18r (IL-lsr或 IL-18sr)，或對抗IL-1、IL-lr、IL-18或IL-18r之抗體的那些組合.。 IL-1加工和釋放抑制劑，係選自由ICE之抑制劑、卡斯蛋白酶之抑制劑，以及IL-1轉譯後加工的抑制劑所組成之群。更佳的是，IL-1加工和釋放抑制劑為IL-1轉譯後加工的抑制劑。特佳的是，IL-1轉譯後加工的抑制劑為IL-1刺激-結合轉譯後加工的抑制劑，且更特定而言，為陰離子運送抑 -14- 200302107 蚕明说明續頁 (ίο) 制劑，以及利尿劑，像是屢喚類化合物（thiazides)和依他尼酸 (ethacrynic acid)。特佳的利尿劑為依他尼酸。上文提及之组合物和方法組合的其他特定的具體實施例，是其中該IL-1抑制劑為IL-1加工和釋放抑制劑，選自由 ICE抑制劑、卡斯蛋白酶抑制劑和IL-1轉譯後加工抑制劑所組成之群的那些組合。

上文提及之組合物和方法組合的其他特定的具體實施例，是其中該IL-1抑制劑為ICE抑制劑的那些組合。上文提及之組合物和方法組合的其他特定的具體實施例，是其中該IL-1抑制劑為卡斯蛋白酶抑制劑的那些組合。上文提及之組合物和方法組合的特定具體實施例，是其中該IL-1抑制劑為IL-1轉譯後加工抑制劑的那些組合。上文提及之組合物和方法組合的特定具體實施例，是其中該IL-1抑制劑為選自二芳基磺醯脲之IL-i轉譯後加工抑制劑的那些組合。

IL-1加工和釋放抑制劑，最好是具有低於50 μΜ之IC5G值的那些，更佳的是低於1 μΜ，而最佳的是低於100 riM (以在本· 文中描述的活體外測定之一來判定）。一種特佳的IL-1加工和釋放抑制劑，其在本發明之方法和組合物中是有用的，為二芳基磺醯脲。較佳的二芳基磺醯脲為式I化合物 RX X /r2 . κ ΝΗ ΝΗ 或其在藥學上可接受的鹽，其中R1和R2分別為式II之基 -15- 200302107 發明嫌>芦續買 (11) 團

η 為 0、1、2 或 3 ;

A、Β、D、Ε和G分別為氧、硫、氮或CR5R6，其中R5和R6分別選自⑴氫、（2) (CVC6)烷基，可視需要被一或兩個選自 (C「C6)烷胺基、（CrC6)烷硫基、（CrC6)烷氧基、羥基、氰基、全氟（C「C6)烷基、（C6-C1G)芳基、（CrC9)雜芳基、（C6-C1())芳胺基、（C6-C1())芳硫基、（C6-C1G)芳氧基，其中該芳基可視需要被 (C「C6)烷氧基、（C「C6)醯基、羧基、羥基或鹵素取代；（CrC9) 雜芳胺基、（crc9)雜芳硫基、（crc9)雜芳氧基、（C6-C1G)芳基 (c6-cl())芳基、（c3-c6)環烷基、羥基、六氫吡畊基、（c6-c1())芳基（C「C6)烷氧基、（C5-C9)雜芳基（C「C6)烷氧基、（cvc6)醯胺基、 (C「C6)醯硫基、（CVC6)醯氧基、（crc6)烷基亞磺醯基、（c6-c10) 芳基亞磺醯基、（crc6)烷基磺醯基、（C6-C1Q)芳基磺醯基、胺基、（CrC6)烷胺基或（(C「C6)烷基）2胺基之基團取代；（3)鹵素；（4)氰基；（5)胺基；（6)羥基；（7)全氟（C「C6)烷基； (8)全氟（CrC6)燒氧基；（9) (CrC6)烯基；（10)羧基（CrC6)烯基 ;(11) (CrC6)块基；（12) (CVQ)燒胺基；（13) ((C「C6)燒基）2胺基 ;(14) (CrC6)烷基磺醯胺基；（15) (C「C6)烷基亞磺醯基；（16) (C「C6)烷基磺醯基；（17) 胺基磺醯基；（18) (CrC6)烷胺基磺醯基；（19) ((C「C6)烷基）2胺基磺醯基；（20) (Q-Q)烷硫基；（21) -16- 200302107 發明說明績頁^ (12)

(C「C6V^ 氧基；（22)全氟（CVC6)烷基；（23) (C6-C1())芳基；（24) (C5-C9)雜芳基；（25) (C6-C1())芳胺基；（26) (C6-C1())芳硫基；（27) (C6-C1())芳基（C「C6)烷氧基；（28) (C5-C9)雜芳胺基；（29) (C5_C9)雜芳硫基；（30) (CrC9)雜芳氧基；（31) (CrC6)環烷基；（32) (Q-Q) 烷基（羥基亞甲基）；（33)六氫吡啶基；（34)吡啶基；（35)噻吩基；（36) 呋喃基；（37) (CrC6)烷基六氫吡啶基；（38) (CrC6) 醯胺基；（39) (CVC6)醯硫基；（40) (CrC6)醯氧基；（41) R7(CrC6) 烷基，其中R7為（CVC6)醯基N-六氫吡畊基、（C6-C1G)芳基N-六氫吡畊基、（C5-C9)雜芳基N-六氫吡畊基、（CVC6)烷基N-六氫吡畊基、（C6-C1G)芳基（CrC6)烷基N-六氫吡畊基、（C5-C9)雜芳基 (C「C6)烷基N-六氫吡畊基、嗎啉基、硫代嗎啉基、N-六氫吡口定基、N-说p各症基、六氫p比咬基、（CrC6)燒基六氫p比症基、 (c6-c1G)芳基六氫吡啶基、（c5-c9)雜芳基六氫吡啶基、（crc6) 烷基六氫吡啶基（crc6)烷基、（C6-C1G)芳基六氫吡啶基（crc6) 烷基、（CrC9)雜芳基六氫吡啶基（CrC6)烷基或（CrC6)醯基六氫

17比σ定基； (42) 或式III之基團〇 γ/^Wt——(CH2)S~| 111 其中s為0至6 ; t為0或1 ; X為氧或NR8，其中R8為氫、（CrC6)烷基或（CrC7)環烷基 (C「C6)烷基； Y為氫、羥基、（CrC6)烷基，可視需要被鹵素、羥基或氰 -17- 200302107 (13) 發明說明續頁基取代；（CVQ)烷氧基、氰基、（C2-C6)炔基、（C6-C1G)芳基，其中該芳基基團可視需要被鹵素、羥基、羧基、（CrC6)烷基、 (CrC6)烷氧基、全氟（CrC6)烷基、（Q-Q)烷氧基（CrC6)烷基或 NR9R1G取代；其中R9和r1g分別選自由氫和可視需要被（Cl_C6) 烷基六氫吡啶基、（C6-C1G)芳基六氫吡啶基、（CrC9)雜芳基六氫吡啶基、（C6-C1G)芳基、（CrC9)雜芳基或（CrC6)環烷基取代的 (CVC6)烷基所組成之群；六氫吡啶基、（crc6)烷基六氫吡啶基、（C6-C1())芳基六氫吡啶基、（crc9)雜芳基六氫吡啶基、（crc6) 醯基六氫吡啶基、（c6-c1G)芳基、（crc9)雜芳基、（crc6)環烷基、Rn(CrC6)烷基、（CrC5)烷基（CHRU)(C「C6)烷基，其中 R11 為羥基、（C「C6)醯氧基、（CrC6)烷氧基、N-六氫吡畊基、（CrC6)醯胺基、（C「C6)fe硫基、（C6-C1G)芳硫基、（C「C6)：fe基亞績酿基、 (C6-CiG)芳基亞續酿基、（CrC6)、fe基續酿基、（C6-C1G)芳基績醯基、胺基、（C「C6)烷胺基、（(CVC6)烷基）2胺基、（C「C6)醯基N-六氫吡畊基、（CrC6)烷基N-六氫吡畊基、（C6-Ch))芳基（CrC6) 燒基N-六氫？比P井基、（C5-C9)雜芳基（C「C6)奴基N-六氫< p井基、嗎p林基、硫代嗎σ林基、N-六氫p比咬基或N- p比洛淀基； R12(C「C6)烷基、（C「C5)烷基（CH-R12)(C「C6)烷基，其中 R12 為六氫吡啶基或（CrC6)烧基六氫吡啶基；以及CH(R13)C〇R14，其中R14 如下文之定義’且Rl3為氫、（Crc6)烷基、（C6-C1G)芳基（crc6) 燒基、（C5-C9)雜芳基（C「C6)：fe基、（crc6)燒硫基（crc6)燒基、 (C6-C1G)芳硫基-(C「C6)燒基、（crc6)烷基亞磺SS基（c「c6)烷基、 (C6-C1G)芳基亞續酿基（CrC6)燒基、（Crc6)烷基磺醯基（crc6)烷基、（C6-C1())芳基續醯基（crc6)烷基、羥基（CrC6)烷基、胺基 200302107 發明號明續頁 (14) (CrC6)烷基、（CVC6)烷胺基（c「c6)烷基、（(CVC6)烷胺基 MQ-Q) 烷基、R^R^NCOCCi-Q)烷基或 RbOCOCCVQ)烷基，其中 R15 和 R16 分別選自由氫、（C「C6)烷基、（C6-C1())芳基（CrC6)烷基和（CrC9)-雜芳基（CrC6)烷基所組成之群；且R14為R17〇或R17R18N，其中， R17和R18分別選自由氫、（CrC6)烷基、（C6-C1())芳基（CrC6)烷基和（CrC9)雜芳基（C「C6)烷基所組成之群； (43) 或式IV之基團

R19\ N

\〇R20 1 其中u為0、1或2 ; R19為氫、（C「C6)燒基或全氟（CVC6)垸基； r2G為氫、（crc6)烷基、（CrC6)羧烷基或（C6-C1Q)芳基（C!-C6)烷基； (44) 或式V之基團

其中a為0、1或2 ; b為0或1 ; c為1、2或3 ; d為0或1 ; e為0、1或2 ; 200302107 發明說明續頁 (15) J和L分別為氧或硫； R21為氫、羥基、氟、（CrC6)烷基、（CrC6)烷氧基、鹵素（C「C6) 烷基、胺基、（CrC6)醯胺基或NR26R27，其中R26和R27分別選自 · 由氫、（CrC6)烷基或（C6-C10)芳基所組成之群；且， R22為氫、（CVC6)烷基，其可視需要被羥基、鹵素、（CVC6)

烷硫基、（CrC6)烷基亞磺醯基或（CrC6)烷基磺醯基取代；或在式II中，當η為1且B和D兩者皆為CR5時，這兩個R5 基團可與附接於其上的碳一起形成式VI之基團

VI 其中斷續線代表可選擇的雙鍵； m為0或1 ;且 T、U、V和W分別為氧、硫、CO、氮或CR5R6，其中R5和R6 如同上文之定義；或當A和B兩者皆為CR5時，或當η為1且B和D兩者皆為CR5 時，或當D和Ε兩者皆為CR5時，或當Ε與G兩者皆為CR5時，這兩個R5基團可與附接其上的相鄰碳原子一起形成（CVQ) 環烷基基團，並可視需要被羥基或苯并基團取代。 (上文）式I化合物的具體實施例，需要R2必須是芳香族的。組合物和方法組合的其他具體實施例，是其中該IL-1抑制成分為式I化合物（上文）的組合群，其中式II和式VI的基團被定義為在相鄰的位置，不具有兩個氧、兩個硫或一個 -20- 200302107 (16) 發明說明續頁氧和硫。更佳的是，可用於本發明之方法和組合物中的二芳基磺醯脲，為式I化合物，其中R1為式II之基團

其中斷續線代表可選擇的雙鍵； η為0 ; Α為CR5，其中R5為氫或鹵素；

B和E兩者分別為CR5，其中R5為（1)氫；（2)氰基；（3)鹵素；（4) (CrC6)烷基，可視需要被一或兩個羥基取代；（5) (CrC7) 環烷基胺基磺醯基；（6) (C「C6)烷胺基磺醯基；或（7)式III 之基團

其中s為0 ; t為0 ;且 Y為氫、（crc6)烷基，可視需要被鹵素取代；或（crc6)烷氧基（CVC6)烷基； D缺少； G為氧、硫或CR5，其中R5為氫或鹵素。可用於本發明之方法和組合物中的更佳的二芳基橫醯腸，為式I化合物，其中該R2為式II之基團 200302107 (17) 發明說明續頁

.G % 其中斷續線代表可選擇的雙鍵； η為1 ; Α為CR5，其中R5為鹵素或（CrQ)烷基； B為CR5，其中R5為氫或鹵素； D為CR5，其中R5為氫、鹵素、氰基或式III之基團〇

Y 、(x)r -(CH2)s-| 其中S為0 ; t為Ο ;且 Υ 為 ΝΗ2 ; Ε為CR5，其中R5為氫或鹵素；且 G為CR5，其中R5為鹵素或（CrC6)烷基。芳基績更佳的是，可用於本發明之方法和組合物中的醯脲，為式I化合物，其中R2為式II之基團擇分選 G 可和 E表、代 B 線A 續且斷；Mi 其 Π

鍵CR5 兩中 G 和 E 和 B 和 A 中其成形起 I 碳的 β, 舞相之上其於接附與可〇團團基基 R°基的烷鄰環相-C 個(C5 -22 - 200302107 (18) I释明嶔明、續頁更佳的是，可用於本發明之方法和組合物中的二芳基磺醯脲，為式I化合物，其中R2為下式之基團

可用於本發明之組合物和方法中的特佳二芳基磺醯脲

物種，可選自由下列化合物所組成之群 1-(1，2,3,5,6,7-六氫-s-茚莘-4-基）-3-[4-(1-羥基-1-甲基-乙基）-呋喃-2-磺醯基卜脲； 1-(2,6-二異丙基-苯基）-3-[4-(1-羥基-1-甲基-乙基）-呋喃-2-績S盈基]-踩； 1-(1,2,3,5,6,7-六氫-4-氮雜-5-茚莘-8-基）-3-[4-(1-羥基-1-甲基-乙基）-呋喃-2-磺醯基]-脲； 1-(4-氯-2,6-二異丙基-苯基）-3-[3-(1-羥基-1-甲基-乙基）-苯

續SS：基]-脈； 1- (1，2,3,5,6,7-六氫-s-茚莘-4-基）-3- [4- (1-羥基-1-甲基-乙基）-4吩-2-績醯基]-脲； 1-(4-[1,3]二氧戊環-2-基-呋喃-2-磺醯基）-3-(1,2,3,5,6,7-六氫-s-茚莘-4-基）-脲； 1-(2,6-二異丙基-苯基）-3-[4-(1-羥基-1-甲基-乙基）-4吩-2- 續SS基]-赚； 1-(4-乙醯基吩-2-磺醯基）-3-(1,2,3,5,6,7-六氫-s-茚莘-4-基）-月尿； -23 - 200302107 發明秀明續頁 (19) 1- (1H-苯并咪唑-5-磺醯基）-3- (1，2,3,5,6,7-六氫-s-茚莘-4-基）-蘇； 1-(1，2,3,5,6,7-六氫-5-茚莘-4-基）-3-[4-(1-羥基-1-甲基-乙基）-噻吩-2-磺醯基]-脲； 1-(8-氯-1,2,3,5,6,7-六氫-5-茚莘-4-基）-3-[4-(1-羥基-1-甲基-乙基）-咬喃-2-續SM基]-膽； 1-(4-乙醯基-呋喃-2-磺醯基）-3-(1,2,3,5,6,7-六氫-s-茚莘-4-基）-

月尿； 1-(8-氟-1,2,3,5,6,7-六氫-5-茚莘-4-基）-3-[4-(1-羥基-1-甲基-乙基）_ 17夫喃-2-橫酿基]-脈； 1-(4-氟-2,6-二異丙基-苯基）-3-[3-(1-羥基-1-甲基-乙基）-苯續si基]-赚； 1-(6-氟-1H-苯并咪唑-5-磺醯基）-3-(1，2,3,5,6,7-六氫-s-茚莘-4-基）-脲； 1-(4-氯-2,6-二異丙基-苯基）-3-(1H-吲哚-6-磺醯基）-脲；

1-(4-氯-2,6-二異丙基-苯基）-3-(5-氟-1H-吲哚-6-磺醯基）-脲； 1- [ 1,2,3,5,6,7-六氫-s-茚莘-u-基]-3- (1H- 4 口朵-6-磺醯基）-脲； 1-(5-氟-1H-吲哚-6-磺醯基）-3-(1,2,3,5,6,7-六氫-5-茚莘-4-基）- 月尿； 1-[4-氯-2,6-二異丙基-苯基]-3-[2-氟-5-(2-甲基-(1，3)二氧戊環-2-基）-苯磺醯基]-脲； 3-[3-(4-氯-2,6-二異丙基-苯基）-脲磺醯基]-N-甲基-苯磺醯胺， 1-[2-氟-5-(2-曱基-(1，3)二氧戊環-2-基）苯磺醯基]-3-(1,2,3,5,6,7- -24 · 200302107 發明說明續頁 (20) 六氫-雖革-4-基）-脲； 1-(4-氯-2,6-二異丙基-苯基）-3-[2-氟-5-環氧乙烷基苯磺醯基]-〗尿； 1-(1，2,3,5,6,7-六氫-s-茚等-4-基）-3-[2-氟-5-環氧乙烷基苯磺 S盡基]-脲；和 3-[3-(1，2,3,5,6,7-六氫-s-茚莘-4-基）-脲磺醯基]-N-甲基-苯磺驢胺。

在那些二芳基磺醯脲之中，可用於本發明之組合物的特佳物種為 1-(1，2,3,5,6,7-六氫-5-茚華-4-基）-3-[4-(1-羥基-1-甲基-乙基）-咬喃-2-橫酿基]-踩； 1-(2,6-二異丙基-苯基）-3-[4-(1-羥基-1-甲基-乙基）-呋喃-2- 績醯基]-脲； 4-氯-2,6-二異丙基-苯基-3-[4-(l-羥基-1-甲基-乙基）-呋喃-2- 磺醯基卜脲；

1，2,3,5,6,7-六氫-4-氮雜-s-茚 ¥ - 8-基-3-[4-(l-羥基-1-甲基-乙基）-咬喃-2-績酿基]-膽； 8-氯-1,2,3,5,6,7-六氫-s-茚華-4-基-3- [4- (1-羥基-1-甲基-乙基）-呋喃-2-磺醯基]-脲； 8-氟-1，2,3,5,6,7-六氫-5-茚莘-4-基-3-[4-(1-羥基-1-甲基-乙基）-咬喃-2-績酿基]-膽，和 4-氟-2,6-二異丙基-苯基-3-[4-(l-羥基-1-甲基-乙基）-呋喃-2- 績醯基]-脈。可用於本發明之組合物中的其他種類的IL-1加工和釋放 -25 - 200302107 發明說明續頁 (21) 抑制劑，為ICE抑制劑。特定而言，較佳的ICE抑制劑為選自由美國專利第 5,656,627 號、5,847，135 號、5,756,466 號、5,716,929 號和5,874,424號之ICE抑制劑化合物所組成之群的化合物及其在藥學上可接受的鹽類。可用於本發明之組合物和方法組合中的較佳ICE抑制劑，為偉特克斯（Vertex VX740)(普倫納凱（pralnacasan)，HMR-3480)，在美國專利第5,874,424號中詳細描述了它的合成和活性。

本發明之組合物和方法組合的其他具體實施例是其中該組合的活性成分之一為可溶性TNF受體（TNFsr)，TNF之抗體或TNFr，或TACE抑制劑的組合群。本發明之組合物和方法組合的其他具體實施例是其中該組合的活性成分之一為腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑艾坦賽特的組合群。本發明的其他具體實施例是組合物之群和方法組合，其中該組合的活性成分之一是腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑因

福西美。本發明的其他具體實施例是組合物之群和方法組合，其中該組合的活性成分之一是腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑 CDP-870。本發明的其他具體實施例是組合物之群和方法組合，其中該組合的活性成分之一是腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑艾得理默。本發明的其他具體實施例，是組合物之群和方法組合，其中該組合的活性成分之一是選自由TACE抑制劑所組成 -26- 4 200302107 (22) 發明說明續頁之群的腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑。在1998年11月3日發證之美國專利第5,830,742號，1997年1月14曰發證之5,594,106號，以及1997年10月2日發表之國際專利公開案WO 97/35538中描述了 TACE及其抑制劑。

本發明亦發現混合帶有不同金屬蛋白酶和瑞普溶解素 (reprolysin)活性（最好是TACE抑制活性勝過MMP和聚集蛋白聚糖酶活性）的抑制劑，與抑制介白素-1/18 (IL-1/18)增殖製劑是可能的。一群較佳的組合，包括選擇性抑制TACE優先於 MMP-1的抑制劑。另一群較佳的組合，包括選擇性抑制TACE 和基質金屬蛋白酶-13 (MMP-13)優先於MMIM的抑制劑。另一群較佳的組合，包括選擇性抑制聚集蛋白聚糖酶和TACE 優先於MMP-1的抑制劑。另一群較佳的組合，包括選擇性抑制聚集蛋白聚糖S每、TACE和MMP-13優先於MMP-1的抑制劑。另一群較佳的組合，包括選擇性抑制TACE優先於MMP-1 、聚集蛋白聚糖酶和MMP-13的抑制劑。

本發明的其他具體實施例，是組合物之群和方法組合，其中該組合的活性成分之一是腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑，選自由ADAM-17 (TACE)抑制劑所組成之群，其對TACE之選擇性勝過每種 MMP-1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 和 14 100倍，如同分別在活體外之測定中定義的。本發明的其他具體實施例，是組合物之群和方法組合，其中該組合的活性成分之一為腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑，選自由TACE抑制劑所組成之群，而另一個活性成分為 IL-lra，最好是安納金雷。 -27- 200302107 (23) 發明說明續頁其的的合明組發該本中其例施實體具他之分成性活制組抑法F) 方TN 和群之物合組是合子因死壞瘤歷為劑合組。法群方之和成群組之所物物合生組衍是酸，肟例羥施異實基體醯具磺他基其芳的由明自發選本分成性活，的劑合制組抑該CE 中TA: 其物式芳該中其生下衍有酸具亏勿月 4 羥生異衍基酸醯妨磺羥基異芳基為醯一磺之基

中其鹽的受接可上學藥在其或 X 為氧、硫、SO、S02 或 NR7 ; R1、R2、R3、R4、R5 和 R6 選自由氫、羥基、NH2、-CN、（C「C6) 烷基、（crc6)晞基、（c6-c1())芳基（crc6)烯基、（crc9)雜芳基（crc6) 烯基、（crc6)炔基、（C6-C1G)芳基（crc6)炔基、（crc9)雜芳基（crc6) 炔基、（C「C6)烷胺基、[(C「C6)烷基]2胺基、（CrC6)烷硫基、（crc6) 烷氧基、全氟（c!-c6)烷基、全氟（crc6)烷氧基、（C6-C1G)芳基、 (CrC9)雜芳基、（C6-C1())芳胺基、（C6-C1G)芳硫基、（C6-C|〇)芳氧基、（crc9)雜芳胺基、（crc9)雜芳硫基、（crc9)雜芳氧基、（crc6) 環烷基、（crc6)烷基（羥基亞甲基）、六氫吡啶基、（crc6)烷基六氫吡啶基、（CrC6)醯基、（CrC6)醯胺基、（Ci-C6)醯硫基、（c「c6) 醯氧基、（crc6)烷氧基- (〇〇)-、-C02H、H2N-(C=0)-、（crc6)烷基-NH-(C=〇）-和[(CrC6)烷基]rN-(C=0)-所組成之群；其中該（Ci-CJ烷基可視需要被一或兩個選自下列之基團

-28- 200302107 (24) 說明'續頁取代：（<^-匚6)烷硫基、（CrC6)烷氧基、三氟甲基、鹵素、-CN 、（c6-c1G)芳基、（crc9)雜芳基、（c6-c1())芳胺基、（c6-c1{))芳硫基、（c6-c1())芳氧基、（crc9)雜芳胺基、（CrC9)雜芳硫基、（Crc9) 雜芳氧基、（c6-c1G)芳基（c6-c1G)芳基、（crc6)環烷基、羥基、六氫吡呼基、（c6-c1{))芳基（crc6)烷氧基、（crc9)雜芳基（crc6) 燒氧基、（Ci-C6)醯胺基、（crc6)醯硫基、（c「c6)醯氧基、（c「c6) 燒基亞磺醯基、（C6-C1Q)芳基亞磺醯基、（c「c6)烷基磺醯基、 (Q-CW芳基磺醯基、胺基、（crc6)烷胺基或（(c「c6)烷基）2胺基； R7為氫；可視需要被一或多個下列基團取代的（crc6)烷基 :幾基、-CN、（C「C6)烷胺基、（CrC6)烷硫基、（crC6)烷氧基、全氟（C「c6)烷基、（C6-C1G)芳基、（c6-ClG)芳硫基、（C6-C1())芳氧基、（CrC9)雜芳胺基、（crc6)環烷基、（crc6)烷基（輕基亞甲基）、六氫吡啶基、（CrC6)烷基六氫吡啶、（Crc6)醯基、（crC6)醯胺基、（C「C6)醯氧基、（CrC6)烷氧基-(〇〇卜、-C〇2H、（Q-C6)烷基-NH-(OO)-，和[(C「c6)烷基]rN(c=〇)· ; (C6-ClG)芳基磺醯基； (CrC6)燒基績酸基；（Cl-c6)烷基·ΝΗ·((>〇)-;((VC6)燒氧基- (c=〇)-，（Crc6)烷基- (C=0)^ [(CrC6)烷基]rN-(c=0)-;或（R8R9N)-(C=0) ’其中R8和R9與附接於其上的氮一起，形成選自氮雜環丁烷基、吡咯啶基、六氫吡啶基、嗎啉基和硫代嗎啉基的環； Q 為（CVC1())芳基（crQ)烷氧基（C6_Ci〇)芳基、（CVCiQ)芳基（CVC：6) 烷氧基（CrC9)雜芳基、（Crc9)雜芳基（Ci-C6)烷氧基（(VCiG)芳基、（CrC9)雜芳基（crC6)烷氧基（Crc9)雜芳基，其中每個該（Q-Qo) 方基或（CrC9)雜芳基基團，可視需要分別被一或多個取代基取代’每個環最好有丨至3個取代基，在末端環上的1至3 200302107 (25) 發确Μ明續頁個取代基，最好分別選自由鹵素、-CN、可視需要被1或多個氟原子、羥基、羥基-(CVQ)烷基取代的（CrC6)烷基、可視需要被一或多個氟原子取代的（crc6)烷氧基、（CVC6)烷氧基 (CrC6)烷基、HO-(〇0)-、（CrC6)烷基-0-(〇0)-、HO-(00)-((:/6) 燒基、（Ci-Q)抗基-〇-(C=0)-(Ci-C6)坑基、（Q-C6)淀基- (〇=0)-0-、（Crc6)烷基- (C=0)-0-(Ci-C6)烷基、H(oo)-、HCOCMCVQ)烷基、（C「C6)fe 基（〇=C)-、（CrC6)fe 基（0=C)-(Ci-C6)燒基、N〇2、胺基、（C「C6)烷胺基、[(CVQ)烷基]2胺基、胺基（c「c6)烷基、（CVQ) 烷胺基（crc6)烷基、[(c「c6)烷基]2胺基（Crc6)烷基、h2n-(c=o)-、（C「C6)烷基-NH-(OO)-、[(CrC6)烷基]rN-(C=0)-、H2N(C=0)-(CrC6) 烷基、（CrC6)烷基-HN(C=〇HCrC6)烷基、[(CrC6)烷基]2N-(C=0)-(CVQ)燒基、H(0=C)-NH-、（CVQ)^ 基（OO)-NH、（CrC6)燒基（c=〇)-[NH](CrC6)烷基、（C「C6)烷基（C=0)-[N(CrC6)烷基](CrC6)烷基、 (CVQ)燒基-S-、（C「C6):f：完基- (S=0)-、（C「C6)燒基-S0r、（crc6)烷基-S0rNH-、（CrC6)烷基-S〇r [N-(CrC6)烷基]-、H2N-S02-、H2N-S0r (CrC6)烷基、（CrC6)烷基 HN-SC^CrQ)烷基、[(CrC6)烷基]2-N-S02-(C「C6)燒基、cf3S〇3-、（CrC6)：fe 基-S0r、苯基、苯基（crC6) 统基、（C3-C1G)環纟充基、（C2-C9)雜環:)¾基和（C2-C9)雜芳基所組成之群；其限制條件為，當X為s0或s〇2且r3和r4為包括雜原子的取代基時，雜原子不可與該環結合。本發明的其他具體實施例’是組合物之群和方法組合，其中該組合的活性成分之一為芳基磺酿基異經辟酸衍生物TACE抑制劑化合物’選自由下列化合物所組成之群： 200302107 發明說明續頁 (26) (2S，3S)-4-[4-(3,5-二氟-芊氧基）-苯磺醯基]-2-甲基-硫代嗎啉-3-羧酸羥基醯胺； (2S,3S) -4- [4- (4-氟-苄氧基）-苯磺醯基]-2-甲基-硫代嗎啉-3-叛酸基醯胺； (28,311，68)-2,6-二甲基-4-[4-(2-甲基-苄氧基）-苯磺醯基]-嗎啉-3-羧酸羥基醯胺； 4- (4-苄氧基-苯磺醯基）-2-甲基-嗎啉-3-羧酸羥基醯胺； (28,311,68)-4-[4-(4-氟-芊氧基）-苯磺醯基]-2,6-二甲基-嗎啉-3-複酸基si胺； (311，63)-4-[4-(4-氟-芊氧基）-苯磺醯基]-2,2,6-三甲基-嗎啉-3- 幾酸經基龜胺； (2S，3R,6S)-6-乙基-4-[4-(4-氟-苄氧基）-苯磺醯基]-2-甲基-嗎啉-3-羧酸羥基醯胺； (2R,3R,6S)-4-[4-(4-氟-芊氧基）-苯磺醯基]-2,6-二甲基-嗎啉-3- 致酸#i基醯胺； (2R，3R，6R) -4- [4- (4-氟-苄氧基）-苯磺醯基]-2,6-二甲基-嗎啉- 3-羧酸羥基醯胺； (2S,3R,6S)-2,6-二甲基-4-[4-(。比啶-4-基甲氧基）-苯磺醯基]-嗎啉-3-羧酸羥基醯胺； (23,311，63)-2,6-二甲基-4-[4-〇比啶-2-基甲氧基）-苯磺醯基]-嗎4 -3-複酸巍基酸胺； (2S,3R，6S)-2,6-二甲基-4-[4-卜比啶-3-基甲氧基）-苯磺醯基]-嗎0林-3-幾酸#i基SS胺； (23,311，65)-2,6-二甲基-4-[4-(2-甲基-吡啶-3-基甲氧基）-苯磺 200302107 (27) 發明着明續頁醯基卜嗎啉-3-羧酸羥基醯胺； (311，63)-2,2,6-三甲基-4-[4-(2-三氟甲基-芊氧基）-苯磺醯基]-嗎0林-3-複酸輕基驢胺； (28,311)-2,2,6-三甲基-4-[4-(外1:啶-4-基甲氧基）-苯磺醯基]-嗎啉-3-羧酸羥基醯胺； (3R，6S)-2,2,6-三甲基-4-[4-(2-甲基-吡啶-3-基甲氧基）-苯磺醯基卜嗎啉-3-羧酸羥基醯胺；

(2S，3R，6S)-[4-(2,5-二曱基-苄氧基）-苯磺醯基]-2,6-二甲基-嗎4 -3-竣酸經基酿胺； (28,311,68)-4-[4-(3,5-二氟-苄氧基）-苯磺醯基]-2,6-二甲基-嗎 7林-3-複酸經基醯胺； (2S，3R，6S)-4-[4-(3-甲氧基-苄氧基）-苯磺醯基]-2,6-二甲基-嗎啉-3-羧酸羥基醯胺； (2S,3R，6S)-4-[4-(5-氟-2-甲基-苄氧基）-苯磺醯基]-2,6-二甲基-嗎啉-3-羧酸羥基醯胺；

(23,311，68)-4-[4-(呋喃-3-基甲氧基）-苯磺醯基]-2,6-二甲基-嗎4 -3-複酸#1基醯胺； (28,311,63)-4-[4-(2-氟-3-曱基-苄氧基）-苯磺醯基]-2,6-二甲基-嗎啉-3-羧酸羥基醯胺； (2S,3R)-4-[4-(4-氟-苄氧基）-苯磺醯基]-2,6,6-三甲基-嗎啉-3-羧酸羥基醯胺； (3R) -4- [4- (4-氟-苄氧基）-苯磺醯基]-6,6-二甲基-嗎啉-3-羧酸經基醯胺； (3R)-6,6-二甲基-4-[4-(吡啶-4-基甲氧基）·苯磺醯基]-嗎啉-3- -32· 200302107 (28) 發明說明續頁羧酸羥基醯胺； (3R) -6,6-二甲基-4- [4- (2-甲基-苄氧基）-苯磺醯基]-嗎啉-3-羧酸羥基醯胺； (2S，3R，6S)-4-(4-環己甲氧基-苯磺醯基）-2,6-二甲基-嗎啉-3-複酸經基醯胺； (3R,6S)-4-[4-(2,5-二甲基-芊氧基）-苯磺醯基]-2,2,6-三甲基-嗎啉-3-羧酸羥基醯胺； (2S，3R) -4- [4- (4-氟-苄氧基）-苯磺醯基]-6-甲氧甲基-2-甲基-嗎琳-3-複酸禮基醒胺； (2S,3R,6S)-4-[4-(3-氯-苄氧基）-苯磺醯基]-6-[(乙基-甲基-胺基）-甲基]-2-甲基-嗎啉-3-羧酸羥基醯胺； (2S，3R)-4-[4-(3-氯-芊氧基）-苯磺醯基]-6-甲氧基-2-甲基-嗎啉-3-羧酸羥基醯胺； (2S,3R，6R)-4-[4-(4-氟-苄氧基）-苯磺醯基]-6-羥甲基-2-甲基-嗎琳-3-致酸基醯胺。本發明的其他具體實施例，是組合物之群和方法組合，其中該組合的活性成分之一為芳基磺醯基異羥肟酸衍生物TACE抑制劑化合物，其中該芳基磺醯基異羥於酸衍生物具有下式：

其中Ri-R8選自由羥基、氫、NH2、鹵素、-CN、（C「C6)烷基、（CrC6)烯基、（C6-C1())芳基（CrC6)晞基、（CrC9)雜芳基（CrC6)烯 200302107 (29) 「奋明說基、（CrC6)炔基、（C6-C1())芳基（CrC6)炔基、（crc9)雜芳基（crc6) 決基、（CrC6)燒胺基、[(CrC6)燒基]2胺基、（Ci-C6)^硫基、（CrC^ 烷氧基、全氟（CrQ)烷基、全氟（CrC6)烷氧基、（c6-ClG)芳基、 (CrC9)雜芳基、（C6-C1())芳胺基、（C6-C1G)芳硫基、（c6-c1())芳氧基、（CrC9)雜芳胺基、（CrC9)雜芳硫基、（crc9)雜芳氧基、（crc6) 環燒基、（CpCJfe基傳基亞甲基）、六氫ρ比p定基、（crc6)：j^基六氫吡啶基、（CrC6)醯基、（cvc6)醯胺基、（crC6)醯硫基、（crc6) 醞氧基、（CrC6)fe 氧基-(〇0)-、-C02H、（crc6)^ 基-NH-(〇〇)-和[(C「c6)烷基]2-N(O0)-所組成之群；其中該（CpC6)坑基可視需要被一或兩個選自下列的基團取代·（Ci-C6)fe硫基、（Ci_C6)坑氣基、三氟甲基、鹵素、-CN 、（Cb-ClQ)方基、（C2-C9)雜方基、（CVClQ)方胺基 ' (C^-ClQ)芳硫基、（c6-c1G)芳氧基、（crc9)雜芳胺基、（crc9)雜芳硫基、（c2-c9；) 雜芳氧基、（C6-C1G)芳基（C6-C1G)芳基、（crc6)環烷基、羥基、六氫吡畊基、（c6-cm)芳基（crc6)烷氧基、（crc9)雜芳基（crc6) 烷氧基、（crc6)醯胺基、（c「c6)醯硫基、（CrC6)醯氧基、（CVC6) 烷基亞磺醯基、（CVC1G)芳基亞磺醯基、（CrC6)烷基磺醯基、 (C6-C1Q)芳基磺醯基、胺基、（crc6)烷胺基或（(crc6)烷基）2胺基；或R1和R2，或R3和R4，或R5和R6可一起形成羰基；或R1和R2,或R3和R4,或R5和R6,或R7和R8可一起形成（CrC6) 環烷基、氧雜環己基、硫雜環己基、氫茚基或1，2,3,4-四氫化莕環，或下式之基團

-34- 200302107 (30) 齊:明:猶孳X: R9為氫或（CrC6)燒基；

Ar 為（C6-C1())芳基（CrC6)燒氧基（C6-C1G)芳基、（C6-C1())芳基（CrC6) 烷氧基（CrC9)雜芳基、（CrC9)雜芳基（CVC6)烷氧基（C6-C1G)芳基、（CrC9)雜芳基（CrC6)烷氧基（CrC9)雜芳基，其可視需要被一或多個取代基取代，分別選自鹵素、-CN、可視需要被一或多個氟原子、羥基、羥基- (CrC6)烷基取代的（Crc6)烷基、可視需要被一或多個氟原子取代的（CVQ)烷氧基、 HO-(OO)-、（Cr*C6)燒基-0-(0 0)-、H〇-(〇=0)-(CrC6)燒基、（CrC6) 烷基-〇-(〇〇)-(crc6)烷基、（crc6)烷基- (〇〇)-〇-、（(:丨/幻烷基-(C=0)-0-(CrC6)烷基、H(OC)-、H(OCMCrC6)烷基、（C「C6)烷基（oc)-、（crc6)烷基（o=c)-(crc6)烷基、N02、胺基、（Ci-C6) 烷胺基、[(crc6)烷基]2胺基、胺基（crc6)烷基、（c「c6)烷胺基 (crc6)烷基、[(CrC6)烷基]2胺基（CrC6)烷基、H2N-(C=0)- ' (CVC6) 烷基-NH-(C=0)-、[(C「C6)烷基]2N-(〇0)-、H2N(C=0)-(CrC6)烷基、（CrC6)烷基-HN(C=〇MCrC6)烷基、[(CrC6)烷基]2N-(0〇MCrC6) 烷基、H(0=C)-NH-、（CrC6)烷基（OO)-NH-、（CrC6)烷基（C=0)-[NH] (匸广。6)’紀基、（(?]-(1；6)燒基（(^=:0)-[1^((^1-(^6)：)：完基]((21-(^6)燒基、（(3「匸6) 烷基-S-、（CrC6)烷基- (S=0) -、（C「C6)烷基-s〇r、（CrCJ 烷基-SOr NH-、H2N-SO2-、H2N-S〇2-(Ci-C6)燒基、（Ci.Q)统基 HN-S〇2-(CrC6) 烷基、[(CVQ)烷基]2N-SOr(CrC6)烷基、CF3SO3-、（CVC6)烷基-S〇r 、苯基、苯基（CrC6)烷基、（CrC1G)環烷基、（crC9)雜環烷基和 (CrC9)雜芳基；本發明的其他具體實施例，是組合物之群和方法組合，其中該組合的活性成分之一為芳基磺醯基異羥肘酸衍生 -35- 200302107 (31) 發明說明續頁物TACE抑制劑化合物，其中該TACE抑制劑係選自由下列化合物所組成之群： (2民511)-1-[4-(2,5-二甲基-苄氧基）-苯磺醯基]-5-羥基-六氫 · 叶匕咬-2-複酸經基酿胺； w

I (2R，5R)-l-[4-(5-氟-2-甲基-苄氧基）-苯磺醯基]-5-羥基-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺；

(2R,4R)-4-羥基-1-[4-(2-甲基-苄氧基）-苯磺醯基卜六氫口比啶-2-羧酸基醯胺； (2R,5R)-l-[4-(5-氟-2-三氟甲基-芊氧基）-苯磺醯基]-5-羥基- 六氫ρ比淀-2-幾酸輕基醯胺； (2R，5R)-5-羥基-1-[4-(2-異丙基-苄氧基）-苯磺醯基]-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺； (2艮511)-1-[4-(2-乙基-苄氧基）-苯磺醯基]-5-羥基-六氫说啶-2-羧酸羥基醯胺； (2R,4R)小[4-(5-氟-2-甲基-苄氧基）-苯磺醯基]-4-羥基-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺； (2R,4R) - M4- (2,5-二曱基-苄氧基）-苯磺醯基]-4-羥基-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺； (2R，5R)-l-[4-(5-氟-2-甲基-芊氧基）-苯磺醯基]-5-羥基-5-甲基-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺； (2R，5R)-l-[4-(5-氟-2-三氟甲基-芊氧基）-苯磺醯基]-5-羥基-5-甲基-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺； (2艮511)-5-羥基-1-[4-(2-異丙基-芊氧基）-苯磺醯基]-5-甲基-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺； •36- 200302107 (32) 發明說明續頁 (2艮511)-5-羥基-5-甲基-1-[4-(2-甲基-苄氧基）-苯磺醯基]-六氫p比淀-2-幾酸禮基醯胺； (2艮311,511)-5-羥基-3-甲基-1-[4-(2-甲基-苄氧基）-苯磺醯基]-' 六氫7比淀-2-致酸經基si胺；、 (2R，3R，5R)-5-羥基-l-[4-(2-異丙基-苄氧基）-苯磺醯基]-3-甲基-六氫说咬-2-幾酸經基醯胺； (2R，3S)-l-[4-(5-氟-2-三氟甲基-苄氧基）-苯磺醯基]-3-羥基-3-甲基-六氫p比咬-2-幾酸經基S龜胺； | (211,311)-1-[4-(2,4-二氯-苄氧基）-苯磺醯基]-3-羥基-3-甲基-六氫p比咬-2-幾酸經基醯胺； (211，511)-1-[4-(2,4-二氯-苄氧基）-苯磺醯基]-5-羥基-3,3-二甲基-六氫咐咬-2-幾酸#i基醯胺； (2R，3S)-l-[4-(2-甲基-苄氧基）-苯磺醯基]-4-胺乙醯基-3-甲基-六氫吡畊-2-羧酸羥基醯胺；

(2R,3S)-l-[4-(4-氟-2-甲基-¥氧基）-苯磺醯基]-3-甲基-5-氧基-六氫吹畊-2-幾酸經基醯胺； (2R,3S) -4- [4- (2-乙基-苄氧基）-苯磺醯基]-3-甲基-4-羧酸甲醯胺-六氫吡畊-2-羧酸羥基醯胺； (2R，3R)-l-[4-(4-氟-2-甲基-苄氧基）-苯磺醯基卜3-羥基-3-甲基-六氫说咬-2-幾酸經基醯胺； (2R，5R) -1- [ 4- (2-氣-4-氣氧基）-禾績酿基]-5-經基-3,3-二甲基-六氫p比咬-2-致酸經基醯胺； (2R,3S)-4-[4-(5-氟-2-甲基-芊氧基）-苯磺醯基]-3-甲基-4-羧酸甲醯胺-六氫p比叫1 -2-複酸經基驢胺； -37- 200302107 (33) 發明詨明續頁. (2R，3R)-l-[4-(2-氯-4-氟-苄氧基）-苯磺醯基]-3-羥基-3-甲基-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺； (2R，3R)-l-[4-(2-氟-4-氯-苄氧基）-苯磺醯基]-3-羥基-3-甲基-六氫说淀-2-複酸經基醯胺； (2R，5R)-l-[4-(4-氟-苄氧基）-苯磺醯基]-5-羥基-3,3-二甲基-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺；

(2R，3S)-l-[4-(2-甲基-5-氟-芊氧基）-苯磺醯基]-3-甲基-5-氧基-六氫吡畊-2-羧酸羥基醯胺； (2R,3S)-l-[4-(2-甲基-苄氧基）-苯磺醯基]-3-羥基-3-甲基-六氫p比淀-2-幾酸經基醯胺； (2R,5R)-l-[4-(4-氟-2-甲基-苄氧基）-苯磺醯基]-5-羥基-3,3-二甲基-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺； (2R，5R)-l-[4-(2-甲基-3-氟-芊氧基）-苯磺醯基]-5-羥基-3,3-二甲基-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺；

(2R,3R)-l-[4-(2-氟-2-苄氧基）-苯磺醯基]-3-羥基-3-甲基-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺； (2R,3R)-l-[4-(2-氯-芊氧基）-苯磺醯基]-3-羥基-3-甲基-六氫 p比淀-2-複酸羥基醯胺； (2R，3R)-l-[4-(2-甲基-3-氟·苄氧基）-苯磺醯基]-3-羥基-3-甲基-六氫说淀-2-複酸輕基醯胺； (2R，5R)-l-[4-(2-甲基-5-氯-苄氧基）-苯磺醯基]-5-羥基-3,3-二甲基-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺； (2R，3R)]-[4-(2-甲基-苄氧基）-苯磺醯基]-3-羥基-3-甲基-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺； -38- 200302107 發明說确續頁、 (34) (2R，3R)-l-[4-(2,4-二氟-苄氧基）-苯磺醯基]-3-羥基-3-甲基-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺； (2R，5R)-l-[4-(2-氟-5-氯-苄氧基）-苯磺醯基]-5-羥基-3,3-二甲基-六氫吡啶-2-羧酸羥基醯胺； (2R,3R)-l-[4-(2-甲基-5-氟-苄氧基）-苯磺醯基]-3-羥基-3-甲基-7T鼠p比呢-2-幾喪基臨胺，

(2R，5R)-l-[4-(2-溴-苄氧基）-苯磺醯基]-5-羥基-3,3-二甲基-六氫峨淀-2-複酸經基醯胺；和 (211，38)-4-[4-(2,4-二氟-苄氧基）-苯磺醯基]-3-甲基-4-羧酸甲醯胺-六氫吡畊-2-羧酸羥基醯胺。本發明之方法和組合物，通常是針對在哺乳動物中， IL-1/18和TNF調節之疾病的治療及/或預防。然而任何罹患 IL-1/18和TNF調節之疾病的哺乳動物，亦可使用本發明之組合物和方法來治療，該哺乳動物最好是人類。

雖然本發明之方法和組合物可用來治療任何的IL-1/18和 TNF調節之疾病，但較佳的是，該IL-1/18和TNF調節之疾病可以是不適當之宿i對傳染病的反應，在那裏活躍的感染出現在任何的身體部位，像是敗血性休克、瀰漫性血管内凝固，及/或成人呼吸緊迫徵候群；急性或慢性的炎症，歸因於抗原、抗體及/或補體沉積；炎症性病況，包括關節炎、膽管炎、結腸炎、腦炎、心内膜炎、血管球性腎炎、肝炎、心肌炎、胰臟炎、心包膜炎、再灌注之傷害和血管炎、以免疫為基礎的疾病，像是急性和延遲性過敏反應、移植排斥和移植物-對-宿主的疾病；自體-免疫疾病，包 -39- 200302107 (35) 發明說明續頁括第1型糖尿病和多發性硬化症。該治療的組合物和方法，最好是針對炎症性病症，像是風濕性關節炎、骨關節炎、敗血性休克、COPD和牙周病。

IL-1抑制劑與TNF抑制劑之組合，亦可用來治療骨和軟骨的吸收作用，以及起因於細胞外基質之過度沉積的疾病。這類疾病包括骨質疏鬆症、牙周病、間質性肺纖維化、肝硬化、系統性硬化症和瘢瘤形成。IL-1抑制劑與TNF抑制劑之組合，亦可用來治療某些產生IL-1作為自分泌生長因子的腫瘤，並可用來預防與某些腫瘤有關的惡病質。IL-1抑制劑與TNF抑制劑之組合，亦可用來治療帶有炎症性成分的神經元疾病，包括但不限於早老性痴呆徵候群、猝發、抑鬱和叩打傷害。IL-1抑制劑與TNF抑制劑之組合，亦可用來治療心血管疾病，其中募集單核細胞至内皮下空間内，扮演某種角色，像是動脈粥樣硬化斑的發展。

特別適用於該方法和組合物的疾病是關節炎，特別是風濕性關節炎。本發明亦提供在一或多個容器中，包括用來治療炎症反應之抑制IL-1增殖的製劑和TNF抑制劑之組合的套組。定義和共同技術除非在本文中另行定義，關於本發明所使用的科學和技術名詞，將具有其為熟諳此藝者所普遍瞭解的意義。此外，除非在上下文中另有需求，單數名詞應包括複數，而複數名詞應包括單數。通常，關於在本文中描述之細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學，以及 -40- 200302107 發明說明續頁 (36) 蛋白質和核酸化學，和雜交作用之技術所使用的術語，是此項技藝中已熟知並普遍使用的那些。除非另行指示，通常根據此項技藝中已熟知的，並如同在本發明中提及和討論的各種普通和較專門之參考文獻中描述的傳統方法，來進行本發明之方法和技術。參見，例如Sambrook等人Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)和 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular

Biology, Greene Publishing Associates (1992)，以及 Harlow f口 Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)，以引用的方式併入本文中。根據製造者的說明書，進行酵素反應和純化技術，如同在此項技藝中共同完成的，或在本文中描述的。關於在本文中描述之分析化學、合成有機化學和醫學與藥理學化學的實驗室程序和技術之術語，為此項技藝中已熟知並普遍使用的那些。至於化學合成、化學分析、藥理學製備、調配和遞送，以及患者的治療，則使用標準技術。下列的名詞，除非另行指示，應瞭解其具有下列的意義： "IL-1抑制劑”意指任何阻止IL-1信號增殖的物質，像是 IL-1細胞激動素的轉譯後加工和釋放，像是藉著阻止31 kDal 前-細胞激動素的切開作用，其為羧基-終端17 kDal成熟細胞激動素的前驅物，或是藉著阻止成熟的細胞激動素釋放至細胞及/或細胞外液内。這類抑制劑的實例為ICE之抑制劑、卡斯蛋白酶之抑制劑，以及IL-1轉譯後加功的抑制劑。 "IL-18抑制劑π意指任何阻止IL-18信號增殖的物質，像是 -41 - 200302107 (37) 發明說明讀頁 IL-18拮抗劑、IL-18和IL-18r抗體，以及可溶性IL-18受體（IL-18sr) ，像是藉著阻止前驅物蛋白質的切開作用，例如藉著卡斯蛋白酶-1或卡斯蛋白酶-4，如此阻止了 156個胺基酸之成熟蛋白質的釋放。 n TNF抑制劑”意指任何阻止TNF信號增殖的物質，像是 TNF拮抗劑；TNF、TNFr和TACE抗體；可溶性TNF受體（TNFsr) :以及TACE抑制劑。

π多肽”意指任何的肽或蛋白質，包括2或多個胺基酸，藉著肽鍵或經過修改的肽鍵也就是肽同位質，將彼此連接在一起。’’多肽π意指短鏈，通常稱為肽、寡肽或低聚物，以及較長的鏈，通常稱為蛋白質兩者。多肽可含有20個基因-編碼之胺基酸以外的胺基酸。'’多肽，，包括藉著天然加工，像是轉譯後加工，或是藉著此項技藝中已熟知的化學修改技術，來修改的胺基酸序列。已經在基礎的教科書中，以及更詳細的專文和在大量的研究文獻中，徹底地描述了這類修改。修改可發生在多肽中的任何地方，包括肽主鏈、胺基酸側鏈和胺基或複基終端。應瞭解相同類型的修改，可在特定多肽的數個位置處，以相同或不同的程度存在。再者，特定的多肽亦可含有許多類型的修改。由於泛素化作用（ubiquitination)的結果，可使多肽分支，且它們可以是有或無分支之環狀的。環狀的、分支的和分支環狀的多肽，可起因於轉譯後的天然加工，或可藉著合成方法來製造。修改包括乙醯化作用、醯化作用、ADP-核糖基化作用、醯胺化作用、黃素的共價附接、血質部分的共價附接、 -42- 200302107 _ (38) I奋明巍明蟥頁

核荅酸或核苷酸衍生物的共價附接、脂質或脂質衍生物的共價附接、磷脂醯肌醇的共價附接、交聯作用、環化作用、二硫鍵形成、脫甲基作用、共價交聯的形成、胱胺酸的形成、焦穀胺酸的形成、甲醯化作用、γ-羧化作用、糖基化作用、GPI固定形成、羥化作用、碘化作用、甲基化作用、肉苴癌SS化作用、氧化作用、蛋白質水解加工、鱗酸化作用、異戊烯化作用、消旋作用、硒醯化作用、硫酸鹽化作用、轉移RNA調節的將胺基酸加至蛋白質中之作用，像是精胺醯化作用和泛素化作用。參見，例如蛋白質-結構和分子特性（PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES)，第 2 版，T.E. Creighton, W.H· Freeman and Company，N.Y., 1993，和 Wold，F.，轉譯後的蛋白質修改：前途和展望（Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects)，第 1-12 頁，在蛋白質的轉譯後之共價修改（POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODinCATION OF PROTEINS)中，B.C· Johnson，編輯，Academic Press，Ν·Υ·, 1983; Seifler 等

人，n蛋白質修改和非蛋白質輔因子的分析（Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors)’’，Meth Enzymol (1990) 182:626-646，以及 Rattan等人”蛋白質合成：轉譯後修改和熟成（Protein Synthesis: Post-translational Modifications and aging)’’，Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62。在本文中所使用的”變體’’一詞，為與參考多肽不同，但仍保留基本特性的多肽。多肽的代表性變體與另一個參考多肽的差異在胺基酸序列中。通常，限制該差異，使得參考多肽與變體之序列大體上是密切類似的，並在許多區域中是相同的。變體和參考多肽在胺基酸序列上的差異，為 -43 - 200302107 (39) 發曰月巍明續頁任何組合的一或多個取代、添加、刪除。經取代或插入的胺基酸殘基，可以是或可以不是由遺傳密碼編碼的。多肽的變體可以是天然存在的，或它可以是不知道出現在自然界中的變體。可藉著突變生成技術或藉著直接合成，來製造多核甞酸和多肽的非-天然存在的變體。 ”同一性f’是核甞酸序列或胺基酸序列之同一性的測量值。一般而言，將序列排成一直線，以便獲得最高的順序配合。π同一性”本身具有此項技藝中公認的意義，並可使用已發表的技術來計算。參見，例如：（計算的分子生物學 (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY) ; Lesk，Α.Μ·，編輯，Oxford University Press，Ν·Υ.，1988 ;生物計算：訊息資訊學和基因組設計（BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS), Smith， D.W.，編輯，Academic Press, N.Y·，1993 ;序列資料的電腦分析 (COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA)，第 1 部，Griffin，A.M.，和 Griffin, H.G·，編輯，Humana Press, N.J·，1994 ;在分子生物學中的序列分析（SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY)，von Heinje, G.，Academic Press, 1987 ;以及序歹|J 分析引子（SEQUENCE ANALYSIS PRIMER)，Gribskov，M.和 Devereux，J·，編輯 M Stockton Press，Ν·Υ·, 1991) 。雖然，現有許多測量在兩個多核荅酸或多肽序列之間的同一性的方法，但”同一性” 一詞已為熟諳此藝者所熟知 (Carillo, Η,，和 Lipton，D·，SIAM J Applied Math (1988) 48:1073)。常用來判定在兩個序列之間的同一性或類似性的方法，包括但不限於在 Guide to Huge Computers，Martin J· Bishop，編輯，Academic Press， San Diego, 1994，和 Carillo, H·，和 Lipton，D.，SIAM J Applied Math (1988) •44- 200302107 發明說明續頁 (40) 48:1073中描述的那些。在電腦程式中編寫了判定同一性和類似性的方法。判定在兩個序列之間的同一性和類似性之較佳的電腦程式方法，包括但不限於GCS套裝程式（Devereux, J.等人，Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387)、BLASTP、BLASTN、 FASTA (Atschul，S.F.等人，J Molec Biol (1990) 215:403)。

’’經過分離的蛋白質”或n經過分離的多肽” 一詞，為憑藉著其衍生起源或來源，（1)不與在其自然狀態下伴隨它的天然結合組份結合，（2)不含得自相同物種的其他蛋白質，（3) 由得自不同物種的細胞表現，或（4)在自然界中不存在的蛋白質或多肽。因此，以化學方式合成，或在與天然從其中產生該多肽之細胞不同的細胞系統中合成的多肽，將是從其天然結合之組份中”經過分離的”。亦可藉著分離，使用此項技藝中已熟知的蛋白質純化技術，使蛋白質大體上不含有天然的結合組份。

當試樣的至少大約60至75%，顯示出單一物種的多肽時，該蛋白質或多肽為π實質上純的"實質上均質的π或π 實質上經過純化的”。多肽或蛋白質可以是單體或多聚體的。實質上純的多肽或蛋白質，通常將包括大約50%、60% 、70%、80%或90%重量/重量的蛋白質試樣，較常見的是大約95%，而最好是超過99%純度。可藉著此項技藝中已熟知的許多方法，來指示蛋白質的純度或均一性，像是蛋白質試樣的聚丙晞醯胺凝膠電泳，接著以此項技藝中已熟知的染色，將凝膠染色，使單一的多肽譜帶呈現。為了某些目的，可藉著使用HPLC或其他此項技藝中已熟知的純化方法 -45 - 200302107 (41) 發明貪明續頁，來提供較高的離析。在本文中所使用的π多肽片段” 一詞，意指具有胺基-終端及/或羧基-終端刪除的多肽，但在此處剩下的胺基酸序列，與在天然存在之序列中相對應的位置是相同的。片段通常為至少5、6、8或10個胺基酸長，最好是至少14個胺基酸長，更佳的是至少20個胺基酸長，通常是至少50個胺基酸長，而再更佳的是至少70個胺基酸長。

在本文中所使用的π多肽類似物” 一詞，意指包括至少25 個胺基酸之斷片的多肽，其對一部分的胺基酸序列具有相當大的同一性，並具有至少一個下列的特性：（1)在適當的結合條件下，專一地結合 IL-1、IL-lr、IL-18、IL-18r、TNF、TNFr 或 TACE，（2)阻斷 IL-1、IL-18、TNF 或 TACE 或 IL-1、IL-18 或 TNF 與 IL-lr、IL-18r 或 TNFr 結合的能力，或（3)降低 IL-lr、IL-18r 或 TNFr

細胞表面表現的能力。多肽類似物，關於天然存在的序列，代表性地包括保留性胺基酸置換（或插入或刪除）。類似物通常為至少20個胺基酸長，最好是至少50個胺基酸長或更長，且通常可以像全長的天然存在之多肽一樣長。在藥理學產業中常使用非-肷類似物來作為藥物，其具有類似那些模板肽的特性。將這些類型的非-肽化合物稱為’’肽模仿物 ’·或”肢模仿物 π。Fauchere，J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber 和 FreidingerTINS 第 392 頁（1985);和 Evans 等人 J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)，將其以引用的方式併入本文中。通常利用電腦化分子塑型的幫助，來發展這類化合物。可使用在結構上類似在治療上有用之肢的肢模仿物，而產生相等的治療或 -46- 200302107 發明說明續頁 (42) 預防效果。一般而言’趾模仿物是在結構上類似範例多趾的（也就是具有想要之生化特性或藥理學活性的多肽），像是人類抗體，但具有一或多個肽鍵結，可視需要藉著此項技藝中已熟知的方法，藉著選自由：-CH2NH-、-CH2S-、-CHrCHr 、-CH=CH-(順和反）、-C〇CHr、-CH(OH)CHr 和-CH2S〇-所組成之群的鍵結置換。亦可使用以相同類型的D-胺基酸，系統性

地取代一致序列的一或多個胺基酸（例如D-離胺酸代替L-離胺酸），產生更穩定的肽。此外，可藉著此項技藝中已知的方法（Rizo 和 Gierasch Ann. Rev. Biochem· 61:387 (1992)，以引用的方式併入本文中），產製受限制的肽，其包括一致序列或實質上相同的一致序列改變；例如藉著加入能夠形成分子内二硫橋之内部的半胱胺酸殘基，其將該肽環化。

π免疫球蛋白”為四聚體的分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每個四聚體分別由兩對相同的多肽鏈所組成，每一對具有一個π輕π (大約25 kDa)和一個”重"鏈（大約50-70 kDa)。每個鏈的胺基-終端部分，包括大約100至110，或更多個胺基酸的可變區，主要負責抗原的認知。每個鏈的羧基-終端部分定義為恆定區，主要負責效應物功能。將人類的輕鏈分類為κ和λ輕鏈。將重鏈分類為μ、△、γ、α或ε，並分別定義抗體的同型物為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕和重鏈中，藉著大約12個或更多個胺基酸的” J π區域，連接可變和恆定區，而重鏈亦包括大約10個或更多個胺基酸的n D ’’區域。通常，參見基礎免疫學（Fundamental Immunology)第7章（Pual, W.，編輯，第2版，Raven Press，N.Y. (1989))(為了各種目的，完整地以 -47- 200302107 發明說明續頁 (43) 引用的方式併入本文中）。每個輕/重鏈對的可變區形成抗體結合位置，使得完整的免疫球蛋白具有兩個結合部位。免疫球蛋白鏈顯示出相同的相對上較受到保留之架構區（FR)的一般結構，藉著3個高變區連接，亦稱為互補性決定區或CDRs。得自每對兩個鏈的CDRs，藉著架構區排成一直線，能夠與特定的抗原決定位結合。從N-終端至C-終端

，輕和重鏈兩者包括功能部位FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3 、CDR3和FR4。對每個功能部位指派的胺基酸，係根據Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health,

Bethesda, Md. (1987 和 1991))，或 Chothia & Lesk J. Mol· Biol· 196:901-917 (1987) ; Chothia 等人 Nature 342:878-883 (1989)的定義。抗體n意指完整的免疫球蛋白，或其抗原-結合部分，其為了專一性結合而與完整的抗體競爭。可藉著重組DNA技術，或藉著完整抗體的酵素或化學切開作用，來產製抗原-

結合部分。抗原-結合部分，特別包括Fab、Fabf、F(aiy) 2、Fv 、dAb和互補性決定區（CDR)片段’單-鍵抗體（scFv)、嵌合型抗體、微型雙功能抗體（diabodies)，以及含有至少一部分免疫球蛋白，足以賦與該多肽專一之抗原結合作用的多肽。

Fab片段是由VL、VH、CL和CH1功能部位所組成的單價片段 ;F(ab’）2片段則是二價片段’包括兩個Fab片段，藉著在絞鏈區的二硫橋連接；Fd片段係由VH和CH1功能部位所組成 ;Fv片段由抗體單臂的VL和VH功能部位組成；dAb片段（Ward 等人，Nature 341:544-546, 1989)則由VH功能部位所組成。單鏈抗體（scFv)為其中VL和VH區配對，經由能夠將其製成單一蛋 -48- 200302107 發明說明續頁 (44) 白質鏈的合成交聯劑，形成單價分子的抗體（Bird等人，Science 242:423-426，1988 和 Huston 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988)。微型雙功能抗體是二價的、雙重專一性的抗體，其中在單一的多肽鏈上表現VH和VL功能部位，但所使用的交聯劑太短，以致於不容許在相同鏈上的兩個功能部位之間發生配對，藉此迫使該功能部位與另一個鏈的互補功能

部位配對，並創造兩個抗原結合部位（參見，例如Holliger, P·, 等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 90:6444-6448, 1993，和 Poljak, R.J.等人，Structure 2:1121-1123，1994)。可將一或多個CDRs以共價或非共價的方式併入分子内，使其成為免疫黏連素（immunoadhesin) 。免疫黏連素可併入CDR(s)，成為較大多肽鏈的一部分，可將CDR(s)與其他多肽鏈共價連接，或可以非共價的方式併入CDR(s)。CDRs容許免疫黏連素專一地結合感興趣的特定抗原。

抗體可具有一或多個結合部位。如果有一個以上的結合邵位，則結合部位可以是彼此相同的，或可以是不同的。例如，天然存在的免疫球蛋白具有兩個相同的結合部位，單鏈抗體或Fab片段則具有一個結合部位，而"雙重專一的” 或”雙重功能的π抗體則具有兩個不同的結合部位。在本文中使用的"單株抗體"一詞，意指獲自實質上同類之抗體族群的抗體，也就是說，族群所包含的個別抗體實質上是同類的抗體，除了可能有天然存在的突變之外，其可能以較少的含量存在。單株抗體是高度專一的，針對單一的抗原位置。此外，與通常包括針對不同決定位（抗原 •49 - 200302107 (45) 發明巍明績頁決定位）之不同抗體的傳統（多株）抗體製品相反，每個單株抗體僅針對在抗原上的一個決定位。除了它們的專一性之外，單株抗體的有利之處，在於其係藉著融合瘤培養來合成它們，未被其他的免疫球蛋白污染。修飾語”單株的π，指出該抗體是獲自實質上同類之抗體族群的特徵，而不應被解釋為需要藉著任何特定的方法來產生抗體。例如，可藉著首先由Kohler & Milstein，Nature 256:495(1975)描述的融合瘤方法，或可藉著重組的DNA方法[參見，例如美國專利第 4,816,567號（Cabilly等人）]，來製造將根據本發明使用的單株抗體。在本文中的單株抗體特別包括”嵌合型”抗體（免疫球蛋白），其中一部分的重及/或輕鏈是與在衍生自特定物種，或屬於特定抗體種類或亞種之抗體中的相對應序列相同的，或是同種的，而該鏈（們）的其餘部分則是與在衍生自其他物種，或屬於其他抗體種類或亞種之抗體中的相對應序列相同的，或是同種的，以及这類抗體的片段’只要它們顯示出想要的生物活性即可[美國專利第4,816,567號’ Cabilly 等人；Morrison 等人，Pr〇c· Nat1· Acad· Sci. USA 81，6851-6855 (1984)]。，，經過分離的抗體，，是下述的抗體’它⑴不與在其自然狀態下伴隨它的天然結合組份結合’包括其他天然結合的抗體，（2)不含得自相同物種的其他蛋白質’（3)由得自不同物種的細胞表現，或（4)並未出現在自然界中。經過分離之抗體的實例，包括已經使用1L·1、Hr、IL-18、IL-18r、™F、 200302107 發明說明續頁 (46) 或TACE作為經過分離的抗體，進行親和力純化的抗- (IL-1、 IL-lr、IL-18、IL-18r、TNF、TNFr 或 TACE)抗體，已經藉著融合瘤或其他細胞株，在活體外合成的抗-(IL-1、IL-lr、IL-18、IL-18r 、TNF、TNFr或TACE)抗體，以及衍生自基因轉殖老鼠的人類抗-(IL-1、IL-lr、IL-18、IL-18r、TNF、TNFr 或 TACE)抗體。

π人類抗體” 一詞，包括具有一或多個衍生自人類免疫球蛋白序列之可變和怪定區的所有抗體。可以各種方式製備這些抗體，如同下文描述的。人類化抗體是衍生自非·人類物種，其中在架構，以及重和輕鏈之恆定功能部位中的某些胺基酸已經發生突變，而得以在人類中避免或廢止免疫反應。或者，亦可藉著將得自人類抗體的恆定功能部位與非-人類物種的可變功能部位融合，來產製人類化抗體。可在美國專利第6,054,297 號、5,886,152號和5,877,293號中找到如何製造人類化抗體的實· 例。

’’嵌合型抗體"一詞，意指含有一或多個得自一個抗體之區域，和一或多個得自一或多個其他抗體之區域的抗體。在較佳的具體實施例中，一或多個CDRs衍生自人類抗-(IL-1 、IL-li*、IL-18、IL-18r、TNF、TNFr 或 TACE)抗體。在更佳的具體實施例中，所有的CDRs均衍生自人類抗- (IL-1、IL-lr、IL-18、 IL-18r、TNF、TNFr或TACE)抗體。在另一個較佳的具體實施例中，在嵌合型抗體中混合並配對得自一個以上人類抗-(IL-1 、IL-lr、IL-18、IL-18r、TNF、TNFr 或 TACE)抗體的 CDRs。例如，嵌合型抗體可包括將得自第一個人類抗-(IL-1、IL-lr、IL-18 -51 - 200302107 發锔說明續頁 (47) 、IL-18r、TNF、TNFr或TACE)抗體之輕鏈的CDR1，與得自第二個人類抗- (IL-1、IL-lr、IL-18、IL-18r、TNF、TNFr 或 TACE)抗體之輕鏈的CDR2和CDR3混合，而得自重鏈的CDRs則可衍生自第三個抗-(IL-1、IL-lr、IL-18、IL-18r、TNF、TNFr 或 TACE)抗體。此外，架構區可衍生自相同的抗- (IL-1、IL-lr、IL-18、IL-18r、TNF 、TNFr或TACE)抗體之一，衍生自一或多個不同的人類抗體，或衍生自人類化抗體。

M中和抗體”或”抑制抗體”為抑制IL-1、IL-18、TNF或TACE與 IL-li*、IL-18r或TNFr結合的抗體，此時過量的抗-(11^1、11^11·、 IL-18、IL-18r、TNF、TNFr 或 TACE)抗體，降低了 IL-1、IL-18 或 TNF 與IL-lr、IL-18r或TNFr結合的含量至少大約20%。在較佳的具體實施例中，抗體降低了結合的含量至少40%，更佳的是 60%，再更佳的是80%，或再更佳的是85%。可藉著熟諳此藝者已知的任何方法，來測量結合作用的降低，例如在活體外的競爭性結合測定中進行測量。

在本文中使用的’’表面等離子體激光共振” 一詞，意指在光感應器矩陣内，藉著檢測在蛋白質濃度上的變化，例如使用 BIAcore 系統（Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway， N.J.)，容許分析即時之生物專一性交互作用的光學現象。至於進一步的說明，參見Jonsson, U·,等人（1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson，U·，等人（1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson，B,，等人（1995) J· Mol. Recognit. 8:125-131 ;以及 Johnsson，B·，等人（1991) Anal. Biochem. 198:268-277。 K。，一詞意指抗體從抗體/抗原複合物中解離的離開速 -52- 200302107 (48) 發明說明續頁率常數。 ” Kd n —詞意指特定之抗體-抗原交互作用的解衰 π抗原決定位"一詞包括任何能夠專一結合免或Τ-細胞受體的蛋白質決定位。抗原決定位通常具有化學活性的表面集合所組成，像是胺基酸g 且通常具有特定的三維結構特徵，以及特定的1 當解離常數S 1 μΜ，較佳的是S 100 nM，且最好是，便說該抗體專一地與抗原結合。可由熟諳此藝者依據本說明書的教導，迅速地或免疫球蛋白分子的片段或類似物。較佳的片段之胺基-和羧基-終端，出現在功能性之功能部位近。可藉著比較核甞酸及/或胺基酸序列資料與專利的序列資料庫，來確認結構和功能性的功能好是使用電腦化的比較方法，來確認出現在具有及/或功能之其他蛋白質中的序列特色或預期的形。確認折疊成已知之三維結構的蛋白質序列的已知的。Bowie 等人 Science 253:164 (1991)。較佳的胺基酸取代是下列那些：（1)降低對蛋白的感受性，（2)降低對氧化作用的感受性，（3)改變質複合物的結合親和力，（4)改變結合親和力，以或修改這類類似物的其他物理化學或功能特性。包括天然存在之肽序列以外的序列的各種突變i ，可在天然存在的序列中（最好是在形成分子間能部位（們）以外的多肽部分中），進行單一或多 i常數。疫球蛋白由分子之 ,糖側鏈，荷特徵。 S 10nM 時製備抗體或類似物邊界的附公開的或部位。最已知結構蛋白質構方法亦是水解作用形成蛋白及（5)賦與類似物可卜白。仿4噙口接觸之功個胺基酸

-53 - 200302107 發明說_績頁 (49) 取代（最好是保留性胺基酸置換）。保留性胺基酸置換不應實質上改變親代序列的結構特徵（例如，置換的胺基酸不應具有打破在親代序列中出現之螺旋，或瓦解親代序列特有之其他類型的二級結構的傾向）。在蛋白質，結構和分子的原則（Proteins, Structures and Molecular Principles) (Creighton，編輯， W.H· Freemanand Company, New York (1984));蛋白質結構的介紹 (Introduction to Protein Structure) (C. Branden 和 J. Tooze 編輯，Garland

Publishing, New York, N.Y. (1991));以及丁homton 等人 Nature 354:105 (1991) 中描述了此項技藝公認之二級和三級結構的實例，將其以引用的方式併入本文中。當在本文中使用時，20個傳統的胺基酸及其縮寫係依據傳統的用法。參見免疫學-合成（Immunology-A Synthesis)(第2版， E.S. Golub 和 D.R· Gren 編輯，Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)) ，將其以引用的方式併入本文中。20個傳統胺基酸的立體

異構體（例如D-胺基酸）、非天然的胺基酸，像是α-，α-二經取代的胺基酸、Ν-烷基胺基酸、乳酸和其他非傳統的胺基酸，亦可為本發明之多肽的適當組份。非傳統胺基酸的實例包括·· 4-羥基脯胺酸、γ-羧基穀胺酸、ε-Ν，Ν，Ν-三甲基離胺酸、ε -Ν·乙醯基離胺酸、0-磷酸絲胺酸、Ν-乙醯基絲胺酸、Ν-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5·羥基離胺酸、s-N-甲基精胺酸，以及其他類似的胺基酸和亞胺基酸（例如4-羥基脯胺酸）。在本文中使用的多肽符號法中，左手方向為胺基終端的方向，而右手方向為羧基-終端的方向，係根據標準用法和習慣。 ’ -54- 200302107 發明說明續頁 (50) 在本文中提及之多核甞酸，意指長度至少10個鹼基的核甘酸之聚合物形式，包括核糖核苷酸或脫氧核甞酸，或任一類型之核甞酸的修改形式。該名詞包括單和雙股形式的 DNA 〇

在本文中使用的π經過分離的多核甞酸π —詞，應意指基因組的、cDNA或合成起源的多核苷酸，或其某種組合，憑藉著其起源，該"經過分離的多核荅酸”（1)是未與在自然界中發現該”經過分離之多核嘗酸π的全部或一部分多核甞酸結合的，（2)是以可操作之方式與在自然界中未與其連接之多核甞酸連接的，或（3)並未以較大序列的一部分之形式出現在自然界中。

在本文中提及的”寡核甞酸” 一詞，包括天然存在的和經過修改的核芬酸，藉著天然存在和非-天然存在的寡核茹酸鍵結連接在一起。寡核茹酸為多核茹酸亞組，通常包括 200個鹼基之長度或更少。較佳的寡核嘗酸為10至60個鹼基長，且最好是12、13、14、15、16、17、18、19或20至40個鹼基長。寡核荅酸通常是單股的，例如探針；雖然寡核站酸亦可以是雙股的，例如在建構基因突變種時所使用的。本發明之寡核甞酸可以是有意義或反義的寡核嘗酸。在本文中提及的π天然存在的核钻酸π —詞，包括脫氧核糖核站酸和核糖核荅酸。在本文中提及的”經過修改之核荅酸’’ 一詞，包括帶有經過修改或取代之糖基團及其類似物的核芬酸。在本文中提及的”寡核荅酸鍵結π —詞，包括諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯〇5 - 200302107 (51) I發明說明續頁

(phosphoroselenoate)、二石西代鱗酸 g旨（phosphorodiselenoate)、硫代苯胺石粦酸酯（phosphoroanilothioate)、醯苯胺轉酸醋（phosphoraniladate)、鱗醢胺酸醋（phosphoroamidate)之類的寡核芬酸鍵結，及其類似物。參見，例如 LaPlanche 等人，Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec 等人，J.Am· Chem· Soc. 106:6077 (1984); Stein 等人，Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon 等人，Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon 等人， Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach » % 87-108 頁（F.Eckstein ，編輯，Oxford University Press，Oxford England (1991)) ; Stec 等人，美國專利第 5，151，510 號；Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)，將其揭示内容以引用的方式併入本文中。如果需要，寡核荅酸可包括可供檢測的標記。

除非另行指定，單股之多核甞酸序列的左手端為5’端；並將雙股之多核甞酸序列的左手方向稱為5f方向。將新生 RNA轉錄本的5f至3’加入方向，稱為轉錄方向；將在DNA股上，具有與RNA相同的序列，且其為7對著RNA轉錄本y端的序列區，稱為”上游序列”；將在DNA股上，具有與RNA 相同之序列，且其為3’對著RNA轉錄本3’端的序列區，稱為 '’下游序列’’。 ”以可操作之方式連接的”序列，包括與感興趣之基因相鄰的表現控制序列，以及以反向作用，或在遠處控制感興趣之基的表現控制序列兩者。在本文中使用的”表現控制序列π —詞，意指多核站酸序列，其為影響與它連接之密碼序列的表現和加工所必需的。表現控制序列包括適當的轉錄開始、中止、啟動基因和促進子序列；有效的RNA加 -56- 200302107 (52) 發明說明續頁

工信號，像是接合和聚腺茹酸化作用信號；使細胞質mRNA 穩定的序列；促進轉譯效力的序列（也就是Kozak —致序列） ;促進蛋白質穩定性的序列；在需要時，還有促進蛋白質分泌的序列。這類控制序列的性質，依據宿主生物而有所不同；在原核生物中，這類控制序列通常包含啟動基因、核糖體結合部位，以及轉錄中止序列。在真核生物中，這類控制序列通常包含啟動基因和轉錄中止序列。”控制序列”一詞企圖至少包括對於表現和加工而言，其存在是必要的所有組份，且亦可包括其存在是有利的額外組份，例如前導序列和融合夥伴序列。

在本文中使用的π載體’’ 一詞，企圖意指能夠運送已經與其連接之其他核酸的核酸分子。一種類型的載體為”質體” ，其意指環狀的雙股DNA環，可將額外的DNA斷片連接到其中。其他類型的載體為病毒載體，其中可將額外的DNA 斷片連接到病毒的基因組内。某些載體能夠在導入它們的宿主細胞中自動複製（例如具有細菌之複製起點的細菌載體，和附加體的哺乳動物載體）。其他的載體（例如，非-附加體的哺乳動物載體）在導入宿主細胞内時，可被整合到宿主細胞的基因組内，並藉此與宿主細胞的基因組一起複製。此外，某些載體能夠指揮以可操作之方式與其連接之基因的表現。在本文中將這類載體稱為π重組的表現載體π (或簡單地稱為π表現載體"）。一般而言，表現載體在重組DNA技術中的使用，通常是以質體之形式。在本說明書中，可交替使用”質體”和”載體”，因為質體是最常使用的 -57- 200302107 (53) 發明說明續頁載體形式。然而，本發明亦企圖包括這類表現載體的其他形式，像是病毒載體（例如，具有複製缺陷的逆轉錄病毒、腺病毒和腺病毒伴隨病毒），其提供相等的功能。

在本文中使用的"重組的宿主細胞”（或簡單地用”宿主細胞π) —詞，企圖意指已經在其中導入重組表現載體的細胞。請瞭解這類名詞不僅企圖意指特定的主題細胞，還有這類細胞的子代。因為某些修改可能在後繼的世代中出現，歸因於突變或環境的影響，這類子代事實上可能與親代細胞不是相同的，但仍包含在於本文中使用之π宿主細胞π 一詞的範圍内。

在本文中提及的”選擇性地雜交π —詞，意指可檢測且專一的結合。根據本發明，多核荅酸、寡核茹酸及其片段，在將對非專一核酸之可檢測結合的可察知含量減至最少的的雜交和沖洗條件下，與核酸股選擇性地雜交。可使用 "高嚴格度”或π高度嚴格的’’條件，達到在此項技藝中已知的，並在本文中討論的選擇性雜交條件。"高嚴格度”或" 高度嚴格的π條件，是培養多核芬酸與其他多核荅酸的方法，其中可將一個多核嘗酸固定在固體表面上，像是膜，在6Χ SSPE或SSC，50%甲醯胺，5Χ登哈特氏（Denhardfs)試劑，0.5% SDS，100微克/毫升變性的、碎裂的鮭精DNA的雜交緩衝溶液中，在42°C的雜交溫度下12-16小時，接著在55°C下使用IX SSC，0.5% SDS的沖洗緩衝溶液沖洗兩次。亦參見Sambrook等人，在前，第9.50-9.55頁。如果在兩個胺基酸序列之間是部分或完全相同的，則這 -58- 200302107 發明說明續頁 (54)

兩個序列是同種的。例如，85%同種性意指當為了最大配合而將兩個序列排成一直線時，85%的胺基酸是相同的。在最大相配時，容許有間隙（在兩個待配之序列的任一個中）；5或更少之間隙長度是較佳的，而2或更少之間隙長度是更佳的。或者最好是，如果兩個蛋白質序列在使用具有突變資料矩陣和6或更大之間隙罰點的ALIGN程式時，具有5以上的排列分數（按標準偏差單位），則按照在本文中使用的該名詞，這兩個蛋白質序列（或衍生自其，具有至少30個胺基酸之長度的多肽序列）便是同種的。參見Dayhoff, Μ.〇.，在 Atlas of Protein Sequence and Structure，第 101-110 頁（第 5 冊， National Biomedical Research Foundation (1972))和該冊的附錄 2，第 1-10 頁中。兩個序列或其一部分，如果在使用ALIGN程式進行最佳排列時，其胺基酸是大於或等於50%相同的，則它們是更佳同種的。

在本文中使用的”與..一致’’ 一詞，意指多核甞酸序列是與全部或一部分的參考多核荅酸序列相同的，或多肽序列是與參考多肽序列相同的。相反的，在本文中使用的”與.. 互補π，意指互補的序列是與全部或一部分的參考多核荅酸序列相同的。舉例來說，核荅酸序列π TATAC"與參考序列 ’’ TATAC” 一致，並與參考序列n GTATA”互補。使用下列的名詞來說明在兩個或多個多核荅酸或胺基酸序列之間的序列關係：”參考序列””比較窗π、’’序列同一性”、”序列同一性的百分比"，和”相當大的同一性”。”參考序列π為已定義之序列，用來作為序列比較的基礎；參 -59- 200302107 _ ⑼ I發明說明續頁

考序列可以是較大序列的亞組，例如，在序列一覽表中提供之全長cDNA或基因序列的斷片，或可包括完整的cDNA 或基因序列。一般而言，參考序列是至少18個核甞酸或6 個胺基酸長，通常是至少24個核甞酸或8個胺基酸長，且經常是至少48個核甞酸或16個胺基酸長。因為兩個多核菩酸或胺基酸序列，可分別（1)包括在兩個分子之間類似的序列（也就是完整多核Ϋ酸或胺基酸序列的一部分），且（2)尚可包括在兩個多核嘗酸或胺基酸序列之間有差異的序列，故通常藉著在”比較窗”上比較兩個分子的序列，來進行在兩個（或多個）分子之間的序列比較，以便確認和比較局部區域的序列類似性。在本文中使用的π比較窗，’，意指具有至少18個相鄰核芬酸位置或6個胺基酸的一個概念上的斷片，其中可將多核甞酸或胺基酸序列與具有至少18個相鄰核嘗酸或6個胺基酸序列的參考序列做比較，且其中該多核荅酸序列在比較窗中的部分，可包括與參考序列（其不包括添加或刪除）相比較，20%或更低的添加、刪除、取代及其類似物（也就是間隙），以便最適切地排列這兩個序列。可藉著Smith和Waterman的局部同種性演算法Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)，藉著Needleman和Wunsch的同種性排列演算法 J. Mol. Biol. 48:443 (1970)，藉著 Pearson 和 Lipman 的搜尋類似性方法 Proc. Natl. Acad· Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988)，藉著這些演算法的電腦化安裝（在Wisconsin遺傳學套裝軟體7.0發行版本（Genetics Computer Group，575 Science Dr” Madison，Wis.)、Geneworks 或 Mac Vector 套裝軟體中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或藉著檢閱， -60- 200302107 發明說明續頁 (56) 進行排列比較窗的序列最適切排列，藉著所選擇的各種方法產生最佳的排列（也就是在比較窗上，產生最高百分比的同一性）。

”序列同一性”一詞，意指兩個多核：y：酸或胺基酸序列在比較窗上是相同的（也就是以一個核甞酸一個核荅酸地，或一個殘基一個殘基地為基礎）。π序列同一性的百分比π 一詞，係藉著在比較窗上，比較兩個以最適切之方式排列好的序列，判定在兩個序列中，在該處出現相同核酸鹼基 (例如A、Τ、C、G、U或I)或殘基之位置的數目，產生相配位置的數目，將相配位置的數目除以在比較窗中的位置總數（也就是窗的大小），並將結果乘以100來計算之，而產生序列同一性的百分比。在本文中使用的”相當大的同一性" 一詞，代表多核荅酸或胺基酸序列的特徵，其中該多核荅酸或胺基酸，在至少18個核甞酸（6個胺基酸）位置的比較窗上，通常是在至少24-48個核苷酸（8-16個胺基酸）位置的窗上，與參考序列相比較時，包括具有至少85%序列同一性，較佳的是至少90至95%序列同一性，更佳的是至少98% 序列同一性，更常見的是至少99%序列同一性的序列，其中該序列同一性的百分比，係藉著在比較窗上，比較參考序列與可包括總共佔參考序列20%或更少之刪除或添加的序列來計算之。參考序列可以是較大序列的亞組。當應用在多肽上時，”相當大的同一性’’ 一詞意指兩個肽序列，當以最適切之方式排列時，像是藉著程式GAP或 BESTFIT，使用預設間隙重時，共享至少80%序列同一性，較 -61 - 200302107 發明說明續頁 (57)

佳的是至少90%序列同一性，更佳的是至少95%序列同一性，再更佳的是至少98%序列同一性，而最佳的是至少99%序列同一性。最好是不相同的殘基位置，其差異在於保留性胺基酸置換。保留性胺基酸置換，意指具有類似側鏈之殘基的可互換性。例如，一群具有脂肪族側鏈的胺基酸是甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸和異亮胺酸；一群具有脂肪族-羥基側鏈的胺基酸是絲胺酸和蘇胺酸；一群具有含-醯胺之側鏈的胺基酸是天冬醯胺和穀胺醯胺；一群具有芳香族側鏈的胺基酸是苯丙胺酸、酿胺酸和色胺酸；一群具有鹼性側鏈的胺基酸是離胺酸、精胺酸和組胺酸；而一群具有含-硫之側鏈的胺基酸是半胱胺酸和甲硫胺酸。較佳的保留性胺基酸置換群是：纈胺酸-亮胺酸-異亮胺酸、苯丙胺酸-酷胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-顯胺酸、穀胺酸-天冬胺酸，以及天冬酿胺-穀胺醯胺。

如同在本文中所討論的，.企圖在本發明中包括在抗體或免疫球蛋白分子之胺基酸序列上的次要變化，其限制條件為該在胺基酸序列上的變化，維持至少75%，更佳的是至少80%、90%、95%，而最好是99%。特定而言，期待保留性胺基酸置換。保留性置換是發生在其側鏈有相互關係之胺基酸家族中的那些。通常將在遺傳學上編碼的胺基酸分成下列家族：（1)酸性的=天冬胺酸、穀胺酸；（2)驗性的=離胺酸、精胺、組胺，（3)非-極性的=丙胺fe、纟頡胺、党胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲较胺酸、色胺酸 ;以及（4)不帶電荷極性的=甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺 -62- 200302107 發明說明續頁 (58)

、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。更佳的家族為：絲胺酸和蘇胺酸是脂肪族-羥基家族；天冬醯胺和穀胺醯胺是含-醯胺的家族；丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸和異亮胺酸是脂肪族家族；且苯丙胺酸、色胺酸和酪胺酸是芳香族家族。例如，可合理的預期分別以異亮胺酸或纈胺酸置換亮胺酸，以穀胺酸置換天冬胺酸，以絲胺酸置換蘇胺酸，或以在結構上相關的胺基酸進行胺基酸的類似置換，對於之所得分子的結合或特性，將沒有重大影響，尤其是如果該置換並未涉及在架構部位内的胺基酸。可藉著測定該多肽衍生物的比活性，迅速地判定該胺基酸改變是否產生有功能的肽。在本文中將詳細說明該測定。在本文中使用的”標記”或”標示’f 一詞，意指在抗體中併入其他的分子。在一個具體實施例中，該標記為可檢測記號，例如併入放射性標示的胺基酸，或附接生物素基化部

分的多肽，其可藉著已經作記號的抗生物素蛋白來檢測（例如，含有螢光標記或酵素活性的鏈黴菌抗生物素蛋白，其可藉著光學或比色的方法來檢測）。在另一個具體實施例中，該標記或記號可以是治療用的，例如藥物共軛物或毒素。在此項技藝中已知各種標示多肽和糖蛋白的方法，並均使用。可供多肽使用之標記的實例，包括但不限於下列的：放射性同位素或放射性核素（例如3H、14C、15N、35S、9QY 、99Tc、ulIn、125I和mI)，螢光標記（例如FITC、若丹明、鑭系金屬憐光體（lanthanide phosphors)，酵素標記（例如辣根過氧化酶、β-半乳糖嘗酶、蟲螢光素酶、驗性鱗酸酶），化學發光 •63 - 200302107 (59) I發明說明續頁

的記號，生物素基的基團，可被二級報告者認出的預定多肽抗原決定位（例如亮胺酸拉鍊對序列、二級抗體的結合部位、金屬結合功能部位、抗原決定位標籤），磁性製劑，像是釓螯合劑，毒素，像是百曰咳毒素，紫杉醇（taxol)、細胞鬆弛素B (cytochalasin B)、短桿菌肽D (gramicidin)、溴化乙錠、吐根驗、絲裂黴素、依托泊奋（etoposide)、替尼泊嘗（tenoposide) 、長春新驗（vincristine)、長春花鹼、秋水仙素、阿黴素（doxorubicin) 、道諾紅菌素（daunombicin)、二經基鄰氨基苯甲酸（anthracin)二酮、米托蒽S昆（mitoxantrone)、光神黴素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因（procaine)、丁卡因（tetracaine)、利多卡因（lidocaine)、普萘洛爾（propranolol)和嘌吟黴素，及其類似物或同系物。在一些具體實施例中，藉著各種長度的間隔臂來附接標記，以便降低可能的立體位阻。在本文中使用的π製劑"一詞，代表化學化合物，化學化合物的混合物，生物學的大分子，或用生物學材料製成的

萃取物。患者一詞包括人類和獸醫學的個體。在本文中使用的π藥學製劑或藥物”一詞，意指當適當地投予患者時，能夠引起想要之治療效果的化學化合物或組合物。在本文中，根據此項技藝中的傳統用法來使用其他的化學名詞，像是 McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker，S. ，編輯，McGraw-Hill, San Francisco (1985)，以引用的方式併入本文中）舉例說明的。 π投藥”意指投予第一個製劑，並在該製劑正成為具有活 -64- 200302107 發明說明續頁 (60) 性的，或仍具有活性時，投予第二個製劑；兩個製劑中任一個都可以先投予，並可同時投予兩個製劑。例如，可藉

先投予IL-1加工和釋放抑制劑，然後在該IL-1加工和釋放抑制劑達到其在哺乳動物體液中之最高濃度的時間之前或之内，投予TACE抑制劑，或藉著先投予IL-1加工和釋放抑制劑，然後投予TACE抑制劑，或藉著與TACE抑制劑一起投予IL-1加工和釋放抑制劑，來完成將IL-1加工和釋放抑制劑和TACE抑制劑投予哺乳動物的工作。在本文中使用的”烷基” 一詞，除非另行指示，包括具有直鏈、分支或環狀部分的飽和單價之碳氫基團，或其組合。在本文中使用的”烷氧基π —詞，包括Ο烷基，其中π烷基 π如同上文之定義。

在本文中使用的π環烷基’’ 一詞，包括（C3-C14)單-、二-和三 -環的飽和碳氫化合物，可視需要被1至2個選自由羥基、氟、氯、三氟甲基、（crc6)烷氧基、（CVC10)芳氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基和（crc6)烷基所組成之群的取代基取代。最好是以羥基取代環烷基。在本文中使用的”芳基π —詞，除非另行指示，包括藉著移除一個氫而衍生自芳香族碳氫化合物的有機基團，像是苯基或莕基，可視需要被1至3個選自由氟.、氯、三氟曱基、（CrC6)烷氧基、（C6-C1())芳氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基和（CrC6)烷基所組成之群的取代基取代。在本文中使用的’’雜芳基” 一詞，特別是（c5-c9)，除非另行指示，包括藉著移除一個氫而衍生自芳香族雜環化合物（例 -65 - 200302107 (61) I發明說明續頁

如5至9個成員的單或二環，含有一或多個雜原子）的有機基團，像是说p定基、吱喃基、p各基、嗜吩基、異嗜σ坐基、咪σ坐基、苯并咪咬基、四σ坐基、ρ比畊基、喊啶基、4琳基、異喹啉基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噻吩基、口比唆基、W味基、異嗓基、嗓呤基、叶吐基、異4 σ坐基、嗜咬基、π号σ坐基、苯并ρ塞峻基或苯并崎。坐基，可視需要被1至2個選自由氟、氯、三氟甲基、（Q-C6)烷氧基、（C6-C10) 芳氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基和（C「C6)烷基所組成之群的取代基取代。在本文中使用的π醯基π —詞，除非另行指示，包括通式 RCO之基團，其中R為烷基、烷氧基、芳基、芳烷基或芳烷氧基，且”烷基π或’’芳基ff 一詞如同上文之定義。在本文中使用的π醯氧基π —詞，包括〇-醯基基團，其中，，醯基”如同上文之定義。

在本文中使用的π以引用·的方式併入本文中"，意指不僅併入該參考文獻的本文和圖解，還有該參考文獻的優先權、分類、亞類和特定的具體實施例。實施方式本發明針對包括抑制介白素-1 (IL-1)及/或IL-18增殖之製劑和腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑之組合的組合物，其係用來治療炎症，包括風濕性關節炎。 IL-1/18反應之增殖的抑制劑，包括可溶性的[L-1/18受體；對IL-1、IL-lr、IL-18和L-18r的抗體；IL-lra多肽和IL-丨工和釋放抑制劑，較佳的是IL-1加工和釋放抑制劑。TNF抑制劑包括 -66- 200302107 (62) 發明說明續頁可溶性TNF受體、TNF抗體（對TNF或其受體），以及TACE抑制劑，特別是TACE抑制劑。這些組合提供了意料之外的協同效果，係歸因於這些細胞激動素的生物學效應，雖然重疊，但是不相同的。 IL-lra

IL-Ira多I太和類似物是此項技藝中已熟知的，且熟諳此藝者瞭解如何製造並使用它們來治療疾病。在本發明中使用的多肽，包括但不限於在下列參考文獻中描述的那些。最佳的IL-lra是安納金雷（Kineret®)。美國專利第5,872,095號，5,874,561號和5,824,549號描述了使用 IL-1受體拮抗劑蛋白質治療疾病的方法，以及產製IL-1受體拮抗劑蛋白質的方法。為了在本文中充分陳述的各種目的，將美國專利第5,872,095號，5,874,561號和5,824,549號完整地以引用的方式併入本文中。

美國專利第5,874,561號描述了各種IL-1受體拮抗劑蛋白質，以及製造它們的方法，和使用它們的治療方法。為了在本文中充分陳述的各種目的，將美國專利第5,874,561號完整地以引用的方式併入本文中。美國專利第5,455,330號描述了特定種類的IL-1受體拮抗劑蛋白質，以及製造它們的方法，和使用它們的治療方法。為了在本文中充分陳述的各種目的，將美國專利第5,455,330 號完整地以引用的方式併入本文中。美國專利第5,075,022號描述了 IL-lm的結構、特性和製造方法，特別是它相對應的DNA序列。為了在本文中充分陳述 -67- 200302107 _ (63) 發明說明續頁的各種目的，將美國專利第5,075,022號完整地以引用的方式併入本文中。

在本發明中有用的較佳多肽，包括美國專利第5,863,769號的序列識別2號之多肽，為了在本文中充分陳述的各種目的，將其完整地以引用的方式併入本文中。特佳的是在本文中描述的成熟IL-lraP多肽，其與一般的人類IL-lra之差異在於它併入N-終端的甲硫胺酸。此外，與美國專利第 5,863,769號之序列識別2號的多肽或相關部分具有至少80% 同一性的多肽亦是有效的，而更佳的是具有至少85%同一性，再更佳的是至少90%，且再更佳的是與美國專利第 5,863,769號之序列識別2號的多肽具有至少95%同一性。

有用的IL-lrap多肽可以是π成熟π蛋白質的形式，或可以是諸如融合蛋白質之類的較大蛋白質的一部分。通常有利的是包括額外的胺基酸序列，其含有分泌或前導序列，前-序列，有助於純化的序列，像是多個組胺酸殘基，或在重組產製期間，給與穩定性的額外序列。因此，在本發明中特別有用的多肽，包括具有至少與美國專利第5,863,769號的序列識別2號或其片段相同之胺基酸序列的多肽，與相對應的美國專利第5,863 J69號的序列識別 2號之片段有至少80%同一性。所有的這些多肽，最好保留了 IL-lrap的生物活性，包括抗原性。在該群中，包括已定義之序列和片段的變體。較佳的變體是藉著保留性胺基酸置換，而與參考物有所不同的那些—也就是以具有類似特徵的另一個殘基來取代某個殘基的那些。代表性的這類取代 -68- 200302107 (64) 發明說明續頁作用是在Ala、Val、Leu和lie之中；在Ser和Thr之中；在酸性殘基Asp和Glu之中；在Asn和Gin之中；以及在驗性殘基Lys和Arg 之中；或芳香族殘基Phe和Tyr之中。特佳的是其中以任何組合取代、刪除或添加數個、5-10、1-5或1-2個胺基酸的變體。

可以任何適當的方式，製備在本發明中特別有用的 IL-lmP多肽。這類多肽包括經過分離的天然存在之多肽、重組產製的多肽、以合成方式產製的多肽，或藉著這些方法之組合來產製的多肽。製備這類多肽的方法為此項技藝中已完全瞭解的。

在本發明中有用的其他較佳之多肽，亦包括如同上述，但額外地與一或多個聚合部分共軛的IL-Ira多肽，其保護該 IL-Ira多肽免於可能在動物之腸道中、在動物的血流或其他細胞外環境中，或在動物之細胞内發生的酵素降解作用。可用來與本發明之IL-Ira共軛的較佳聚合部分，是所謂的直線和分支聚乙二醇化作用試劑，像是在美國專利第5,681，811 號和5,932,462號中描述的那些，為了在本文中充分陳述的各種目的，將兩者完整地以引用的方式併入本文中。在PCT 公開案WO 97/28828中徹底地描述了聚乙二醇化的IL-lra多肽。將聚合部分與蛋白質共軛的方法，為此項技藝中已熟知的，並描述在例如上文在該段落中陳述的專利，以及聚 (乙二醇）化學：生物技術和生物醫學應用（Poly (Ethylene Glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications) J.M. Harris 編輯 ’Plenum， NY，1992 中。 -69- 200302107 (65) 發明說明續頁 IL- lsr 在美國專利第5,081,228號；5，180,812號；5,767,064號和再發證的RE 35,450 ;以及歐洲專利公開案EP 460,846中描述了可溶性 IL-1受體（IL-lsr)、其製備方法和含有它的醫藥組合物。 IL-18

在國際公開案 WO 99/37772, WO 00/56771 和 WO 01/58956，以及歐洲專利公開案EP 864,585和EP 974,600中描述了 IL-18，包括其受體及對抗它的抗體和可溶性受體（IL-18sr)。介白素抗體亦可根據 XenoMouse™ 技術，製備對抗 IL-1、IL-lr、IL-18 或 11^181* 的單株抗體。

XenoMouse™是一種經過設計的老鼠品系，其包括大片段

的人類免疫球蛋白位點，並在老鼠抗體產製上是有缺陷的。參見，例如 Green 等人 Nature Genetics 7:13-21 (1994)，以及 1990 年 1月12曰申請之美國專利申請案第07/466,008號，1990年11月8 曰申請之07/610,515號，1992年7月24日申請之07/919,297號，1992 年7月30曰申請之07/922,649號，1993年3月15曰申請之08/031,801 號，1993年8月27日申請之08/112,848號，1994年4月28日申請之 08/234,145 號，1995 年 1 月 20 曰申請之 08/376,279 號，1995 年 4 月 27 曰申請之08/430,938號，1995年6月5曰申請之08/464,584號，1995 年6月5曰申請之08/464,582號，1995年6月5曰申請之08/463,191 號，1995年6月5曰申請之08/462,837號，1995年6月5日申請之 08/486,853 號，1995 年 6月 5 日申請之 08/486,857 號，1995 年 6 月 5 曰申請之08/486,859號，1995年6月5日申請之08/462,513號，和1996 -70- 200302107 (66) 發明說明續頁年10月2曰申請之08/742,752號；以及美國專利第5,916,771號’ 5,939,598 號，5,985,615 號，5,998,209 號，6,075，181 號 ’ 6,091,001 號’ 6，114,598號和6，130,364號。亦參見1991年7月25曰發布的W〇 91/10741，1994年2月3日發布的WO 94/02602，兩者皆在1996年10 月31日發布的WO 96/34096和WO 96/33735，1998年4月23日發布的 WO 98/16654，1998 年 6 月 11 日發布的 WO 98/24893，1998 年 11 月 12

日發布的 WO 98/50433，1999 年 9 月 10 日發布的 WO 99/45031 ’ 1999 年10月21日發布的W〇99/53049，2000年2月24曰發布的WO 00/09560，和 2000 年 6 月 29 日發布的 WO 00/037504。設計帶有酵母菌人造染色體（YACs)的XenoMouse™品系，其分別含有人類重鏈位點和A：輕鏈位點的245 kb和190 kb-尺寸之生殖種系組態片段，其含有核心可變和恆定區序列。同上。XenoMouse™產生類似-成人之完整人類抗體的人類節目

，並產製抗原-專一的人類Mabs。經由導入百萬鹼基尺寸的人類重鏈位點和κ輕鏈位點之生殖種系組態YAC片段，第二代的XenoMouse™含有大約80%的人類抗體節目。參見 Mendez 等人 Nature Genetics 15:146-156(1997)，Green Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)，以及1996年12月3日申請之美國專利申請案第08/759,620號，將其揭示内容完整地以引用的方式併入本文中。在其他的具體實施例中，包括人類免疫球蛋白基因位點的非-人類動物是具有人類免疫球蛋白之”迷你位點 (minilocus)π的動物。在迷你位點的方法中，經由包含得自Ig 位點的各別基因，來模仿外源的Ig位點。因此，在插入動 -71 - 200302107 (67) I發明說明續頁物的構築體中，形成一或多個VH基因、一或多個DH基因，一或多個JH基因，mu恆定區和第二個恆定區（最好是γ恆定區）。特別在美國專利第5,545,807號，5,545,806號’ 5,625,825號， 5,625，126 號，5,633,425 號，5,661，016 號，5,770,429 號，5,789,650 號， 5,814,318 號，5,591，669 號，5,612,205 號，5,721，367 號 ’ 5,789,215 號和 5,643,763號中描述了該方法，以引用的方式併入本文中。

迷你位點法的優點是用它來產製包含部分Ig位點之構築體，並導入動物内的迅速。然而，迷你位點法的潛在缺點，是其可能沒有足夠的免疫球蛋白歧異性，來支持充分的B-細胞發育，使其可能具有較低的抗體產生。

在其他的具體實施例中，本發明藉著免疫包括人類免疫球蛋白位點的非-人類之基因轉殖動物。提供包括得自非-人類、非-老鼠動物之IL-1、IL-lr、IL-18或IL-18r抗體的組合。可使用在美國專利第5,916,771號，5,939,598號，5,985,615號， 5,998,209 號，6,075，181 號，6,091，001 號 ’ 6，114,598 號和 6，130,364 號中描述的方法’來產製這類動物。亦參見1991年7月25日發布之WO 91/10741，1994年2月3日發布之WO 94/02602，兩者皆在1996 年10月31日發布之WO 96/34096和WO 96/33735，1998年4月23曰發布之 WO 98/16654，1998 年 6 月 11 日發布之 WO 98/24893 ’ 1998 年 11 月12日發布之WO 98/50433，1999年9月10日發布之WO 99/45031 ，1999年10月21日發布之WO 99/53049，2000年2月24日發布之 W〇00/09560，和2000年6月29日發布之WO 00/037504。可按照在美國專利第5,994,619號中的描述，修改在這些專利中揭示的方法。在較佳的具體貫施例中，非-人類動物可以疋大乳 -72 - 200302107 發明說^續頁 (68) 、綿羊、豬、山羊、牛或馬。非-融合瘤宿主細胞及重組產製蛋白質的方法

可使用編碼IL-1、IL-lr、IL-18或IL-18r抗體的核酸分子，和包括這些抗體的載體，來轉化適當的哺乳動物宿主細胞。可藉著任何將多核苷酸導入宿主細胞的已知方法來轉化。將異種多核苷酸導入哺乳動物細胞内的方法，是此項技藝中已熟知的，並包括葡聚糖-調節的轉移感染、磷酸鈣沉澱法、海美溴胺（polybrene)-調節的轉移感染、原生質體融合、電穿透作用、將多核甞酸（們）包膠在微脂類中，以及將DNA直接顯微注射至核内。此外，可藉著病毒載體將核酸分子導入哺乳動物細胞内。轉化細胞的方法為此項技藝中已熟知的。參見，例如美國專利第4,399,216號，4,912,040號，4,740,461號和4,949,455號（將這些專利以引用的方式併入本文中）。

可用來作為表現宿主的哺乳動物細胞株，為此項技藝中已熟知的，並包括許多可獲自美國典型培養物收集中心 (American Type Culture Collection) (ATCC)的永存不死之細胞株。這些特別包括中國倉鼠卵巢（CHO)細胞、NSO、SP2細胞、HeLa 細胞、幼倉鼠腎臟（BHK)細胞、猴子腎臟細胞（COS)、人類肝細胞癌細胞（例如Hep G2)、A549細胞和許多其他的細胞株。經由判定該細胞株具有高的表現程度，而選出特佳的細胞株。其他可使用的細胞株為昆蟲細胞，像是Sf9細胞。當將編碼抗體基因的重組表現載體導入哺乳動物宿主細胞内時，藉著培養該宿主細胞一段足以容許在該宿主細胞中表 -73 - 200302107 發明說明續頁 (69) 現抗體的時間，來產製抗體，或更佳的是將該抗體分泌至宿主細胞在其中生長的培養基中。可使用標準蛋白質純化方法，從培養基中回收抗體。此外，可使用許多已知的技術，增強從生產細胞株中表現本發明之抗體（或得自其的其他部分）。例如，穀胺醯胺

合成酶基因表現系統（GS系統），是在某些條件下增強表現的常用方法。關於歐洲專利第0 216 846號，0 256 055號和0 323 997 號，以及歐洲專利公開案第89303964.4號，完整地或部分地討論了 GS系統。基因轉殖動物

亦可以基因轉殖的方式，經由產製基因轉殖感興趣之免疫球蛋白重和輕鏈序列的哺乳動物或植物，並從其中產製可回收形式之抗體，來產製本發明組合的抗體。關於在哺乳動物中轉殖基因的產製，可從山羊、牛或其他哺乳動物中產製並回收抗體。參見.，例如美國專利第5,827,690號、 5,756,687號、5,750，172號和5,741,957號。在一個具體實施例中，利用IL-1、IL-lr、IL-18或ΙΙ^18γ，或其片段免疫包括人類免疫球蛋白位點的非-人類基因轉殖動物。可使用在美國專利第 5,916,771 號，5,939,598 號，5,985,615 號，5,998,209 號，6,075，181 號，6,091，001號，6，114,598號和6，130,364號中描述的方法，來產製這類基因轉殖的動物。亦參見1991年7月25日發布之WO 91/10741，1994年2月3日發布之WO 94/02602，兩者皆在1996年10 月31日發布之WO 96/34096和WO 96/33735，1998年4月23日發布之 WO 98/16654，1998 年 6月 11 日發布之 W〇 98/24893，1998 年 11 月 -74- 200302107 (70) 發明說明續頁 12 日發布之 WO 98/50433, 1999 年 9 月 10 日發布之 WO 99/45031，1999 年10月21日發布之WO 99/53049，2000年2月24日發布之WO 00/09560，和2000年6月29日發布之WO 00/037504。在其他的具體實施例中，基因轉殖的動物可包括人類免疫球蛋白基因的 π迷你位點’’。可按照特別是在美國專利第5,994,619號中的描述，來修改上文揭示的方法。在較佳的具體實施例中，非-人類動物可以是大鼠、綿羊、豬、山羊、牛或馬。在另一個具體實施例中，基因轉殖的動物包括編碼抗-(IL-1、IL-lr· 、IL-18或IL-18r)抗體的核酸分子。在較佳的具體實施例中，基因轉殖的動物包括編碼對IL-1、IL-lr、IL-18或IL-18r專一之重和輕鏈的核酸分子。在其他的具體實施例中，基因轉殖的動物包括編碼經過修改之抗體，像是單鏈抗體、嵌合型抗體或人類化抗體的核酸分子。可在任何基因轉殖的動物中，製造抗-(IL-1、IL-k、IL-18或IL-18r)抗體。在較佳的具體實施例中，非-人類的動物為老鼠、大鼠、綿羊、豬、山羊、牛或馬。 g莖菌體展示庫除了在本文中揭示的抗- (IL-1、IL-lr、IL-18或IL-18r)抗體之外，可藉著篩選重組的综合抗體庫，最好是使用從衍生自人類淋巴細胞之mRNA製備的人類VL和VH cDNAs所製備的 scFva莖菌體展示庫，來分離本發明之重組的抗- (IL-i、IL-lr 、IL-18或IL-18r)人類抗體。製備和篩選這類庫的方法學，為此項技藝中已知的。有產製嘆菌體展示庫的市售套組（例如，Pharmacia重組的噬菌體抗體系統，目錄第27-9400-01號； 200302107 (71) 發明說明續頁以及Stratagene SuefZAP™嘆菌體展示套組，目錄第號240612號）。亦有其他的方法和試劑，可用來產製和篩選抗禮展示庫

(參見，例如Ladner等人美國專利第5,223,409號；Kang等人PCT 公開案第WO 92/18619號；Dower等人PCT公開案第w〇 91/17271 號；Winter 等人 PCT 公開案第 WO 92/20791 號；Markland 等人 PCT 公開案第WO 92/15679號；Breitling等人PCT公開案第WO93/01288 號；McCafferty 等人 PCT 公開案第 WO 92/01047 號；Garrard 等人 PCT 公開案第 WO 92/09690 號；Fuchs 等人（1991) Bio/Technology 9:1370-1372 ;Hay 等人（1992) Hum. Antibod· Hybridomas 3:81-85 ; Huse 等人（1989) Science 246:1275-1281; McCafferty 等人，Nature(1990) 348:552-554; Griffiths 等人（1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins 等人（1992) J. Mol. Biol. 226:889-896 ; Clackson 等人（1991) Nature 352:624-628 ; Gram 等人（1992) Proc. Natl.

Acad· Sci· USA 89:3576-3580 ; Garrad 等人（1991) Bio/Technology 9:1373-1377 ;

Hoogenboom 等人（1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137 ;和Barbas 等人（1991)

Proc· Natl· Acad. Sci. USA 88:7978-7982。

在較佳的具體實施例中，欲分離具有想要特徵的人類抗- (IL-1、IL-lr、IL-18或IL-18r)抗體，首先使用在本文中描述的人類抗-(IL-卜 IL-lr、IL-18 或 IL-18r)抗體，來選擇對 IL-1、IL-lr·、IL-18 或IL-18r具有類似結合親和力的人類重和輕鏈序列，使用在 1"1〇(^6111)〇〇111等人，？(：丁公開案第貿0 93/06213號中描述的抗原決定位銘記法。在該方法中使用的抗體庫，最好是按照在 McCafferty 等人，PCT 公開案第 WO 92/01047 號，McCafferty 等人， Nature (1990) 348:552-554 和 Griffiths 等人（1993) EMBO J 12:725-734 中之描述來製備和篩選的scFv庫。最好是使用人類IL-卜IL-lr、IL-18 -76- 200302107 (72) 發明說明續頁或IL-18r作為抗原，來篩選scFv抗體庫。

一旦選出了最初的人類VL和VH斷片，便進行"混合和相配π實驗，其中針對IL-1、IL-lr、IL-18或IL-18r結合作用，來篩選不同對的最初選出之VL和VH斷片，選出最佳的VL/VH對組合。此外，欲進一步改善抗體的品質，可隨機地使較佳 VL/YH對（們）的VL和VH斷片發生突變，最好是在VH及/或VL 之CDR3區域内，以類似在活體内，在天然免疫反應期間内，負責抗體之親和力成熟的體細胞突變過程的過程。可藉著使用分別與VH CDR3或VL CDR3互補的PCR引子，擴大VH 和VL區域，來完成這種在活體外的親和力成熟作用，已經在某些位置，利用四個核茹酸鹼基的隨機混合物’’釘住” 該引子，使得所得的PCR產物編碼其中已經將該隨機突變導入VH及/或VL CDR3區域内的VH和VL斷片。可針對與IL-1 、IL-lr、IL-18或ΙΙ^18γ的結合作用，再蒒選這些隨機的VH和 VL斷片。

在從重組的免疫球蛋白展示庫中篩選和分離本發明的抗- (IL-l、IL-lr、IL-18或IL-18r)抗體之後，可從展示包裝（例如從噬菌體基因組中）回收編碼所選出之抗體的核酸，並藉著標準重組DNA技術，在其他表現載體内繼代選殖。如果想要，可進一步操縱核酸，按照下述產生本發明的其他抗體形式。欲表現藉著篩選综合庫所分離之重組的人類抗體，將編碼該抗體之DNA選殖到重組的表現載體内，並按照上述導入哺乳動物宿主細胞内。種類轉變 -77- 200302107 (73) I發明說明續頁

本發明的其他觀點是提供可將一類的抗-(IL-1、IL-lr、IL-18 或IL-18r)抗體轉變為另一類的技巧。在本發明的一項觀點中，使用此項技藝中已熟知的分離編碼VL或VH的核酸分子，使其不含任何編碼CL或CH的核酸序列。然後以可操作之方式，將編碼VL或VH之核酸分子與編碼得自其他種類免疫球蛋白分子之CL或CH的核酸序列連接。這可使用包括CL或CH鏈的載體或核酸分子來完成，如同上述。例如，可將最初是IgM的抗-(IL-1、IL-lr、IL-18或IL-18r)抗體種類轉變為IgG。此外，可使用種類轉變將一種IgG亞類轉變為另一種，例如從IgGl至IgG2。抗體衍生物可使用上述的核酸分子，使用熟諳此藝者已知的技術和方法，來產製抗體衍生物。人類化抗體

如同上文關於人類抗體產製所討論的，產製具有降低之免疫原性的抗體是有利的。這可使用人類化作用之技術，以及展示技術，使用適當的庫，而達到某種程度。應瞭解可使用此項技藝中已熟知的技術，將老鼠抗體或得自其他物種的抗體人類化或靈長動物化。參見，例如Winter和Harris Immunol Today 14:43-46 (1993)，和 Wright 等人 Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992)。可藉著重組DNA技術，以相對應的人類序列取代CHI、CH2、CH3、絞鏈功能部位及/或架構功能部位，來設計感興趣的抗體（參見W〇92/02190，和美國專利第 5,530,101 號、5,585,089 號、5,693,761 號、5,693,792 號、5,714,350 號、 -78 - 200302107 (74) 發明說明續頁 5,777,085 號）。突變抗體

在其他的具體實施例中，可使用核酸分子、載體和宿主細胞來製造突變的抗-(IL-1、IL-lr、IL-18或IL-18r)抗體。可在重及/或輕鏈的可變功能部位中，使抗體發生突變，改變該抗體的結合特性。例如，可在一或多個CDR區域中製造突變，增加或降低該抗體對於IL-1、IL-lr、IL-18或IL-18I·的Kd ，增加或降低KQff，或改變該抗體的結合專一性。指定位置之突變生成作用的技術，為此項技藝中已熟知的。參見，例如Sambrook等人和Ausubel等人，在前。在較佳的具體實施例中，可在已知與抗-(IL-1、IL-lr、IL-18或IL-18r)抗體之可變區中的生殖種系相比較，已經改變的胺基酸殘基上製造突變。可在架構區或恆定功能部位中製造突變，增加抗-(IL-1 、IL-lr、IL-18或IL-18r)抗體的半衰期。參見，例如1999年8月 17曰申請之美國專利申請案第09/375,924號，以引用的方式併入本文中。亦可在架構區或恆定功能部位中製造突變，改變該抗體的免疫原性，提供共價或非-共價結合另一個分子的位置，或改變諸如補體固定之類的特性。可在單一突變之抗體中的架構區、恆定功能部位和可變區中，分別製造突變。或者，可僅在單一突變之抗體中的一個架構區、可變區或恆定功能部位中製造突變。在一個具體實施例中，與在突變之前的抗-(IL-卜IL-lr、IL-18 或IL-18r)抗體相比較，在已突變之抗- (IL-1、IL-lr、IL-18或IL-18r) 抗體的VH或VL區域中，沒有超過10個胺基酸改變。在更佳 -79- 200302107 發明說明續頁 (75) 的具體實施例中，在已突變之抗- (IL-1、IL-lr、IL-18或IL-18r) 抗體的VH或VL區域中，沒有超過5個胺基酸改變，更佳的是不超過3個胺基酸改變。在另一個具體實施例中，在恆定功能部位中沒有超過15個胺基酸改變，更佳的是不超過 10個胺基酸改變，再更佳的是不超過5個胺基酸改變。 IL· ：[加工和釋放抑制劑 ICE抑制劑

美國專利第 5,656,627 號、5,847，135 號、5,756,466 號、5,716,929號和 5,874,424號揭示了數類的ICE抑制劑化合物，其特徵在於氫-鍵結、忌水性和帶負電部分的組態，以便與ICE受體部位結合。這些專利揭示了特定ICE抑制劑與細胞激動素之抑制劑和拮抗劑的普通組合，但並未揭示或暗示ICE抑制劑和TNF抑制劑之組合，其提供本發明之組合物和方法的意外協同效果。

本發明的一個具體實施例提供治療之組合物和方法’使用包括TNF抑制劑和一或多個美國專利第5,656,627號、 5,847,135 號、5,756,466 號、5,716,929 號和 5,874,424 號之 ICE 抑制劑化合物的組合物。為了在本文中充分陳述的所有目的，將美國專利第 5,656,627 號、5,847，135 號、5,756,466 號、5,716,929 號和 5,874,424號完整地以引用的方式併入本文中。美國專利第5,585,357號揭示了一種經取代的吡唑ICE抑制劑。本發明的一個具體實施例提供治療之組合物和方法，使用包括TNF抑制劑和一或多個美國專利第5,585,357號之 ICE抑制劑化合物的組合物。為了在本文中充分陳述的所 -80- 200302107 (76) I發明說明續頁有目的，將美國專利第5,585,357號完整地以引用的方式併入本文中。美國專利第5,434,248號揭示了一種肢基酸icE抑制劑。本發明的一個具體實施例提供治療之組合物和方法，使用包括TNF抑制劑和一或多個美國專利第5,434,248號之ICE抑制劑化合物的組合物。為了在本文中充分陳述的所有目的，將美國專利第5,434,248號完整地以引用的方式併入本文中。美國專利第5,462,939號和5,585,486號揭示了一種肽基酮ICE 抑制劑。本發明的一個具體實施例提供治療之組合物和方法，使用包括TNF抑制劑和一或多個美國專利第5,462,939號和5,585,486號之ICE抑制劑化合物的組合物。為了在本文中充分陳述的所有目的，將美國專利第5,462,939號和5,585,486 號完整地以引用的方式併入本文中。美國專利弟5,411，985號揭不了作為ICE抑制劑的γ-p比喃嗣-3-乙酸。本發明的一個具體實·施例提供治療之組合物和方法，使用包括TNF抑制劑和γ-吡喃酮-3-乙酸的組合物。為了在本文中充分陳述的所有目的，將美國專利第5,411，985號完整地以引用的方式併入本文中。美國專利第5,834,514號揭示了一種作為ICE抑制劑的鹵甲基醯胺。本發明的一個具體貫施例提供治療之組合物和方法，使用包括TNF抑制劑和一或多個美國專利第5,834,514號之ICE抑制劑化合物的組合物。為了在本文中充分陳述的所有目的，將美國專利第5,834,514號完整地以引用的方式併入本文中。 -81 - 200302107 (77) 發明說明續頁美國專利第5,739,279號揭示了一種作為ICE制劑的4-胺基-2,2-二氟-8-氧基]，6-己二酸之肽基衍生物。本發明的一個具體實施例提供治療之組合物和方法，使用包括TNF抑制劑和一或多個美國專利第5,739,279號之ICE抑制劑化合物的組合物。為了在本文中充分陳述的所有目的，將美國專利第 5,739,279號完整地以引用的方式併入本文中。

美國專利第5,843,904號揭示了一種肽基ICE抑制劑。本發明的一個具體實施例提供治療之組合物和方法，使用包括 TNF抑制劑和一或多個美國專利第5,843,904號之ICE抑制劑化合物的組合物。為了在本文中充分陳述的所有目的，將美國專利第5,834,904號完整地以引用的方式併入本文中。美國專利第5,670,494揭示了一種經取代之^密症ice抑制劑。本發明的一個具體實施例提供治療之組合物和方法，使用包括TNF抑制劑和一或多個美國專利第5,67〇,494號之ICE 抑制劑化合物的組合物。為了在本文中充分陳述的所有目

的’將美國專利第5,670,494號完整地以引用的方式併入本文中。美國專制劑。本利第5,744,451號揭示了一種經取代之穀胺酸ICE抑發明的一個具體實施例提供治療之组合物和方法，使用包括TNF抑制劑和一或多個美國專利第5,744,451號之 ICE抑制劑化合物的組合物。為了在本文中充分陳述的所有目的，將美國專利第5,744,451號完整地以幻用的方式併入本文中。美國專利第5,843,9〇5號揭示了一種經取代之穀胺酸ice抑 •82- (78) 200302107 制劑。本發明的一個具體實施例提供治療之組合物和方法，使用包栝TNF抑制劑和一或多個美國專利第5,843,905號之 ICE抑制劑化合物的組合物。為了在本文中充分陳述的所有目的，將美國專利第5,843,905號完整地以引用的方式併入本文中。

美國專利第5,565,430號揭示了一種作為ICE抑制劑的氮雜天冬胺酸類似物。本發明的一個具體實施例提供治療之組合物和方法，使用包括TNF抑制劑和一或多個美國專利第 5,565,430號之ICE抑制劑化合物的組合物。為了在本文中充分陳述的所有目的，將美國專利第5,弘5,430號完整地以引用的方式併入本文中。

美國專利第5,552,400號和5,639,745號揭示了一種稠合-二環内醯胺ICE抑制劑。本發明的一個具體實施例提供治療之組合物和方法，使用包括TNF抑制劑和一或多個美國專利第5,552,400號和5,639,745號之ICE抑制劑化合物的組合物。為了在本文中充分陳述的所有目的，將美國專利第5,552,400 號和5,639,745號完整地以引用的方式併入本文中。 IL-1刺激結合之韓譯後加工和釋放抑制劑在上文中描述了在本發明之組合中有用的IL-1刺激結合之轉譯後加工和釋放抑制劑。特別適用於本發明方法和組合物的IL-1加工和釋放抑制劑是二芳基磺醯脲（DASU)化合物。可根據在1998年7月30日申請之PCT公開案WO 98/32733中描述的方法，來製備這類化合物。2000年2月8日發證之美國專利第6,022,984號提及製備DASU化合物的其他方法。2001 -83 - 200302107 _ (79) 發明說明續頁年3月22日發布之國際專利申請案WO 01/19390提及IL-1RA與 DASU抑制劑白勺组合。2001年10月10日和2001年6月28日分別申請之美國臨時申請案60/328,254和60/301,712，提及以DASU抑制劑治療動脈粥樣硬化。與這些DASU化合物有關的是 DASU結合蛋白質（DBPs)，其調節這些製劑的細胞激動素之抑制活性。可使用DBPs篩選具有特有結構的藥物，其可瓦解刺激-結合的轉譯後加工。亦可使用與DBPs結合的化合物，作為治療炎症性病症的治療劑。在1998年8月31日申請之美國臨時專利申請案第60/098,448號中描述了 DBPs。熟諳此藝者應瞭解可製備針對DASU結合蛋白質的抗體，並將對上述的DASU抑制劑具有類似的活性。為了在本文中充分陳述的所有目的，將前述專利、公開案和申請案分別以引用的方式併入本文中。 TNF抑制齋j TNF抑制劑包括可溶性TNF受體（TNFsr)、對抗TNF的抗體和 TACE之抑制劑。在本發明中有用的市售TNF抑制劑包括艾坦賽特（安布瑞（Enbrel)®)、因福西美（瑞密塞德®)、CDP-870和艾得理默（D2E7)。在美國專利第5,698,195號和5,656,272號中描述了艾坦賽特，以及說明其產製和使用的方法。在國際專利公開案W〇97/29131號中描述了艾得理默，以及說明其產製和使用的方法。在歐洲專利公開案120694、460167和5165,785 中，描述了產製諸如CDP-870之類的人類化抗體的方法。 TNFsr (可溶性TNF受體，例如艾坦賽特）是細胞激動素級聯阻斷劑。在活體内，其反映與引起激動劑TNF之誘發相同 -84- 200302107 _ (80) 發明說明續頁

的誘發事件而產生，像是創傷、敗血症和胰臟炎。其為單一的分子。可以二聚體的形式產製重組體分子（rTNFsr)，藉此增加受體-配體親和力大約100倍。天然存在之分子的解離系數為ΗΓ7，而重組二聚體的解離系數為1CT11 (Oppenheim等人，1993)，藉此在作為治療劑時，需要比天然存在之分子更少的劑量。此外，二聚體結構導致在活體内增加半衰期至27小時，容許每天投藥1次（Mohler，1994)。然而，在實行本發明時，可使用任何降低分子之解離系數的其他方法。在美國專利第 5,395,760 號、5,712，155 號、5,945,397 號、5,344,915 號和再發證的RE 36,755中，描述了艾坦賽特，以及說明其產製和使用的方法。在歐洲專利公開案第422,339號和美國專利第6,143,866號中，描述了其他的TNF抑制劑，包括其製備方法，其亦描述了聚乙二醇化和糖基化的變體。 TACE抑制劑

在兩者皆在2000年2月24日發布的國際專利公開案WO 00/09485和WO 00/09492，以及2001年3月7日發布之歐洲專利公開案EP 1，081，137號中，描述了 TNF-ot轉變酵素（TACE)抑制劑，及其製備和使用的方法。在美國專利第5,830,742號中描述了其他的TACE抑制劑。 TNF抗體可藉著類似上述關於製備IL-1、IL-lr、IL-18或IL-18I*抗體的那些方法，來製備TNF、TNFr、TNFbp或TACE的其他抗體。將每個前述的專利、公開案和申請案，完整地以引用的 <85 - 200302107 (81) 發明說明續頁方式併入本文中。

已知僅阻斷IL-1/IL-18或TNF的作用，足以明顯地在大鼠中抑制風濕性關節炎的炎症反應，並在狒狒中抑制敗血性休克。在嚆齒類關節炎中，已經證實在正遭受由肽聚糖-多醣（PG/PS)引起之再激活關節炎的大鼠中，藉著僅投予IL-ka 或TNFbp，最大地抑制了關節腫脹。在敗血性休克中，藉著單獨投予IL-lra或TNFbp，以類似的程度保護利用大腸桿菌攻毒的狒狒，對抗致死和血液動力學的改變。然而，意外的是，利用根據本發明之IL-1/IL-18抑制劑和 TNF抑制劑的組合，治療正遭受LPS-再激活之關節炎的大鼠，對關節腫脹引起協同的抑制效果。下文的實例描述證實本發明之組合（也就是利用IL-1/18抑制劑和TNF抑制劑），對於治療IL-1/18和TNF-調節之炎症疾病，像是關節炎、成人呼吸緊迫徵候群（ARDS)和敗血症之協同效果的方法。該組合在活體内的協同效果

可使用藉著兩種微生物組份（脂多醣（LPS)和肽聚糖多醣 (PG/PS))引起之風濕性關節炎的動物模式，來判定組合治療對關節炎之治療的效果。根據R.L· Wilder，在Immunggathoeenetic Mechanisms of Arthritis，第9章，標題為”慢性關節炎的實驗動物模式（Experimental Animal Models of Chronic Arthritis) ” 中，關於鏈球菌細胞壁-誘導之關節炎，"實驗性關節疾病的臨床、組織學和放射線學特徵，與在成人和兒童關節炎中觀察到的密切相似（Clinical, histological and radiological features of the experimental joint disease closely resemble those observed in adult and juvenile arthritis) -86- 200302107 (82) 發明說明續頁根據下列代表性的實驗，可使用在Schwab, Experimental Medicine， 1688-1702,（1987)中描述的動物模式，在正常大鼠的跗關節引起關節炎。簡言之，藉著連續投予兩種微生物組份：（1) 首先關節内注射含有肽聚糖多醣（PG/PS)的鏈球菌細胞壁 (SCW)產物，並（2)在21天之後，靜脈内注射得自鼠傷寒沙門氏桿菌的脂多醣（LPS)，引起關節炎。

欲在靜脈内注射LPS之後的72小時期間内，評估炎症的程度，在再激活關節炎之後的0、24、36、48和72小時時，測量足踝關節的直徑。

在關節炎的再激活期間，對關節腫脹的發展，測試在單獨和混合投予IL-1/18抑制劑和TNF抑制劑的效果。在相對於靜脈内注射LPS的時間0、2、6、12、18、24、30、36和42小時處，在頸部的頸背處皮下投予抑制劑和媒劑。亦參見Williams, R.〇·，Marinova-Mutafchieva，L·, Feldmann，Μ·，和 Maini，R.N.，2000，’丨在膠原蛋白-誘導之關節炎中，評估TNF-a和IL-1阻斷，並與混合的抗- TNF-a/抗-CD3 治療相比較（Evaluation of TNF-a and IL-lblockade in collagen- induced arthritis and comparison with combined anti-TNF-a/anti-CDS therapy)’’，J. Immunology, 165:7240-7245; Feige, U.，Hu, Y.-L·，Gasser，J·， Campagnuolo, G.，Munyakazi，L.，以及 Bolon, B·，1999,，’’ 抗-介白素-1 和抗-腫瘤壞死因子-a在Lewis大鼠中協同地抑制了佐劑關節炎(Anti- interleukin-1 and anti-tumor necrosis factor-a synergistically inhibit adjuvant arthritis in Lewis rats)n, Cell. Mol. Life Sci., 57:1457-1470 ;以及 Joosten， L.A. B., Helsen，Μ·Μ·Α·，Saxne，T·，van de Loo, F.A.J·，Heinegard，D·,和 Van den Berg, W.B.，1999, ” IL-lab阻斷，在老鼠第II型膠原蛋白-誘導的關 -87- 200302107 發明k明續頁 (83) 節炎中防止了軟骨和骨骼的破壞，而TNF-a阻斷僅改善關節的炎症（IL- lab blockade prevents cartilage and bone destruction in murine type II collagen-induces arthritis, whereas TNF-ablockade only ameliorates joint inflammation)' J. Immunology, 163:5049-5055 o ATP誘導IL-la、IL-Ιβ或IL-18釋放的抑制作用

從100毫升使用LSM (Organon Teknika)分離之血液中純化單核細胞。以20毫升培養基（RMI 1640, 5%FBS, 1%青黴素/鏈黴素， 25 mM HEPES，pH 7.3)稀釋肝素化的血液（在每個50毫升的注射筒中，加入1.5毫升1000單位/毫升之注射用肝素，得自 Apotheconis)。在50毫升圓錐形聚丙烯離心管中，使30毫升經

過稀釋的血液在15毫升LSM (Organon Teknika)上分出層次。在室溫下，在台上型Sorvall離心機中，以1200rpm離心該試管30分鐘。移出位在血漿和LSM界面的單核細胞，以培養基稀釋，達到50毫升之終體積，並按照上文藉著離心收集之。拋棄上清液，並以50毫升培養基沖洗細胞小球2次。在第2次沖洗之前，取出10微升懸浮細胞的試樣進行計數；以該計數為基礎，以培養基稀釋經過沖洗的細胞，達到2.0χ10ό個細胞/毫升的終濃度。在96孔培養盤的各孔中，加入〇.1毫升的細胞懸浮液。容许單核細胞附著2小時，然後藉著抽吸移除未-附著的細胞 ’並以100微升培養基沖洗已附著的細胞兩次。在各孔中加入100微升培養基，並在37°C下，在5%二氧化碳恆溫箱中 ’培養該細胞過夜。第2天，在各孔中加入25微升的50毫微克/毫升LPS (在培養 •88- 200302107 (84) 發明諫明績貪基中），並在37°C下激活細胞2小時。

如下製備受試製劑溶液。以二甲亞砜稀釋IL-1加工和釋放抑制劑，至1〇 _之終濃度。從該母液中，首先按1:5〇稀釋IL-1加工和釋放抑制劑[5微升的1〇 mjy[母液+ 245微升的 Chase培養基（rpmi 1640, 25mM Hepes，pH6.9，1%FBS, 1%青黴素 / 鏈黴素’ 10毫微克/毫升LPS和5 mM碳酸氫鈉）]至200 μΜ之濃度。藉著將10微升的200 μΜ IL-1加工和釋放抑制劑加至90微升的Chase培養基中，製備第二次的稀釋。以100微升Chase培養基沖洗經LPS-激活的單核細胞1次，然後在各孔中加入1〇〇微升Chase培養基（含有〇·2%二甲亞砜）。在適當的孔中，加入0.011微升的受試製劑溶液，並在37乞下培養該單核細胞3〇分鐘。在此時，藉著加入12微升20 mM母液 (利用氫氧化鈉預先調整到pH 7·2)，導入2mM ATP，並在37°C 下培養該細胞額外3小時。

在Sorvall台上型離心機中，以2〇〇〇rpm離心該96-孔培養盤1〇分鐘，移除細胞和細胞碎屑。移出每個上清液的90微升等分’並移至96孔圓底培養盤中，離心該盤2次，以便確保移除所有的細胞碎屑。將30微升所得的上清液加至亦含有 70微升PBS、1% FBS之IL-Ιβ ELISA盤的孔中。在4°C下培養該 ELISA盤過夜。依據套組的指示，執行elISA (R& D Systems)。數據計尊和分析 : 按對照組百分比，計算在Chase培養基試樣中之IL-Ιβ免疫反應性的含量，它等於在受試化合物孔在450毫微米處之光密度與在ELISA上的試劑空白孔在450毫微米處之光密度 •89- 200302107 (85) 發明說明續頁之間的差異，和在僅以0.2%二甲亞颯處理之細胞在450毫微米處之光密度與試劑空白孔在450毫微米處之光密度之間的差異之商數的100倍：對照組％ = {(X-B) / (TOT-B)} X 100，其中 X=受試化合物孔的OD450毫微米；B=在ELISA上之試劑空白孔的OD450毫微米；TOT=僅以0.2%二甲亞砜處理之細胞的 OD450。 Θ血液為基礎之細胞激動素的產製測定：在含有肝素的真空採血管（vacutainer tube)中，從正常志願者和RA患者中收集血液；可將這些試樣儲存在冰上高達4小時，對於測定效率並沒有不利的影響。將75微升的血液放在96孔培養盤各別的孔中，並以75微升含有20 mM Hepes，pH 7·3的RPMI 1640培養基稀釋。然後在37°C下，在5% C02的環境中，在有或無LPS (100毫微克/毫升；大腸桿菌血清型〇55:B5

;Sigma Chemicals; St. Louis, MO)之下，培養經過稀釋的血液試樣2小時。在該培養之後，導入作為分泌刺激物的ATP (藉著加入10毫升在20 mM Hepes，pH 7中之100 mM ATP的溶液），並在 37°C下培養該混合物額外2小時。然後以700 X g離心該96-孔培養盤10分鐘，並收獲所得的血漿試樣；將這些試樣儲存在-20°C下。以DMSO將待以IL-1加工和釋放抑制劑之身分評估的受試製劑稀釋成各種濃度，並在加入LPS之前，才稀釋至血液試樣内；在所有試樣中的DMSO媒劑之終濃度為 0.2%。以最少一式三個孔之方式，測定每種條件。在下列的ELISAs中分析血漿上清液·· IL-lb (R&D Systems, Minneapolis，MN) ; IL-18 (MBL Nagoya，Japan) ; TNF(R&D Systems)。依 -90- 200302107 (86) 發明說明續頁據製造者的說明書，進行測定，並以在已知含量之重纟且細胞激動素標準物的存在下，測定效率的比較為基礎，來# 算絕對細胞激動素含量。從該測定中，針對IL-1加工和釋放抑制劑而言，判定全血IC%值為在使絕對細胞激動素各量降低至在沒有任何IL-1加工和釋放抑制劑存在了執行的對照組含量之50%時的血漿濃度。可按照各種不同的劑量投予本發明之化合物，一般而言，本發明之在治療上有效的化合物係以範圍從大約5.0重量 %至大約70重量％之濃度含量的這類劑量形式存在。栓劑通常含有範圍在〇·5重量％到1〇重量％的活性成分；口服調配物最好含有10%至70%的活性成分。在各種已承認的分子生物學手冊中，提供了在下列實例中描述之程序，或適當改變之程序的標準方法，像是，例

如 Sambrook 等人，Molecular Cloning，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987)和 Ausabel 等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates/Wiley Interscience，New York (1990) 〇所有的化學物質為分析級或USP等級。人類膠原蛋白酶-1的抑制作用（重組的膠原蛋白酶-1測定）在本發明中使用該測定來測量膠原蛋白酶-1化合物的效力（IC5〇s)。利用騰蛋白酶激活人類重組的膠原蛋白酶-1。使膝蛋白酶的含量最適於每批的膠原蛋白酶-1，但代表性的反應使用下列的比例：每100毫克膠原蛋白酶5毫克胰蛋白@每。在 -91- 200302107 (87) 發明說明續頁大約20°C至大約25°C下，培養胰蛋白酶和膠原蛋白酶，最好是大約23°C 10分鐘，然後加入5倍過量的（50毫克/10毫克胰蛋白酶）大豆胰蛋白酶抑制劑。在二甲亞颯中製造母液（10 mM)，然後使用下列的計晝稀釋： 10 mM----->120 μΜ---->12 μΜ---->1.2 μΜ---->0.12 μΜ

然後以一式三份，將每種濃度各25微升加至96孔微量螢光盤（microfluor plate)的適當孔中。在加入酵素和受質之後，抑制劑之終濃度將是1:4稀釋。將孔D7-D12設定為陽性對照組（酵素，無抑制劑），並將孔D1-D6設定為陰性對照組（無酵素，無抑制劑）。將膠原蛋白酶-1稀釋至240毫微克/毫升，然後將25毫升加至微量螢光盤的適當孔中。在測定中，膠原蛋白酶之終濃度為60毫微克/毫升。

在二甲亞颯中，將受質（DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys (NMA)-NH2)製成5 mM母液，然後以測定緩衝溶液稀釋成20 μΜ 。藉著在微量螢光盤的各孔中加入50微升受質，得到10 μΜ 之終濃度，開始本測定。在時間0處，然後以大約20分鐘之間隔，取得螢光讀數 (360毫微米激發，460毫微米發射）。在大約20至大約25°C的溫度下進行本測定，最好是大約23°C，而代表性的測定時間為大約3小時。然後對空白和含有膠原蛋白酶之試樣（平均得自一式三份判定的數據），進行螢光對時間的作圖。選擇提供良好 -92- (88) (88)200302107 婆明說明續頁信號（超過空白至少5倍），並在曲線之直線部分（通常在i2〇分鐘附近)上的時間點’來判定％“直。對於每種濃度的每個化合:物，使用0時間作Aή 、， F為二白’亚從12〇分鐘的數據中減去這，值。按照抑制劑濃度對對照組％ (抑制劑勞光除以僅有膠原蛋白酶之螢光χ 100) ’對數據作圖。從所提供之信號為對照組50%的抑制劑濃度，判定ic.。如果所報告之IC5Q低於〇〇3 rnM，$ & 、_u j 此時以〇 3 μΜ、〇〇3 μΜ 和〇〇〇3 μΜ的濃度來測定抑制劑。組的膠屈蛋白醢一測定）在本發明中使用該測定來測量膠原蛋白酶_3化合物的效力（IC5〇s)。在大約37°C下，利用2mM APMA(對-胺苯基乙酸汞）激活人類重組的膠原蛋白酶-3大約2 〇小時，並以測定緩衝溶液(5〇 mM Tris，pH 7.5, 200 mM 氯化鈉，5 mM 氯化鈣 ’ 2〇 mM 氣化鋅，〇〇2% BRU-35)稀釋成大約240毫微克/毫升。在％孔微量螢光盤的各孔中加入25微升經過稀釋的酵素。然後藉著加入抑制劑和受質，以1:4之比例稀釋酵素，在本測定中得到6〇毫微克 /毫升的終濃度。在一甲亞職中製造抑制劑的母液（10 mM)，然後按照人類膠原蛋白酶之抑制作用的每個抑制劑稀釋計畫，以測定緩衝〉谷液稀釋。以一式三份，將每種濃度各25微升加至微量螢光盤中。在本測足中的終濃度為3〇 μΜ、3 μΜ、〇 3 μΜ和〇〇3 μΜ。 -93- 200302107 _ (89) I發明說明續頁按照人類膠原蛋白酶（膠原蛋白酶-1)的抑制作用，製備受質（Dnp-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA)-NH2)，並在各孔中加入50毫升，得到10 μΜ的終測定濃度。在時間0處，和大約每隔5分鐘，取得螢光讀數，持續大約1小時。

按照在膠原蛋白酶-1測定中概述的，設定一式三份的陽性對照組和陰性對照組。按照每個人類膠原蛋白酶（膠原蛋白酶-1)的抑制作用，判定IC5〇。如果所報告之IC5〇低於0.03 mM，此時以 0.3 μΜ、0.03 μΜ、0.003 μΜ 和 0.0003 μΜ 的終濃度來測定抑制劑。聚集蛋白聚糖酶軟骨細胞測定在本發明中使用該測定來測量聚集蛋白聚糖酶化合物的效力（IC5〇s)。

藉著連續的胰蛋白酶和膠原蛋白酶消化作用，接著是膠原蛋白酶消化過夜，從關節軟骨分離原始的豬軟骨細胞，並以2 X105個細胞/孔，將其平舖在以其中帶有5微居里/毫升35S (1000居里/毫莫耳）硫之第一型膠原蛋白塗覆的48孔培養盤中。容許細胞在37°C下，在5% C〇2的氣壓下，將標記併入其蛋白多糖基質内（約1週）。在開始測定前一晚，以DMEM/1% PSF/G沖洗軟骨細胞單層2 次，然後容許在新鮮的DMEM /1% FBS中培養過夜。第二天早上，以DMEM/ 1%PSF/G沖洗軟骨細胞1次。最後的沖洗容許將培養盤放在恆溫箱中，同時進行稀釋。可按照在下文產JL中的描述，使用培養基並進行稀釋。 -94· 200302107 (90) 表1 發明翁明續買: 對照組培養基 IL-1培養基只有DMEM (對照組培養基 DMEM+IL-l (5毫微克/毫升）藥物稀釋在DMSO中，製造10 mM的所有化合物母液。在96孔培養盤中，在DMEM中製造100 μΜ的每種化合物母液。儲存在冰箱中過夜。第2天，利用帶有IL-1的DMEM進行連續稀釋，至 5 μΜ，500 ηΜ 和 50 ηΜ。從孔中吸出最後的沖洗液，並將5〇微升得自以上稀釋之化合物，加至在48孔培養盤之適當孔中的450微升ILel培養基中。終化合物濃度等於500nM，5〇nM和5遍。所有 4樣均以一式二份完成，在每個培養盤上〇 &示培養盤，並僅使用培.養盤~~ 養♦卜Μ叔/ I円側的24個孔。在一個培风上，將數個襴位稱為^ (無藥物）。對这此祖物）和對照組（無IL-1，無 )對以二對照組欄位定期計數，u / 糖的釋放。在孔日^ 以便監視35S-蛋白多礼中加入對照組和Ιτ丨著加入化八物^ 養基（450微升）’接化口物（5〇微升），而得以開妒太，有5% ca氣壓τ Ί如本測定。在37Τ：，帶—W虱&下，培養該盤。當藉著培表# ^ 暴試樣的液相閃爍外赵/τ 釋故時（此時彳曰Α 冲數（LSC)，估計在40-50% ，炊，自1L-1培養基之CPM為f+9^ ，·冬止該測定，丄· 曷對知組培養基的4-5倍）養基， (大约9至大約12小時）並攻在閃螓試管中。加入從所有的孔中移出培閃壤體，並獲得（LSC)放射 -95 - 200302107 (91) 發魂說明續頁性計數。欲促使細胞層溶解，在每孔中加入500微升木瓜蛋白酶消化緩衝溶液（0.2 M Tris，pH 7.0, 5 mM EDTA，5 mM DTT，和 1毫克/毫升木瓜蛋白酶）。在60°C下培養裝有消化溶液的培 ^ 養盤過夜。第2天，從培養盤中移出細胞層，並放在閃燦試管中。然後加入閃爍體，並對試樣計數（LSC)。判定得自出現在各孔中之總和的釋放計數百分比。從每孔中減去以對照組背景進行之一式三份的平均值。以IL-1 試樣為基礎的化合物抑制百分比為0%抑制（總計數的100%)。 φ 可溶性TNF-α產Μ的抑制作用（TACE全血測定）在本發明中使用該測定來測量TACE化合物的效力（IC50s)。藉著下列在活體外的測定，顯示化合物或其在治療上可接受的鹽類，抑制細胞釋放TNF-a的能力，而結果證實其對於治療涉及可溶性TNF-a失調之疾病的效力：

使用單一步驟的Ficoll-hypaque分離技術’從抗凝的人類血液中分離人類單核細胞。（2)以帶有二價陽離子的漢克氏 (Hanks)平衡鹽溶液（HBSS)沖洗單核細胞三次，並以2χ 1〇ό個/ 毫升之密度，再度懸浮於含有1% BSA的HBSS中。使用Abbott Cell Dyn 3500分析器判定差示計數，指出單核細胞佔這些製品中所有細胞的17-24%。將180微升的細胞懸浮液，等分在平底的96孔培養盤 (Costar)中。加入化合物和LPS (100毫微克/毫升終濃度），得到 200微升之終體積。所有條件均以一式三份進行。在大約37 °C下，在潮濕的c〇2恆溫箱中培養大約4小時之後，移出培養盤，並離心（以大約250 xg離心大約⑴分鐘），並移出上清 -96- 200302107 (92) 發明說明續頁液，使用R&D ELISA套組，測定TNF-α。注意到該TACE全血測定，通常所得的值比重組的膠原蛋白酶測定更高約1000倍。因此，具有1000 nM(也就是1 μΜ)之 -· TACE IC5G的化合物，與1 ηΜ之IC5G的膠原蛋白酶是約略等效 >· 的〇 IL-18的抑制作用可根據與在 Wei, X., Leung，B.P., Arthur，H.M.L.，Mclnnes, I.B.，和 Liew, F.Y.，2001，n在缺乏IL-18的老鼠中，降低了膠原蛋白-引起之關節炎的發生率和嚴重性（Reduced incidence and severity of collagen-induced arthritis in mice lacking IL-18)’，，J. Immunology, 166:517-521 ；牙口 Pomerantz，B.J·, Reznikov，L.L·，Harken, A.H·，和 Dinarello，C.A·，2001，n 卡斯蛋白酶1的抑制作用，經由抑制IL-18和IL-lb，降低了人類心月几梗塞的功能障礙（Inhibition of caspase 1 reduceds human myocardial ischemic dysfunction via inhibition of IL-18 and IL-lb)"，Proc. Natl. Acad. Sci., USA，98:2871-2876中描述的那些類似的方法，來測定IL-18。醫藥組合物本發明藉著投予個體有效含量之TNF抑制劑連同IL-1/18 抑制劑（最好是IL-1加工和釋放抑制劑），提供治療（和預防）的方法。該個體最好是動物，包括但不限於諸如牛、豬、雞、靈長動物等等的動物，更佳的是哺乳動物，而最佳的是人類。因為較佳抑制劑的抑制功能，可能由一或多個各別和可分開的部分所給與，故亦想像可藉著投予治療組合物，其具有作為活性成分的一部分或部分的TNF抑制劑或IL-1/18

-97- 200302107 發明說明續頁 (93) 抑制劑，其控制介白素-1/18或TNF抑制作用，來實行本發明之方法。可藉著注射，以非經腸之方式投予本發明之治療組合物，雖然亦想像其他有效的投藥形式，像是關節内注射、吸入的霧、口服的活性調配物、經皮的離子電滲療法，或栓劑。一種較佳的載劑是生理鹽水溶液，但亦可使用其他在藥學上可接受的載劑。

在一個具體實施例中，想像載劑和TNF抑制劑與IL-1/18抑制劑組成在生理學上可相容的、緩慢釋放的調配物。在這類載劑中的主要溶劑，在性質上可以是含水或不-含水的。此外，載劑亦可含有其他在藥學上可接受的賦形劑，以

便修改或維持調配物的pH值、滲透性、黏性、澄清性、顏色、無菌性、穩定性、解離速率或味道。同樣地，載劑仍可含有其他在藥學上可接受的賦形劑，以便修改或維持 TNF抑制劑及/或IL-1/18抑制劑的穩定性，解離、釋放或吸收的速率。這類賦形劑是在調配單一劑量或多重劑量形式之非經腸投藥的劑量時，經常且習慣性地使用的那些物質。一旦已經調配好治療組合物，便可以溶液、懸浮液、凝膠、乳劑、固體或脫水或冷凍乾燥之散劑的形式，將其儲存在無菌的小瓶中。可以隨時使用之形式，或在投藥之前需要先立刻重建的方式，來儲存這類調配物。這類調配物的較佳儲存方式是在至少像一樣低的溫度下，而最好是在-70°C下。這類含有TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑的調配物，也最好是在接近生理學pH值之下儲存和投藥。目前，咸 -98 - 200302107 發明說明續頁 (94) 相信不希望投予高（也就是超過8)或低pH值（也就是低於5) 的調配物。

為了全身性遞送，投予含有TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑之調配物的方式，最好是經由皮下、肌肉内、靜脈内、鼻内，或陰道或直腸栓劑。至於局部遞送，投予含有TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑之調配物的方式，最好是關節内、氣管内，或滴注或吸入至呼吸道。此外，亦可能想要藉著口服在適當調配物或裝置中的TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑，或藉著栓劑或灌腸劑，將TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑投予至消化管的特定部分。

在其他治療TNF和IL-1/18調節之疾病的較佳模式中，投予 TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑的最初靜脈内團塊注射，接著是 TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑的連續靜脈内輸液。著手治療敗血性休克，應該在診斷出敗血症或敗血症的可能性之後儘快開始。例如，可在手術或意外事故，或任何可能帶來發動敗血性休克之風險的其他事件之後，馬上開始治療。治療TNF或IL-1/18調節之疾病，更特定而言，是治療關節炎的較佳方式，包括：（1)按照預防或治療關節炎再發的需要，定期地單次關節内注射TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑；並 (2)定期地皮下注射TNF抑制劑和IL· 1/18抑制劑。治療TNF和IL-1/18調節之疾病，更特定而言，是治療成人呼吸緊迫徵候群的較佳方式，包括：1)單次或多次氣管内投予TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑；並2)團塊或連續靜脈内輸液TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑。 -99- 200302107 發明說明續頁 (95)

亦期待某些將以口服投藥，含有TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑的調配物。當TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑為蛋白質時，最好將以此方式投藥的藥物包膠。可將經過包膠的TNF抑制劑及/或IL-1/18抑制劑，與或不與在調配固體劑量形式時慣用的那些載劑一起調配。最好將膠囊設計成得以在胃-腸道中某一處釋放調配物的活性部分，此時生物利用性最大，而前-全身性降解作用則是最小。可包含其他的賦形劑，以便促進TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑的吸收。亦可使用稀釋劑、香料、低溶點的壌、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑和黏合劑。

關於口服投藥，當TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑是非-肽的 (例如IL-1加工和釋放抑制劑、ICE抑制劑或TACE抑制劑）時，可使用含有各種賦形劑，像是微晶纖維素、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸二鈣和甘胺酸，連同各種崩解劑，像是澱粉 (最好是玉米、馬鈴薯或樹薯澱粉）、藻酸和某些複合矽酸鹽，還有顆粒黏合劑一起，像是聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠和阿拉伯樹膠的鍵劑。此外，為了形成鼓劑之目的，諸如硬脂酸鎂、十二燒基硫酸鋼和滑石之類的潤滑劑，通常是非常有用的。在明膠膠囊中，亦可使用類似類型的固體組合物作為填料；關於這一點，較佳的材料亦包括乳糖或乳糖，以及高分子量的聚乙二醇。當想要口服用的含水懸浮液及/或酏劑時，可將活性成分與各種增甜劑或香料、著色劑或染料混合，且如果想要，還有乳化劑及/或懸浮劑，連同諸如水、乙醇、丙二醇、甘油之類的稀釋劑， •100- 200302107 發明說明續頁 (96) 及其各種可能的組合。投藥亦可以是全身性或局部的。此外，可能想要藉著任何適當的途徑，將TNF抑制劑連同抑制IL-1/18增殖之製劑一起導入發炎的關節中，包括腦室内和椎管内；藉著腦室内導管，有助於腦室内注射，例如與貯液器附接，像是歐麥亞（Ommaya)貯液器。

在特定的具體實施例中，可能想要在需要治療的地方，局部地投予TNF抑制劑連同抑制IL-U18增殖的製劑；這可藉著例如，但不限於在手術期間的局部輸注，局部塗抹，例如在手術之後與傷口敷料一起，藉著注射，藉著導管，藉著栓劑，或藉著植入，該植入是多孔的、非-孔性的，或是膠狀的材料，包括膜，像是唾液酸的（sialastic)膜或纖維而達成。

本發明亦提供包括一或多個答器，裝有一或多種本發明之醫藥組合物的成分的藥學包裝或套組。可視需要使這類容器（們）附帶有通知書，以由管理製藥或生物學製品之製造、使用或販賣的政府機構規定的形式，該通知書表示為了人類投藥，已由該機構批准製造、使用或販賣。因此，本發明的一個較佳的具體實施例提供醫藥組合物，包括TNF抑制劑與IL-1加工和釋放抑制劑或IL-Ira的組合，以及一或多個選自由在藥學上可接受的載劑、在藥學上可接受的賦形劑、濕潤劑、緩衝劑、乳化劑和黏合劑所組成之群的成分。在另一個較·佳的具體實施例中，提供在一或多個容器中 -101 - 200302107 發明說明續頁 (97) 包括TNF抑制劑與IL-1加工和釋放抑制劑或IL-lra之組合的套組。所需之劑量範圍，依據所選出的TNF抑制劑和抑制IL-1/18 增殖的製劑、投藥途徑、調配物之性質、個體狀況的性質，以及負責照顧之臨床醫師的判斷而定。

在某些具體實施例中，設計投藥以便在患者的血流中創造預定的TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑之濃度範圍。咸相信將 TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑的循環濃度維持在每毫升血漿 0.01毫微克以下，可能不是有效的組合物，而超過每毫升 10微克之循環含量的延長維持，則可能具有不想要的副作用。

需要由熟諳此藝者例行地進行更精細的計算，以便判定涉及每個上文提及之調配物的治療之適當劑量，這亦在熟諳此藝者例行進行的技藝範圍内，不需過度的實驗，特別是從在本文中揭示之劑量資訊和測定的觀點來看。可經由使用為了用來判定劑量而已經確立的測定，連同適當的劑量-反應數據，來確定這些劑量。然而，TNF抑制劑適當的每日1次或2次劑量，是在1-1000 微克/公斤個體的範圍内，與50-1200毫克抑制IL-1/18增殖之製劑混合。然而，從各種可利用之化合物和各種投藥途徑之不同效率的觀點來看，預期在所需之劑量上有各式各樣的變化。預期口服投藥將需要比靜脈内注射投藥更高的劑量。可使用最優化的標準經驗慣例，其為此項技藝中已完全暸解 -102- 200302107 (98) 發明說明續頁的，來進行在這些劑量含量上的改變。

可以各種劑量形式，投予包括TNF抑制劑和抑制IL-1/18增殖之製劑的組合物。一般而言，在治療上有效的本發明組合物，在這類劑量形式中，以範圍從大約5.0重量％至大約 70重量％的濃度含量存在。

應注意到在本文中描述的TNF抑制劑和IL-1/18抑制劑調配物，可供獸醫和人類應用使用，而不應以限制之方式解釋’’患者π —詞。在獸醫應用的案例中，劑量範圍應該與上文指定的相同。 TNF抑制劑連同抑制IL-1/18增殖之製劑，可與其他具有生物活性的製劑一起投予。與TNF抑制劑和抑制IL-1/18增殖之製劑混合投予的較佳生物活性製劑，為NSAIDs，特別是COX-2 選擇性抑制劑（例如西樂寇克司（celecoxib)、凡德寇克司 (valdecoxib)、洛福寇克司（rofecoxib)和艾特雷寇克司（etoricoxib))，以及基質金屬蛋白酶。

本發明前面的說明，是為了解釋和說明之目的而舉例說明的。熟諳此藝者應瞭解不達背本發明之精神和範圍的變化和修改是可能的。企圖將下列的申請專利範圍解釋為包括所有的這類變化和修改。 (1)美國專利第5,863,769號之序列識別2號的資訊 (i)序列特徵： (A) 長度：169個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股型：單股 • 103 - 發明說明績頁 200302107 (99) (D)拓樸學：直線 ⑼分子類型：蛋白質 (xi)序列說明：美國專利第5,863,769號之序列識別2號：

MetArgGlyThrProGlyAspAlaAspGIyGIyGlyArgAlaValTyr 15 10 15

GlnSerMetCysLysProlleThrGlyThrlleAsnAspLeuAsnGIn 20 25 30 GInValTrpThrLeuGInGlyGInAsnLeuValAlaValProArgSer 35 40 45

AspSerValThrProValThrValAlaValHeThrCysLysTyrPro 50 55 60

GluAlaLeuGluGinGlyArgGlyAspProlleTyrLeuGlylleGIn 65 70 75 80

AsnProGluMetCysLeuTyrCysGluLysValGlyGluGInProThr 85 90 95

LeuGInLeuLysGluGInLysfleMetAspLeuTyrGlyGInProGlu 100 105 110

ProValLysProPheLeuPheTyrArgAlaLysThrGlyArgThrSer 115 120 125

ThrLeuGluSerValAlaPheProAspTrpPhelleAlaSerSerLys 130 135 140

ArgAspGInProllelleLeuThrSerGluLeuGlyLysSerTyrAsn 145 150 155 160

ThrAlaPheGluLeuAsnlleAsnAsp 165

-104-

Claims

200302107

拾、申請專利範圍 1. 一種治療炎症的組合物，包括定量的IL-1抑制劑與定量的腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑混合，其中兩種組份的含量，對於治療炎症是有效的，以及在藥學上可接受的載劑。 2. —種治療炎症的組合物，包括定量的IL-1抑制劑和定量的IL-18抑制劑，與定量的腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑混合，其中三種組份的含量，對於治療炎症是有效的，以及在藥學上可接受的載劑。 3. 根據申請專利範圍第2項之組合物，其中該IL-1抑制劑係選自由IL-1加工和釋放抑制劑所組成之群。 4. 根據申請專利範圍第3項之組合物，其中該IL-1加工和釋放抑制具有式I · 〇SV〇 f yR2 人 fvJh/ i 或其在藥學上可接受的鹽，其中R1和R2分別為式II之基團

其中斷續線（一-)代表可選擇的雙鍵； η為 0、1、2或 3 ; A、Β、D、Ε和G分別為氧、硫、氮或CR5R6，其中R5和 R6分別選自（1)氫、（2) (Q-Q)烷基，可視需要被一或兩專利範圍續頁個選自（CrC6)烷胺基、（C「C6)烷硫基、（CrC6)虼氧基、輕基、氰基、全氟（CpQ)垸基、（C6-C1())芳基、（Crc9)雜芳基、（C6_Ci〇) 芳胺基、（CVQq)芳疏基、（cvc^o) ^氧基’其中該芳基可視需要被（C「C6)坑氧基、（CpCJSS基、&基、幾基咬齒素取代；（CrC9)雜芳胺基、（CrC9)雜芳硫基、（crc9)雜芳氧基、（C6-C1())芳基（c6-c1G)芳基' (crc6)環烷基、輕基、六氮口比畊基、（C6-C1G)芳基（CrC6)烷氧基、（Crc9)雜芳基（CVC6)虎氧基、（CpC6) s盛胺基、（C1-C6) s篮硫基、（c「C6) 1¾ 氧基、（c「c6) 烷基亞磺醯基、（C0-C1G)芳基亞磺醯基、（CVC6)烷基續醯基、（C6-C1G)芳基磺醯基、胺基、（crc6)烷胺基或（(Crc6)燒基h 胺基之基團取代；（3)鹵素；（4)氰基；（5)胺基；⑹經基；（7)全氟（CrC6)燒基；（8)全氟（CrC6)燒氧基；（9) (C，_C6) 晞基；（10)羧基（Crc6)烯基；（11) (crc6)炔基；（12) (Crc6) 烷胺基；（13) ((CVC6)烷基）2胺基；（14) (CrC6)烷基續醯胺基’（15) (Ci-C6)力元基亞· S显基，（16) (C「C6)、>fe基續酿基；（17) 月i 基％ S篮基，（18) (CrC6)：fe 胺基續 S盈基，（19) ((CrC6)：l：完基），胺基磺醯基；（20) (CrC6)烷硫基；（21) (CrC6)烷氧基；（22)全氟（CVC6)烷基；（23) (C6-C1G)芳基；（24) (CrC9)雜芳基；（25) (C6-C1{))芳胺基；（26) (CVCm)芳硫基；（27) (C6-Cm)芳基（CrC6) 燒氧基；（28) (CrC9)雜芳胺基；（29) (C5-C9)雜芳硫基；（30) (CrC9)雜芳氧基；（31) (CrC6)環烷基；（32) (CrC6)烷基⑽基亞甲基）；（33)六氫吡啶基；（34)吡啶基；（35)噹吩基 ;(36)呋喃基；（37) (CrC6)烷基六氫吡啶基；（38) (CrC6) 醯胺基；（39) (C「C6)醯硫基；（40) (CVQ)醯氧基；（41) R7(Cl-C6) 申請專利範圍續頁烷基，其中R7為（CrC6)醯基N-六氫吡畊基、（C6-C1Q)芳基N-六氫吡畊基、（C5-C9)雜芳基N-六氫吡畊基、（CrC6)烷基N-六氫吡畊基、（C6-C1G)芳基（CrC6)烷基N-六氫吡畊基、（C5-C9) 雜芳基（CrC6)烷基N-六氫吡畊基、嗎啉基、硫代嗎啉基、N-六氫p比ρ定基、N-说p各淀基、六氫p比咬基、（CrC6)燒基六氫吡啶基、（C6-C1G)芳基六氫吡啶基、（C5-C9)雜芳基六氫吡啶基、（Q-C6)烷基六氫吡啶基（crc6)烷基、（C6-C1G)芳基六氫口比啶基（CVC6)烷基、（crc9)雜芳基六氫口比啶基（c「c6) 烷基或（crc6)醯基六氫吡啶基； (42) 或式III之基團 0 v^^(X)t——(CH2)S-^ 111 其中s為0至6 ; t為0或1 ; X為氧或NR8，其中R8為氫、（C「C6)烷基或（CrC7)環烷基 (Q-Q)烷基； Y為氫、羥基、（CrC6)烷基，可視需要被鹵素、羥基或氰基取代；（CrC6)烷氧基、氰基、（CrC6)炔基、（C6-C10) 芳基，其中該芳基基團可視需要被鹵素、羥基、羧基、 (CrC6)燒基、（CrC6)燒氧基、全氟（Q-Q)垸基、（CrC6)烷氧基（CrC6)烷基或NR9R1G取代；其中R9和分別選自由氫和可視需要被（CVC6)烷基六氫吡啶基、（C6-C1G)芳基六氫吡啶基、（c5-c9)雜芳基六氫吡啶基、（C6-C1Q)芳基、（c5-c9)雜芳基或（C3-C6)環烷基取代的（CVC6)烷基所組成之群；六氫 200302107 申請專利範圍續頁口比淀基、（C!-C6)燒基六氮p比淀基、（Cs-CjQ)芳基六氯p比呢基、（C5-C9)雜芳基六氮？比淀基、（CpC6)驢基六氮p比咬基、 (C6-C1G)芳基、（c5-c9)雜芳基、（crc6)環烷基、RH(Crc6)烷基、（CrC5)烷基（CHRUKCi-C^)烷基，其中 R11為羥基、（(^-〇：6)醯氧基、（Crc6)烷氧基、N-六氫吡畊基、（crc6)醯胺基、（Q-C6) 烷硫基、（C6-C1G)芳硫基、（CVQ)烷基亞磺醯基、（c6-c1())芳基亞磺醯基、（CrC6)烷基磺醯基、（C6-Cm)芳基磺醯基、胺基、（C「C6)fe胺基、（(CrC6)坑基）2胺基、（crC6)Si基N-六氫吡畊基、（CVQ)烷基N-六氫吡4基、（C6-C1())芳基（CrC6)烷基N-rr氫卩比p井基、（C5-C9)雜芳基（C「C6)燒基N-六氫？比卩并基

、嗎p休基、硫代嗎4基、N-六氫ρ比咬基或N-说p各淀基； R12(C「C6)烷基、（c「c5)烷基（CHR12)(CrC6)烷基，其中 R12 為六氫吡啶基或（CrC6)烷基六氫吡啶基；以及CH(R13)COR14，其中R14如下文之定義，且R13為氫、（Cl_C6)烷基、（C6-CI0)芳基（Crc6)烷基、（c5-c9)雜芳基（cvc6)烷基、（c「c6)烷硫基 (C「c6)烷基、（c6-c1())芳硫基-(CrC6)烷基、（Ci-Q)烷基亞磺醯基（Crc6)烷基、（cvc1{))芳基亞磺醯基（C|-C6)烷基、（Crc6)烷基^ 基（CrCJfe基、（C^-Ciq)方基績S显基（C「C6)坑基、起基（Crc6)烷基、胺基（crc6)烷基、（crc6)烷胺基（C「C6)烷基、（(CrC6)烷胺基）2(crc6)烷基、R15R16NCO(CrC6)烷基或 R15OCO(CrC6)烷基，其中妙和R16分別選自由氫、（Crc6)烷基、（c6-c1())芳基（crC6)烷基和（c5-c9)雜芳基（C|-C6)烷基所組成之群；且R14為r口〇或R17R1SN，其中R!7和Ris分別選自由氫、（CrC6)烷基、（C6-C1G)芳基（c「c6)烷基和（crc9)雜芳基 •4- 200302107 申請專利範圍續頁 (crc6)烷基所組成之群； (43) 或式IV之基團 R

IV 其中u為0、1或2 ; R19為氫、（CVC6)烷基或全氟（Q-C6)烷基； r2G 為氫、（crc6)烷基、（crc6)羧烷基或（C6-C1G)芳基（c「c6) 烷基； (44) 或式V之基團

V b為0或1 ; c為卜2或3 ; d為0或1 ; e為0、1或2 ; J和L分別為氧或硫； R21為氫、羥基、氟、（C「C6)烷基、（Q-Q)烷氧基、鹵素 (CrC6)烷基、胺基、（CVC6)醯胺基或NR26-R27，其中R26和R27 分別選自由氫、（CVQ)烷基或（C6-C1G)芳基所組成之群；且 R22為氫、（CVQ)烷基，其可視需要被羥基、齒素、（C「C6) 200302107 申請專利範圍續頁

烷硫基、（CVC6)烷基亞磺醯基或（Q-Q)烷基磺醯基取代；或在式II中，當η為1且B和D兩者皆為CR5時，這兩個 R5基團可與附接於其上的碳一起形成式VI之基團 VI G 其中斷續線代表可選擇的雙鍵； m為0或1 ;且 T、U、V和W分別為氧、硫、CO、氮或CR5R6，其中R5 和R6如同上文之定義；或在式II中，當A和B兩者皆為CR5時，或當η為1且B 和D兩者皆為CR5時，或當D和Ε兩者皆為CR5時，或當Ε 與G兩者皆為CR5時，這兩個R5基團可與附接其上的相鄰碳原子一起形成（C5-C6)環烷基基團，並可視需要被羥基或苯并基團取代。 5.根據申請專利範圍第4項之組合物，其中該IL-1加工和釋放抑制劑係選自由： 1-(1，2,3,5,6,7-六氫+茚莘-4-基）-3-[4-(1-羥基-1-甲基-乙基）-口夫喃-2-續S盖基]-脈， m 1-(2,6-二異丙基-苯基）-3-[4-(l-羥基-1-甲基-乙基）-呋喃- λ 2-磺醯基]-脲；， 4-氯-2,6-二異丙基-苯基-3-[4-(l-羥基-1-甲基-乙基）-呋喃- -2-績醯基]-赚； 1，2,3,5,6,7-六氫-4-氮雜+茚莘-8-基-3-[4-(1-經基-1-甲基-乙 -6- 200302107 申請專利範圍續頁基）·咬喃-2-續醒基]-踩； 8-氯-1，2,3,5,6,7-六氫-s-茚莘-4-基-3-[4-(l-羥基小甲基-乙基）-口夫喃-2-續醒基]-脈； ^ 8-氟-1,2,3,5,6,7-六氫+雖華-4-基-3-[4-(1-羥基-1-甲基-乙基）-參咬喃-2-橫S1基]-ίΙ尿；和 4-氟-2,6-二異丙基-苯基-3-[4-(1-羥基-1-甲基-乙基）-呋喃-2-磺醯基]-脲所組成之群。 6. 根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該IL-1抑制劑 φ 為 IL- Ira 0 7. 一種治療炎症的組合物，包括定量的雙重IL-1和IL-18抑制劑與定量的腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑混合，其中兩種組份的含量，對於治療炎症是有效的，以及在藥學上可接受的載劑。 8. 根據申請專利範圍第1、2或7項之組合物，其中該腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑是艾坦賽特、因福西美、CDP-870

、艾得理默或TACE抑制劑。 9. 根據申請專利範圍第1、2或7項之組合物，其中該腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑是芳基磺醯基異羥肟酸衍生物。 10. —種治療炎症的結合物，在分開的容器中包括有效含量的IL-1抑制劑和有效含量的腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑，可供同時、分開或一起投予，或連續投予。 11. 一種治療炎症的結合物，在分開的容器中包括有效含量的IL-1抑制劑、有效含量的IL-18抑制劑和有效含量的腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑，可供同時、分開或一起投

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申請專利範圍續頁癥予，或連續投予。 12. —種治療炎症的結合物，在分開的容器中包括有效含量的IL-1和IL-18抑制劑，以及有效含量的腫瘤壞死因子 (TNF)抑制劑，可供同時、分開或一起投予，或連續投予 0 200302107 陸、（一)、本案指定代表圖為··第___圖 (二）、本代表圖之元件代表符號簡單說明：

柒、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：〇、/〇 S NH

R