TW200300171A - Sesquiterpene synthases from grand fir (abies grandis), and methods of use - Google Patents

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Rodney B Croteau
John E Crock
Jorg Bohlman
Reinhard Jetter
Christopher L Steele
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Univ Washington State Res Fdn
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Description

200300171 A7 £7__ 五、發明説明（1 )
本發明部分由 NIH GM-30354 、USDA NRI 97-3 5302-4432，及孵化計劃（Hatch Project) 10A-3037-0268 等證號支持之。美國政府對本發明具有特定權利。本專利 申請案主張1998年1月22日提出支美國第60072204號（暫時 案號）專利申請案之優先權。 【發明所屬之技術領域】 本發明領域 本發明係有關源自於大冷杉grawi/以）之倍半萜 合成酶（循環酶）之核苷酸序列編碼，並有關於包含該序列 之載體、包含該序列之宿主細胞，及生產製造該等重組型 倍半萜合成酶及其突變體的方法。 【先前技術】 本發明背景 松柏油性樹脂係松脂和松香之混合物，其作用在於抗 蟲及癒傷（Johnson，Μ & Corteau，R· (1987) in 五co/ogy Metabolism of Plant Lipids (Fuller, G. & Nes, W.D., eds) pp 76-91, ACS Symposium Series 325, America Chemical Society, Washington, DC; Gijzen, M, et al., (1993) in Bioactive Volatile Compounds from Plants (Teranishi, R, et al., eds) pp8-22, ACS Symposium Series 525, America Chemical Society，Washington, DC)。松脂係由單萜婦（C10) 及倍半萜烯（C15)烯烴組成，而松香則由二萜（C20)樹脂酸 (第一圖）組成。可由至多30種不同之單萜烯（Lewinsohn，E·， et al·，（1993)戶Χηα/. 4, 220-225) ’ 或甚至更大量 之倍半萜烯（見實施例1)組成的松柏油性樹脂之揮發性松 脂部分作為該二萜樹脂酸之溶劑，在莖部癒傷時使其變硬 本紙張尺度適用中國國家標準（™s)A4規格（210X297公愛） (請先閲讀背面之注意事項再？^本頁) 士 •訂|
• I 200300171 A7 B7 五、發明説明（2) (請先聞讀背面之注意事項再填窝本頁) 以形成一機械性障蔽使該傷處癒合（Johnson，M.A. & Croteau, R. (1987) in Ecology and Metabolism of Plant Lipids eds. Fuller, G. & Nes, W.D. (Am. Chem. Soc., Washington, DC)，ACS Symp· Series 325, pp. 67-91) o . 大冷杉gr⑽db)已發展成研究組織性及傷處誘 導性油性樹脂形成（oleoresinosis)之模式系統。大冷杉油 '性樹脂之單萜烯烴及二萜樹脂酸部分之組成物已被界定 _ (Lewinsohn, E., et al., (1993) Phytochem. Anal. 4, 220-225)，且該等由莖部受傷而來的天然產物之誘導性生合成 已被詳細地揭露（Gijzen，M·，et al·，（1993) in Volatile Compounds from Plants (Teranishi, R·, et al., eds) pp 8-22，ACS Symposium Series 525，American Chemical Society, Washington, DC; Lewinsohn，E” et al”（1992) in Regulation of Isopentenoid Metabolism (Nes, W.D., et al., eds) pp8-17, ACS Symposium Series 497, American Chemical Society, Washington, DC; Gijzen, M., et al., ^ (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294, 670-674; Funk, C., et 經濟部中知禚準A貞工消費合作社印製 al·，（1994) Plant Physiol. 106，999-1005)。有關於松脂形 Λ$ 成之癒傷誘導的單萜烯合成酶以免疫轉印技術分析，而顯 示誘導性油性樹脂的製造係有關於該等酵素之重新合成 (Gijzen, M., et al., (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294, 670-674)。松脂二烯合成酶，即源自大冷杉之二萜循環酶 之cDNA序列所造成之樹脂酸之生合成（LaFever，R.E·，et al·，（1994) drcA. BbcAem. 313，139-149)曾被報 本紙浪尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐） 200300171 A7 B7_ 五、發明説明（3 ) 導（Stofer Vogel, B·，et al·，（1996) 5ζ·ο/· 271， 23262-23268)，且近來已可獲得來自本松柏品種之具有單 萜烯合成酶之數個 cDNA純株（Bohlmann，J·，et al·，（1997) J. 5b/· Ckm· 272, 21784-21792)。 相較於松柏油性樹脂之單萜烯及二萜，松柏類油性 樹脂之倍半萜烯由於其在該油性樹脂含量少於10%而較不 受實驗上的重視。然而，松柏類油性樹脂中倍半萜烯之相 對低濃度具有其生物性意義。類倍半萜烯植物補體，也就 是抗體化合物，在裸子植物中為習知的（Threlgall，D.R. & Whitehead, I.Μ. (1991) in Ecological Chemistry' and Biochemistry of Plant Terpenoids (Harborne, J B. & Tomas-Barberan, F.A, eds) pp 159-208, Clarendon Press, Oxford，UK)，其暗示了松柏類油悻樹脂之倍半萜烯在抗 生方面扮演類似的角色。 經濟部中央標準局貝工消费合作社印裝 HI- tin ml VLr— 11 In HI an ml I k * (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 線 松柏類油性樹脂倍半萜烯其習知特徵在於其為青春 激素。青春激素係椴松酸之曱酯，其係該倍半萜稀稀烴甜 沒藥烯之一種氧合衍生物（第2圖）。該松柏類倍半萜烯青 春激素類似於昆蟲的青春激素，因而可以在蛻變和滯育上 擾亂昆蟲的發展及生殖（Bowers, W.S·，et al·，（1976) Science 193, 542-547; Bowers, W.S. (1991) in Herbivores: Their Interaction with Secondary Plant Metabolites, Vol. /, G.A. Rosenthal and M.R. Berenbaum, eds. (Acad. Press, San Diego), pp· 431-456)。青春激素有時被稱作「紙因子（paper factor)」，因為其出現於由冷杉屬樹木製成的紙張中，並 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） 200300171 A7 __B7_ 五、發明説明（4 ) 可阻止以該紙張培養之昆蟲幼蟲的成熟（Slama，K. & Williams, C.M. (1965) Proc. Natl Acad. Sci. USA 54, 411-414; Slama, K. & Williams, C.M. (1966) Nature 210, 329-330; Bowers, W.S., et al., (1966) Science 154, ， 1020-1021)。在餵食昆蟲後，冷杉中椴松酸及青春激素前 趨物的累積暗示了，該青春激素類似物的生合成係原位誘 導以因應蟲害（Purity, G.S. & Nijholt，W.W· (1974) C⑽.·/· _ 如，· 52, 585-587)。 來自裸子植物法國海岸松（Pbw 之倍半萜 烯合成酶中，只有E-召-菌綠烯合成酶曾被報導（Salin，F·， et al·，（1995) /·戶/απί 146, 203-209)。但是，來自 被子植物的多種倍半萜烯合成酶已被揭露（Dehal，S.S· & Croteau, R. (1988) Arch. Biochem. Biophys. 261, 346-356; • Munck, S.L. & Croteau, R. (1990) Arch. Biochem. Biophys. 282, 58-64; Belingheri, L., et al., (1992) Plant Sci. 84, 129-136)，且與被子植物中植物抗毒素生合成有關的數個 9 倍半萜烯合成酶基因編碼業已被分離（Facchini，P.J· & Chappell, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, * 1 1088-1 1092; Back, K. & Chappell, J. (1995) J. Biol Chem. 270, 7375-7381; Chen, X-Y., et al., (1995) Arch. Biochem. Biophys. 324, 255-266) ° 【發明内容】 太發明概述 據前所述，本發明係有關於分離的核苷酸，該核苷酸 具有裸子植物倍半萜烯合成酶編碼；分離的重組型裸子 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 奉 •訂· :線丨 200300171 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 A7 B7_五、發明説明（5 ) 種:物倍半格烯合成酶；可複製的重組表現載體，該載體包 括一段具裸子植物倍半萜烯編碼之核苷酸序列；轉形、穿 染’或其他經處理以包括有本發明之一或多個核苷酸的細 胞；並有關於在一宿主細胞中進行或強化裸子植物倍半萜 烯合成酶的方法，該方法包括將本發明之表現載體植入該 宿主細胞中，使該倍半萜烯合成酶蛋白質可在該宿主細胞 中表現。 具有該等裸子植物倍半萜烯合成酶Ε-α -甜沒藥婦合 成酶、5-芹子烯合成酶及^-葎草烯合成酶之編碼的典型 cDNA已被分離自大冷杉（jWa gr⑽山\y)並定序，且談對應 的胺基酸序列業已被演繹出。由此，在較佳具體實施例中， 本發明有關於具有E- α -甜沒藥烯合成酶之表現編碼的 DNA序列，如序列辨識編號12之序列，其具有來自大冷 杉s gran山3)之Ε- α -甜沒藥烯合成酶（序列辨識編號 13)編碼；具有5 -芹子烯合成酶之表現編碼的DNA序列， 如序列辨識編號19之序列，其具有來自大冷杉 graWb)之5-芹子烯合成酶（序列辨識編號20)編碼；以及 具有葎草烯合成酶之表現編碼的DNA序列，如序列辨 識編號23之序列’其具有來自大冷杉（dha 之γ · 葎草烯合成酶（序列辨識編號24)編碼。 另一方面，本發明直接相關於可複製的重組選殖載 體，其包含有具Ε-a-甜沒藥烯合成酶、芹子烯合成酶 或7 -葎草烯合成酶編碼的核苷酸序列。本發明亦直接相 關於一鹼基序列，其與至少部分具有甜沒藥烯合成 本紙張尺度適用中國國家標本（CNS ) A4規格（21〇><297公釐) :1·1 n ·=Γ- ϋ 8— —8 1-1 · (請先閲讀背面之注意事項再本頁) -訂· 線 -r-IILr. 200300171 A7 B7 五、發明説明（6) 酶、芹子烯合成酶或7 -葎草烯合成酶編碼的核苷酸序 列完全互補，以加強其間的雜交反應。該等前述的互補鹼 基序列包括，但不限於：與具有甜沒藥烯合成酶、 序子烯合成酶或7-葎草烯合成酶編碼的核苷酸序列完 全或部分互補的RNA反訊息股；與具有Ε- α -甜沒藥稀合 成酶、5-芹子烯合成酶或r-葎草烯合成酶編碼的核苷酸 序列部分互補的DNA片段，其還可作為聚合酶鏈反應的 引子，或Ε-α_甜沒藥烯合成酶、芹子烯合成酶或 释草烯合成酶，或其相關基因的探針。
倉
本發明之再另一方面提供經修飾的宿主細胞，，其經 一重組轉殖載體及/或本發明之DNA序列轉形、穿染及/或 注射。所以，本發明提供裸子植物之甜沒藥烯合成 酶、5-芹子烯合成酶或^-葎草烯合成酶重組表現，較佳 的為大冷杉以客r⑽山·5〇之E-α·甜沒藥烯合成酶、占-芹子烯合成酶或r-葎草烯合成酶，本發明概念還可用於 簡化用於定序的Ε-α-甜沒藥烯合成酶、芹子烯合成酶 或7 -葎草烯合成酶（或其初級酵素產物）之定量生產、分 離及純化’以得到植物體、微生物或動物趙内Ε- α -甜沒 藥烯合成酶、芹子烯合成酶或7_葎草烯合成酶之表現 或加強的表現，或可另外用於調控或表現Ε-α 甜沒藥稀 合成酶、芹子烯合成酶或7_葎草烯合成酶以產生該等 所需的合成酶，或其酵素產物，或其衍生物之環境中。 攝式簡要說明 參考隨附的詳細圓式說明，本發明之前述各方面及 -10· 本緘張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210><297公釐） 200300171 A7 ____ Β7_____ 五、發明説明（7 ) 其許多優勢將變得更易於認識並了解： 、 第1圖顯示單萜烯、倍半萜烯及二萜烯之聲合成及其 一級代謝關係。所用的縮寫如下：ΙΡΡ，二磷酸異戊烯酯； DMAPP，二磷酸二甲基丙烯酯；GPP，二磷酸槐牛兒酯； FPP，二磷酸法呢酯；GGPP，二磷酸槐牛兒槐牛兒酯。 第2圖顯示E-CJ：-甜沒藥烯、幼稚激素類似物椴松酸 及青春激素，其昆蟲幼稚激素III之構造。 第3圖顯示存在於由未受傷的大冷杉（jMw 抽取出的油性樹脂之松脂部分之六種主要倍半萜烯的化學 結構。該立體化學圓說係近似的。該百分比值代表各倍半 萜烯在該松脂部分之倍半萜烯成分中所佔百分比。 第4圖顯示以二磷酸槐牛兒酯作為基質時，倍半箱稀 合成酶δ -芹子烯合成酶（序列辨識編號·· 2〇)及丫-葎草摊 合成酶（序列辨識編號：24)胞外生產的單萜烯產物之作用 及相對量。括弧中對總單萜烯部分的百分比係指該占·芹 子烯合成酶（括弧中的第一個值）及7 •採草烯合成酶（括弧 中的第二個值）。ND表示未測得。 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 具體會施例之詳祕 此處所用之「胺基酸」係指所有自然發生的L a胺 基酸及其殘基。該等胺基酸以單一字母或三個字母標記 之： 不°
Asp D天冬胺酸ne i異亮胺酸 Ήιγ T蘇胺酸 Leu L亮胺酸
Ser S絲胺酸 Tyr Y酪胺酸
Glu E榖胺酸 Phe F苯丙胺酸 -11 · 本紙張从適用中關家標準（CNS ) A4規格（21GX297公釐)---—- Μ濟部t夫嫖準Λδς工消费洽作术印il 200300171 A7 B7 五、發明説明（8 )
Pro P 脯胺酸 His Η 組胺酸
Gly G甘胺酸 Lys K賴胺酸
Ala A 丙胺酸 Arg R 精胺酸
Cys C 半胱胺酸Trp W 白胺酸 Val V 纈胺酸 Gin Q 榖胺醢胺
Met M 曱硫胺酸Asn N 天冬醯胺 _ 此處所用之「核苷酸」意指包含一糖基（五碳糖）、一 磷酸及一含氮雜環鹼基之DNA或RNA單元單位。該驗基 係經由糖穿碳（五碳糖之1’碳）連接至該糖基且鹼基與糖之 ^ 該組合稱為核苷。該驗基使該核苷酸之特徵在於DNA具 四種鹼基··腺嘌呤（“A”）、烏糞嘌呤（“G”）、胞嘧啶（“C”)及 胸腺嘧啶（“T”）。纖維核苷（“I”)係一合成的鹼基，其可取 代四種天然發生的鹼基（A、C、G或T)之任一種p四種rna 之鹼基為A、G、C及尿嘧啶（“U”）。此處揭露的核苷酸序 列包含有一以相鄰五碳糖之3,及5,碳之間之磷酸二酯鍵連 接的線狀排列的核嘗酸。 所謂「百分密度」（％1)意指當兩段胺基酸序列或兩 φ 段核苷酸序列並排時，佔據同一相對位置之胺基酸或核苷 H 酸之百分比。 . 所謂「百分相似度」係指兩段相比較的蛋白質序列 相關程度之統計量。該百分相似度係以電腦程式運算，其 係各以一數值表示各對胺基酸之化學相似度（例如，無論 該比較之胺基酸為酸性、鹼性、疏水性、芳香族的等）及/ 或以減基對變化之最小值測出之演化距離，其必須將比較 之胺基酸對之一成員之編碼轉換為該對之另一成員編碼。 •12- 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公资） —•I I I I I I I 裝— I I I I 訂— I I I I I 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 200300171 A7 B7 五、發明説明（9 ) 經 央 標 準 局 工 合 作 社 運算係在該兩段序列經反覆比較所有可能的排列後得到最 佳配對之後進行（Henikoff，S· and Henikoff，J.G.， C/iSj 89: 10915-10919，1992)。 「寡核苷酸」係指短的以磷酸二酯鍵鏈結的單股或 雙股去氧核糖核酸序列。該等寡核苷酸係以習知方式經化 學合成並純化於如聚丙烯酸凝膠之上。 在此「Ε-α_甜沒藥烯合成酶.」係指可由二磷酸法呢 酯產生多數的倍半萜合成酶之酵素。以-甜沒藥烯合 成酶合成之主要的及特有的倍半萜烯為Ε-α-甜沒藥稀， 其包含至少90%之以Ε-α ·甜沒藥烯合成酶由二磷酸，法呢 酯合成的倍半萜烯混合物。 在此「芹子烯合成酶」係指可由二磷酸法呢酯產 生多數的倍半萜合成酶之酵素。以5•芹子烯合成酶合成 之主要的及特有的倍半箱婦為5_序子稀，其包含至少2〇% 之以5-芽子稀合成酶由二碟酸法呢醋合成的倍半格稀混 合物。 在此「r-採草稀合成酶」係指可由二碟酸法呢醋產 生多數的倍半箱合成酶之酵素。以7-採草稀合成酶合成 之主要的及特有的倍半箱稀為卜採草稀其包含至少鄕 之以r-採草稀合成酶由二碟酸法呢輯合成的倍半莊稀混 合物。 「所:J改造」、「胺基酸序列改造」、「變異艘」、 胺 變異趙」係指與天然E-«.甜沒藥稀合成酶、 夂芽子烯合成酶或τ_料歸合成酶分子比較胺基酸序列 _____________ · 13 · 本紙張尺度適用中國國家標準（ (請先閲讀背面之注意事項再. -裝· 頁) -訂 -線· 200300171 A7 B7 經濟部中夬福準為贫工消费含作社印東 五、發明説明（10) 略有不同之Ε-α-甜沒藥烯合成酶、5-芽子烯合成酶或γ -葎草烯合成酶分子β通常，該等變異體與天然Ε_α-甜沒 藥烯合成酶、5-芹子烯合成酶或7•葎草烯合成酶具有至 少約70%之同源性，且其較佳地與天然Ε- α _甜沒藥烯合 成酶、5-芹子烯合成酶或7-葎草烯合成酶具有至少約8〇% 之同源性。本發明之Ε-α_甜沒藥烯合成酶、芹子烯合 成酶或r-葎草烯合成酶之胺基酸·序列變異體在特定位置 發生取代、缺失，及/或插入。E-QJ-甜沒藥烯合成酶、占 -芹子烯合成酶或r-葎草烯合成酶之序列變異體可用於獲 得所欲之強化的或減弱的酵素活性、經修飾的特定化學或 空間化學，或變更的基質利用或產品分類。 取代的Ε_α-甜沒藥烯合成酶、芹子烯合成酶或7 -释草稀合成酶之變異體係天然Ε-α-甜沒藥烯合成酶、占 -芹子烯合成酶或7-葎草烯合成酶序列中至少一個胺基酸 殘基被移除並在該位置插入一不同的胺基酸者。該等取代 可為單一的，即該分子中只有一個胺基酸被取代；或其可 為多數的，即同一分子中兩個以上胺基酸被取代。該等Ε_ α-甜沒藥烯合成酶、芹子烯合成酶或7_葎草烯合成 酶分子之活性的取代性變化可得自取代一具有與該天然胺 基酸之電價及/或構造完全不同之側鏈之胺基酸。此種取 代會影響該聚胜肽骨架之構造及/或該取代區域之分子的 電價或疏水度。 該等Ε-α-甜沒藥烯合成酶、5-芹子烯合成酶或r-葎草烯合成酶分子之適當改變可經取代具有與天然分子相 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ----------^------1T------^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 200300171 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（11) 似之電價及/或構造之侧鏈之胺基酸得到。此種取代，稱 作保留性取代者，可經取代改變該聚胜肽骨架之構造或該 取代區域中分子之疏水性β 插入之E-CK-甜沒藥烯合成酶、芹子烯合成酶或7 -葎草烯合成酶變異體係指在天然Ε_ α -甜沒藥烯合成酶、 (5-芹子烯合成酶或7·葎草烯合成酶分子中特定位置之胺 基酸之側插入一個或以上的胺基酸者。胺基酸之侧意指連 接於該胺基酸之ck-叛基或α-胺基官能基。該插入可為一 個或以上之胺基酸。通常，該插入包含一或兩個保留性胺 基酸》電價及/或構造相似於該相鄰插入位置之胺基，酸者 被界定為保留性的。任擇地，本發明包括插入具有與該插 入位置之胺基酸電價及/或構造完全不同之側鏈的胺基 酸。 缺失變異體係該等一個或以上之胺基酸被自該天然 Ε-α-甜沒藥烯合成酶、5•芽子烯合成酶或7_葎草烯合 成酶分子中移除者❶通常，缺失變異體將在該Ε-α_甜沒 藥稀合成酶、δ _芹子烯合成酶或丫-葎草烯合成酶分子之 特定區域中具有一或兩個胺基酸缺失。 所謂「生物活性」、「生物性活化」、「活性」及 「活化」係指E-α·甜沒藥烯合成酶、占·芹子烯合成酶及 r-葎草烯合成酶分子將二磷酸法呢酯轉化為倍半萜烯類 之能力，其中甜沒藥烯係以Ε-α-甜沒藥烯合成酶合 成之主要且特定的倍半祐烯，5-芹子烯係以芹子烯合 成酶合成之主要且特定的倍半搭烯，而葎草烯係以 請 先 聞 面 之 注 I 頁 裝 訂 參 線
200300171 A7 B7 五、發明説明（l2) 葎草烯合成酶合成之主要且特定的倍半萜烯，其酵素活性 測定一如實施例2中所揭露者。ε_ α -甜沒藥烯合成酶、5 -芹子烯合成酶及葎草烯合成酶之胺基酸序列變異體可 具有所需的改變的生物活性，包括例如改變的反應動能、 基質利用產物分配或其他如特定化學及空間化學等特徵。
J ----------^-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 所謂「DNA序列編碼」、「DNA編碼」及「核酸鴆 碼」係指沿著去氧核糖核酸之一股之去氧核糖核苷酸之次 序或序列。該等去氧核糖核苷酸之次序決定沿著該轉譯出 之聚胜肽鏈之胺基酸次序。該DNA序列因而為該胺基酸 序列之密碼。 所謂「可複製的表現載體」及「表現載體」通常為 一段雙股DNA，其中可插入一段外來DNA。外來DNA係 界定為非同源DNA，該DNA非天然存於該宿主中。該載 體係用以傳送該外來的或非同源DNA至一適當的宿主細 胞中。一但進入該宿主細胞，該載體能獨立於或與該宿主 染色體DNA同步複製，並可產生數套該載體及其插入的（外 Ψ 來)DNA。此外，該載體包含可轉譯該外來DNA成聚胜肽 經濟部中处標準A貞工消费合作社印裂 . 之必要原件。該外來DNA編碼之聚胜肽之許多分子可因 而被快速合成。 所謂「轉形宿主細胞」、「轉形的」及「轉形」係 指將DNA送入一細胞。該細胞係所謂的「宿主細胞」， 且其可為一原核或真核細胞。典型的原核宿主細胞包括各 種品係的大腸桿菌（五· α/ί)。典型的真核細胞為玉米細胞 等植物細胞、酵母菌細胞、昆蟲細胞或動物細胞^。該送 -16- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS )八4規格（2l〇X297公釐） 200300171 A7 B7_ 五、發明説明（l3) 入的DNA形式通常為包含有一插入的DNA之載體。該送 入的DNA可來自與該訴主細胞相同或不同之品種，或者 其可為一包含部分外來DNA及部分衍生自該訴主品種之 DNA之雜教的DNA序列。 根據本發明，具有完整長度之傷誘導Ε-α-甜沒藥烯 合成酶編碼之cDNA以5’-RACE選殖之。標記為AG1.28 (序 列辨識編號：1)之部分長度之傷誘導推定的倍半萜烯合成 酶早已以PCR引子C (序列辨識編號·· 2)及D (序列辨識編 號·· 3)自受傷的大冷杉cDNA基因庫分離出以擴增成110 bp 之cDNA片段，標記為探針1 (序列辨識編號：4)。然後， 探針1 (序列辨識編號：4)被用以篩選大冷杉之cDNA基因 庫並辨識cDNA AG1.28 (序列辨識編號：1)。為了得到植 株AG1.28之消失的5’序列（序列辨識編號：1)，採用分離 自受傷的大冷杉莖部之連接接合體的cDNA以進行5’_ RACE反應。該接合體寡核苷酸之序列係提出於（序列辨識 編號：5)中。該5’-RACE反應採用引子API (序列辨識編 號：6)及反向RACE引子RJ1 (序列辨識編號：7)。 標記為RJ8 (序列辨識編號：8)之PCR產物的内部長 度為404bp之cDNA片段係以引子RJ1 (序列辨識編號：7) 及RJ2 (序列辨識編號：9)擴增之。引子RJ2 (序列辨識編 號：9)將用於RJ8 (序列辨識編號：8)之次選殖之BflmHI限 制切位納入衍生自pBluescript SK(+)之包含cDNA AG1.28 (序列辨識編號：1)之質體pAG1.28。 位於插入pAG1.28 (序列辨識編號：1)之cDNA上第 ____^7—---- 本紙强:尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請先閲讀背面之注意事項再^^頁) 裝· -訂 -線- 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 « —Ml n ϋ^· · 經濟部中务揉準局工消費合作社印製 200300171 A7 B7 五、發明説明（Μ)
2382個核甘酸位置之月7/icII切位，也就是2350 bps長度之 開放閱讀架構之終止密碼下游32個核甘酸，其係以誘變引 子F (序列辨識編號：10)及引子R (序列辨識編號：11)經 位置專一突變消除之。cDNA片段RJ18 (序列辨識編號：8) 係以5amHI及分解並連接至經分解的 pAGl.28，形成質體pAGl。質體pAGl之完整長度的Ε-α-甜沒藥烯合成酶cDNA插入物係以（序列辨識編號：12)提 出。為了 功能性表現，pAGl之2528 bp cDNA 插入物被次選殖至經丑amHI/ZAd分解的pGEX-4T-2而成為 質體pGAGl〇 具完整長度之芹子烯合成酶編碼之一 cDNA係經 5’-RACE選殖之。一段部分長度之想像的標記為ag4.30 (序 列辨識編號：9)之倍半萜烯合成酶cDNA事先已利用PCR 引子C (序列辨識編號：2)及D (序列辨識編號：3)擴增一 段標記為探針4 (序列辨識編號：15)之110 bp長度之cDNA 以分離自受的大冷杉cDNA基因庫。接著，以探針4 (序列 辨識編號：15)篩選該大冷杉cDNA基因庫並辨識出cDNA ag4.30(序列辨識編號：14)。由於ag4.30(序列辨識編號： 16)不具起始甲硫胺酸編碼，5，-RACE洗用以產生一段包 含有消失的ag4.30之5,端（序列辨識編號：14)。該5’_RACE 反應利用分離自受傷的大冷杉樹苗之p〇ly-A+ mRNA和對 ag4·30專一之反向RACE引子（序列辨識編號：17)。 基於ag4.30 (序列辨識編號：14)之序列設計一段5’-專一性引子（序列辨識編號·· 17)及一段3’·專一性引子（序 -18 - 本紙張適用中ϋϋ家榡準（CNS ) Α4· ( 21()χ297公瘦） I---------^------1T------^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 200300171 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A7 ____B7_ ___ 五、發明説明（IS) 列辨識編號：18)，及該包含ag4.30之消失的5’端之5’-RACE 產物。該ag4.30-專一性5,引子（序列辨識編號：17)將一 5amHI限制内核酸酶切位併入該起始甲硫胺酸密妈之上 游。該3’·專一性引子（序列辨識編號：18)被設計成包圍該 終止密碼，並包括一 ZAd切位以便連接至該pGEX-4T-l表 現載體。所得的PCR產物AG4 (序列辨識編號：19)具有完 整長度之5-芹子烯合成酶蛋白質編碼（序列辨識編號：20) 然後先植入pBluescript (SK-)，再植入一標記為pGAG4之 pGEX4載體。至於該經擴增的完整長度度之CDNA之進一 步次選殖進該用於高度表現之載體pSBETa，該pGAG4插 入物以引子組合(序列辨識編號：21)及4-5amHI (序 列辨識編號：22)經PCR擴增之。該PCR產物以BamHI及Ndel 分解之然後連接至經分解的pSBETa以產生表 現質體pSBAG4。 r-葎草烯合成酶cDNA AG5 (序列辨識編號：23)係 以與該5 -芹子烯合成酶CDNA (序列辨識編號：19)相同 方式選殖之，但其PCR引子C (序列辨識編號：2)及D (序 列辨識編號：3)係用以擴增一段標記為探針5 (序列辨識 編號：25)之11〇 bp之cDNA片段。探針5 (序列辨識編號： 25)係用於篩選該大冷杉cDNA基因庫並辨識一段標記為 ag5·9 (序列辨識編號：26)之cDNA分子。由於ag5.9 (序列 辨識編號：26)不具起始甲硫胺酸編碼，5，-RACE係利用 分離自受傷的大冷杉樹苗之poly-A+ mRNA進行之。該5，-RACE反應採用一個對ag5 9 (序列辨識編號：27)具專一性 ..___ -19 - 本紙張纽適用中國國家標準（CNS ) Α4» ( 210X297公釐） -----Γ*-----裝11 (請先閲讀背面之注意事項再Hi本頁) 訂 -線- — βϋ Ur— _ e n In 11^1 經濟部中央標準工消費合作社印製 200300171 A7 B7 五、發明説明（l6) 的反向RACE引子。 基於ag5.9之序列和包含該消失的ag5.9之5’端之5’-RACE產物設計一段5’-專一性引子（序列辨識編號：28)及 一段3’-專一性引子（序列辨識編號：29)。該ag5.9-專一性 5’引子（序列辨識編號：28)將一個限制内切酶直接 併入該起始甲硫安酸密碼上游。該3’-專一性引子（序列辨 識編號：29)係設計為包圍該終止密碼，並包括一個五cMJ ® 切位以便連接至PGEX-4T-1表現載體。所得的PCR產物具 有完整長度之7*·蘀草烯合成酶cDNA AG5 (序列辨識編 號：23)然後先植入pBluescript (SK-)，再植入標記為pGAG5 之pGEX載體。至於該擴增的完整長度之cDNA之進一步次 選殖至該高度表現的pSBETa，該pGAG5插入物係以引子 組合5-iVWeI (序列辨識編號：30)及5- 5amHI (序列辨識編 號：31)經PCR擴增之。該PCR產物係以BamHI及Ndel分解 之並連接至經分解的pSBETa以產生表現質體 pSBAG5 〇 ^ 不同於單萜烯合成酶之蛋白質序列，該等選殖出的 ^ 倍半萜烯合成酶所推知之胺基酸序列，也就*Ε_α -甜沒 藥烯合成酶（序列辨識編號：13)、5-芹子烯合成酶（序列 辨識編號：20)及r -葎草烯合成酶（序列辨識編號：24)， 各自缺少一個位於Ν端的質體目標序列。該等選殖的蛋白 質的質體目標序列之缺乏符合於所有倍半萜烯合成酶皆為 胞質酵素之事實。可採用習知之添加選自傳送序列之Ν端 的目標序列（例如見於 von Heijne G et al·，£wr. /· -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） .1 n I I I I I I I I I I ~訂 n I I I ϋ I 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 200300171 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 _B7___五、發明説明（Π) 180: 535-545, 1989; Stryer, Biochemistry W.H. Freeman and Company, New York, NY, p· 769 [1988])以導弓1 本發明之 倍半萜烯合成酶至其他胞内或胞外的位置》 除了分別以序列辨識編號：12、19及23提出之cDNA 所編碼之天然的E-α -甜沒藥烯合成酶（序列辨識編號： 13)、天然的5 -芹子烯合成酶（序列辨識編號：20)及天然 的7 -葎草烯合成酶（序列辨識編號：24)外，經缺失、取 代、突變及/或插入產生的序列變異體亦合乎本發明觀點 而不被習之際義肢範圍所限制。Ε-α-甜沒藥烯合成酶、 5-芹子烯合成酶或7 -葎草烯合成酶胺基酸序列變異'體可 由突變的具野生型Ε-α-甜沒藥烯合成酶、5-芹子烯合成 酶或7-擇草烯合成酶編碼之DNA序列建構之，例如採用 所謂的位置專一突變技術。各種聚合酶連鎖反應（PCR)方 法為本領域之習知技藝，例如可採用Clontech出品之 Transformer Site-Directed Mutagenesis 等雙引子系統套組 以達到目的。 本系統中該目標質體變性之後，兩個引子同時黏至 該質體；該等引子之一包含該所需的位置專一突變，另一 個包含在該質體之另一點上的突變使排除一限制切位。然 後第二股緊密的連接至該二突變以合成之，並將產生的值 體轉形進[α/z·之品系中。質體DNA系分離自該轉形 細菌，其以適當限制酵素限制之（所以該未經突變的質體 被線狀化），然後再轉形進五。本系統考慮針對一表現 載體中同遍的產生，而不論次選殖之必須或單股嗤菌質體 -21- ________- 本紙張尺度適用中國國家標準（〇>«)八4規格（210父297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再 頁) 訂 -線· 200300171 A7 B7 Φ 經濟部中处標準A負工消費合作社印装 五、發明説明（IS) 之產生。該兩個突變的緊密連接及後績的未經突變之質體 之線狀化造成高突變率並縮小篩選。合成該起始限制切位 引子後，本方法在每一突變位置只需要用一個新引子。不 需分別製備各位置的突變，一套「設計的變質者」募核苷 酸引子可被合成以同時在一特定位置上引發所有所需的突 變。轉形體可經由該質體DNA穿過該突變誘發區域之定 序篩選以辨識並分類突變植株。·然後各突變DNA可在突 變偵測放大凝膠（J.T· Baker)上以電泳分析限制並分析以 確認該序列並未發生任何其他改變（經帶移動與該未經突 變誘導之對照組比較）。 該經確認的突變二倍體可被植入一複製表現載體.， 若未植入本型載體，則該所得表現建構用以轉形五c〇/i BL21(DE3)pLysS等[cW成該突變蛋白質的高度生產及其 隨後的純化。FAB-MS地圖製造法可被用於快速確認突變 表現的真實度。該技術提供一段種蛋白質的定序並提供該 序列並排中必需的特徵。在該型態之地圖繪製實驗中，蛋 白質以一蛋白酶（由於該片段系最初的且該剩下的地圖應 與未經突變的蛋白質之地圓相同，該選擇將視欲修飾的特 定區域而定）設計之。成套的切割片段係以微孔HPLC (反 向或離子交換，意識欲修飾之特定區域而定）分段以提供 各段中數個胜肽，且該等胜肽之分子量係以FAB-MS決定 之。然後將該質量與得自分解之預想序列的胜肽比較，並 快速破定該序列之正確性。既然本突變誘發直接達成蛋白 質修飾，該改變的胜肽之定序在MS程度如預測的下應為 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I---------裝--------訂------線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 200300171 A7 B7 五、發明説明（19) 不必要的。右必需證明改變的殘基，CAD·縱排MS/MS可 被用以定序該討論中的混合物之胜肽，或視該修飾位置而 定的以取代Edman降解作用或羧肽酶γ分解作用純化的目 標胜肽。 在特別設計的位置專一突變體中，通常首先需要做 個非保留型取代（例如，Ala取代Cys，His取代Glu)並決 疋活性是否因而減弱。該經誘導突變的蛋白質之特性接著 以其動能參數尤讲及尺加作為功能變化指檁而檢驗之，其系 由其本身之鍵結及/或催化相較於天然酵素之減少的改變 測知。若此方法以活性之損失或破壞證明該殘基之.重要 性’則可達成保留性取代，例如以Asp取代Glu以改變側 鏈長度、Ser取代Cys或Arg取代His。對於疏水片段而言， 將改變大範圍，即使芳香環亦可被烷基側鏈取代。該一般 產物分布之改變可表示該反應程序中被該突變改變的步 驟。 其他的位置專一突變技術亦可被用於本發明之核苷 酸序列。例如，連結作用之前的DNA之限制核酸内切酶 分解可用於產生Ε·α-甜沒藥烯合成酶、5-芹子烯合成酶 或7-律草稀合成酶缺失變異體，一如Sambrook等人於15.3 節所揭露（Mo/aw/ar C/o/n•叹·· 4 Ζτα&παίο,少 A/a/zwa/，2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratort Press, New York, NY [1989])❶類似的策略亦可用於建構插入變異體，一如 Sambrook等人於swpra 15.3節所揭露。 募核苷酸專一突變亦可被用以製備本發明之取代變 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） n· m ϋϋ f—k 1 unv^pn n ml mmmMMMM I (請先聞讀背面之注意事項再頁) 訂' 線 _ 經濟部中先樣準局V工消費合作社印製 200300171 Α? __Β7 五、發明説明（2〇) 異體。其亦可用於合宜地製備本發明之缺失及插入變異 體。本技術係Adelman等人揭露之習知技藝（^〇见4 2:183 [1983])。一般而言，長度至少為25個核苷酸之募核苷酸 在Ε-α-甜沒藥烯合成酶、5-芹子烯合成酶或7-葎草烯 合成酶分子中被用於插入、缺失或取代兩個或更多的核苷 酸。一個適當的寡核苷酸在該突變編碼之核苷酸上將有12 至15個完全相配的核苷酸《為了誘變原型Ε- a：-甜沒藥烯 合成酶、5-芹子烯合成酶或了-葎草烯合成酶，該募核苷 酸在適當雜合條件下被黏合至該單股DNA模板分子。然 後添加一種DNA聚合酶，通常即五· co/z· DNA聚合酶I之 Klenow片段。這種酶利用該寡合苷酸作為引子以完成該 含變異股DNA之合成。因此，型成一種異形雙螺旋鏈使 得DNA之一股具有插入該載體中之Ε_α-甜沒藥烯合成 酶、5-芹子烯合成酶或^-葎草烯合成酶編碼，而〇ΝΑ之 第二股具有插入該載體中之Ε_α -甜沒藥婦合成酶、5 -芹 子烯合成酶或葎草烯合成酶變異型編碼。然後將本異 形雙股螺旋分子轉形進一適當的宿主細胞。 具有超過一個取代胺基酸之突變體可以多種方式之 一產生之。若該等胺基酸在該聚胜肽鏈上所在位置接近， 其可同時以一各具有所有所需胺基酸取代編碼之募核苷酸 誘變之。然而，若該等胺基酸之間有距離（例如被超過十 個胺基酸分開）要產生一個具有所需變化之編碼的募核苷 酸就較為困難了。取而代之，可採用兩種方式之任一種。 第一個方法中，以預取代的胺基酸產生一分離的募核苷 •24· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 1·1·-------疼------1Τ------線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 200300171 經濟部中央標準局貝工消费合作社印«. 五 A7 B7___發明説明（21) 酸。然後將該寡核苷酸同時黏合至該單股模板DNA，而 由該模板合成的第二股DNA將具有所有所需的胺基酸取 代編碼。另一種方法係有關於兩次或以上之誘變以產生該 所欲的突變體。第一次係如該單獨突變所述：以原型E- α -甜沒藥烯合成酶、（5-芹子烯合成酶或葎草烯合成酶 DNA作為該模板，一種具有該第一所欲的胺基酸取代編 碼的寡核苷酸被黏合至本模板，然後產生該異形雙股螺旋 DNA分子。該第二次誘變使用該第一次誘變所產生的突 變DNA作為模板。所以，本模板已經包含一或多個突變。 該具有該（等）額外的胺基酸取代編碼之募核苷酸被接著黏 合至本模板，且所造成的DNA同時具有第一次和第二次 誘變之突變編碼。本產物DNA可被用作第三次誘變之模 板，依此類推。 真核表現系統可被用於生產Ε-α -甜沒藥烯合成酶、 (5-芹子烯合成酶或r_葎草烯合成酶因為其具有進行任何 一種轉錄後修飾的能力，以及引導具有一段N端目標序列 之經修飾的Ε-α-甜沒藥烯合成酶、芹手烯合成酶或r -葎草烯合成酶至適當的膜系位置的能力。本目的之代表 性真核表現系統利用重組型竿狀病毒，苜宿銀紋夜蛾 顆粒體病毒以表現本發明之Ε- α -甜沒藥豨合成酶、δ -芹子稀合成酶或Τ-律草稀合成酶 (AcNPV; M.D, Summers and G-E. Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures [1986]; Luckow et al., Bio-technology 6:47-55 -25- 請 先 閲 面 之 注
I Η 訂 線 本i氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 經濟部中央標準S工消費合作社印製 200300171 A7 B7 五、發明説明（22) " [1987])。以該等重级型竿狀病毒感染尾蟲細胞（如草地黏 蟲〇S> 種之細胞）可產生大量Ε· α _甜沒 藥烯合成酶、芹子烯合成酶或7_葎草烯合成酶蛋白 質。此外’該竿狀病毒在重組型Ε- 〇：-甜沒藥烯合成酶、 ‘ 5-芽子烯合成酶或7-葎草烯合成酶之生產上有另一個重 要優勢。例如，竿狀病毒不感染人類因而可安全的控制於 大數量❶在該竿狀病毒系統中，.一段DNA建構係經製備 ® 包括具有α -甜沒藥烯合成酶、（5 _芹子烯合成酶或_ 葎草烯合成酶編碼之DNA片段及一載體《該載體可包含 竿狀病毒之多面體積因啟動子區域、重組過程中交換所必 須的該等竿狀病毒外側序列（該等外側序列包含相鄰於該 啟動子序列之約200_300酴基對）及一段細菌的複製區域其 允許該建構以在細菌體内複製β建構該載體使得⑴該DNA 片對被置於該多面體基因啟動子旁邊（或操作地連結或，，下 游”或’’在其控制之下，，)及（ii)該啟動子/ Ε_α -甜沒藥烯合 ^ 成酶' δ -芹子稀合成酶或丫-採草稀合成酶組合兩端皆有 Μ 200-300鹼基對之竿狀病毒DNA (該等外側序列）》 . 為了生產該Ε_α -甜沒藥烯合成酶、5-芹子烯合成酶 或7 -葎草烯合成酶DNA建構體，以該等此處所揭露的方 法或得一段具有完整長度之Ε-α-甜沒藥烯合成酶、5-芹 子烯合成酶或7 -葎草烯合成酶編碼之cDNA植株。該DNA 建構體在重組所需條件下以一種適當的竿狀病毒（也就是 與該建構體中該啟動子編碼同種的竿狀病毒）之竿狀病毒 DNA送入一個宿主細胞中。該等所得的重組型竿狀病毒 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I —裝 II II 訂 "~"~線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 200300171 A? B7 五、發明説明（23) 具有完整的Ε-α-甜沒藥烯合成酶、5-芹子烯合成酶或r -葎草烯合成酶編碼。例如，一個昆蟲宿主細胞可分別以 該DNA建構體及一個功能性竿狀病毒共穿染或穿染。所 的的重組型竿狀病毒接著可被分離並用以感染細胞以完成 該Ε-α-甜沒藥烯合成酶、芹子烯合成酶或r-葎草烯 合成酶之生產。宿主昆蟲細胞包括草地黏蟲 之細胞，其可生產一種經竿狀病毒表現的Ε-α -甜沒藥稀合成酶、5-芹子稀合成酶或7-採草烯合成酶。 被本發明之重組型竿狀病毒感染的昆蟲宿主細胞接著被培 養於允許Ε-α_甜沒藥稀合成酶、芹子稀合成酶或Τ-葎草烯合成酶表現之條件下。然後以習知方法由該等細胞 萃取出所產生的Ε-α-甜沒藥烯合成酶、5-芹子烯合成酶 或7 -葎草烯合成酶。 如酵母菌等其他真核微生物亦可被用於實施本發 明。用以烘製麵包的啤酒酵母菌（Saak〜如) 係一種常用的酵母菌，雖然可獲得許多其他品系。該質體 YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282:39 [1979]; Kingsman et al, Gene 7:141 [1979]； Tschemper et al., Gene 10:157 [1980])在酵母菌屬中常被用作表現載 體。本質禮包含該trpl基因，其提供一種用於篩選出於白 胺酸中缺乏生長能力的酵母菌之標識，如ATCC No· 44076 及 PEP4-l(Jones，85:12 [1977])。該酵母菌宿主細 胞基因庫之特有的trpl損害接著提供一種以白胺酸存在下 之生長偵測轉形作用之有效環境。酵母菌宿主細浼一般以 • 27- 本紙珉A度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） m- tn —ϋ iM- —.ϋ —Bxvri— m· l_i— I— I (請先閲讀背面之注意事項再頁) -訂 -線- 經濟部中央標準局貝工消费合作社印裝 經濟部中夬標準局貫工消費合作社印製 200300171 A7 B7 五、發明説明（24) 聚乙二醇轉形之，一如Hinnen所揭露（pr(7C· A以·以/· t/M 75:1929 [1978])。其他的酵母菌轉形作用步驟被提出 於 Giets et al•，见儿凡 20(17):1425，1992; Reeves et al” FEMS 99:193-197,1992. 酵母菌載體中適當的啟動序列包括3-磷酸甘油酸激 酶之啟動子（Hitzman et al.,丄 CAe/w· 255:2073 [1980]) 或其他糖解酵素（Hess et al·，丄 dt/v. Jinzj/me iieg. 7:149 , [1968]; Holland et al·，17:4900 [1978])，如 稀醇酶、甘油搭-3-破酸去氩酶、己醣激酶、丙闕酸去叛 酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸'甘油 酸變位酶、丙酮酸激酶、鱗酸丙糖異構酶、構酸葡萄糖異 構酶，及葡萄糖酸激酶。在適合的表現質體之建構中，與 該等基因相連的末端序列亦連結進入該所需序列3,端之表 現載體中以表現之，從而提供該mRNA之聚腺苷酸作用及 終止作用。其他具有額外的轉·錄優勢之經生長條件控制之 啟動子係用於酒精去氫酶2、異細胞色素C、酸性碟酸分 ¥ 解酶、與氮代謝相關的降解酵素，及前述之甘油醛_3-破 酸去氩酶，及與麥芽糖及乳糖利用相關之酵素之啟動區 域。任何包含適用於酵母菌之啟動子、複製區域及終止序 列之質體載體皆為適用的。 衍生自植物等多細胞生物之細胞培養可被用作宿主 以實施本發明。例如，轉殖植物可得自轉移具有Ε_α-甜 沒藥烯合成酶、5-芹子烯合成酶或r-葎草烯合成酶編碼 及一個可篩選的基因，如，具有抗康黴素編碼的lean基因 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂' -線- 200300171 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 _B7 ___五、發明説明（25) 的質體進入包含有如 Hoeckema et al·，303:179-181 [1983]所街路之輔助Ti質體之產瘤田野桿菌 it/mi/ac/这似)並以葉片培養該等田野桿菌細 胞使如 An et al·，Ρ/αηί 81:301-305 [1986]所揭 露而被轉形。植物宿主細胞之轉形作用通常經由產瘤田野 桿菌iwmi/acien·?)完成之，正如上所述。不 具有堅硬之細胞膜障壁之哺乳動物及其他宿主細胞之培養 通常以採用破酸約之方法轉形之，其由Graham及Van der Eb首揭（Wro/ogj; 52:546 [1978])並由 Sambrook et al·，汶吵广<2 之16.32-16.37節揭露其修飾。然而，其他用於將DNA送入 細胞的方法如 Polybrene (Kawai and Nishiwaza，Mo/· Ce//· 价〇/· 4:1172 [1984])、原生質融合（Schaffner，Proc· iV^i/· *SW· C/iS^4 77:2163 [1980])、電穿孔（electroporation) (Neumann et al·，五M50 ·/· 1:841 [1982])，以及直接為注射 進入細胞核（匸&卩6〇(：1^，€^//22丨479 [1980])等亦可被採用。 此外動物性轉形策略被Monastersky G.M·及Rohl，J.M.檢閱 於 iSiraiegia M TVanirgenic *SWence，ASM Press， Washington，D.C” 1995。經轉形的植物癒合組織可經在培 養基培養該等細胞由可辉選的標識筛選之，該培養基含有 康徽素及適量的植物激素，如用於癒合組織及發芽誘導之 萘乙酸及苄基腺嘌呤。然後熟習此藝者可利用習知技術產 生該等植物細胞及該等植物。 此外，基因調控之Ε-α-甜沒藥烯合成酶、5-芹子烯 合成酶或葎草烯合成酶生產可與可誘導的啟動子一起 •29- 請 先 閲 面♦ 之 注 項
訂 線 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 B7 五、發明説明（26) 被納入該植物體。實施本發明之具體實施例時，僅具有專 一性外部或内部刺激之啟動子融合至該目標cDNA。因此， 該基因除了回應該專一性刺激外將不被轉錄。只要該基因 不被轉錄，其基因皋物就不會產生。 -可用於實施本發明之回應的啟動子系統之說明實施 例係玉米中的榖胱甘肽-S-轉移酶（GST)系統。GST係一群 對許多常被用作幼苗出土前的除草技之疏水親電性化合物 _ 解毒的酵素（Weigand et al·，朽⑽ί 7:235-243 [1986])。研究顯示該等GST係有關於造成該抗 藥性之增加。本步驟基本上經由一段專一性1 · 1 kb Mrna 轉錄產物調停之。簡言之，玉米具有一種天然存在之可對 外界刺激產生反應並誘導基因產物之產生的沉默基因。本 基因早已被辨識並選殖出。所以，在本發明之一具體實施 例中，其啟動子係被自該GST反應基因移除之並連接至事 先移除啟動子之Ε-α-甜沒藥稀合成酶、5-芹子稀合成酶 或r-葎草烯合成酶基因。本經巧妙處理的基因係組合一 φ -·個對外界化學刺激有反應的啟動子以及一個可以順利產生 Ε-α-甜沒藥稀合成酶、5 -芹子稀合成酶或释草稀合 成酶的基因》 除了上述方法之外，許多習知方法可轉移選殖DN A 使進入各種植物品種，包括裸子植物、被子植物、單子葉 植物及雙子葉植物（見於Glick and Thompson, eds·， Methods in Plant Molecular Biology^ CRC Press, Boca Raton, Florida [1993])。代表性實施例包括以原生質吸收 -30· 本鉍張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4：IUM 210X297公釐） ----------•裝-- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂' 線 經濟部中先樣準<身工消费合作社印製 200300171 A7 A7 B7 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 五、發明説明（27) 的經電穿孔加速的 DNA (electroporation-facilitated DNA) (Rhodes et al·，240(4849):204-207 [1988]);以聚 乙二醇處理原生質（Lyznik et al·，P/awi Mo/ecw/ar 5沁/叹少 13:151-161 [1989]);以裝滿DNA之微粒子痛擊細胞（Klein et al·，ΡΛγίο/· 91:440-444 [1989]及Boynton et al·， 抑ce 240(4858):1534-1538 [1988])。此外，植物轉形策 略及技術被檢閱於Birch，R.G.，drtn Λβν尸ΡΑγ尸 Mol Biol 48:297 (1997); Forester et al., Exp. Agric. 33:15-33 (1997)。次要變異體使得該等技術可實施於大範圍之 植物品種。 該等技術各有其優點及缺點。各技術中，質體DN A 通常被巧妙處理使其不只包含該插入基因，一包括可選擇 的即可篩選的標識基因。可選擇的標識基因係被用以選擇 僅含有該質體之完整套數之細胞（該建構體係將插入的基 因及該等可選擇的和可篩選的基因被當作一個轉移單 位）。該可篩選的基因對只具有該等插入基因的細胞之順 利培養提供另一檢驗。常用之選擇性標識基因係新擻素磷 酸轉移酶II (NPT II)。本基因傳達康黴素的抗性，該康黴 素係一種可直接添加至該等細胞生長的培養基之化合物。 職務細胞通常對康黴素敏感並因之致死。該NPT II基因之 存在克服該康黴素的影響且具有此基因之細胞持續存活。 另一可被採用以實施本發明之選擇性標識基因係對該除草 劑glufosinate(Basta)具有抗性之基因。常用的篩選性基因 係冷-葡萄糖苷酸酶（GUS)。本基因之存在特徵在於其以組 -31- 本鉍張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請 先 閲 之 注 I h 頁 裝 訂 線 200300171 at B7 五、發明説明（28) ----------.裝-- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 織化學反應中推定的轉形細胞樣品進行GUS化驗溶液處 理。在適當培養後，該等包含該GUS基因之細胞變成藍色。 較佳地，該質體將同時包含選擇性和篩選性細胞。 包含一個或以上該等基因之質體以前述任一種技術 ，被送入植物原生質或癒合組織細胞中。若該標識基因係選 擇性基因，則只有該等被納入該DNA包袤之細胞在該適 f 當的植物毒劑之選擇下存活。一但該等適當細胞被辨識出 φ 並繁殖之，則產生植物體。該等轉行植物之後帶必須被測 試以確定其DNA包裹已經順利地進入該植物之基因庫 中。 線 經濟部中識準局Λ·工消费合作社印製 哺乳動物宿主細胞亦可被用於實施本發明。合適的 哺乳動物細胞株實施例包括一SV40轉形的猴子腎臟CVI株 (COS-7, ATCC CRL 1651);人類胚胎腎臟株293S (Graham et al·，/· Gd Wro/· 36:59 [1977]);老鼠赛拢利氏細胞 (BHK，ATCC CCL 10);中國大頻鼠卵巢細胞（Urlab and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 [1980])) ； ^ IL ^ 腎臟細胞（CVI-76，ATCC CCL 70);非洲綠猴腎臟細胞 (VERO-76，ATCC CRL-1587);人工子宮頸癌細胞（HELA， ATCC CCL 2);犬腎臟細胞（MDCK，ATCC CCL 34);水牛 大老鼠肝臟細胞（BRL 3 A，ATCC CEL 1442);人類肺細胞 (W138, ATCC CCL 75);人類肝臟細胞（Hep G2, HB 8065); 老鼠乳房腫瘤細胞（MMT 060562, ATCC CCL 51);老鼠肝 癌細胞（HTC, MI.54，Baumann et al·，·/· Ce// 85:1 [1980])及 TRI細胞（Mather et al.，dnwa/s 见 K dcarf· iSW· •32- 本鉍張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 200300171 A7 B7_ 五、發明説明（29) 383:44 [1982])。該等細胞之表現載體通常包括（若需要）一 段複製區域之DNA序列、一個位在該將表現之基因前端 之啟動子、一個核糖體結合位置、一個RNA剪接位置、一 個聚腺苷酸化位置，以及一個轉錄終止位置。 用於哺乳動物表現載體中之啟動子常來自病毒《該 等病毒性啟動子通常衍生自多性瘤病毒、腺病毒2，及最 常見的Simian Virus 40 (SV40)。·該SV40病毒包含兩個啟 動子，稱為早期及晚期啟動子。該等啟動子特別有用因為 其皆為易於自病毒中獲得者*該病毒係一段包含該病脊性 複製區域之 DNA 片段（Fiers et al·，273:113 [1978])。亦可使用較小的或較大的SV40 DNA片段，其包 含該並延伸自該病毒複製區域中Hindlll位置至該Bgll位置 約250-bp之序列。 任擇地，可採用天然連接於該外來基因之啟動子（同 源啟動子），因為其和選用於轉形作用之宿主細胞株相容。 複製區域可得自外生來源，如SV40或其他病毒（例多 性瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)並可插入該選殖載體。 任擇地，該複製區域可由該宿主細胞染色體複製機制提 供。若包含該外來基因之載體被整合進入該宿主細胞染色 體，則後者常為充分的。 二級DNA編碼可加強Ε-α-甜沒藥烯合成酶、5-芹子 烯合成酶或T-葎草烯合成酶在轉形細胞株中之產量。該 二級編碼序列通常包含酵素二氫葉酸還原酶（DHFR)。原 型DHAR通常被化學物質胺甲碟呤（MTX)抑制。DHFP在細 _-33-__ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -----r--f—--裝-- (請先閲讀背面之注意事項再^頁) -訂 經濟部中夫梯準局t工消费合作社印製 200300171 A7 B7 五、發明説明（30)
胞内之表現程度將視添加至該經培養的宿主細胞之MTX 量而定。DHFR作為一個特別有用的二級序列之另一特徵 係在於其可被用作一選擇標識以辨識轉形細胞。可得到兩 種作為二級序列之DHFR，原型DHFR及抗MTX之DHFR。 用於特定宿主細胞之DHFR之種類係視該宿主細胞是否缺 乏DHFR (使其不是DHFR產量極低，就是完全不能產生功 能性DHFR)而定。由Urlaub及Chksin揭露於sifpra中缺乏 钃| DHFR之細胞株被轉形以原型DHFR編碼序列•轉形作用 之後，該等缺乏DHFR之細胞株表現功能性DHFR並可生 長於缺乏營養素次黃嘌呤、甘胺酸及胸答之培養基中。未 經轉形的細胞將不能於該種培養基中生存。 該抗MTX型的DHFR可被用作在該等内生的產出正常 量之對MTX敏感之功能性DHFR之宿主細胞中選出轉形宿 主細胞之方法。CHO-K1細胞株（ATCC No· CL 61)具有該
等特徵，且因而對於本目的為有用的細胞株。添加MTX i 至該細胞培養基將只准許該等經具有抗MTX之DHFR編碼 | • 之DNA轉形的細胞生長◎該等為經轉形的細胞將無法於 本培養基中生存《 原核生物亦可被用作本發明起始編碼步驟之宿主細 胞。其對於快速產生大量DNA、用於位置專一突變之單 股DNA之生產、同時篩選許多變異體，以及該等產生的 變異體之DNA定序尤其有用。合適的原核宿主細胞包括凡 α/ζ· K12 品係 294 (ATCC No· 31446)、五·⑶"品係 W3110 (ATCC No. 27325) ' E. coli X1776 (ATCC No. 31537) » JSl -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） I 裝 n —訂1 ~線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁). 200300171 A7 B7__ 五、發明説明（31) co/z· B ;然而許多 c<9/z·之其他品係，如 HB101，JM101， NM522，NM53 8，NM539，以及許多別種和別屬之原核生 物，包括枯草桿菌等桿菌、鼠傷寒桿菌 (Salmonella typhimuriuni)灸 1 释議{Serratia marcesans)專 其他腸道桿菌科，以及各種假單胞菌屬〇Pm Worn⑽w)皆 可被用作宿主。原核宿主細胞或其他具有堅硬細胞壁之宿 主細胞較佳地以揭露於Sambrook et al·，第1.82節中 之氯化約方法轉形。任擇地，電穿孔（electroporation)可 被用於該等細胞之轉形作用。原核生物轉形作用技術被提 出於Dower, W· J·，in Genetics Engineering, Principles and Methods, 12:275-296, Plenum Publishing Corp., 1990; Hanahan et al·，MeiA.五似少mo/·，204:63，1991 ❶ 作為一個代表性的實施例，具有E- α -甜沒藥烯合成 酶、芹子烯合成酶或7-葎草烯合成酶編碼之cDNA序 列可被轉移至商業化之（His)6· TagpET載體（來自Novagen) 以在[co/i異源宿主中過度表現。本pET表現質體在高效 益性表現系統中具有許多優點。該所需的cDNA插入物於 被連結至具有六個組織胺酸編碼其後並接有一個高度專一 性蛋白晦辨識位置（凝血酶）與該目標蛋白質之胺基端連接 之質體載體序列架構中。該融合蛋白質之組織胺酸，，塊，，助 長極緊密之結合以固定金屬離子並以該固定的金屬離子親 合力色層分析允許該重組型蛋白質之快速擴增作用。該以 組織胺酸為首的序列接著於該專一性蛋白質裂解位置經該 以凝血晦純化的蛋白質處理而被切開，而E- α -甜沒藥烯 _________ -35- _____ 本紙張尺度逋用中國國家檩準（CNS ) A#規格（21〇><297公釐） 請先聞讀背面之注意事項再填Λ:頁) 裝. -訂· -線- 經濟部中央標準局負工消費合作社印装 200300171 A7 B7 五、發明説明（32) 合成酶、5-芹子烯合成酶或葎草烯合成酶以固定的金 屬離子親合力色層分析再次純化，這次利用一個較淺的罙 唑梯度以析出該重組型合成酶而仍吸附該組織胺酸塊。本 過度表現純化系統具高效性、完美的溶解力，且係快速的， 此外以類似的鍵結行為造成的[α/ί污染蛋白質之機會 (凝血酶裂解之前或之後）很小。 一如熟習此藝者所了解，任核包含複製子及衍生自 相容於該素主細胞之品種的控制序列之質體載體皆可被實 施於本發明。該載體通常具有一個複製位置、供轉形細胞 中表型選擇之標記基因，以及一個包含許多用以插入外來 DNA之限制切位的聚交連劑區域。常用於五· 之轉形作 用之質體包括pBR322, pUC18, pUC19, pUCI18, PUCI19及 Bluescript M13，其皆揭露於Sambrook et al.，第 1.12-1.20節。然而，還有許多其他合適的載體。該等載體 包含具有抗氨苄青黴素及/或Θ環黴素編碼之基因，其使 該經該等載體轉形的細胞可在該等抗生素存在下生長。 該等啟動子最常用於包括有沒-内醢胺酶（青黴素酶） 及乳糖啟動子系統（Chang et al· iVVziwM 375:615 [1978]; Itakura et al., Science 198:1056 [1977]; Goeddel et al., //aiwre 281:544 [1979])及一個色胺酸（trp)啟動子系統 (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057 [1980]; EPO Appl. Publ· No. 36776)，以及鹼性磷酸酶系統之原核載體中e 當其係最常用者時，其他曾用的微生物啟動子，及曾被出 版之關於其核苷酸序列之細節使熟習此藝者易於功能性地 -36- 本纵張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ---------^II (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 經濟部令央揉率局贫工消费合作社印装 200300171 A7 經濟部中央標準局舅工消費合作社印製 B7五、發明説明（33)連結其至質體載體内（見於Siebenlist et al·，Ce// 20:269 [1980]) 〇 許多分泌自該細胞之真核蛋白質在其胺基酸序列之 部分包含有一段内生的分泌訊息序列。所以，如本發明之 倍半萜烯合成酶等存於細胞質之蛋白質可經由連結一段訊 息序列而成為分泌目標。其做法係將具有一段訊息序列編 碼的DNA連結至具有該蛋白質編碼之DN Α的5 ’端上然後在 適當的宿主細胞内表現該融合的蛋白質。具有該訊息序列 編碼的DNA可得自任何有訊息序列之蛋白質基因編碼之 限制片段。因此，在此原核的、酵母菌的及真核的訊息序 列之使用可視實施本發明時所採用的宿主細胞型態而定。 具有如人類生長激素、預胰島素及預蛋白酶等多種真核基 因之訊息序列部分編碼之DNA及胺基酸序列係為習知的 (見於 Stryer，Biochemistry W.H. Freeman and Company, New York，NY, p· 769 [1988])，且在適當的真核宿主細胞 内可被用作訊息序列。酵母菌訊息序列，如酸性磷酸酶 (Arima et al” iW/c· 如· 11:1657 [1983])、阿伐因子 (alpha_factor)、鹼性磷酸酶及蔗糖酶可直接自酵母菌宿主 細胞分泌。得自 LamB或OmpF (Wong et al” Ge/ze 68:193 [1988])、MalE、PhoA或冷-内醯胺酶等編碼之基因，以及 其他基因之原核訊息序列可被用以將原核細胞之蛋白質送 入培養基。 本發明之倍半萜烯合成酶缺乏一段N端標的序列。雖 然如此，植物、動物及微生物之N端標的序列再實施本發 -37- 請 先 閲 之 注 I 麵 頁 裝 訂 線 本多氏珉尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 200300171 Α7 Β7 五、發明説明（34) ----------窣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 明時可被用以導引該等倍半萜烯合成酶至内質網、粒線體 或其他細胞組成，或者標的該蛋白質以輸出至介質。此等 考量適用於Ε_ύ：_甜沒藥烯合成酶、5-芹子烯合成酶或7 -葎草烯合成酶之過量表現，以及造成在細胞内或完整生 物體内之表現使基因產物在任何所欲位置作用。 含有具複製序列、調控序列、表型篩選基因編碼之 DNA及所欲的Ε-α-甜沒藥烯合成酶、（5 -芹子烯合成酶或 葎草烯合成酶DNA之適當載體之建構體可以標準重組 型DNA程序製備。分離的質體及DNA片段以特定順序分 裂、加尾端並連結在一起以產生所欲的載體，一如習知技 藝（例如見於 Sambrook et al·, 。 如上所述，Ε-α-甜沒藥烯合成酶、芹子烯合成酶 或r-葎草烯合成酶變異體較佳地以位置專一誘變法產生 突變之方式產生。本方法需要合成並利用同時具有該所需 突變體之序列及適量的鄰近核苔酸編碼之專一性寡核苷酸 以確保該核苷酸可穩定地與該DNA模板雜合 經濟部中夹標準局I工消费合作社印製 該Ε-α-甜沒藥烯合成酶cDNA、芹子烯合成酶 cDNA或r ·葎草烯合成酶cDNA之分離允許用於該等功能 性酵素知表現系統之發展；提供檢驗倍半萜烯生合成之發 生調控之有用的工具；並准許其他具有Ε-α-甜沒藥烯合 成酶、5 -芽子婦合成酶或7-律草稀合成酶編碼之基因分 離。該Ε_α-甜沒藥烯合成酶、5-芹子烯合成酶及r-葎 草烯合成酶cDNA之分離亦允許有機體廣泛之轉形作用。 具有E-α-甜沒藥烯合成酶、5-芹子烯合成酶及7*- -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 200300171 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 發明説明（35) 律草烯C7成酶、4媽之基因可被納入任何有機體（完整的植 物、動物、微生物），或其衍生之細胞栽培株，其視該有 機體而錢產生：伽法呢醋使該基本基質轉化為E+ 甜沒藥烯、以子.烯或T·律草稀，及其後續代謝產物。 該等甜沒_合成酶u子烯合成酶或厂擇草 烯合成酶基因可因應不同目的用於任何—種有機體，其包 括但不限於：倍半萜烯重新生合成之採用；内生的倍半萜 烯生合成之修飾，例如，改變植物材料之氣味及/或味道 特色，或產生提供大量味道及/或氣味化合物來源的植物； 防禦能力之改善，例如，產生倍半萜烯產物作為趨蟲劑、 防蛀劑、抑卵劑、毒素，或者作為植物補體（抗生素）或荷 爾蒙類似物之前趨物；其他以二磷酸法呢酯及其衍生物調 節的生態學反應，例如，植物之遺傳變異以產生各式作用 如傳粉者引誘物’或如競爭的植物補體之倍半萜婦。 下列代表性實施例有助於對前述之了解，其中「質 體」以小寫P及一個代表性標號標記之。本發明所用之起 始質體係一般商業化共用的，或可用習知前趨物建構自該 等商業化質體。此外，其他等效質體對熟習此藝者來說皆 為習知的。 DNA之「分解」、「切割」或「分裂」係指以一種 只作用在該DNA之特定位置上之酵素之催化性分裂。該 等酵素被稱作限制内切核酸酶，且沿著該DNA序列之各 酵素作用之切位被稱作限制切位。本發明所用之該等限制 酵素係商業化的並根據其製造者所提供之說明使用之亦 -39- 請 先 閲 面 之 注 li 頁 裝 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 B7 五、發明説明（36 可見於Sambrook et al·，第 1.60-1.61 節及3.38-3.39節） 得自限制分解之DNA片段之「回收」或「分離」係指 以電泳分析聚丙烯胺或瓊脂凝膠上所得DNA片段之分 離，以已知分子量之標記DNA片段之可動性與插入片段比 較以辨識之，包含該所欲片段之凝膠之移除，以及將DNA 自該凝膠上分離。本步驟係一般習知者。例如，見於Lawn et al. 9:6103-6114 (1982))，及Goeddel ei al. (Nucleic Acids: Res., supra) o 【實施方式】 下列實施例僅說明目前欲實施本發明之各式具體實 施例，而不應被用以限制本發明。此處所有引言皆清楚地 納入附件。 實施例1 抽取自未受傷之大洽杉grafx山·幼苗之油性樹脂倍 半褡烯之分妍 涵/4 靥分灕及分#·將大冷杉幼苗經部切成2-3m瓜支 圓盤狀並以丙烷（3.0 ml/g組織）於室溫萃取隔夜。該丙烷萃 取物以活性炭除色，以水洗滌，並通過MgS04及矽膠管柱 (Mallinckrodt，60A型）以移除任何殘留之水分以及鍵結氧 合代謝物，因而提供該松脂部分。然後以二乙醚潤洗該管 柱以釋出該等氧合代謝物。毛細管GLC(燃燒電離偵測器） 被用於該松脂單萜烯及倍半萜烯烴成分之辨識及定量[具 備冷卻（40°C)管柱上注射、300°C偵測器及141)虬下^載體 之Hewlett Packard Model 5890，管柱：0 25mm i.d.x 30 m 以0.25//mFFAP之薄膜（Alltech)與矽融合，設計為以 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •訂— ;線丨 200300171 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（37) 5(TC /min由35°C加熱至5(TC (維持5分鐘）然後以1(TC /min加 熱至230°C /min]。毛細管GLC-MS被用以經由與可信的標 準比較滯留時間及70 eV質量光譜而確實辨識[Hewlett Packard Model 6890氣體色層分析與Heweltt Packard Model 5872質譜儀一起用冷卻的（4(TC)管柱上注射，及0.7ml/min 之 He載體，管柱：0.25 腿 i.d.X30 m 以0.25/zm 5MS (Hewlett Packard)或聚乙二 S旨（AT 1000 Alltech)之薄膜與石夕 融合並設計為以50°C /min由4(TC加熱至5(TC (維持5分鐘）-然後以 l〇°C/min加熱至230°C/min]。 可信的萜烯標準來源如下：得自加拿大膠杉 油性樹月旨的α-長蔽稀、環蒜頭稀、蒜頭婦及α-依籣香烯；得自歐洲冷杉β/δα)油性樹脂的5 -芹子 浠；由Larry Cool (加州大學柏克來分校）提出的α -、沒-及7 -希馬巧稀（γ -himachalene)、α -及δ-紫穗塊稀、α-木籮稀（Λ -muurolene)、瘡創未-6,9·二稀、α _杜黎稀、5 -芹子烯、大根香葉烯Α、召-依蘭香烯、召-長蒎烯、五-a -及iS -甜沒藥烤；由Robert Adam (貝勒大學）提出的大根 香葉烯B，以及含有α -杜鬆烯及α -诂》烯的黑胡椒油性 樹脂；由Ron Binder (USDA，Albany，CA)提出的紅色柿子 椒種子之7-葎草烯；得自西伯利亞五葉松（Pinws 油性樹脂枝鮮卑花烯及環千里光烯；購自Sigma Chemical Co.之長葉烯；得自荷蘭芹葉油之五-泠-菌綠烯；得自香菜 及描薄荷草精油之大根香葉稀D ; Rudolf Hopp (Haarmaan及Reimer GebH)提出之冷石竹烯；自胡_ -41-_ 本紙張尺度適用中國國家襟準（CNS ) A4規格（210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填ί •裝· -訂 線- 經濟部中央擦準局务工消費合作社印裝 200300171 A7 B7 五、發明説明（38) 蘿蔔根部分離出之7 -甜沒藥烯；購自Flika Chemical Co. 之α-择草烯；得自瓦倫西瓦（Valencia)撥皮精油之/3-蓽 橙茄油烯；得自芹菜種子之α-芹子烯及芹子-3,7(11)-二 烯；Margaret Essenberg (奥克拉荷馬州立大學）提出之5 -杜鬆烯；得自虎尾草精油之α-癒創木烯；自洋芋葉油分 離出之大根香葉烯C;唇形科植物精油之四曱基雙環十一 碳二烯；以及得自生薑根部之卢·古蕓烯》除非另外提及， 所有其他的生化藥品或試劑皆購自Sigma Chemical Co.或 Aldrich Chemical Co· e 油性樹脂之倍半转烯組成物。大羚衫 細管GLC-MS分析顯示該材料最少約12.5%由38個倍半葙 烯組成，而其餘87.5%係由預辨識出之單萜烯組成 (Lewinsohn, E·，et al.，(1993) Phytochem. Anal. 4，220-225)。其中六種主要的倍半萜烯係α-蓽橙茄油烯、α-琀 把稀、泠-石竹稀、a -木籮稀（a -muiirolene)、5 -杜鬆稀 及瓦五-大根香葉烯B，其佔所有倍半萜烯部分之62% (第3 圖）。亦辨識出5-芹子烯、癒創木-6,9-二烯、r -紫穗塊 烯、鮮皁花烯、T -葎草烯、長葉烯、a -、召-及τ -希馬 巧稀（7* -himachalene)、a -長蔽稀、泠-甜沒藥稀、a -依 蘭香烯、蒜頭烯及環蒜頭烯（該倍半萜烯之〜33%)，而其 餘次要部分（〜5%)係由20種左右未辨識出之倍半萜烯烯烴 組成。 大冷杉之倍半萜烯含量分析再此指出落磯山脈生態 型和先前分析之本材料之海岸生態型非常一致（Smedman， -42 - 本紙張;^度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------^------tr------0 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 200300171 A7 B7 五、發明説明（39) L.A·, et al·，（1969) 8，1471-1479)只有小差 異存於前者（19%大根香葉烯B而無可偵測的/9 -欖香烯）和 後者（8%冷-欖香烯而無可偵測的大根香葉烯B)之間。該差 異似乎是方法（僅靠.滯留時間來辨識肩-欖香烯）所引起的 誤差，並已經以較新的該海岸生態型3之烯烴再分析矯正 之0 實施例2 受傷及未受傷之大冷杉妁幼苗莖部之倍丰萜 烯合成酶活性 摩斧分雜-兩歲大之大冷杉（乂6/以Lindl.)幼苗 係購自 Forestry Research Nursery, University of Idaho, Moscow, ID·。幼苗係以16-h光週期（200-300私E/m2s)及日 間26°C /夜間151：循環溫度栽種於標準盆栽混合土（Sals Inc., Puyallup, WA) t，並每週施肥[15:30:15(N:P:K)]並每 曰澆水。 積極生長的大冷杉幼苗被用酵素來源以經由標準癒 傷程序在受傷莖部内測知被誘導的類萜烯合成酶組成物及 類萜烯合成酶（Funk, C.，et al·，（1994)朽⑽i 106, 999-1008)。收集除對照組幼苗之莖部及受傷八天後之幼 苗（通常十株幼苗）並移除之頂部及側部生長，並自其基部 切除約5cm。該等莖部被剁成5-7cm之片段，在液態乂中冷 凍，並在移除所有針葉後在一個經液態仏冷凍了的1號 Wiley研磨機中磨成粉末狀。該冷凍粉末被添加至經冷凍 的緩衝液（5 ml/g新鮮組織），該緩衝液包含10 Mm磷酸鉀 • 43- 本鉍張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） 請先閲讀背面之注意事項再填βι頁： •裝· 訂- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 經濟部中夬標準局舞工消費合作社印製 200300171 at B7 五、發明説明（40) 二鹼鹽及 1.8 mM—元磷酸鉀（pH 7.3)、140 mM NaC卜 20 mM 泠-氩硫基乙醇、10 mM MgCl2、5 mM MnCl2、 10% (v/v) 甘油及各1% (w/v)之聚乙烯咄咯酮（Mr 40000)及聚乙烯聚 吡咯酮。該抽出物於〇-4°C攪拌30分鐘然後以5000Xg離心 並通過Miracloth (Calbiochem)過遽以淨化之。該抽出物之 部分純化係如前所述（Gijzen，M·，et al·，（1991) Biockem. Biophys· 289, 267-273)在 0-二乙基胺基乙基纖維 藝 素（Whatman DE-52)上經色層分析達成。 摩#/6潑-前述已報告[1-3H]二磷酸法呢酯（125 Ci/mol)(Dehal，S.S·及Croteau, Λ·, JrcA· 261: 346-356 (1988))、[1_3H]二磷酸桅牛兒基槐牛兒酯（120 Ci/mol)(LaFever et aL, Arch. Biochem. Biophys. 313: 139-149 (1994))、及[1-3H]二磷酸槐牛兒酯（250 Ci/mol)(Croteau， R，et al·，（1994) yireA. 5/(9/7办>^· 309: 184-492)之 合成。可信的萜烯標準之來源在實施例1中提出。 對重組型倍丰萜烯合成酶（循環酶）活性之化驗係在1 ¥ ml包含3·5#Μ [1-3Η]二磷酸法呢酯之緩衝液（不含MnCl2 ^ 或聚合吸附劑之萃取緩衝液）中進行且自5 ml細菌培養液 中抽取出之總蛋白質在31°C下2 h内產生105-106 dpm之產 物°在該培養混合物上覆蓋1 ml戊烷以分離揮發性產物，。 培養後，以戊烷（3 XI ml)抽取該反應混合物並使該經組合 的抽取物通過一 MgS04矽膠管柱以提供前述之萜烯碳水化 合物部分。接著以3 X 1 ml之乙醚洗滌該等管柱以收集任 何氧合產物，並取各部分之整數進行液體閃爍計數以決定 -44· 本紙張纽適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2獻297公釐） I--------^------1T------線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 200300171 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A7 B7_ 五、發明説明（41) 轉化率。該單萜稀合成酶及二搭烯合成酶活性之化驗以類 似於揭露於他處（LaFever，R.E.，et al·，（1994) drcA. Biochem. Biophys. 313, 139-149; Bohlmann, J., et al., (1997) J. Biol. Chem. 272, 21784-21792; Lewinsohn, E., et al., (1991) 戶/αηί ΡΑγίο/· 96, 38-43)之細節執行之。 在預備培養物時，該分析物被調整至5 ml，其包含 自100 ml細菌培養液抽取出的所有蛋白質及30# M[1-3H] 二磷酸法呢酯，並將其培養時間延長至8 h。其烯烴部分 及含有氧合代謝物（二乙醚析出物）之整數以液體閃爍技術 評估之，並經無線電-GLC (Croteau, R· & Cane, D.E. (1985) Method Enzymol. 110， 383-405; Satterwhite, D.M. & Croteau，R· (1988) ·/· 452，61-73)分析之，其 係利用Gow-Mac 550P層析儀，該層析儀在100/120網狀Gas Chrom Q (Alltech)上配備有一個3.18mm X3.66 m，以5% OV17 (50%苯基：50%曱基矽氧烷）包覆之不銹鋼柱，並設 定在以2°C/min由150°C加熱至220eC並以He作為載體。共 同加入的標準析出誤以Gow-Mac熱傳導偵測儀（25(TC及 150 mA)追縱之且該放射能訊號以Nuclear Chicago Model 8731氣體比例計數器持續追蹤之；輸出資料以Perkin-Elmer Turbochrom Software處理之。 液體閃爍計數係以10 ml曱苯：乙醇（7:3, v/v)執行， 其在3H計數效率為43%時包含0·4% (w/v) Omnifluor (DuPont-NEN)。蛋白質濃度以 Bradford (Bradford, Μ·Μ· (1976) 们oc/rem· 72，248-254)之方法決定，其係以 -45- (請先閲讀背面之注意事項再填β頁) -裝· -訂- -線· 本鉍張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 經濟部中央榛準扃I工消费合作社印裝 200300171 Α7 Β7 五、發明説明（42)
Bio-Rad試劑及小牛金清作為標準。 分離自受傷及未受傷的大冷杉莖部之倍半萜烯合成 鏵之活尨。自未受傷的（對照組）幼苗莖部抽取出之適 當酵素催化[1-3H]二磷酸法呢酯，類倍半萜烯之普遍性前 趨物（Cane, D.E. (1981) in Biosynthesis of Isoprenoid Compounds (Porter, J.W, & Spurgeon, S.L., eds) Vol. 1, pp 283-374, John Wiley and Sons, New York; Cand, D.E. (1990) φ CAem· i?ev· 90，1089-1103)之二價金屬離子轉化成為一個 經標定的烯烴部分（12x2 ml化驗產生的〜16 nmol產物），其 係以無線電-GLC分析達成並顯示出與該油性樹脂中倍半 萜烯相同的光譜。 酵素抽取物同樣係製備自受傷9天候之幼苗莖部*其 係採用標準受傷步驟（Funk，C·，et al·，（1994)尸ΡΛπίο/· 106, 999-1005)，並如前述分析之（2x2 ml化驗產生1·8 nmol 產物）。該烯烴部分之無線電-GLC分析顯示出一個明顯的 單一成分之存在，其滯留時間非常像私-杜鬆烯者。得自 ^ 誘導幼苗之抽出物之部分純化作用可消除殘餘之内生的油 性樹脂，然後進行預備量化驗，以提供足量材料進行毛細 鬌 管GLC-MS分析。本較高之鑑別方法顯示，以誘導性酵素 衍生自二磷酸法呢酯之產物包含兩種主要成分，經辨識為 5-杜鬆烯及五甜沒藥烯。 儲存期間該5 -杜鬆烯合成酶活性之損失差（數據未顯 示）暗示了 5-杜鬆烯及五-α-甜沒藥烯為兩種不同酵素之 產物。煮沸的對照組，及不含二磷酸法呢酯之對照反應缉 -46-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） V > ----------^------1Τ------^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 200300171 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（43) 實構造性及誘導性倍半萜烯合成酶活性皆為視酵素及基質 而定的。[1-3H]二磷酸法呢酯和部份純化之誘導性倍半萜 烯合成酶之尺m值約為0.4Mm。有趣的是，在其可能的生 理特性中，構造性倍半萜烯合成酶活性與該傷誘導的酵素 活性在產物組成上不一樣。類似的現象亦存於本組織之構 造性及傷誘導性單萜烯及二萜烯合成酶（Funk，C·，et al.， (1994) Plant Physiol.106, 999-10Ό5; Gijzen, M., et al., (1991) 289，267-273)。 實施例3 完整長度之五甜沒藥揄合成酶cDNA選殖 如實施例2所提及，受傷的大冷杉抽取物可以將二磷 酸法呢酯轉化成5 -杜鬆烯及fa -甜沒藥烯。PCR選殖策 略被用以選殖負責形成5 -杜鬆烯及fa甜沒藥烯之傷誘 導性酵素之一或二者。 根據得自綠薄荷之華烯合成酶（Colby，S· M·，Alonso, W. R·，Katahira，Ε· J·，McGairvey, D· J·及 Croteau，R· (1993) /·价〇/· CAem. 268，23016-23024)、得自菸草之5-表-馬兜 鈴婦合成酶（Facchini，Ρ· J.及Chappell, J· (1992)尸Λ^ζί/· W· Scz·· 89, 11088-11092)及得自蓖麻子之蓖麻烯合成 酶（Man, C· J· D·及 West, C· Α· (1994) /Vw.iVai/· dead· 5W· CASW 91，8497_8501)之比較，辨識出四段保留性區域，其 合成一套一致的變質引子（引子A-D)。引子A、B及C已揭 露於前述（Steele, C· L.，et al·，（1995)尸⑺e. iWz"· 5W· CAW 92，4164-4168);未曾揭露於前述之引子D序列係基 • 47- -----·Γ丨卜；——裝—— (請先閲讀背面之注意事項再填頁) -訂 ·. -線_ 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） 200300171 A7 B7_ 五、發明説明（44) 於上述萜烯合成酶之保留性胺基酸序列片段DD(T/I)(I/Y/F) D(A/V)Y(A/G)(序列辨識編號：32)而標記之。訊息引子D 之序列係 5，-GA(C/T) GA(C/T) III T(T/A)(T/C)GA(C/T)GCI (C/T)A(C/T) GG-3’（序列辨識編號：3)。該等訊息引子A、 B及D分別經由採用大範圍之擴增作用條件與反訊息引子C (序列辨識編號：2)組合以用於PCR。 PCR執行於總體積為50#1中，其包含有20 mM 響 Tris/HCl (三甲醇胺基甲烷/HC1，pH 8.4)、50 mM KC卜 5mM MgCl2、200" Μ各式dNTP、1-5# Μ各式弓1子、2·5單位之 nqr聚合酶（BRL)及5从1經純化之大冷杉莖部cDNA基因庫 噬菌體以作為模板（1.5><109?化/1111)。該？€11反應產物之瓊 8旨凝膠電泳分析（Sambrock，J·，Fritsch，E· F·及 Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual^ 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) 顯示僅引子C (序列辨識編號：2)與D (序列辨識編號：3) 之組合產生一段約110 bps之專一性PCR產物。本PCR產物 ▼ 以凝膠純化之、連結至pT7Blue (Novagen)，並轉形至五· α/ί XLl-Blue細胞中。質體DNA係從41個轉形體製備之並定 m 序其插入物（DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing， Applied Biosystems)❶辨識出四種不同的插入序列，並標 記為探針1、2、4及5。 探針1係用以篩選在前述之受傷的大冷杉莖部基因庫 105之cDNA噬菌體斑。與探針1對應之最大的cDNA係2424 bp cDNA 乂(?人25 (序列辨識編號：1)，其係基因家族 -48- 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） I---------¥------1T------^ Γ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 200300171 翅济都中夬蒙局貝工>s«費合作、社印製 A7 B7_ 五、發明説明（45) 中的一員（Bohlmann，J·，et al.，/· 272:21784- 21792(1997))。該基因家族包含大冷杉⑽山·〇 及太平洋紫杉之單萜烯、倍半萜婦及二 萜烯合成酶基因。基因家族具有至少40%之胺基酸 相似度。 為了產生一段對應於植株AG1.28(序列辨識編號：1) 之完整長度之cDNA，依照操作手冊採用馬拉松式cDNA擴 增系統（Marathon cDNA amplification system) (Clontech) 進行5’-11八0£。對乂6/.2(?(序列辨識編號：1)專一的尽向 RACE 引子係 RJ1 (5，_AGA CGG TCG GAC AGC AGA AAG TGG G_3’）（序列辨識編號：7)。RJ1 (序列辨識編號：7) 係與引子API (序列辨識編號：6) (Clontech)及連結有接合 子之傷誘導的大冷摻莖部基因庫cDNA組合以用於PCR❶ 連結至該cDNA之接合子序列提出於（列辨識編碼：5)之 中。該所得之PCR產物被植入pT7/Blue-載體（Novagen)中。 該選殖之PCR產物之一段内部的404 bp cDNA片段RJ8 (序 列辨識編號：8)以引子RJ1 (序列辨識編號：7)及以2(5’-CTT GGA TCC ATG GCT GGC GTT TCT GCT G-3，)擴增 之，其中該引子RJ2 (序列辨識編號：9)係設計成一段5amHI 之限制切位用以將RJ8 (序列辨識編號：8)次選殖進入衍 生自 pBluescript SK(+)之質體pAG1.28 (Bohlmann, J” et al·， 丄 Bb/· Ckm· 272:21784-21792(1997))中。 位於pAG1.28 (序列辨識編號：1)中之cDNA插入物之 第2382個核苷酸之一段FincII切位，其係為位於該2350 bps ___-49- ___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -----,·5.Γ——^! (請先閱讀背面之注意事項再頁) 訂- -線- 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 200300171 7 A7 B7 五、發明説明（46) 開放閱讀架構之停止密碼下游之32個核苷酸，其係利用 QuikChange位置專一誘變套組並根據其使用手冊利用誘 變引子F (5’-GTT GCA ΑΤΑ ATA ATT GTT ATA ATC TCA ACT ATG TTT CAC-3’）（序列辨識編號：i〇)及引子厌（5’-GTG AAA CAT AGT TGA GAT TAT TTC AAT TAT TAT TGC AAC-3’）（序列辨識編號：11)以位置專一誘變消除 之。Cdna片段RJ8 (序列辨識編號.：8)被5amHI及分 # 解並連結至經5⑽分解的pAG1.28而生成質體 pAGl。插入pAGl之cDNA核苷酸序列被提出於（序列辨識 編號：12)。插入pAGl之2528 bp經5amHIAH7ncII分解的 cDNA (序列辨識編號：12)被次選殖進入經 分解的pGEX-4t-2 (Pharmacia)而形成質體pGAGl以進行功 能性表現。所有重組型質體之插入物經採用DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing法（Applied Biosystems)以弓1 子漫步雙股以完成定序。序列分析係以Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI 執行之。 實施例4 cDNA菌落AG1 i序列辨識編號·· 12)之序列分析 (序列辨識編號：12)之一段2451個核苷酸的ORF 具有一段817個胺基酸的蛋白質編碼（序列辨識編號：13)， 其分子量為93776且pi估算值為5·03。菌落衍生出之胺 基酸序列（序列辨識編號：13)與其他轉殖植物萜烯類合成 酶比較之並比擬兩種最接近的裸子植物二搭烯合成酶，大 -50· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 11111 訂 I n 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 200300171 經濟部中央標準局負工消费合作社印家
A7 B7 五、發明説明（47) 冷杉松香二稀合成酶（71%相似度，49%—致性）（Stofer Vogel, B., et al., (1996) J. Biol. Chem. 271, 23262-23268) 及短葉紅豆杉（TVxws 紅豆杉二稀合成酶（71 %相 似度，49%—致性）（Wildung, M.R. & Croteau, R. (1996) ·/· 5b/· Chm· 271，9201-9204)，以及大冷杉倍半萜烯合成 酶中具有5-芹子烯合成酶編碼（序列辨識編號：20)之AG4 (70°/。相似度，48%—致性）及具有r -葎草烯合成酶編碼（序 列辨識編號：24)之AG5 (序列辨識編號：23) (68%相似度， 47%—致性）。AG1蛋白質（序列辨識編號：13)與大冷杉單 萜烯合成酶共享63-65%相似度及41-42%—致性（Bohlmann， J·，et al·，J•別·〇/· CAem. 272:21784-21792(1997))。 比較菌落AG1 (序列辨識編號：13)編碼之蛋白質及 朵子植物萜稀類合成酶之序列相關性程度（百分一致性及 百分相似度），由菌落AG1編碼之蛋白質（序列辨識編號： 13)顯示與被子植物之單萜烯合成酶、倍半萜烯合成酶、 二萜烯合成酶具有較低的序列相關性（53-59%相似度，28-34%—致性）（Facchini，P.J·，& Chappell，J· (1992) Prw· Μζί/· Jed· 5W· C/Λί 89, 11088-11092 (得自菸草之一種二 萜烯合成酶，表-馬兜鈐烯合成酶）；Colby，S.M·，et al·， (1993) /· Ck/w· 268, 23016_23024 (得自綠薄荷之一 種單鞟烯合成酶，葶烯）；Mau，C.J.D· & West C.A· (1994) iVai/· 乂⑺么 iScz·· Ι7Λ4 91，8497-8501 (得自蓖麻子之 一種二萜烯合成酶，蓖麻烯合成酶）；Sun，Τ· & Kamiya，Υ· (1994) 尸/⑽ί Ce" 6, 1509-1518 (得自阿拉伯芬 -51- ^^尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210X297公fT (請先閲讀背面之注 .裝. 訂 -線· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 200300171 δ7 Α7 Β7 五、發明説明（48) 之一種二萜烯合成酶，貝殼杉婦合成酶A); Back, K·，& Chappell，J· (1995) /· Ckm· 270, 7375-7381 (得自天 仙子之一種倍半萜婦合成酶，高山绣線菊二烯）；Bensen， R.J·，et al”（1995) Ρ/αηί Ce// 7, 75-84 (得自玉米之一種二 萜烯合成酶，貝殼杉烯合成酶A); Chen, X-Y·，et al·，（1995) 324, 255-266 (得自棉花之一種倍 半萜烯合成酶，5-杜鬆烯合成酶）；Chen，X-Y·，et al·， 瞻 （1996) ·/· iVW. 59, 944_951 (得自棉花之一種倍半萜 烯合成酶）；Dudareva，N·, et al·，（1996)尸/αηί Ο// 8，1137-1148 (得自之一種單萜稀合成酶）; Yamaguchi, S·，et al·，（1996) Ρ/α/ζί 丄10, 203-210 (得自南 瓜之一種二萜婦合成酶，貝殼杉烯合成酶B); Yuba, A·，et al·，（1996) drcA. jBiocAew· 332，280-287 (得自紫 蘇之一種單萜稀合成酶，葶烯合成酶））β 以全長來看，該AG1蛋白質（817個殘基）（序列辨識編 號：13)最接近松香二烯合成酶（868個殘基）及紅豆杉二烯 胃 合成酶（862個殘基）且較大冷杉單萜烯合成酶多180-190個 • 殘基，並比以(序列辨識編號：20)及(序列辨識 編號：24)編碼的大冷杉倍半萜烯合成酶多出220-230個殘 基。比較AG1蛋白質（序列辨識編號：13)、松香二烯合成 酶及紅豆杉二烯合成酶與大冷杉單搭烯合成酶及倍半萜烯 合成晦時，其長度差基本上係以一段214個胺基酸對應於 AG1 (序列辨識編號：13)之Pro81-Tyr294之區域證明之。本 序列要素在AG1 (序列辨識編號：I3)及該兩種二萜稀合成 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I---------裝------訂------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 200300171 A7 B7__ 五、發明説明（49) 酶貝殼杉烯合成酶及紅豆杉二烯合成酶（72-76%相似度， 52-58—致性）間為高度保留性的，但不存於所有預先選殖 出的大冷杉單萜稀合成酶（Bohlmann，J·，et al·，/· 5b/· Ck所· 272:21784-21792 (1997))及倍半褡烯合成酶AG4 (序 列辨識編號·· 20)及AG5 (序列辨識編號·· 24)申。 單萜烯及二β烯生合成被劃分在質體中可是二萜烯 係在細胞質内生合成（Kleinig，Η· (1989) Ρ/α/ζί
Physiol. Plant Mol. Biol. 40, 39-53; Gershenzon, J. & Croteau, R. (1993) in Lipid Metabolism in Plants ed. Moore, T, S. Jr. (CRC Press, Boca Raton, FL), pp. 339-388;
McGarvey, D.J. & Croteau, R. (1995) Plant Cell 7, 1015- 1 1026)。所以，所有選殖的單萜稀合成酶（Bohlmann, J·，et al., J. Biol. Chem. Ill, 21784-21792 (1997); Colly, S.M., et al., (1993) J.Biol. Chem. 268, 23016-23024; Dudareva, N., et al., (1996) Plant Cell 8, 1137-11481 Yuba, A., et al., (1996) drc/t. 332，280-287)及二 IS 烯合 成酶（Stofer Vogel，B·，et al·, (1996) /· 5ζ·ο/· CAem· 271， 23262-23268; Wildung, M.R. & Croteau, R. (1996) J. Biol. Chem. 271, 9201-9204; Mau, C.J.D. & West, C.A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8497-8501; Sun, T. & Kamiya, Y. (1994) Plant Cell 6, 1509-1518;Bensen, R.J., et ah, (1995) Plant Cell 7, 75-84; Yamaguchi, S., et al., (1996) 尸/awij· l〇: 203-210)係具有用於輸入該等核基因產物至質 體之N端運輸胜肽之預蛋白質編碼其中於該體中進行蛋白 -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請先聞讀背面之注意事項再頁 .裝· -訂_ 線 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 200300171 Α7 Β7 經濟部中央標準局貞工消费合作社印製 五、發明説明（50) 質水解以形成成熟形式（Keegstra，K·，et al·，（1989)
Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40, 471-501; von Heijne，G·，et al·，（1989) /· 180，535-545)。 至於胞質酵素，包括由AG4 (序列辨識編號：19)及AG5 (序列辨識編號：23)編碼的蛋白質之所有選殖到的倍半萜 烯合成酶編碼中沒有輸送質體（Facchini，P.J·，& Chappell， J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11088-11092; Back, φ K. & Chappell, J. (1995) J. Biol. Chem. 270, 7375-7381; Chen, X-Y., et al., (1995) Arch. Biochem. Biophys. 324, 255-266; Chen, X-Y., et al., (1996) J. Nat. Prod. 59, 944-951)。儘管其與裸子植物二萜烯合成酶具有高相似度，由 植株AG1編碼的蛋白質（序列辨識編號：12)不包含具有以 質體為標的之序列之N端域（Keegstra，K·，et al·，（1989) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40, 471-501; von Heijne，G·，et al·，（1989) 180, 535_545) o 由植株AG1編碼的蛋白質（序列辨識編號：12)中缺乏輸送 • 質體可解釋其相較於松香二烯备成酶及紅豆杉二烯合成酶 * 時大小的差別（約少了 45-50個胺基酸）。該AG1蛋白質（序 列辨識編號：13)之起始蛋胺酸的相關位置類似於大冷杉 (dhej 之植株AG4及AG5編碼的胞質倍半萜 烯合成酶（序列辨識編號：19及序列辨識編號：23) 之N端，且其位於一段rr-片段（AG1蛋白質（序列辨 識編號：13)中Arg25、Arg26)上游僅25個殘基處， 其在許多植物萜烯類合成酶中係保留性的且被認為 -54· 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •澤--- 、τ- 200300171 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 __B7_五、發明説明（51) 為接近其成熟酵素之N端。並排所有選殖出的植物 li 婦類合成酶（Bolilmann，J·，et al·，/· 5ζ·<9/. CAem 272, 23262-23268; Wildung, M.R. & Croteau, R (1996) J. Biol. Chem. 271, 9201-9204; Facchini, P.j. & Chappell, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1 1088-1 1092; Colby, S.M., et al., (1993) J. Biol. Chem. 268, 23016-23024; Mau,· C-J.D. & West, C.A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci· USA 91, 8497-8501; Sun, T. & Kamiya, Y. (1994) Plant Cell 6, 1 509-151 8; Back, K. & Chappell, J. (1995) J. Biol. Chem. 270, 7375-738 1; Bensen, R.J., et al., (1995) Plant Cell 7,75-84; Chen, X-Y., et al., (1995) Arch. Biochem. Biophys. 324, 255-266; Chen, X-Y., et al., (1996) J. Nat. Prod. 59, 944-951; Dudareva, N., et al., (1996) Plant Cell 8, 1 137-1 148; Yamaguchi, S., et al., (1996) Plant J. 10, 203-210; Yuba, A. et al., (1996) 332, 280-287)顯示該 RR-片 段上游相似度很小，且大冷杉單萜烯合成酶、松香 二烯合成酶及薄荷箏烯合成酶之端缺失分析揭示 該RR-片段上游之殘基與催化活性無關。 簡言之，比較性序列分析揭示出基因產物 (序列辨識編號：13)係裸子植物〇以基因家族之倍 半萜烯及二萜烯合成酶所以其功能性辨識需要有活 性酵素之表現。 -55- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210Χ297公楚) ~ · 請 先 閲 之 注
訂 線 經濟部中夬標準局貝工消費合作社印製 200300171 at B7 五、發明説明（52) 實施例5 cDNA植株AG1 (戽列辨識編號：12)在J?. 中之者 現及產物辨識 cDNA植株AG1 (序列辨識編號：12)在Ε. coli中 之表現。質體pGAGl被轉形進入五· Μ/ί XLl_Blue (Sambrook, J., et al., (1989) Molecular Cloning： A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab·, Cold _ Spring Harbor, NY), 2nd Ed)。所得到的細菌品係五. α/ί XLl-Blue/pGAGl 生長於 37。(：下以 100# g氨苄 青黴素/ml及12.5#g四環黴素/ml補足至Α6ΟΟ=1·0之5 ml 之 LB 培養基（Sambrook, J., et al·, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab·, Cold Spring Harbor, NY), 2nd E d)中’然後添加1 in M之異丙基-1 -硫代-沒-D -半乳 糖吡喃苷以誘導之並在2 0。(：再培養12 h。以離心 (2000 Xg，10分鐘）回收細胞並再懸浮於1 ml單萜烯 P 合成酶化驗緩衝液、1 ml倍半萜烯合成酶化驗緩衝 液或1 ml二萜稀合成酶化驗緩衝液中（Bohlmann，J·， et al·，J· CAem· 272:21784-21792(1997))。 以超音速震盪（具微探針之Braun-Sonic 2000於 0-4 eC以最大動力持續15秒）打破細胞，離心 (18000xg，10分鐘）以澄清該等均質化物質，並取1 ml 所得懸浮液化驗之，依循標準程序（Dehal，S.S. & Croteau, R. (1998) Arch. Biochem. Biophys. 261, -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） —.1 I I I I I 裝— — I I I 訂— — I I I 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 200300171 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ______B7_五、發明説明（53) 346-356; LaFever R.E·, et al., (1994) Arch. Biochem. Biophys. 313, 139-149; Croteau, R. & Cane, D. E. (1985) Methods Enzymol. 110, 383-40 5)]¾ 2.5/z M[l-3H]二磷酸桅牛兒酯化驗其單萜烯合成酶活性、以3·5 /ζ Μ[1-3Η]二磷酸法呢酯化驗其倍半萜烯合成酶活 性’或以5 # Μ[1-3Η]二磷酸槐牛兒基桅牛兒酯化驗 其二萜烯合成酶活性。在單萜·稀合成酶及倍半萜酞 萜烯合成酶之事例中，該培養混合誤以i ml戊烷覆 蓋以阻止揮發性產物。所有事例中，以3丨C培養2 h 以後，以戊烷（3xl ml)萃取該反應混合物且該組合 的萃取物通過1.5 ml之無水MgS04管柱及矽膠 (Mallinckrodt 60人）以提供不含氧合代謝物之萜烯 類碳水化合物部份。然後以3 X 1 mi之乙醚洗滌該等 管枉以收集任何氧合產物，並對各部份之整數進行 液體閃爍計數以決定轉化率。 在E.coli中以cDNA植株AG1 (序列辨識編號·· 12) 編碼的重紅型E-a-甜沒藥烯合成酶產物之特徵。 該倍半萜烯合成酶產物之GLC-MS分析係在裝設有 Hewlett-Packard 5MS毛細管（0.25mmIDx3〇 m，外覆 以0.25私m之5%苯甲基矽氧烷）或AT1〇〇〇毛細管 (0.25EMIDX30. m，外覆以 〇·25// m2 聚乙烯）之 Hewlett- Packard 6890氣體色層分析儀上與7〇以之 四極質譜儀一起執行。以250t之注射器完成分裂 注射且該爐依循維持4(TC5分鐘，以1(rc/min加熱 -57· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公慶）—------ (請先閲讀背面之注意事項再^^頁) -裝· 訂- 線 • Ll — Lr· 200300171 Α7 Β7 五、發明説明（μ) 至250 eC，以50°C/min加熱至300 °c，維持i分鐘之 溫度程式。以〇·7 mL He/min之穩定流執行分離作 用。在配備有召環糊精管柱（0.25mm ID X30 M，具0.2 5 # m厚度薄膜）之GLC-MS系統上進行單萜烯合成酶 分析。以230eC之注射器進行分裂注射且加熱程式 如下··維持70°C 15分鐘，以10°C /min加熱至210eC , 維持1分鐘。流速如上。與該等可信之標準比較質 _ 譜並以 Hewlett-Packard Chemstation 軟體分析之。 根據鏡像純化標準之滯留時間選定其空間結構。 萜烯烴類之酵素性產物僅能以二磷酸桅牛兒酯 及二磷酸法呢酯發現，證實了重組型AG1蛋白質（序 列辨識編號：13)組合了單萜烯合成酶及倍半萜烯 合成酶活性，而不具有二萜稀合成酶活性。該倍半 萜烯產物經GLC-MS辨識為五甜沒藥烯。二磷酸 桅牛兒酯不能被XLl-Blue/pGAGl萃取物轉化成單 萜烯（ + )-4i?-葶烯。二鱗酸桅牛兒酯及二磷酸法呢 # 酯，而非二磷酸桅牛兒基槐牛兒酯之轉化同時也是 β 5-芹子烯合成酶及r-葎草烯合成酶之條件（見實施 例9)。作為實施例4更完整之提出，缺乏用於質體 輸送之轉化胜肽，以及相較於與單搭烯合成酶之相 似度’與以大冷杉之AG4及AG5編碼的倍半莊稀合 成酶（序列辨識編號：Μ及序列辨識編號：23)具 較高之相似程度暗示了 AG1 (序列辨識編號·· 12)具 有命名為五-α甜沒藥烯合成酶之倍半萜烯合成酶編 -58- 本k張又度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公逢） ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂- 線 經濟部中夬標準局貝工消费合作社印製 200300171 經濟部中央標準局貞工消费合作社印製 A7 B7___ 五、發明説明（55) 碼，而非單萜烯合成酶之事實。在完整植物細胞之 生理條件下，胞質五-α -甜沒藥烯合成酶不可能與 存於質體中之二填酸槐牛兒酯相遇（<^1^1^112011，1· & Croteau, R. (1993) in Lipid Metabolism in Plants ed. Moore, T. S. Jr. (CRC Press, Boca Raton, FL),pp. 3 3 9-3 8 8)，所以在篩選本外來介質之不同時沒有環 境壓力。 五-α-甜沒藥烯合成酶（序列辨識編號：13)與其 他精選殖的植物萜烯合成酶分享許多絕對或高度保 留性殘基：Arg3 59，His361，Phe3 73，Leu422，Glu509, Trp516, Pro552 , Asp5 66, Asp567 , Asp570, Trp647, Pro 653 , Cys723 (Bohlmann, J., et al·, J. Biol. Chem. 272:21784-21792(1997))。萜烯類合成酶保留性 DDXXD (序列辨識編號：36)元素（五-α-甜沒藥稀合 成酶（序列辨識編號：13)之Asp566，Asp567，Asp570) 係牵涉到一個二價金屬離子之鍵結（Starks, C.Μ.，et aL, Science 277: 1815-1820(1997); Lesburg, C.A., et al·，Science 277: 1820-1824(1997))，通常為或 Mg2+ ’其被認為係採用於該反應序列之離子化步驟 以中和該二磷酸離去基之負價（Cr〇teau，R (Bp) Chem. Rev. 87, 929-954; Cane, D,E. (1992) Ciba Found. Symp. Ser. 171, 163-167) « 從前未曾自任何其他的有機體選殖出五-甜 沒藥烯合成酶且一個形成單獨的倍半萜烯產物之箱 •59- 本、紙張尺度逋用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X297公釐) --- -----♦---Μ--裝-- (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂 # 線- 經濟部中夫標準局貨工消费合作社印製 200300171 A7 B7 五、發明説明（56) 稀類合成酶亦不尋常。許多萜婶類合成酶有多種產 物（Bohlmann，J·，et al., J. Biol. Chem. 272:21784-21792(1997); Colby, S,M., et al., (1993) J. Biol. Chem. 268, 23016-23024; Munck, S.L. & Croteau, R. (1990) Arch. Biochem. Biophys. 282, 58-64;
Wagschal, K., et al., (1991) Tetrahedron 47, 5933-5944; Savage, T.J., et al·, (1994) J. Biol. Chem. 269, % 4012-4020; Savage, T.J., et al., (1995) Arch. 320，257-265)係親電反應機制的 結果（Gershenzon，J· & Croteau, R. (1993) in Lipid Metabolism in Plants ed. Moore, T. S. Jr. (CRC Press, Boca Raton, FL), pp 339-388; Croteau, R. (1987) Chem. Rev. 87, 929-954; Cane, D.E. (1992) Ciba Found. Ser. 171， 1 63- 1 67)，其中單一產物需 要高度反應性含碳陽離子在該反應位置之緊密調 ，控。 • 甜沒藥烯合成酶之產物絕對專一性與作為防禦 . 化合物，幼稚激素類似物之青春激素的前趨物角色 一樣可抑制昆蟲幼蟲之發展。青春激素係構造上衍 生自甜沒藥烯之椴松酸的甲酯（第2圖）。在各種冷 杉屬Mhes)中，對昆蟲發展及生殖有嚴重損害效果 的倍半萜烯昆蟲幼稚激素類似物，青春激素（Bowers, W.S., et al·, (1976) Science 193, 542-547; Bowers, W.S. (1991) in Herbivores: Their Interaction wuth -60· 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（21QX297公釐） I I I I I I I I 裝——ί I I I 訂— I I I I I 線 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 200300171 A7 B7 五、發明説明（57)
Scondary Plant Metabolites, VoL /, G.A. Rosenthal and M.R. Berenbaum, eds. (Acad. Press, San Diego), pp· 43卜456)在1960年代中期發現「紙因子」就已 被習知（Slama，K· & Williams，C.M· (1965) Prw·
Nalt. Acad. Sci. USA 54, 411-414; Slama, K. & William, C.M. (1966) Nature 210, 329-330; Bowers, W.S·，et al·，（1966) Sconce 154，1020-1021)。在大 冷杉中，椴松酸僅在牙蟲蛀咬後被發現但不在未被 侵害的樹木中偵測到（Puritch，G.S. & Nijholt，W.W. (1974) Cfl/i·丄52, 585-587)其與甜沒藥烯合成酶酵素 活性之傷誘導（揭露於實施例6) —起暗示該幼稚激素類似 物作為一對抗草食昆蟲之誘導性防禦反應之重新生合成。 實施例6 AG1 列辨識编號：12) mRNA表現之傷諉導 大冷杉幼苗經不組織以標準程序使之受傷並收集之 (Gijzen, M., et al., {\99\) Arch. Biochem. Biophys. 289, 267-273)。分離出所有RNA (Lewinsohn, E·，et al·, (1994) Pkni MW· 及印· 4，220-225)並於凝膠上每一條道25 # g之RNA在變性條件下分離之（Sambrook，J·, et al·, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab” Cold Spring Harbor，NY)，2nd Ed)並根據其製 造程序轉印至确化纖維膜（Schleicher及Schuell)上。為了 製備雜合反應之探針，擴增AG1.28 (序列辨識編號·· 1)之 一段522 bp之cdNA片段（序列辨識編號：33)並經具有引 _ -61- 本氏張7^通用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐)
200300171 A7 B7 五、發明説明（58) 子 1.28F (5’-TAG CAT AGT TCA CGA GGT GGC-3’）（序列 辨識編號：34)及引子 1.28R (5’-CAG CGG TTC AAT GAG ACA CTC-3’）（序列辨識編號：35)之 PCR 以[α-32Ρ] dATP 標定之。於60°C在3XSSPE及0.1% SDS中雜合墨點24 h， 於60°C之1XSSPE及0.1% SDS中洗滌並以自動射線照相術 於-8(TC顯像20 h。 以622 bp cDNA片段（序列辨識編號：33)探測受傷前 Φ 及受傷後自幼苗莖部抽取出的RNA之所有北方墨點，其無 法雜合到任何預先分離出的大冷杉萜烯類合成酶cDNA包 括松香二烯合成酶、兩種構造性倍半箱烯合成酶植株 (序列辨識編號：19)及(序列辨識編號：23)或顯直出 的單萜稀合成酶（Bohlmann，J·，et al·，J·价〇/· CAem· 272, 21784-21792(1997); Stofer Vogel, B., et al., (1996) J. Biol. CAem· 271，23262-23268)。受傷之前偵測不到五-a甜沒藥 烯合成酶的訊息RNA。隨著幼苗莖部之機械性傷害，五-a φ 甜沒藥烯合成酶mRNA之含量在處理之11-14天後之短時 ^ 間内增加至一最大值，因而證明了增加的mRNA累積五-a . 甜沒藥烯合成酶係大冷杉中誘導性倍半萜烯防禦反應之主 因。相較於單萜烯合成酶基因在受傷後1-2天mRNA累積 最大值之快速的轉錄活性，mRNA增加以累積五-a甜沒藥 烤合成酶之速度較為緩慢（Bohlmann，J·，et al·，·/· 5ζ·ο/· Chm· 272:21784-21792(1997))顯示了大冷杉中由受傷刺 激引起的早期及後期防禦反應可能牵涉部份獨立的訊息途 徑。 _______·62· __ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） - , 11 - ―― I I I I I 11 I 訂— — I I I — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中喪樣準為男工消费合作社印裝 200300171 A7 B7 五、發明説明（59) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 其實單萜烯及二萜烯防禦化合物係有關於昆蟲攻擊 早期之防禦，甜沒藥烯衍生的植物幼稚激素在昆蟲橫行期 間影響其之後的生殖及發展。大冷杉中誘導性萜烯類為主 的化學性防禦係針對多種攻擊性剝樹皮甲蟲之生理及經該 等剝樹皮甲蟲送入大冷杉樹木中之致病真菌。各個防禦組 成物之確實時間係由龐大的了以?-基因家族之不同時活化所 控制。本多組成物及多標的化學性防禦策略在松柏類超過 3億年之演化中為重要因素（Langenheim，J.H. (1969) Science 163, 1157-1169; Langenheim, J.H. (1990) Am. Sci. 78, 16-24; Langenheim, J.H. (1994) J.Chem. Ecol. 20, 1223-1280) 〇 實施例7 具有-芽子烯合成酶及y -葙箪烯合成醃編碼的cDNAs之 分離作用 cDNA分離，59-RACE及表現載體之建構-傷議導的大 冷杉莖部cDNA基因庫之建構已被揭露（Stofer Vogel, B·，et al·，（1996) J· 5/〇/· CAe/w· 271，23262-23268)，且雜合作用 探針生產及基因庫篩選技術細節提出於實施例3及 Bohlmann, J., et al., J. Biol Chem. 272, 21784-21792 (1997)。如同實施例3所提出，只有引子C (序列辨識編號： 2)及引子D (序列辨識編號·· 3)之組合產生一段約110 bps 之專一性PCR產物。該110 bp之PCR產物之次選殖及定序 顯示其包含四種不同序列，分別標記為探針1、2、4及5。 依據該受傷的大冷杉莖部cDNA基因庫之篩選，也就是分 -63· 請 先 閱 面 之 注 再 ► 頁 裝 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 B7 五、發明説明（60) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 別以探針4 (序列辨識編號：15)及5 (序列辨識編號：25) 雜合至兩段各自標示為叹矣別（序列辨識編號·· 14)及 叹5·Ρ(序列辨識編號：26)之cDNA。 既然該等cDNA分離物皆不具有起始蛋胺酸編碼，5’-RACE以馬拉松cDNA擴增作用套組（Clonetech)依照使用程 序稍作修改而進行。所有的RNA以公開方式（Lewinsohn，E·， et al·，（1994) P/⑽i Me?/· 5^/· 12, 20-25)定量抽取自 60 經濟部中央標準^^工消費合作社印製 翁 株幼苗（兩歲；受傷後6或8日）。聚A+ mRNA係以Qiagen揭 露的Oligotex珠及旋轉管柱方法分離。為了避免RNA二級 構造特徵阻礙完整長度之cDNA合成，執行三種不同的 cDNA合成反應，首先於42°C或50°C變性該RNA，或以曱 采氬氧化物處理之（Maniatis，T. et· al·，（1982) A/b/ecw/ar Cloning: A Laboratory Manual, 1st ed., pp 230-232, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) o 取該程序中建議量兩倍之mRNA，並依指示執行PCR擴增 作用，但不採用該低忠實度Tqr聚合酶。該等cDNA專一 性PCR引子分別為針對(序列辨識編號·· 14)之5’-CTGCGAACCTTGAGAGTGGTCTGCAG-3’（序列辨識編 號：16)及針對叹5.9 (序列辨識編號：26)之5’- GTCTATCGATTCCCAGCCATTCC-3’（序列辨識编號： 27)。 該等所得之PCR產物依標準步驟被轉形進入pT7Blue-載體（Novagen)，並被部份定序以在各事例中顯示推測的 起始蛋胺酸密碼子，因而表示該5’-RACE合成作用順利完 -64· 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 A7 B7 經濟部中央標準局男工消費合作社印製 五、發明説明（61) 成。以設計的5’-及3’-專一性PCR引子產生的各cDNA之完 整長度代表接著被高度忠實的擴增。該5’-專一性引子係 設計成在各段cDNA之起始蛋胺酸密碼子上游具有一 5amHI限制内切酶切位（針對(序列辨識編號：14) 之 5’-GGAGGATCCATGGCTGAGATTTCTG-3，（序列辨識 編號：17)及針對叹5.9 (序列辨識編號：26)之5’-TGGTACCATGGCTGGCGTTTCTGCGTATC-3’（序列辨識 編號：28))。該3’_專一性引子係設計成包圍一個終止密碼 子；該叫^.30引子包括一個Zbl切位而該叹引子包括 一 個 JScoRI 切位（針對 ag4.30 之 5’-AAAGTCTCGAGATATTAATTATTGCC-3’（序列辨識編 號： 18) 及 針 對 叩又5> 之 5’-TATGAATTCTCAAATAGGCACGGGGAd (序列辨識編 號：29))以加速連結至該pGEX-4T-l表現載體 (Pharmacia) 〇 PCR反應之執行係於94°C持續1分鐘，50°C1分鐘， 然後72°C6分鐘，循環30次接著一段72°C5分鐘之最終延長 期，採用揭露於使用手冊（Stratagene)之户/w聚合酶及緩衝 液。該等所得之DNA片段隨後以標準方法選殖之，首先 置入 pBluescript (SK-) (Stratagene)，然後放入標記為 pGAG4及pGAG5之pGEN (Pharmacia)載體。為了進一部次 選殖cDNA進入用於大量表現之pSBETa載體（Schenk，P.M·， et al·，（1995) 19, 196-200)，pGAG4及pGAG5 之插入物經PCR (如上所述之Stratagene P/w聚合酶）以引子 -65- (請先聞讀背面之注意事項再
-裝· P 頁) 訂 -線_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 B7 五、發明説明（62) 組 合 4-Ndel (5，- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) CTGGTTCCGCGTGGACATATGGCTGAGT-3，）（序列辨識 編 號 ： 21)及 4-BamHI (5，-CTACAACCAAG- AGGATCCCTATTCCTCCATTGG-3，）（序列辨識編號：22) 放大 pGAG4 ，及 5-Ndel (5’-CTGGTTCCGCGTGG-ACATATGGCTCAG-3，）（序列辨識編號：30)及 (5，-GTCAGTGACGATGGATCCTCAAATAGGCAC-GG-3，） 瞻 (序列辨識編號：31)放大pGAG5。該等PCR產物係以上述 限制酵素分解，經超過濾純化，然後連結進入經 5amHI分解的pSBETa以分別得到質體pSBAG4及 PSBAG5。 經濟部中央揉準《負工消費合作社印製 該等原始分離物，叹序列辨識編號：14)及 (序列辨識編號：26)，及其在及pGAG4及pSBAG4中對應 之之完整長度之cDNA插入物（序列辨識編號：20)(5-芹子烯合成酶）.，及叩5之完整長度之cDNA插入物（序列辨 識編號：23)(γ-择草稀合成酶），於the Washington State University Laboratory for Biotechnology and Bioanalysis利 ^ 用該染色終止子循環定序法（Applied Biosystems)在一 ABI 373 DNA Sequencer Stretch儀器上經由引子漫步兩股皆被 完全定序。以來自 the Genetics Computer Group 之 the Wisconsin Package Version 9.0之程式進行序列分析 (Genetics Computer Group (1996) Progeam Manual for the Winsconsin Package, Version 9.0, Genetics Computer Group, Madison, WI) o -66- 本紙張A度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 _B7_ 五、發明説明（63) 實施例8 r.DNA植姝插入物AG4(序列辨識編號：19)及AG5 (序列辨 識編號：25)之庠列分折
(5-芹子烯合成酶cDNA (序列辨識編號：19)具有一 段長度581個氨基酸的蛋白質（序列辨識編號：20)預測其 分子量為67625，而τ _葎草烯合成酶cDNA (序列辨識編 號：23)包含一段架構内含有終止密碼子且可能的起始蛋 胺酸位於-21bp的89 bp 5’-不轉譯區域，而該5-芹子稀合 成酶序列（序列辨識編號：19)於-12 bp被切齊。兩個倍半 萜烯合成酶基因之可能的ATG序列附近之核苷酸序列為保 留性的，並與該等其他植物基因之起始蛋胺酸附近者類似 (Joshi，C.P· (1987) 7/wc/· dc/A 15，6643-6653)。此等 資料支持該等起始位置之預測，以及作為倍半萜烯合成酶 之兩cDNA之辨識，因為該等預測之分子量適於該等級胞 質酵素（1^(：(：111111，？丄&(1：11&卩卩611，1.(1992)/>”(^·//^^/· Acad. Sci. USA 89, 11088-11092; Chen, X.-Y., et al., (1995) 乂rcA· 少《y. 324, 255-266)。據此，由兩cDNA (序列辨識編號：20及24)編碼之蛋白質缺乏同時存於單萜 烯合成酶及二格烯合成酶預蛋白質之質體標的胜肽（Stofei: Vogel, B., et al., (1996) J. Biol. Chem. 271, 23262-23268; Bohlmann, J., et al., (1997) J. Biol. Chem. 272, 21784-21792; Colby, S.M., et al., (1993) J. Biol. Chem. 268, 23016-23024; Mau, C.J.D. & West, C.A. (1994) Proc Natl. dead.版 C/以 91，8497-8501)。 餐67- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210XM7公釐） (請先聞讀背面之注 意事項再頁) •裝· -訂 -線· 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 200300171 A7 B7 五、發明説明（64) 該等胺基酸序列之比較致初期相互具有83%相似度 及65%—致性，且相較於其他得自松柏類之類萜烯類合成 酶，包括得自大冷杉之松香二烯（二格烯）合成酶（Stofer Vogel, B., et al., (1996) J. Biol Chem. 271, 23262-23268) > 得自此品種之香葉烯、蒎烯及葶烯（單萜烯）合成酶 (Bohlmann, J., et al., (1997) J. Biol. Chem. 272, 21784-21792)，及得自太平洋紫杉之紅豆杉二烯（二萜烯）合成酶 (Wildung, M.R, & Croteau, R· (1996) J. BioL Chem. 271, 9201 -9204)，兩個倍半萜烯合成酶間顯示66%相似度及45% 一致性。此等裸子植物倍半萜烯合成酶（序列辨識編號：20 及24)與得自被子植物之類萜烯類合成酶（Back, Κ·& Chappell，J· (1995)丄 Bb/· 270, 7375-7381 (得自菸 草之表馬兜鈴烯合成酶）Chen, Χ·-Υ·，et al·，（1995) drc/z· 324，255-266 (得自棉花之杜鬆烯）） 之比較揭示約56%之相似性及30%左右之一致性。 有趣的是，該裸子植物倍半萜烯合成酶顯示出與裸 子植物單萜烯合成酶及二萜烯合成酶較為相似，而與被子 植物倍半萜烯合成酶較不相似，此事實暗示包含有單萜 烯、倍半萜烯，及二萜烯合成酶之該裸子植物#W家族之 遠古分歧（Bohlmann，J·，et al”（1997)丄 5/〇/· CAe/w· 272, 21784-21792)。與微生物倍半萜烯合成酶比較沒有明顯相 似度。例如，該5 -芹子烯及r ·葙草烯合成酶（序列辨識 編號：20及24)與得自孢子絲梭黴菌 eoroir/cAioWa)之孢子絲二烯相較之下顯示45·46%相似 • 68· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規择（210X297公釐） ----------驾-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ 經濟部中夹標準馬貝工消费合作社印裝 200300171 A7 B7 五、發明説明（65) 度及 18-22%—致性（Hohn，Τ·Μ· & Beremand，P.D. (1989) (7咖 79, 131-138) 〇 胺基酸修飾試劑之研究指出得自被子植物及裸子植 物之祐烯類合成酶催化作用有關於組織胺酸、半胱色胺酸 及精胺酸殘基（1^£6乂61：，11.£.，61&1.，（1994)^4/^々.5/0〇^/«· Biophys. 313, 139-149; Dehal, S.S. & Croteau, R. (1988) Arch. Biochem. Biophys. 261, 346-356; Munck, S.L. & Croteau, R. (1990) Arch. Biochem. Biophys. 282, 58-64; Savage, T.J., et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 4012-4020; Lewinsohn, E., et al., (1992) Arch. Biochem. Biophys. 293, 167-173; Rajaonarivony, et al., (1992) Arch.
Biochem. Biophys. 299, 77-82; Savage, T.J., et al., (1995) drcA· 5沁ckm· 5/叩320，257-265)。所有公開的褡烯 類合成酶序列之比較揭示Cys5G7(附件之7 -葎草烯合成酶 (序列辨識編號：24)之胺基酸序列編號）為唯一完全保留 性的半胱胺酸殘基，而his95及his141(附件之r-葎草烯合成 酶（序列辨識編號：24)之胺基酸序列編號）為唯一完全保 留性的組織胺酸殘基。然而，限於倍半格烯合成酶之比較 ί 顯示位於該7-葎草烯合成酶（序列辨識編號：24)之283位 置上有額外的保留性組織胺酸殘基。倍半萜烯合成酶之間 的比較亦顯示出八個保留性精胺酸殘基係位於7 -葎草烯 合成酶（序列辨識編號：24)之136、139、243、247、306、 329、364及485位置上，其被認為係用於比較的植物品種 之分類的分布上令人驚訝的多數（Facchini，P· J· & ____ -69-
本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公AT (請先閲讀背面之注意事項再頁) •裝· -訂 -線 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 經濟部中央標準局属工消費合作社印製 200300171 a7 B7 五、發明説明（66)
Chappell, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1 1088-11092; Back, K. & Chappell, J. (1995) J. Biol. Chem. 270, 7375-7381; Chen, X.-YM et al., (1995) Arch. Biochem. Biophys. 324, 255-266) ° 一段高度保留性的富含天冬胺酸片段（DDXXD)(序 列辨識編號：36)係存於所有來自微生物的類萜烯類合成 酶，以及異戊稀轉移酶（chen, A, et al·, (1994)尸roi们·《 iSW· 3, 600-607)中，其係由一般的二磷酸異戊烯基質之相關機制 操控（Cane，D.E· (1980) 36，1109-1159; Poulter， C.D. & Rilling, H.C. (1978) Acc. Chem. Res. 11, 307-313; Poulter, C.D. & Rilling, H.C. (1981) in Biosynthesis of Isoprenoid Compounds (Porter, J.W. & Spurgeon, S.L., eds) Vol· 1，pp. 161-224，John Wiley and Sons，New York)。基 於X-光構造研究及專一誘變之有意義的證據，其指出本 段序列係用虞姬植二磷酸根金屬離子錯合物之二價金屬離 • 子之鍵結（Tarshis，L.C·，et al”（1994) 33, ‘ 10871-10877; Cane D.E. & Xue, Q. (1996) J. Am. Chem. Soc. . 118, 1563-1564)。同時揭露一段第二DDXXD (序列辨識編 號：39)片段，其中之天冬胺酸殘基在類萜類合成酶之間 係保留性的；最近發現的天冬胺酸殘基僅存於大冷杉倍半 箱婦合成酶中。 5 ·芹子烯合成酶（序列辨識編號：20)及τ -葎草烯合 成酶（序列辨識編號：24)之間的序列比較顯示該二酵素非 常相似，但向該等蛋白質的羧基端遞減。本觀察係前述以 _ -70-_ 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I —. I I I I I I I I I I 訂 I I I I I I 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 200300171 A7 B7 五、發明説明（67) 相關的倍半萜烯合成酶進行之域交換實驗的結論（Back, K. & Chappell，J· (1996) Proc· iVai/· dead· &/· 93，6841- 6845)其暗示該等蛋白質之胺端區域係有關於起始，即循 環反應之一般步驟，並暗示了更多地羧基端區域係用於決 定特定產物之結果。 兩種裸子植物倍半萜烯合成酶（序列辨識編號：20及 24)明顯地在序列上與被子植物類搭烯類合成酶相似（約 55%相似度及31%—致性），其保留性程度與該等在被子植 物之本植物綱之倍半莊烯合成酶及二結烯合成酶及單萜烯 合成酶間所觀察到者相似（Bohlmann，J·, et al·，（1997)丄 Biol. Chem. 272, 21784-21792; Chen, X.-Y., et al., (1995) 324，255-266)。不同類萜烯類合 成酶間之兩度相似性區域係成串的且係該等用於一般擔環 化學（例如，離子化作用、電價穩定作用、去質子作用）之 代表。較不同的區域可能分別為該活化位置之特定形狀其 加強介質基中間產物之構形並因而造成特定產物。兩種倍 半萜烯循環酶之結晶構造最近被揭露為得自鏈黴菌 UC5319 的戊荟烯合成酶（Lesburg，C.A” et al·，（1997) iWe/za 277, 1815-1820)。兩種酵素顯現出與二 磷酸法呢酯合成酶極相似的折褶構造（Tarshis，L.C·，et al·， (1994) 33，10871-10877)，並皆具有由中央 大空腔造成的平行反向螺旋。 實施例9 立二^子烯合成序列辦謐編號·· 2〇)及r -葙草烯合成酶 __ -71·__ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請先閲讀背面之注意事項再頁 .裝· 訂 -線· 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 200300171 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製
五、發明説明（68) (序列辨識編號：24)之基質專一性及動能參數特徵 5 -芹子烯合成酶（序列辨識編號：20)及r -葎草烯合 成酶（序列辨識編號·· 24)之基質專一性及動能參數特徵係 用以證實該等酵素之辨識及分類。[1-3H]二磷酸法呢酯和 γ -葎草烯合成酶（序列辨識編號·· 24)及δ -芹子烯合成酶 (序列辨識編號：20)之仏估計值分別約為4.5//Μ至1.5// Μ。丫 -葎草烯合成酶（序列辨識編號：24)及δ -芹子烯合 成酶（序列辨識編號：20)所需之金屬離子亦被估算出來 了，一如辅因子專一性常為不同的類萜烯類合成酶型態之 特徵（Savage, T.J” et al”（1994) ·/·如〇/· CUm· 269, 4012-4020)。5 -芹子烯合成酶（序列辨識編號·· 20)顯示對Mg2+ 之特殊偏好；具有Mg2+之最大速率較具有Mg2+在飽和狀 態者少10%。相反的，r -葎草烯合成酶（序列辨識編號·· 24) 在循環反應中可利用具有可比較的速度Mg2+或Mn2+。對 於兩種酵素，Mg2+之值約為125从Μ，而Mn2+者為25 # Μ。此等倍半萜烯合成酶活性不需K+或其他單償陽離子。 反而得自松柏類的單萜烯合成酶活性需要Μη2+或Fe2+，但 Mg2+不支持催化作用（Bohlmann，J” et al·，（1997) J· 5/0/. Chem. 272, 21784-21792； Lewinsohn, E., et al., (1992) Arch. 293, 167-173)，且此等酵素亦顯示對一 單價陽離子之絕對需要，Κ+其中為較佳的（Bohlmann，J·，et al., (1997) J. Biol. Chem. 272, 21784-21792; Savage, T.J., et al·，（1994) /· CAem· 269, 4012-4020)。 占-芹子烯合成酶（序列辨識編號：20)及r -葎草烯合 -72- 本紙垠尺度適用中國國家榇隼（CNS ) a4規格（2ΐ〇χ297公釐） ----------^-------tr------^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 200300171 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（69) 成酶（序列辨識編號：24)之基質專一性係經比較各萜烯烴 之前渠物在飽和狀態下二磷酸法呢酯（C15)和二磷酸槐牛 兒酯及二磷酸槐牛兒基槐牛兒酯（C2G)。兩種酵素皆 不能自二磷酸槐牛兒基桅牛兒酯產生可測得的烯烴類產 物，其中由二磷桅牛兒酯合成的兩單萜烯約為由二磷酸法 呢酯之倍半萜烯生合成速率之一半。該等由倍半萜烯產生 之單萜烯產物之角色係由GLC-MS決定並提出於第4圖 中。葶稀係兩種合成酶主要的單箱稀產物，大部份其他產 物可以大約之比例比較，其中明顯的例外為f羅勒烯勢其 係5 _芹子烯合成酶（序列辨識編號：22)之主要產物（22.4%) 但不為7 -葎草烯合成酶（序列辨識編號：24)之可偵測的 產物。r -葎草烯合成酶（序列辨識編號：24)產生可彳貞測 的量之莰烯，其生合成需要Wagner-Meerwein重新排列成 長葉婦和蒜頭烤；5 -芹子婦合成酶（序列辨識編號：2〇) 不產生本單褡烯。 雖然5 -芹子烯（序列辨識編號：20)及7 -葎草烯合成 酶（序列辨識編號：24)與二攝酸槐牛兒婦一起存在時皆可 產生單萜烯，許多證據顯示此等酵素實際上係倍半萜烯合 成酶。首先，如實施例8所揭露，具有此等酵素編碼之cdna (序列辨識編號：19及2 3)不具有具備單萜稀（及二格稀）之質 體轉換胜肽特徵之預蛋白質合成酶，而具有胞質倍半箱稀 合成酶尺寸上更成熟的蛋白質。第二，二價及單價離子之 需求不像該等單萜稀合成酶者’而如同其他倍半搭稀合成 酶。最後，由得自二磷酸桅牛兒酯之5-芹子烯合成酶（序 -73· 請 先 閲 I - 再 頁 裝 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央，標準局貧工消费合作社印装 200300171 at Β7 五、發明説明（70) 列辨識編號：20)及r -葎草烯合成酶（序列辨識編號：24) 產生的非環狀單萜烯（羅勒烯酮）不存於大冷杉油性樹脂之 萜烯類部份（Lewinsohn，E·，et al·，（1993) dwa/· 4, 220-225; Lewinsohn, E., et al., {\99\) Plant Physiol. 96, 38-43; Smedman, L.A., et aL, (1969) Phytochemistry 8, 1471-1479)。 因此累積的證據清楚地支持此等新穎酵素(序列辨識 # 編號：20及24)被辨識為倍半萜烯合成酶。雖然倍半萜烯 生合成發生在細胞質中，該前趨物二磷酸法呢酯亦在此合 成，而該等單萜烯合成酶係被分隔再質趑等該前趨物二磷 酸法呢旨意存在之胞器中（Gershenzon，J· & Croteau，R· (1993) in Lipid Metabolism in Plants (Moore, Jr., T.S., ed) pp 340-388, CRC Press, Boca Raton，FL; Colby，S.M·，et al” (1993) J. Biol. Chem. 268, 23016-23024; Belingheri, L., et al., (1988) J. Plant Physiol. 132, 80-85; Gleizes, M., et al., ^ (1983) P/⑽ία 159, 373-3 81)，此等倍半萜烯合成酶胞外產 • 生單萜烯之能力可簡單的代表從未在胞内相遇的外來基質 ^ 之應用，並可對抗演化壓力。現今認為以該倍半萜烯合成 酶進行外來二磷酸桅牛兒酯之利用部份造成天然大冷杉莖 部抽出物中高程度之箏烯合成酶活性（Gijzen，M·，et al·， (1991) jrcA. C7叩A少*y· 289, 267-273) β 實施例10 g -芹子嬌厶我酶（序列辨識,煸號：2〇)及r -蘀草烯合成酶 (序列辨識編號：24)之產物之胞外表現 ___ ·74· _ 本錶浪尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（nOXW7公釐） 裝------訂------線 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部t央標準局負工消費合作社印裝 200300171 A7 B7 _ 五、發明説明（71) E. coli中倍半萜烯合成酶CDNAAG4 (序列辨識編號： 及乂(?5 (多艿辨諸·編麓：23)。人造倍半萜烯循環酶cDNA (序列辨識編號：19及23)係表現在實施例7所提出的細菌 品系[co/ί XLl_Blue/pGAG4、[ co/z· XLl_Blue/pGAG5、 E. coli BL21(DE3)/pSBAG4 » AE. coli BL21(DE3)/pSBAG5 中。細菌係生長37eCA600 = 0.5之5 ml或100 ml視載體而定 懸浮有100 # g氨苄青黴素/ml或30从g康那黴素/ml之LB培 養基中。接著添加1 mM異丙基-1-硫-召-D-11比喃半乳糖苗 以誘導培養物並使另外於20°C生長12 h。以離心（2000 X g，10 min)回收細胞並在懸浮在1 ml或5 ml倍半箱烯合成 酶化驗緩衝液（實施例2)中。以超音波震盪（採用微探針於 0-4°C以最大動力持續15秒之Braun-Sonic 2000)打破細胞 並以離心（1800〇xg，10 min)均質化並澄清之。製備性化 驗係用以產生用於GLC-MS分析之產物，一如實施例2所 提出，並經總離子流色層分析評定其組成。 喳δ-芹子烯合成酶（序列辨識編號：20)之胞外 產#。在該等衍生性烯烴之分離及GLC-MS分析之後以[1-3Η]二磷酸法呢酯之大量培養顯示由AG4 (序列辨識編號： 19)編碼的酵素之主要產物為5-芹子烯，其合成酶以其命 名，以及大根香葉烯Β及癒創木-6,9-二烯。此外，Π種其 他得倍半萜烯烴以GLC-MA辨識之，而另外14種顯示出倍 半萜烯烴產物特殊光譜態樣[m/z 2〇4 (Ρ+)、189 (P、CH3) ’ 及161 (P+-C3H7)]，可針對總共至少34種不同倍半萜烯產 物被偵測（表1)。 -75-__ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I---L·--·-!--裝-- (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂 -線- 200300171 A7 _B7五、發明説明（72)表1 (?-芹子烯合成酶及r-葎蕈婦合成酶之倍丰萜嫌產物 產物係以其含量排列並經GLC滯留時間及可信之標 準質譜配對辨識之。被標示為（tent.)之化合物係僅基於其 質譜被暫時辨識的。 5 -芹子烯合成酶〇发4) 葎萆烯合成晦（agJ] ^ (序列辨識編號：20)_(序列辨識編號：24) _倍半萜稀_%_:倍半萜烯 ％ 經濟部中央標準馬貝工消費合作社印製 5 -芹子烯 五-五-大根香葉烯B 癒創木-6,9·二烯 大根香葉烯A 5 -紫穗塊烯 未知 未知 大根香葉烯C α -紫穗塊烯 未知 α -芹子烯 点-石竹烯 α -杜鬆烯 未知 未知 五-大根香葉烯B (tent·) 芹子-3,7(11)•二烯 大根香葉烯D α -葎草稀 点-甜沒藥烯 鮮卑花烯 α ·癒創木婦 α -杜鬆烯 α -依蘭香烯 -诂《烯 9種未知，各<1% 25.3 r -# 軍烯 17.4鮮杯花烯 9.7長葉烯 6.7卢-希馬巧婦 6.4 r -希馬巧烯 4.7 α -希馬巧蛐 4·4点-甜沒藥烯 3·4 α -長蒎烯 2.7蒜頭烯 2·6 α -依蘭香烯 1.7泠古蕓烯 1.5 r -甜沒藥烯 1.4泠-長蒎烯 1·4五-泠-菌綠婦 1.3五-江-甜沒藥烯 1.3 d -紫穗塊烯 1.2 α -紫穗塊& 〇·8彡-依蘭香烯 0.7 1,5,9-三甲基環十二烷- 0.7 1,5,9-三烯（tent. 2 異構物 0.7環千里光烯 〇·2点-蓽橙茄油烯 0·2 α ·琀汜烯 0·1 ύ：-蓽橙茄油烯 0.1 Ζ,五大根香葉烯B (tent·) 3.4環蒜頭烯 26種未知，<1% 8 5 2 1 11 11 5 4333221 1 ο ο ο ο oooooo
ο 4 V 用以產生如此大量產物之環狀架構已被公式化， 2 8 8 9 4 0 9 5 3 9 5 5 2 2 其 中該主要產物（5 -芹子烯之角色係基於其他雙環倍半萜稀 而形成（Cane, D.E. (1981) in J5z.ow少niAehs -76- 本紙張尺度i4用中國國家標準（CNS ) A4規格（2i〇X297公釐） .I I I I —— I I I I f I I I 訂— I I I I H 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
200300171 A7 B7 五、發明説明（73)
Compounds (Porter, J.W. & Spurgeon, S.L., eds) Vol. 1, pp 283-374, John Wiley and Sons, New York; Cane, D.E· (1990) Chem. Rev. 90, 1089-1103; Cane, D.E. (1992) in Secondary Metabolites: Their Function and Evolution (Chadwick, D.J, & Whelan, J., eds) pp 163-183, Ciba Foundation Symposium 171，John Wiley and Sons，West Sussex，UK)。該環狀架構 係提出於 Steele et al·，J. Biol. Chem· ΊΊ3，· 20Ί%- 2089(1998)，在此併入本案以為參考資料。 t1 γ-葎草烯合成酶（序列辨識編號：24)胞外產 秦。雖然由5-芹子烯合成酶（序列辨識編號：20)產生的 產物之排列係值得注意的，由AG5 (序列辨識編號：23)編 碼的合成酶所產生之倍半萜烯烴之光譜更令人困惑。7-葎草烯，用於命名本合成酶之主要烯烴，芹子烯及長葉烯 係經GLC-MS分析辨識為主要產物。此外，23種其他倍半 萜烯與26種未知的倍半萜烯被辨識為總共52種不同的產物 (表I)。此等產物分布在由簡單非環狀烯烴冷-菌綠烯至 複雜的四環烯烴環千里光烯及環蒜頭烯之複雜度内。 已經有一種反應架構用以說明經r -葎草烯合成酶（序 列辨識編號：24)胞外產生的倍半萜烯之明顯排列，其顯 示排外地採用二磷酸順燈花油叔酯作為中間產物在該主要 產物之形成作用中。該環狀架構係根據其複雜性被提出於
Steele et al·，7ϋ/· CAe/w· 273: 2078-2089(1998)。 雖然r-葎草烯合成酶（序列辨識編號：24)被限制於 於該二磷酸順燈花油酯中間產物之利用，正與利用順式及 ____ _-77-__ 本紙張纽適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21QX297公瘦） —---ί--*---裝-- (請先閱讀背面之注意事項再頁) 訂 線 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 經濟部中失標準总貝工消費合作社印製 200300171 Δ7 Α7 Β7 五、發明説明（74) 反式形式的5-芹子烯合成酶（序列辨識編號：20)相反， 前者催化較多且歧異度較大的產物，包括非環狀、單環、 雙環、三環及四環形式，以及由Wagner-Meerwein重新排 列產生的烯烴。儘管有許多經（5-芹子烯合成酶（序列辨識 ‘編號：20)及r -葎草烯合成酶（序列辨識編號：24)產生大 量不同的倍半萜烯骨架，各套構造的去質子化自同一基質 之相同的少數碳原子發生，以提供至少一個在該二者間的 • 一致性.之測量係無意義的《尤其該葎草烯合成酶（序列 辨識編號：24)催化續多複雜的梯瀑式反應並產生遠多於 任何前述箱稀類合成酶之產物，且伴隨5 -芽子烯合成酶 (序列辨識編號：20)，其用於許多外皮的倍半萜烯之構造 性生產。然而，具有可形成許多大冷杉油性樹脂（例如， 木蘿烯、α_诂JS烯、α-蓽橙茄油烯及y5-石竹烯）之較 豐富的構造性倍半萜烯之合成酶編碼的cDNA種類尚未明 確。雖然Ε-α -甜沒藥烯係r -葎草烯合成酶（序列辨識編 φ 號：24)之產物，且5 -杜鬆烯係5 ·芽子烯合成酶（序列辨 • 識編號·· 20)之產物，這兩種倍半搭烯僅為這兩種合成酶 . 所產生的許多烯烴之小部分。所以，r -释草烯合成酶（序 列辨識編號：24)及5-芹子烯合成酶（序列辨識編號：20) 不能造成五-α-甜沒藥烯及杜鬆烯之傷誘導性生產。 萜烯合成酶產生多種產物之能力已被公開（Munck， S.L. & Croteau, R. (1990) Arch. Biochem. Biophys. 282, 58-64; Savage, TJ., et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 4012-4020; Lewinsohn, E., et al., (1992) Arch. Biochem. -78· 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（2l〇X297公釐） I 裝 .—111訂— 線 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印裝 200300171 A7 B7 五、發明説明（75)
Biophys. 293, 167-173; Savage, T. J., et al., (1995) Arch. Biochem. Biophys. 320, 257-265; Wagshal, K., et al., (1991) 办ow 47，5933_5944)且可為本酵素形式所採用之異 常親電性反應機制（Gershenzon，J· & Croteau，R· (1993) in Lipid Metabolism in Plants (Moore, Jr., T.S., ed) pp 340-388, CRC Press, Boca Raton, FL; Cane, D.E. (1992) in Secondary Metabolites: Their Function and Evolution (Chadwick, D.J. & Whelan, J., eds) pp 163-183, Ciba Foundation Symposium 171, John Wiley and Sons, West Sussex, UK; Croteau, R. (1987) Chem. Rev. 87, 929-954) » 其亦可代表演化上以最少遺傳及酵素機制產生最大量萜烯 類產物之適應（Langenheim，J.H. (1994) ·/· CTiem.五α/· 20, 1223-1280)。雖然如此，δ -芽子烯合成酶（序列辨識編號： 20)產生的34種不同產物及以r _葎草烯合成酶（序列辨識 編號：24)產生的52種不同倍半萜烯，經不同循環途徑變 異，係很明顯的。該經r-葎草烯合成酶（序列辨識編號： 24)梯瀑式催化的反應在產生（經由去質子化）對應於各循 環途徑之許多碳陽離子化之中間產物穩定烯烴終止產物上 係特別複雜的（見於Steele et al. 乂 ΰίο/· C/rem. 273: 2078-2089(1998)) 〇 實施例11 其他具有Ε-α -甜沒藥烯合成酶、占-斧手烯合成酶及r-穩草歸合成酶編碟的_代表性核酸序列 除了序列辨識編號·· 12提出的核酸序列外，本發明 •79- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) "~ -----^---.--^-- (請先閱讀背面之注意事項再^^頁) 訂 A7 200300171 _B7_ 五、發明説明（76) 之具有E- α -甜沒藥烯合成酶蛋白質之代表性核酸序列之 實施例係提出於序列辨識編號：37、序列辨識編號：39及 序列辨識編號：41 ^該等序列辨識編號：39及序列辨識編 號：41提出的核酸序列係以電腦產生之並具有Ε- α ·甜沒 藥烯合成酶蛋白質編碼，其係提出於序列辨識編號：40及 序列辨識編號：42，具有與序列辨識編號：13所提出的Ε-α -甜沒藥烯合成酶蛋白質序列相關的保留性胺基酸取代 •物· 序列辨識編號：37提出的cDNA係以與具有Ε- α -甜 沒藥烯合成酶編碼之AG1 (序列辨識編號：12)相同方法分 離自大冷杉。序列辨識編號：37提出之cDNA與得自AG1 cDNA (序列辨識編號：12)者在地194位置之核苷酸不同（在 AG1 (序列辨識編號：12)為’’C”而在序列辨識編號：37之 序列中為”T”）。結果，序列辨識編號：13所提出的蛋白質 Ε-α-甜沒藥烯合成酶，其係由AG1 (序列辨識編號：12)編 參碼，包括一個位於65位置之丙胺酸，其中該蛋白質序列係 提出於序列辨識編號：38，係由提出於序列辨識編號：37 • 之核酸序列所編碼，其包括一個位於65位置之纈胺酸。目 前相信提出於序列辨識編號：37之序列係大冷杉Ε-α -甜 沒藥稀合成酶cDNA之正碟序列，而提出於序列辨識編號： 12之序列被認為係人工轉殖上在第194位置以”τ”取代”C” 的結果。雖然如此，序列辨識編號：13及序列辨識編號： 38所提出的蛋白質皆為功能性E- qj -甜沒藥稀合成酶蛋白 質。 ____-80· 本紙張JCSJt用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐)"' 裝— I I I I訂— ~"線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準Λ貝工消費合作社印製 200300171 A7 B7 五、發明説明（
Tl· 經濟部中央標準局貞工消费合作社印製 除了序列辨識編號：19提出的核酸序列外，本發明 之具有5-芽子烯合成酶蛋白質編碼之代表性核酸序列之 實施例係提出於序列辨識編號：43、序列辨識編號：45及 序列辨識編號：47。,序列辨識編號：43、序列辨識編號：45 及序列辨識編號：47所提出的核酸序列係以電腦產生並具 有芹子烯合成酶蛋白質序列編碼，其提出於序列辨識 編號：44、序列辨識編號：46及序列辨識編號：48，其具 有與序列辨識編號·· 20所提出之5-芹子烯合成酶蛋白質 序列相關之保留性胺基酸取代物。 除了序列辨識編號：23提出的核酸序列外，本發明 之具有r-葎草烯合成酶蛋白質編碼之代表性核酸序列之 實施例係提出於序列辨識編號：49、序列辨識編號：51及 序列辨識編號：53。序列辨識編號：49、序列辨識編號：51 及序列辨識編號：53所提出的核酸序列係以電腦產生並具 有r-葎草烯合成酶蛋白質序列編碼，其提出於序列辨識 編號：50、序列辨識編號：52及序列辨識編號：54，其具 有與序列辨識編號：24所提出之τ-择草烯合成酶蛋白質 序列相關之保留性胺基酸取代物。 實施例12 大冷杉grand/方）E- α -甜沒藥嫌合成酶cDNA (序列 辨識編號：12)、d-芹子烯合成酶cDNA(庠列辨識編號：1Q、 及g-葆箪嬌合成醃cDNA (戽列辨識編號：23)奧本發明斗 他核酸庠列之雜合反應 具有本發明Ε-α-甜沒藥烯合成酶蛋白質、芹子烯 -81 - 請 先 閱 I Ψ 頁 裝 訂 線 本k張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇><297公釐） 經濟部中类標準扃負工消費合作社印装 200300171 A7 B7_ 五、發明説明（78) 合成酶蛋白質或蘀草烯合成酶蛋白質編碼之核酸分子 在後述嚴格條件下較佳的可分別雜合至序列辨識編號： 12、序列辨識編號：19或序列辨識編號：23所提出的核酸 序列，或分別雜合至序列辨識編號：12、序列辨識編號： ^ 19或序列辨識編號·· 23所提出的核酸序列之互補序列：於 65°C 3 X SSC中培養16小時，然後在下列條件下以水洗滌 之：於18°C至25°C下2XSSC中洗滌二十分鐘兩次，並於55 C0.5XSSC中係迪三十分鐘一次。 採用前述雜合及洗滌條件，該具有序列辨識編號：12 所提出之核酸序列的Ε-α -甜沒藥烯合成酶cDNA分子被用 作下列植物品種RNA樣品之北方墨點探針：大冷杉 granc/b)、白杉（jWa conco/or)、美西落葉松（Zan’jc 、北美雲杉（Pieea pw/zge/u)、扭葉松（PMw c⑽ioria)、德達松（Phws iaeia)及花旗松 menziehz·)。RNA係根據Lewin^ohn et al” Plant Mol· Biol· • Rep. 21:20-25 (1994)所揭露的方法分離自二自五歲大的幼 苗，其在此併入本案以為參考資料。在所有的前述RNA樣 ， 品中，該經放射線標定的cDNA探針（序列辨識編號：12) 雜合至一段約2.5千鹼基的RNA帶。 該等前述RNA樣品係以具有序列辨識編號：19及序 列辨識編號：23所提出的核酸序列之cDNA分子探測之， 該等序列分別具有大冷杉5-芹子烯合成酶及r -葎草烯合 成酶。該雜合及洗滌條件係如前述採用E-ο：-甜沒藥烯合 成酶cDNA分子作為探針之雜合實驗所揭露者，其中該 -82-____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 裝 I 訂 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 200300171 A7 B7 五、發明説明（79) cDNA分子具有序列辨識編號：12所提出的核酸序列。該 5-芹子烯合成酶核酸探針（序列辨識編號·· 19)在所有前 述RNA樣品中雜合至一段約1.8千鹼基的RNA帶。該r -葎 草烯合成酶核酸探針（序列辨識編號：23)在所有前述RNA 樣品中雜合至一段約1.8千鹼基的RNA帶。 本發明之核酸序列分子雜合至一或多段由序列辨識 編號：12，序列辨識編號：19或序列辨識編號：23提出的 核酸序列，或其互補序列之能力，可利用任何標準核酸雜 合技術決定之，該等技術包括例如，Molecular Cloning，A Laboratory Manual (2nd edition), J. Sambrook, E.F. Fritsch 狂11<11\^^1^狂1^6(13第9.52至9.55頁所提出的技術，該等頁 數在此併入本案以為參考資料。 實施例13 本發明之Ε-α-田沒藥烯合成酶蛋白質、芹子烯合成酶 蛋白質及τ-兹蕈烯合成酶蚤白質之特徵 本發明之代表性Ε·α-田沒藥烯合成酶蛋白質、5-芹 子烯合成酶蛋白質及葎草烯合成酶蛋白質較佳的具有 下列特徵。三種倍半萜烯合成酶（Ε-α -田沒藥烯合成酶、 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 5-芹子烯合成酶及r-葎草烯合成酶）分別較佳的需要二 價陽離子，如Mg++或Mn++，以進行催化且個別較佳的具 有落在約pH 6·5至約pH 7.5範圍内之最佳催化活性。三種 倍半萜烯合成酶之較佳的基質係二磷酸法呢酯，但其各亦 可採用二磷酸槐牛兒酯作為優勢基質。三種倍半萜烯合成 酶各自較佳的缺乏胺基端質體導向序列，其較佳的pi各自 -83- __ _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 200300171 A7 B7 五、發明説明（8〇 在約4.5至約6.0範圍内且各自較佳的包括至少一段 XXDDXXD (序列辨識編號：55)其中各χ殘基代表一個疏水 性胺基酸而D係作為二價陽離子的天冬胺酸殘基。此外， ‘ S種倍半萜烯合成酶分別在其胺基端之前25個胺基酸中較 佳的包括-個作用為離子化及/或同分異構化基質的精胺 * 酸殘基。 _ 本發明之較佳具體實施例已被說明並揭露，其可在不 背離本發明精神及觀點之前提下作各式適當改變。 本發明所主張之排外的特質或特權的具體實施例係 如以申請專利範圍界定之。 參考附的詳細圖式說明，本發明之前述各方面及其 許多優勢將變得更易於認識並了解： 【圖式簡單說明】 第1圖顯示單萜烯、倍半萜烯及二萜烯之聲合成及其 一級代謝關係。所用的縮寫如下：ΙΡΡ,二磷酸異戊烯酯； DMAPP，二磷酸二曱基丙烯酯；Gpp ,二磷酸桅牛兒酯； FPP ’二鱗酸法呢酯；GGPP，二磷酸桅牛兒桅牛兒酯。 第2圖顯示Ε-甜沒藥烯、幼稚激素類似物椴松酸及 青春激素，其昆蟲幼稚激素m之構造。 第3圖顯示存在於由未受傷的大冷杉（jha γ⑽山·〇 抽取出的油性樹脂之松脂部分之六種主要倍半萜烯的化學 結構。該立體化學圖說係近似的。該百分比值代表各倍半 萜烯在該松脂部分之倍半萜烯成分中所佔百分比。 第4圖顯示以二磷酸桅牛兒酯作為基質時，倍半結婦 -84- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •、^τ— :線丨 200300171 A7 B7 五、發明説明（SI ) 合成酶5 -芹子烯合成酶（序列辨識編號：2〇)及r -葎草烯合 成酶（序列辨識編號：24)胞外生產的單萜烯產物之作用及 相對量。括弧中對總單萜烯部分的百分比係指該5 -芹子烯 合成酶（括弧中的第一個值）及r -葎草烯合成酶（括弧中的 第二個值）。ND表示未測得。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •訂· -85- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱） 200300171 A7 __B7 _ 1 ·五、發明説明（82 ) ' -1- 序列表 <110> Croteau, Rodney B ! Crock, John E *
Bohlman, Jorg Jetter, Reinhard Steele, Christopher L <l2〇>源自於大冷杉gTWirfzi)之倍半萜合成晦及使用方法： <130> .WSUR11334 6 * <140> <141> <150> 60/012,204 <151> 1990-01-22 <160> 55
I <1"7〇> Patentln Ver. 2.0
<210> 1 <211> 2424 <212> DNA <213> Abies grandls <400> 1 - gggttatgat cttgtgcatt ctcttaaatc accttacatt gattctagtt acagagaacg 60 cgcggaggtc cttgttagcg agattaaagt gatgcttaat ccagctatta caggagatgg 120 agaatcaatg attactccat ctgcttatga cacagcatgg gtagcgaggg rgcccgccat 1B0 tgatggctct gctcgcccgc aatttcccca aacagttgac tggattttga aaaaccagtt 240 aaaagatggt. tcatggggaa ttcagtccca ctttctgctg tccgaccgtc ttcttgccac 300 tctttcttgt gttcttgtgc tccttaaatg gaacgttggg gatctgcaag tagagcaggg 360 aattgaattc ataaagagca acctggaact agtaaaggat gaaaccgatc aagatagctt 420 ggtaacagac tttgagatca tatttccttc tctgttaaga gaagctcaat ctctgcgcct 4日0 cggacttccc tacgacctgc cttatataca tctgttgcag actaaacggc aggaaagatt 540 • . ·*· I agcaaaactt tcaagggagg aaatttatgc ggttccgtcg ccattgttgt attctttaga 600 gggaatacaa garatagttg aatgggaacg aataatggaa gttcaaagtc aggatgggtc 660 tttcttaagc tcacctgctt ctactgcctg cgttttcatg cacacaggag acgcgaaatg 720 ccttgaattc ttgaacagtg tgatgatcaa gtttggaaat tttgttccct gcccgtatcc 7Θ0 tgtggatctg ctggaacgcc tgttgatcgt agataatatt gtacgccttg gaatctatag 840 acactctgaa aaggaaatca aggaagctcr tgattacgtt tacaggcatt ggaacgaaag 900 aggaartggg tggggcagac xaaarcccat agcagatctt gagaccactg ctttggga^T： 960 tcgattgctt cggctgcata ggtacaatgt atctccagcc atttttgaca acttcaaaga 1020 tgccaatggg aaattcattt gctcgaccgg tcaattcaac aaagatgtag caagcatgct 1080 gaatctttat agagcttccc agctcgcact tcccggagaa aacattcttg acgaagctaa 1140 .-86- 本紙張尺度適用中國國家襻準（CNS) A4規格（210X297公釐） ----------V:··/——裝！ (請先閲讀背面之注意事項再^一^本頁) •訂— 200300171 A7 B7 五 發明説明（83 aagcttcgct gaacaacaaa cagtgttccg catagcaaaa aaaartagat ctggtttaga ctacrtctra tacaaaagtg agatgaattg ccrtccagac ttgggaggca ggattatctt cttggacgag tggagtgttg tccaggaaga gaagacatat gaaagaccat gccggcggtg caagaagatg attcggtgtt gccactgtaa aaaaaaaaaa actaaatatt caaaacctga agagtggaag tgcgtttaca ttcaacatta gattcggggt gtagcggcgg gcatgcttgc aagctattca tatatgaaac gagaaggaac ctgggttatt tacataaaga. ataatggatg cgtgttctca aaagctgaga cctgaatg-ta aaggaactga cttttcgagg tccaaarrag tcaaaatagt aaaaaaaaaa tgagagaagc gccaagagat caaagagata agctacccta tccagtccat tgccactatt ggacctatga agactgttcr ctgaggctgt tatgttacca aggggcgtga acgaagaagc atggaatcac ggcaactcct cagagctgaa aggctcgtgg cagaggaaga caagagagrct agacaagagt aagrcaaaga tgcaataata aaaa -2- tcttgagaaa agtgagactt caaatacgcg ctgaagactt ctgtcaagtg tatcgcccag cgtgaacaat gaaaagtttt ccaccaagaa gaaatgaaga caccttcgct cgggagaggc accccagtat gccaaatgca ggacgatatg tatgacactt gagaagatgg gacctctcct aarctattat gacatagttc attggtcagc ttt*tt:cagaa tgaatggtta gctgctgagt atctatcggc caacgtatac ttcgcaagag -gcattagaga tagcctcatt rcccgcctgg agaattggcg tccagcattg ggctctcgat cacatctata tctgaagccc gacgacgtcc gacgatggtg atattcaagg tcatatcaaa gagtgtdica attgaaataa tgtcaactat ccagtgcatg 1200 cttggcatgc 1260 attatgcacg 1320 tagagctggg 13B0 atgttaccag 1440 cgctggaatt 1500 ggttcctctt 1560 atggaaccct 1620 ttacagaaaa 16Θ0 acgaggtggc 1740 aggga-tggga 1Θ00 atgtgcctac I960 ctctgttgag 1920 aagtagatta 1980 cggatgacac 2040 aatgttacat 2100 gcattctgga 2X60 cattcgcctg 2220 atggaLgatgg 22Θ0 ttgaaccgct 2340 gtttcacaaa 2400 2424 <210> 2 <211> 32 <212> D13A <2工3>人工序列 <220> <223>人工序列之種類：PCR引子C <220> <221>各種特徵 <222> (1).:(32) <223> j>C]R引子c其中位於21 24、27及30位置之η代表a、c、g或t <4〇〇> 2 cgtctagayt kcatrtartc nggnarnykn tc 32 <210> 3 <2U> 21 -87-
(請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 本紙張 反度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 200300171
<212> DNA <213>人工序列 <220><223>人工序列之種類：PCR引子D <220> <221>各種特徵 <222> (1)/. (21) <223> PCR引子d其争位於7、8、9及10位置之η代表a、c、g或t <400> 3 gaygaynnnt wygaygcnya y <210> 4 <211> 108 * <212> DNA <213> Abies grandis <400> 4 tttcatgtaa tcggggaagt tgtctgtaaa ggagaggtcc catcttctca cagcctcagt 6Q gaatagcttc aattcatcta gggttccgtg cgcatcaaac ccatcatc 21 10Θ (請先閲讀背面之注意事項再？本頁) <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>人工序列之種類：募核苷酸 <220><221>各種特徵I <222> (1).,(44) i ，<223>馬拉松募核菩酸接合子 <400> 5 ccaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc aggt 44 、一吞 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> ^ ^ ^<223>人工序列之種類：募核苷敗 <220> .<221>各種特徵 <222> (1)..(27) <223> PCR引子API <400> 6 ccatcctaat acgactcact atagggc 27
<210> 7 <211> 25 <212> DNA -88- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 Α7 Β7 五T發明説明（85 <213>人工序列 <220> <223>人工序列之種類•·募核苷酸 <220> <221>各種特徵 <222> (1)..(25) <223>募核苷酸引子RJ1 <400> 7 agacggtcgg acagcagaaa gtggg <210> θ <211> 404 <212> DNA <213> Abies grandis * <400> β cttggatcca tggctggcgt ttctgctgta tcaaaggttt tcgagtacca gcggctrgat tcgaagaact gccaatcctc gatctcgtgc attctcttaa atcaccttat attgattcta gtccttgtta gcgagattaa agcgatgcrr aatccagcta argattactc catctgctra tgacacagca tgggtagcga tctgctcgcc cgcaatttcc ccaaacagtt gactggattt ggttcatggg gaattcagtc ccacrttctg ctgtccgacc ccagcttggp atcccaatgt gttacagaga rtacaggaga ··〆 gggtgcccgc rgaaaaacca gtct 25 trgtgatttg 60 ctggggttat 120 acgcgcggag 180 tggagaatca 240 cattgacggc 300 gttaaaagat 360 404 (請先閱讀背面之注意事項再填窝本頁) <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之種類：寡核苷酸 <220> <221>各種特徵 <222> (1)-.(28) 寡核苷酸引子RJ2 <400> 9 28 cttggatcca tggctiggcgt ttctgctg <210> 10 <211> 39 <212> DMA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之種類：寡核苷酸 <220> <221>各種特徵 <222> (1)..(39] -89- 本紙張 :度適用中國國家標準（CNS) A4規格(.210 X 297公釐） 200300171
-90- 392 <400> 12 gtggcgacca tcctccaaaa tcggatctgg ttccgcgtgg atcc atg get ggc gtt
Met Ala Gly Val 1 tet get gta tea aag gtt tee age ttg gtt tgt gat ttg teg agt acc
Ser Ala Val Ser Lys Vai Ser Ser Leu Val Cys Asp Leu Ser Ser Thx 5 10 15 20 age ggc ttg att ega aga ac*c gee aat cct cat ccc aat gtc tgg ggt
Ser Gly Leu lie Arg Arg Thr Ala Asn Pro His Pro Asn Val Trp Gly 25 30 35 tat gar ett: gtg cat tet ett aaa tea cct tat att gat tet agt rac
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Arg Glu Arg Ala Glu Val Leu Val Ser Glu lie Lys Ala Met Leu Asn 55 60 65 cca get: att aca gga grat gga gaa tea atg azz act cca tet get tat
Pro Ala 工le Thr Gly Asp Gly Glu Ser Met lie Thr Pro Ser Ala Tyr 70 75 80 ^ac aca gca tgg gta geg agg gtg ccc gee att gat ggc tet get ege
Asp Thr Ala Trp Val Ala Arg Val Pro Ala lie Asp Gly Ser Ala Arg Θ5 90 95 100 ccg caa ttt ccc caa aca gtt gac tgg att ttg aaa aac cag tta aaa
Pro Gin Phe Pro Gin Thr Val Asp Trp lie Leu Lys Asn Gin Leu Lys 105 110 115
(請先閲讀背面之注意事項再m太頁) 訂— 本紙張又度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱） 200300171 Α7 Β7 五•、發明説明（87 ) ·6· gat ggt tea tgg gga att cag tee cac ttt ctg ccg tee gac cgt czt 440 I Asp Gly Ser Trp Gly lie Gin Ser His Phe Leu Leu Ser Asp Arg Leu 120 125 130 ett gee act ett tet tgt gtt ett gtg etc ett aaa tgg aac gtt ggg 488 Leu Ala Thr Leu Ser Cys Val Leu Val Leu Leu Lys Trp Asn Val Gly 135 140 145 gat ctg caa gta gag cag gga att gaa tzc ata aag age aat ctg gaa 536 Asp Leu GJLn Val Glu Gin Gly 工le Glu Phe lie Lys Ser Asn Leu Glu 150 155 160 eta gta aag gac gaa acc gat caa gat age ttg gta aca gac ttt gag 584 Leu Val Lys Asp Glu Thr Asp Gin Asp Ser Leu Val Thr Asp Phe Glu 165 170 1.75 160 ate ata ttt cct tet ccg eta aga gaa get caa tet ctg ege etc gga lie lie Phe Pro Ser Leu Leu Arg Giu Ala Gin Ser Leu Arg Leu Gly 185 130 195 632 ett ccc tac gac ctg cct tat at a cat ctg ttg cag act aaa egg cag 6Θ0 Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Tyr lie His Leu Leu Gin Thr Lys Arg Gin 200 205 210 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) faa aga tta gca aaa ctr cca agg gag gaa att tat geg gtt ccg teg 728 Arg Leu Lys Leu Ser Arg Glu Glu lie Tyr Ala Val Pro Ser 215 . 220 225 cca ttg ttg tat tex: tta gag gga ata caa gat ata gtt gaa tgg gaa 776 .Pro Leu Leu Tyr Ser Leu Glu Gly lie Gin Asp He Val Glu Trp Glu 230 235 24 0 ega ata atg gaa gtt caa agt cag gat ggg tet ttc tta age tea cct 824 Arg lie Met Glu Val Gin Ser Gin Asp Gly Ser Phe Leu Ser Ser Pro 245 250 255 260 get tet act gee tgc gtc ti:c atg cac aca gga gac geg aaa tgc ett Θ72 Ala Ser Thr Ala Cys Val Phe Met His Thr Gly Asp Ala Lys Cys Leu 265 270 275
gaa ttc ttg aac agt gtg atg ate aag ttt gga aat ttt gtc ccc tgc Glu Phe Le-α Asn Ser Val Met 工le Lys Pbe Gly Asn Phe Val Pro Cys 280 285 290 ctg tat cct gtg gat ctg ctg gaa ege ctg ttg ate gta gat aat att Leu Tyr Pro Val Asp Leu Leu Glu Arg Leu Leu 工le Val Asp Asn lie 295 300 305 gta ege ett gga ate tat aga cac ttt gaa aag gaa ate aag gaa get Val Arg Leu Gly lie Tyr Arg His Phe Glu Lys Glu lie Lys Glu Ala 310 315 320 920 96Θ 1016 ett gat tat gtt tac agg cat tgg aac gaa aga gga att ggg tgg ggc 1064 Leu Asp Tyr Val Tyr Arg His Trp Asn Glu Arg Gly lie Gly Trp Gly 325 330 335 340 aga eta ccc ata gca gat ett gag acc act get: ttg gga ega 1112 Arg Leu Asn Pro lie Ala Asp Leu Glu Thr Thr Ala Leu Gly phe Arg 345 350 355 ttg ett egg ctg cat agg tac aar gta tet cca gee art ttt gac aac 1160 Leu Leu Arg Leu His Arg Tyr Asn Val Ser Pro Ala lie Phe Asp Asn 360 365 370 zzc aaa gat gee aat ggg aaa ttc ati: rgc teg acc ggt caa ttc aac 1206 Phe Lys Asp Ala Asn Gly Lys Phe He Cys Ser Thr Gly Gin Phe Asn -91- 本紙張&度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 _____B7 五·、發明説明（88 ) 375 3Θ0 1 385 aaa gat gta gca age atg ctg aat ett tat aga get tee cag etc gca 1256 Lys Asp Val Ala Ser Met Leu Asn Leu Tyr Arg Ala Ser Gin Leu Ala 390 395 400 ttt ccc gga gaa aac att cut gat gaa get aaa age ttc gerc act aaa 1304 Phe Pro Gly Glu Asn lie Leu Asp Glu Ala Lys Ser Phe Ala Thr Lys 405 410 415 420 tat ttg aga gaa* get ett gag aaa age gag act tee agt gca tgg aac 1352 Tyr Leu Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ser Glu Thr Ser Ser A.la Trp Asn 425 430 435 aac aaa caa aac eng age* caa ate aaa tac geg ctg aag act tee 1400 Asn Lys Gin Asn Leu Ser Gin Glu lie Lys Tyr Ala Leu Lys Thr Ser 440 445 450 tgg car gee agt gtt ccg aga gtg gaa gca aag aga tac tgr caa gt:g 144Θ Trp His Ala Ser Val Pro Arg Val Glu Ala Lys Arg Tyr Cys Gin Val 455 460 465 tat ege cca gat: tat gca ege ata gca aaa tgc gtt tac aag eta ccc 1496 Tyr Arg Pro Asp Tyr Ala Arg lie Ala Lys Cys Val Tyr Lys Leu Pro 470 475 480 tac gtg aac aat gaa aag ttt tta gag ctg gga aaa tta gat ttc aac 1544 Tyr Val Asn Asn Glu Lys Phe Leu Glu Leu Gly Lys Leu Asp Phe Asn 485 490 495 500 atr ate cag tee ate cac caa gaa gaa atg aag aar grt acc age tgg 1592 lie lie Gin 5er lie His Gin Glu Glu Met Lys Asn Val Thr Ser Trp 505 510 5^5 ttt aga gat teg ggg ttg cca eta ttc acc nc gee egg gag agg ccg 1640 Phe Axg Asp Ser Gly Leu Pro Leu Phe Thr Phe Ala Arg Glu Arg Pro 520 525 530 ctg gaa ttc tac ttc tta gra geg geg ggg acc tat gaa ccc cag tat 16ΒΘ Leu Glu Phe Tyr Phe Leu Val Ala Ala Gly Thr Tyx Glu Pro Gin Tyr 535 540 545 gee aaa tgc agg ttc etc ttt aca aaa gtg gca tgc ttg cag act gtt 1736 Ala Lys Cys Arg Phe Leu Phe Thr Lys Val Ala Cys Leu Gin Thr Val 550 555 S60 ctg gac gat atg tat gac act tat gga acc eta gat gaa ttg aag eta 1784 Leu Asp Asp Met Tyx Asp Thr Tyr Gly Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu 565 570 575 5Θ0 ttc act gag get gtg aga aga tgg gac etc tee ttt aca gaa aac cbt 1032 Phe Thr Glu Ala Val Arg Arg Trp Asp Leu SBr Phe Thr Glu Asn Leu 585 590 595 cca gac tat atg aaa erta tgt tac caa ate tat tat gac ata gtt cac I860 Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Tyr Gin lie Tyr Tyr Asp lie Val His 600 605 €10 gag gtg get tgg gag gca gag aag gaa cag ggg cgt gaa ttg gtc age 192日 Glu Val Ala Trp Glu Ala Glu Lys Glu Gin Gly Arg Glu Leu Val Ser 615 620 625 ttt ttc aga aag gga tgg gag gat tat ett ctg g-gt tat tat gaa gaa 1976 Phe Phe Arg Lys Gly Trp Glu Asp Tyr Leu Leu Gly Tyr Tyr Glu Glu 630 635 640 (請先閲讀背面之注意事項再UI本頁) -訂· -齡-- -92- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 B7 五 發明説明（89 get gaa tgg tta get get gag tat gtg cct acc ttg gac gag tac ata 2024
Ala Glu Trp Leu Ala Ala Glu Tyr Val Pro Thr Leu Asp Glu Tyr lie 645 650 655 660 aag aat gga ate aca tet ate ggc caa cgt ata ett ctg ttg agt gga Lys Asn Gly lie Thr Ser lie Gly Gin Arg lie Leu Leu Leu Ser Gly 665 670 675 2072 gtg ttg ata atg gat ggg caa etc ett teg caa gag gca tta gag aaa 2120 Val Leu lie Met Asp Gly Gin Leu Leu Ser Gin Glu Ala Leu Glu Lys 6Θ0 68S 690 gta gat t.at cca gga aga cgt gtt etc aca gag ctg aat age etc att 2168 Val Asp Tyr Pro Giy Arg Arg Val Leu Thr Glu Leu Asn Ser Leu lie 695 700 705 tee ege ctg geg gac gac aeg aag aca tat aaa get gag aag get cgt Ser Arg Leu Ala Asp Asp Thr Lys Thr Tyr Lys Ala Glu Lys Ala Arg 710 715 720 gga gaa ctg geg tee age att gaa tgt tac atg aaa gac cat cct gaa GJLy Glu Leu Ala Ser Ser lie Glu Cys Tyr Met Lys Asp His Pro Glu 725 730 735 740 tgt aca gag gaa gag get etc gat cac ate tat age att ctg gag ccg Cys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Asp His lie Tyr Ser lie Leu Glu Pro 745 750 755 gcq gtg aag gaa ccg aca aga gag ttt ctg aag ccc gac gac gtc cca Ala Val Lys Glu Leu Thr Arg Glu Phe Leu Lys Pro Asp Asp Val Pro 760 . 765 770 rtc gee Phe Ala tgc aag aag atg ett ttc gag gag aca aga gtg aeg atg gtg Cys Lys Lys Met Leu Fhe Glu Glu Thr Arg Val Thr Met Val 775 780 785 ata ttc aag gat gga gat gga ttc ggt gtt tee aaa tta gaa gtc aaa He Phe Lys Asp Gly Asp Gly Phe Gly Val Ser Lys Leu Glu Val Lys 790 *795 BOO gat cat ate aaa gag tgt ere att gaa ccg ctg cca ctg taatcaaaat Asp fils lie Lys Glu Cys Leu lie Glu Pro Leu Pro Leu 805 B10 815 agttgcaata ataattgaaa taatctcaac tatgtttcac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2216 2264 2312 2360 2408 2456 250S 2565 2571 請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁)
<210> 13 <2U> B17 <212> PRT <213> Abies grandis <400> 13
Met Ala Gly Val Ser Ala Val Ser Lys Val Ser Ser Leu Val Cys Asp 15 10 15
Len Ser Ser Thr Ser Gly Leu lie Arg Arg Thr Ala Asn Pro His Pro 20 . 25 30
Asn Val Trp Gly Tyr Asp Leu Val His Ser Leu Lys Ser Pro Tyr lie 35 40 . 45
Asp Ser Ser Tyr Arg Glu Arg Ala Glu Val Leu Val Ser Glu lie Lys 50 55 60 -93- 本紙張 l度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 乓、發明説明（9〇 )
Ala Met Le.u Asn Pro Ala He Thr Gly Asp Gly Glu Ser Met lie Thr 65 70 75 80
Pro Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Arg Val Pro Ala lie Asp Θ5 90 95
Gly Ser Ala Arg Pro Gin Ph.e Pro Gin Thr Val Asp Trp He Leu Lys 100 105 110
Asn Gin Leu Lys Asp Gly Ser Trp Gly lie Gin Ser His Phe Leu Leu 115 120 125
Ser Asp Arg Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Val Leu Val Leu Leu Lys 130 135 140
Trp Asn Val Gly Asp Leu Gin Val Glu Gin Gly lie Glu Phe lie Lys 145 150 155 160
Ser Asn Leu Glu Leu Val Ly3 Asp Glu Thr Asp Gin Asp Ser Leu Val 165 170 175
Thr Asp Phe Glu lie lie Phe Pro Ser Leu Ueu Arg Glu Ala Gin Ser 180 185 190
Leu Arg Leu Gly Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Tyr lie His Leu Leu Gin 195 200 205
Thr Lys Arg Gin Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser Arg Glu Glu lie Tyr 210 215 220
Ala Val Pro Ser Pro Leu Leu Tyr Ser Leu Glu Gly lie Gin Asp lie 225 230 235 240
Val Glu Trjp Glu Arg 工le Met Glu Val Gin Ser Gin Asp Gly Ser Phe 245 250 255
Leu Ser Ser Pro Ala Ser Thr Ala Cys Val Phe Met His Thr Gly Asp 260 265 270
Ala Lys Cys Leu Glu Phe Leu Asn Ser Val Met lie Lys Phe Gly Asn 275 280 285
Phe Val Pro Cys Leu Tyr Pro Val Asp Leu Leu Glu Arg Leu Leu lie 290 295 300
Val Asp Asn lie Val Arg Leu Gly lie Tyr Arg Hi's Phe Glu Lys Glu 305· 310 3工5 320 lie Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg His Trp Asa Glu Arg Gly 325 330 335
He Gly Trp Gly Arg Leu Asn Pro lie Ala A9p Leu Glu Thr Thr Ala 3^0 345 350
Leu Gly Phe Arg Leu Leu Arg Leu His Arg Tyr Asn Val Ser Pro Ala 355 360 365 lie Phe Asp Asn Phe Lys Asp Ala Asn Gly Lys Phe lie Cys Ser Thr 370 375 3Θ0
Gly Gin Phe Asn Lys Asp Val Ala Ser Met Leu Asn Leu Tyr Arg Ala 3Θ5 390 395 400
Ser Gin Leu Ala Fhe Pro Gly Glu Asn 工le Leu Asp Glu Ma Lys Ser 405 410 415 -94- 本紙張广度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7B7 五 、發明説明（91 • 10
Phe Ala Thr Lys Tyr Leu Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ser Glu Thr Ser 420 425 430
Ser Ala Trp Asn Asn Lys Gin Asn Leu Ser Gin Glu lie Lys Tyr Ala 435 440 445
Leu Lys Thr Ser Trp His Ala Ser Val Pro Arg Val Glu Ala Lys Arg 450 455 4β0
Tyr Cys Gin Val Tyr Arg Pro Asp Tyr Ala Arg lie Ala Lys Cys Val 465 470 475 480
Tyr Lys Leu Pro Tyr Val Asn Asn Glu Lys Phe Leu Glu Leu Gly Lys 485 490 495
Leu Asp Phe Asn lie lie Gin Ser 工le His Gin Glu Glu Met Lys Asn 500 505 510
Val Thr Ser Trp Phe Arg Asp Ser Gly Leu Pro Leu Phe Thr Phe Ala 515 520 525
Arg Glu Arg Pro Leu Glu Phe Tyr Phe Leu Val Ala Ala Gly Thr Tyr 530 535 540
Glu Pro Gin Tyr Ala Lys Cys Arg Phe Leu Phe Thr Lys Val Ala Cys 545 550 555 560
Leu Gin Thr Val Leu Asp Asp Met Tyr Asp Thr Tyr Gly Thr Leu Asp 565 5*70 575
Glu Leu Lys Leu Phe Thr Glu Ala Val Arg Arg Trp Asp Leu Ser Phe 500 585 590
Thr Glu Asn Leu Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Tyr Gin lie Tyr tyr 595 600 605
Asp lie Val His Glu Val Ala Trp Glu Ala Glu Lys Glu Gin Gly Arg 610 615 620
Glu Leu Val Ser Phe Phe Arg Lys Gly Trp Glu Asp Tyr Leu Leu Gly 625 630 635 640
Tyr Tyr Glu Glu Ala Glu Trp Leu Ala Ala Glu Tyr Val Pro Thr Leu 645 650 655
Asp Glu Tyr lie Lys Asn Gly 工le Thr Ser lie Gly Gin Arg lie Leu 660 665 670
Leu Leu Ser Gly Val Leu lie Met Asp Gly Gin Leu Leu Ser Gin Glu 675 660 665
Ala Leu Glu Lys Val Asp Tyr Pro Gly Arg Arg Val Leu Thr Glu Leu 690 635 700
Asn Ser Leu He Ser Arg Lsu Ala Asp Asp Thr Lys Thr Tyr Lys Ala 705 710 715 720
Glu Lys Ala Arg Gly Glu Leu Ala Ser Ser lie Glu Cys Tyr Met Lys 125 730 735
Asp His Pro Glu Cys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Asp His lie Tyr Ser 740 745 750 lie Leu Glu Pro Ala Val Lys Glu Leu Thr Arg Glu Phe Leu Lys Pro 755 760 765 -95·- 本紙張 (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) - :線丨 义度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 _____B7_ 五、發明説明（92 ) -11-
Asp Asp Val Pro Phe Ala Cys Lys Lys Met Leu Phe Glu Glu Thr Arg 770 775 7Θ0
Val Thr Met Val lie Phe Lys Asp Gly Asp Gly Phe Gly Val Ser Lys
7Θ5 790 795 BOO
Leu Glu Val Lys Asp His lie Lys Glu Cys Leu lie Glu Pro Leu Pro 805 810 815
Leu
<210> 14 <211> 1967 <212> DNA <213> Abies grandis <400> 14 tttctgaatc rtccatccct cgacgcacag ggaatcatca cggaaatgtg tgggacgatg 60
I I acctcataca ctctctcaac tcgccctatg gggcacctgc atattatgag ctccttcaaa 120 agcttattga ggagatcaag catttacttt tgact牙aaat ggaaatggat gatggcgatc ΙβΟ atgattcaat caaacgtctt cagatcgttg acactttgga atgcctggga atcgacagac 240 attttgaaca cgaaaracaa acagctgctt cagattacgt ttacagatgg tggaacgaaa 300 aaggtatcgg ggagggatca agagattcct tcagcaaaga tctcaacgct acagctttag 360 ! gatttcgcgc tctccgactg catcgatata acgtatcgtc aggtgtgtrg aagaatttca 420 ， aggatgaaaa cgggaagttc ttctgcaact ttactggtga agaaggaaga ggagataaac 4Θ0 i ; aagtgagaag catgttgtcg ttacttcgag cttcagagat ttcgtttccc ggagaaaaag 540 tgatggaaga ggccaaggca ttcacaagag aatatctaaa ccaagtttta gctggacacg 600 gggatgtgac tgacgtggat caaagccttt tggagagagg tgaagtacgc attggagttt 660 ! ccatggcttg cagtgtgccg agatgggagg caaggagctt tctcgaaata tatggacaca 720 accattcgtg gctcaagtcg aatatcaacc aaaaaatgtt gaagttagcc aaattg-gact 7B0 tcaatattct gcaatgcaaa catcacaagg agatacagtt tal;tacaagg tggtggagag Θ40 actcgggrat atcgcagctg aatttctatc gaaagcgaca cgtggaatat tattcttggg 900 ttgttatgtg catttttgag ccagagttct ctgaaagtagr aattgccttc gccaaaactg 960 ctatcctatg tactgttcta gatgacctct atgatacgca cgcaacgttg catgaaatca 1020 aaatcatgac agagggagtg agacgatggg atctttcgtt gacagatgac ctcccagact 1080 acattaaaat tgcattccag ttcttcttca aCacagtgaa tgaattgata gttgaaatcg 1140 tgaaacggca agggcgggat atgacaacca tagttaaaga ttgctggaag cgatacattg 1200 agtcttatct gcaagaagcg gaatggatag caactggaca tattcccact tttaacgaat 1260 I acataaagaa cggcatggct agctcaggga tgtgtattgt aaatttgsiat ccacttctct 1320 tgttgggtaa acttctcccc gacaacattc tggagcaaat acattctcca tccaagatcc 1380 _.…96- ·_' 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再？本頁) 奉 .訂| 200300171 A7 B7 五 發明説明（93 ) tggacctctt aggaacgcgg cagtggaaaa attgggagtt raggtcgagg aagtaaagga ggtcttggtt tcttaaacgt gtggaagtgt ttgtgtttat agaarcgacg ggagatggct tgctrtaaat tacgaagcag acttcaattc ccagatarrc gtagttgtct utagggcgga ttagggcata aatattttta ggcagaatcg tcatctttac cacataaaag gatagtgtcc atctacaaat aaaattctag attatggtat ccgttaaata aaattgccta ttttatttaa •12- ccgatgactt agtgttatat gcatccttaa caatgrgttg acagagacgg tccaccaagt attgcattga agttggcaat tggcctatgg aaaaaaaaaa aaaagatttc gaaagaaaax: tcgttccctt caagaaattc cttatacatt tccaarggag catttatgct aattaatatt caagctacaa aaaaaaa <210> 15 <211> 104 <212> DNA <213> Abies grandis <400> 15 tttcatatag tcggggaagc ggtcaacgaa agatcccatc gtctcactcc ctctgrtcatg 60 gaggacgaga 1440 cctcaarcta 1500 gaggaattta 1560 actttcaata 1620 tctgacaagg 1680 gaatagtgat 1740 raaaggtgtt 1ΘΟΟ tagagacttt 1860 attgaaattg 1920 1967 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張 attttgattt cttccaacgt tccgtacgca tcatacccat catc <210> 16 <211> 26 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> ^ ^<223>人工序列之種類：寡核苷酸 <220><221>各種特徵 <222> (1)..(26)反向RACE引子· <4〇0> 16 ctgcgaacct tgagagtggt ctgcag <210> 17 <211> 25 <212> DNA <2工3>人工序列 <220> .<223>人工序列之種類：寡核苷酸 <220><221>各種特徵 <222> (I).'. t25)<223>對吨4.30專一之5’寡核苷酸RACE引子 <400> 17 ggaggatcca tggctgagat ttctg -97- 己度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 104 26 25 200300171 A7B7 五 發明説明（94 13- <210> 1Θ <211> 26 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之種類 募核苷酸 <220><拉1>各種特徵 <222> (1) /. (26)<223>對ag4.30專一之3’募核苷酸RACE引子 <400> 10 aaagtctcga gatattaatt attgcc 2$ <210> 13 <211> 18Θ8 <212> DNA <213> Abies grandis <22 0> <221> CDS <222> (24).-(1766) <400> 19 cggatctggt tccgcgtgga tcc atg get gag att tet gaa tet tee ate ecc 53 Met Ala Gla lie Ser Glu Ser Ser lie Pro 15 10 ega ege aca ggg aat cat cac gga aat gtg tgg gac gat gac czc ata · 101 Arg Arg Thr Gly Asn His His Gly Asn Val Trp Asp Asp Asp Leu lie 15 20 25 cac tet etc aac teg ccc tat ggg gca cct g.ca tat tat gag etc c*ct 14 9 His Ser Leu Asn Ser Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Tyr Tyr Glu Leu Leu 30 35 40 caa aag ett att cag gag ate aag cat tta ett ttg act gaa atg gaa 197 Gin Lys Leu lie Gin Glu lie Lys His Leu Leu Leu Thr Glu Met Glu •45 50 _ 55 atg gat gat ggc gat cat gat tta ate aaa cgt ett cag ate gtt gac 245 Met Asp Asp Gly Asp His Asp Leu lie Lys Arg Leu Gin lie Val Asp 60 65 70 act ttg gaa tgc ctg gga ate gat aga cat ttt gaa cac gaa ata caa 293 Thr Leu Glu Cys Leu Gly 工le Asp Arg His Phe Glu His Glu lie Gin 75 80 85 90 aca get get tta gat tac get tac aga tgg tgg aac gaa aaa gg-t ate 341 Thr Ala Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg Trp Trp Asn Glu Lys Gly lie 95 100 105 ggg gag gga tea aga gat tec ttc age aaa gat ctg aac get aeg gen 389 Gly Glu Gly Ser Arg Asp Ser Phe Ser Lys Asp Leu Asn Ala Thr Ala 110 115 120 tta gga ttt ege get etc ega ctg cat ega tat aac gta teg tea ggt Leu Gly Phe Arg Ala Leu Arg Leu His Arg Tyr Asn Val Ssr Ser Gly 125 130 · 135 437 (請先閲讀背面之注意事項再ϋΙ本頁) -訂— -98- 本紙張 t度適用中國國家標準（CNS) A4規格（21QX297公釐） 200300171 A7B7 五 發明説明（95 14- gtg ttg aag aat ttc aag gat.gaa aac ggg aag ttc ttc tgc aac ttt Val Leu Lys Asn Phe Lys Asp Glu Asn Gly Lys Phe Phe Cys Asn Phe 140 145 i5〇 act ggt gaa gaa gga aga gga gat aaa caa gtg aga age atg ttg teg Thr Gly Glu Glu Gly Arg Gly Asp Lys Gin Val Arg Ser Daet Leu Ser 155 160 165 170 tta ett ega get tea gag att teg ttt ccc gga gaa aaa gtg atg gaa Leu Leu Arg Ala Ser Glu lie Ser Phe Pro Giy Glu Lys Val Met Glu 175 100 165 gag gcc aag gca ttc aca aga gaa rat eta aac caa gt^ eta get gga Glu Ala Lys Ala Phe Thr Arg Glu Tyr Leu Asn Gin Val Leu 2Vla GXy 190 195 200 cac ggrg gat gtg ace gac geg gat caa age ett ttg aga gag gtg aag His Gly Asp Val Thr Asp Val Asp Gin Ser Leu Leu Arg Glu Val Lys 205 210 215 tac gca ttg gag ttt cca tgg cat tgc age gtg ccg aga tgg gag gca Tyr Ala lieu Glu Phe Pro Trp His Cys Ser Val Pro Arg Trp Glu Ala 220 225 230 agg age ttt etc gaa ata tat gga cac aac cat teg tgg ere aag ccg Arg Ser Phe Leu Glu lie Tyx Gly His Asn His Ser Trp ijeu Iijrs Ser 235 240 245 250 aat ate aac caa aaa atg ttg aag tra gee aaa ttg gac ttc aax: att Asn lie Asn Gin liys Met Leu Lys Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn lie 255 260 265 ctg caa tgc aaa cat cac aag gag ata cag ttt att aca agg tgg tgg Leu Gin Cys Lys His His Lys Glu lie Gin Phe lie Thr Arg Trp Trp 270 275 280 aga gac teg ggt·ata teg cag ctg aat ttc tat ega aag ega cac gtg Arg Asp Ser Gly lie Ser Gin Leu Asn Phe Tyr Arg Lys Arg His Val 2Θ5 290 295 gaa tat tat tet tgg gtt gtt atg tgc att ttt gag cca gag tie tet Glu Tyr Tyr Ser Trp Val Val Met Cy3 lie Phe Glu Pro Gla Phe Ser 300 305 310 gaa agt aga att gee ttc gee aaa act get ate ctg tgt act gtt eta Glu Ser Arg 工le Ala Phe Ala Lys Thr Ala lie Leu Cys Thr Val Leu 315 320 325 ·* 330 gat gac etc tat gat aeg cac gca aca ttg cat gaa ate aaa ate atg Asp Asp Leu Tyx Asp Thr His Ala Thr Leu His Glu He Lys lie Met 485 533 5B1 629 677 725 773 •-B21 Θ69 917 965 1013 1061 (請先閲it·背面之注意事項再填窝本頁) 335 340 345 1109 aca gag gga gtg aga ega tgg gat ett teg teg aca gat gac etc cca Thr Glu Gly Val Arg Arg Trp Asp Leu Ser Leu Thr Asp Asp Leu Pro 350 355 360 gac tac att aaa att gca ttc cag ttc ttc ttc aat aca gtg aat gaa 1157 Asp Tyr 工le Lys lie Ala Phe Gin Phe Phe Phe Asn Thr Val Asn Glu 365 370 375 ttg aza gtt gaa ate gtg aaa egg caa ggg egg gat atg aca acc ata 1205 Leu lie Val Glu lie Val Lys Arg Gin Gly Arg Asp Met Thr Thr lie 380 3B5 390 gtt aaa gat tgc rgg aag ega tac att gag tet tat ctg caa gaa geg 1253 99- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐〉 200300171 A7 ____ B7 五丨、發明説明（％ ) •15-
Val Lys Asp Cys Trp Lys Arg Tyr He Glu Ser Tyr X^u Gin Glu Ala 395 400 405 «ίο gaa tgg at a gca act gga cat att ccc act ttt aac gaa rac ata aag 1301
Glu Trp lie Ala Thr Gly His lie Pro Thr Phe Asn Glu Tyr lie Lys 415 420 425 aac ggc atg get age tea ggg atg tgt att eta aat ttg aat cca ect 1349
Asn Gly Met Ala Ser Ser Gly Met Cys lie Leu Asn Leu Asn Pro Leu 430 435 440 etc ttg ttg gat aaa ett etc ccc gac aac att ctg gag caa ata cat 1397
Leu Leu Leu Asp Lys Leu Leu Pro Asp Asn He Leu Glu Gin lie His 445 450 455 tet cca tcc aag ate ctg gac etc tta gaa ttg aeg ggc aga ate gcc 14 45
Ser Pro Ser Lys lie Leu Asp Leu Leu Glu Leu Thr Gly Arg lie Ala 460 465 470 gat gac tta aaa gat tcc gag gac gag aag gaa ege ggg gag atg get 14 93
Asp Asp Leu Lys Asp Phe Glu Asp Glu Lys Glu Arg Gly Glu Met Ala 475 4Θ0 485 490 tea tet tta cag tgt tat ang aaa gaa aat cct gaa tet aca gtg gaa 1541
Ser Ser Leu Gin Cys Tyr Met Lys Glu Asn Pro Glu Ser Thr Val Glu 495 500 505 aat get· aat c这c ata aaa ggc ate ett aat cgt tee ett gag gaa 15日 9
Asn Ala Leu A.sn His lie Lys Gly lie Lea Asn Arg Ser Leu Glu Glu 510 515 520 ttt aat tgg gag ttt atg aag cag gat agt gtc cca atg tgt tgc aag 1637
Phe Asn Trp Glu Phe Met Lys Gin Asp Ser Val Pro Met Cys Cys Lys 525 530 535 aaa ttc act ttc aat ata ggt ega gga ett caa ttc ate tac aaa tac 1665
Lys Phe Thr Phe Asn lie Gly Arg Gly Leu Gin Phe lie Tyr Lys Tyr 540 545 550 aga gac ggc tta tac att tet gac aag gaa gta aag gac cag ata tee 1733
Arg Asp Gly Leu Tyr He Ser Asp Lys Glu Val Lys Asp Gin He Phe 555 560 565 570 aaa att eta gtc cac caa gtt cca atg gag gaa tagtgatggt cttiggttgta 1766
Lys He Leu Val His Gin Val Pro Met Glu Glu 575 580 gttgtctatt atggtatatt gcattgacat ttacgcttaa aggtgtttct taaacgttta 1B46 gggcggaccg traaataagt tggcaataat taatateteg ag 16ΘΘ
<210> 20 <211> 581 <212> PRT <213> Abies grandls <400> 20
Met Ala Glu 工le Ser Glu Ser Ser lie Pro Arg Arg Thr Gly Asn His 1 5 10 15
His Gly Asn Val Trp Asp Asp Asp Leu lie HJLs Ser Leu Asn Ser Pro 20 25 30
Tyr Gly Ala Pro 2U.a Tyr Tyr Glu Leu Leu Gin Lys Leu lie Gin Glu 35 40 45 -100- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) .訂- 200300171 A7 B7 五、發明説明（97 16- lie Lys His Leu Leu Leu Thr Glu Met Glu Met Asp Asp Gly Asp His 50 55 60 Asp Leu 工le Lys Arg Levi Gin lie Val Asp Thr Leu Glu Cys Leu Gly €5 70 75 80 lie Asp Arg His Phe Glu JfLis Glu lie Gin Thr Ala Ala Leu Asp Tyr Θ5 90 95 Val Tyr Arg Trp Trp Asn Glu Lys Gly lie Gly Glu Gly Ser Arg Asp 100 105 110 .· Ser Phe Ser Lys Asp Leu Asn Ala Thr Ala Leu Gly Phe Arg Ala Leu ! 115 120 125 Arg Leu His Arg Tyr Asn Val Ser Ser Gly Val Leu Lys Asn Phe Lys 130 135 140 Asp 61a Asn Gly Lys Phe Phe Cys Asn Phe Thr Gly Glu Gla Gly Arg 145 150 155 160 Gly Asp Lys Gin Val Arg Ser Met Leu Ser Leu Leu Arg Ala Ser Glu 165 170 175 'lie Ser Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Lys Ala Phe Thr I 180 105 190 i Arg Glu Tyr Leu Asn 61n Val Leu Ala Gly His Gly Asp Val Thr Asp * 195 200 205 I j Val Asp Gin Ser Leu Ldu Arg Glu Val Lys Tyr Ala Leu Glu Phe Pro I 210 215 220 Trp His Cys Ser Val Pro Arg Trp Glu Ala Arg Ser Phe Leu Glu He 225 230 235 240 Tyr Gly His Asn His Ser Trp Leu Lys Ser Aszl lie Asn Gin Lys Met 245 250 255 Leu Lys Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn lie Leu Gin Cys Lys fiis fiis 260 265 270 Lys Glu lie Gin Phe lie Thr Arg Trp Trp Arg Asp Ser Gly lie Ser 275 290 265 Gin Leu Asn Phe Tyr Arg Lys Arg His Val Glu Tyr Tyr Ser Trp Val 290 295 · 300 Val Met Cys He Phe Glu Pro Glu Phe Ser Glu Ser Arg lie Ala Phe 305 310 315 320 Ala Lys Thi Ala lie Lsu Cys Thr Val Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr 325 330 335 His Ala Thr Leu His Glu lie Lys lie Met Thr Glu Gly Val Arg Arg 340 345 350 Trp Asp Leu Ser Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp Tyr He Lys He Ala 355 360 365 Phe Gin Phe Phe Phe Asn Thr Val Asn Glu Leu lie Val Glu He Val 370 375 380 Lys Arg Gin Gly Arg Asp Met Thr Thr lie Val Lys Asp Cys Trp Lys 385 390 395 400 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) -裝—
•、可I -101- 本紙張 尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 B7 五 發明説明（98 ) 17-
Arg Tyr lie Glu Ser Tyr Leu Gin Glu Ala Glu Trp He A.la Thr Gly «5 410 415 His He Pro Thr Phe Asn Glu Tyr Ila Lys Asn Gly Met Ala Ser Ser 420 425 430 Gly Met Cys lie Leu Asn Leu Asn Pro Leu L*eu Leu Leu Asp Lys Leu 435 440 445 Leu Pro Asp Asn lie Leu Glu Gin He His Ser Pro Ser Lys lie Leu 450 455 4 60 Asp Leu Leu Glu Leu Thr Gly Arg lie Ala Asp Asp Leu Lys Asp Phe 4 65 470 475 4Θ0 Glu Asp Glu Lys Glu Arg Gly Glu Met Ala Ser Ser Leu Gin Cys Tyr 485 490 495 Met Lys Glu Asn Pro Glu Ser Thr Val Glu Asn Ala Leu Asn His lie 500 505 510 Lys Gly lie Leu Asn Arg Ser Leu Glu Glu Phe Asn Trp Glu Phe Met 515 520 525 Lys Gin Asp Ser Val Pro Met Cys Cys Lys Lys Phe Thr Phe Asn lie 530 535 540 Gly Arg Gly Leu Gin Phe He Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Leu Tyr lie 550 555 5^0 Ser Asp Lys Glu Val Lys Asp Gin lie Phe L/s lie Leu Val His Gin 565 570 . 575 Val Pro Met Glu Glu 580 (請先閲讀背面之注意事項再本頁)
P -訂丨 <210> 21 <211> 2B <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之種類••寡核苷酸 <220><221>各種特徵 <222> (1)..(28)<223> PCR募核苷酸引子Ndel <400> 21ctggttccgc gtggacatat ggctgagt <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>人工序列之種類：募核苷酸
2B <220> -102. 本紙張 尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 200300171 A7 B7 五、發明説明（99 ) atg tgg gag Trp Glu 30 18 <221>各種特徵 <222> (1)..(33)
<223> PCR寡核苷酸引子4-BamHI <400> 22 ctacaaccaa gaggatccct atucctccat tgg 33
<210> 23 <2U> 1977 <212> DNA <213> Abies grandis <220> <221> CDS <222> (4)..(1702) <400> 23 tcc atg get cag att t.ot gaa tet gta cca ccc tet acc gat ttg aag 40
Met Ala Gin lie Ser Glu Ser Val Ser Pro Ser Thr Asp Leu Lys 15 10 15 age acc gaa tet tec att acc tet aat ega cat gga aat Ser Thr Glu Ser Ser lie Thr Ser Ash Arg Bis Gly Asn Met 20 25 96 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) gac gat ege at a cag tet etc aac tea cct tat ggg ?ca cct gca tat Asp Asp Arg lie Gin Ser Leu Asn Ser Pro-Tyr Giy Ala Pro Ala Tyr 35 40 45 caa gaa ege age gaa aag ett at:t gaa gag ate aaa ett rta ttt ttg Gin Glu Arg Ser Glu Lya Leu lie Glu Glu lie Lys Leu Leu Pha Leu 50 55 60 I agt gac atg gac gat age tgc aat gat age gat cgt gat tta ate aaa 1 Ser Asp Met Asp Asp Ser Cys Asn Asp Ser Asp Arg Asp Leu lie Lys 65 70 7S cgt ett gag ate gtt gat act gtc gag tgt ctg gga att gat ega cat Arg Leu Glu lie Val Asp Thr Val Glu Cys Leu Gly lie Asp Arg His AO 65 90 95 ttt caa cct gag ata aaa tta get ctg gat tac gtt tac aga tgt tgg Phe Gin Pro Glu lie Lys Leu Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Axg Cys Trp 100 105 110 144 192 240 26Θ 336 •訂· :線丨 384 tec etc aag aaa gat Ser Leu Lya Lys Asp 125 aac gaa aga ggc ate gga gag gga tea aga gat Asn Glu Arg· Gly lie Gly Glu Gly Ser Arg Asp 115 120 ctg aac get aca get ttg gga ttc egg get etc ega etc cat ega tat Lea Asn Ala Thr Ala Leu Gly Phe Arg Ala Leu Arg Leu His Arg Tyr 130 135 140 aac gta tec tea ggt gtc ttg gag aat ttc aga gat gat aac ggg cag Asn Val Ser Ser Gly Val Leu 61a Asn Phe Arg Asp Asp Asn Gly Gin 145 150 155 ttc ttc tgc ggt tet aca gtt gaa gaa gaa gga gca gaa gca tat aat Phe Phe Cys Gly Ser Thr Val Glu Glu Glu Gly Ala Glu Ala Tyr Asn 160 165 170 175 I aaa cac gta aga tgc atg ctg tea tta teg ega get tea aac att tta Lys His val Arg Cys Met Leu Ser Leu Ser Arg Ala Ser Asn lie Leu 180 185 190 432 4Θ0 520 576 103- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱） 200300171 A7 B7 五 發明説明（⑽ -19- ttt ccg ggc gaa aaa gtg atg gaa gag gcg aag gca ttc aca aca aat Phe Pro Gly *Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Lys Ala Phe The Thr Asn 195 200 205 624 tat eta aag aaa gtt tta gca gga egg gag get acc cac gtc gat gaa Tyr Leu Lys Lys Val Leu Ala Gly Arg Glu Ala Thr His Val Asp Glu 210 215 220 672 age ett trg gga gag gtg aag tac gca ttg gag ttt cca ngg cat tgc 720 Ser Leu Leu Gly Glu Val Lys Tyr Ala Leu Glu Phe Pro Trp His Cys 225 230 235 agt gtg cag aga tgg gag gca agg age ttt ate gaa ata ttt gga caa 7 60 Ser Val Gin Arg Trp Glu Ala Arg Ser Phe lie Glu lie Phe Gly Gin 240 24S 250 255 att gat: tea gag ett aag teg aat ttg age aaa aaa atg tta gag ttg 816 He Asp Ser Glu Leu Lys Ser Asn Leu Ser Lys Lys Met Leu Glu Leu 260 265 270 gcg aaa t:tg gac ttc aat att ctg caa tgc aca cat cag aaa gaa ctg 664 Ala Lys Asp Phe Asn 工JLe Leu Gin Cys Thr His Gin ILys Glu Leu 275 280 285 cag att ate tea agg tgg ttc gca gac tea agt ata gca tcc ctg'aax: 912 Gin lie lie Ser Arg Trp Phe Ala Asp Ser Ser He Ala Ser Leu Asn 290 295 300 ttc tat egg aaa tgt tac gtc gaa ttt tac ttt tgg atg get gca gcc 960 Phe Tyr Arg Lys Cys Tyr Val Glu Phe Tyr Phe Trp Met Ala Ala Ala 305 310 315 III —^^Γ— I I I I 本頁) -、tr— ；ate tcc gag ccg gag ttt tet: gga age aga gtt gcc ttc aca aaa atx: } lie Ser Glu Pro Glu Fha Ser Gly Ser Arg Val Ala Phe Thr Lys lie ! 320 325 330 335 1008 get ata ctg atg aca atg erta gat gac ctg tac gat act cac gga acc 1056 Ala lie Leu Met Thr Met Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr His Gly Thr 340 345 350 ttg gac caa etc aaa ate ttt aca gag gga gtzg aga ega tgg gat gtt 1104 Leu Asp Gin Leu Lys 工le Phe Thr Glu Gly Val Arg Arg Trp Asp Val 355 360 365 teg ttg gta gag ggc etc cca gac ttc atg aaa ate gca ttc gag ttc 1152 Ser Leu Val Glu Gly Leu Pro Asp Phe Met Lys lie Ala Phe Glu Phe 370 375 _ 380 tgg tta aag aca tct'aat gaa trg att get gaa get gtt aaa gcg caa 1200 Trp Leu Ljrs Thr Ser Asn Glu Leu lie Ala Glu Ala Val Lys Ala Gin 3B5 390 395 ggg caa gat atg gcg gcc tac ata aga aaa aat gca tgg gag ega tac 1240 Gly Gin Asp Met Ala Ala Tyr He Arg Lys ASsn Ala Trp Glu Arg Tyr 400 405 410 415 ett gaa get tat ctg caa gat gcg gaa tgg ata gcc act gga cat gtc 1296 Lea Glu Ala Tyr Leu Gin Asp Ala Glu Trp lie Ala Thr Gly His Val 420 425 430 ccc acc ttt gat gag tac ttg aat aat ggc aca cca aac act ggg atg 1344 Pro Thr Phe Asp Glu Tyr Leu Asn Asn Gly Thr Pro Asn Thr Giy Met 435 “ο 445 rgt gta ttg aat: ttg att ccg ett ctg tta atg ggt gaa cat tta cca 1392 Cys Val Leu Asn Leu lie Pro Leu Leu Leu Met Gly Glu flis Leu Pro -104- 本紙度適用中國國家標準（01:5) A4規格（210x297公楚） 200300171 五7發明説明（10) -20 4S0 455 4 60 ate gac att ctg gag caa ata ttc ttg ccc tee agg ttc cac cat ere ! lie Asp lie Leu Glu Gin lie Phe Leu Pro Ser Arg Phe His His Leu 465 470 475 1440 att gaa ttg get tee agg etc cptc gat gac geg aga gac ttc cag geg 14S8 lie Glu Leu Ala Ser Arg Leu Val Asp Asp Ala Arg Asp Phe Gin Ala 480 485 490 495 gag aag cfat cat ggg gat tta teg tgt att gag tgt tat tta aaa gat Glu Lys Asp His Gly Asp Leu Ser Cys lie Glu Cys Tyr Leu Lys Asp 500 505 510 1536 cat cct gag tet aca gta gaa gat get tta aat cat gtt aat ggc etc 1564 His Pro Glu Ser Thr Val Glu Asp Ala Leu ksn His Val Asn Gly Leu 515 520 525 ett ggc aat tgc ett ctg gaa aeg aat tgg aag ttc tta aag aag cag Leu Gly Asn Cys Lea Leu Glu Met Asn Trp Lys Phe Leu Lys Lys Gin 530 535 540 1632 gac agt gtg cca etc teg tgt aag aag tac age ttc cat gta ttg gca 1680 Asp Ser Val Pro Leu Ser Cys Lys Lys Tyr Ser Phe His Val Leu Ala 550 545 555 ega age ate caa ttc atg tac aar caa ggc gat ggc ttc tee att td:g Arg Ser lie Gin Phe Met Tyr Asn. Gin Gly Asp Gly Phe Ser lie Ser 560 565 5.-70 575 aac aaa gtg ate aag gat caa gtg cag aaa gtt ett att gtc ccc gtg Asn Lys Val lie Lys Asp Gin Val Gin Lys Val Leu lie Val Pro Val 5B0 595 530 cct att tgagaattcc cgggtcgact cgagcggccg catcgtgact gactgacgat Pro lie 1720 1776 1日32 本紙張 ctgcctcgcg cgrtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 1892 ggtcacagct tgtctgtaag eggatgeegg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 1952 gggtgttggc gggtgtccgg gegea 1977 <210> 24 <211> 593 <212> PRT <213> Abies grandis <400> 24 Met Ala Gin He Ser Glu Ser Val Ser Pro Ser Thr Asp Leu Lys Ser IS l〇 15 Thr Glu Ser Ser lie Thr Ser Asn Arg His Gly Asn Met Trp Glu Asp 20 25 30 Asp Arg lie Gin Ser Leu Asn Ser Pro .Tyr Gly Ala Pro Ala Tyr Gin 35 40 45 Glu Arg Ser Glu !Lys Leu lie Glu Glu lie Lys Leu Leu Phe Leu Ser 50 55 60 Asp Met Asp Asp Ser Cys Asn Asp Ser Asp Arg Asp Leu lie Lys Arg 65 70 ,75 80 Leu Glu He Val Asp Thr Val Glu Cys Leu Gly lie Asp Arg His Phe -105-瓦度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐）
....................裝· (請先閲讀背面之注意事项再填窝本頁) -訂..................線- 200300171
五、發明説明（l〇2
Gin Pro Glu lie Lys Leu Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg Cys Trp As π 100 105 110 fslu Arg Gly lie Gly Glu Gly Ser Arg Asp sex· Leu Lys Lys Asp Leu 115 120 125
Asn Ala Thr Ala Leu Gly Phe Arg Ala Leu Arg Leu His Arg Tyx Asn 130 135 140
I
Val Ser Ser Gly Val Leu Glu Asn Phe Arg Asp Asp Asn Gly Gin Phe 145 150 155 160
Phe Cys Gly Ser Thr Val Glu Glu Glu Gly Ala Glu Ala Tyr Asn Lys 165 170 175
His Val Arg Cys Met Leu Ser Leu Ser Arg Ala Ser Hsu lie Leu Phe { 1Θ0 ΙΘ5 190
Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Lys Ala Phe Thr Thr Asn Tyr 195 200 205
Leu Lys Lys Val Leu Ala Gly Arg Glu Ala Thr His Val Asp Glu Ser 210 215 220 X，eu Leu Gly Glu Val Lys Tyr Ala Leu Glu Phe Pro Trp His Cys Ser 225 230 235 240
Val Gin Arg Txp Glu Ala Arg Ser Phe lie Glu lie Phe Gly Gin 工le 245 2S〇l 255
Asp Ser Glu Leu Lys Ser Asn Leu Ser Lys Lys Met Leu Glu Leu Ala 260 265 270
Lys Leu Asp Phe Asn He Leu Gin Cys Thr His Gin Lys Glu Leu Gin 275 2Θ0 285 lie lie Ser Arg Trp Phe Ala Asp Ser Ser lie Ala Ser Leu Asn Phe 290 295 300
Tyi* Axg Lys Cys Tyr Val Glu Phe Tyr Phe Trp Met Ala Ala Ala lie 305 310 315 320
Ser Glu Pro Glu Phe Ser Gly Ser Arg Val Ala Phe Thr Lys lie Ala 325 330 335 lie Leu Met Thr Met Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr His Gly Thr Leu 340 345 350
Asp Gin lieu I<ys 工le Phe Thr Glu Gly Val Arg Arg Tarp Asp Val Ser 355 360 365
Leu Val Glu Gly Lea Pro Asp Phe Met Lys lie Ala Phe Glu Phe Trp 370 375 380
Leu Lys Thr Ser Asn Glu Leu lie Ala Glu Ala Val Lys Ala Gin Gly 385 390 395 400
Gin Asp Met Ala Ala Tyr lie Arg Lys Asn Ala Trp Glu Arg Tyr Leu 405 410 415
Glu Ala Tyr Leu Gin Asp Ala Glu Trp lie Ala Thr GJLy His Val Pro 420 425 430
Thr Phe Asp Glu Tyr Leu Asn Asn Gly Thr Pro Asn Thr Gly Met Cys -106- 本紙，尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（21·0Χ297公釐） -22. 200300171 435 440 445
Val Leu Asn Leu lie Pro Lea Leu Leu Met Gly Glu His Leu Pro lie 450 455 460 Asp He Leu Glu Gin lie Phe Leu Pro Ser Arg Phe His Kis Leu lie 465 470 475 480 Glu Leu Ala Ser Arg Leu Val Asp Asp Ala Arg Asp Phe Gin Ala Glu 4Θ5 490 495 Lys Asp His Gly Asp Leu Ser Cys lie Glu Cys Tyr Leu Lys Asp His 500 505 510 Pro Glu Ser Thr Val Glu Asp Ala Leu Asn His Val Asn Gly Leu Leu 515 520 S25 Gly Asn Cys Leu Leu Glu Met Asn T2^> Lys Phe Leu Lys Lys Gin Asp 530 S35 e 540 Ser VaX Pro Leu Ser Cys Lys Lys Tyr Ser Phe His Val Leu Ala Arg 545 550 555 560 Ser lie Gin Phe Met Tyr Asn Gin Gly Asp Gly Phe Ser lie Ser Asn 565 570 575 Lys Val lie Lys Asp Gin Val Gin Lys Val Leu lie Val Pro Val Pro 580 585 590 lie <21〇> 25 <211> 116 · <212> DNA <213> Abies grandis <400> 25 ggtctagatt gcatgtagtc ggggaagtgg tctaccaacg aaacatccca tcgtcccact 60 ccctcrgtaa agattttgag ttggtccaag gttccatgcg catcataccc atcgtc 116 緣 <210> 26 <211> 1416 <212> DNA <213> Abies grandis <400> 26 aaaaagtgat ggaagaggcg aaggcattca caacaaatta tctaaagaaa gacgggaggc tacccacgtc gatgaaagcc ttttgggaga ggtgaagtac ttccatggca ttgcagtgtg cagagatggg aggcaaggag ctttatcgaa aaattgattc agagcttaag tcgaatttga gcaaaaaaat gttagagttg acttcaatat tctgcaatgc acacatcaga aagaactgca gattatctca cagactcaag tatagcatcc ctgaatttct atcggaaatg ttacgtcgaa ggatggctgc agccatctcc gagccggagt tttctggaag cagagrttgcc ttgctatact gatgacaatg ctagatgacc tgtacgatac tcacggaacc gtcctagcag 60 gcattggagt 120 atatttggac 180 gcgaaattgg 240 aggtggttcg 300 ttttactttt 360 ttcacaaaaa A20 ttggaccaac 4Θ0 107- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X207公楚） 200300171
本紙張p度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐) 200300171 A7 B7 一1"^月説明（l〇5 -24· tggtaccatg gctggcgttt ctgctgtatc ο 3 j <21〇> 29 ! <2H> 21 \ <212> DNA <213>人工序列 人工序列之種類••募核菩跋 各種特徵SW5l297i--^3^ACE^ <400> 29 tatgaattct caaataggca cggggac 27 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <22；B>人工序列之種類 募核苷酸 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁)
<22 0> <221>各種特徵 <222> (1)-.(2*7) <223> PCR引子 5NdeI <400> *3〇 ctggttccgc gtggacatat ggctcag 27 •訂· <210> 31 <211> 32 <212> DMA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之種類 <220> <221>各種特徵 <222> CD . - (32) <223> pCR引子 5BamHI <400> 31 gtcagtgacg atggatcctc aaataggcac gg 募核苷酸 :線丨 <210> 32 <211> 0 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之種類 胺基酸片段 -109_ 本紙張 t度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171
<220> , 丨<221>域 <222> (1)..(0) j<223>保留性序列片段其中位於3之Xaa為Thr或lie ;位於4之Xaa為lie或Tyr或 I Phe ;位於6之Xaa為Ala或Val ;位於8之Xaa為Ala或Gly <400> 32
Asp Asp Xaa Xaa Asp Xaa Tyr Xaa 1 5
<210> 33 <211> 622 <212> DNA. · <213> Abies grandis <400> 33 tgacatagtt cacgaggtgg cttgggaggc agagaaggaa caggggcgtg aattggtcag 60 ctttttcaga aagggatggg aggattatct tctgggttat tatgaagaag ctgaatggtt 120 agctgctgag tatgtgccta ccttggacga gtacataaag aatggaatca catctatcgg 180 ccaacgtata cttctgttga gtggagtgtt gataatggat gggcaactcc tttcgcaaga 240 ggcattagag aaagtagact atccag^aag acgtgttctc acagagctga atagccrtcat 300 ttcccgcctg gcggatgaca cgaagacata taaagctgag aaggctcgtg gagaattggc 360 gtccagcatt gaatgttaca tgaaagacca tcctgaatgt acagaggaag aggctctcga 420
tcacatctat agcattctgg agccggcggt gaaggaactg acaagagagt ttctgaagcc 4BO cgacgacgtc ccattcgcct gcaagaagat gcttttcgag gagacaagag tgacgatggt 540 gatattcaag gatggagatg gactcggtgt ttccaaatta gaagtcaaag atcatatcaa 600 agagtgtctc attgaaccgc tg 622 <210> 34 <211〉 21 <212> DNA <2i3>人工序列 <220> <2幻> 人工序列之種類••募核苷酸 <220> 各種特徵 <222> (1)..(21)
<223>寡核苷酸引子1.28F <400> 34 tgacatagtt cacgaggtgg c <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <22 0> -110- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 B7 ’玉 1蒼日万說 -26 <223>人工序列之種類：暮核答酸 <220> •丄， <221>各種特徵 <222> (1)..(21) <223>募核苷酸弓丨子1.28R <400> 35 cagcggttca atgagacact c 21 <210> 36 <211> 5 <2X2> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之種類 胺基睃序列片段 <220> <221> 域 <222> (1).- (5) <22 3> 保留性胺基酸序列片段其中位於3及4之Xaa代表任何胺基酸 <400> 3β Asp Asp Xaa Xaa Asp 1 5 <210> 37 <211> 2528 <212> DNA <213> Abies grandis <220> <221> CDS <222> (1)..(2451) <400> 37 atg get ggc gtt tet get gta tea aag gtt tee age ttg gtx: tgt gat Met Ala Gly Val Ser Ala Val Ser Lys Val Ser Ser Leu Val Cys Asp 15 10 15
AS ttg t:cg agt acc age ggc ttg att ega aga act gee aat cct cat ccc 96 Leu Ser Ser Thr Ser Gly Leu He Arg Arg Thr Ala Asn Pro His Pro 20 25 30 aat Asn gtc tgg ggt tat gac ett gtg cat tet ett aaa tea cct tat att 144 Val ‘ 一 - - '
Trp Gly Tyr Asp Leu Val His Ser Leu Lys Ser Pro Tyr lie 35 40 45 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂— :線丨 192 gat tet agt tac aga gaa ege geg gag gtc ett gtt age gag att aaa Asp Ser Ser Tyr Arg Glu Arg Ala Glu Val Leu Val Ser Glu He Lys 50 55 60 gtg atg ett aat cca get att aca gga gat gga gaa tea atg att act 240
Val Met Leu Asm Pro Ala lie Thr Gly Asp Gly Glu Ser Met lie Thx
65 70 75 BO cca tet get tat gac aca gca tgg gta geg agg gtg ccc gee att gat 288
Pro Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Arg Val Pro Ala lie Asp 85 90 95 -111- 本紙?J：尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 336200300171 五1發明説明（l〇8 -27' ggc tct get ege ccg caa ttt ccc caa aca gtt. gac tgg att ttg aaa Glv Ser Ala Arg Pro Gin Phe Pro Gin Thr Val Asp Trp lie Leu Lys 100 105 110 aac cag tta aaa gat ggt tea tgg gga att cag tee cac ttt ctg ctg Asn Gin Leu Lys Asp Gly Ser Trp Gly lie Gin Ser His Phe Leu Leu 115 120 125 tee gac cgt ett ett gee act ett tct tgt gtt ett gtg etc ett aaa Ser Asp Arg Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Val Leu Val Leu Leu Lys 130 135 140 364 432 ,tgg aac gtt ggg gat ctg caa gta gag cag gga att gaa ttc ata aag ,Trp Asn Val Gly Asp Gin Va：L Glu Gin lie Glu Phe 工le Le 4Θ0 145 150 155 160 age aar ctg gaa eta gta aag gat gaa acc gat caa gat age rtg gta Ser Asn Leu Glu Leu Val Lys Asp Glu Thr Asp Gin Asp Ser Leu Val 165 170 175 aca gac ttt gag ate ata ttt cct tct ctg tta a?a gaa get caa tct Thr Asp Phe Glu lie lie Phe Pro Ser Leu Leu Arg Glu Ala Gin Ser j 180 185 190 ! ctg ege etc gga ett ccc tac gac ctg cct tat ata cat ctg ttg cag Leu Arg Leu Gly Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Tyr lie His Leu Leu Gin 195 200 205 act aaa egg cag gaa aga tta gca aaa etc tea agg gag gaa ate tat Thr Lys Arg Gin Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser Arg Glu Glu lie Tyr 210 215 220 geg gtt ccg teg cca ttg ttg tat tct tta gag gga aca caa gat ata Ala Val Pro Ser Pro Leu Leu Tyr Ser Leu Glu Gly lie Gin Asp lie 225 230 235 240 gtt gaa tgg gaa ega ata atg gaa gtt caa agt cag gat ggg tct ttc Val Glu Trp Glu Arg lie Met Glu Val Gla Ser Gin Asp Gly Ser Phe 245 250 255 52Θ 事 576 624 672 720 760 頁 訂 tta age tea cct get tct Leu Ser Ser Pro Ala Ser 260 act gee tgc gtt rtc atg cac aca gga gac Thr Ala Cys VaX Phe Met His Thr Gly Asp 265 2Ί0 816 geg aLaa tgc ett gaa rtc ttg aac gtg atg ate aag trt gga aat Ala Lys Cys Leu Glu Phe Leu Asn Ser Vai Met 工le Lys Phe Giy Asn 275 2Θ0 ·· :285 ttt gtt ccc tgc cug tat cct gtg gat ctg ctg gaa ege ctig zzg ate Phe Val Pro Cys Leu Tyr Pro Val Asp Leu Leu Glu Arg Leu Leu lie 290 295 300 gt3 gat aat att: gtsi ege ett ate tat aga cac ttt gaa aag gaa Val Asp Asn lie Val Arg Leu Gly lie Tyr Arg His Phe Glu Lys Gla 305 310 315 320 ate aag gaa get ett gat tat gtt tac agg cat tgg aac gaa aga gga lie Lys Glu £la Ιιβ*α Asp Tyr Val Tyr Arg His Trp Asn Glu Arg Gly 325 330 335 att ggg tgg ggc aga eta aat ccc ata gca gat ett gag acc act get He Gly Trp Gly Arg Leu Asn Pro He Ala Asp Leu Glu Thr Thr Ala 340 345 . 350 ttg gga ttt ega ttg ett egg erg cat agg tac aat gta tct cca gee Leu Gly Phe Arg Leu l»eu Arg Leu His Arg Tyr Asn Val Ser Pro Ala Θ64 912 360 1008 1056 1104 m -112- 本紙4尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（2i〇X297公釐） 200300171 五 發明説明（l〇9 * 28 - 355 360 365 att ttt gac aac ttc aaa gat gcc aat ggg aaa ttc att tgc teg ace lie Phe Asp Asn Phe Lys Asp Ala Asn Gly Lys Phe lie Cys Ser Thr 370 375 380 ggt caa ttc aac aaa gat gta gca age atg ctg aat ett tat aga get Gly Gin Phe Asn Lys Asp Val Ala Ser Met Leu Asn Leu Tyr Arg Ala 385 390 395 400 tcc cag etc gca ttt ccc gga gaa aac atr ett gat gaa get aaa age Ser Gin Leu Ala Phe Pro Gly Glu Asn lie Leu Asp Glu Ala Lys Ser 405 410 415 ttc get act aaa tat ttg aga gaa get cut gag aaa agt gag act tec Fhe Ala Ttir Lys Tyr Leu Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ser Glu Thr Ser 420 425 430 agt: gca tgg aaic aac asi违 caa aac ctg age caa gag ate aaa tac geg Ser Ala Trp Asn Asn Lya Gin Asn Leu Ser Gin Gla lie Lys Tyr Ala 435 440 445 1152 1200 1248 1296 1344 ctg aag Leu Lys 450 act tet tgg cat gcc agt gtt ccg aga gtg gaa Thr Ser Trp His Ala Ser Val Pro Arg Val Glu 455 460 gca aag aga Ala Lys Arg 1392 tac tgt caa gtg tat ege cca gat tat gca ege ata gca aaa tgc gtt Tyr Cys Gin Val Tyr Arg Pro Asp Tyr Ala Arg 工le Ala Lys Cys Val 465 470 475 480 tac aag eta ccc tac gtg aac aat: gaa aag ttt tta gag ctg gga aaa Tyr Lys Leu Pro Tyr Val Asn Asn Glu Lys Phe Leu Glu Leu Gly Lys 485 430 495 tta gat ttc aac att ate cag tec ate cac caa gaa gaa atg aag aat Leu Asp Phe Asn lie He Gin Ser lie His Gin Glu Glu Mer Lys Asn 500 505 510 gtt acc age tgg ttt aga gat teg ggg ttg cca eta ttc ace ttc get Val Thr Ser Trp Phe Arg Asp Ser Gly Lea Pro Leu Phe Thr Phe Ala 515 520 525 egg gag agg ccg ctg gaa ttc tac ttc tta gta geg geg ggg acc tat Arg Glu Arg Pro Leu Glu Phe Tyr Phe Leu Val Ala Ala Gly Thr Tyr 530 535 540 gaa ccc cag tat gcc aaa tgc agg ttc etc ttt aca aaa gtg gca tgc Glu Pro Gin Tyr Ala Lys Cys Arg Phe Leu Phe Thr Lys Val Ala Cys 545 550 555 560 ttg cag act gtt ctg gac gat atg tat gac act tat gga acc eta gat Leu Gin Thr Val Leu Asp Asp Met Tyr Asp Thr Tyr Gly Thr Leu Asp 565 570 575 gaa ttg aag eta ttc act gag get gtg aga aga tgg gac etc tec ttt Glu Leu Lys Leu Phe Thr Glu Ala Val Arg Arg Trp Asp Leu Ser Phe 1440 14Θ8 1536 1584 1632 16Θ0 1728 1776 580 585 ΰ90 aca gaa aac ett cca gac tat atg aaa eta tgt tac caa ate tat tat Thr Glu Asn Leu Pro Asp Tyr Met Lys Lea Cys Tyr Gin He Tyr Tyr 595 600 605 gac ata gtt cac gag gtg get tgg gag gca gag aag gaa cag ggg cgt Asp lie Val His Glu Val Ala Trp Glu Ala Glu Lys Glu Gin Gly Arg 610 615 620 1Θ24 1072 -113·本紙頡尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格U10X297公釐）
(請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁)
i 200300171 五卜發明説明（110 ) ί -29-gaa ttg gtc age ttt ttc aga aag gga tgg gag gat tat ett ctg ggt Glu Leu Val Ser Phe Phe Arg Lys Gly Trp Glu Asp Tyr Leu Leu Gly 625 630 635 640 tat tat gaa gaa get gaa tgg tta get get gag tat gtg cct acc ttg Tyr Tyr Glu Glu Ala Glu Trp Leu Ala Ala Glu Tyr Val Pro Thr Leu 645 650 655 gac gag tac ata aa? aat gga ate aca tet ate ggc caa cgt ata ett
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Leu Leu Ser Gly Val Leu lie Met Asp Gly Gin Leu Leu Ser Gin Glu 675 680 685 gca tra gag aaa gta gat cat cca gga aga cgt gtt etc aca gag ctg
Ala Leu Glu Lys Val Asp Tyr Pro Gly Arg Arg Val Leu Thr Glu Leu 690 695 700 aat age etc att tee ege ctg geg gat gac aeg aag aca rat aaa get
Asn Ser Leu lie Ser Arg Leu Ala Asp Asp Thr Lys Thr Tyr Lys Ala 705 710 715 720 gag aag get cgt gga gaa ttg geg tee age att gaa tgt tac atg aaa
Gla Lys Ala Arg Gly Glu Leu Ala Ser Ser He Glu Cys Tyr Met Lys 725 730 735 gac car cct gaa tgc aca gag gaa gag get etc gat cac ate tat age
Asp His Pro Glu Cys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Aap His lie Tyr Ser 740 745 750 a±t ctg gag ccg geg gtg aag gaa ctg aca aiga gag ttt ctg aag cce lie Lea Glu Pro Ala Val Lys Glu Leu Thr Arg Glu Phe Leu Lys Pro
755 760 76S gac ga>c guc cca ttc gee tgc aag aag atg ert ttc gag gag aca aga
Asp Asp Val Pro Phe Ala Cys Lya Lys Met Leu Phe Glu Glu Thr Arg 770 775 780 gtg aeg ax:g gtg ata ttc aag gat gga gat gga ttc ggt gtt tee aaa
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Leu Glu Val Lys Asp His lie Lys Glu Cys Leu lie Glu Pro Leu Pro Θ05 B10 - 815 ctg taatcaaaat agttgcaata ataattgaaa taatctcaac tatgtttcac Leu aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa
<210> 3B <211> 817 <212> PRT <213> Abies grandxs <4〇0> 30 ·
Met Ala Gly Val Ser Ala Val Ser Lys Val Ser Ser Leu Val Cys Asp 15 l〇 15
Leu Ser Ser Thr Ser Gly Leu lie Axg Arg Thr Ala Asn Pro His Pro 20 25 30 -114- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1920 I960 2016 2064 2112 2160 2208 2256 2304 2352 2400 2448 2501 2528 200300171 五《發明説明（111 • 30_
Asti Val Trp Gly Tyr Asp Lsu Val His Ser Leu Lys Ser Pro Tyt lie 35 40 45 Asp Ser Ser Tyx Arg Glu Aarg Ala Glu Val Leu Val Ser Glu lie Lys 50 55 60 Val Met Leu Asn Pro Ala He Thr Gly Asp Gly Glu Ser Me*c He Thr 65 70 *75 BO Pro Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Arg Val Fro Ala He Asp * B5 90 95 Gly Ser Ala Arg Pro Gin Phe Pro Gin Thr Val Asp Trp lie Leu Lys 100 105 110 Asn Gin Leu I*ys Asp Gly Ser Trp Gly lie Gin Ser His Phe Leu Leu 115 120 125 Ser Asp Arg Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Val Leu Val Leu Leu Lys 130 13S · 140 Trp Asn Val Gly Asp Leu Gin Val Glu Gin Gly lie Glu Phe lie Lys 145 150 155 160
Ser Asn Leu Glu Leu Val Lys 155
Glu Thr Asp Gin Asp Ser Leu Val 170 115
Thr Asp Phe Glu 工le lie Phe Pro Ser Leu Leu iUrg Gill Ala Gin Ser 180 185 190 Leu Arg Leu Gly Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Tyr He His Leu Leu Gin 195 200 205 Thr Lys Arg Gin Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser Arg Glu Glu lie Tyr 210 215 220 Ala Val Pro Ser Pro Leu Leu Tyr Ser Leu Glu Gly lie Gin Asp lie 225 230 235 240 Val Glu Trp Glu Arg lie Met Glu Val Gin Ser Gin Asp Gly Ser Phe 245 250 255 Leu Ser Ser Pro Ala Ser Thr Ala Cys Val Phe Met His Thr Gly Asp 2G0 265 270
Ala Lys Cys Leu Glu Phe Leu Asn Ser Val Met lie Lys Phe Gly Asn 275 280 2B5
Phe Val Pro Cys Leu Tyr Pro Val Asp Leu Leu Glu Arg Leu Leu lie 290 295 300 Val Asp Asn 工le Val Arg Leu Gly 工le Tyr Arg Uis Phe Glu Lys Glu 305 310 315 320 lie Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg His Trp Asn Glu Arg Gly 325 ; 330 335 lie Gly Trp Gly Arg I*eu Asn Pro 工le Ala Asp Leu Glu Thr Thr Ala 340 345 350 Leu Gly Phe Arg Leu Leu Arg Leu His Arg Tyr Asn Val Ser Pro Ala 355 360 365
He Phe Asp Asn Phe Lys Asp Ala Asn Gly Lys Phe lie Cys Ser Thr 370 375 380 115-本紙張I尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐〉
(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .訂· :線丨 ·31· 五卜發明説明（m)
Gly Gin Phe Asn Lys Asp Val Ala Ser Met Leu Asn Leu Tyr Arg Ala 3Θ5 390 395 400
Ser Gin Leu Ala Phe Pro Gly Glu Asn He Leu Asp Glu Ala Lys Ser 405 410 , 415
Phe Ala Thr Lya Tyr Leu Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ser Glu Thr Ser 420 425 430
Ser Ala Trp Asn Asn Lys Gin Asn Leu Ser Gin Glu lie Lys Tyr Ala 435 440 445
Leu Lys Thr Ser Trp His Ala Ser Val Pro Arg Val Glu Ala Lys Arg 450 455 460
Tyr Cys Gin Val Tyr Arg Pro Asp Tyr Ala Arg He Ala Lys Cys Val 465 410 475 4Θ0
Tyr Lys Leu Pro Tyr Val Asn Asn Glu Lys Phe Leu Glu Leu Gly Lys 4B5 490 05
Leu Asp Phe Asn lie lie Gin Ser 工le His Gin Glu Glu Met Lys Asxi 500 505 510
Val Thr Ser Trp Phe Arg Asp Ser Gly Leu Pro Leu Phe Thr Phe Ala* 515 520 525
Arg Gla Arg Pro Leu Glu Phe Tyr Phe Leu Val Ala Ala Gly Thr Tyr 530 535 540
Gl*u Pro Gin Tyr Ala Lys Cys Arg Phe Leu Phe Thr Lys Val Ala Cys 545 550 555 560
Leu Gin Thr Val Leu Asp Asp Met Tyr Asp Thr Tyr Gly Thr Leu Asp 565 570 575
Gin Leu Lys Leu Phe Thr Glu Ala Val Arg Arg Trp Asp Leu Ser Phe 580 585 590
Tha: Glu Asix Leu Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Tyr Gin I丄e Tyr Tyr 595 600 605
Asp lie Val His Gla Val Ala Trp Glu Ala Glu Lys Glu Gin Gly Arg 610. . βΧ5 «0
Glu Leu Val Ser Phe Phe Arg Lys Gly Trp Glu Asp Tyr Leu Leu Gly 625 630 635 4 * 640
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Asp Glu Tyr lie X*ys Asn Gly lie Thr Ser lie Gly Gin Arg lie Leu 660 665 670
Leu Leu Ser Gly Val Leu lie Met Asp Gly Gin Leu Leu Ser Gin Glu 675 680 · 685
Ala Leu Glu Lys Val Asp Tyr Fro Gly Arg Arg Val Leu Thr Glo Leu 690 695 700
Ala 720 k
Asn Ser Leu lie Ser Arg Leu Ala Asp Asp Thr Lys Thr Tyr Lys 7〇5 7X0 715
Glu Lys Ala Arg Gly Glu Leu Ala Ser Ser He Glu Cys Tyr Met Lys 725 730 735 -116- 本紙張(尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 B7 -32 _ 五、:發明説明（11)
Asp His Pro Glu Cys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Asp His lie Tyr Ser 740 745 750 lie Leu Glu Pro Ala Val Lys Glu Leu Thr Arg Glu Phe Leu Lys Pro 755 "760 765
Asp Asp Val Pro Phe Ala Cys Lys Lys Met Leu Phe Glu Glu Thr Arg 770 775 780
Val Thr Met Val He Phe Lys Asp Gly Asp Gly Phe Gly Val Ser Lys
785 790* 795 BOO
Leu Glu Val Lys Asp His lie Lys Glu Cys Leu lie Glu Pro Leu Pro Θ05 Θ10 Θ15
Leu . <210> 39 <211> 2525 <212> DNA <213>人工序列 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) <220> <223>人工序列之種類 列 <220> <221> CDS <222> (1).,(2451) <400> 39 電腦產生之具有E-阿伐-甜沒藥烯合成酶編碼之核酸序 atg gcc ggc gtt tct get gta tea aag gtt tcc age ttg gtt tgt gat Met Ala Gly Val Ser Ala Val _ ~ * 一· 48 1 5
Ser Lys Val Ser Ser Leu Val Cys Asp 10 15 ttg teg agt acc age ggc zzg att ega ag-a act gcc aat cct cat ccc 96
Leu Ser Ser Thr Ser Gly Leu He Arg Arg Thr Ala Asn Pro His Pro 20 25 30 144 aat gtc tgg ggt tat gat ett gtg cat tet ett aaa tea cct tar att • Asn Val Trp Gly Tyr Asp Leu Val His Ser Leu Lys Ser Pro Tyr lie 35 40 45 gat tet agt tac aga gaa -ege geg gag gtc ett gtt age gag att aaa 192
Asp Ser Ser Tyr Arg Glu Arg Ala Glu Val Leu Val Ser Glu lie Lys 50 55 60 geg atg ett aat cca get att aca gga gat gga gaa tea atg act act 240
Ala Met Leu Asn Pro Ala He Thr Gly Asp Gly Glu Ser Met lie Thr
65 7Q 75 BO cca tet get tat gac aca gca tgg gta geg agg gtg ccc gcc att gat 28Θ
Pro Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Trp Val· Ala Arg Val Pro Ala lie Asp Θ5 90 95 336 ggc tet get ege ccg caa ttt ccc caa aca gtt gac tgg att ttg aaa Gly Ser Ala Arg Pro Gin Phe Pro Gin Thr Val Asp Trp 工le Leu Lys 100 105 110 aac cag eta aaa gat ggt tea tgg gga att cag tee cac ttt ctg ctg 3B4
Asn Gin Leu Lys Asp Gly Ser Trp Gly lie Gin Ser His Phe Leu Leu 115 120 125 -117- 本紙缉尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X：297公釐） 200300171 五1發明説明（11今 -33 tcc gac cgt ctt ctt gcc act ctt tct tgt gtt ctz gtg etc cct aaa Ser Asp Arg Leu Lea Ala Thr Leu Ser Cys Val Leu Val Leu Leu Lys 130 135 140 432 egg aac gtt ggg gat ctg caa gta gag cag gga att gaa ttc ata aag Trp Asn Val Gly Asp Leu Gin Val Glu Gin Gly lie Glu Phe lie Lys 145 150 155 160 age aat ctg gaa eta gta aag gat gaa acc gat caa gat age ttg gta Ser Asn Leu Glu Leu Val Lys Asp Glu Thr Asp Gin Asp Ser Leu Val 4Θ0 528 165 170 175 aca gac ttt gag ate ata ttt cct tct ctg tta aga gaa get caa tec Thr Asp Phe Glu He lie Phe Pro Ser Leu Leu Arg Glu Ala Gin Ser 100 185 190 576 erg ege etc gga ctt ccc tac gac ctg cct tat ata cat ctg rtg cag Leu Arg Leu Gly Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Tyr lie His Leu Leu Gin 195 200 205 624 J act aaa egg cag gaa aga tta gca aaa ctt tea agg gag gaa att tat Thr Lys Arg Gin Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser Arg Glu Glu lie Tyr I 210 215 220 672 geg gzt ccg teg cca ttg ttg tat tct tta gag gga ata caa gai: ata Ala Val Pro Ser Pro Leu Leu Tyr Ser Leu Glu Gly lie Gin Asp lie 223 230 235 24 0 gtt gaa tgg gaa ega ata atg gaa gtt caa agt cag gat ggg tert ttc Val Glu Trp Glu Arg lie Met GXu Val Gin Ser Gin Asp Gl.y^Ser Phe 245 250 2S5 720 766 tta age tea cct get tct act gcc tgc gtt tre atg cac aca gga gac S16 Leu Ser Ser Pro Ala Ser Thr Ala Cys Val Phe Met His Thr Gly Asp 260 265 270 geg aaa tgc ctt gaa ttc ttg aac agt gtg atg ate aag ttt gga aat 064 Ala Lys Cys Leu Glu Phe Leu Asn Ser Val Met lie Lys Phe Gly Asn 275 2Θ0 2Θ5 ttt get ccc tgc ctg tat cct gtg gat ctg ctg gaa ege ctg ttg ate 912 Phe Val Pro Cys Leu Tyr Pro Val Asp Leu Leu Glu Arg Leu Leu lie 290 295 300 gca gat aat att gta ege ctt gga ate tat aga cac ttt gaa aag gaa 960 Val Asp Asn lie Val Arg Leu Gly lie Tyr Arg His Phe Glu Lys Glu 305 310 315 · 320 ate aag gaa get ctt gat tat gtt tac agg cat tgg aac gaa aga gga 1008 lie Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg His Trp Asn Glu Arg Gly 325 330 335 att ggg tgg ggc aga eta aac ccc ata gca gat ctt gag acc act get 1056 工le Gly Trp Gly Arg Leu Asn Pro lie Ala Asp Leu Glu Thr Thr Ala 340 345 350 ttg gga ttt ega ttg ctt egg ctg cat agg tac aat gta tct cca gcc e 1104 Leu Gly Phe Arg Leu Leu Arg Leu His Arg Tyr Asn Val Ser Pro Ala 355 360 365 att ttt gac aac ttc aaa gat gcc aat ggg aaa ttc att tgc teg acc 1152 工le Phe Asp Asn Phe Lys Asp Ala Asn Gly Lys Phe lie Cys Ser Thr 370 375 380 ggt caa ttc aac aaa gat gta gca age atg ccg aat ctt cat aga get 1200 Gly Gin Phe Asn Lys Asp Val Ala Ser Met Leu Asn Leu Tyr Arg Ala 118.-
(請先閲讀背面之注意事項再 本頁) •訂· 本紙被尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格UlOX297公釐） 200300171 五f發明説明（ll5) -34· 3Θ5 390 395 400 tee cag etc gca ttt ccc gga gaa aac att ett gat gaa get aaa age Ser Gin Leu Ala Phe Pro Gly GIu Asn He Leu Asp Glu Ala Lys Ser 405 410 415 tee get act aaa tac ttg aga gaa get ett gag aaa agt gag acz tee Phe Ala Thr Lys Tyr Leu Arg Glu Ala Leu Glii Lys Ser Glu Thr Ser 420 425 430 agt gca tgg aac aac aaa caa aac ctg age caa gag ate aaa tac geg Ser Ala Trp Asn Asn Lys Gin Asn Leu Ser Gin Glu lie Lys Tyr Ala 435 440 · 445 c*cg aag act tet tgg cat gee agt gtt ccg aga gtg gaa gca aag aga Leu Lys Thr Ser Trp His Ala Ser Val Pro Arg Val Glu Ala Lys Arg 450 455 460 tac tgt caa gtg tat ege cca gat tat gca ege ata gca aaa tgc gtt Tyr Cys Gin Val Tyr Arg Pro Asp Tyr Ala Arg He Ala Lys Cys Val 465 470 475 400 tac aag eta ccc tac gtg aac aat gaa aag ttt tta gag cfcg gga aaa Tyr Lys Leu Pro Tyr Val Asn Asn Glu Lys Phe Leu Glu Lea Gly Lys 485 490 495 1246 1296 1344 1392 1440 ιαββ tta gat ttc aac att aic cag tee ate cac caa gaa gaa atg aag aat 1536 Leu Asp Phe Asn lie 工le Gin Ser lie His Gin Glu Glu Met Lys Asn 500 505 510 gtt acc age tgg ttt aga gat teg ggg ttg cca eta tuc acc ttc get 1584 Val Thr Ser Trp Phe Arg Asp Ser Gly Leu Pro Leu Phe Thr Phe Ala 515 520 525 egg gag agg ccg ctg gaa ttc tac' ttc tta gta geg geg ggg acc tat 1632 Arg Glu Arg Pro Leu Glu Phe Tyr Phe Leu Val Ala Ala Gly Thr Tyr 530 535 540 gaa ccc cag tat gee aaa tgpc 為gg ttc etc ttt aca aaa gt:g gca tgc 16Θ0 Glu Pro Gin Tyr Ala Lys Cys Arg Phe Leu Phe Thr Lys Val Ala Cys 545 550 555 560 ttg cag act gtt ctg gac gat atg tat gac act tat gga acc eta gat Leu Gin Thr Val Leu Asp Asp Met Tyr Asp Thr Tyr Gly Thr Leu Asp 565 570 575 1728 gaa ttg aag eta ttc act gag get gtg aga aga tgg ^ac etc tec ttt Glu Leu Lys Leu Phe Thr Glu Ala Val Arg Arg Trp Asp Leu Ser Phe 580 585 590 aca gaa aac ett cca gac tat atg aaa eta rgt tac caa ate tat tat Thr Glu Asn Leu Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Tyr Gin lie Tyr Tyr 595 600 605 gac ata gtt cac gag gtg get tgg gag gca gag aag gaa cag ggg cgt. Asp 工le Val His Glu Val Ala Trp Glu Ala Glu Lys Glu Gin Gly Arg 610 615 620 1776 1824 1872 gaa ttg gtc age ett ttc Glu Leu Val Ser Phe Phe 625 630 aga aag gga tgg gag gat tat ett ctg ggt Arg Lys Gly Trp Glu Asp Tyr Leu Leu Gly 1920 635 640 tat tat gaa gaa get gaa tgg tta get get gag tat gtg cct acc ttg Tyr Tyr Glu Glu Ala Glu Trp Leu Ala Ala G-lu Tyr Val Pro Thr Leu 645 650 655 196Θ -119-
(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度遍用中國國家標準（CNS) A4規格U10X297公釐） •35- •35-
200300171 五、發明説明（ιιή gac gag tac ata aag aar gga ate aca tet ate ggc caa cgt aca ett
Asp (Slu Tyr lie Lys Asn Gly lie Thr Ser lie Gly Gin Arg lie Leu 660 665 670 ctg ttg agt gga gtg ttg ata atg gar ggg caa etc cct teg caa gag
Leu Leu Ser Gly Vai Leu lie Met: Asp Gly Gin Leu Leu Ser Gin Glu 675 600 685 gca tta gag aaa gta gat tat cca gga aga cgt grt etc aca gag ctg
Ala Leu Glu Lys Val Asp Tyr Pro Gly Arg Arg Val Leu Thr Glu Leu G90 695 700 aat age etc att tee ege ctg geg gat gac aeg aag aca tat aaa get
Asn Ser Leu lie Ser Arg Leu Ala Asp Asp Thr Lys Thr Tyr Lys &la 705 710 715 720 gag aag get cgt gga gaa ttg geg tee age att gaa tgt tac ang aaa
Glu Lys Ala Arg Gly Glu Leu Ala Ser Ser lie Glu Cys Tyr Met Lys 725 730 735 gac cat cct gaa tgt aca -gag gaa gag get etc gat cac ate tat age
Asp His Pro Glu Cys Thz: Glu Glu Glu Leui Asp His lie Tyr Ser 740 745 750 att ctg gag ccg geg gtg aag gaa ctg aca aga gag ttt ctg aag ccc lie Leu Glu Pro Ala Val Lys Glu Leu Thr Arg Glu Phe Leu Lys Pro 755 760 765 gac gac gtc cca ttc gee tgc aag aag atg ett ttc gag gag aca aga
Asp Asp Val Pro Phe AJLa Cys Lys Lys Met Leu Phe Glu Glu Thr Arg 770 7*75 780 gtg aeg atg gtg ata ttc aag gar gga gat gga ttc ggt gtt tee aaa
Val Thr Met Val lie Phe Lys Asp Gly Asp Gly Phe Gly Val Ser Lys 785 790 *7 95 Θ00 tta gaa gxc aaa gat can ate aiaa gag tgn etc att gaa ccg ctg cca
Leu Glu Val Lys Asp His 工le Lys Glu Cys Leu lie Glu Pro Leu Pro 805 810 Θ15 ctg taatcaaaat agttgcaata ataatztgaaa tarcaacnat gtttcacaaa Leu aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa <210> 40 * <211> 817 <212> PRT <213>人工序列 <400> 40
Met Ala Gly Val Ser Ala Val Ser Lys Val Ser Ser Leu Val Cys Asp 15 10 15
Leu Ser Ser Thr Ser Gly Leu lie Arg Arg Thr Ala Asn Pro His Pro 20 25 30
Asn Val Trp Gly Tyr Asp Leu Val His Ser Leu Lys Ser Pro Tyr lie 35 40 45
Asp Ser Sar Tyr Axg Glu Arg Ala Glu Val Leu Val Ser Glu lie Lys 50 55 60
Ala Met Leu Asn Pro Ala lie Thr Gly Asp Gly Glu Ser Met lie Thr 65 70 75 80 -120- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 2016 2064 2112 2160 2208 2256 2304 2352 2400 244B 2501 2525 200300171 五，發明説明（in -36 -
Pro Ser Ala Tyr Asp Thx Ala Trp Val Ala Arg Val Pro Ala lie Asp Θ5 - 一 90 95
Gly Ser Ala Arg Pro Gin Phe Pro Gin Thr Val Asp Trp lie Leu Lys 100 105 no 厶sn Gin Leu Lys Asp Gly Ser Trp Gly 工le Gin Ser His Phe Leu Leu 115 120 · 125 Ser Asp Arg Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Val Leu Val· Leii Leu Lys 130 135 140
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Phe Ala Thr Lys Tyr Leu Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ser Glu Thr Ser 420 425 430 •121-
(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙ίί:尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 -37. A7 五1發明説明（us
Ser Ala Trp Asn Asn Lys Gin Asn Leu Ser Gin Glu lie Tyr Ala 435 440 445
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Asp Asp Val Pro Phe Ala Cys Lys Lys Met Leu Phe Glu Glu Thr Arg 770 775 780 122- 本紙d尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐）
(請先閲讀背面之注意事項 本頁) .訂· 200300171 五}發明説明（ll9 ) .38-
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Phe Ala Thr Lys Tyr Leu Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ser Glu Thr Ser -124- 本紙張k度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 576 624 672 720 768 81β 864 912 960 100Θ 1056 1104 1152 1200 1248 129€ 200300171 • 40- 420 425 430 agt gea tgg 这ac aaic aaa caa aac ctg age caa gag ate aaa tac gcg Ser Ala Trp Asn Asn Lys Gin Asn Leu Ser Gin Glu lie Lys Tyr Ala 435 440 445 ctg aag act tet egg cat gcc agt gtt ccg aga gtg gaa gca aag aga Leu Lys Thr Ser Trp fiis Ala Ser Val Pro Arg Val Glu Ala Lya Arg 450 455 460 tac tgt caa gtg tat ege cca gat tat gca ege ata gca aaa tgc gtt Tyr Cys Gin Val Tyr Arg Pro Asp Tyr Ala Arg He Ala Lys Cys Val 465 470 475 4S0 tac aag eta ccc tac gtg aac aat gaa aag ttt tta gag ctg gga aaa Tyr Lys Leu Pro Tyr Val Asn Asn Glu Lys Phe Lee Glu Leu Gly Lys 485 490 495 tta gat rtc aac att ate cag tee ate cac caa gaa gaa atg aag aat Leu Asp Phe Asn He 工le Gin ·Ser lie His Gin Glu Glu Met Lys Asn 1344 1392 1440
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:線丨 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) -訂 200300171 五7發明説明（l22 I gca tta gag aaa gta gat tat cca gga aga cgt gtt etc aca gag ctg I Ala Leu Glu Lys Val Asp Tyr Pro Gly Arg Arg Val Leu Thr Glu Leu # 690 695 700 2112 aat age etc att tee ege ctg geg gat gac aeg aag aca tat aaa get 2160 Asn Ser Leu lie Ser Arg Leu Ala Asp Asp Thr Lys Thr Tyr Lys Ala 705 710 715 720 gag aag get cgt gga gaa ttg geg zee age att gaa tgt tac atg aaa 2208 Glu Lys Ala Arg Gly Glu Leu Ala Ser Ser lie Glu Cys Tyr Met Lys • 725 730 735 gac cat cct gaa tgt aca gag gaa gag get etc gat cac ate tat age 2256 Asp His Pro Glu Cys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Asp Hi3 lie Tyr Ser 740 745 750 atn ctg gag ccg geg gtg aag gaa ctg aca aga gag ttt ctg a总g ccc lie Leu Glu Pro Ala Val Lys Glu Leu Thr Arg Glu Phe Leti Lys Pro 755 7S0 765 gac gac g^c cca ttc gee tgc aag aag atg ett ttc gag gag aca aga Asp Asp Val Pro Phe Ala 2304 2352 770
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Gly Ser Ala Arg Pro Gin Phe Pro Gin Thr Val Asp Trp lie Leu Lys 100 105 ’ no Asn Gin Leu Lys Asp Gly Ser Trp Gly lie Gin Ser His Phe Leu Leu -126- 本紙張I尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐）
(請先閲讀背面之注意事項本頁) 訂丨
200300171 五'^發明説明（l23 •42 125 j Ser Asp Arg Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Val Leu Val Leu Leu Lys j 130 135 140 j Trp Asn Val Gly Asp Leu Gin Val 61u Gin Gly lie Glu Phe lie Lys I 145 150 155 160 • Thr Asn Leu Glu Leu Val Lys Asp Glu Thr Asp Gin Asp Ser Leu Val J 165 170 1*75
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Leu Gly Phe Arg Leu Leu Arg Leu His Arg Tyr Asn Val Ser Pro Ala 355 360 365 lie Phe Asp Asn Phe Lys Asp Ala Asn Gly Lys Phe 工le Cys Ser Thr 370 375 - 380
Gly Gin Phe Asn Lys Asp Val Ala Ser Met Leu Asn Leu Tyr Arg Ala 385 390 395 400
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:線丨 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 120 115 -訂！ · -43 200300171 五^發明説明（l24 4 65 470 475 480 I Tyr Lys Leu Pro Tyr Val Asn Asn Glu Lys Phe Leu Glu Leu Gly Lys 4Θ5 490 495
Leu Asp Pile Asn lie lie Gin Ser lie His Gin Glu Glu Met Lys Asn 500 505 510
Val Thr Ser Trp Phe Arg Asp Ser Gly Leu P*ro Lea Phe Thr Phe Ala 515 520 525
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Glu Pro Gin Tyr Ala Lya Cys Arg Phe Leu Phe Thr Lys Val Ala Cys 545 550 555 560
Leu Gin Thr Val Leu Asp Asp Met Tyr Asp Thr .Tyr Gly Thr Leu Asp 565 570 575
Glu Leu Lys Leu Phe Thr Glu Ala Val Arg Arg Trp Asp Leu Ser Phe I 5Θ0 585 590 ! Thr Glu Asn Leu Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Tyr Gin He Tyr Tyr 595 600 605
Asp He Val His Glu Val Ala Trp Glu Ala Glu Lys Glu Gin Gly Arg 610 615 620
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Asp His Pro Glu Cys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Asp His lie Tyr Ser 740 745 750 lie Leu Glu Pro Ala Val Lys Glu Leu Thr Arg Glu Phe Leu Lys Pro 755 7 60 765
Asp Asp Val Pro Phe Ala Cys Lys Lys Met Leu Phe Glu Glu Thr Arg 770 775 780
Val Thr Met Val lie Phe Lys Asp Gly Asp Gly Phe Gly Val Ser Lys 785 790 195 0〇〇
Leu Glu Val Lys Asp flis lie Lys Glu Cys Leu He Glu Pro Leu Pro Θ05 B10 B15
Lqu 128. 本紙張k度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 五？發明説明（125 44- <210> 43 <211> 1885 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之種類·•電腦產生之具有δ芹子烯合成酶編碼之核酸序列 <220> <221> CDS <222> (21)..(1763) j <400> 43 _ cggatccggt ttcgcgatcc atg get gag att tea gaa tet tee ate cct ega 53 Met Ala Glu lie Ser· Glu Ser Ser lie Pro Arg 1 5 10 ege aca ggg aat cat cac gga aat gtg tgg gac gat gac etc at a cac 101 Arg Thr Gly Asn Ris His Gly Asn Val Trp Asp Asp Asp Leu lie His 15 20 25 ret etc aac teg ccc ttt ggg gca cct gca tat tat gag etc ett caa 149 Ser Leu Asn Ser Pro Phe Gly Ala Pro Ala Tyr Tyr Glu Leu Leu Gin 30 35 40 aag ett att cag gag Lys Leu lie Gin Glu 45 arc aag cat eta ett ttg act gaa atg gaa atg 工le Lys His Leu Leu Leu Thr Glu Met Glu Met 50 55 197 gat gat: ggc gat. cat gat tta ate aaa cgt ctt. cag ate get gac act Asp Asp Gly Asp His Asp Leu lie Lys Arg Leu Gin lie Val Asp Thr 60 65 70 Ί5 245 ttg gaa tgc ctg gga ate gat aga cat ttt gaa cac gaa ata caa aca 293 Leu (Slu Cys I*eii Gly lie Asp Arg His Phe Glu His Glix lie Gin Thr 60 85 90
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(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 45-200300171 五？發明説明（ 126 .gcc aag gca ttc aca aga gaa tat eta aac caa gtt tta get gga cac 629 Ala Lys Ala Phe Thr Arg Glu Tyr Leu Asn Gin Val Leu Ala Gly His 190 195 200 ggg gar gtg act gac gtg gal： caa 这gc ett ttg aga gag gtg aag tac 677 Gly Asp Val Thr Asp Val Asp Gin Ser Leu Leu Arg Glu Val Lys Tyr 205 210 215 gca ttg gag ttt cca tgg cat tgc agt gtg ceg aga tgg gag gca agg 725 Ala Leu Glu Phe Pro Trp His Cys Ser Val Pro Arg Trp Glu Ala Arg 220 225 230 235 age ttt etc gaa at a tat gga cac aac car teg tgg etc aag teg aat 773 Ser Phe Leu Glu He Tyr Gly His Asn His Ser Trp Leu Lys Ser Asn 240 245 250 ate aac caa aaa atg ttg aag tta gee aaa ttg gac ttc aat act ctg 821 He Asn Gin Lys Met Leu Lys Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn He Leu 255 260 265 • · caa tgc aaa cat ede aag gag ata cag ttt aitt aca agg egg tgg aga 869 Gin Cys Lys His His Lys Glu He Gin Phe He Thr Arg Trp Trp Arg 270 275 280
I gac teg ggt ata teg cag ctg aat ttc tat ega aag ega cac gtg gaa 317 Asp Ser Gly lie Ser Gin Leu Asn Phe Tyr Arg Lys Arg His Val Glu 205 290 2B5 tat tat tet tgg gtt gtt atg tgc att tzt gag cca gag ttc tet gaa 965 Tyr Tyr Ser Trp Val Val Met Cys He Phe Glu Fro Glu Phe Ser Glu 300 305 310 315 agt aga att gcc rtc gcc aaa act get ate ctg tgt act gtt eta gat 1013 Ser Arg lie Ala Phe Ala Lys Thr Ala lie Leu Cys Thr Val Lbu Asp 320 325 330 gac etc tat gat aeg cac gca aca ttg cat gaa ate aaa ate atg aca 1061· Asp Leu Tyr Asp Thr His Ala Thf Leu His Glu lie Lys lie Met Thr 335 340 345 gag gga gtg aga ega tgg gat ett teg ttg aca gat gac etc cca gac 1109 Glu Gly Val Arg Arg Trp Asp Leu Ser Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp 350 355 360 tac act aaa att gca ttc cag ttc etc ttc aat aca gtg aat gaa ttg 1157 Tyr lie Lys lie Ala Phe Gin Phe Phe Phe Asn Thr Val Asn Glu Leu 365 370 375 ata gtt gaa ate gtg aaa egg caa ggg egg gat atg aca acc ata gtt 1205 lie Val Glu He Val Lys Arg Gin Gly Arg Asp Met Thr Thr He Val 380 385 390 395 .ij aaa gat tgc tgg aag ega tac att gag tet tat ctg caa gaa geg gaa Lys Asp Cys Trp Lys Arg Tyr lie Glu Ser Tyr Leu Gin Glu Ala Glu 400 405 410 1253 tgg ata gca act gga cat att ccc act ttt aac gaa cac ata aag aac Trp Xle Ala Thr Gly His lie Pro Thr Fhe Asn Glu Tyr He Lys Asn 415 420 425 1301 ggc atg gcc age tea ggg atg tgt att eta aat ttg aat cca ett etc 1349 Gly Met Ala Ser Ser Gly Met Cys He Leu Asn Leu Asn Pro Lea Leu 430 435 440 ttg ttg gat aaa ett etc ccc gac aac att ctg gag caa ata cat tet 1397 Leu Leu Asp Lys Leu Leu Pro Asp Asn lie Leu Glu Gin lie His Ser 130- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1445 -46- 200300171 五 發明說明（127 445
4SO 455 cca tcc aag ate ctg gac etc tta gaa ttg aeg ggc aga ate gee gat Pro Ser Lys lie Leu Asp Leu Leu Glu Leu Thr Gly Arg He Ala Asp 460 465 410 <Π5 gac tta aaa gat ttc gag gac gag aag gaa ege ggg gag atg get tea 14 93
Asp Leu Lys Asp Phe Glu Asp Glu Lys Glu Arg Gly Glu Met Ala Ser 480 485 490 tet tta cag tgt tat atg aaa gaa aat cct gaa tet aca gtg gaa aat 1541
Ser Leu Gin Cys Tyr Met Lys Glu Asn Pro Glu Ser Thr Val Glu Asn 495 500 505 get rta aat cac ata aaa ggc ate ett aat c^t tec ert gag gaa ttt 1589
Ala Leu Asn His lie Lys Gly lie Asn Arg Ser Leu Glu Glu Ph.e 510 515 520 1637 aa*t tgg gag ttt atg aag cag gat agt gtc cca atg tgt tgc aag aaa Asn Trp Glu Phe Met Lys Gin Asp Ser Val Pro Met Cys Cys Lys Lys 525 530 535 I ttc act ttc aat ata ggt ega gga ett caa ttc ate tac aaa tac aga 16Θ5
Phe Thr Phe Asn lie Gly Arg Gly Leu Gin Phe lie Tyr Lys Tyr Arg 540 545 550 555 gac ggc tta tac att tet gac aag gaa gta aag gac cag ata ttc aaa 1733
Asp Gly Leu Tyr lie Ser Asp Lys Glu Val Lys Asp Gin lie Phe Lys 560 565 570 att eta gtc cac caa gtt cca atg gag gaa tagtgatggt cttggttgta 1783 lie Leu Val Biis Gin Val Pro Met Glu Glu 575 580 gttgtctatt atggtatatt gcattgacat ttatgcttaa aggtgtttct taaacgttta 1843 gggcgrgaccg ttaaataagt tggcaataar taatateteg ag 1885 <210> 44 <211> 581 <212> PRT <213> X工序列 <400> 44
Met Ala Glu lie Ser Glu Ser Ser He Pro Arg Arg Thr Gly Asn His 15 10 15
His Gly Asn Val Trp Asp Asp Asp Leu He His Ser Leu Asn Ser Pro 20 25 30
Phe Gly Ala Pro Ala Tyr Tyr Glu Leu Leu Gin Lys Leu lie Gin Glu 35 40 45 lie Lys His Leu Leu Leu Thr Glu Met Glu Met Asp Asp Gly Asp His 50 55 60
Asp Leu 工le Lys Arg Leu Gin lie Val Asp Thr Le*u Glu Cys Leu Gly 65 70 75 Θ0 lie Asp Arg His Phe Glu His Glu lie Gin Thr Ala Ala Leu Asp Tyr 85 90 95
Val Tyr Arg Trp Trp Asn Glu Lys Gly He Gly Glu Gly Ser Arg Asp 100 105 110 •131- 本紙Θ尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（2〗〇X297公釐） 200300171 -47- 五Ί發明説明（128
Ser Phe Ser Lys A.sp Leu Asn Ala Thr Ala Leu Gly Phe Arg Ala Leu 115 120 125
Arg Leu His Arg Tyr Asn Val Ser Ser Gly Val Leu Lys Asn Phe Lys I 130 135 140 .Asp Glu Asn Gly Lys Phe Phe Cys Asn Phe Thr Gly Glu Glu Gly Arg ·. 145 150 155 160 .Gly Asp Lys Gin Val Arg Ser Met Leu Ser Leu Leu Arg Ala Ser Glu j 165 1*70 115 .lie Ser Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu GJLu Ala Lys Ala Phe Thr I 180 105 190
Arg Glu Tyr Leu Asn Gin Val Leu Ala Gly His Gly Asp Val Thi： Asp ; 195 200 205 I ‘ i Val Asp Gin Ser Leu Leu Arg Glu Val Lys Tyr Ala Lea Glu Phe Pro j 210 215 220
Trp His Cys Ser Val Pro Arg Trp Glu Ala Arg Ser Phe Leu Glu lie 225 230 235 240
Tyr Gly His Asn tils Ser Trp Leu Lys Ser Asn lie Asn Gin Lys Met 245 250 # 255 j Leu Lys Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn lie Leu Gin Cys Lys His His j 260. 265 270
Lys Glu 工le Gin Phe lie Thr Arg Trp Trp Arg Asp Ser Gly lie Ser j 275 200 285
Gin Leu Asn Phe Tyr Arg Lys Arg His Val Glu Tyr Tyr Ser Trp Val 290 295 300
Val Met Cys lie Phe· Glia Pro Glu Phe Ser Glu Ser Arg lie Ala Phe 305 310 315 320
Ala Lys Thr Ala lie Leu Cys Thr Val Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr 325 330 335
His Ala Thr Leu His Glia He Lys lie Met Thr Glu Gly Val Arg Arg 340 345 350
Asp Leu Ser Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp Tyr lie Lys lie Ala 355 360 · 365 ^
Phe Gin Phe Phe Phe Asa Thr Val Asn Glu Leu lie Val Glu He Val 370 375 380
Lys Arg Gin Gly Arg Asp Met Thr Thr He Val Lys Asp Cys Trp Lys 385 390 395 400
Arg Tyr lie Glu Ser Tyr Leu Gin Glu Ala Glu Trp lie Ala Thx Gly 405 410 415
His lie Pro Thr Phe Asn Glu Tyr lie Lys Asn Gly Met Ala Ser Ser 420 425 430
Gly Met Cys lie Asn Leu Asn Pro I»eu Leu Leu I*eu Asp Lys Leu 435 440 445
Lea Pro Asp Asn lie Leu Glu Gin He His Ser Pro Ser Lys lie Leu 450 455 460 -132- 本紙張k度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱） ,48.200300171 五 發明説明（l29 A5P Leu Leu Glu Leu Thr Gly Arg He Ala Asp Asp Lea Lys Asp Phe 4^5 470 475 4Θ0 Glu Asp Glu Lys Glu Arg Gly Glu Met Ala Ser Ser Leu Gin Cys Tyr 465 490 495 Met Lys Glu Asn Pro Giu Ser Thr Val Glu Asn Ala Leu Asn His lie 500 505 510 Lys Gly He Leu Asn Arg Ser Leu Glu Glu Phe Asn Trp Glu Phe Met 515 520 525 j Lys Gin Asp Ser Val Pro Met Cys Cys Lys Lys Phe Thr Phe Asn lie 530 535 540
Gly Arg Gly Leu Gin Phe lie Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Leu Tyr lie 545 550 555 560 Ser Asp Lys Glu Val Lys Asp Gin 工le Phe Lys lie Leu Val His Gin 565 570 575 Val Pro Met Glu Glu 580 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本貧) ,<210> 45 ! <211> 18B5 I <212> Dm • <213>人工序列 I <220> <223>人工序列之種類：電腦產生之具有5芹子烯合成酶編碼之核酸序列 <22 0> <221> CDS <222> (24) "(1766) · <40〇> 4S cggatctggt tccgcgtgga ccc atg get gag att tet gaa tet tec ate cct 53 Met Ala Glu He Ser Glu Ser Ser He Pro 1 5 10 ega ege aca ggg aat cat cac gga aar gtg tgg gac gat gac etc ata Gly Asn His His Gly Asn Val Trp Asp Asp Asp Leu lie
Arg Arg Thr 15 20 25 101 cac tet etc aac teg ccc tat ggg gca cct gca tat tat gag ozc ett 149
His Ser Leu Asn Ser Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Tyr Tyr Glu Leu Leu 30 35 40 caa aag ett att cag gag ate aag cat tta ett ttg act gaa atg gaa 19*7
Gin Lys Leu lie Gin Glu lie Lys His Leu Leu Leu Thr Glu Met Glu 45 * 50 55 atg «gat gat ggc gat cat gat tta ate aaa cgt ett cag ate gtt gac 245
Met Asp Asp Gly Asp His Asp Leu He Lys Arg Len Gin He Val Asp 60 65 70 act ttg gaa tgc ctg gga ate gat aga cat ttt gaa cac gaa ata caa 293
Thx Leu Glu Cys Leu Gly lie Asp Arg His Phe Glu His Glu lie Gin 75 80 65 90 aca get gtt tta gat tac gtt tac aga tgg rgg aac gaa aaa ggt ate 341
Thr Ala Val Leu Asp Tyr Val Tyr Arg Trp Trp Asn Glu Lys Gly He -133- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐) 105200300171 A7 B7 五f發明説明（l3〇 49- 95 100 ggg gag gga tea aga gat: tee ttc age aaa gat ccg aac get aeg get Glv Glu Glv Ser Arg Asp Ser Phe Ser Lys Asp Leu Asn Ala Thr Ala y 1X0 115 120 w一 w___ege ——-. . - - —— Leu Gly Phe Arg Ala Leu Arg Leu His Arg Tyr Asn Val Ser Ser Gly 125 130 135 gtg trg aag aac ttc aag gat gaa aac ggg aag ttc ttc tgc aac ttx Val Leu Lys Asn Phe Lys Asp Glu Asn Gly Lys Phe Phe Cys Asn Phe 140 145 ISO act ggt gaa gaa gga aga gga gat aaa caa gxg aga age atg ttg teg Thr Gly Glu Glu Gly Arg Gly Asp Lys Gin Val Arg Ser Met Leu Ser 155 160 165 170 tta ett ega get tea gagr att teg ttt ccc gga gaa aas gtg atg gaa Leu Leu Arg Ala Ser Glu lie Ser Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glia 175 1Θ0 185 gag gee aag gca ttc aca aga gaa tat eta aac caa gtt tta get gga Glu Ala Lys Ala Phe Thr Arg Glu Tyr Leu Asn Gin Val Leu Ala Gly 190 195 200 .· ： · ' cac grgg gat gtg act gac g*cg gat caa age ett ttg aga gag gtg aag His Gly Asp Val Thr Asp Val Asp Gin Ser Leu Leu Arg Glu Val Lys 205 210 215 tac gca teg gag ttc cca rgg cat rgc agt gtg ccg aga tgg gag gca Tyr Ala Leu Glu Phe Pro Trp His Cys Ser Val Pro Arg Trp Glu Ala 220 225 230 agg age ttt etc gaa ara tat gga cac aac cat teg tgg etc aag teg Arg Ser Phe Leu Giu 工le Tyr Gly His Asn His Ser Trp Leu .Lys Ser 235 240 245 250 aat ate aac caa aaa atg ttg aag tta gee aa.a ttg gac tre aat att Asn lie Asn Gin Lys Met Leu Lys Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn lie 255 260 255 ctg caa tgc aaa car cac aag gag ata cag trt art aca agg tgg Leu Gin Cys Lys His His Lys Glu lie Gin Phe lie Thr Arg Trp Trp 270 275 280 aga gac teg ggt ata zcg cag ctg aac ttc tat ega aag ega cac gtg Arg Asp Ser Gly He Ser Gin Leu Asn Phe Tyr Arg Lys Arg His Val 2BS 290 295 gaa tat tat tet tgg gtt gtt atg tgc att ttt gag cca gag ttc tet Glu Tyr Tyr Ser Trp Val Val Met Cys lie Phe Glu Pro Glu Phe Ser 300 305 310 3Θ9 437 485 533 5B1. 629 677 725 *773 B21 869 917 965 ---------7,»·-------裝：：· (請先閲讀背面之注意事項再本頁) ,訂丨
gaa agt aga att gee ttc Glu Ser Arg lie Ala Phe 315 320 gat gac etc tat gat Asp Asp Leu Tyr Asp 335 jee aaa act get ate ptg tgt act gtt eta \la Lys Thr Aia lie Leu Cys Thr Val Leu 325 330 cac gca aca ttg cat gaa ate aaa ate atg His Ala Thr Leu His Glu lie Lys lie Met 340 345 1013 1061 aca gag gga gzg aga ega tgg gat ett teg ttg aca gat gac etc cca Thr Glu Gly Val Arg Arg Trp Asp Leu Ser ku Thr Asp Asp Leu Pro 350 355 360 -134- 本紙一尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1109 200300171 五7發明説明（m -50- gac tac att aaa att gca ttc cag ttc ttc ttc aat aca gta aat: gaa Asp Tyr lie Lys lie Ala Phe Gin Phe Phe Phe Asn Thr Val Asn Glu 365 310 375 1157 ttg aca gtt gaa ate gtg aaa egg caa ggg egg gat atg aca acc aca 1205 Leu lie Val Glu lie Val Lys Arg Gin Gly Arg Asp Met Thr Thr lie 380 385 390 gtt: aaa. gat tgc tog aag ega tac att gag tet tat ctg caa gaa geg Val Lys Asp Cys Trp Lys Arg Tyr He Glu Ser Tyr Leu Gin Gla Ala 395 _ 400 405 410 gaa rgg ata gca act gga cat att ccc act ttt aac gaa tac ata aag Glu Trp lie ila Thr Gly His lie Pro Thr Phe Asn Glu Tyr lie Lys 415 420 425 aac ggc atg get age tea ggg atg tgt att eta aat ttg aat cca ett Asn Gly Met Ala Ser Ser Gly Met Cys lie Leu Asn Leu Asn Pro Leu 430 435 440 etc ttg ttg gat aaa ett etc ccc gac aac att ctg gag caa ata cat Leu Leu Leu Asp Lya Leu Leu Pro Asp Asii lie Leu Glu Gin lie His 445 450 455 tet: cca tcc aag ate ctg gac etc tta gaa ttg aeg ggc aga ate gee Ser Pro Ser Lys lie Leu Asp Leu Lea Glu Leu Thr Gly Arg lie Ala 4 60 465 470 1253 1301 1349 1397 1445 gat gac eta aaa Asp Asp Leu Lys 475 gat Asp ttc gag gac gag aag gaa ege ggg gag atg get Phe Glu Asp Glu Lys (3lu Arg Gly Glu Met Ala 480 485 490 1493 tea tet tta cag rgt tat atg aaa gaa aat cct gaa tet *aca gtg gaa Ser Ser Leu Gin Cys Tyr Met Lys Glu Asn Pxo Glu Ser Thr Val Glu 495 500 505 1541 aat get tta aat cac ata aaa ggc ate cti aat cgt tec ett gag gaa 15B9 Asn Ala Leu Asn ilis lie Lys Gly lie Leu Aan Arg Ser Leu Glu Glu 510 515 520 '· ttt aat tgg gag ttt atg aag cag gat agt gee Phe Asn Trp Glu Phe Met Lys Gin Asp Ser Val 525 530 aaa ttc act ttc aat ata ggt ega gga ett caa Lys Phe Thr Phe Asn lie Gly Arg Gly Leu Gin 540 545 aga gac ggc tta tac att tet gac aag gaa gta Arg Asp Gly Leu Tyr lie Ser Asp Lys Glu Val 555 560 565 aaa att eta gre cac caa gtt cca atg gag gaa Lys 工le Leu Val His Gin Val Pro Met Glu Glu 575 580 gttgtctatt atggtatatt gcattgacat ttatgcttaa gggcggaccg ttaaataagg caataattaa tatcacgag <210> 46 <211> 5S1 <212> PRT______ . <213>人工序列 cca*atg tgt zgc aag 1637 Pro Met Cys Cys Lys 535 ttc ate tac aaa tac 1685 Phe lie Tyr Lys Tyr 550 aag gac cag ata rtc 1733 Lys Asp Gin He Phe 570 tagtgatggt crtggrtgta 1786 aggtgtttct taaacgttta 1846 1Θ85 -135,本紙張I尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐）
:線丨 .................:裝：； (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) •.......訂......... 200300171 五 發明説明（l32 ) -51- <400> 46 Met Ala Glu lie Ser Glu Ser Ser lie Pro Arg Arg Thr Gly Asn His 1 5 10 15 His Gly Asn Val Trp Asp Asp Asp Leu lie His Ser Leu Asn Ser Pro 20 25 3〇 Tyr Gly Ala Pro Ala Tyr Tyr Glu Leu Leu Gin Lys Leu lie Gin Glu 35 40 45 lie Lys His Leu Leu Leu Thr Glu Met Glu Met Asp Asp Gly Asp His 50 55 60 Asp Leu lie Lys Arg Leu Gin lie Val Thr l»eu Glu Cys Le*u Gly 65 70 75 80 lie Asp Arg His Phe Glu His Gla lie Gin Thr Ala Val Leu Asp Tyr 85 90 95 Val Tyr Arg Trp Trp Asn Glu Lys Gly 工le Gly Glu Gly Ser Arg Asp 100 . 105 110 Ser Phe Ser Lys Asp Leu Asn Ala Thr Ala Leu Gly Phe Arg 7U.a Leu 115 120 125 Arg Leu His Arg Tyr Asn Val Ser Ser Gly Val Leu Lys Asn Phe Lys 130 135 140 Asp Glu Asn Gly Lys Phe Phe Cys Asn Fhe Thr Gly Glu Glu Gly Arg 145 150 · 155 160 Gly Asp Lys Gin Val Arg Ser Met Leu Ser Lea Leu Arg Ala Ser Glu 165 170 175 lie Ser JPhe Pro Gly Glu ：Lys Val Met Glu Glu Ala Lys Ala Phe Thr 180 185 190 Arg Glu Tyr Leu Asn Gin Val Leu Ala Gly His Gly Asp Val Thr Asp X95 200 205 Val Asp Gin Ser Leu Leu Arg Glu Val Lys Tyr Ala Leu Gl\i Phe Pro 210 2X5 220 Trp His Cys Ser Val Pro Arg Trp Glu Ala Arg Ser Phe Leu Glu lie 225 230 2*35 240
Tyr Gly His Asn His Ser Trp Leu Lys Ser Asn 11¾ Asn Gin Lys Met 245 250 255 Leu Lys Leu Ala Lys Leu Asp Phe Aan He Leu Gin Cys Lys His His 260 265 270 Lys Glu lie Gin Phe lie Thr Arg Trp Trp Arg Asp Ser Gly lie Ser 275 280 2Θ5 Gin Leu Asn Phe Tyr Arg Lys Arg His Val Glu Tyr Tyr Ser Trp Val 290 295 300 Val Met Cys lie Phe Glu Pro Glu Phe Ser Glu Ser Arg ILe Ala Phe 305 310 315 320 Ala Lys Thr Ala He leu Cys Thr Val Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr 325 330 335 His Ala Thr Leu His Glu lie Lys He Met Thr Glu Gly Val Arg Arg 340 345 350 136·本紙fij尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公楚）
(請先閲讀背面之注意事項本頁)
•訂丨
200300171 五、發明説明（l33 •52-
Trp Asp Leu Ser Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp Tyr lie Lys lie Ala 355 360 365 Phe Gin Phe Phe Phe Asn Thr Val Asn Glu L*eu lie Val Glu lie Val 370 375 380 Lys Arg Gin Gly Arg Asp Met Thr Thr lie Val Lys Asp Cys Trp Lys 385 390 395 400 Arg Tyr 工le Glu· Ser Tyr Leu Gin Glu Ala Glu Trp lie Ala Thr Gly 405 410 415 His lie Pro Thr Phe Asn Glia Tyr lie Lys Asn Gly Met Ala Sar Ser 420 425 430 Gly Met Cys He Leu Asn Leu Asn Pro Leu Leu Leu Leu Asp Lys Leu 435 440 4^5 Leu Pro Asp Asn lie Leu Glu Gin lie His Ser Pro Ser Lys lie Leu 450 455 460 Asp Leu Leu Glu Leu Thr Gly Arg 工le Ala Asp Asp Leu Lys Asp Phe 465 4*70 475 4Θ0 Glu Asp Glu Lys Glu Arg Gly Glu Met Ala Ser Ser Leu Gin Cys Tyr 4Θ5 490 495 Met Lys Glu Asn Pro Glu Ser Thr Val Glu Asn Ala Leu Asn His lie 500 505 ·. 510 Lys Gly He Leu Asn Arg Ser Leu GXu Glu Phe Asn Trp Glu Phe Met 515 520 525 Lys Gin Asp Ser Val Pro Mer Cys Cys Lya Lys Phe Thr Phe Asn lie 530 535 540 Gly Arg Gly Leu Gin Phe lie Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Leu Tyx lie 545 550 555 560 Ser Asp Lys Glu Val Lys Asp Gin 工le Phe Lys lie Leu Val His Gin SS5 570 575 Val Pro Met Glu Glu 580 <210> 47 <211> 1885 <212> DMA <213：>人工序列 <220> <223>人工序列之種類：電腦產生之具有δ芹子烯合成酶編碼之核酸序列 <220> <221> CDS <22Z> (24)..(1763) <400> 47 ^ cggatctggt cccgcgtgga tcc atg get gag ate tet gaa tcc ate ect ega 53 Met Ala Glu He Ser Glu Ser lie Pro Arg 1 5 l〇 本紙張 -137« 义度適用中國國家標準（GNS) A4規格（210X297公釐）
(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 :線丨 .53- αοι 149 200300171 五1發明説明（l34 cgc aca ggg aac cat cac gga aat gtg tgg gac gat gac etc ata cac Arg Thr Gly Asn His His Gly Asn Val Trp Asp Asp Asp Leu 工le His 15 20 25 tet etc aac teg ccc tat ggg gca cct gca tat tat gag etc ett caa Ser Leu Asn Ser Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Tyr Tyr Glu Leu Leu Gin 30 35 40 aag ett att cag gag ate aag cat tta ett ttg act gaa atg gaa atg 197
Lys Leu lie Gin Glu lie Lys His Leu Leu Leu Thr Glu Net Glu Met 45 50 55 gat gat ggc gat cat gat tta ate aaa cgt etT： cag ate gtt: gac act 245
Asp Asp Gly Asp His Asp Leu lie Lys Arg Leu Gin lie Val Asp Thr 60 65 70 ：ttg gaa tgc ctg gga ate gat aga cat ttt gaa cac gaa ata caa aca 293 I Leu Glu Cys Leu Gly lie Asp Arg His Phe Glu His Glu lie Gin Thr ；75 Θ0 85 90 ί get get tta gat tac gtt tac aga tgg tgg aac gaa aaa ggt ate ggg 341
Ala Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg Trp Trp Asn Glu Lys Gly lie Gly 95 100 X05 gag gga tea aga gat tee ttc age aaa gat ctg aac get aeg get tta 369
Gla Gly Ser Arg Asp Ser Phe Ser Lys Asp Leu Asri Ala Thr Ala Leu 110 115 120 gga ttt cgc get etc ega ctg cat ega cat aac gta teg tea ggt gtg 437
Gly Phe Arg Ala Leu Arg Leu flis Arg Tyr Asn Val Ser Ser Gly Val 125 130 135 ttg aag aac ttc aag gat gaa aac ggg aag ttc ttc tgc aac ttt act 485
Leu Lys Asn Phe Lys Asp Glu Asn Gly Lys Phe Phe Cys Asn Plie Thr 140 145 150 ggt gaa gaa gga aga gga gat aaa caa gtg aga age atg ttg teg tta 533
Gly Glu Glu Gly Arg Gly Asp Lys Gin Val Arg Ser Met Leu Ser Leu 155 160 165 170 ett ega gee tea gag att teg ttt ccc gga gaa aaa gtg atg gaa gag 5Θ1
Leu Arg Ala Ser Glu lie Ser Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu 175 180 185 gee aag gca ttc aca aga gaa tar eta aac caa gtt tta get gga cac 629 ^la Lys Ala Phe Thx Arg Glu Tyr Leu Asn Gin Val Leu Ala Gly His 190 195 - 200 ggg gat gtg act gac gtg gat caa age ett ttg aga gag gtg aag tac 677
Gly Asp Val Thr Asp Val Asp Gin Ser Leu Leu Arg Glu Val Lys Tyr 205 210 215 gca ttg gag ttt cca tgg cat tgc agt gtg ccg aga tgg gag gca agg 725
Ala Leu Glu Phe Pro Trp His Cys Ser Val Pro Arg Trp Glu Ala Arg 220 _ 225 230 age ttt etc gaa ata tat gga cac aac cat teg tgg etc aag teg aat 773
Ser Phe Leu Glu lie Tyr Gly His Asn His Ser Trp Leu Lys Ser Asri 235 240 24 5 250 ate aac caa aaa atg ttg aag tta gee aaa ttg gac ttc aat att ctg Θ21 lie Asn Gin Lys Met Leu Lys Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn He Leu 255 260 265 caa tgc aaa cat cac aag gag ata cag ttt att aca agg tgg tgg aga 869
Gin Cys Lys His His Lys Glu lie Gin Phe He Thr Arg Trp Trp Arg • -138 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐）
(請先閲讀背面之注意事項 -----^--------- 本頁) 917 917
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Ser Arg lie Ala Phe Ala Lys Thr Ala lie Leu Cys Thr Val Leu Asp ••315 320 325 330 I gac etc tat gat aeg cac gca aca rtg cat gaa ate aaa ate aeg aca :Asp Leu Tyr Asp Thr liis Ala Thr Leu ttis Glu lie Lys lie Met Thr ； 335 340 345 * gag gga gtg aga egra tgg gac ctr teg ttg aca gat gac etc cca gac
Glu Gly Val Arg Arg Trp Asp Leu Ser Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp 350 355 360 tac att aaa att gca ttc cag ttc ttc ttc aat aca gtg aat gaa ttg
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Asp Leu Lys Asp Phe Glu Asp Glu Lys Glu Arg Gly Glu Met Ala Ser 475 480 4*05 490 tet tta cag tgt tat atg aaa gaa aat cct gaa tet aca gtg gaa aat
Ser Leu Gin Cys Tyr Met Lys Glu Asn Pro Glu Ser Thr Val Glu Asn 4 95 500 505 get tta aat cac ata aaa ggc ate ett aat cgt tec ett gag gaa ttr
Ala Leu Asn His lie Lys Gly lie Leu Asn Arg Ser Leu Glu Glu Phe 510 515 520 aat tgg gag ttt atg aag cag gat agt gtc cca atg tgt tgc aag aaa
Asn Trp Glu Phe Met Lys Gin Asp Ser Val Pro Met Cys Cys Lys Lys 525 530 535 -139- 本絨張度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 965 1013 1061 1109 1157 1205 1253 1301 1349 1397 1445 1493 1541 1589 1637 200300171 五]發明説明（l36 -55- tzc act ttc aat ata ggt cga gga ctt caa ttc ate tac aaa tac aga 1685 Phe Thr Phe Asn lie Gly Arg Gly Leu Gin Phe lie Tyr Lys Tyr Arg 540 545 550 gac ggc tta tac att tet gac aag ?aa gta aag gac cag ata ttc aaa 1733 Asp Gly Leu Tyr He Ser Asp Lys Glu Val Lys Asp Gin lie Phe Lys 555 560 565 370 art eta gec cac caa gtt cca atg gag gaa tagtgatggt cttggttgta 1783 .工le Leu VaH His Gin VaJL Pro Met Glu Glu 575 560 gtngtctatt atggtaratr gcattgacat ttatgcttaa aggtgtttct taaacgttta 1B43 gggcggaccg ctaaataagt tggcaacaat taatanctcg ag 1Θ日5 <210> 4B <211> 5B0 <212> PRT <213>人工序列 <400> 4Θ Het Ala Glu 工le Ser Glu Ser I JLe Pro Arg Arg Thr Gly Asn His His 1 5 10 15 Gly Asn Val Trp Asp Asp Asp Leu lie His Ser Leu Asn Ser Pro Tyr 20 25 30 Gly Ala Pro Ala Tyr Tyr Glu Leu Leu Gin Lys Leu lie Glri Glu lie 35 40 45 Lys His Leu Leu Leu Thr Glu Met Glu Wet Asp Asp Gly Asp His Asp 50 55 60 Leu lie Lys Arg Leu GIjl lie Val Asp Thr Leu Glu Cys Leu Gly lie 65 70 75 Θ0 Asp Arg His Phe Glu His Glu lie Gin Thr Ala Ala Leu Asp Tyr Val 85 90 95 Tyr Arg Trp Trp Asn Glu Lys Gly lie Gly Glu Gly Ser Arg Asp Ser 100 105 110 Phe Ser Lys Asp Leu Asn Ala Thr Ala Leu Gly Fhe Arg Ala Leu Arg 115 120 125 Leu His Axg Tyr Asn Val Ser Ser Gly Val Leu Lys Asn Phe Lys Asp 130 135 140 Glu Asn Gly Lys Phe Phe Cys Asn Phe Thr Gly Glu Glu Gly Arg Gly 145 150 155 160 Asp Lys Gin Val Arg Ser Met Leu Ser Leu Leu Arg Ala Ser Glu He 165 170 175 Ser Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Lys Ala Phe Thr Arg 180 185 190 Glu Tyr Leu Asn Gin val Leu Ala Gly His Gly Asp Val Thr Asp Val 195 200 205 Asp Gin Ser Leu Leu Arg Glu Val Lys Tyr Ala Leu Glu Phe Pro Trp 210 215 ’ 220 His Cys Ser Val Pro Arg Trp Glu Ala Arg Ser Phe Leu Glu lie Tyr -140- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公楚）
訂丨！ :請先閲讀背面之注意事項^^本頁) 200300171 五 發明説明（l37 56 - 225 230 235 240
Gly His Asn His Ser Trp Leu Lys Ser hsn He Asn Gin Lys Met Leu 245 250 255 Lys Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn lie Leu Gin Cys Lys His His Lys 260 265 270
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Lys Thr Ala lie Lea Cys Thr VaX Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr His 325 330 335 Ala Thr Leu His Glu He Lys lie Met Thr Glu Gly val Arg Arg Trp 340 345 350
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Pro Met Glu Glu -141- 本紙巧尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐）
:線丨 :...............裝：； (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -----訂....... 200300171 五}發明説明（1¾ •57· 500 <210> 49 <211> 17B5 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之種類 電腦產生之具有r葎草烯合成晦编碼之核敗序列 <220> <221> CDS <222> (4). (1782) <400> 49 tcc acg get cag att tee gaa acc gta tea ccc tet ace gat ttg aag Met Ala Gin lie Ser Glu Thr Val Ser Pro Ser Thr Asp Leu Lys 15 10 15 age acc gaa tet tec ate acc tet aat ega cat gga aat atg zgg gag Ser Thr Glu Ser Ser lie Thr Ser Asn Arg His Gly Asn Met Trp Glu 20 25 30 gac gat ege ata cag tet etc aac tea cct tat ggg gca cct gca tat Asp Asp Arg lie Gin Ser , Leu Asn Ser Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Tyr 35 40 45 caa gaa ege age gaa aag ett att gaa gag ate aaa ett tta ttt ttg Gin Glu Arg Ser Glu Lys Leu lie Glu Glu lie Lys Leu Leu. Phe Leu 50 55 60 agt gac atg gac gat age tgc aat gat age gat cgt gsit ttsL a/tc aaa Ser Asp Met Asp Asp Ser Cys Asii Asp Ser Asp Arg Asp Leu lie Lys 65 70 75 egrt ett gag ate gtt gat act gtc gag tgt ctg gga att gat ega cat Arg Lea Glu lie Val Asp Thr Val Glu Cys Leu Gly He Asp Arg His BO Θ5 90 95 ttt caa cct gag ata aaa eta get ctg gat tac gtt tac aga tgt tgg Phe Gin Pro Glu lie Lys Leu Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg Cys Trp 100 105 110 aac gaa aga ggc ate gga gag gga tea aga gat tee etc aag aaa gat Asn Glu Arg Gly He Gly Glu Gly Ser Arg Asp Ser Leu Lys Lys Asp 115 120 125 ctg aac get aca get ttg gga tec egg get etc ega etc cat ega tat Leu Asn Ala Thr Ala Leu Gly Phe Arg Ala Leu Arg Leu His Arg Tyr ：130 135 140 aac gta tec tea ggt gtc ttg gag aat ttc aga gat gat aac ggg cag Asn Val Ser Ser Gly Val Leu Glu Asn Phe Arg Asp Asp Asn Gly Gin 145 150 155 ttc ttc tgc ggt tet aca gtt gaa gaa gaa gga gca gaa gca tat aat Phe Phe Cys Gly Ser Thr Val Glu GJu Glu Gly Ala Glu Ala Tyr Asn 160 165 170 175 aaa cac gta aga tgc arg ctg tea tta teg ega get tea aac att tta Lys His Val Arg Cys Met Leu Ser Leu Ser Arg Ala Ser Asn lie Leu 180 1B5 19〇 4Θ 96 144 13之 240 288 336 384 432 480 528 576 -142- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱）
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Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Lys Ala Phe Thr Thr Asn 195 200 205 672 720 7€B 616 864 912 960 1008 1056 1104 1152 1200 1248 1296 1344 1392
tat eta aag aaa gtt tta gca gga egg gag get acc cac gtc gat gaa Tyr Leu Lys Lys Val Leu Ala Gly Arg Glu Ala Thr His Val Asp Glu 210 215 220 age ett ttg gga gag gtg aag tac gca ttg gag ttt cca tgg cat tgc Ser Leu Leu Gly Glu Val Lys Tyr Ala Leu Glu Phe Pro Trp His Cys 225 230 235 agx: gtg cag aga tgg gag gca agg age ttt ate gaa ata ttr gga caa Ser Val Gin Arg Trp Glu Ala Arg Ser Phe lie Glu He Phe Gly Gin 240 245 250 255 ate gat tea gag ett aag ccg aat ttg age aaa aaa atg tt.a gag ttg lie Asp Ses* Gita lieu Lys Ser Asxi Leu Ser Lys Iiys Het Leu Gla Leu 260 265 · 270 gcg aaa ttg gac ttc aat att ctg caa tgc aca cat cag aaa gaa ctg AXa Lys Leu Asp Phe Asn lie Leu Gin Cys Thr His Gin Lys Glu Leu 275 280 285 cag att ate tea agg tgg ttc gca gac tea agt ata gca tcc ctg aat
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Phe Tyr Arg Lys Cys Tyr Val Glu Phe Tyr Phe Trp Met Ala Ala Ala 305 310 315 ate tcc gag ccg gag ttt tet gga age aga gtt gcc ttc aca aaa att lie Ser Glu Pro Glu Phe Ser Gly Ser Arg Val AXa Phe Thr Lys lie 320 325 330 335 get ata ctg atg aca atg cca gat gac ctg tac gat act cac gga acc Ala lie Leu Met Thr Met Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr His Gly Thr 340 345 350 ttg gac caa etc aaa ate ttt aca gag gga gtg aga ega tgg gat gtt
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200300171 五 、發明説明（HO) 450 455 4 60 ate gac att ctg gag caa ata ttc ttg ccc tcc agg ttc cac cat etc 14 40 lie Asp lie Leu Glu Gin Ils Phe Leu Pro Ser Arg Phe His His Leu 4S5 470 475 att gaa ttg get tcc agg etc gtc gat gac geg aga gat ttc cag geg 14ΘΘ He Glu Leu Ala Ser Arg Leu VaX Asp Asp Ala Arg Asp Phe Gin Ala 480 485 490 4 95 gag aag gat cat ggg gat tta teg tgt att gag tgt tat tta aaa gat 1536 Glu Lys Asp His Gly Asp Leu Ser Cys He Glu Cys Tyr Leu Lys Asp 500 505 510 cat cct gag tet aca gta gaa gat gen tta aat c^t gtt aat ggc etc 1584 His Pro Glu Ser Thr Val Glu Asp Ala Leu Asn His Val Asn Gly Leu 515 520 525 ett ggc aat tgc ett ctg gaa atg aar tgg aag ttc tta aag aag cag 1632 Leu Gly Asn Cys Leu Leu Glu Met Asn Trp Lys Phe Leu Lys Lys Gin 530 535 540 gac agt gtg cca crc teg tgt aag aag tac age ttc cat gta ttig gca Asp Ser Val Pro Leu Ser Cys Lys Lys Tyr Ser Phe His Val Leu Ala 545 550 555 1660 ega age ate caa ttc atg tac aat caa ggc gat ggc ttc tee att ccg Arg Ser lie Gin Plie Met Tyr Asn Gin Gly 苎sp Gly Phe Ser lie S«r
172B 560 565 570 575 aac aaa gtg ate aag gat caa gtg cag aaa gtt ett att gtc ccc gtg Asn Lys Val lie Lys Asp Gin VaJL Gin Lys Val Leu lie Val Pro Val 580 585 590 cct att tga Pro He 1776 17Θ5 <210> 50 <211> 593 <212> PRT <Z13>人工序列 <400> 50 Met Ala Gin 工le Ser Glu Thr Val Set Pro Ser Thr Asp Leu Lys Ser 1 5 10 15 • · · _ Thr Glu Ser Ser lie Thr Ser Asn Arg His Gly Asn Met Trp Glu Asp 20 25 30 Asp Arg lie Gin Ser Leu Asn Ser Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Tyr Gin 35 40 45 Glu Arg Ser Glu Lys Leu He Glu Glu lie Lys Leu Leu Phe Leu Ser 50 55 60 Asp Met Asp Asp Ser Cys Asn Asp Ser Asp Arg Asp Leu lie Lys Arg 65 70 75 80 Leu Glu lie Val Asp Thr Val Glu Cys Leu Gly lie Asp Arg His Phe 85 9〇 95 Gin Pro Glu He Lys Leu Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg Cys Trp Asn 100 105 110 Glu Arg Gly lie Gly Glu Gly Ser Arg Asp Ser Leu Lys I»ys Asp Leu 144- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐）
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200300171 五 發明説明（） -60· 115 120 125
Asn Ala Thr Ala Leu Gly Phe Arg Ala Leu Arg Leu His Arg Tyr Asn 130 135 140 Val Ser Ser Gly Val Leu Glu Asn Phe Arg Asp Asp Asn Gly Gin Phe 145 150 155 160 Phe Cys Gly Ser Thr Val Glu Glu Glu Gly Ala Glu Ala Tyr Asn Lys 165 170 175 His Val Arg Cy^ Met Leu Ser Leu Ser Arg Ala Ser Asn 工le Leu Phe 1日0 185 190 Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Lys Ala Phe Thr Thr Asa Tyr 195 200 205 Leu Lys Lys Val Leu Ala Gly Arg Glu Ala Thr His Val Asp Glu Ser 210 215 220 Leu Leu Gly Glu Val Lys Tyr Ala Leu Glu Phe Pro Trp His Cys Ser 225 230 235 240 Val Gin Arg Trp Glu Ala Arg Ser Phe lie Glu lie Phe Gly Gin lie 245 250 255 Asp Ser Glu Leu Lys Ser Asn Leu Ser Lys Lys Met Leu Glu Leu Ala 260 265 270 Lys Leu Asp Phe Asn lie Leu Gin Cys Thr His Gin Lys Glu Leu Gin 275 2Θ0 285 He lie Ser Arg Trp Phe Ala Asp Ser Ser lie Ala Ser Leu Asn Phe 290 295 300 Tyr Arg Lys Cys Tyf Val Glu fhe Tyr Phe Trp Met Ala Ala Ala lie 305 310 315 . 320 Ser Glu Pro Glu Phe Ser Gly Ser Arg Val Ala Phe Thr Lys He Ala 325 330 335 工le Leu Met Thr Met Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr His Gly Thr Leu 340 345 350 Asp Gin Leu Lys lie Phe Thr Glu Gly Val Arg Arg Trp Asp Val Ser 355 . 360 365 Lea Val Glu Gly Leu Pro Asp Phe Met Lys He Ala Phe Glu Phe Trp 370 375 380 Leu Lys Thr Ser Asn Gl*u Leu He Ala Glu Ala Val Lys Ala Gin Gly 385 390 395 400 Gin Asp Met Ala Ala Tyr lie Arg Lys Asn Ala Tip Glu Arg Tyr I*eu 405 410 415 Glu Ala Tyr Leu Gin Asp Ala Glu Trp lie Ala Thr Gly His Val Pro 420 425 430 Thr Phe Asp Glu Tyr Leu Asn Asn Gly Thr Pro Asn Thr Gly Met Cys 435 440 44S Val Leu Asn Leu lie Pro Leu Leu Leu Met Gly Glu His Leu Pro lie 450 455 460 Asp lie Leu Glu Gin 工le Phe Leu Pro Ser Arg Phe His flis Leu He _ -145- *本紙d尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐）
(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂丨 線丨 61 200300171 五卜發明説明（l42 465 470 4·75 4Θ0
Glu Leu Ala Ser Arg Leu Val Asp Asp Ala Arg Asp Phe Gin Ala Glu 485 490 495
Lys Asp His Gly Asp Leu Ser Cys He Glu Cys Tyr Leu Lys Asp His 500 505 510
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Gly Asn Cys Leu Leu Glu Met Asn Trp Lys Phe Leu Lys Lys Gin Asp 530 535 540 _· Ser Val Pro Leu Ser Cys Lys Lys Tyr Ser Phe His Val Leu Ala Arg ；545 550 555 560 I Ser lie Gin Phe Met Tyr Asn Gin Gly Asp Gly Phe Ser He Ser Asn j 565 570 575
I ! Lys Val lie Lys Asp Gin Val Gin Lys Val Leu lie Val Pro Val Pro , 5Θ0 585 590
I j lie <210> 51 <211> 17日S <212> DNA <213>人工序列 <22 0> <223>人工序列之種類：電腦產生之具有r葎草烯合成酶編碼之核酸序列 <220> <221> CDS <222> (4)..(1782) <40〇> 51 48 tct atg get cag att tct gaa tct gta tea ccc tct acc gat ttg aag Met Ala Gin lie Ser Glu Ser Val Ser Pro Ser Thr Asp Leu lys 15 10 15 age acc gaa tct tec att acc tct aat ega cat gga aat atg tgg gag 96
Ser Thr Glu Ser Ser lie Thr Ser Asn Arg His Gly Asn Met Trp Glu 20 25 30 gac gat ege ata cag tct etc aac tea cct tat ggg gca ect gca tar 144
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Arg Leu Glu lie Val Asp Thr Val Glu Cys Leu Gly lie Asp TLrg His 80 Θ5 90 95 -146- 本紙？I：尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 200300171 i 發明説明（143 62- I ttt caa cct gag ata aaa tts get ctg gat tac gtt tac aga tgt tgg * Phe Gin Pro Glu lie Lys Leu Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg Cys Trp 100 105 110 aac gaa aga ggc ate gga gag gga tea aga gat tee etc aag aaa gat Asn Glu Arg Gly lie Gly Glu Gly Ser Arg Asp Ser Leu Lys Lys Asp 115 120 125 ctg aac get aca get ttg gga ttc egg get etc ega etc cat ega tat Leu Asn Ala Thr Ala Leu Gly Phe Arg Ala Leu Arg Leu His Arg Tyr 130 135 140 aac gta tee tea ggn gtc ttg gag aat ttc aga gat gat aac ggg cag Asn Val Ser Ser Gly Val Leu Glu Asn Phe Arg Asp Asp Asn Gly Gin 145 150 155 ttc ttc tgc ggt ret aca gtt gaa gaa gaa gga gca gaa gca tat aat Phe Phe Cys Gly Ser Thr Val Giu Glu Glu Gly Ala Glu Ala Tyr Asn 160 165 170 175 aaa cac gta aga tgc atg ctg tea tra teg ega get tea aac att t:ta Lys His Val Arg Cys Met Leu Ser Leu Ser Arg Ala Ser Asn lie Leu 180 185 190 ttt ccg ggc gaa aaa gtg atg gaa gag geg aag gca ttc aca aca aat Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Lys Ala Phe Thr Thr Asn 195 200 205 tat eta aag aaa gtt ..t-ta gca gga egg gag get acc cac gtc gat gaa Tyr Leu Lys Lys Val Leu Ala Gly Arg Glu Ala Thr His Val Asp Glu 210 2X5 220 age ett ttg gga gag gtg aag tac gca ttg gag cca tgg cat tgc Ser Leu Leu Gly Glu Val Lys Tyr Ala Leu Glu Phe Pro Trp His Cys 225 230 235 agt gtg cag aga tgg gag gca agg age ttt ate gaa ata ttt gga caa Ser Val Gin Arg Trp Glu ida Arg Ser Phe lie Glia lie Phe Gly Gin 240 245 250 255 at*t gat tea gag ett aag teg aat ttg age aaa aaa atg tta gag ttg lie Asp Ser Glu Leu Lys Ser Asn Leu Ser Lys 260 265 aaa Lys Met Leu Glu Leu 270 geg aaa ttg gac ttc aat att ctg caa tgc aca cat cag aaa gaa ctg Thr His Gin Lys Glu Leu
Ala Lys Leu Asp Phe Asn Ile^Leu Gin Cys 275 280 285 cag act ate tea agg tgg ttc gca gac tea agt ata gca tee ccg aat Gin 工le 工le Ser.Arg Trp Phe 為sp Ser Ser lie Ala Ser I*evi Asn 290 295 300 ttc tat egg aaa tgt tac gtc gaa ttt tac ttt tgg atg get gca gee Phe Tyr Arg Lys Cys Tyr Val Glu Phe Tyr Phe Trp Met Ala Ala Ala 305 310 315 ate tee gag ccg gag ttt tet gga age aga gtt gee ttc aca aaa art lie Ser Glu Pro Glu Phe Ser Gly Ser Arg Val Ala Phe Thr Lys He 320 325 330 335 A, ct ata ctg atg aca atg eta gat gac ctg tac gat act cac gga acc la lie Leu Met Thr Met Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr His Gly Thr 340 345 . 350 ttg gac caa etc aaa ate ttt aca gag gga gtg aga ega tgg gat gtt Leu Asp Gin Leu Lys lie Phe Thr Glu Gly Val Arg Arg Trp Asp Val -147. 33€ 384 432 480 528 516 624 672 720 768 Θ16 B64 912 960 1008 1056 1104
(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙ψ尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7B7 五、丨發明説明（l44) •63· 355 360 365 teg ttg gta gag ggc etc cca gac ttc atg aaa att gee etc gag ttc Ser Leu Val Glu Gly Leu Pro Asp Phe Met Lys lie Ala Phe Glu Phe I 370 375 380 tgg tta aag aca tet aat gaa ttg act get gaa get gtt aaa geg caa Trp Leu Lys Thr Ser Asn Glu Leu He Ala Glu Ala Val Lys Ala Gin 3日5 390 395 ggg caa gat atg geg gee tac ata aga aaa aat gca tgg gag ega tac Gly Gin Asp Met Ala Ala Tyr lie Arg Lys Asn Ala Xrp Glu Arg Tyr 400 405 410 415 ett gaa get tat ctg caa gat geg gaa tgg ata gee act gga cat gtc Leu Glu Ala Tyr Leu Gin A3p Ala Glu Trp 工le Ala Thr Gly His Val 420 425 430 ccc acc ttt gar gag tac ttg aat aat ggc aca cca aac act ggg atg Pro Thr Phe Asp Glu Tyr Leu Asn Asn Gly Thr Pro Asn Thr Gly Met 435 440 445 tgt gta ttg aat ttg att ccg ett ctg tta atg ggt gaa cat eta cca Cys Val Leu Asn Leu He Pro Leu Leu Leu Mel: Gly Glu His Leu Pro 450 455 460 ate gac a*ct ctg gag caa ata ttc ttg ccc tee agg ttc cac cat c.tc lie Asp lie Leu Glu Gin lie Phe Leu Pro Ser Arg Phe His His L白u 4 65 470 475 att gaa ttg get tee agg etc gtc gat gac geg aga gat ttc cag geg He Glu Leu Ala Ser Arg Leu VaX Asp Asp Ala Arg Asp Phe Gin Ala 480 4Θ5 490 495 gag aag gat cat ggg gat tta teg tgt att gag tgt cat tta aaa gat Glu Lys Asp His Gly Asp Leu Ser Cys lie Glu Cys Tyr Leu Lys Asp 500 505 510 cat cct gag tet aca gta gaa gat get tta aat cat gtt aat ggc etc His Pro Glu Ser Thr Val Glu Asp Ala Leu Asn His Val Asn Gly Leu 515 520 525 1152 1200 124Θ 1296 1344 1392 1440 148Θ 1536 1584 (請先閲讀背面 之注意事項再本頁) .裝丨 •、可i 'ett ggc aat tgc ett ctg gaa atg aat tgg aag ttc tta aag aag cag Leu Gly Asn Cys Leu Leu Glu Met Kan Trp Lys Phe Leu Lys Lys Gin 1632 530 535 540 gac agt gtg cca etc teg tgt aag aag tac age ttc cat gta ttg gca Asp Ser Val Pro Leu Ser Cys Lys Lys Tyr Sjer Phe His Val Leu Ala 545 550 555 ega age ate caa ttc atg tac aat caa ggc gat ggc ttc tee att teg Arg Ser lie Gin Phe Met Tyr Asn Gin Gly Asp Gly Phe Ser lie Ser 560 565 570 575 aac aaa gtg arc aag gat caa gtg cag aaa gtt ett att gtc ccc gtg Asn Lys Val lie Lys Asp Gin Val Gin Lys Val Leu lie Val Pro Val 5Θ0 5Θ5 590 cct gtt tga Pro Val 16Θ0 1728 1776 1785 <210> 52 <211> 593 <212> PRT <213>人工序列 148- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7B7 五 發明説明（l45 -64 * <400> 52 Met Ala Gin He Ser Glu Ser Val Ser Pro Ser Thr Asp Leu Lys Ser i 1 5 10 15 I ! Thr Glu Ser Ser lie Thr Ser Asn Arg His Gly Asn Met： Txp Giu Asp ； 20 25 30 .. I Asp Arg lie Gin Ser Leu Asn Ser Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Tyr Gin I 35 40 45 I Glu Arg Ser Glu Lys Lea lie Glu Glu Ils Lys Leu Leo Phe Leu Ser 1 50 55 60 ! Asp Met Asp Asp Ser Cys Asn Asp Ser Asp Arg Asp Leu He Lys Arg 65 70 75 BO I Leu Glu lie Val Asp Thr Val Glu Cys Leu Gly lie Asp Arg His Phe 85 90 95 Gin Pro Glu lie Lys Leu Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg Cys Trp Asn 100 105 110 Glu Arg Gly lie Gly Glu Gly Ser Arg Asp Ser Leo Lys Lys Asp Leu 115 120 125 Asn Ala Thr Ala Leu Gly Phe Arg Ala Leo Arg Leu His Arg Tyr Asn 130 135 140 Val Ser Ser Gly Val Leu Glu Asn Phe Arg Asp Asp Asn Gly Gin Phe 145 150 155 160 Phe Cys Gly Ser Thr Val Glu Glu Glu Gly Ala Glu Ala Tyr Asn Lys 1S5 1*70 · 175 His Val Arg Cys Met Leu Ser Leu Ser Arg Ala Ser Asn lie Leu Phe 100 1Θ5 190 Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Lys Ala Phe Thr Thr Asn Tyr 195 200 205 Leii Lys Lys Val Leu Ala Gly Arg Glu Ala Thr His Val,Asp Glu Ser 210 215 220 Leu Leu Gly Glu Val Lys Tyr Ala Leu Glu Phe Pro Trp His Cys Ser 225 230 235 240 Val Gin Arg Trp Glu Ala Arg Ser Phe lie Glu lie Phe Gly Gin He 245 250 255 Asp Ser Glu Leu Lys Ser Aszi Leu Ser Lys Lys Met Leu G2u Leu Ala 260 265 270 Lys Leu Asp Phe Asn lie Leu Gin Cys Thr His Gin Lys Glu Lea Gin 275 290 285 lie lie Ser Arg Trp Wie Ala Asp Ser Ser lie Ala Ser Leu Asn Phe 290 295 300 Tyr Arg Lys Cys Tyr Val Glu Phe Tyr Phe Trp Met Ala Ala Ala lie 305 310 315 320 Ser Glu Pro Glu Phe Ser Gly Ser Arg Val Ala Phe Thr Lys lie Ala 335 325 330 lie Leu Met Thr Met Leu Asp Asp Leu Tyr Asp
His Gly Thr Leu :請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .訂 :線· -149- 本紙張 尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 B7 五 發明説明（Μ6 ) 65 340 345 350
Asp Gin Leu Lys lie Phe Thr Glu Gly Val Arg Arg Trp Asp Val Ser 355 360 365 Leu Val Glu Gly Leu Pro Asp Phe Met: Lys lie Ala Phe Glu Phe Trp 370 375 380 Leu Lys Thr Ser Asn Glu Leu lie Ala Glu Ala Val Lys Ala Gin Gly 305 390 395 400 Gin Asp Met Ala Ala Tyr lie Arg Lys Asn Ala Trp Glu Arg Tyr Leu 一 415 405 410
Glu Ala Tyr Leu Gin Asp Ala Glu Trp lie Ala Thr Gly His Val Pro 420 425 430 Thr Phe Asp Glu Tyr Leu Asn Asn Gly Thr Pro Asn Thr Gly Met Cys 435 440 445 Val !<eu Asn X*eu lie Pro Leu Leu Leu Met Gly Glu His Leu Pro lie 450 455 460 Asp lie Leu Glu Gin lie Phe Leu Pro Ser Arg Phe His His Leu lie 465 470 475 4Θ0 Glu Leu Ala Ser Arg Leu Val Asp Asp Ala Arg Asp Phe Gin Ala GXu 465 A9〇 435 Lys Asp His Gly Asp Leu Ser Cys He Glu Cys Tyr Leu Lys Asp flis (請先閲讀背面之注意事項再Pi：本頁) 500 Pro Glu Ser Thr Val Glu 515 505 510
Ala Leu Asn His Val Asn Gly Leu Leu 520 525 •訂·
Gly Asn Cys Leu Leu Glu Met Asn Trp Lys Phe Leu Lys Lys Gin Asp 530 535 540
Ser Val Pro Leu Ser Cys Lys Lys Tyr Ser Phe His Val Leu Ala Arg 545 550 555 560
Ser lie Gin Phe Met Tvr Asn Gin GJLy Asp Gly Phe Ser lie Ser Asn 565 570 575
Lys Val lie Lys Asp Gin Val Gin Lys Val Leu lie Val Pro Val Pro 5Θ0 5B5 ^ 590
Val ·· <210> 53 <211> 1785 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之種類：電腦產生之具有r葎草烯合成酶編碼之核酸序列 <220> <221> CDS 1 <222> (4)--(1702) <400> 53 150-· 本紙張 尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 B7 五 發明説明（Η7) • 66 tcc atg get cag att tet gaa tet gta tea ccc ter acc gat ttg aag Met Ala Gin 工le Ser Glu Ser Val Ser Pro Ser Thr Asp Leu Lys 15 10 15 age acc gaa tet tec att acc tet aat ega cat gga aat atg egg gag Ser Thr Glu Ser Ser lie Thr Ser Asn Arg His Gly Asn Met Trp Glu 20 25 30 gac gat ege at a cag tet etc aac tea cct tat ggg gca cct gca tat Asp Asp Arg lie Gin Ser Leu Aan Ser Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Tyr 35 40 45 caa gaa ege age gaa aag ett att gaa gag ate aaa ett tta ttt ttg Gin Glu Arg Ser Glu Lys Leu lie Glu Glu He Lys Leu Leu Fhe Leu 50 55 60 agt gac atg gac gat age tgc aat gat age gat cgt gat tua ate aaa Ser Asp Met Asp Asp Ser Cys Asn Asp Ser Asp Arg Asp Leu lie Lys 65 70 75
4B 144 192 2A0 cgt ett gag ate gtt Arg Leu Glu 工le Val 80 gat act gtc gag tgt ctg gga att gat ega cat Asp Thr Val Glu Cys Leu Gly He Asp Arg His 2ΘΘ Θ5 90 95 ttt caa cct gag ata aaa tta get ctg gat tac gtt tac aga tgt tgg Phe Gin Pro Glu lie Lys Leu Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg Cys Trp 100 105 110 aac gaa aga ggc ate gga gag gga tea aga gat tec cue aag aaa gat Asn Glu Arg Gly lie Gly Glu Gl/ Ser Arg A.sp Ser Leu Lys Lys Asp 115 120 125 ctg aac gee aca get ttg gga ttc egg get ere ega ccc cat ega tac Leu Asn Ala Thr Ala Leu Gly Phe Arg Ala Lea Arg Leu His Arg Tyr 130 135 140 aac gta tec cca ggt gtc ttg gag aat ttc aga gat gat aac ggg cag Asn Val Ser Ser Gly Val Leu Glu Asn Phe Arg Asp Asp Asn Gly Gin 145 150 _ 155 ttc ttc tgc ggt tet aca gtt gaa gaa gaa gga gca g-aa gca tat aat Phe Phe Cys Gly Ser Thr Val Glu Glu Glu Gly Ala Glix Ala Tyr Asn 160 165 170 175 336 384 432 480 528 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁)
-訂I aaa cac gta Lys His Val aga tgc atg ctg tea tta reg ega get tea aac alt tta 576 Arg Cys Met Leu Ser Leu Ser Arg Ala 5er Asn lie Leu 1Θ0 1B5 190 ttt ccg ggc gaa aaa gtg atg gaa gag geg aag gca ttc aca aca aat Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Lys Ala Phe Thr Thr Asn 195 200 205 tat era aag aaa gtt eta gca gga egg gag get acc cac gtc gat gaa Ala 624 672 -線丨
Tyr Leu Lys Lys Val Leu Ala Gly Arg Glu 210 215
Thr His Val Asp Glu 220 age ett ttg gga gag gtg aa.g tac gca ttg gag ttt cca tgg cat tgc Ser Leu Leu Gly Glu Val Lys Tyr Ala Leu Glu Phe Pro Trp liis Cys 225 230 .235 agt gtg cag aga tgg gag gca agg age ttt ate gaa ata ttt gga caa Ser Val Gin Arg Trp Glu Ala Arg Ser Phe lie Glu lie Phe Gly Gin 240 245 250 255 att gat tea gag ett aag teg aat ttg age aaa aaa atg tta gag ttg lie Asp Ser Glu Leu Lys Ser Asn Leu Ser Lys Lys Met Leu Glu Leu 720 Θ16 -151- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 B7 五 發明説明（I48 260 265 270 gcg aaa ttg gac tie aat att ctg caa tgc aca cat cag aaa gaa ctg 664
Ala Lys Leu Asp Phe Asn lie Leu Gin Cys Thr His Gin Lys Glu Leu 275 280 285 cag att ate tea agg tgg ttc gca gac tea agt ata gca tcc ctg aat 912
Gin lie lie Ser Arg Trp Phe Ala Asp Ser Ser lie Ala Ser Leu Asn 290 295 300 ttc tat egg aaa tgt tac gre gaa rtt tac ttt egg atg get gca gcc 960
Phe Tyr Arg Lys Cys Tyr Val Glu Phe Tyr Phe Trp Met Ala Ala Ala 305 310 315 ate tcc gag ccg gag ttt tet gga age aga gtt gcc ttc aca aaa att 1008 lie Ser Glu Pro Glu Phe Ser Gly Ser Arg Val Ala Phe Thr Lys He 320 325 330 335 get ata ctg atg aca atg eta gat gac ctg tac gat act: cac gga acc 1056
Ala lie Leu Met Thr Met Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr His Gly Thr 340 345 350 ttg gac caa etc aaa ate ttt aca gag gga gtg aga ega tgg gat gtt 1104
Leu Asp Gin Leu Lys lie Phe Thr Glu Gly Val Arg Arg Trp Asp Val 355 360 365 teg ttg gta gag ggc etc cca gac ttc atg aaa att gca ttc gag ttc 1152
Ser Leu Val Glu Gly Leu Pro Asp Phe Met Lys lie Ala Phe Glu Phe 370 375 3Θ0 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) egg tta aag aca tet aat gaa ttg att get gaa get gtt aaa gcg Trp Leu Lys Thr Ser Asn Glu Leu lie Ala Glu Ala Val Lys Ala caa 1200 Gin 3B5 390 395 •訂- 1248 ggg ca.a gat atg gcg gtt tac ata aga aaa aat gca egg gag ega tac Gly Gin Asp Met Ala Val Tyr 工le Arg Lys Asn Ala Trp Glu Arg Tyr 400 405 410 415 ett gaa gcc tat ctg caa gat gcg gaa tgg ata gcc act gga cat gtc 1296
Leu Glu Ala Tyr Leu Gin Asp Ala Glu Txp lie Ala Thr Gly His Val 420 425 430 1344 ccc acc ttt gat gag tac ttg aat aat ggc aca cca aac act ggg atg Pro Thr Phe Asp Glu Tyr Leu Asn Asn Gly Thr Pro Asn Thr Gly Met 435 440 445 tgt gta ttg aat ttg att ccg ett ctg tta atg ggt gaa cat tta cca 1392
Cys Val Leu Asn Leu lie Pr。Leu Leu Leu Met Giy Glu His Leu Pro 450 455 460 ate gac atr ctg gag caa ata ttc ttg ccc tcc agg ttc cac cat etc 1440 lie Asp lie Leu Glu Gin He Phe Leu Pro Ser Arg Phe His tiis Leu 4 65 470 475 att gaa ttg get tcc agg etc gtc gat gac gcg aga gat ttc cag gcg I486
He Glu Leu Ala Ser Jlrg Leu Val Asp Asp Ala Arg Asp Phe Gin Ala 4Θ0 4Θ5 490 495 gag aag gat cat ggg gat tta teg tgt 'art gag tgt tat tta aaa gat 1536
Glu Lys Asp His Gly Asp Leu Ser Cys lie Glu Cys Tyr Leu Lys Asp 500 505 510 cat cct gag tet aca gta gaa gat get tta aat cat gtt aat ggc crc 1584
His Pro Glu Ser Thr Val Glu Asp Ala Leu Asn His Val Asn Gly Leu 515 520 525 -152- 本紙張 尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 B7 五、 發明説明（l49) -68 ctt ggc aat tgc ctt ctg gaa atg aat tgg aag ttc tta aag aag cag 1632
Leu Gly Asn Cys Leu Leu Glu Met Asn Trp Lys Phe Leu Lys Lys Gin 530 535 540 gac agt gtg cca etc teg tgt aag aag tac age ttc cat gta ttg gca Asp Ser Val Pro Leu Ser Cys Lys Lys Tyr Ser Phe His Val Leu Ala 545 550 555 16B0 ega age ate caa ttc atg tac aat caa ggc gat ggc ZZc tcc att teg 1720 Arg Ser lie Gin Phe Met Tyr Asn Gin Gly Asp Gly Phe Ser lie Ser 560 565 570 575 aac aaa gtg ate aag gat caa gtg cag aaa gtt cct att gtc ccc gtg 3776 Asn Lys Val lie Lys Asp Gin Val Gin Lys Val Leu lie Val Pro Val 580 5日5 590 cct att tga Pro lie 1785 <210> 54 <211> 593 <212> PRT <213>人工序列 <400> 54 Met Ala Gin 工le Ser Glu Ser Val Ser Pro Ser Thr Asp Leu Lys Ser 15 10 15 Thr Glu Ser Ser lie Thr Ser Asn Arg His Gly Asn Met Trp Glu Asp 20 25 30 Asp Arg lie Gin Ser Leu Asn Ser Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Tyr Gin 35 40 45 Glu Arg Ser Glvx Lys Leu lie Glu Glu 工le Lys Leu Leu Phe Leu Ser 50 55 60 Asp Met Asp Asp Ser Cys Asn Asp Ser Asp Arg Asp Leu lie Lys Arg 65 70 75 80 Leu Glu lie Val Asp Thr Val Glu Cys Leu Gly lie Asp Arg His Fhe 85 90 95 (請先閱讀背面之注意事項再填窝本頁) •、可|
Gin Pro Glu lie Lys Leu Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg Cys Trp Asn 100 105 110
Glu Arg Gly lie Gly Glu Gly Ser Arg Asp Ser Leu Lys Lys Asp Leu 115 120 125
Asn Ala Thr Ala Leu Gly Phe Arg Ala Leu Arg Leu His Arg Tyr Asn 130 135 ^ 140
Val Ser Ser Gly Val Leu Glu Asn Phe Arg Asp Asp Aan Gly Gin phe 145 150 155 160
Phe Cys Gly Ser Thr Val Glu Glu Glu Gly Ala Glu Ala Tyr Asn Lys 165 170 175
His Val Arg Cys Met: Leu Ser Leu Ser Arg Ala Ser Asn lie Leu Phe 180 105 190
Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Lys Ala Phe Thr Thr Asn Tyr 195 200 205
Leu Lys Lys Val Leu Ala Gly Arg Glu Ala Thr His Val Asp Glu Ser 153- 本紙張 尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7 B7 五 發明説明（15〇) 210 215 -69 220
Leu Leu Gly Glu Val Lys Tyr Ala Leu Glu Phe Pro Trp His Cys Ser ：-25 230 235 240 Val Gin Arg Trp Glu Ala Arg Ser Phe lie Glu lie Phe Gly Gin He 245 250 255 Asp Ser Glu I#eu lys Ser Asn Leu Ser Lys Lys Met： Leu Glu Leu j 260 Z65 270 Lys Leu Asp Phe Asn lie Leu Gin Cys Thr Hia Gin Lys Glu Leu Gin 275 2B0 2B5 ^Cle lie Ser Arg Trp Phe Ala Asp Ser Ser lie Ala Ser Leu Asn Phe 290 295 300
Tyr Arg Lys Cys Tyr Val Glu Phe Tyr Phe Trp Met Ala Ala Ala He 310 315 320
Glu Pro Glu Phe Ser Gly Ser Arg Val Ala Phe Thr Lys lie Ala 325 330 335 (請先閱讀背面之注意事項再本頁)
Ele Leu Met Thr Met Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr His Gly Thr Leu 340 345 350 P^sp Gin Leu Lys lie Phe Thr Glu Gly Val Arg Arg Trp Asp Val Ser 355 360 365
Leu Val Glu Gly Leu Pro Asp Phe Met Lys lie* Ala Phe Glu Phe Trp 370 375 380
Leu Lys Thr Ser Asn Glu Leu lie Ala Glu Ala Val Lys Ala Gin Gly 385 390 335 400
Gin Asp Met Ala Val Tyr 工le Arg Lys Asn Ala Trp Glu Arg Tyr Leu 405 410 415
Clu Ala Tyr Leu Gin Asp Ala Glu Trp He Ala Thr Gly His Val Pro ' 420 425 430
Thr Phe Asp Glu Tyx Leu Asn Asn Gly Thr Pro Asn Thr Gly Met Cys 435 440 445
Val Leu Asn Leu lie Pro Leu Leu Leu Met Gly Glu His Leu Pro 工le 450 455 460
Asp lie Leu Giu Gin lie Phe Leu Pro Ser Arg Phe His His Leu He 465 470 475 400
Glu Leu Ala Ser Arg Leu Val Asp Asp Ala Arg Asp Phe Gin Ala Glu 485 490 495
Lys Asp His Gly Asp Leu Ser Cys lie Glu Cys Tyr Leu Lys Asp flis 500 505 510
Pro Glu Ser Thr Val Glu Asp Ala Leu Asn His Val Asn Gly Leu Leu 515 520 525
Gly Asn Cys Leu Leu Glu Met Asn Trp Lys phe Leu Lys Lys Gin Asp 530 535 540
Ser Val Pro Lea Ser Cys Lys Lys Tyr Ser Phe His Val Leu Ala Arg 545 550 555 560
Ser lie Gin Phe Met Tyr Asn Gin Gly Asp Gly Phe Ser He Ser Asn -154- 本紙張 -訂· 尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 200300171 A7B7 五、發明説明（⑸） -70- 565 570 575
Lys val lie Lys Asp Gin Val Gin Lys Val Leu lie Val Pro Val Pro 580 5Θ5 590 lie <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <223>人工序列之種類••胺基政序列片段 <220> <221> 域 <222> (1)..(7) <223>保留性胺基酸片段，其中位於1、2、5及6之Xaa各代表任何胺基酸 <400> 55
Xaa Xaa Asp Asp Xaa Xaa Asp 1 5 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .訂_ -155- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公楚〉

Claims (1)

  1. A B c D 200300171 六、申請專利範圍 1. 一種可複製的表現載體，其包含有一個編碼一裸子植物 倍半萜烯合成酶之核酸序列。 2. 如申請專利範圍第1項之可複製的表現載體，其包含有一 個編碼倍半搭烯合成酶之核酸序列，該倍半萜烯合成酶 係選自於下列群中：Ε-α-甜沒藥烯合成酶、5-芹子烯合 成酶及Τ -葎草烯合成酶。 3. 如申請專利範圍第2項之可複製的表現載體，其中該倍半 萜烯合成酶係得自於一種選自於下列群中的裸子植物： 大冷杉gaw山、白杉ecmco/or)、美西落葉 松(Ζ^η·Λ： 、北美雲杉pwwgews)、扭葉 松（P/y contorta)、德遠松（Pinus iaeia)及花旗松 (Pseudotsuga menziesii) 〇 4. 如申請專利範圍第1項之可複製的表現載體，其包含有一 個編碼具有大冷杉倍半萜烯合成酶之核 酸序列，該倍半萜烯合成酶係選自於下列群中：Ε-α-甜 沒藥烯合成酶、芹子烯合成酶及r-葎草烯合成酶。 5· —種在宿主細胞中賦予或加強一裸子植物倍半萜稀合成 酶之產生的方法，其包含在可加強該倍半萜烯合成酶蛋 白質在該宿主細胞中之表現的條件下將如申請專利範圍 第1、2或3項之表現載體送入該宿主細胞中。 6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該宿主細胞係為一種 原核細胞。 7. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該宿主細胞係為一種 真核細胞。 8·如申請專利範圍第7項之方法，其中該宿主細胞係為一種 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格釐） 200300171 A B CD 申請專利範圍 植物細胞。 9·如申請專利範圍第7項之方法，其中該宿主細胞係為一種 動物細胞。 10· —種用以製造一基因轉殖植物的方法，其包含有： (a) 將一種編碼有一裸子植物倍半萜烯合成酶蛋白質之 核酸分子導入一植物細胞内，該核酸分子能在55°C下於 0.5X SSC中雜合至序列辨識編號：12、序列辨識編號： 19及序列辨識編號：23中所述核酸分子之任一個之互補 核酸分子；以及 (b) 從依據步驟（a)所處理之植物細胞再生成一基因轉殖 植物； 序列辨識編號：12 gtggcgacca tcctccaaaa tcggatctgg ttccgcgtgg atcc atg get ggc gtt 56 Met Ala Gly Val 1 tet get gta tea aag gtt tee age ttg gtt tgt gat ttg teg agt acc 104 Ser Ala Val Ser Lys Val Ser Ser Leu Val Cys Asp Leu Ser Ser Thr 5 10 15 20 age ggc ttg att ega aga act gee aat cct cat ccc aat gtc tgg ggt Ser Gly Leu lie Arg Arg Thr Ala Asn Pro His Pro Asn Val Trp Gly 25 30 35 152 tat gat ett gtg cat tet ett aaa tea cct tat att gat tet agt tac 200 Tyr Asp Leu Val His Ser Leu Lys Ser Pro Tyr He Asp Ser Ser Tyr 40 45 50 aga gaa ege geg gag gtc ett gtt age gag att aaa geg atg ett aat Arg Glu Arg Ala Glu Val Leu Val Ser Glu lie Lys Ala Met Leu Asn 55 60 65 248 cca get att aca gga gat gga gaa tea atg att act cca tet get tat 296 度適用中國國家標準（CNS ) A4規格公釐） 裝 訂 線 A B c D 200300171 六、申請專利範圍 Pro Ala He Thr Gly Asp Gly Glu Ser Met He Thr Pro Ser Ala Tyr 70 75 80 gac aca gca tgg gta gcg agg gtg ccc gcc att gat ggc let get ege 344 Asp Thr Ala Trp Val Ala Arg Val Pro Ala lie Asp Gly Ser Ala Arg 85 90 95 100 ccg caa ttt ccc caa aca gtt gac tgg att ttg aaa aac cag tta aaa 392 Pro Gin Phe Pro Gin Thr Val Asp Trp lie Leu Lys Asn Gin Leu Lys 105 110 115 gat ggt tea tgg gga att cag tcc cac ttt ctg ctg tcc gac cgt ett 440 Asp Gly Ser Trp Gly He Gin Ser His Phe Leu Leu Ser Asp Arg Leu 120 125 130 ett gcc act ett tet tgt gtt ett gtg etc ett aaa tgg aac gtt ggg 488 Leu Ala Thr Leu Ser Cys Val Leu Val Leu Leu Lys Trp Asn Val Gly 135 140 145 gat ctg caa gta gag cag gga att gaa ttc ata aag age aat ctg gaa 536 Asp Leu Gin Val Glu Gin Gly lie Glu Phe lie Lys Ser Asn Leu Glu 150 155 160 eta gta aag gat gaa acc gat caa gat age ttg gta aca gac ttt gag 584 Leu Val Lys Asp Glu Thr Asp Gin Asp Ser Leu Val Thr Asp Phe Glu 165 170 175 180 ate ata ttt cct tet ctg tta aga gaa get caa tet ctg ege etc gga 632 lie lie Phe Pro Ser Leu Leu Arg Glu Ala Gin Ser Leu Arg Leu Gly 185 190 195 ett ccc tac gac ctg cct tat ata cat ctg ttg cag act aaa egg cag 680 Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Tyr lie His Leu Leu Gin Thr Lys Arg Gin 200 205 210 gaa aga tta gca aaa ett tea agg gag gaa att tat gcg gtt ccg teg 728 Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser Arg Glu Glu lie Tyr Ala Val Pro Ser 215 220 225 cca ttg ttg tat tet tta gag gga ata caa gat ata gtt gaa tgg gaa 776 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格公釐） 200300171 A BCD •申請專利範圍 Pro Leu Leu Tyr Ser Leu Glu Gly lie Gin Asp He Val Glu Trp Glu 230 235 240 cga ata atg gaa gtt caa agt cag gat ggg tct ttc tta age tea cct Arg lie Met Glu Val Gin Ser Gin Asp Gly Ser Phe Leu Ser Ser Pro 245 250 255 260 824 get tct act gcc tgc gtt ttc atg cac aca gga gac geg aaa tgc ett Ala Ser Thr Ala Cys Val Phe Met His Thr Gly Asp Ala Lys Cys Leu 265 270 275 872 gaa ttc ttg aac agt gtg atg ate aag ttt gga aat ttt gtt ccc tgc Glu Phe Leu Asn Ser Val Met lie Lys Phe Gly Asn Phe Val Pro Cys 280 285 290 920 ctg tat cct gtg gat ctg ctg gaa ege ctg ttg ate gta gat aat att Leu Tyr Pro Val Asp Leu Leu Glu Arg Leu Leu He Val Asp Asn He 295 300 305 968 gta ege ett gga ate tat aga cac ttt gaa aag gaa ate aag gaa get Val Arg Leu Gly lie Tyr Arg His Phe Glu Lys Glu lie Lys Glu Ala 310 315 320 1016 ett gat tat gtt tac agg cat tgg aac gaa aga gga att ggg tgg ggc Leu Asp Tyr Val Tyr Arg His Trp Asn Glu Arg Gly lie Gly Trp Gly 325 330 335 340 1064 τ aga eta aat ccc ata gca gat ett gag acc act get ttg gga ttt cga Arg Leu Asn Pro He Ala Asp Leu Glu Thr Thr Ala Leu Gly Phe Arg 345 350 355 1112 ttg ett egg ctg cat agg tac aat gta tct cca gcc att ttt gac aac Leu Leu Arg Leu His Arg Tyr Asn Val Ser Pro Ala lie Phe Asp Asn 360 365 370 1160 ttc aaa gat gcc aat ggg aaa ttc att tgc teg acc ggt caa ttc aac Phe Lys Asp Ala Asn Gly Lys Phe He Cys Ser Thr Gly Gin Phe Asn 375 380 385 1208 aaa gat gta gca age atg ctg aat ett tat aga get tcc cag etc gca 1256 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（2l?¥gg7e：公釐） A B CD 200300171 六、申請專利範圍 Lys Asp Val Ala Ser Met Leu Asn Leu Tyr Arg Ala Ser Gin Leu Ala 390 395 400 ttt ccc gga gaa aac att ctt gat gaa get aaa age ttc get act aaa 1304 Phe Pro Gly Glu Asn lie Leu Asp Glu Ala Lys Ser Phe Ala Thr Lys 405 410 415 420 tat ttg aga gaa get ctt gag aaa agt gag act tcc agt gca tgg aac 1352 Tyr Leu Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ser Glu Thr Ser Ser Ala Trp Asn 425 430 435 aac aaa caa aac ctg age caa gag ate aaa tac geg ctg aag act tet 1400 Asn Lys Gin Asn Leu Ser Gin Glu lie Lys Tyr Ala Leu Lys Thr Ser 440 445 450 tgg cat gcc agt gtt ccg aga gtg gaa gca aag aga tac tgt caa gtg 1448 Trp His Ala Ser Val Pro Arg Val Glu Ala Lys Arg Tyr Cys Gin Val 455 460 465 tat ege cca gat tat gca ege ata gca aaa tgc gtt tac aag eta ccc 1496 Tyr Arg Pro Asp Tyr Ala Arg lie Ala Lys Cys Val Tyr Lys Leu Pro 470 475 480 tac gtg aac aat gaa aag ttt tta gag ctg gga aaa tta gat ttc aac 1544 Tyr Val Asn Asn Glu Lys Phe Leu Glu Leu Gly Lys Leu Asp Phe Asn 485 490 495 500 att ate cag tcc ate cac caa gaa gaa atg aag aat gtt acc age tgg 1592 lie lie Gin Ser He His Gin Glu Glu Met Lys Asn Val Thr Ser Trp 505 510 515 ttt aga gat teg ggg ttg cca eta ttc acc ttc get egg gag agg ccg 1640 Phe Arg Asp Ser Gly Leu Pro Leu Phe Thr Phe Ala Arg Glu Arg Pro 520 525 530 ctg gaa ttc tac ttc tta gta geg geg ggg acc tat gaa ccc cag tat 1688 Leu Glu Phe Tyr Phe Leu Val Ala Ala Gly Thr Tyr Glu Pro Gin Tyr 535 540 545 gcc aaa tgc agg ttc etc ttt aca aaa gtg gca tgc ttg cag act gtt 1736 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（2ip_I公釐） 200300171 ABCD 、申請專利範圍 Ala Lys Cys Arg Phe Leu Phe Thr Lys Val Ala Cys Leu Gin Thr Val 550 555 560 ctg gac gat atg tat gac act tat gga acc eta gat gaa ttg aag eta 1784 Leu Asp Asp Met Tyr Asp Thr Tyr Gly Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu 565 570 575 580 ttc act gag get gtg aga aga tgg gac etc tcc ttt aca gaa aac ett 1832 Phe Thr Glu Ala Val Arg Arg Trp Asp Leu Ser Phe Thr Glu Asn Leu 585 590 595 cca gac tat atg aaa eta tgt tac caa ate tat tat gac ata gtt cac 1880 Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Tyr Gin lie Tyr Tyr Asp He Val His 600 605 610 gag gtg get tgg gag gca gag aag gaa cag ggg cgt gaa ttg gtc age 1928 Glu Val Ala Trp Glu Ala Glu Lys Glu Gin Gly Arg Glu Leu Val Ser 615 620 625 ttt ttc aga aag gga tgg gag gat tat ett ctg ggt tat tat gaa gaa Phe Phe Arg Lys Gly Trp Glu Asp Tyr Leu Leu Gly Tyr Tyr Glu Glu 630 635 640 1976 裝 訂 get gaa tgg tta get get gag tat gtg cct acc ttg gac gag tac ata Ala Glu Trp Leu Ala Ala Glu Tyr Val Pro Thr Leu Asp Glu Tyr lie 645 650 655 660 2024 aag aat gga ate aca tet ate ggc caa cgt ata ett ctg ttg agt gga 2072 Lys Asn Gly lie Thr Ser lie Gly Gin Arg lie Leu Leu Leu Ser Gly 665 670 675 gtg ttg ata atg gat ggg caa etc ett teg caa gag gca tta gag aaa 2120 Val Leu lie Met Asp Gly Gin Leu Leu Ser Gin Glu Ala Leu Glu Lys 680 685 690 gta gat tat cca gga aga cgt gtt etc aca gag ctg aat age etc att Val Asp Tyr Pro Gly Arg Arg Val Leu Thr Glu Leu Asn Ser Leu lie 695 700 705 2168 tcc ege ctg geg gat gac aeg aag aca tat aaa get gag aag get cgt 2216 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格公釐） 線 A B CD 200300171 六、申請專利範圍 Ser Arg Leu Ala Asp Asp Thr Lys Thr Tyr Lys Ala Glu Lys Ala Arg 710 715 720 gga gaa ttg gcg tcc age att gaa tgt tac atg aaa gac cat cct gaa 2264 Gly Glu Leu Ala Ser Ser He Glu Cys Tyr Met Lys Asp His Pro Glu 725 730 735 740 tgt aca gag gaa gag get etc gat cac ate tat age att ctg gag ccg 2312 Cys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Asp His He Tyr Ser He Leu Glu Pro 745 750 755 gcg gtg aag gaa ctg aca aga gag ttt ctg aag ccc gac gac gtc cca 2360 Ala Val Lys Glu Leu Thr Arg Glu Phe Leu Lys Pro Asp Asp Val Pro 760 765 770 ttc gcc tgc aag aag atg ett ttc gag gag aca aga gtg aeg atg gtg 2408 Phe Ala Cys Lys Lys Met Leu Phe Glu Glu Thr Arg Val Thr Met Val 775 780 785 ata ttc aag gat gga gat gga ttc ggt gtt tcc aaa tta gaa gtc aaa 2456 lie Phe Lys Asp Gly Asp Gly Phe Gly Val Ser Lys Leu Glu Val Lys 790 795 800 gat cat ate aaa gag tgt etc att gaa ccg ctg cca ctg taatcaaaat 2505 Asp His lie Lys Glu Cys Leu He Glu Pro Leu Pro Leu 805 810 815 agttgcaata ataattgaaa taatctcaac tatgtttcac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2565 aaaaaa 2571 序列辨識編號：19 cggatctggt tccgcgtgga tcc atg get gag att tet gaa tet tcc ate cct 53 Met Ala Glu lie Ser Glu Ser Ser lie Pro 1 5 10 ega ege aca ggg aat cat cac gga aat gtg tgg gac gat gac etc ata 101 Arg Arg Thr Gly Asn His His Gly Asn Val Trp Asp Asp Asp Leu lie 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格公釐） A B c D 200300171 申請專利範圍 15 20 25 cac tct etc aac teg ccc tat ggg gca cct gca tat tat gag etc ett 149 His Ser Leu Asn Ser Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Tyr Tyr Glu Leu Leu 30 35 40 caa aag ett att cag gag ate aag cat tta ett ttg act gaa atg gaa 197 Gin Lys Leu lie Gin Glu He Lys His Leu Leu Leu Thr Glu Met Glu 45 50 55 atg gat gat ggc gat cat gat tta ate aaa cgt ett cag ate gtt gac 245 Met Asp Asp Gly Asp His Asp Leu lie Lys Arg Leu Gin He Val Asp 60 65 70 act ttg gaa tgc ctg gga ate gat aga cat ttt gaa cac gaa ata caa 293 Thr Leu Glu Cys Leu Gly lie Asp Arg His Phe Glu His Glu lie Gin 75 80 85 90 aca get get tta gat tac gtt tac aga tgg tgg aac gaa aaa ggt ate 341 Thr Ala Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg Trp Trp Asn Glu Lys Gly He 95 100 105 ggg gag gga tea aga gat tee ttc age aaa gat ctg aac get aeg get 389 Gly Glu Gly Ser Arg Asp Ser Phe Ser Lys Asp Leu Asn Ala Thr Ala 110 115 120 裝 訂 f tta gga ttt ege get etc ega ctg cat ega tat aac gta teg tea ggt 437 Leu Gly Phe Arg Ala Leu Arg Leu His Arg Tyr Asn Val Ser Ser Gly 125 130 135 gtg ttg aag aat ttc aag gat gaa aac ggg aag ttc ttc tgc aac ttt Val Leu Lys Asn Phe Lys Asp Glu Asn Gly Lys Phe Phe Cys Asn Phe 140 145 150 485 線 act ggt gaa gaa gga aga gga gat aaa caa gtg aga age atg ttg teg Thr Gly Glu Glu Gly Arg Gly Asp Lys Gin Val Arg Ser Met Leu Ser 155 160 165 170 533 tta ett ega get tea gag att teg ttt ccc gga gaa aaa gtg atg gaa Leu Leu Arg Ala Ser Glu lie Ser Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu 581 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格公釐） ABCD 200300171 六、申請專利範圍 175 180 185 gag gcc aag gca ttc aca aga gaa tat eta aac caa gtt tta get gga 629 Glu Ala Lys Ala Phe Thr Arg Glu Tyr Leu Asn Gin Val Leu Ala Gly 190 195 200 cac ggg gat gtg act gac gtg gat caa age ett ttg aga pag gtg aag 677 His Gly Asp Val Thr Asp Val Asp Gin Ser Leu Leu Arg Glu Val Lys 205 210 215 tac gca ttg gag ttt cca tgg cat tgc agt gtg ccg aga tgg gag gca 725 Tyr Ala Leu Glu Phe Pro Trp His Cys Ser Val Pro Arg Trp Glu Ala 220 225 230 agg age ttt etc gaa ata tat gga cac aac cat teg tgg etc aag teg 773 Arg Ser Phe Leu Glu lie Tyr Gly His Asn His Ser Trp Leu Lys Ser 235 240 245 250 aat ate aac caa aaa atg ttg aag tta gcc aaa ttg gac ttc aat att 821 Asn lie Asn Gin Lys Met Leu Lys Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn He 255 260 265 ctg caa tgc aaa cat cac aag gag ata cag ttt att aca agg tgg tgg 869 Leu Gin Cys Lys His His Lys Glu He Gin Phe He Thr Arg Trp Trp 270 275 280 aga gac teg ggt ata teg cag ctg aat ttc tat ega aag ega cac gtg 917 Arg Asp Ser Gly lie Ser Gin Leu Asn Phe Tyr Arg Lys Arg His Val 285 290 295 gaa tat tat tet tgg gtt gtt atg tgc att ttt gag cca gag ttc tet 965 Glu Tyr Tyr Ser Trp Val Val Met Cys He Phe Glu Pro Glu Phe Ser 300 305 310 gaa agt aga att gcc ttc gcc aaa act get ate ctg tgt act gtt eta 1013 Glu Ser Arg He Ala Phe Ala Lys Thr Ala lie Leu Cys Thr Val Leu 315 320 325 330 gat gac etc tat gat aeg cac gca aca ttg cat gaa ate aaa ate atg 1061 Asp Asp Leu Tyr Asp Thr His Ala Thr Leu His Glu lie Lys lie Met 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格公釐） A B c D 200300171 申請專利範圍 335 340 345 aca gag gga gtg aga cga tgg gat ctt teg ttg aca gat gac etc cca Thr Glu Gly Val Arg Arg Trp Asp Leu Ser Leu Thr Asp Asp Leu Pro 350 355 360 1109 gac tac att aaa att gca ttc cag ttc ttc ttc aat aca gtg aat gaa Asp Tyr He Lys lie Ala Phe Gin Phe Phe Phe Asn Thr Val Asn Glu 365 370 375 1157 ttg ata gtt gaa ate gtg aaa egg caa ggg egg gat atg aca acc ata 1205 Leu lie Val Glu lie Val Lys Arg Gin Gly Arg Asp Met Thr Thr He 380 385 390 gtt aaa gat tgc tgg aag cga tac att gag tet tat ctg caa gaa geg 1253 Val Lys Asp Cys Trp Lys Arg Tyr lie Glu Ser Tyr Leu Gin Glu Ala 395 400 405 410 gaa tgg ata gca act gga cat att ccc act ttt aac gaa tac ata aag 1301 Glu Trp lie Ala Thr Gly His lie Pro Thr Phe Asn Glu Tyr lie Lys 415 420 425 aac ggc atg get age tea ggg atg tgt att eta aat ttg aat cca ctt 1349 Asn Gly Met Ala Ser Ser Gly Met Cys He Leu Asn Leu Asn Pro Leu 430 435 440 etc ttg ttg gat aaa ctt etc ccc gac aac att ctg gag caa ata cat Leu Leu Leu Asp Lys Leu Leu Pro Asp Asn lie Leu Glu Gin lie His 445 450 455 1397 裝 線 tet cca tcc aag ate ctg gac etc tta gaa ttg aeg ggc aga ate gcc Ser Pro Ser Lys He Leu Asp Leu Leu Glu Leu Thr Gly Arg He Ala 460 465 470 1445 gat gac tta aaa gat ttc gag gac gag aag gaa ege ggg gag atg get Asp Asp Leu Lys Asp Phe Glu Asp Glu Lys Glu Arg Gly Glu Met Ala 475 480 485 490 1493 tea tet tta cag tgt tat atg aaa gaa aat cct gaa tet aca gtg gaa Ser Ser Leu Gin Cys Tyr Met Lys Glu Asn Pro Glu Ser Thr Val Glu 1541 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格公釐） 200300171 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 495 500 505 aat get tta aat cac ata aaa ggc ate ett aat cgt tee ett gag gaa Asn Ala Leu Asn His lie Lys Gly lie Leu Asn Arg Ser Leu Glu Glu 510 515 520 ttt aat tgg gag ttt atg aag cag gat agt gtc cca atg tgt tgc aag Phe Asn Trp Glu Phe Met Lys Gin Asp Ser Val Pro Met Cys Cys Lys 525 530 535 aaa ttc act ttc aat ata ggt ega gga ett caa ttc ate tac aaa tac Lys Phe Thr Phe Asn lie Gly Arg Gly Leu Gin Phe lie Tyr Lys Tyr 540 545 550 aga gac ggc tta tac att tet gac aag gaa gta aag gac cag ata ttc Arg Asp Gly Leu Tyr lie Ser Asp Lys Glu Val Lys Asp Gin lie Phe 555 560 565 570 aaa att eta gtc cac caa gtt cca atg gag gaa tagtgatggt cttggttgta Lys He Leu Val His Gin Val Pro Met Glu Glu 575 580 gttgtctatt atggtatatt gcattgacat ttatgcttaa aggtgtttct taaacgttta gggcggaccg ttaaataagt tggcaataat taatateteg ag 序列辨識編號·· 23 tee atg get cag att tet gaa tet gta tea ccc tet acc gat ttg aag Met Ala Gin He Ser Glu Ser Val Ser Pro Ser Thr Asp Leu Lys 15 10 15 age acc gaa tet tee att acc tet aat ega cat gga aat atg tgg gag Ser Thr Glu Ser Ser lie Thr Ser Asn Arg His Gly Asn Met Trp Glu 20 25 30 gac gat ege ata cag tet etc aac tea cct tat ggg gca cct gca tat Asp Asp Arg He Gin Ser Leu Asn Ser Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Tyr 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（21?γ#7_公釐） 1589 1637 1685 1733 1786 1846 1888 48 96 144 ABCD 200300171 申請專利範圍 35 40 45 caa gaa cgc age gaa aag ett att gaa gag ate aaa ett tta ttt ttg Gin Glu Arg Ser Glu Lys Leu lie Glu Glu lie Lys Leu Leu Phe Leu 50 55 60 192 agt gac atg gac gat age tgc aat gat age gat cgt gat tta ate aaa 240 Ser Asp Met Asp Asp Ser Cys Asn Asp Ser Asp Arg Asp Leu lie Lys 65 70 75 cgt ett gag ate gtt gat act gtc gag tgt ctg gga att gat ega cat 288 Arg Leu Glu He Val Asp Thr Val Glu Cys Leu Gly He Asp Arg His 80 85 90 95 ttt caa cct gag ata aaa tta get ctg gat tac gtt tac aga tgt tgg Phe Gin Pro Glu He Lys Leu Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg Cys Trp 100 105 110 336 aac gaa aga ggc ate gga gag gga tea aga gat tee etc aag aaa gat Asn Glu Arg Gly lie Gly Glu Gly Ser Arg Asp Ser Leu Lys Lys Asp 115 120 125 384 ctg aac get aca get ttg gga ttc egg get etc ega etc cat ega tat Leu Asn Ala Thr Ala Leu Gly Phe Arg Ala Leu Arg Leu His Arg Tyr 130 135 140 432 aac gta tee tea ggt gtc ttg gag aat ttc aga gat gat aac ggg cag 480 Asn Val Ser Ser Gly Val Leu Glu Asn Phe Arg Asp Asp Asn Gly Gin 145 150 155 ttc ttc tgc ggt tet aca gtt gaa gaa gaa gga gca gaa gca tat aat Phe Phe Cys Gly Ser Thr Val Glu Glu Glu Gly Ala Glu Ala Tyr Asn 160 165 170 175 528 aaa cac gta aga tgc atg ctg tea tta teg ega get tea aac att tta 576 Lys His Val Arg Cys Met Leu Ser Leu Ser Arg Ala Ser Asn He Leu 180 185 190 ttt ccg ggc gaa aaa gtg atg gaa gag geg aag gca ttc aca aca aat 624 Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Lys Ala Phe Thr Thr Asn 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格公釐） A B c D 200300171 a、申請專利範圍 195 200 205 tat eta aag aaa gtt tta gca gga egg gag get acc cac gtc gat gaa 672 Tyr Leu Lys Lys Val Leu Ala Gly Arg Glu Ala Thr His Val Asp Glu 210 215 220 age ett ttg gga gag gtg aag tac gca ttg gag ttt cca tgg cat tgc 720 Ser Leu Leu Gly Glu Val Lys Tyr Ala Leu Glu Phe Pro Trp His Cys 225 230 235 agt gtg cag aga tgg gag gca agg age ttt ate gaa ata ttt gga caa 768 Ser Val Gin Arg Trp Glu Ala Arg Ser Phe lie Glu lie Phe Gly Gin 240 245 250 255 att gat tea gag ett aag teg aat ttg age aaa aaa atg tta gag ttg 816 lie Asp Ser Glu Leu Lys Ser Asn Leu Ser Lys Lys Met Leu Glu Leu 260 265 270 geg aaa ttg gac ttc aat att ctg caa tgc aca cat cag aaa gaa ctg 864 Ala Lys Leu Asp Phe Asn lie Leu Gin Cys Thr His Gin Lys Glu Leu 275 280 285 cag att ate tea agg tgg ttc gca gac tea agt ata gca tee ctg aat 912 Gin lie lie Ser Arg Trp Phe Ala Asp Ser Ser lie Ala Ser Leu Asn 290 295 300 ttc tat egg aaa tgt tac gtc gaa ttt tac ttt tgg atg get gca gee 960 Phe Tyr Arg Lys Cys Tyr Val Glu Phe Tyr Phe Trp Met Ala Ala Ala 305 310 315 ate tee gag ccg gag ttt tet gga age aga gtt gee ttc aca aaa att 1008 lie Ser Glu Pro Glu Phe Ser Gly Ser Arg Val Ala Phe Thr Lys lie 320 325 330 335 get ata ctg atg aca atg eta gat gac ctg tac gat act cac gga acc 1056 Ala lie Leu Met Thr Met Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr His Gly Thr 340 345 350 ttg gac caa etc aaa ate ttt aca gag gga gtg aga ega tgg gat gtt 1104 Leu Asp Gin Leu Lys lie Phe Thr Glu Gly Val Arg Arg Trp Asp Val 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（21?公釐） A BCD 200300171 申請專利範圍 355 360 365 teg ttg gta gag ggc etc cca gac ttc atg aaa att gca ttc gag ttc Ser Leu Val Glu Gly Leu Pro Asp Phe Met Lys lie Ala Phe Glu Phe 370 375 380 1152 tgg tta aag aca tet aat gaa ttg att get gaa get gtt aaa geg caa Trp Leu Lys Thr Ser Asn Glu Leu lie Ala Glu Ala Val Lys Ala Gin 385 390 395 1200 ggg caa gat atg geg gee tac ata aga aaa aat gca tgg gag ega tac 1248 Gly Gin Asp Met Ala Ala Tyr lie Arg Lys Asn Ala Trp Glu Arg Tyr 400 405 410 415 ett gaa get tat ctg caa gat geg gaa tgg ata gee act gga cat gtc 1296 Leu Glu Ala Tyr Leu Gin Asp Ala Glu Trp He Ala Thr Gly His Val 420 425 430 ecc acc ttt gat gag tac ttg aat aat ggc aca cca aac act ggg atg 1344 Pro Thr Phe Asp Glu Tyr Leu Asn Asn Gly Thr Pro Asn Thr Gly Met 435 440 445 tgt gta ttg aat ttg att ccg ett ctg tta atg ggt gaa cat tta cca 1392 Cys Val Leu Asn Leu He Pro Leu Leu Leu Met Gly Glu His Leu Pro 450 455 460 ate gac att ctg gag caa ata ttc ttg ccc tee agg ttc cac cat etc 1440 He Asp lie Leu Glu Gin lie Phe Leu Pro Ser Arg Phe His His Leu 465 470 475 att gaa ttg get tee agg etc gtc gat gac geg aga gat ttc cag geg 1488 He Glu Leu Ala Ser Arg Leu Val Asp Asp Ala Arg Asp Phe Gin Ala 480 485 490 495 gag aag gat cat ggg gat tta teg tgt att gag tgt tat tta aaa gat 1536 Glu Lys Asp His Gly Asp Leu Ser Cys lie Glu Cys Tyr Leu Lys Asp 500 505 510 cat cct gag tet aca gta gaa gat get tta aat cat gtt aat ggc etc 1584 His Pro Glu Ser Thr Val Glu Asp Ala Leu Asn His Val Asn Gly Leu 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格公釐） 裝 訂 線 200300171 A8 B8 C8 _________ D8 六、申請專利範圍 515 520 525 ctt ggc aat tgc ctt ctg gaa atg aat tgg aag ttc tta aag aag cag 1632 Leu Gly Asn Cys Leu Leu Glu Met Asn Trp Lys Phe Leu Lys Lys Gin 530 535 540 gac agt gtg cca etc teg tgt aag aag tac age ttc cat gta ttg gca 1680 Asp Ser Val Pro Leu Ser Cys Lys Lys Tyr Ser Phe His Val Leu Ala 545 550 555 ega age ate caa ttc atg tac aat caa ggc gat ggc ttc tcc att teg 1728 Arg Ser lie Gin Phe Met Tyr Asn Gin Gly Asp Gly Phe Ser He Ser 560 565 570 575 aac aaa gtg ate aag gat caa gtg cag aaa gtt ett att gtc ccc gtg 1776 Asn Lys Val lie Lys Asp Gin Val Gin Lys Val Leu He Val Pro Val 580 585 590 cct att tgagaattcc cgggtcgact cgagcggccg catcgtgact gactgacgat 1832 Pro lie ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 1892 ggtcacagct tgtctgtaag eggatgeegg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 1952 1977 gggtgttggc gggtgtccgg gegea 11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該編碼有一裸子 植物倍半結烯合成酶之核酸分子包含如申請專利範圍 第10項中所列示之序列辨識編號：12的核酸序列。 12. 如申請專利範圍第項之方法，其中該編碼有一裸子 植物倍半碎烯合成酶之核酸分子包含如申請專利範圍 第10項中所列示之序列辨識編號·· 19的核酸序列。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（21?^^§7_公釐） 200300171 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 13·如申請專利範圍第1()項之方法，纟中該編碼有一裸子 植物倍半萜烯合成誨之核酸分子包含如申請專利範圍 $10$ +所列示之序列辨識編號 :23的核酸序列。 14·如申δ月專利範圍第1〇項之方法，其中該編碼有一裸子 植物倍半萜烯合成晦之核酸分子係藉由草原桿菌 (dgrMacien’wm)而導入一植物細胞内。 15·如申請專利範圍第1〇項之方法，其中該編碼有一裸子 裝 植物倍半萜烯合成晦之核酸分子係藉由電穿孔法而導 入一植物細胞内。 16·如申凊專利範圍第丨〇項之方法，其中該編碼有一裸子 植物倍半萜烯合成酶之核酸分子係藉由微粒子痛擊法 而導入一植物細胞内。 訂
    線 本紙張尺度適用中國國家標準（Cns ) A4規格（210 公^ " ' -----------
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