WO2011078338A1 - 新規のテルペン類合成酵素活性を有するタンパク質とそれをコードする遺伝子 - Google Patents

新規のテルペン類合成酵素活性を有するタンパク質とそれをコードする遺伝子 Download PDF

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WO2011078338A1
WO2011078338A1 PCT/JP2010/073374 JP2010073374W WO2011078338A1 WO 2011078338 A1 WO2011078338 A1 WO 2011078338A1 JP 2010073374 W JP2010073374 W JP 2010073374W WO 2011078338 A1 WO2011078338 A1 WO 2011078338A1
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seq
dna
plant
amino acid
protein
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Application number
PCT/JP2010/073374
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English (en)
French (fr)
Inventor
杉村哲
梅基直行
三沢典彦
原田尚志
矢崎一史
Original Assignee
キリンホールディングス株式会社
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme that synthesizes hop monoterpenoids and sesquiterpenoids, a DNA encoding the terpene synthase, a method of synthesizing terpenes using the enzyme, and a breeding and selection method using the DNA.
  • Terpenes are hydrocarbons composed of isoprene as a basic unit, and derivatives having functional groups are called terpenoids and are rich in diversity. It is synthesized in vivo such as plants, insects, and fungi, and is especially abundant in plants as the main component of essential oils. Terpenoids synthesized in plants are thought to play a role in pathogens, pests, beneficial insects, herbivores, and plant-to-plant interactions. In addition to being used as a fragrance raw material for beverages, foods and cosmetics due to its fragrance, it also has antibacterial and antitumor properties, so that it can also be used as a pharmaceutical raw material.
  • Substrates for biosynthesis of terpenes include C10 geranyl diphosphate, C15 farnesyl diphosphate, and C20 geranyl geranyl diphosphate. Converted to terpenes and diterpenes.
  • Asapaceae hops are sexual plants of different sexes, and their spikelets are the main raw material for beer brewing.
  • the role of hops as a beer raw material is to improve bitterness, flavor, foaming, storage stability, and the like.
  • Abundant secondary metabolites are synthesized in the hop blossom lupulin gland hair, and monoterpenes and sesquiterpenes are contained in the essential oil components (Non-patent Document 1). These terpenes are important factors that determine the flavor of beer as an aroma component.
  • Non-patent Document 2 As terpenes having a high content in hop spikelets, monoterpenes such as myrcene and sesquiterpenes such as ⁇ -humulene and ⁇ -caryophyllene are known (Non-patent Document 2). Studies on the synthases of these terpenes in hops have been advanced, and in recent years, genes for enzymes that synthesize myrcene, ⁇ -humulene, and ⁇ -caryophyllene have been identified (Non-patent Document 3). Linalool, a monoterpene alcohol, may account for 1% of the essential oil component.
  • Non-patent Document 4 It is a representative component of floral incense and is an important component proposed as an indicator substance for hop aroma incense (Non-patent Document 4).
  • nerolidol is a component that is rarely detected in hop essential oil and beer as a product (Non-patent Documents 2 and 4), and exhibits a woody fragrance and a citrus fragrance together with a floral fragrance.
  • the production mechanism, enzyme activity, and enzyme gene in hops have not yet been identified.
  • Patent Document 1 So far, a breeding marker using a random cDNA-based RFLP method (PCR-RFLP method) focusing on the content of linalool has been reported (Patent Document 1).
  • a DNA marker is effective only in breeding using a specific variety having the DNA marker.
  • the gene itself is not used as a marker, a certain probability, that is, if the linkage between the DNA marker and the gene is broken, the DNA marker indicates what does not show the expected trait, and there remains a problem with accuracy. . From this point, the gene itself is identified, and using the gene itself as a breeding marker is also excellent as a breeding marker.
  • the present invention relates to an enzyme that synthesizes hop monoterpenoids and sesquiterpenoids, a DNA encoding the terpene synthase, a method for synthesizing terpenes using the enzyme, and characterization and breeding of hops using the DNA
  • the issue was to provide a selection method.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a gene comprising any of the following DNAs (d) to (g): (d) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; (e) encodes a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and has terpene synthase activity DNA; (f) DNA consisting of a base sequence having 85% or more sequence identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and encoding a protein having terpene synthase activity; and (g) SEQ ID NO: 2 or DNA consisting of a degenerate isomer of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • Gene comprising any of the following DNAs (k) to (n): (k) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16; (l) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and encodes a protein having terpene synthase activity; (m) a DNA comprising a base sequence having a sequence identity of 85% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and encoding a protein having terpene synthase activity; and (n) a base shown in SEQ ID NO: 16 DNA consisting of degenerate isomers of sequences.
  • [8] (i) a step of isolating a nucleic acid that is genomic DNA or RNA from a plant, (ii) a step of synthesizing cDNA by reverse transcription when the nucleic acid of (i) is RNA; (iii) amplifying the gene fragment containing the gene [2] or [4] or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 from the DNA obtained in the step (i) or (ii); (iv) The presence of mutations and / or polymorphisms in the DNA amplified in (iii) is determined by comparison with the corresponding nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 5, respectively.
  • [10] A method for detecting a mutation and / or polymorphism of a gene encoding a terpene synthase by the method of [8] or [9] and selecting a plant having the mutation and / or polymorphism.
  • an enzyme that synthesizes a monoterpenoid and a sesquiterpenoid in a hop genus plant a DNA that encodes the terpene synthase, a method for synthesizing terpenes using the enzyme, and a breeding or selection method using the DNA Etc. are provided.
  • an enzyme that synthesizes linalool, which is one of the monoterpene alcohols, which is regarded as very important in beer brewing, and a DNA encoding linalool synthase are provided in the present invention.
  • the selection method can be put into practical use.
  • HlLIS / NES-1 is a diagram comparing the N-terminal genomic base sequences of HlLIS / NES-1 and HlLIS / NES-3 in three varieties of “Kirin No. 2”, “Hallertauer Mfr.” And “Hersbrucker”. Analysis was performed with GENETYX (Genetics).
  • the exon and intron sequences of HlLIS / NES-1 are indicated by solid and dotted arrows, respectively, and the exon sequence of HlLIS / NES-3 is indicated by double arrows.
  • ATG corresponding to the translation initiation methionine of HlLIS / NES-1 and HlLIS / NES-3 is shown by a solid line frame and a double line frame, respectively.
  • Novel terpene synthase The protein of the present invention has a plastid translocation signal, and uses geranyl diphosphate and farnesyl diphosphate as substrates, and the activity of synthesizing monoterpenoid linalool and sesquiterpenoid nerolidol It is an enzyme with
  • the protein of the present invention is an enzyme having no plastid transfer signal and having an activity of synthesizing monoterpenoid linalool and sesquiterpenoid nerolidol using geranyl diphosphate and farnesyl diphosphate as substrates. is there.
  • the enzyme of the present invention is a terpene synthase derived from a hop genus (Humulus lupulus) plant.
  • Hop genus plants include hop (Humulus lupulus), calla (Humulus lupulus var. Cordifolius), canamgra (Humulus japonicus) and the like.
  • the full-length amino acid sequence of the enzyme of the present invention is shown in SEQ ID NO: 1 or 3. Furthermore, the protein of the present invention has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, has a plastid transfer signal, and has terpene synthase activity.
  • the full-length amino acid sequence of the enzyme of the present invention is shown in SEQ ID NO: 15. Furthermore, the protein of the present invention includes a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, having no plastid transfer signal, and having terpene synthase activity.
  • the substantially identical amino acid sequence one or a plurality or several (1 to 10, preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to the amino acid sequence). ⁇ 3, more preferably 1 or 2 amino acid sequences deleted, substituted, inserted and / or added, or the amino acid sequence and BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information (US National Biological Information Center Basic Local Alignment Search Tool)) etc. (eg using default or default parameters), at least 85% or more, preferably 90% or more, and An amino acid sequence having a sequence identity of preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more is mentioned.
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information (US National Biological Information Center Basic Local Alignment Search Tool)
  • the enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 and the enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 are encoded in the same gene, but the enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 is The methionine in the first intron of the genomic DNA encoding the enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 is the translation initiation point, and the first exon is combined with the first intron and the second exon downstream from it. In this respect, they are different.
  • the amino acid positions at positions 16-538 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 correspond to the amino acid positions at positions 68-590 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3.
  • the active site of the enzyme that contributes to the synthesis of terpenes is present in the corresponding amino acid position.
  • the enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 Since the enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 has a plastid transfer signal, it is involved in the synthesis of monoterpenes such as linalool in plastids, while the enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 It is involved in the synthesis of sesquiterpenes such as nerolidol in the cytosol because it has no plastid translocation signal.
  • the terpene synthase of the present invention includes a natural terpene synthase isolated from a plant body and a recombinant terpene synthase produced by a genetic engineering technique.
  • the gene of the present invention has a plastid transfer signal, geranyl diphosphate and farnesyl diphosphate as substrates, and activity to synthesize monoterpenoid linalool and sesquiterpenoid nerolidol
  • the gene of the present invention encodes an enzyme that does not have a plastid translocation signal and has an activity to synthesize monolinpenoid linalool and sesquiterpenoid nerolidol using geranyl diphosphate and farnesyl diphosphate as substrates. And a gene encoding a protein having no plastid transfer signal and having terpene synthase activity.
  • the DNA base sequence of the gene of the present invention is shown in SEQ ID NO: 2 or 4. Furthermore, DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA having a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, and BLAST (Basic (Local Alignment At least 85% or more when calculated using Search Tool at the National Center for Biological (Information (for example, using default or default parameters) One or more or a number of DNAs having sequence identity of preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, or the amino acid sequence of the protein encoded by said DNA (1 to 10, preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, More preferably 1 or 2 amino acids, a DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence deleted, substituted, inserted and / or added, having a plastid translocation signal, and having a terpene synthase DNA encoding a protein having a protein having
  • stringent conditions are, for example, “1XSSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” conditions, and more severe conditions are “0.5 XSSC, 0.1% SDS, 42 ° C.” conditions. There are more severe conditions such as “0.2XSSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”.
  • the gene of the present invention includes DNA consisting of a degenerate isomer of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the DNA base sequence of the gene of the present invention is shown in SEQ ID NO: 16. Furthermore, DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA having a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 16, the base sequence shown in SEQ ID NO: 16, BLAST, etc.
  • DNA having a sequence identity of at least 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, or One or more or several (1 to 10, preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably) amino acid sequences of the protein encoded by the DNA Is a DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, Without a localization signal, and it includes a DNA encoding a protein having a protein having the terpenes synthase activity.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 encodes the enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, respectively.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 encodes an enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • the enzymes encoded by these genes are derived from the same gene, and the nucleotide positions at positions 46-1614 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 are shown in SEQ ID NO: 2 or 4. Corresponds to base positions 202-1770 in the base sequence. The active site of the enzyme contributing to terpene synthesis is encoded in the corresponding base position.
  • the vector of the present invention is a recombinant vector into which a gene comprising the DNA of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 has been inserted.
  • the vector of the present invention is a recombinant vector into which the gene consisting of the DNA of SEQ ID NO: 16 is inserted.
  • Known vectors for E. coli, plant cells, insect cells, etc. can be widely used.
  • the vector used in the present invention incorporates a component related to expression or suppression of a gene such as a promoter, terminator, enhancer, etc., and, if necessary, a selectable marker (for example, drug resistance gene, antibiotic resistance gene, reporter gene) ).
  • Constituent elements relating to gene expression and suppression are preferably incorporated into a recombinant vector in such a manner that they can function according to their properties. Such an operation can be appropriately performed by those skilled in the art.
  • the transformant of the present invention is a transformant carrying the recombinant vector of the present invention.
  • a transformant can be obtained by introducing a recombinant vector into which a gene encoding an enzyme is inserted into a host so that the target gene can be expressed. What is necessary is just to use a host suitable for a vector.
  • Escherichia coli, plant cells, insect cells (such as Sf9), plant viruses and the like can be mentioned.
  • Escherichia coli, a plant cell, a plant virus, etc. are mentioned.
  • the method for introducing the recombinant vector is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into a microorganism.
  • a method using calcium ions (Cohen, SNet al. 1972 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2110), electroporation method, tri-parental mating method, etc. .
  • Examples of a method for producing a transformed plant include a method using a virus, an Agrobacterium Ti plasmid, an Ri plasmid, or the like as a vector.
  • Examples of host plants include monocotyledonous plants such as rice, wheat and corn, and dicotyledonous plants such as soybean, rapeseed, tomato and potato.
  • a transformed plant can be obtained by regenerating a plant cell transformed with the gene of the present invention.
  • Plant regeneration from plant cells can be performed by known methods.
  • the terpene synthase of the present invention is cultured from cells containing the nucleic acid of the present invention and a vector incorporating the nucleic acid, or recovered from a plant containing the nucleic acid of the present invention and the vector incorporating the nucleic acid. can do.
  • Cell culture conditions and plant growth conditions are appropriately selected according to the cell type and other conditions, and can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • the extraction operation and purification method of terpene synthase can also be performed by known methods.
  • the terpene synthase of the present invention can be produced, for example, by mass production using a microorganism expression system such as Escherichia coli transformed with the gene of the present invention. It can be obtained by expressing the gene of the invention.
  • the transformant may be cultured by a known method using a known medium.
  • the terpene synthase of the present invention can be expressed as a protein having high activity in a microorganism expression system such as Escherichia coli.
  • Terpenes can be produced by adding a substrate for the terpenes synthase.
  • linalool and nerolidol can be efficiently produced in large quantities by administering geranyl diphosphate and farnesyl diphosphate as substrates to a transformed E. coli culture solution.
  • linalool and nerolidol can be efficiently produced in plants by expressing the terpene synthase of the present invention in plant cells and plants transformed with the gene of the present invention.
  • geranyl diphosphate, a substrate for the synthesis of monoterpenes, and farnesyl diphosphate, a substrate for the synthesis of sesquiterpenes are found in plant cells in the non-mevalonate pathway of plastids, respectively. It originates from the cytosolic mevalonate pathway, and the synthesis sites for each substrate are also considered to be plastid and cytosol, respectively.
  • a gene encoding a terpene synthase having a plastid transfer signal of the present invention (for example, a DNA comprising a base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4) is used.
  • the resulting terpene synthase is transferred to plastid by its plastid transfer signal, and linalool is efficiently produced using geranyl diphosphate synthesized in the plastid as a substrate.
  • nerolidol which is a sesquiterpene
  • a gene encoding a terpene synthase having no plastid transfer signal of the present invention (for example, a DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 16) is used.
  • the terpene synthase expressed by transformation is present in the cytosol because it does not have a plastid translocation signal, and nerolidol is used as a substrate for farnesyl diphosphate synthesized in the cytosol. It can be produced efficiently.
  • Various cells including Escherichia coli and plants used for synthesizing terpenes for example, enzymes of the mevalonate pathway that promotes the production of geranyl diphosphate and farnesyl diphosphate, which are substrates for terpene synthesis, Genes encoding them may also be included, which makes it possible to increase production of terpenes.
  • terpenes such as linalool and nerolidol can be produced from geranyl diphosphate, farnesyl diphosphate, and the like using the terpene synthase and the gene encoding the terpene synthase of the present invention. it can.
  • the obtained terpenes can be used as a fragrance raw material for foods and cosmetics because of their fragrance, and can also be used as a raw material for pharmaceuticals because they have antibacterial and antitumor properties.
  • the terpene expressed by selecting and introducing a gene encoding a terpene synthase having a plastid transfer signal or a terpene synthase having no plastid transfer signal of the present invention as described above For example, the production amount of linalool or nerolidol can be selectively increased as compared with a normal plant.
  • the present invention is for detecting the presence of polymorphisms such as terpene synthase gene mutations, single nucleotide polymorphisms (SNPs) and gene expression mutations in plants Provide a method.
  • the mutant individuals may be those caused by radiation, chemical treatment, UV irradiation, or natural mutation.
  • genomic DNA and RNA are isolated from mutant individuals, plants of various varieties and breeding individuals, the latter reverse transcribes and synthesizes cDNA, and DNA amplification technology is used to convert terpene synthase genes from DNA. Amplifying the contained gene fragment and determining the presence of the mutation in the DNA are included.
  • kits such as DNeasy and RNeasy® (Qiagen)
  • a method for synthesizing cDNA a commercially available kit (for example, Superscript First Strand System (Invitrogen)) can be used. Techniques such as so-called PCR and LAMP can be used as methods for amplifying gene fragments by using DNA amplification techniques.
  • PCR Protocols A guide to methods It is stated.
  • nucleotide sequence determination (Applied Biosystems) and TILLING method (Till et al.) That detects mutants using an enzyme that cleaves one side of the mismatched pair. 2003 Genome Res-13: 524-530) and the like, and the detection method using the homology between the mutant gene and the normal gene may be used. These can be performed by comparing the sequence data obtained from this technique with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 16 relating to the gene portion.
  • a real-time PCR method (Roche Diagnostics) using the primers prepared based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 16 is applied to the cDNA.
  • Quantitative PCR such as Nostics light cycler
  • a mutation due to a difference in the amount of mRNA can be determined by comparing with the amount of cDNA obtained from the variety “Kirin No. 2”.
  • the method for determining the presence of a terpene synthase gene mutation as defined above is applied to a material obtained from a hop genus (Humulus lupulus) plant.
  • mutations and polymorphisms of genes encoding terpene synthases can be identified at the base level, and the genes encoding terpene synthases are suddenly identified. Plants having mutations can be selected and obtained.
  • the present invention includes a plant having a mutation or polymorphism in the gene encoding the terpene synthase thus obtained.
  • a plant in which the expression ability of a terpene synthase-encoding gene or the activity of a terpene synthase is modified refers to the gene expression ability or the activity of the terpene synthase by mutation such as an artificial mutation. It refers to plants that differ in gene expression ability or terpene synthase activity due to modification and polymorphism.
  • the modification by the mutation of the activity of a plant refers to a modification to an existing variety included in the plant species, and the existing variety includes a wild type.
  • Existing varieties refer to all varieties that exist when plants with modified genes encoding terpene synthases are obtained, varieties created by artificial manipulations such as mating and genetic manipulation, and natural conditions It includes a population that can be distinguished from the wild type that appeared in In addition, in the activity modification, the activity does not have to be changed for all existing varieties. If the activity is modified for a specific existing variety, “a plant in which the activity of the terpene synthase is modified” include.
  • Plant in which the activity of the terpene synthase has been modified includes plants whose activity has been altered by mutation in the natural state without being subjected to human manipulation, and plants whose activity has been altered in the natural state by the method of the present invention. Can be selected and can be established as a new variety.
  • the comparison target may be an existing variety that has been mutagenized, or other existing variety But you can. For example, when the plant is a hop (Humulus lupulus), existing varieties include “Kirin No.
  • the expression ability of a gene encoding a terpene synthase or the activity of a terpene synthase modified for an existing variety refers to the expression ability of a gene encoding a terpene synthase for an existing variety. Include plants that have increased and decreased, and plants that have increased and decreased activity of terpene synthase relative to existing varieties.
  • the present invention also includes a plant in which the expression ability of a gene encoding such a terpene synthase or the activity of a terpene synthase is modified with respect to an existing variety.
  • the difference in terpene synthesis ability between individuals and varieties can be clarified using the expression ability and expression level of the terpene synthase gene of the present invention and the mutation and polymorphism of the gene as an index. That is, by comparing and identifying the expression ability, expression level, mutation and polymorphism of the gene with respect to existing varieties by the above method, and further comparing and analyzing the synthesis ability and synthesis amount of existing varieties and terpenes, It is possible to clarify the relationship between gene expression ability and expression level, mutation and polymorphism, and terpene synthesis ability.
  • the expression level and expression ability of a gene encoding a terpene synthase having a plastid transfer signal of the present invention (for example, the gene represented by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4), and By comparing and identifying mutations and polymorphisms in the gene and the expression control region of the gene with respect to existing varieties, monoterpenes synthesized with plastids, for example, varieties with altered linalool synthesis ability Can be selected and established.
  • the expression level and expression ability of a gene encoding a terpene synthase having no plastid transfer signal of the present invention for example, the gene represented by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16
  • the gene and the gene By selecting and establishing mutations and polymorphisms in the expression regulatory region of existing varieties, and selecting and establishing varieties that have altered the ability to synthesize sesquiterpenes such as nerolidol in cytosol be able to. “Synthetic ability is altered” means that the amount of monoterpenes and / or sesquiterpenes synthesized is increased or decreased relative to existing varieties.
  • the activity of the terpene synthase having the plastid translocation signal of the present invention is changed based on mutation or polymorphism.
  • a change in activity based on mutation or polymorphism in a terpene synthase for example, the enzyme represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15
  • a change in activity based on mutation or polymorphism in a terpene synthase for example, the enzyme represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15
  • RNA was isolated and cDNA was made with reverse transcriptase.
  • the cDNA plasmid library was constructed using the yeast expression vector pDR196.
  • the first strand of cDNA was synthesized using an oligo (dT) 18 anchor primer containing an XhoI restriction site.
  • a blunt end adapter containing an EcoRI restriction site was ligated to the double stranded DNA, and the fragment was then incorporated into a plasmid with the constitutive promoter PMA1, pDR196.
  • a plasmid was extracted to determine the base sequence of 12,288 5 ′ end. As a result of clustering analysis, it was found to contain 1597 cluster gene sequences.
  • Example 2 Cloning of candidate cDNA
  • the above-mentioned cluster gene is compared with the amino acid sequence database (Database: NCBI / blast / db / FASTA / 2008_09_05_09_00_0 / nr 6,937,173 sequences; 2,395,280,820 total letters)
  • BLASTX 2.2.10 Altschul et al. 1997 Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402
  • the gene fragment shown was found.
  • the restriction enzymes used were AccI and ClaI. Each restriction enzyme was reacted with 3 ⁇ g of DNA at 37 ° C. for 3 hours and treated at 70 ° C. for 15 minutes to inactivate the enzymes. Ligation was performed using T4 Ligase (BioLabs), and amplification was performed by PCR using this as a template. The PCR reaction was performed using ExTaq polymerase (TaKaRa) according to the general reaction composition, 2 minutes at 94 ° C denature, followed by 1 minute at 94 ° C denature, 1 minute at 50 ° C annealing, 5 minutes at 72 ° C extension. The reaction was carried out for 30 cycles for 30 minutes, and finally for 10 minutes at an extension of 72 ° C. The amplified fragment was cloned with TOPO TA cloning kit (Invitrogen), and the sequence was analyzed to confirm that it was an unknown upstream sequence.
  • TOPO TA cloning kit Invitrogen
  • Primers were designed in the 5'UTR region upstream from the predicted translation initiation methionine of the obtained upstream sequence and the 3'UTR region downstream from the stop codon (04_L185'UTR; GTGCTGTATCCGCCAGCTTCG (SEQ ID NO: 8), 04_L18R1; CTGAGGTTTAACTATTTCTCTGTCC (sequence No. 9))
  • CTAB Cetyltrimethylammonium bromide
  • Amplification by PCR was performed using the single-stranded cDNA synthesized by (Invitrogen) as a template.
  • the PCR reaction was performed using ExTaq polymerase (TaKaRa) according to the general reaction composition, 2 minutes at 94 ° C denature, followed by 1 minute at 94 ° C denature, 1 minute at 50 ° C annealing, 2 minutes at 72 ° C extension.
  • the reaction was performed for 30 cycles for 30 minutes, and finally, at an extension of 72 ° C for 5 minutes.
  • the amplified fragment was cloned with TOPO TA cloning kit (Invitrogen), and the sequence was analyzed.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 the protein encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is represented as “HlLIS / NES-1”, and has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the protein encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 is referred to as “HlLIS / NES-2”.
  • Example 4 Expression system and terpene synthesis using E. coli HlLIS / NES-1 and HlLIS / NES-2 are ChloroP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/) and According to the program of WoLF PSORT (http://wolfpsort.org/), it is thought to have a plastid translocation signal sequence, which can be detrimental to protein expression in E. coli and should be removed.
  • a primer was designed so that 43 amino acids were deleted from the start methionine, and a primer paired therewith was designed as a stop codon site (Nde1-04_L18F; CATATGAGACGCTCAGCTAGTTACCATCC (SEQ ID NO: 10), Nde1-04_L18R; CATATGTCACTCCCCAACTCCATCGGTTTG (SEQ ID NO: 11)).
  • NdeI sequence was added to each primer, and the ATG in NdeI was designed to be the start codon.
  • the PCR reaction was performed using ExTaq polymerase (TaKaRa) according to the general reaction composition, 2 minutes at 94 ° C denature, followed by 1 minute at 94 ° C denature, 1 minute at 57 ° C annealing, 2 minutes at extension 72 ° C. The reaction was performed for 30 cycles for 30 minutes, and finally, at an extension of 72 ° C. for 5 minutes.
  • the amplified fragment was cloned with TOPO TA cloning kit (Invitrogen), and transformed into E. coli and extracted with a general method. This plasmid was treated with NdeI at 37 ° C.
  • PAC-Mev is a gene group of the mevalonate pathway derived from streptmycesmysp.CL190 (MVA kinase, DPMVA decarboxylase, PMVA kinase, IPP isomerase, HMG CoA reductase, HMG CoA synthasse), tac promoter, rrnB terminator, ram It is a pAC plasmid having a phenicol resistance gene.
  • pET-HlLIS / NES-1 and pET-HlLIS / NES-2 and pAC-Mev were co-introduced into E. coli BL21 (DE3), and terpenes were prepared according to the method of Harada et al. And recovery with dodecane.
  • Example 5 Analysis of synthesized terpenes
  • HlLIS / NES-1 and HlLIS / NES2 are recovered in the dodecane layer. 1 ⁇ l of the collected dodecane layer was subjected to GC-MS analysis. GC-MS analysis was performed according to the method of Harada et al. (2009 Appl Microbiol Biotechnol 81: 915-925). As a result, HlLIS / NES-1 had retention times at 24.550 and 36.216 minutes, and HlLIS / NES-2 had retention times at 24.534 and 36.197 minutes. Was detected (FIGS. 1A (i) (ii), peaks indicated by circles).
  • FIG. 1D and FIG. 1E are the MS analysis results of the samples of linalool and nerolidol, respectively, which are consistent with the MS analysis results of the peaks detected at the retention times of 24.550 / 24.534 minutes and 36.216 / 36.197 minutes. From these results, it was confirmed that linalool and nerolidol were produced in Escherichia coli co-introduced with pET-HlLIS / NES-1 and pET-HlLIS / NES-2 and pAC-Mev.
  • HlLIS / NES-1 and HlLIS / NES-2 are enzymes that produce linalool and nerolidol. That is, HlLIS / NES-1 and HlLIS / NES-2 synthesize linalool and nerolidol using geranyl diphosphate and farnesyl diphosphate as substrates (FIGS. 2A and 2B).
  • HlLIS / NES-1 sequence comparison and phylogenetic analysis Since the subsequent amino acid sequences of HlLIS / NES-1 and HlLIS / NES-2 are very similar, HlLIS / NES-1 Used as a representative.
  • HlLIS / NES-1 is an enzyme that produces linalool and nerolidol. Enzymes with such activity are Qualcomm (Dinesh AN 2008 The Plant Journal 55 224-239; AmNESLIS-1 (accession no. EF433761) and AmNESLIS-2 (EF433762)) and strawberry (Asaph A. et al. 2004 The Plant Cell 16 3110-3131; FaNES (CAD57106)).
  • amino acid sequences between the enzymes were compared (FIGS. 3A-C).
  • HlLIS / NES-1 is classified into a different cluster from Qualcomm terpene synthases AmNESLIS-1 and AmNESLIS-2 and strawberry terpene synthase FaNES, which also have the enzymatic activities of synthesizing linalool and nerolidol. It was found that the relationship was far from gene evolution. It is also classified into different clusters from linalool synthases of plants such as Picea abies, Clarkia breweri, Arabidopsis thaiana, Artemisisa annua, Perilla citriodora, Perilla frutescens. This indicates that HlLIS / NES-1 has a very unique amino acid sequence.
  • Example 7 Determination of genome sequence encoding HlLIS / NES-1 From the leaves of Kirin No. 2, DNA was extracted using Nucleon PhytoPure (GE Healthcare Bioscience). Using this DNA as a template, the following primer pair (04_L185'UTR; GTGCTGTATCCGCCAGCTTCG (SEQ ID NO: 12)), 04_L18R1; CTGAGGTTTAACTATTTCTCTGTCC (SEQ ID NO: 13)), genomic base sequence encoding HlLIS / NES-1 by PCR Fragment amplification was performed.
  • the PCR reaction was performed using ExTaq polymerase (TaKaRa) according to the general reaction composition, 2 minutes at 94 ° C denature, followed by 1 minute at 94 ° C denature, 1 minute at 50 ° C annealing, 2 minutes at 72 ° C extension. The reaction was performed for 30 cycles for 30 minutes, and finally, at an extension of 72 ° C. for 5 minutes.
  • the amplified fragment was cloned with TOPO TA cloning kit (Invitrogen), and the sequence was analyzed to reveal the genomic nucleotide sequence encoding HlLIS / NES-1.
  • sequence up to the poly (A) addition site is known from the sequence data of the gene library, and 2,752 bp added thereto is shown in SEQ ID NO: 5.
  • Example 8 Analysis of two kinds of transcripts by RT-PCR method As a result of further analysis of the genomic nucleotide sequence encoding HlLIS / NES-1, it was found in the first intron (75 bp) shown in FIG. This suggests that ATG may exist and that there is a transcript with this translation initiation methionine.
  • a primer containing this ATG was designed (2ndM-F; ATGCATATAACACAGAATAAAGCTAAGATTTTG (SEQ ID NO: 14)), and primer 04_L18R (SEQ ID NO: 9) designed for 3′UTR was used.
  • the cDNA base sequence and genomic base sequence were amplified in the same manner as in Example 3. All PCR reactions were carried out using ExTaq polymerase (TaKaRa) according to the general reaction composition, 2 minutes at 94 ° C denature, followed by 1 minute at 94 ° C denature, 1 minute at 50 ° C annealing, 72 ° C extension The reaction was performed for 30 minutes for 1 minute and 30 seconds, and finally for 5 minutes at an extension of 72 ° C.
  • HlLIS / NES-1 first intron is used as the translation start point, and the HlLIS / NES-1 first intron and HlLIS / NES-1 second exon are combined to form the first exon.
  • Fig. 6 This is HlLIS / NES-3, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 15, and the genome base sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 16.
  • HlLIS / NES-1 has a plastid translocation signal
  • HlLIS / NES-3 does not have a plastid translocation signal.
  • Monoterpenes have also been synthesized in plastids, and sesquiterpenes have been synthesized in cytosol (Rodriguez-Concepcion and Boronat 2002 Plant Physiol 130: 1079-1089).
  • HlLIS / NES-1 migrates to plastid by its plastid translocation signal and functions to synthesize linalool, a monoterpene, and HlLIS / NES-3 has no plastid translocation signal. It was suggested that it functions in the synthesis of nerolidol, a terpene.
  • HlLIS / NES-1 and HlLIS / NES-3 were performed among multiple hop varieties.
  • three varieties of “Hallertauerer Mfr.” And “Hersbrucker” were used.
  • HlLIS / NES-1 specific primer pair (04_L18 5'UTR-F3; AGCATTCGGCAATTTAAACGGTCAG (SEQ ID NO: 17), HlLIS / NES GSP 2.3ex; CTCTAAATCTGTCAAACACATCAGAGCC (SEQ ID NO: 18)) and HlLIS / NES-
  • the presence or absence of amplification by a PCR reaction was examined using a 3-specific primer pair (2ndM-F (SEQ ID NO: 14), HlLIS / NES GSP 2.3ex (SEQ ID NO: 18)).
  • GAPDH gene primary pair (GAPDH ori-F; GGTGTCAGGAACCCTGAAGAAATCC (SEQ ID NO: 19), GAPDH ori-R; GGAGCAAGGCAATTGGTAGTGCAAC (SEQ ID NO: 20)) was confirmed.
  • Example 9 Comparison of genome sequences of HlLIS / NES-1 and HlLIS / NES-3 among varieties Nucleon PhytoPure (from “Kirin 2", “Hallertauerer Mfr.” And “Hersbrucker") Using DNA extracted by GE Healthcare Biosciences as a template, a primer designed in the 5'UTR region (04_L185'UTR (SEQ ID NO: 12)) and a primer designed in the stop codon site of HlLIS / NES-1 (Nde1 PCR reaction was performed using -04_L18R (SEQ ID NO: 11).
  • Non-Patent Document 2 There is a difference in the amount of terpenes produced between hop varieties (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 2 By utilizing the genomic base sequence and cDNA base sequence clarified in the present invention, mutations and / or polymorphisms are detected, varietal characteristics relating to the synthesis of linalool and nerolidol, and plant body selection are performed. I can do it.
  • the present invention provides an enzyme that synthesizes hop monoterpenoids and sesquiterpenoids, a DNA encoding the terpenoid synthase, a method for synthesizing terpenoids using the enzyme, and a pharmaceutical or quasi-drug component or food. And can be used as a fragrance for cosmetics.
  • a line selection method using the DNA is provided, which is useful for breeding useful hop varieties.

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Abstract

　ホップ（Humulus）のテルペン類合成酵素のDNAの提供。　ホップのテルペン類酵素活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードする遺伝子を用いて新規の生物を作成・検定する方法。

Description

新規のテルペン類合成酵素活性を有するタンパク質とそれをコードする遺伝子
　本発明は、ホップのモノテルペノイドとセスキテルペノイドを合成する酵素、当該テルペン類合成酵素をコードするDNA、当該酵素を用いてテルペン類を合成する方法、および当該DNAを用いた育種や選抜方法に関する。
　テルペンとはイソプレンを基本単位として構成される炭化水素であり、官能基を持つ誘導体はテルペノイドと呼ばれ多様性に富む。植物・昆虫・菌類等の生体内で合成され、特に植物中には精油の主成分として豊富に含まれている。植物で合成されるテルペノイドは、病原体、害虫、益虫、草食動物、および植物同士の相互作用において役割を担うと考えられている。その芳香性から飲料・食品や化粧品の香料原料として利用される他、抗菌性や抗腫瘍性等も有することから医薬品原料としても利用できる。
　テルペン類生合成の基質となるのは、C10のゲラニル二リン酸、C15のファルネシル二リン酸、およびC20のゲラニルゲラニル二リン酸などであり、テルペン類合成酵素の触媒反応により、それぞれモノテルペン、セスキテルペン、およびジテルペンへと変換される。
　アサ科のホップは雌雄異株の蔓性植物であり、その毬花はビール醸造の主要原料となっている。ビール原料としてのホップの役割は、苦味、香味、泡立ち、保存性の向上等である。ホップ毬花のルプリン腺毛では豊富な二次代謝産物が合成されており、その内の精油成分にモノテルペンやセスキテルペンが含まれている（非特許文献１）。これらテルペン類は、アロマ成分としてビールの香味を決定する重要な因子である。
　ホップ毬花中の含有量が高いテルペン類として、モノテルペンであるミルセン、セスキテルペンであるα－フムレンやβ－カリオフィレン等が知られている（非特許文献２）。これらホップ中のテルペン類についてはその合成酵素について研究が進められ、近年、ミルセン、α－フムレン、β－カリオフィレンを合成する酵素の遺伝子が同定されている（非特許文献３）。モノテルペンアルコールであるリナロールは精油成分の1%を占めることもある。フローラル香の代表成分であり、ホップアロマ香の指標物質に提案されている重要な成分である（非特許文献４）。しかしながら、ホップにおけるリナロールの生成機構や酵素活性、ならびに酵素遺伝子は未だ同定されていない。一方、ネロリドールは、ホップ精油や製品であるビールにもまれに検出される成分であり（非特許文献２と４）、フローラル香とともにウッデイ香・柑橘香を示す。リナロールと同様にホップにおける生成機構や酵素活性ならびに酵素遺伝子は未だ同定されていない。
　これまでに、リナロールの含有量に着目したランダムなｃＤＮＡによるＲＦＬＰ法（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法）を用いた育種マーカーが報告されている（特許文献１）。一般にＤＮＡマーカーは、そのＤＮＡマーカーを持っている特定の品種を用いた育種でのみ有効である。また、遺伝子そのものをマーカーにしない場合は、一定の確率、つまりＤＮＡマーカーと当該遺伝子との連鎖が切れた場合では、期待される形質を示さないものがＤＮＡマーカーで示されるため精度に課題が残る。この点からも遺伝子そのものが同定され、遺伝子そのものを育種マーカーとして利用することが育種マーカーとしても優れている。
WO2008/053834
小若雅弘、島津武、橋本直樹 (1976) 醸協 72 21-34 Katsiotis S T, Langezaal C R, Scheffer J J C, Verpoorte R (1989) Flavour Fragr J 4 187-191. Wang G, Tian L, Aziz N, Broun P, Dai X, He J, King A, Zhao PX, Dixon RA (2008) Plant physiology 148: 1254-1266 小野美代子 (1999) 「醸造物の成分」日本醸造協会 250-272
　本発明は、ホップのモノテルペノイドとセスキテルペノイドを合成する酵素、当該テルペン類合成酵素をコードするDNA、当該酵素を用いてテルペン類を合成する方法、および当該DNAを用いたホップの特性評価および育種選抜方法の提供を課題とした。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ホップにおいてこれまでに見つかっていない、新規のテルペン類合成酵素遺伝子を同定した。当該遺伝子を大腸菌において発現させることにより、ゲラニル二リン酸からモノテルペンであるリナロールを、ファルネシル二リン酸からセスキテルペンであるネロリドールを合成できることを明らかにした。また、プラスチド移行シグナルを伴うおよび当該シグナルを伴わない２つのタイプのテルペン類合成酵素遺伝子を同定し、これらがそれぞれリナロールおよびネロリドールの合成に関与していることを見出した。これにより、当該酵素を用いたテルペン類の合成、当該遺伝子を用いたホップ品種の特性評価、育種選抜が可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　即ち、本発明は以下の発明を包含する。
[１]　以下の(a)～(c)のいずれかのタンパク質：
　(a) 配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質； 
　(b) 配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、テルペン類合成酵素活性を有するタンパク質;ならびに
　(c) 配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸配列と85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、テルペン類合成酵素活性を有するタンパク質。
[２]　以下の(d)～(g)のいずれかのDNAからなる遺伝子：
　(d) 配列番号２または配列番号４に示す塩基配列からなるDNA；
　(e) 配列番号２または配列番号４に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テルペン類合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；
　(f) 配列番号２または配列番号４に示す塩基配列と85％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、テルペン類合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；および
　(g) 配列番号２または配列番号４に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。
[３]　以下の(h)～(j)のタンパク質：
　(h) 配列番号１５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
　(i) 配列番号１５に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、テルペン類合成酵素活性を有するタンパク質；ならびに
　(j) 配列番号１５に示すアミノ酸配列と85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、テルペン類合成酵素活性を有するタンパク質。
[４]　以下の(k)～(n)のいずれかのDNAからなる遺伝子：
　(k) 配列番号１６に示す塩基配列からなるDNA；
　(l) 配列番号１６に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テルペン類合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；
　(m) 配列番号１６に示す塩基配列と85％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、テルペン類合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；および
　(n) 配列番号１６に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。
[５]　[２]または[４]の遺伝子を含有する組換えベクター。
[６]　[５]の組換えベクターを導入した形質転換体。
[７]　植物体である[６]の形質転換体。
[８]　(i) ゲノムDNAまたはRNAである核酸を植物から単離する工程、
(ii) (i)の核酸がRNAである場合に、逆転写してcDNAを合成する工程、
(iii) (i)または(ii)の工程で得られたDNAから[２]もしくは[４]の遺伝子、または配列番号５に示す塩基配列を含有する遺伝子断片を増幅する工程、
(iv) (iii)で増幅したDNA中に突然変異および／または多型の存在を、それぞれ対応する配列番号２、配列番号４もしくは配列番号１６または配列番号５に示す塩基配列と比較して決定する工程、
これらの工程を含む、植物におけるテルペン類合成酵素をコードする遺伝子の突然変異および／または多型の存在を検出する方法。
[９]　植物がホップ属植物である[８]の方法。
[１０]　[８]または[９]の方法によってテルペン類合成酵素をコードする遺伝子の突然変異および／または多型を検出し、突然変異および／または多型を有する植物体を選抜する方法。
[１１]　テルペン類合成酵素をコードする遺伝子の発現能またはコードするテルペン類合成酵素の活性が、既存品種に比較して改変されている植物を選抜することをさらに含む、[１０]の植物体を選抜する方法。
[１２]　選抜される植物体が既存品種に比較してリナロールおよび／またはネロリドールの合成能が改変されている、[１１]の植物体を選抜する方法。
[１３]　[１０]～[１２]のいずれかの方法によって選抜された、植物体。
[１４]　ホップ属植物である[１３]の植物体。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-295889号、2010-038797号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明により、ホップ属植物においてモノテルペノイドとセスキテルペノイドを合成する酵素、当該テルペン類合成酵素をコードするDNA、当該酵素を用いてテルペン類を合成する方法、および当該DNAを用いた育種や選抜方法等が提供される。特に、ビール醸造において非常に重要視されている、モノテルペンアルコールの一つであるリナロールを合成する酵素、リナロール合成酵素をコードするDNAが本発明において提供されており、当該DNAを用いた育種や選抜方法を実用化できる。
(i)pET-HlLIS/NES-1およびpAC-Mevを共導入した大腸菌培養液のドデカン抽出物を、ガスクロマトグラフィー（GC）で分析した結果を示した図である。(ii)pET-HlLIS/NES-2およびpAC-Mevを共導入した大腸菌培養液のドデカン抽出物を、ガスクロマトグラフィー（GC）で分析した結果を示した図である。 (i)図１Ａ(i)におけるRT（保持時間：分）24.550のピークのドデカン抽出物について、質量スペクトル（MS）を示したグラフである。(ii)図１Ａ(ii)におけるRT（保持時間：分）24.534のピークのドデカン抽出物について、質量スペクトル（MS）を示したグラフである。 (i)図１Ａ(i)におけるRT36.216のピークのドデカン抽出物について、MSを示したグラフである。(ii)図１Ａ(ii)におけるRT36.197のピークのドデカン抽出物について、MSを示したグラフである。 リナロール標品のMSを示したグラフである。 ネロリドール標品のMSを示したグラフである。 ゲラニル二リン酸からリナロールが合成される反応を簡易に示した図である。 ファルネシル二リン酸からネロリドールが合成される反応を簡易に示した図である。 HlLIS/NES-1のアミノ酸配列(配列番号１)とキンギョソウのテルペン類合成酵素AmNESLIS-1のアミノ酸配列を示した図である。GENETYX（ゼネティックス社）で解析を行った。 HlLIS/NES-1のアミノ酸配列(配列番号１)とキンギョソウのテルペン類合成酵素AmNESLIS-2のアミノ酸配列を示した図である。GENETYX（ゼネティックス社）で解析を行った。 HlLIS/NES-1のアミノ酸配列(配列番号１)とイチゴのテルペン類合成酵素FaNESのアミノ酸配列を示した図である。GENETYX（ゼネティックス社）で解析を行った。 HlLIS/NES-1の分子進化系統樹解析の結果を示す図である。解析において、キンギョソウのテルペン類合成酵素AmNESLIS-1および同2やイチゴのテルペン類合成酵素FaNESを始め、様々な植物のテルペン類合成関連酵素を比較対照に用いた。 HlLIS/NES-1のイントロン・エクソン構造を示した図である。 HlLIS/NES-1とHlLIS/NES-3の転写様式を示した図である。それぞれ、上段がイントロンを含むゲノム塩基配列、下段がスプライシング後のcDNA塩基配列を表す。黒矢印：エクソン；白矢印：イントロン；四角枠：プラスチド移行シグナルの部位。 「キリン2号」、「Hallertauer Mfr.」および「Hersbrucker」の3品種におけるHlLIS/NES-1およびHlLIS/NES-3のRT-PCRによる増幅を示した図である。対照にはGAPDHを用いた結果を示す。 「キリン2号(Kirin 2)」、「Hallertauer Mfr.」および「Hersbrucker」の3品種におけるHlLIS/NES-1およびHlLIS/NES-3のN末端側ゲノム塩基配列を比較した図である。GENETYX（ゼネティックス社）で解析を行った。HlLIS/NES-1のエクソン配列およびイントロン配列を、それぞれ実線および点線の矢印で示し、HlLIS/NES-3のエクソン配列を二重線の矢印で示した。また、HlLIS/NES-1およびHlLIS/NES-3の翻訳開始メチオニンにあたるATGを、それぞれ実線枠および二重線枠で示した。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．新規のテルペン類合成酵素
　本発明のタンパク質は、プラスチド移行シグナルを有し、かつゲラニル二リン酸およびファルネシル二リン酸を基質とし、モノテルペノイドであるリナロール、およびセスキテルペノイドであるネロリドールを合成する活性を持つ酵素である。
　また本発明のタンパク質は、プラスチド移行シグナルを有さず、かつゲラニル二リン酸およびファルネシル二リン酸を基質とし、モノテルペノイドであるリナロール、およびセスキテルペノイドであるネロリドールを合成する活性を持つ酵素である。
　本発明の酵素は、ホップ(Humulus lupulus）等のホップ属（カラハナソウ属）植物由来のテルペン類合成酵素である。ホップ属植物には、ホップ（Humulus lupulus)、カラハナソウ（Humulus lupulus var. cordifolius)、カナムグラ(Humulus japonicus）等が含まれる。
　本発明の酵素の全長アミノ酸配列は、配列番号１または３に示される。さらに、本発明のタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列または配列番号３に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、プラスチド移行シグナルを有し、かつテルペン類合成酵素活性を有するタンパク質を包含する。
　また本発明の酵素の全長アミノ酸配列は、配列番号１５に示される。さらに、本発明のタンパク質は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、プラスチド移行シグナルを有さず、かつテルペン類合成酵素活性を有するタンパク質を包含する。
　ここで、実質的に同一のアミノ酸配列としては、当該アミノ酸配列に対して１または複数もしくは数個(１～10個、好ましくは１～７個、さらに好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個、さらに好ましくは１個もしくは２個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有しているアミノ酸配列が挙げられる。
　配列番号１または３に示されるアミノ酸配列を有する酵素と配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する酵素とは、同一の遺伝子中にコードされるが、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する酵素は、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列を有する酵素をコードするゲノムDNAの第1イントロン中のメチオニンを翻訳開始点としており、それより下流の第1イントロンと第2エクソンを組み合わせて第1エクソンとして含んでおり、この点において、両者は異なる。配列番号１５に示されるアミノ酸配列中16-538位のアミノ酸位置は、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列中68-590位のアミノ酸位置に対応する。テルペン類合成に寄与する酵素の活性部位は、当該対応するアミノ酸位置内に存在する。
　配列番号１または３に示されるアミノ酸配列を有する酵素は、プラスチド移行シグナルを有するためにプラスチドにてモノテルペン類、例えばリナロールの合成に関与し、一方配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する酵素はプラスチド移行シグナルを有さないためにサイトゾルにてセスキテルペン類、例えばネロリドールの合成に関与する。
　本発明のテルペン類合成酵素は、植物体から単離された天然のテルペン類合成酵素および遺伝子工学の手法により製造されたリコンビナントのテルペン類合成酵素を含む。
２．テルペン類合成酵素をコードする遺伝子
　本発明の遺伝子は、プラスチド移行シグナルを有し、ゲラニル二リン酸およびファルネシル二リン酸を基質とし、モノテルペノイドであるリナロールおよびセスキテルペノイドであるネロリドールを合成する活性を持つ酵素をコードする遺伝子であり、上記のプラスチド移行シグナルを有し、かつテルペン類合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
　また本発明の遺伝子は、プラスチド移行シグナルを有さず、かつゲラニル二リン酸およびファルネシル二リン酸を基質とし、モノテルペノイドであるリナロールおよびセスキテルペノイドであるネロリドールを合成する活性を持つ酵素をコードする遺伝子であり、上記のプラスチド移行シグナルを有さず、かつテルペン類合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
　本発明の遺伝子のDNAの塩基配列は、配列番号２または４に示される。さらに、配列番号２または４に示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、配列番号２または４に示される塩基配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有しているDNA、または前記DNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１または複数もしくは数個(１～10個、好ましくは１～７個、さらに好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個、さらに好ましくは１個もしくは２個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAであって、プラスチド移行シグナルを有し、かつテルペン類合成酵素活性を有するタンパク質を有するタンパクをコードするDNAを包含する。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１XSSC、0.1％ SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5XSSC、0.1％ SDS、42℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2XSSC、0.1％ SDS、65℃」程度の条件である。さらに、本発明の遺伝子は、配列番号２または４に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNAを包含する。
　本発明の遺伝子のDNAの塩基配列は、配列番号１６に示される。さらに、配列番号１６に示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、配列番号１６に示される塩基配列と、BLAST等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有しているDNA、または前記DNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１または複数もしくは数個(１～10個、好ましくは１～７個、さらに好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個、さらに好ましくは１個もしくは２個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAであって、プラスチド移行シグナルを有さず、かつテルペン類合成酵素活性を有するタンパク質を有するタンパクをコードするDNAを包含する。
　配列番号２または４に示される塩基配列は上記配列番号１または３に示されるアミノ酸配列を有する酵素をそれぞれコードする。配列番号１６に示される塩基配列は上記配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する酵素をコードする。
　したがって、上記の通りこれらの遺伝子にコードされる酵素は同一の遺伝子に由来するものであり、配列番号１６に示される塩基配列において46-1614位の塩基位置は、配列番号２または４に示される塩基配列中202-1770位の塩基位置に対応する。テルペン類合成に寄与する酵素の活性部位は、当該対応する塩基位置内にコードされる。
３.組換えベクター
　本発明のベクターは、上記配列番号２または配列番号４のDNAからなる遺伝子が挿入された組換えベクターである。また本発明のベクターは、上記配列番号１６のDNAからなる遺伝子が挿入された組換えベクターである。ベクターとしては公知の大腸菌用、植物細胞用、昆虫細胞用等のものを広く使用できる。本発明において使用されるベクターには、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等の遺伝子の発現や抑制に関する構成要素が組込まれ、必要に応じて、選択マーカー（例えば、薬物耐性遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、レポーター遺伝子）を含有する。遺伝子の発現や抑制に関する構成要素は、その性質に応じて、それぞれが機能し得る形で組換えベクターに組み込まれることが好ましい。そのような操作は、当業者であれば適切に行うことができる。
４．形質転換体
　本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを保持する形質転換体である。形質転換体は、酵素をコードする遺伝子を挿入した組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。宿主は、ベクターに適したものを使用すればよい。例えば、大腸菌、植物細胞、昆虫細胞（Sf9など）、植物ウイルスなどが挙げられる。好ましくは、大腸菌、植物細胞または植物ウイルスなどが挙げられる。組換えベクターの導入方法は、微生物にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, S.N.et al. 1972 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110）、エレクトロポレーション法、トリペアレンタルメイティング(tri-parental mating）法等が挙げられる。また、形質転換植物体を作製する方法として、ウイルス、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド等をベクターとして用いる方法が挙げられる。宿主植物としては、イネ、ムギ、トウモロコシ等の単子葉植物、ダイズ、ナタネ、トマト、バレイショ等の双子葉植物が挙げられる。形質転換植物体は、本発明の遺伝子で形質転換した植物細胞を再生させることにより得ることができる。
　植物細胞からの植物体の再生は公知の方法により行うことができる。
５．テルペン類合成酵素の製造方法
　本発明のテルペン類合成酵素は、本発明の核酸および核酸を組み込んだベクターを含む細胞を培養させ、あるいは本発明の核酸および核酸を組み込んだベクターを含む植物体より回収することができる。細胞の培養条件、および植物の成長条件は、細胞の種類等の条件に応じて適宜選択され、当業者に公知の方法により行うことができる。テルペン類合成酵素の抽出作業、精製方法も公知の方法により行うことが出来る。
　さらに、本発明のテルペン類合成酵素は、例えば、本発明の遺伝子で形質転換した大腸菌等の微生物発現系を用いた大量生産により製造することができ、また、上記の形質転換植物体中で本発明の遺伝子を発現させることにより得ることができる。形質転換体の培養は公知の培地を用いて公知の方法で行えばよい。
６．形質転換体を用いたテルペン類の生産
　本発明のテルペン類合成酵素は、大腸菌等の微生物発現系において高い活性を持ったタンパク質として発現できるため、形質転換した大腸菌等の微生物発現系の培養液に前記テルペン類合成酵素の基質を添加することにより、テルペン類を生産することができる。例えば、形質転換した大腸菌の培養液に、ゲラニル二リン酸およびファルネシル二リン酸を基質として投与することにより、リナロールおよびネロリドールを効率的に大量に生産することが可能である。
　また、本発明のテルペン類合成酵素を、本発明の遺伝子で形質転換した植物細胞や植物体で発現させることにより、リナロールやネロリドールを植物で効率的に生産することができる。一部の例外を除いて、一般的にモノテルペン類合成の基質であるゲラニル二リン酸およびセスキテルペン類合成の基質であるファルネシル二リン酸は、植物細胞において、それぞれプラスチドの非メバロン酸経路およびサイトゾルのメバロン酸経路に由来し、各基質の合成の場もそれぞれプラスチドおよびサイトゾルと考えられている。したがって、例えば、モノテルペン類であるリナロールを合成するのであれば、本発明のプラスチド移行シグナルを有するテルペン類合成酵素をコードする遺伝子（例えば、配列番号２または４に示す塩基配列からなるDNA）を用いて形質転換を行うことにより、発現されたテルペン類合成酵素はそのプラスチド移行シグナルによりプラスチドへと移動し、当該プラスチドにて合成されたゲラニル二リン酸を基質としてリナロールを効率的に生産することができる。また、セスキテルペン類であるネロリドールを合成するのであれば、本発明のプラスチド移行シグナルを有さないテルペン類合成酵素をコードする遺伝子（例えば、配列番号１６に示す塩基配列からなるDNA）を用いて形質転換を行うことにより、発現されたテルペン類合成酵素はプラスチド移行シグナルを有さないためにサイトゾル中に存在し、当該サイトゾルにて合成されたファルネシル二リン酸を基質としてネロリドールを効率的に生産することができる。
　テルペン類を合成する際に使用する大腸菌や植物を始めとした各種細胞は、例えば、テルペン類合成の基質となるゲラニル二リン酸やファルネシル二リン酸の産生を促進するメバロン酸経路の酵素や、それらをコードする遺伝子等を含んでいても良く、そのことによりテルペン類の増産が可能となる。
　上記のように、本発明のテルペン類合成酵素およびテルペン類合成酵素をコードする遺伝子を用いて、ゲラニル二リン酸やファルネシル二リン酸等から、リナロールやネロリドール等のテルペン類を生産することができる。得られたテルペン類は、その芳香性から食品や化粧品の香料原料として利用でき、また、抗菌性や抗腫瘍性等も有することから医薬品原料としても利用可能である。
７．形質転換植物
　本発明のテルペン類合成酵素遺伝子を導入した植物体においては、通常の植物と比較してリナロールまたはネロリドールの産生量を増大させることが可能である。テルペン類は、微生物や害虫との相互作用に関与しており、本発明により病虫害耐性を増強した植物体を作出することが可能である。また、リナロールあるいはネロリドールを持たない植物においても、本発明の遺伝子を導入することによってこれらを合成させることもできる。
　また、上記のとおり本発明のプラスチド移行シグナルを有するテルペン類合成酵素をコードする遺伝子またはプラスチド移行シグナルを有さないテルペン類合成酵素をコードする遺伝子を選択して導入することによって、発現されたテルペン類合成酵素の局在を制御することができ、通常の植物と比較して、例えばリナロールまたはネロリドールの産生量を選択的に増大させることが可能である。
８.遺伝子変異、多型個体、遺伝子発現変異の選抜
　本発明は、植物におけるテルペン類合成酵素遺伝子突然変異、一塩基多型（SNP)等の多型、遺伝子発現変異の存在を検出するための方法を提供する。
　変異個体は放射線によるもの、化学処理によるもの、UV照射によるもの、自然突然変異によるものであっても構わない。
　この方法には、ゲノムDNAやRNAを変異個体や様々な品種や育成個体の植物から単離し、後者は逆転写しcDNAを合成する工程と、DNA増幅技術の使用によりDNAからテルペン類合成酵素遺伝子を含有する遺伝子断片を増幅する工程と、このDNA中に突然変異の存在を決定する工程が含まれる。DNAやRNAを抽出する方法には市販のキット（例えばDNeasyやRNeasy (キアゲン社)など）が使用できる。cDNAを合成する方法も市販キット（例えばスーパースクリプト ファーストストランド システム（インビトロジェン社）など）を使うことができる。DNA増幅技術の使用により遺伝子断片を増幅する方法としては、いわゆるPCR法やLAMP法などの技術を用いることができる。これらは継続的なポリメラーゼ反応により特異的なDNA配列の増幅（つまり、コピー数を増やすこと）を達成するためにポリメラーゼを使用することを基にした、一群の技術を意味する。この反応は、クローニングの代わりに使用することができるが、必要であるのは、核酸配列に関する情報のみである。DNAの増幅を行うために、増幅しようとするDNAの配列に相補的なプライマーを設計する。次にそのプライマーを自動DNA合成により作成する。DNA増幅方法は、当技術分野で周知であり、本明細書中で与えられる教示及び指示に基づき、当業者であれば容易に行うことができる。いくつかのPCR法（ならびに関連技術）は、例えば、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、同第4,800,159号、同第4,965,188号、およびInnisら編、PCR Protocols:A guide to method and applicationsで述べられている。
　DNA中に突然変異や多型の存在を決定する工程では塩基配列の決定（アプライドバイオシステムズ社）やミスマッチペアの片側を切断する酵素を用いて突然変異体を検出するTILLING法（Till et al. 2003 Genome Res 13:524-530）など変異遺伝子と正常遺伝子の相同性を利用し検出する方法を用いればよい。これらは該技術から得られた配列データを遺伝子部分に関する配列番号２もしくは配列番号４または配列番号１６で表される塩基配列と比較することで行うことができる。
　mRNA量の違いによる変異を決定する工程では上記cDNAに対し、配列番号２もしくは配列番号４または配列番号１６で表される塩基配列に基づいて作製したプライマーを利用してリアルタイムPCR法（ロシュ・ダイアグノスティックス社ライトサイクラーなど）等の定量的PCRを採用すればよい。その後、例えば、品種「キリン２号」から得られたcDNAの量と比較することでmRNA量の違いによる変異を決定することができる。
　特に好ましい実施形態において、上記で定義したテルペン類合成酵素遺伝子の変異の存在の決定方法を、ホップ（Humulus lupulus）等のホップ属（カラハナソウ属）植物から得られた材料に適用する。
　上記の突然変異および／または多型を決定する方法により、テルペン類合成酵素をコードする遺伝子の突然変異や多型を塩基レベルで同定することができ、さらにテルペン類合成酵素をコードする遺伝子に突然変異を有する植物体を選抜し、得ることができる。本発明はこのようにして得られたテルペン類合成酵素をコードする遺伝子に突然変異や多型を有する植物体を包含する。
　また、突然変異や多型の決定やmRNA量の違いの決定により、テルペン類合成酵素をコードする遺伝子の発現能またはテルペン類合成酵素の活性が改変された植物を選抜することが可能になる。
　ここで、テルペン類合成酵素をコードする遺伝子の発現能またはテルペン類合成酵素の活性が改変された植物とは、人為的突然変異等の突然変異による遺伝子の発現能またはテルペン類合成酵素の活性の改変および多型による遺伝子の発現能またはテルペン類合成酵素の活性が異なっている植物を指す。
　ある植物の活性の突然変異による改変は、その植物の種に含まれる既存品種に対する改変をいい、既存品種には野生型も含まれる。既存の品種は、テルペン類合成酵素をコードする遺伝子が改変された植物が得られたときに存在するすべての品種をいい、交配、遺伝子操作等の人為的操作により作出された品種、および自然状態で出現した野生型とは酵素活性において区別できる個体群を含む。また、活性の改変において、すべての既存品種に対して活性が変化している必要はなく、特定の既存品種に対して改変されていれば、「テルペン類合成酵素の活性が改変された植物」に含まれる。「テルペン類合成酵素の活性が改変された植物」は、人為的操作を受けず自然状態で突然変異により活性が改変された植物も含み、本発明の方法により、自然状態で活性が変化した植物を選抜することができ、新たな品種として確立することもできる。また、ある既存品種に変異誘発処理を行い、テルペン類合成酵素の活性が改変された植物を作出した場合、比較対象は変異誘発処理を行った既存品種でもよいし、それ以外の他の既存品種でもよい。例えば、植物がホップ（Humulus lupulus）の場合、既存品種として、「キリン２号」、「とよみどり」、「Hallertauerer Mfr.」、「Hersbrucker」等がある。ここで、テルペン類合成酵素をコードする遺伝子の発現能またはテルペン類合成酵素の活性が既存品種に対して改変された植物とは、既存品種に対してテルペン類合成酵素をコードする遺伝子の発現能が増強した植物および低下した植物を含み、さらに、テルペン類合成酵素の活性が既存品種に対して上昇した植物および低下した植物を含む。本発明は、このようなテルペン類合成酵素をコードする遺伝子の発現能またはテルペン類合成酵素の活性が既存品種に対して改変された植物体も包含する。
　本発明のテルペン類合成酵素遺伝子の発現能や発現量および当該遺伝子の突然変異や多型を指標にして、個体および品種間におけるテルペン類合成能の差異を明らかにすることができる。すなわち、上記手法により当該遺伝子の発現能や発現量および突然変異や多型を既存品種に対して比較、同定し、さらに既存品種とテルペン類の合成能および合成量を比較解析することによって、当該遺伝子の発現能や発現量および突然変異や多型とテルペン類合成能の関係を明らかにすることができる。
　したがって、一態様において、本発明のプラスチド移行シグナルを有するテルペン類合成酵素をコードする遺伝子（例えば、配列番号２または配列番号４に示される塩基配列で表される遺伝子）の発現量や発現能ならびに当該遺伝子および当該遺伝子の発現調節領域における突然変異や多型を既存品種に対して比較、同定することによって、プラスチドにて合成されるモノテルペン類、例えばリナロールの合成能が改変されている品種を選抜、確立することができる。また、本発明のプラスチド移行シグナルを有さないテルペン類合成酵素をコードする遺伝子（例えば、配列番号１６に示される塩基配列で表される遺伝子）の発現量や発現能ならびに当該遺伝子および当該遺伝子の発現調節領域における突然変異や多型を既存品種に対して比較、同定することによって、サイトゾルにて合成されるセスキテルペン類、例えばネロリドールの合成能が改変されている品種を選抜、確立することができる。「合成能が改変されている」とは、既存品種に対してモノテルペン類および／またはセスキテルペン類の合成量が、増大または低下していることを意味する。
　また別の態様において、本発明のプラスチド移行シグナルを有するテルペン類合成酵素(例えば、配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列で表される酵素)における突然変異や多型に基づく活性の変化を既存品種に対して比較、同定することによって、プラスチドにて合成されるモノテルペン類、例えばリナロールの合成能が改変されている品種を選抜、確立することができる。また、本発明のプラスチド移行シグナルを有さないテルペン類合成酵素(例えば、配列番号１５に示されるアミノ酸配列で表される酵素)における突然変異や多型に基づく活性の変化を既存品種に対して比較、同定することによって、サイトゾルにて合成されるセスキテルペン類、例えばネロリドールの合成能が改変されている品種を選抜、確立することができる。
　以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
（実施例１）ホップの遺伝子発現ライブラリーの構築
　ホップ（Humulus lupulus）の品種「キリン2号」の毬花からルプリンを多く含む部分を切り取り、液体窒素を用いて破砕した。CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)法(Chang et al. 1993 Plan Mol Biol Rep 11: 113-116)を用いて全RNAを抽出した。得られた全RNA 620μgをタカラバイオ株式会社に提供しcDNAライブラリーの作成、12,288のEST解析およびクラスタリング解析を委託し、Oligotex-dT Super mRNA Purification Kit(タカラバイオ)を使用してpoly(A)+RNAを単離し、逆転写酵素でcDNAを作成した。cDNAプラスミドライブラリーは酵母発現用ベクターpDR196を用いて構築した。cDNAの第１鎖を、XhoI制限部位を含むoligo(dT)18アンカープライマーを使用して合成した。cDNAの第２鎖を合成した後、EcoRI制限サイトを含む平滑末端アダプターを二本鎖DNAへ結合させ、次いで当該フラグメントを、構成的プロモータPMA1を有するプラスミド、pDR196中に組み込んだ。Escherichia coli DH10Bに構築したライブラリーについて、プラスミドを抽出し12,288の５’端の塩基配列を決定した。クラスタリング解析の結果、1597のクラスター遺伝子配列を含んでいることがわかった。
（実施例２）候補cDNAのクローニング
　上記クラスター遺伝子をアミノ酸配列データベース（Database: NCBI/blast/db/FASTA/2008_09_05_09_00_0/nr 6,937,173 sequences; 2,395,280,820 total letters）に対して塩基配列相同性検索BLASTX 2.2.10（Altschul et al. 1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)を用いて解析を行ったところ、Citrus junos のterpene synthase（Genbank accretion AAG01339）やSantalum albumのmonoterpene synthase（Genbank accretion ACF24767）に対し相同性を示す遺伝子断片を見出した。
（実施例３）候補cDNAのクローニングおよびcDNA塩基配列の決定
　上記の遺伝子ライブラリー中に見出した遺伝子断片は、N末端を含まない636bpの不完全長cDNAであった。そこで、「キリン2号」の葉から、Nucleon PhytoPure（GEヘルスケア バイオサイエンス）によりDNAを抽出し、既知の塩基配列にプライマーを設計し（04_L18GSPnest2; GGATCGAATCAATTAGCTTCAAGAGTG（配列番号６）, 04_L18F2; GGTAATGAACTGATCTATGATGTTC（配列番号７））、Inverse PCR法により上流のゲノム塩基配列を明らかにした。Inverse PCR法の詳細は次の通りである。制限酵素はAccＩとClaＩを用い、3μgのDNAに対し各制限酵素を37℃にて3時間反応させ、70℃にて15分間処理して酵素を失活させた。T4 Ligase（BioLabs）を用いてligationを行い、これをテンプレートとしてPCR法による増幅を行った。PCR反応は、ExTaqポリメラーゼ（TaKaRa）を用いて一般的な反応組成に従い、ディネイチャー94℃で2分間、続いて、ディネイチャー94℃で1分間、アニーリング50℃で1分間、エクステンション72℃で5分間を30サイクル、最後にエクステンション72℃で10分間反応させた。増幅された断片をTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン）でクローニングし、シークエンスを解析し、未知の上流配列であることを確認した。
　得られた上流配列の推定翻訳開始メチオニンより上流の5’UTR領域と、終止コドンより下流の3’UTR領域にプライマーを設計し（04_L185’UTR; GTGCTGTATCCGCCAGCTTCG（配列番号８）, 04_L18R1; CTGAGGTTTAACTATTTCTCTGTCC（配列番号９））、「キリン2号」の毬花から、CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)法(Chang et al. 1993 Plan Mol Biol Rep 11: 113-116)を用いて抽出したRNAからSuperScript IIIファーストストランド合成システム（インビトロジェン）で合成した一本鎖cDNAをテンプレートに、PCR法による増幅を行った。PCR反応は、ExTaqポリメラーゼ（TaKaRa）を用いて一般的な反応組成に従い、ディネイチャー94℃で2分間、続いて、ディネイチャー94℃で1分間、アニーリング50℃で1分間、エクステンション72℃で2分間を30サイクル、最後にエクステンション72℃で5分間反応させた。増幅された断片をTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン）でクローニングし、シークエンスを解析した。その結果、２種類の全長遺伝子を取得することができた。ともに590アミノ酸からなる、それぞれの推定分子量68.035kDa、68.197kDa（DNADynamo; Blue Tractor Software Ltd.）のポリペプチド（配列番号１および３）をそれぞれコードする1770bp（終止コドンを含む）の推定ORFを含有する遺伝子であった（配列番号２および４）。これら遺伝子がコードするアミノ酸配列は、22、121、316、391、449、518および581位の7アミノ酸残基が互いに異なる。
　当該アミノ酸配列中には、RR(P)X8W、RXR、DDXXDといった多くのテルペン類合成酵素に保存されているモチーフが存在していた（Keeling CI and Boulmann J 2006 New Phytol 170:657-675）。
　以下、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、配列番号２で示される塩基配列にコードされるタンパク質を「HlLIS/NES-1」と表記し、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有し、配列番号４で示される塩基配列にコードされるタンパク質を「HlLIS/NES-2」と表記する。
（実施例４）大腸菌を用いた発現系とテルペン類の合成
　HlLIS/NES-1およびHlLIS/NES-2は、ChloroP 1.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）およびWoLF PSORT（http://wolfpsort.org/）のプログラムによるとプラスチド移行シグナル配列を持つと考えられ、このことは大腸菌でタンパク質を発現させるにあたって弊害となりうるため取り除く必要がある。そこで、配列番号２および４に示される塩基配列において、開始メチオニンから43アミノ酸を削るようにプライマーを設計し、これと対になるプライマーを終止コドン部位に設計した（Nde1-04_L18F; CATATGAGACGCTCAGCTAGTTACCATCC（配列番号１０）, Nde1-04_L18R; CATATGTCACTCCCCAACTCCATCGGTTTG（配列番号１１））。なお、いずれのプライマーにも制限酵素NdeＩの配列を付加しており、NdeＩ中のATGが開始コドンとなるように設計した。PCR反応は、ExTaqポリメラーゼ（TaKaRa）を用いて一般的な反応組成に従い、ディネイチャー94℃で2分間、続いて、ディネイチャー94℃で1分間、アニーリング57℃で1分間、エクステンション72℃で2分間を30サイクル、最後にエクステンション72℃で5分間反応させた。増幅された断片をTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン）でクローニングし、一般的な手法によって大腸菌へのトランスフォーメーション、プラスミド抽出を行った。このプラスミドにNdeＩ処理を37℃で2時間行い、両端にNdeＩサイトの付いた断片を用意し、同様にNdeＩ処理およびアルカリフォスファターゼ処理を行ったベクターpETDuet-1（Novagen）へクローニングした。クローニングには、DNA Ligation Kit（TaKaRa）を用いた。一般的な手法によって大腸菌へのトランスフォーメーション、プラスミド抽出を行い、発現系に用いるプラスミドを得た（以下、pET-HlLIS/NES-1およびpET-HlLIS/NES-2と表記）。
　続いて、pET-HlLIS/NES-1およびpET-HlLIS/NES-2を用いて大腸菌においてHlLIS/NES-1およびHlLIS/NES-2を発現させることにより、どのようなテルペン類が合成されるのかを調べた。モノテルペンおよびセスキテルペンを合成するにあたって基質となるのはゲラニル二リン酸およびファルネシル二リン酸であり、これらの基質はHaradaら（2009 Appl Microbiol Biotechnol 81:915-925）が構築したpAC-Mevと大腸菌BL21(DE3)に共導入させることにより得られる。なお、pAC-Mevとは、streptmyces sp.CL190由来のメバロン酸経路の遺伝子群（MVA kinase, DPMVA decarboxylase, PMVA kinase, IPP isomerase, HMG CoA reductase, HMG CoA synthasse）とtacプロモーター、rrnBターミネーター、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有したpACプラスミドである。pET-HlLIS/NES-1およびpET-HlLIS/NES-2とpAC-Mevを大腸菌BL21(DE3)に共導入させ、以下、Haradaら（2009 Appl Microbiol Biotechnol 81:915-925）の方法に従ってテルペン類の合成、ドデカンによる回収を行った。
（実施例５）合成されたテルペン類の解析
　上記の方法により、HlLIS/NES-1およびHlLIS/NES2により合成されたテルペン類はドデカン層に回収されている。回収したドデカン層1μlをGC-MS分析に供試した。GC-MS分析は、Haradaら（2009 Appl Microbiol Biotechnol 81:915-925）の方法に従って行った。その結果、HlLIS/NES-1において保持時間24.550分の位置と36.216分の位置に、また、HlLIS/NES-2において保持時間24.534分の位置と36.197分の位置に、対照には見られないピークが検出された（図１Ａ(i)(ii)、ピークを丸で指示）。これらのピークを分取し、MS分析を行った結果を図１Ｂ(i)(ii)および図１Ｃ(i)(ii)に示す。図１Ｄおよび図１Ｅは、それぞれリナロールおよびネロリドールの標品のMS分析結果であり、保持時間24.550/24.534分と36.216/36.197分の位置に検出されたピークのMS分析結果と一致している。これらの結果より、pET-HlLIS/NES-1およびpET-HlLIS/NES-2とpAC-Mevを共導入した大腸菌において、リナロールとネロリドールが産生されていることが確認できた。この結果、HlLIS/NES-1とHlLIS/NES-2はリナロールとネロリドールを生成する酵素であることが明らかとなった。すなわち、HlLIS/NES-1とHlLIS/NES-2は、ゲラニル二リン酸およびファルネシル二リン酸を基質としてリナロールおよびネロリドールを合成する（図２Ａおよび２Ｂ）。
（実施例６）HlLIS/NES-1の配列比較と系統発生分析
　これ以降の解析はHlLIS/NES-1とHlLIS/NES-2のアミノ酸配列が極めて似ていることから、HlLIS/NES-1で代表して用いて行った。HlLIS/NES-1はリナロールとネロリドールを生成する酵素である。このような活性を持つ酵素はキンギョソウ（Dinesh A. N. 2008 The Plant Journal 55 224-239 ; AmNESLIS-1(accession no. EF433761)およびAmNESLIS-2(EF433762)）やイチゴ（Asaph A. et al. 2004 The Plant Cell 16 3110-3131; FaNES(CAD57106)）から単離されたことが報告されている。これらとの関係を明らかにする目的で当該酵素間のアミノ酸配列の比較を行った（図３Ａ－Ｃ）。
　その結果、これらの酵素は同じような活性を持つにもかかわらず、アミノ酸の同一性は30％台と極めて低いものとなった。
　さらに37種の様々な植物のテルペン類合成関連酵素（AmNESLIS-1; AmNESLIS-2; FaNES, Arabidopsis snapdragon myrcene synthase(AAO41726), (E)-β-ocimene synthase(AAO42614); Arabidopsis linalool synthase(AAO85533); Artemisia annua linalool synthase(AAF13356); Abies grandis (-)-4S-limonene synthase(AF006193), myrcene synthase(U87908), pinene synthase(U87909), terpinolene synthase(AF139206), βphellandrene synthase(AF139205), γ-humulene synthase(U92267) and δ-selinene synthase(U92266); Arabidopsis thaliana myrcene/ocimene synthase(AF178535); Clarkia breweri linalool synthase(U58314); Cichorium intybus germacrene A synthase(AF497999); Citrus limon (-)-β-pinene synthase(AF514288), (+)-limonene synthase(AF514287) and γ-terpinene synthase(AF514286); Cucurbita maxima copalyl diphosphate synthase(AF049905) and ent-kaurene synthase(U43904); Gossypium arboretum (+)-δ-cadinene synthase(U23205); Lycopersicon esculentum　copalyl diphosphate synthase(AB015675) and germacrene C synthase(AF035630); Mentha piperita (E)-β-farnesene synthase(AF024615); Mentha spicata 4S-limonene synthase(L13459); Nicotiana tabacum 5-epi-aristolochene synthase(L04680); Picus abies linalool synthase(AAS47693); Perilla citridora limonene synthase(AF241790) and linalool synthase(AY917193); Perilla frutescens linalool synthase(AF444798); Salvia officinalis (+)-bornyl diphosphate synthase(AF051900), (+)-sabinene synthase(AF051901) and 1,8-cineole synthase(AF051899); Solanum tuberosum vetispiradiene synthase(AB022598); Zea mays TPS1(AAO18435)）のアミノ酸配列を比較しCLUSTALW（Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994) Nucleic Acids Res. 22(22):4673-80.）、分子進化系統樹を作成した（図４）。
　その結果、HlLIS/NES-1は、同じくリナロールとネロリドールを合成する酵素活性を持つキンギョソウのテルペン類合成酵素AmNESLIS-1およびAmNESLIS-2やイチゴのテルペン類合成酵素FaNESとは、異なるクラスターに分類され、遺伝子進化の面からも類縁関係は遠いことがわかった。また、Picea abies, Clarkia breweri, Arabidopsis thaiana, Artemisisa annua, Perilla citriodora, Perilla frutescens等の植物のリナロール合成酵素とも、異なるクラスターに分類されている。このことからHlLIS/NES-1はきわめてユニークなアミノ酸配列を有することがわかった。
（実施例７）HlLIS/NES-1をコードするゲノム塩基配列の決定
　キリン2号の葉より、Nucleon PhytoPure（GEヘルスケア バイオサイエンス）を用いてDNAを抽出した。このDNAをテンプレートに、以下のプライマー対を用いて（04_L185’UTR; GTGCTGTATCCGCCAGCTTCG（配列番号１２））, 04_L18R1; CTGAGGTTTAACTATTTCTCTGTCC（配列番号１３））、PCR法によりHlLIS/NES-１をコードするゲノム塩基配列断片の増幅を行った。PCR反応は、ExTaqポリメラーゼ（TaKaRa）を用いて一般的な反応組成に従い、ディネイチャー94℃で2分間、続いて、ディネイチャー94℃で1分間、アニーリング50℃で1分間、エクステンション72℃で2分間を30サイクル、最後にエクステンション72℃で5分間反応させた。増幅された断片をTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン）でクローニングし、シークエンスを解析して、HlLIS/NES-1をコードするゲノム塩基配列を明らかにした。また、遺伝子ライブラリーのシークエンスデータより、poly(A)付加部位までの配列がわかっており、これを加えた2,752bpを配列番号５に示した。HlLIS/NES-1をコードするcDNAの塩基配列との比較により、7個のエクソンと6個のイントロンにより構成されていることが明らかとなった（図５）。
（実施例８）RT-PCR法による2種の転写物の解析
　HlLIS/NES-1をコードするゲノム塩基配列について、一層の解析を行った結果、図５に示した第１イントロン（75bp）中にATGが存在し、これを翻訳開始メチオニンとする転写物が存在する可能性が示唆された。
　そこで、このATGを含むプライマーを設計し（2ndM-F; ATGCATATAACACAGAATAAAGCTAAGATTTTG（配列番号１４））、これと3’UTRに設計したプライマー04_L18R（配列番号９）を用い、「キリン2号」を材料に、実施例３と同様の手法でcDNA塩基配列およびゲノム塩基配列の増幅を行った。PCR反応は、いずれもExTaqポリメラーゼ（TaKaRa）を用いて一般的な反応組成に従い、ディネイチャー94℃で2分間、続いて、ディネイチャー94℃で1分間、アニーリング50℃で1分間、エクステンション72℃で1分30秒間を30サイクル、最後にエクステンション72℃で5分間反応させた。
　電気泳動にてcDNA塩基配列およびゲノム塩基配列のいずれも増幅を確認し、増幅された断片をTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン）でクローニングし、シークエンスを解析した。
　その結果、このHlLIS/NES-1第1イントロン中のメチオニンを翻訳開始点として、それより下流のHlLIS/NES-1第1イントロンとHlLIS/NES-1第2エクソンが組み合わさって第1エクソンとして存在する、6個のエクソンから構成される転写物が存在することを明らかにした（図６）。これをHlLIS/NES-3とし、そのアミノ酸配列を配列番号１５、ゲノム塩基配列を配列番号１６に示す。
　実施例４で述べ、図６に示した通り、HlLIS/NES-1の第1エクソン中にはプラスチド移行シグナルペプチドをコードする配列が存在する。従って、HlLIS/NES-1はプラスチド移行シグナルを有するが、HlLIS/NES-3はプラスチド移行シグナルを持たない。また、モノテルペン類はプラスチドにおいて合成され、セスキテルペン類はサイトゾルにおいて合成されることが明らかとなっている（Rodriguez-Concepcion and Boronat 2002 Plant Physiol 130:1079-1089）。したがって、HlLIS/NES-1はそのプラスチド移行シグナルによりプラスチドに移行してモノテルペン類であるリナロールの合成に機能し、HlLIS/NES-3はプラスチド移行シグナルを有さないことから、サイトゾルにおいてセスキテルペン類であるネロリドールの合成に機能していることが示唆された。
　続いて、複数のホップ品種間において、HlLIS/NES-1およびHlLIS/NES-3の転写解析を行った。既述の「キリン2号」に加え、「Hallertauerer Mfr.」および「Hersbrucker」の3品種を用いた。「キリン2号」、「Hallertauerer Mfr.」および「Hersbrucker」の毬花から、CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)法(Chang et al. 1993 Plan Mol Biol Rep 11: 113-116)を用いて抽出したRNAを、それぞれ1μgずつ用いてSuperScript IIIファーストストランド合成システム（インビトロジェン）で一本鎖cDNAを合成した。これをテンプレートに、HlLIS/NES-1に特異的なプライマー対（04_L18 5’UTR-F3; AGCATTCGGCAATTTAAACGGTCAG（配列番号１７）,HlLIS/NES GSP 2.3ex; CTCTAAATCTGTCAAACACATCAGAGCC（配列番号１８））とHlLIS/NES-3特異的なプライマー対（2ndM-F（配列番号１４）,HlLIS/NES GSP 2.3ex（配列番号１８））を用いてPCR反応による増幅の有無を調べた。いずれのPCR反応も、ExTaqポリメラーゼ（TaKaRa）を用いて一般的な反応組成に従い、ディネイチャー94℃で2分間、続いて、ディネイチャー94℃で30秒間、アニーリング52℃で30秒間、エクステンション72℃で30秒間を30サイクルおよび40サイクル、最後にエクステンション72℃で3分間反応させた。その結果、「キリン2号」、「Hallertauerer Mfr.」および「Hersbrucker」の3品種において、HlLIS/NES-1およびHlLIS/NES-3の増幅を確認することができた（図７）。これより、「キリン2号」、「Hallertauerer Mfr.」および「Hersbrucker」の3品種において、HlLIS/NES-1およびHlLIS/NES-3が発現していることが明らかとなり、リナロールとネロリドールの合成にそれぞれ機能していることが示唆された。なお、対照としてGAPDH遺伝子（プライマー対（GAPDH ori-F; GGTGTCAGGAACCCTGAAGAAATCC（配列番号１９）, GAPDH ori-R; GGAGCAAGGCAATTGGTAGTGCAAC（配列番号２０））の増幅を確認した。
（実施例９）品種間におけるHlLIS/NES-1およびHlLIS/NES-3のゲノム塩基配列の比較
　「キリン2号」、「Hallertauerer Mfr.」および「Hersbrucker」の3品種の葉から、Nucleon PhytoPure（GEヘルスケア バイオサイエンス）により抽出したDNAをそれぞれテンプレートに、5’UTR領域に設計したプライマー（04_L185’UTR（配列番号１２））と、HlLIS/NES-1における終止コドン部位に設計したプライマー（Nde1-04_L18R（配列番号１１））を用いてPCR反応を行った。
　PCR反応は、いずれもExTaqポリメラーゼ（TaKaRa）を用いて一般的な反応組成に従い、ディネイチャー94℃で2分間、続いて、ディネイチャー94℃で1分間、アニーリング54℃で1分間、エクステンション72℃で2分30秒間を30サイクル、最後にエクステンション72℃で5分間反応させた。増幅された断片をTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン）でクローニングし、シークエンスを解析した。
　「キリン2号」、「Hallertauer Mfr.」および「Hersbrucker」の3品種におけるHlLIS/NES-1およびHlLIS/NES-3のゲノム塩基配列の比較を行ったところ、HlLIS/NES-1およびHlLIS/NES-3それぞれの翻訳開始メチオニンの上流領域に著しい多型を見出すことができた（図８）。
　ホップ品種間において、テルペン類の生成量には違いが認められる（非特許文献２）。本発明において明らかにしたゲノム塩基配列やcDNA塩基配列を利用することで、その突然変異および／または多型を検出し、リナロールやネロリドールの合成に関わる品種特性の検定や植物体の選抜を行うことが出来る。
　本発明により、ホップのモノテルペノイドとセスキテルペノイドを合成する酵素、当該テルペノイド合成酵素をコードするDNA、当該酵素を用いてテルペノイドを合成する方法が提供され、医薬品や医薬部外品の成分、あるいは食品や化粧品の香料としての利用が可能となる。また、当該DNAを用いた系統選抜方法が提供され、有用なホップ品種の育種に有用である。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (14)

  1. 　以下の(a)～(c)のいずれかのタンパク質：
    　(a) 配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質； 
    　(b) 配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、テルペン類合成酵素活性を有するタンパク質;ならびに
    　(c) 配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸配列と85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、テルペン類合成酵素活性を有するタンパク質。
  2. 　以下の(d)～(g)のいずれかのDNAからなる遺伝子：
    　(d) 配列番号２または配列番号４に示す塩基配列からなるDNA；
    　(e) 配列番号２または配列番号４に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テルペン類合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；
    　(f) 配列番号２または配列番号４に示す塩基配列と85％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、テルペン類合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；および
    　(g) 配列番号２または配列番号４に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。
  3. 　以下の(h)～(j)のいずれかのタンパク質：
    　(h) 配列番号１５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
    　(i) 配列番号１５に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、テルペン類合成酵素活性を有するタンパク質；ならびに
    　(j) 配列番号１５に示すアミノ酸配列と85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、テルペン類合成酵素活性を有するタンパク質。
  4. 　以下の(k)～(n)のいずれかのDNAからなる遺伝子：
    　(k) 配列番号１６に示す塩基配列からなるDNA；
    　(l) 配列番号１６に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テルペン類合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；
    　(m) 配列番号１６に示す塩基配列と85％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、テルペン類合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；および
    　(n) 配列番号１６に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。
  5. 　請求項２または請求項４に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
  6. 　請求項５に記載の組換えベクターを導入した形質転換体。
  7. 　植物体である請求項６に記載の形質転換体。
  8. 　(i) ゲノムDNAまたはRNAである核酸を植物から単離する工程、
    (ii) (i)の核酸がRNAである場合に、逆転写してcDNAを合成する工程、
    (iii) (i)または(ii)の工程で得られたDNAから請求項２もしくは４に記載の遺伝子、または配列番号５に示す塩基配列を含有する遺伝子断片を増幅する工程、
    (iv) (iii)で増幅したDNA中に突然変異および／または多型の存在を、それぞれ対応する配列番号２、配列番号４もしくは配列番号１６または配列番号５に示す塩基配列と比較して決定する工程、
    これらの工程を含む、植物におけるテルペン類合成酵素をコードする遺伝子の突然変異および／または多型の存在を検出する方法。
  9. 　植物がホップ属植物である請求項８に記載の方法。
  10. 　請求項８または請求項９に記載の方法によってテルペン類合成酵素をコードする遺伝子の突然変異および／または多型を検出し、突然変異および／または多型を有する植物体を選抜する方法。
  11. 　テルペン類合成酵素をコードする遺伝子の発現能またはコードするテルペン類合成酵素の活性が、既存品種に比較して改変されている植物を選抜することをさらに含む、請求項１０に記載の植物体を選抜する方法。
  12. 　選抜される植物体が既存品種に比較してリナロールおよび／またはネロリドールの合成能が改変されている、請求項１１に記載の植物体を選抜する方法。
  13. 　請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法によって選抜された、植物体。
  14. 　ホップ属植物である請求項１３に記載の植物体。
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