TR201816062T4 - Polimorfizm sayımlarını kullanarak genom fraksiyonlarının çözülmesi. - Google Patents

Abstract

Küçük baz varyasyonları ya da insersiyonlar-delesyonlar gibi polimorfizmlerden genomik fraksiyonun (örn., fetal fraksiyonun) güvenilir bir şekilde hesaplanması için metotlar sunulmuştur. Bir multigenomik kaynaktan alınan sekanslanmış veriler bir ya da daha fazla polimorfizm için alel sayımlarının belirlenmesinde kullanılır. Bir ya da daha fazla polimorfizm için zigotluk atanır ve zigotluk ve alel sayımlarından genomik fraksiyon belirlenir. Belli uygulamalar uygun polimorfizmler olarak SNPleri kullanırlar. Açıklanan metotlar bilinen poliformizmlere yönelik kasti, önceden tasarlanmış ve tekrar sekanslayıcı bir çalışmanın bir parçası olarak uygulanabilir ya da maternal plazmadan (ya da birçok insandan alınan bir DNA karışımının olduğu bir kurulumda) üretilmiş örtüşen sekanslarda tesadüfen bulunmuş varyasyonların geriye dönük analizinde kullanılabilir.

Description

TARIFNAME POLIMORFIZM SAYIMLARINI KULLANARAK GENOM FRAKSIYONLARININ ÇÖZÜLMESI ARKA PLAN Anne kanindaki serbest yüzer fetal DNA'nin (ki bazen “hücresiz DNA” ya da “cfDNA” olarak da anilir) kesfi kromozomal anormallik, anöploidi ve aberasyonun kan numunelerinden tespit edilmesine olanak tanimaktadir. Anne kani plazmasinda fetal DNA'nin fraksiyonal bollugi kalici degildir ve numune alma ve gebelik dönemi de dahil olmak üzere bir dizi faktöre göre degiskenlik gösterir.

Kromozomal aberasyonlari ya da genetik bozukluklari tanimlamak için DNA sekanslama kullanilirken toplam DNA popülasyonu içinde fetal DNA'nin görece bol oldugunu bilmek önemlidir. Örnegin, fetal fraksiyon bilindiginde, istatistiki güç (anomali durumlari ya da hassasiyeti tanimlama ihtimali) permütasyon metotlariyla ya da dogrusal kombinasyonlarin entegrasyonu ya da alfadan sonsuza merkezi olmayan F dagilimlarinin kivrimlari araciligiyla hesaplanabilir; burada alfa aberasyon olmadigi durumdaki sifir hipotezi altindaki Skorlar popülasyonunun önemi için kritik noktadir (hatayla bir anomali belirlemeye dair maksimum olasilik).

US 7,332,277, bir fetal kromozomal anormalitenin varligi ya da yoklugunun ilgili bir heterozigot loküsdeki alellerin görece miktarinin oraninin hesaplanmasiyla tespiti için bir metodu açiklamaktadir.

Fetal fraksiyonun tespiti için mevcut metotlarin bir sorunu, bunlarin cinsiyet kromozomlarinin çoklugunun ölçümlerine (ki bunlar sadece erkek embriyonik DNA'snin görece bollugunun güvenle ölçülmesi için kullanilabilirler) ya da hamile ve embriyonik› dokular arasinda farklilasacak sekilde ifade edilmesiyle bilinen genlerin mRNA sekansina (ki bu de genelik dönemi ya da diger faktörlere göre ifade çesitliligine tabidir) dayanmasidir.

Fetal fraksiyonun ölçülmesi sunlar da dahil olmak üzere çesitli nöans faktörleri sebebiyle zor olabilir: parental farksal popülasyon genetik parametreleri ve sekanslama hatalari.

Dolayisiyla, bu ve diger siklikla gerçeklesen karistirici faktörlerin varliginda saglikli olan metotlara sahip olmak istenmektedir.

BULUSUN ÖZETI Bulus, hamile bir bireyin bir Vücut sivisindan alinan DNA içindeki bir fetal DNA fraksiyonunu ölçmeye dair bir` metot sunmaktadir ve bu metot: (m hamile bireyin vücut sivisindan alinan DNA segmentlerinin bir dizi polimofizm sekanslarina eslenmesini, ki burada DNA bir dizi polimorfizm sekansini tanimlayan kosullar altinda sekanslanmistir; (m bu polimorfizm sekanslarinin her biri için eslenmis nükleik asitlerin bir alel frekansinin belirlenmesini; ve fetal DNA fraksiyonunun bir ölçümü elde etmek için alel frekanslarinin bir karisim modeline uygulanmasini içerir; burada (b)-(C) belirleme ve uygulama için program talimatlari altinda açlisan bir ya da daha fazla islemci altinda gerçeklestirilir.

Açiklanan uygulamalardan bazilari bir anne kan numunesinin sekanslanmasiyla serbest dolasan fetal DNA'nin göreli çoklugunun güvenilir sekilde ölçülmesi için bilgisayarli metotlarla Spesifik uygulamalarda, bulus parental etnisite, embriyonun cinsiyeti, gebelik. dönemi ve diger çevresel faktörlere göre saglikli olan küçük. baz varyasyonlari ya da dahil etmeler- silmeler gibi polimorfizmlerden fetal fraksiyonun güvenilir sekilde ölçülmesine dair metotlar sunmaktadir. Burada açiklanan bir çok örnek uygun polimorfizmler olarak SNPleri kullanmaktadir. Bulus, bilinen polimorfizmlere karsi hedeflenmis bilinçli, önceden tasarlanmis bir tekrar sekanslama çalismasinin bir parçasi olarak uygulanabilir ya da anne plazmasindan üretilmis örtüsen fekanslarda tesadüfen bulunmus varyasyonlarin geriye dönük analizi için kullanilabilir (ya da çesitli insanlardan alinmis DNA'larin bir karisiminin mevcut oldugu herhangi baska bir düzenekte kullanilabilir).

Bu belge, anne kani numunesi içindeki fetal DNA'nin fraksiyonel çoklugunun ölçümü için teknikleri sunmaktadir. Açiklanan tekniklerden bazilari sans eseri bulunan ya da fetal fraksiyonun ölçümü amaciyla tasarlanmis önceden bilinen SNP panelleri içinde bulunan SNP'lerin gözlemlenmis alel frekanslarini kullanir.

Burada istemi yapilan bulus bir numune içindeki fetal nükleik asidin fraksiyonunun ölçülmesiyle ilgiliyse de, bildirim bununla sinirli degildir. Burada açiklanan teknik ve aparatlar ebeveyn ve çocuk genomlari olarak iliskili olabilecek ya da olmayabilecek iki genom karisimi içindeki bir genomdan nükleik asit fraksiyonunu ölçmek için birçok durumda kullanilabilir.

Bildirimin belli yönleri hamile bir bireyin bir vücut sivisindan elde edilen DNA içindeki fetal DNA fraksiyonunun ölçümüne dair metotlarla ilgilidir. Bu metotlar asagidaki süreçlerle karakterize edilebilirler: (a) vücut sivisindan bir numune almak; (b) vücut sivisi içinde mevcut olan bir anne genomu ve bir fetal genomun her ikisinin de DNA'sini özütleyen kosullar altinda numuneden DNA özütlemek; (c) özütlenmis DNA'yi bir ya da daha fazla polimorfizm içeren DNA segment sekanslari üreten sartlar altinda bir nükleik asit siralayici ile sekanslama; (d) vücut sivisi içindeki DNA'nin sekanslanmasiyla elde edilen DNA segment sekanslarini bir referans sekansi üzerinde bir ya da daha fazla belirlenmis polimorfizme esleme; (e) en az bir belirlenmis polimorfizm için eslenmis DNA segment sekanslarinin alel frekanslarini belirleme; (f) en az bir belirlenmis polimorfizmi hamile bireyin zigotlugu ve fetüsün zigotlugunun bir kombinasyonuna bagli olarak siniflandirma; ve (g) hamile bireyden alinan DNA içindeki fetal DNA fraksiyonunu (e) adiminda belirlenen alel frekanslari ve (f) adiminda belirlenen zigotluk kombinasyonunu kullanarak ölçme.

Esleme, nülkeik asit sekanslarini bir ya da daha fazla belirlenmis polimorfizme eslemek için programlanmis bir bilgisayar programi kullanilarak yapilabilir. Genel olarak, (d) - (g) arasi adimlarin hepsi program talimatlari altinda çalisan bir ya da daha fazla islemci üzerinde gerçeklestirilebilir.

Belli uygulamalarda, hamile bir bireyin bir Vücut sivisindan alinan DNA. hamile bireyin, plazmasindan elde edilen. hücresiz DNA'dir. Tipik olarak, sekanslama bir ya da daha fazla belirlenmis polimorfizmden herhangi biri seçimli olarak büyütülmeden uygulanir.

Belli uygulamalarda, fetüsü tasiyan hamile bireyin ladinindan elde edilen DNA segmentlerinin eslenmesi, segmentlerin bir polimorfizm veri tabanina bilgisayarli yöntemle eslenmesini içerir. Belli uygulamalarda, (f) adimindaki siniflandirma en az bir belirlenmis polimorfizmi asagidaki kombinasyonlarin biri içine siniflandirir: (i) hamile birey homozigot ve fetus homozigottur, (ii) hamile birey homozigot ve fetüs heterozigottur, (iii) hamile birey heterozigot ve fetus homozigottur, ve (iv) hamile birey heterozigot ve fetüs heterozigottur. Çesitli filtreleme operasyonlari uygulanabilir. Bunlar arasinda örnegin kombinasoyun (i) ya da kombinasyon (iv) içine siniflandirilmis tüm.polimorfizmlerin göz ardi edilmesi bulunur.

Bir diger örnekte, metotlar ayrica en az bir belirlenmis polimorfizmin tanimlanmis bir esikten büyük bir minör alel frekansina sahip tüm polimorfizmlerin göz ardi edilmesi için filtrelenmesini içerir. Yine bir baska örnekte, metotlar en az bir belirlenmis polimorfizmin tanimlanmis bir esikten daha düsük bir minör alel frekansina sahip tüm polimorfizmlerin göz ardi edilmesi için bir filtreleme operasyonunu içerir.

Siniflandirma operasyonu çesitli yollarla gerçeklestirilebilir. Örnegin, (e) adiminda belirlenen alel frekansina bir esik uygulanmasini içerebilir. Diger bir örnekte, siniflandirma operasyonu bir çok polimorfizm için (e) adimindan alinan alel frekansi verisini bir karisim modeline uygulamayi içerir. Bir uygulamada, karisim modeli çarpinim momentlerini kullanir.

Burada açiklandigi sekilde belirlenen fetal fraksiyon çesitli uygulamalar için kullanilabilir. Bazi örneklerde, burada açiklanan metotlar, (g) adiminda belirlenen DNA'nin fetal fraksiyonunun, hamile birey için okunabilir bir bilgisayar ortaminda saklanan bir hasta medikal kaydi içine otomatik olarak kaydedilmesi için bir ya da daha fazla islemci üzerinde program talimatlarini uygulamaya dair bir islem içerir. Hasta medikal kaydi bir laboratuvar, bir doktor muayenehanesi, bir hastane, bir saglik bakim organizasyonu, bir sigorta sirketi ya da bir kisisel medikal kayit sitesi tarafindan muhafaza edilebilir.

Bir baska uygulamada, fetal DNA fraksiyonunun ölçümü, anne test numunesinin alindigi bir insan sujenin tedavisinin yazilmasi, baslatilmasi ve/veya degistirilmesi için kullanilabilir. Bir baska uygulamada, fetal DNA fraksiyonunun ölçülmesi bir ya da daha fazla testin istenmesi ya da yapilmasi için kullanilir.

Bildirimin bir diger yönü, hamile bir bireyin bir Vücut sivisindan elde edilen DNA. içindeki fetal DNA fraksiyonunun ölçülmesi için bir aparatla ilgilidir. Bu tür bir aparat asagidaki özelliklerle karakterize edilebilir: (a) (i) hem bir anne genomu hem de bir fetal genomun DNA'larini içeren Vücut sivisinin bir numunesinden Özütlenmis DNA'yi almak ve (ii) özutlenmis DNA'yi bir ya da daha fazla belirlenmis polimorfizmi içeren DNA segment sekanslari üreten kosullar altinda sekanslamak için yapilandirilmis bir siralayici; ve (b) burada açiklanan iki ya da daha fazla metot islemleri ile açiklananlar gibi çesitli islemleri gerçeklestirmek için bir ya da daha fazla islemciye talimat göndermek üzere yapilandirilmis (örn., programlanmis) bir bilgisayarli aparat. Bazi uygulamalarda, bilgisayarli aparat (i) nükleik asit sekanslarini bir referans sekansi üzerinde bir ya da daha fazla belirlenmis polimorfizme eslemek, (ii) en az bir belirlenmis polimorfizm için, eslenen DNA segment sekanslarinin alel frekanslarini belirlemek, (iii) en az bir belirlenmis polimorfizmi hamile bireyin zigotlugu ve fetüsün zigotlugunun bir kombinasyonuna göre siniflandirmak ve (iv) hamile bireyden elde edilen DNA içindeki fetal DNA fraksiyonunu alel frekanslari ve zigotluk kombinasyonunu kullanarak ölçmek üzere yapilandirilmistir.

Belli uygulamalarda, aparat ayrica numuneden DNA'nin hem anne genomu hem de fetal genomun DNA'sini özütleyen kosullar altinda özütlenmesi için bir araç da içerir. Bazi uygulamalarda, aparat hamile bireyin plazmasindan alinan hücresiz DNA'yi siralayicida sekanslanmasi için özütlemek üzere yapilandirilmis bir modül Bazi uygulamalarda, aparat bir polimorfizm veri tabani içerir.

Bilgisayarli aparat ayrica bir ya da daha fazla islemciye fetüsü tasiyan bireyin kanindan elde edilen DNA segmentlerini polimorfizni veri tabanina segmentlerin bilgisayarli yöntemle eslenmesi yoluyla eslemesi için talimat gönderecek sekilde yapilandirilmis olabilir. Veri tabani içindeki sekanslar bir referans sekansinin bir örnegidir. Referans sekanslarinin diger Belli uygulamalarda, bilgisayarli cihaz ayrica bir ya da daha fazla islemciye en az bir belirlenmis polimorfizmi asagidaki kombinasyonlardan biri içine siniflandirmak üzere talimat gönderecek sekilde yapilandirilmistir: (i) hamile birey homozigot ve fetüs homozigottur, (ii) hamile birey homozigot ve fetüs heterozigottur, (iii) hamile birey heterozigot ve fetus homozigottur, ve (iv) hamile birey heterozigot ve fetüs heterozigottur. Bazi uygulamalarda, bilgisayarli aparat ayrica bir ya da daha fazla islemciye kombinasyon (i) ya da kombiasyon (iv) içine siniflandirilmis polimorfizmleri göz ardi etmesi için talimat göndermek üzere yapilandirilmistir.

Belli uygulamalarda, bilgisayarli aparat ayrica bir ya da daha fazla islemciye tanimli bir esikten daha büyük bir minör alel frekansina sahip tüm polimorfizmleri göz ardi etmesi için talimat göndermek üzere yapilandirilmistir. Bazi uygulamalarda, bilgisayarli aparat ayrica bir ya da daha fazla islemciye tanimli bir esikten daha küçük bir* minör` alel frekansina sahip tüm polimorfizmleri göz ardi etmesi için talimat göndermek üzere yapilandirilmistir. Belli uygulamalarda, bilgisayarli aparat ayrica bir ya da daha fazla islemciye en az bir belirlenmis polimorfizmi alel frekansina bir esik uygulayarak siniflandirmasi için talimat göndermek üzere yapilandirilmistir.

Belli uygulamalarda, bilgisayarli aparat ayrica bir ya da daha fazla islemciye en az bir belirlenmis polimorfizmi polimorfizmlerden elde edilmis alel ferans verilerini uygulayarak bir karisim modeline siniflandirmasi için talimat göndermek üzere yapilandirilmistir. Karisim modeli çarpinim momentleri kullanabilir.

Belli uygulamalarda, bilgisayarli aparat bir ya da daha fazla islemciye fetal DNA fraksiyonunu hamile birey için bir bilgisayarla okunabilir ortamda saklanan bir hasta medikal kaydina otomatik olarak kaydetmesi için talimat göndermek üzere yapilandirilmistir. Hasta medikal kaydi bir laboratuvar, bir doktor muayenehanesi, bir hastane, bir saglik bakim organizasyonu, bir sigorta sirketi ya da bir kisisel medikal kayit sitesi tarafindan muhafaza edilebilir.

Bildirimin diger yönü, hamile bir bireyin bir vücut sivisindan elde edilen DNA'nin fetal DNA fraksiyonunun asagidaki islemlere göre ölçülmesine dair metotlarla ilgilidir: (a) hamile bir bireyin vücut sivisindan alinan DNA segmentlerinin. bir dizi polimorfizm sekanslarina eslemek, burada DNa polimorfizm sekanslarini tanimlayan sartlar altinda sekanslanmistir; (b) her bir polimorfizm sekansi için eslenmis nükleik asitlerin alel frekanslarinin belirlenmesi; ve (o) fetüsü tasiyan bireyin kanindan elde edilen DNA içindeki fetal DNA fraksiyonunun bir ölçümünu elde etmek için alel frekanslarinin bir karisim modeline uygulanmasi. (a) - (0) arasi islemlerin hepsi program talimatlari altinda çalisan bir ya da daha fazla islemci üzerinde gerçeklestirilebilir. Belli uygulamalarda, (c) islemi polimorfizm sekanslarinin her biri için alel frekans verilerinin çarpinim momentleri için bir dizi denklemin çözülmesi için bir ya da daha fazla islemci üzerinde talimatlarin gerçeklestirilmesini içerir. Bazi uygulamalarda, karisim modeli sekanslama hatasinin sebebini açiklamaktadir.

Belli uygulamalarda, metotlar ek olarak hem fetus hem de hamile bireyde heterozigot olarak tanimlanmis polimorfizmler için alel frekanslarinin bilgisayarli yöntemle çikarilmasini içerir. Bazi uygulamalarda, (c) adimi öncesinde, metotlar hem fetus hem de hamile bireyde homozigot olarak tanimlanmis polimorfizmler için alel frekanslarinin bilgisayarli yöntemle çikarilmasini içerir.

Bazi uygulamalarda, (c) adimi öncesinde, metotlar hamile bireyde heterozigot olarak tanimlanmis polimorfizmler için alel frekanslarinin bilgisayarli yöntemle çikarilmasini içerir.

Hamile bir bireyin bir Vücut sivisindan elde edilen DNA hamile bireyin plazmasindan elde edilmis hücresiz DNA olabilir. Vücut sivisindan elde edilen nükleik asitlerin eslenmesi segmentlerin polimorfizmlerin bir veri tabanina eslenmesi yoluyla yapilabilir.

Bildirimin bu yönünün metotlari ayrica. hamile bireyin Vücut sivisindan alinan DNA'nin bir nükleik asit siralayiciyla polimorfizm sekanslari içeren DNA segmenti sekanslari üreten sartlar altinda sekanslanmasini da içerebilir.

Bazi uygulamalarda, (a) adimindaki esleme biallelik bir polimorfizm sekanslari dizisinin tanimlanmasini içerir. Diger uygulamalarda, (a) adimindaki esleme DNA segmentlerinin önceden tanimlanmis bir polimorfizm sekanslari dizisine eslenmesini Bazi uygulamalarda, bu yönün metotlari ek olarak bir ya da daha fazla islemciye (C) adiminda belirlenen fetal DNA fraksiyonlarini hamile birey için bilgisayarda okunabilir bir ortamda saklanan bir hasta medikal kaydina otomatik olarak kaydetmesi için talimatlarin verilmesini içerir. Hasta medikal kaydi bir laboratuvar, bir doktor muayenehanesi, bir hastane, bir saglik bakim organizasyonu, bir sigorta sirketi ya da bir kisisel medikal kayit sitesi tarafindan muhafaza edilebilir.

Fetal DNA fraksiyonunun ölçümüne dayali olarak, bu yönün metotlari ayrica anne test numunesinin alindigi bir insan süjenin tedavisinin yazilmasi, baslatilmasi ve/Veya degistirilmesini de içerebilir. Fetal DNA fraksiyonunun ölçümüne dayali olarak, bu yönün metotlari ayrica bir ya da daha fazla testin istenmesi ya da yapilmasini da içerebilir.

Bildirimin yine bir baska yönüne göre, hamile bir bireyin bir Vücut sivisindan elde edilen DNA içindeki fetal DNA fraksiyonunun ölçülmesi için asagidaki islemleri kullanan metotlar sunulmustur: (a) vücut sivisindan bir numune almak; (b) Vücut sivisi içinde mevcut olan bir anne genomu ve bir fetal genomun her ikisinin de DNA'sini özütleyen kosullar altinda numuneden DNA özütlemek; (c) özütlenmis DNA'yi DNA segment sekanslari üreten sartlar altinda bir nükleik asit siralayici ile sekanslama; (d) Vücut sivisindan elde edilen DNA segment sekanslarini karsilastirma ve bu karsilastirmadan bir ya da daha fazla biallelik polimorfizm tanimlama (e) en az bir belirlenmis polimorfizm için eslenmis DNA segment sekanslarinin alel frekanslarini belirleme; (f) en az bir belirlenmis polimorfizmi hamile bireyin zigotlugu ve fetüsün zigotlugunun bir kombinasyonuna bagli olarak siniflandirma; ve (g) hamile bireyden alinan DNA içindeki fetal DNA fraksiyonunu (e) adiminda belirlenen alel frekanslari ve (f) adiminda belirlenen zigotluk kombinasyonunu kullanarak ölçme.

Esleme, nülkeik asit sekanslarini bir ya da daha fazla belirlenmis polimorfizme eslemek için programlanmis bir bilgisayar programi kullanilarak yapilabilir. Genel olarak, (d) - (g) arasi adimlarin hepsi program talimatlari altinda çalisan bir ya da daha fazla islemci üzerinde gerçeklestirilebilir.

Bu yönün belli uygulamalarinda, DNA segment sekanslari yaklasik baz Çifti ve yaklasik 300 baz çifti arasinda bir uzunluga sahiptir.

Bu yönün belli uygulamalarinda, (f) adimindaki siniflandirma en az bir belirlenmis polimorfizmi asagidaki kombinasyonlardan birinde siniflandirir: (i) hamile birey homozigot ve fetüs homozigottur, (ii) hamile birey homozigot ve fetüs heterozigottur, (iii) hamile birey heterozigot ve fetüs homozigottur, ve (iv) hamile birey heterozigot ve fetüs heterozigottur. Metotlar ayrica (1) kombinasyonu ve (iv) kombinasyonu içine siniflandirilmis polimorfizmlerin göz ardi edilmesini içerebilir. Çesitli uygulamalara uygun olarak, bu yönün metodu burada açiklandigi sekliyle diger yönlerle baglantili olarak filtreleme ve/Veya siniflandirma islemlerini içerebilir. Örnegin, bu yönün metotlari bir ya da daha fazla polimorfizmlerin tanimlanmis bir esikten daha büyük bir minör alel frekansina sahip tüm polimorfizmlerin göz ardi edilmesi için filtrelenmesini içerebilir. Bazi durumlarda, en az bir tanimlanmis polimorfizmin siniflandirilmasi (e) adiminda belirlenmis alel frekansina bir esigin uygulanmasini içerir. karisim modellerinin burada açiklandigi sekliyle kullanimi tanimlanmis polimorfizmlerin siniflandirilmasi için kullanilabilir.

Bildirimin bir baska yönü bir fetal DNA fraksiyonunu ölçmek için var olan ve asagidaki unsurlari içeren bir aparatla ilgilidir: (a) (i) heni bir anneye ait genoni heni de bir fetal genomun DNA'sini içeren bir Vücut sivisi numunesinden özütlenen DNA'yi almak ve (ii) DNA'nin sekans segmentlerini üretmek için özütlenmis DNA'yi sekanslamak üzere yapilandirilmis bir siralayici; ve (b) bir ya da daha fazla islemciye (i) hamile bireyin Vücut sivisindan elde edilmis DNA'nin sekans segmentlerini bir dizi polimorfizm sekanslarina eslemek, (ii) DNA'nin eslenmis sekans segmentlerinden bir dizi polimorfizm sekansinin her biri için bir alel frekansi belirlemek ve (iii) alel frekanslarini fetüsü tasiyan bireyin kanindan elde edilen DNA içindeki fetal DNA fraksiyonunun ölçümünü elde etmek için bir karisini modeline uygulamak için talimat göndermek üzere yapilandirilmis bir bilgisayarli cihaz.

Fetal DNA fraksiyonunun ölçümü için bir baska aparat ise asagidaki unsurlari içerir: (a) (1) hem anneye ait bir genom hem de bir fetal genomun DNA'sini içeren bir Vücut sivisi numunesinden özütlenmis DNA'yi almak ve (ii) özütlenmis DNA'yi DNA segment dizileri üreten sartlar altinda sekanslamak için yapilandirilmis bir siralayici ve (b) bir ya da daha fazla islemciye (i) Vücut sivisindan türetilmis DNA segment sekanslarini karsilastirmak ve bu karsilastirmadan bir ya da daha fazla biallelik polimorfizmi tanimlamak, (ii) tanimlanan polimorfizmlerden en az biri için DNA segment sekanslarinin alel frekanslarini belirlemek, (iii) en az bir tanimlamis polimorfizmi hamile bireyin zigotlugu ve fetüsün zigotlugunun bir kombinasyonunu baz alarakr siniflandirmak ve (iv) hamile bireyden elde edilen DNA içindeki fetal DNA fraksiyonunu alel frekanslari ve zigotluk kombinasyonunu kullanarak ölçmek için talimat vermek üzere yapilandirilmis bilgisayarli bir cihaz.

Burada açiklanan aparat yönlerinde kullanilan talimatlar ve/veya donanim, bu islemlerin yukarida açikça söylenip söylenmemis olmasindan bagimsiz olarak, burada açiklanan metot yönlerinin herhangi bir ya da daha fazla bilgisayarli ya da algoritmik isleminin uygulanmasini saglayabilir.

Açiklanan uygulamalarin bu ve diger özellik ve avantajlari asagida ilgili çizimlere referansla daha detayli olarak açiklanacaktir. ÇIZIMLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, belli bir genom pozisyonu için fetal ve anneye ait zigotluk durumlarinin siniflandirmasini gösteren bir blok diyagramdir.

Sekil 2, açiklanan uygulamalardan bazilarinin uygulanmasi için bir örnek süreç akisidir.

Sekil 3, varsayilan parametrelerle Eland kullanilarak insan genomu HGl8'e hizalanmis Illumina GAZ verisinin 30 hatti üzerinde siralanmis baz pozisyonunun hata ölçümlerini göstermektedir.

Sekil 4, heterozigotluk vakalari 1 ila 4 için D kapsamina karsi minör alel sayimi A'ya dair (hata olmadigi varsayilarak) bir senaryodur.

Sekil 5, Durum 3 verisinin Durum 2 üzerine aktarilmasini göstermektedir.

Sekil 6, Dl'in seçildigi böylece Durum 1 ile Durumlar 2, 3'ün örtüsmedigi rotasyon sonrasi verisini göstermektedir. El Durum l verisinin yüzde 99 üst güven araliginin üst sinirini temsil etmektedir.

Sekil 7, sonuçlarin bir karisim modeli ve bilinen fetal fraksiyonu ve ölçülmüs fetal fraksiyonu kullanilarak bir karsilastirmasidir.

Sekil 8, makine hata oraninin. bilinen bir parametre olarak kullanilmasinin yukari yönlü yanliligini bir nokta kadar azalttigini göstermektedir.

Sekil 9, makine hata oraninin bilinen bir parametre olarak kullanan ve vakalar` 1 ve 2 hata› modellerini artiran simüle edilmis verinin 0,2 altindaki fetal fraksiyon için yukari yönlü yaklasimi bir noktadan aza büyük ölçüde azalttigini göstermektedir.

Sekil 10, düzgün sekilde yapilandirildiginda (örn., programlandiginda) ya da tasarlandiginda açiklanan uygulamalar için bir analiz aparati görevi gören bir bilgisayar sisteminin sematik bir gösterimidir.

Sekiller llA ve B, bir örnekte üretildikleri gibi kromozomlar l(A) ve 7 için minör alel yüzdeliginde (A/D) degisken gözlemlerinin (Frekans) sayisinin bir histogramini göstermektedirler.

Sekiller 12A ve B, kromozomlar l(A) ve 7 boyunca alelik frekans dagilimini göstermektedirler.

BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Giris ve Genel Bakis Açiklanmis belli uygulamalar, hamile bir kadinin kanindan alinan DNA'nin analiz edilmesini ve analizin fetustan gelen bu DNA'nin fraksiyonunun ölçülmesi için kullanilmasini içerir. DNA'nin fetal fraksiyonu daha sonra annenin kanindan alinan DNA'nin bagimsiz olarak analiz edilmesine bagli olarak fetüsün karakterizasyonu ya da bir baska ölçüsüne belli bir seviyede güven atamak için kullanilabilir. Örnegin, anneye ait kandan alinan bir fetal DNA numunesi, hamile kadin tarafindan tasinan fetüste anöploidiyi tespit etmek için ayrica analiz edilebilir.

Bu ayri analizle yapilan anöploidi belirlemesi, annenin kanindan alinan DNA içinde mevcut olan fetal DNA'nin fraksiyonel miktarina bagli olarak istatistiki olarak saglam bir güven düzeyi olarak verilebilir. DNA'nin toplam komplemani içindeki fetal DNA'nin görece düsük fraksiyonlari fetal DNA'ya bagli herhangi bir karakterizasyonda düsük bir güveni gösterir.

Illa ki öyle olmasa da tipik olarak annenin kanindaki analiz edilmis DNA'ya hücresiz DNA denir, gerçi bazi uygulamalarda bu hücre-bagli DNA olabilir. Hücresiz DNA annenin plazmasindan alinir. Hamile disilerden alinan hücresiz DNA içerigindeki fetal DNA miktari fetüsün gebelik müddeti de dahil olmak üzere bir dizi faktöre göre büyük ölçüde çesitlilik gösterir. Bugün, tipik hamile insan disileri için, hücresiz DNA'nin yaklasik %5- 'sinin fetal DNA olduguna inanilmaktadir. Ancak, fetal fraksiyonun anlamli sekilde daha düsük (örn., yaklasik %1 ya da daha az) olmasi nadir degildir. Böyle durumlarda, fetal DNA'nin herhangi ayri bir karakterizasyonu tabiati geregi süpheli olabilir. Diger taraftan, bazi arastirmacilar anneye ait hücresiz DNA numunelerinin %40 ya da %50'ye kadar yükselebilen miktarlarda fetal DNA fraksiyonlari içerdigini rapor etmislerdir.

Burada açiklanan bazi belli uygulamalarda, anneye ait DNA'nin fetal fraksiyonunun belirlenmesi, bir ya da daha fazla polimorfizmi barindirdigi bilinen sekans bölgelerindeki birçok DNA'nin sekans okumasina baglidir. Illa ki böyle olmasa da tipik olarak bu tür polimorfizmler tek nükleotid polimorfizmlerdir (SNP). Uygun polimorfizmlerin diger türleri arasinda delesyonlar, STRler (Kisa Tandem Tekrarlar), insersiyonlar, ekleme ya da çikarilmalar (mikro olanlar da dahil olmak üzere) vb. bulunur. Daha fazla örnek asagida sunulmustur. Belli uygulamalarda, polimorfizm alanlari asagida açiklandigi gibi bir polimorfizm alanlari sekans etiketlerinin birbirine ve/veya bir referans sekansina baglanmasi sirasinda kesfedilmistir.

Açiklanan bazi metotlar bir fetüsün dikkate alinan polimorfizm alanlarindaki DNA sekanlarinin anneninkilere karsilik gelmedigi olgusunu kullanirlar. Örnegin, belli bir SNP'nin alanindaki anne DNA'si homozigot olabilirken fetüsün SNP versiyonu heterozigot olacaktir. Dolayisiyla, söz konusu SNP için alinan sekans numunelerinin bir koleksiyonu majör aleli içeren, sekanslarin çogunlukta olmasi ve kalan fraksiyonun minör alelleri içermesiyle heterojen olacaktir. Majör ve minör alellerin ilgili miktarlari numune içindeki fetal DNA. fraksiyonu ile belirlenir.

Homozigot bir numunenin içinde verilen SNP ya da diger polimorfizmin her iki kopyasinin da ayni aleli içerdigi ve heterozigot bir SNP ya da diger polimorfizm içinde bir kopyanin majör alel ve bir kopyanin minör aleli içerdigi söylenmelidir.

Dolayisiyla, sadece heterozigot bir bireyden alinan DNA'nin %50 majör ve %50 minör alel içerecegi bilinecektir. Bu bilgi yukarida açiklandigi gibi fetal DNA fraksiyonunun açiklanmasinda kullanilabilir. Asagida daha detayli olarak açiklandigi üzere, burada açiklanan çesitli metotlar anneye ait ve fetal DNA içinde toplamda sadece iki alelin oldugu polimorfizmleri dikkate almaktadir.

Bazi uygulamalarda, annenin kanindan alinan DNA. birçok defa okunur, polimorfizmin belli bir alanina eslenen toplam okuma sayisi polimorfizmin “kapsami” ve bu polimorfizni için minör alele eslenen okuma sayisi minör alel sayimi olarak kabul edilir.

Minör alel sayiminin kapsama orani birçok uygulamada önemlidir.

Burada açiklanan metotlardan bazilari hem anneden hem de fetüsten DNA'yi içeren DNA numuneleri içindeki polimorfizmlerin dört durumunu tanimlar ve karakterize eder. Asagidaki Sekil 1 bu dört durumu göstermektedir. Özellikle, pek de ilgi çekici olmayan bir ilk durumda, hem anne hem de fetüs dikkate alinan belli polimorfizmde homozigottur. Böyle bir durumda, ilgili polimorfizmi içeren DNA numunesindeki her bir sekans ayni aleli içerecek ve anne ve fetüsden gelen DNA'nin göreli miktarlariyla ilgili herhangi bir bilgi alinamayacaktir. Ancak, unutulmamalidir ki bu durum arastirmaci ya da teknisyenin incelenmekte olan sekans verisini üretmek için kullanilan DNA sekanslama aparatinin göreli hata orani hakkinda bilgi edinmesini saglamasi açisindan ilgi çekici olabilir.

Analizin karsilasacagi ikinci duruni hamile disinin. homozigot fetüsün ise heterozigot oldugu bir polimorfizmdir. Bu durumda, tespit edilen sekanslarin görece küçük ama yine de anlamli bir fraksiyonu minör aleli içerir. Özellikle bu ikinci durumda, minör alel frekansi nominal olarak annenin ikiye bölünmüs kan akisindaki fetal DNA fraksiyonu tarafindan verilir. Üçüncü bir durumda, incelenen polimorfizm annenin DNA'sinda heterozigot ve fetüsün. DNA'sinda. homozigottur. Bu durumda, minör alel frekansi nominal olarak DNA numunesi içindeki fetal DNA fraksiyonunun yarisinin 0,5 eksigi tarafindan verilir.

Son olarak, dördüncü bir durumda incelenen polimorfizm hem anne hem de fetüste heterozigottur. Bu durumda, majör ve minör alellerin her ikisinin de 0,5 olmasi beklenir. Ilk durumda oldugu gibi, dördüncü durumda fetal DNA fraksiyonunun belirlenmesi için görece pek ilgi çekici degildir.

Eger arastirmaci, teknisyen ya da bir numune içindeki fetal DNA fraksiyonunu belirleme görevi verilen yazilim verilen bir polimorfizm için polimorfizmin dört durumdan hangisine ait oldugunu bilirse, incelenen polimorfizmin ikinci ya da üçüncü durumlardan biri içine düstügü düsünülerek fetal DNA fraksiyonu dogrudan ölçülebilir. Ancak uygulamada bu bilgiye önden sahip olmak mümkün degildir. Dolayisiyla, burada açiklanan islemleri yapmak için bilgisayarli aparata ihtiyaç duyulur.

Burada baska yerlerde açiklanan belli uygulamalarda tek bir polimorfizmi dört durumdan biri içine siniflandirmak için bir esik teknigi uygulanir. Polimorfizm bu sekilde siniflandirildik ve 2'ince ya da 3'üncü durumlardan biri içinde oldugu bulunduktan sonra, fetal fraksiyon ölçülebilir. Diger uygulamalarda, teknik bir' genomun tamami ya da bir kismi üzerine yayilmis birçok polimorfizmin varligini kabul eder. Spesifik örneklerde gösterildigi gibi, genom üzerindeki birçok farkli SNP bu amaçla kullanilabilir.

Belli uygulamalarda, alel frekansi bir annenin kan numunesinden alinan bir DNA numunesi içindeki bir dizi farkli polimorfizm için belirlenir. Bu polimorfizm çoklugu için, bazi fraksiyonlar zigotluk durumu l'e, bir diger fraksiyon durum 2'ye, üçüncü bir fraksiyon› duruni 3'e ve son› bir fraksiyon da duruni 4'e denk gelecektir. Bu fraksiyonlarin toplami l degerine esit olacaktir. Bir karisim modeli ya da benzeri teknik, bu dört kategorinin her biri içindeki polimorfizmlerin istatistiki özelliklerinden biri ya da daha fazlasini açikliga kavusturmak için kullanilabilir. Özellikle, bir karisim modeli bir ortalama ve opsiyonel olarak hamile bir disinin kanindan alinan bir DNA numunesi içinde karsilasilan. bu dört durumdan. her` biri için degiskeni belirlemek için kullanilabilir. Spesifik uygulamalarda bu, incelenen bir polimorfizm için toplam sayim sayisiyla ilgili minör alellerin frekansi ile iliskilendirilmis ortalama ve degiskendir (kapsam). Burada baska bir yerde açiklandigi üzere, bu dört kategoriden her biri için, ya da en azindan ikinci ve üçüncü kategoriler için ortalama degerler annenin kanindan alinan DNA içindeki fetal fraksiyonla dogrudan ilgilidir.

Karisim modellerini kullanan spesifik bir uygulamada, bir polimorfizmin incelendigi her bir pozisyon için bir ya da daha fazla çarpinim momenti hesaplanir. Örnegin, bir çarpinim momenti (ya da çarpinini momentleri yigini) DNA sekansinda incelenen birçok SNP pozisyonu kullanilarak hesaplanabilir. Asagidaki denklem 4'te gösterildigi üzere, çesitli çarpinim momentlerinin her biri belli bir pozisyon için minör alel frekansinin kapsama olan orani için incelenen çesitli SNP pozisyonlarinin tümünün bir toplamidir. Asagidaki denklem 5'te gösterildigi üzere, bu çarpinim momentleri ayrica yukarida açiklanan dört zigotluk durumunun her biri ile iliskilendirilmis parametrelerle de ilgilidir. Özellikle, bunlar her bir durumun olasiligiyla birlikte incelenen polimorfizmler yigini içinde bu dört durumun her birinin görece miktari ile alakalidir. Açiklandigi üzere, olasilik anne kanindaki hücresiz DNA içindeki fetal DNA fraksiyonunun bir islevidir. Asagida daha detayli olarak açiklandigi üzere, bu çarpinim momentlerinden yeterli sayida bir kismini hesaplayarak (ki bunlar denklem 4'te gösterilmistir), metot tüm bilinmeyenlerin çözümü için yeterli sayida ifade sunmaktadir. Bu durumda bu bilinmeyenler incelenen polimorfizm popülasyonu içinde bu dört durumun her birinin göreli miktari ve bu dört durumdan her biriyle iliskilendirilmis olasiliklar (ve dolayisiyla fetal DNA fraksiyonlari) olacaklardir. Bkz. Denklem . Benzer sonuçlar asagidaki denklemler 7-12'de gösterildigi gibi karisim modellerinin çesitli versiyonlari kullanilarak da elde edilebilir. Bu belli versiyonlar sadece durumlar 1 ve 2 içine düsen polimorfizmleri kullanirlar; durumlar 3 ve 4 içine düsen polimorfizmler bir esik teknigi ile filtrelenirler.

Dolayisiyla, çarpinim momentleri bir karisim modelinin bir parçasi olarak zigotlugun dört durumunun herhangi bir kombinasyonunun olasiligini belirlemek için kulalnilabilirler.

Ve bahsedildigi üzere, bu olasiliklar ya da en azindan ikinci ve üçüncü durumlardakiler anne kanindaki tplam hücresiz DNA içindeki fetal DNA fraksiyonu ile dogrudan iliskilidir.

Ayrica belirtilmelidir ki sekanslama hatasi çözülmesi gereken çarpinim momenti denklemleri sisteminin karmasikligini azaltmak için kullanilabilir. Bu baglamda, sekanslama hatasinin aslinda gerçekten (verilen herhangi bir polimorfizm pozisyonundaki dört olasi temelden herhangi birisine denk gelen) dört sonuçtan herhangi birine sahip olabilecegi fark edilmelidir.

Belli uygulamalarda, etiketler bir referans kromozomu ya da genomu ile hizalanirlar ve biallelik polimorfizmler belirlenirler. Bu polimorfizmler önceden tanimli ya da hizalama öncesi herhangi bir sekilde belirlenmis degildirler. Bunlar basit sekilde hizalama sirasinda tanimlanirlar ve sonra zigotluklari ve burada açiklandigi sekilde minör alel sayimlarina göre karakterize edilirler. Bu bilgi burada açiklandigi gibi genom fraksiyonlarinin hesaplanmasinda kullanilir.

Burada açiklanan uygulamalarda kullanilan etiketlerin uzunluklari genel olarak etiketlerin üretilmesi için kullanilan sekanssama metodu tarafindan belirlenecektir. Metotlar genis bir araliktaki etiket uzunluklari karsisinda saglamdir. Belli uygulamalarda, etiketler uzunluk olarak yaklasik 20 ila 300 baz çifti araligindadir (ya da yaklasik olarak 30 ila 100 baz çifti).

Açiklanan uygulamalardan bazilarinin uygulanmasi için örnek bir süreç akisi Sekil 2'de gösterilmistir. Orada gösterildigi üzere, süreç 201'de anneye ait kan ya da diger vücut sivisindan (hücresiz ya da hücre bagli) DNA alimi ile baslar. Bu DNA'dan, çoklu sekanslar bir referans sekansindaki bir ya da daha fazla polimorfizme eslenir. Bu esleme her bir polimorfizm için bir alel frekansi saglar. Bkz. Blok 203.

Daha belirgin olarak, blok 203'teki süreç alinan DNA'nin sekanslarinin birçok polimorfizm konumunda okunmasini içerebilir. Bazi durumlarda, bunlar fetal DNA'ya göre ploidi belirlemeleri ya da diger belirlemeler için sürecin bir parçasi olarak üretilebilirler. Dolayisiyla, bazi uygulamalarda, ayri sekanslarin üretilmesine gerek yoktur. Okuma sekanslari hizalamanin maksimize edilmesi için BLAST ya da benzeri bir araç kullanilarak referans sekansina hizalanir.

Referans sekansi bir polimorfizmler veri tabani olarak sunulabilir. Bazi durumlarda bu, bütün polimorfizm tanimlarinin (yani, polimorfizmlerin SNPler oldugu durumda, bütün SNP sekanslari) kombinasyonal bir genislemesinden üretilen bir alel aramasi referans setidir. Örnek için eke bakiniz. Spesifik bir örnekte, sekanslar uzunluk olarak yaklasik 100 ila 150 baz çiftidir.

Sekil 2'ye dönersek, metot blok 203'te incelenen bir ya da daha fazla polimorfizm için anne/fetus zigotlugunun kombinasyonunu belirler. Bkz. Blok 205. Belli uygulamalarda bu amaçla bir karisim modeli kullanilabilir. Bahsedildigi üzere, kombinasyonlar su sekildedir: M&F homozigot, M homozigot ve F heterozigot, M heterozigot ve F homozigot ve M&F heterozigot.

Son olarak, blok 207'de gösterildigi üzere, metot anneye ait numuneden alinan DNA içindeki fetal bilesenin fraksiyonal miktarini hesaplamak için bir ya da daha fazla polimorfizmde zigotluk durumu alel frekansinin kombinasyonunu kullanir.

Tanimlar Asagidaki açiklama, açiklanan uygulamalarin belli yön ve avantajlarinin anlasilmasinda bir yardimci olarak sunulmustur. sekans okumasini ifade eder. Illa ki sart olmasa da tipik olarak bir okuma numune içindeki bitisik baz çiftlerinin kias bir sekansini temsil eder. Okuma numune kisminin baz çift skeansi (ATCG içindeki) tarafindan sembolik olarak temsil edilebilir. Bu bir bellek cihazinda saklanabilir ve bir referans sekansiyla eslesip eslesmedigini ya da diger kriterleri karsilayip karsilamadigini belirlemek için uygun sekilde eslenebilir. Bir okuma dogrudan bir sekanslama aparatindan ya da dolayli olarak numuneyle ilgili depolanmis sekans bilgisinden elde edilebilir. ifade eder. Tipik olarak, bir etiket sekansin genom içindeki konumu gibi ilgili bilgileri içerir. Bazi amaçlar için, okuma ve etiket terimleri burada birbiri yerine kullanilmistir. Ancak, tipik olarak sekans Okumalari bir referans sekansina hizalanir ve referans genomu üzerinde tek bir bölgede eslesen okumalara etiketler denir. “Segment sekansi” burada bazen “etiket” yerine kullanilir.

Burada siklikla “okumalar” 36 baz çifti uzunlugundaki (36mers) nükleik asit sekanslari olarak açiklanirlar. Elbette ki, açiklanan uygulamalar bu boyutla sinirlandirilmis degildir. Daha küçük ve daha büyük okumalar birçok uygulamada uygundur.

Okumalari insan genomuna hizalayan uygulamalar için, 30 baz çifti ya da daha büyük bir okuma boyutu bir numuneyi tek bir kromozoma eslemek için genellikle yeterli bulunur. Çok daha büyük etiketler/okumalar bazi uygulamalar için uygundur. Tam genom sekanslama ile, 1000 baz çifti ya da daha büyük düzendeki okumalar kullanilabilir. Belli uygulamalarda, bir okuma yaklasik da yaklasik 30 ila 50 baz çifti araliginda bir uzunluga sahip olabilir.

Bir “referans sekansi” siklikla bir kromozom ya da genom gibi bir nükleik asit olan bir biyolojik molekülün sekansidir. Tipik olarak, çoklu okumalar verilen bir referans sekansinin unsurlaridir. Belli uygulamalarda, bir okuma ya da etiket referans sekansinin okuma sekansini içerip içermedigini belirlemek için bir referans sekansi ile karsilastirilir. Bu sürece bazen hizalama denir. Çesitli uygulamalarda, referans sekansi kendisine hizalanan okumalardan önemli ölçüde büyüktür. Örnegin, yaklasik en az 100 kat ya da yaklasik en az 1000 kat ya da yaklasik en az 10000 kat ya da yaklasik en az 105 kat ya da yaklasik en az 106 kat ya da en az 107 kat daha büyük olabilir.

Bir örnekte, referans sekansi bir tam uzunlukta insan genomunun sekansidir. Bu tür sekanslara genomik referans sekanslari denilebilir. Bir diger örnekte, refarans sekansi kromozom 13 gibi spesifik bir insan kromozomu ile sinirli olabilir. Bu tür sekanslara kromozom referans sekanslari denilebilir. Referans sekanlarinin diger örnekleri arasinda diger türlerin genomlari ve diger türlerin kromozomlari, alt kromozom bölgeleri (diziler gibi) Vb. bulunur. Çesitli uygulamalarda, referans sekansi bir konsensus sekansi ya da birçok bireyden türetilmis diger bir kombinasyondur. Ancak, belli uygulamalarda, referans sekansi belli bir bireyden alinabilir. ile karsilastirilmasi ve böylece referans sekansinin okuma sekansini içerip içermediginin belirlenmesi sürecine denilir.

Eger referans sekansi okumayi içeriyorsa, okuma referans sekansina eslenebilir ya da, belli uygulamalarda, referans sekansi içindeki belli bir konuma eslenebilir. Bazi durumlarda, hizalama basit sekilde bir okumanin belli bir referans sekansinin bir elemani olup olmadigini (yani okumanin referans sekansi içinde bulunup bulunmadigini) gösterir. Örnegin, bir okumanin insan kromozomu 13 için referans sekansina hizalanmasi okumanin kromozom. 13 için referans sekansinda bulunup bulunmadigini gösterecektir. Bu bilgiyi saglayan bir araca bir set üye test cihazi denilebilir. Bazi durumlarda, bir hizalama ek olarak okumanin ya da etiketin referans sekansi içinde eslestigi bir konumu da belirtir. Örnegin, eger referans sekansi tam insan genom sekansi ise, bir hizalama bir okumanin kromozom 13 içinde mevcut oldugunu gösterebilir ve ayrica okumanin kromozom 13'ün belli bir dizisi üzerinde oldugunu da gösterebilir.

Bir “alan” bir referans sekansi içinde bir okuma ya da etikete denk gelen benzersiz bir pozisyondur. Belli uygulamalarda, kromozomun kimligini (örn., kromozom 13), kromozomun bir dizisini ve kromozom içindeki belli bir pozisyonu belirler. geldigi bir lokustur. Lokus, bir baz çifti kadar küçük olabilir.

Açiklayici isaretleyiciler, her biri seçilen bir popülasyonun 6 l'inden daha büyük ve daha tipik olarak % 10 veya % 20'sinden daha büyük olan en az iki alel içerir. Polimorfik bölge, bir baz çifti kadar küçük olabilir. Burada kullanildigi sekliyle yerine kullanilmaktadir. örn. bir SNP ya da bir tandeni SNP içeren bir nükleik asit sekansini örn. bir DNA sekansini ifade eder. Mevcut teknolojiye göre polimorfik diziler, anneye ait ve anneye ait olmayan nükleik asitlerin bir karisimini içeren anneye ait numunedeki anneye ait ve anneye ait olmayan alelleri ayirt etmek için kullanilabilir.

Detayli Uygulamalar Tipik olarak, burada açiklanan süreçler bir ya da daha fazla polimorfizmi içeren ve numunesi alinan DNa ile iliskilendirilmis bir referans sekansini kullanir. Bir referans sekansi örnegin bir insan genomu, bir kromozom ya da bir kromozom içindeki bir bölge olabilir. Polimorfizmlerin bir ya da daha fazlasi fetal DNA fraksiyonunu hesaplamak amaciyla belirlenmis olabilir. Fetal fraksiyonu belirlemek için belirlenmis polimorfizmler önceden bilinen polimorfizmlerdir. Örnegin, önceden. bilinen STEler üzerindeki referanslar, olgular ve sekans bilgisine dair kapsamli bir liste ve ilgili popülasyon verisi STR tabaninda toplanmistir ve buna internette ibm4.carb.nist.gov:8800/dna/home.htnn adresinden 'ulasilabilir.

Yaygin olarak kullanilan STR lokuslari için GenBank® (http://www2.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/genbank)'dan gelen dizi bilgilerine de STRBase veritabani üzerinden erisilebilir. Önceden bilinen SNP'lerle ilgili bilgilere, dünya çapindaki web adresi wi.mit.edu olan Insan SNP Veri Tabani, dünya çapindaki web adresi ncbi.nlm.nih.gov, lifesciences.perkinelmer.com olan NCBI dbSNP Ana Sayfasi, dünya çapindaki web adresi appliedbiosystems.com olan Applied Biosystems, Life TechnologiesTM (Carlsbad, CA), dünya çapinda web adresi celera.com olan Celera Insan SNP veritabani, dünya çapindaki web adresi gan-iarc-fr olan Genom Analiz Grubu'nun (GAN) SNP Veri Tabani dahil olmak üzere, ancak bunlarla sinirli olmamak üzere, herkese açik erisilebilen veritabanlarindan temin edilebilir.

Bir uygulamada, fetal fraksiyonu belirlemek için atanmis SNPler Pkastis ve ark. tarafindan açiklanmis olan 92 ayri tanimlama SNPsi'nden olusan gruptan seçilir, (Pakstis ve ark. Hum Genet çok küçük varyasyonu sahip oldugu (FH<0.O6), ve 20.4 ortalama bir heterozigotlukla dunya çaginda son derece bilgilendirici oldugu gösterilmistir. Baglantili ve baglantisiz SNP'ler bulusa ait yöntem ile kapsanan SNP'ler arasinda bulunur. Uygun ardisik SNP dizilerini tanimlamak için International HapMap Consortium veritabani aranabilir (The International HapMap Project, Nature hapmap.org adresinde mevcuttur.

Bu sekilde kullanilan polimorfizmler fetal DNA fraksiyonunu belirlemek için atanmis önceden bilinen polimorfizmlerin panelleri olabilir ya da numune DNA etiketlerini kromozomlara esleme gibi diger amaçlar için anneye ait DNA'nin bir analizinde sans eseri bulunabilirler.

Belli uygulamalarda metot, örn. fetal ve anneye ait hücresiz DNA'yi içeren bir anneye ait numune kullanilarak bir referans genomu üzerindeki önceden bilinen polimorfik alanlari içeren sekanslara eslenen bir sekans etikerleri grubunu saglamak için genomlarin bir karisimi kullanilarak ve fetal fraksiyonu asagida detayli sekilde açiklandigi gibi belirlemek için önceden bilinen alanlarda eslenmis etiketler kullanilarak bir numune içindeki DNA'nin sekanslanmasini içerir. Alternatif olarak, DNA'nin sekanslanmasi sonrasinda, sekanslama teknolojisi, örn. NGS araciligiyla elde edilen sekans etiketleri referans genomuna, örn. hg19 eslenir ve polimorfizmlerin olustugu alanlara sans eseri eslesen sekans etiketleri, yani önceden bilinmeyenler, fetal fraksiyonu belirlemek için kullanilir.

Sekans etiketlerinin önceden bilinen polimorfik alanlara eslendigi referans sekansi yayinlanmis bir referans genomu olabilir ya da yapay bir veri tabani ya da incelenecek polimorfizmler için diger önceden tanimlanmis sekanslar koleksiyonu olabilir. Bu veri tabanlarinin her biri polimorfizmlerle iliskilendirilmis bir ya da daha fazla nükleotidi içerecektir. Bir örnek olarak, asagida “Ek 1"de sunulan polimorfizm sekanslari listesine bakiniz. Çesitli uygulamalarda, fetal DNA fraksiyonunu hesaplamak için kullanilan bir dizi polimorfizm en az 2 polimorfizmdir, ve bilhassa her biri için en az 10 polimorfizm ve daha da tercih edilir sekilde her biri için en az 100 polimorfizmdir.

Bir örnekte, SNP kapsami ve alel frekansi, üretilen sekanslarin SNP tanimlamalarinin kombinasyonal genislemesinden yapilandirilan bir referans genomuna hizalanmasi ile belirlenir.

Amplikon veri tabani örn. en az 50 komsu sekans bazi ile çevrelenmis biallelik varyasyon bilgisini içerir. Örnegin, (alternatif aleller g” ve “c"yi temsil eden) varyasyon bilgi dizisine “[g/c]” sahip bir amplikon söyle görünebilir.

Bazi durumlarda, amplikon veri tabani ve üretilmis sekanslar ve çikti SNP/alel sayimlarini girme prosedürü asagidaki gibidir. 1. SNP tanimlarinin kombinasyonal genislemesinden. bir alel referans seti olustur. Amplikon veri tabani içindeki her bir sekans için, varyasyon bilgisi dizisi içindeki her bir alel için, varyasyon bilgisi dizisinin alelle degistirildigi bir alel sekansi olustur. a. Örnegin, yukaridaki örnek amplikon sekansi düsünüldügünde, iki sekans olusturulacaktir: l) atcg accchcgt.... b Bir tam alel arama referans setinin bir örnegi Alel Arama Veritabani Sekans Listesinde bulunabilir. 2. Sadece arama seti içinde sadece bir sekansla eslesen eslesmeleri tutarak sekanslari alel arama referans setine 3. Alel sayimi, kendi alel sekansina eslesen sekanslarin sayisi sayilarak belirlenir.

Burada açiklanan metotlar “normal” bir hamileligi, yani annenin tek bir fetüsü tasidigi ve ikizlerinin, üçüzlerinin, Vb. olmadigi bir hamileligi varsaymaktadirlar. Teknikte yetkin kisiler normal olmayan hamilelikler, özellikle de fetüs sayisinin bilindigi normal olmayan hamilelikleri hesaba katan modifikasyonlarin yapilabilecegini bilecektirler.

Gösterildigi üzere, fetal fraksiyon belirlenirken, metot anne kanindan alinan numune içindeki DNA'yi sekanslar ve incelenen polimorfizmlerin her bir sekansina eslesen sekans etiketlerini sayar. Her bir polimorfizm için, metot buna eslenen toplam okuma sayisini (kapsam) ve her bir alelle iliskili sekans etiketlerinin sayisini (alel sayimi) sayar. Basit bir örnekte, 'lik bir kapsama sahip bir polimorfizm 3 alel B okumasi ve 2 alel A okumasina sahip olabilir. Bu örnekte, alel A'nin minör alel, alel B'nin ise majör alel oldugu kabul edilir.

Bazi uygulamalarda, bu islemde çok büyük ölçekte paralel DNA sekanslama araçlari gibi çok hizli sekanslama araçlarini kullanilir. Bu tür araçlarin örnekleri asagida daha ayrintili olarak açiklanmaktadir. Bazi durumlarda, binlerce ya da milyonlarca etiket sekansi tek bir numune için okunur. Tercihen, sekanslama sekanslanan DNA'nin incelenen polimorfizmleri barindiran önceden tanimli belli sekanslara hizla ve dogrudan atanmasina olanak taniyacak sekilde yapilir. Genel olarak, bu amaç için 30 baz çifti ya da daha büyük boyuttaki etiketlerde yeterli bilgi mevcuttur. Bu boyuttaki etiketler ilgili sekanslara açik bir biçimde eslenebilirler. Spesifik bir uygulamada, süreçte kullanilan etiket sekanslari uzunluk olarak 36 baz çiftidir.

Etiketler bir referans genomuna ya da bir alel sekans veri tabanindaki sekanslara (örn., daha önce bahsedildigi gibi Ek l'e bkz.) eslenirler ve bu sekilde eslenen etiketleri sayisi belirlenir. Bu, incelenen her bir polimorfizm için hem kapsam hem de minör alel sayimini verecektir. Bazi durumlarda bu, es zamanli olarak her bir etiketin 23 insan kromozomundan birine eslenmesi ve eslenen etikerlerin kromozom basina sayisinin belirlenmesi ile yapilabilir.

Bahsedildigi üzere kapsam, bir referans sekansi içinde verilen bir polimorfizme eslenen okuma sekanslarinin toplam sayisidir.

Alel sayimi, bir alele sahip böyle bir polimorfizme eslenen okuma sekanslarinin toplam sayisidir. Tüm alel sayimlarinin toplaminin kapsama esit olmasi gerekir. En yüksek sayima sahip alel majör alel ve en düsük sayima sahip alel minör aleldir. Belli uygulamalarda, fetal DNa fraksiyonunu hesaplamak için gereken tek bilgi polimorfizmlerin her biri için kapsam ve minör alel sayimidir. Bazi uygulamalarda, DNA sekanslama cihazinin bir baz çagirma hata orani da kullanilir.

Burada açiklanan belli metotlarin matematiksel ya da sembolik desteklemelerini dikkate almak faydali olacaktir. Bahsedildigi üzere, çesitli örneklerde, anne kanindan üretilen sekanslar bir referans genomuna ya da diger bir nükleik asit sekansina hizalanir (birbirinin ayni bazlar maksimize edilecek sekilde üst üste getirilir). Bir genomik pozisyon j ve referansa hizalanmis bir sekanslar dizisi için, hizalanmis sekanslar arasindaki dört DNA bazinin (“a", “t", “9" ve “c", ki bunlara aleller de denir) her birinin olusumlarini sirasiyla w(j,l), w(j,2), w(j,3), ve w(j,4) olsun. Bu açiklamanin amaçlari için, genellik kaybedilmeden tüm varyasyonlarin biallelik oldugu düsünülebilir.

Dolayisiyla, asagidaki simgeler kullanilabilirler: Majör Alel Sayimi genomik pozisyon j'de, j pozisyonunda sayimlarin ilk düzen istatistigi olarak söyledir maksimum argümandir. Alt simgeler birden fazla SNP incelendiginde kullanilir).

Minör Alel Sayimi pozisyon j'de, j pozisyonundaki sayimlarin ikinci düzen istatistigi olarak söyledir l' * Kapsani pozisyon j'de söyledir ve Sekanslama makinesi hata orani e ile gösterilmistir.

Içerik açik oldugunda, kolaylik açisindan isaretler birbiri yerine kullanilir; Örnegin, A, Ai ya da {ai} birbiri yerine minör alel ya da minör alel sayimini göstermek için kullanilabilirler.

Alt simgeler birden fazla SNP'nin incelenip incelenmedigine bagli olarak kullanilabilir ya da kullanilmayabilirler. (SNPler sadece örnekleme amaciyla kullanilmistir. Diger türlerdeki polimorfizmler burada baska bir yerde açiklandigi üzere kullanilabilirler).

Sekil 1'de, polimorfizm zigotlugunun dört durumu için tamem gösterilmistir. Gösterildigi üzere, anne belli bir polimorfizimde homo ya da heterozigot olabilir. Benzer sekilde, bebek de ayni pozisyonda heterozigot ya da homozigot olabilir.

Gösterildigi gibi, durumlar l \K3 2 annenin homozigot. oldugu polimorfizm durumlaridir. Hem bebek hem de anne homozigotsa, polimorfizm bir durum 1 polimorfizmidir. Yukarida belirtildigi üzere, bu durum tipik olarak pek ilgi çekici degildir. Eger anne homozigot ve bebek heterozigotsa, fetal fraksiyon f` nominal olarak minör alelin kapsama oraninin iki kati ile verilir.

Annenin heterozigot bebegin homozigot oldugu polimorfizm durumunda (Sekil l'deki durum 3 fetal fraksiyon nominal olarak bir eksi minör alelin kapsama oraninin iki kati olarak verilir.

Son olarak, hem anne hem de bebegin heterozigot oldugu durumda, minör alel fraksiyonu hata haricide her zaman 0,5 olacaktir.

Fetal fraksiyon durum 4 içinde kalan polimorfizmler için bulunamaz.

Dört durum buradan itibaren daha net açiklanacaktir.

Durum 1: Anne ve Bebek Homozigot ~ Bu durumda, sekanslama. hatasi ya da bulasma. haricinde, herhangi bir fark gözlemlenmemelidir. v Pratikte A ^~ düsüp np için Poisson dagilimiyla iyi bir sekilde yakinlastirilmis Binominal bir dagilim (olarak dagitilmistir). Binominal ya da Poisson için dagilim orani parametresi sekanslama hata orani, e ve kapsam D ile ilgilidir. Sekil 3, bir Insan referans genomuna hizalanmis üretilmis 36mer sekanslarinin yanlis esleme frekanslarini göstermektedir.

° Bu durum fetal fraksiyonla ilgili herhangi bir bilgi içermez.

Sekil 3, varsayilan parametrelerle Eland kullanilarak Insan Genomu HGl8'e hizalanmis Illumina GAZ verisinin 30 hatti üzerinde sekanslanmis baz pozisyonunca hata hesaplarini göstermektedir.

Durum 2: Anne Homozigot - Bebek Heterozigot ° Bu durumda, küçük fetal fraksiyon için (Il gözlemlenen alel frekanslari belirgin sekilde farkli olacaktir. Majör alel minör alelden genellikle defalarca kez daha fazla frekansta olusacaktir.

~ Hata haricinde, tek bir SNP pozisyonunda (D, A), E(A) = Df/2 ve f için yansiz bir tahmin 2A/D'dir.

° Hata. haricinde, A ^« Binominal (f/2, D). Ortalama Df/2, Varyans (l-f/2)Df/2. [Eger D>15 ise, yaklasik Normal uzaklikta].

Durum 3: Anne Heterozigot - Bebek Homozigot - Bu durumda, majör ve minör aleller için gözlemlenen frekanslar yakindir ve A/D 0,5'in hemen altindadir. f)/2), Varyans D/4(l-f^2).

Durum 4: Anne Heterozigot - Bebek Heterozigot Hata haricinde bunun için iki alt durum oldugu bilnmelidir.

Durum 4,1: Babadan gelen alel annenin alellerinden farklidir Bu E(A) = Df/2 ile minör alel olacak olan üçüncü bir aleli ortaya çikaracaktiri Bu durumlarin f'in hesaplanmasi üzerinde bir etkisinin olmamasi gerekir zira sekanslarin amplikonlara atanmasi prosedürü referans SNPler bi-allelik oldugunda bu durumlari eleyecektir.

Durum 4,2: Babadan gelen alel annenin alelleriyle uyumlu - Bu durumda, hata haricinde, iki alel lzl oraninda görünecektir bu sebeple bu durum fetal fraksiyonun hesaplanmasi için kullanisli degildir. 0,5'te kesilmistir.

Sekil 4, 1'den 4'e heterozigotluk durumlari için (herhangi bir hatanin omadigi var sayilarak) minör alel sayimi A'ya karsi kapsam D'nin oldugu bir senaryoyu göstermektedir. Çesitli uygulamalarda, metot genis anlamda bir ya da daha fazla SNP'deki (ya da diger polimorfizmlerdeki) alel frekansinin polimorfizmlerin durum 2 ve/Veya durum 3 içinde oldugunun siniflandirmasini yapmakla ilgilidir. Alel frekansini siniflandirma ile birlikte kullanarak, metot fetal fraksiyonu hesaplayabilir.

Bazi durumlarda, minör alel sayimi A ve kapsam D'nin, diger bir deyisle bireysel bir SNP pozisyonu için tek bir (D, A) pozisyonunun verilmesi metodun tek gbir noktayi hesaplamasina olanak tanir. Örnegin, belli metotlar (D, A) alel sayimina sahip bir SNP'yi bir durum içine siniflandirir ve fetal fraksiyonu hesabini söyle yapar: ESl.1 Duruma Karar Vermek Için Basit Esikler Ayri bir pozisyon (SNP) bilindiginde, 1. 2A/D < e gibi bir karar isleviyle ya da Binominain (e, D) ya da Poisson'un (De) tanimlanmis kritik bir degeriyle durum l'i seçin. Bu bulusun kapsami içinde alternatif bir dagilim da kullanilabilir. Herhangi bir fetal fraksiyonu (f) hesabi yoktur. 2 Eger 2A/d > (0,5-e) ya da Binominal'in kritik bir degeriyse (0,5, D) (ya da diger bir uygun yakinlastirma. dagilimi) duruni 4'ü seçin. Pozisyonu f'in bir hesabi için kullanmayin. 3. Diger durumlarda, eger 2A/D < 0,25 (ya da elle ayarlanmis ya da otomatik olarak hesaplanmis bir baska esik) ise, durum 2'yi seçin. Fetal fraksiyonu f 2A/D olarak hesaplanir. 4 Bunlar disinda durum 3'tür. Fetal fraksiyonu hesabi f=(1-2A/D)'dir.

Fetal fraksiyonu. hesaplamak için birçok SNP'den. alinan alel sayim bilgisini bilestirerek kesinlik elde edilebilir.

Metot EMI: Birçok SNP'yi Ortalama ile Bilestirin.

Ortalama, medyan ya da diger bir merkez ölçümünü alin (örnegin: Tukey bi-agirligi, M-tahmincisi, Vb...). Agirlikli ortalamalar da kullanilabilirler. agirliklarin nasil tanimlanacagina dair bir örnek için asagidaki EM2.4'e bakiniz. Ek olarak, merkezin saglam ölçümleri de kullanilabilir.

Metot EM2 dönüstürme araciligiyla durum 2 ve durum 3'ten es zamanli hesaplama f'in %X'ten az oldugu durumlarda, durum 3 noktalari (D,A) durum 2 noktalariyla çakisacak sekilde dönüstürülebilirler. Bu hattan orijin içinden gerileme araciligiyla ortak bir egri Dönüstürmeye bagli metotlarin bir teorik eksikligi durum 2 ve 3'ün binominal dagilimlarinin farkli sekillere sahip olacagidir.

Tipik fetal fraksiyon seviyelerinde (

Claims (15)

ISTEMLER
1. .Hamile bir bireyin bir Vücut sivisindan alinan bir DNA içindeki fetal DNA fraksiyonunu hesaplamanin bir metodu olup, özelligi; metodun a)hamile bireyin vücut sivisindan alinan DNA segmentlerinin bir dizi polimofizm sekanslarina eslenmesini, ki burada DNA bir dizi polimorfizm sekansini tanimlayan kosullar altinda sekanslanmistir; b)bu polimorfizm sekanslarinin her biri için eslenmis nükleik asitlerin bir alel frekansinin belirlenmesini; ve c)fetüsü tasiyan bireyin kanindan alinan DNA içindeki fetal DNA fraksiyonunun bir ölçümü elde etmek için alel frekanslarinin bir karisim modeline uygulanmasini içermesi; burada (b)-(c) adimlarinin belirleme ve uygulama için program talimatlari altinda çalisan bir ya da daha fazla islemci altinda gerçeklestirilmesidir.
2. .Istem 1'in metodu olup, özelligi; (c) adiminin polimorfizm sekanslarinin her biri için alel frekanslarinin çarpinim momentleri için bir denklemler serisinin çözülmesi için bir ya da daha fazla islemci üzerinde talimatlarin gerçeklestirilmesini içermesidir.
3. .Istem 1'in metodu olup, özelligi; ayrica (c) adimindan önce hem fetüs hem de hamile annede heterozigot oldugu belirlenen polimorfizmler için alel frekanslarinin bilgisayarli yöntemle çikarilmaSidir.
4. .Istem l'in metodu olup, özelligi; ayrica (c) adimindan önce hem fetüs hem de hamile annede homozigot oldugu belirlenen polimorfizmler için alel frekanslarinin bilgisayarli yöntemle çikarilmasidir.
5. . Istem l'in metodu olup, özelligi; ayrica (0) adimindan önce hamile bireyde heterozit oldugu belirlenen polimorfizmler için alel frekanslarinin bilgisayarli yöntemle çikarilmasidir.
6. .Istem 1'in metodu olup, özelligi; karisim modelinin sekanslama hatasini hesaba katmasidir.
7. 7.Istem l'in metodu olup, özelligi; hamile bir bireyin bir vücut sivisindan alinan DNA'nin hamile bireyin plazmasindan alinan hücresiz DNA olmasidir.
8. 8. Istem l'in metodu olup, özelligi; hamile bir bireyin vücut sivisindan alinan nükleik asitlerin eslenmesinin söz konusu segmentlerin bir polimorfizmler veritabanina eslenmesini içermesidir.
9. 9.Istem l'in metodu olup, özelligi; ayrica hamile bir bireyin vücut sivisindan bir numune almayi içermesidir.
10. 10. Istem l'in metodu olup, özelligi; ayrica hamile bireyin Vücut sivisindan alinan DNA'nin bir nükleik asit siralayici ile polimorfizm sekanslari içeren DNA segment sekanslari üreten kosullar altinda sekanslanmasini da içermesidir.
11. 11. Istem l'in metodu olup, özelligi; (a) adimindaki eslemenin bir dizi biallelik polimorfizm sekansinin tanimlanmasini içermesidir.
12. 12. Istem 1'in metodu olup, Özelligi; (a) adimindaki eslemenin DNA segmentlerinin bir dizi önceden tanimlanmis polimorfizm sekanslarina eslenmesini de içermesidir.
13. 13. Istem l'in metodu olup, özelligi; ayrica (c) adiminda hesaplanan fetal DNA fraksiyonunun hamile bir birey için bir hastanin bilgisayarda okunabilir bir ortamda saklanan medikal kaydina otomatik olarak kaydedilmesi için bir ya da daha fazla islemci üzerinde program talimatlarinin islenmesini de içermesidir.
14. 14. Istem 13'ün metodu olup, özelligi; söz konusu hasta medikal kaydinin bir laboratuvar, bir doktorun ofisi, bir hastane, bir saglik bakim organizasyonu, bir sigorta sirketi ya da bir kisisel medikal kayit sitesinde saklanmasidir.
15. 15. Istem l'in metodu olup, Özelligi; ayrica fetal DNA fraksiyonu hesaplamasina göre bir ya da daha fazla ek testin istenmesi ya da yapilmasidir.