TR201815682T4 - Kanser tedavisi. - Google Patents

Abstract

Bir insan tümörünün aksitinib tedavisine duyarlı olup olmadığının kestirilmesine yönelik tanı yöntemleri ve bir insan tümörünü tedavi etme yöntemleri açıklanır. Yöntemler, bir tümörden alınan bir doku örneği içinde CD68 polipeptiti ekspresyon düzeylerinin ölçülmesine dayanır. CD68 ekspresyon düzeyleri, immüno-histokimya kullanılarak ölçülebilir, burada tümör içinde CD68-pozitif hücrelerin yüzdesi ve CD68-pozitif hücrelerin yoğunluğu belirlenebilir.

Description

TARIFNAMEKANSER TEDAVISISAHAMevcut açiklamanin sahasi, moleküler biyoloji, onkolo ji ve klinik tani içerir. Istemde bulunulan mevcut bulus, aksitinib ile tedaviye duyarli bir tüinörün tanimlanmasina yönelik bir yöntem ve böyle bir yöntemkullanilarak kanser tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib sunar.GEÇMISKanser ilaçlarinin çogu bazi hastalarda etkilidir, ancak bazi hastalarda degildir. Bunun nedeni, tümörler arasindaki genetik farklilik olabilir ve ayni hastadaki tümörler arasinda bile gözlenebilir. Degisken hasta tepkisi özellikle hedeflenen terapötikler baglaminda belirgindir. Bu nedenle hedeflenen terapilerin tam potansiyeli, hangi hastalarin hangi ilaçlardan fayda saglanacaginin belirlenmesi için uygun testler olmadan elde edilemez. Ulusal Saglik Enstitüsüne (NIH) göre "biyo- marker" terimi, normal biyolojik veya patojenik proseslerin veya bir terapötik müdahaleye verilen farmakolojik tepkinin göstergesi olarak objektif sekilde ölçüler ve degerlendirilen bir karakteristik" olarak tanimlanir.Biyo-markerlerin kesfine dayali olarak gelismis tani araçlarinin gelistirilmesi, belirli bir ilaca klinik tepki göstermesi en olasi olan hastalarin önceden tanimlanmasi suretiyle yeni ilaç gelistirme sürecinihizlandirma potansiyeline sahiptir. Bu tani araçlari, klinik deneylerinbüyüklügünü, uzunlugunu ve maliyetini öneinli düzeyde azaltma potansiyeline sahiptir. Genomik, proteomik ve inoleküler görüntüleme gibi teknolojiler günümüzde spesifik gen mutasyonlarinin, belirli genlerin ekspresyon düzeylerinin ve diger moleküler biyo-markerlerin hizli, hassas ve güvenilir sekilde saptaninasini saglamaktadir.

Tümörlerin moleküler karakterizasyonuna yönelik çesitli teknolojilerin bulunmasina ragmen kanser biyo-markerlerinin klinik kullanimi, nISpeten az sayida kanser biyo-markeri kesfedilmis oldugundan büyük ölçüde gerçeklesmemistir. Ornegin yeni bir inceleme makalesi söyle der: Zorluk, kanser biyo-markerlerinin kesfedilmesidir. Moleküler hedefli ajanlar kullanilarak birçok tüinör tipinin moleküler tanimli alt kümesinin 7 örnegin kronik miyeloid lösemi, gastrointestinal stromal tümör, akciger kanseri ve glioblastoma multiform - hedeflenmesinde klinik basarilar saglanmasina ragmen bu basarilarin daha genis ölçekte uygulanmasi, hastalarda hedeflenen ajanlarin degerlendirilmesinde etkili bir strateji bulunmadigindan son derecede sinirlidir. Sorun asil olarak bu heyecan verici yeni ilaçlari degerlendirmek amaciyla moleküler tanimli kanserlere sahip hastalarin klinik deneyler için seçilememesinde yatar. Çözüm, belirli bir ajandan fayda saglamasi en olasi olan hastalari güvenilir sekilde tanimlayan biyo-markerler gerektirir. (Sawyers, 2008, Nature 452z548-552, at 548.)Yukaridaki gibi yorumlar, klinik açidan faydali biyo-markerlerin ve bu biyo-markerlere dayali tani yöntemlerinin kesfedilmesine duyulan ihtiyacin fark edildigini gösterir.Kanser biyo-markerlerinin üç ayri tipi mevcuttur: (1) prognostik biyo- markerler, (2) kestirimsel biyo-markerler ve (3) farmakodinamik (PD)biyo-markerler. Bir prognostik biyo-marker, bir kanseri, örn. bir katitümörü, agresiflige, yani büyüme ve/veya inetastaz hizina ve tedaviye gösterdigi refraktiflige göre siniflandirmak için kullanilir. Bu bazen “iyi sonuçlu” tümörlerin “kötü sonuçlu” tümörlerden ayirt edilmesi olarak adlandirilir. Kestirimsel bir biyo-marker, belirli bir hastanin belirli bir ilaçla yapilan tedaviden fayda saglamasi olasiligini degerlendirmek için kullanilir. Omegin ERBB2 (HER2 veya NEU) geninin amplifiye oldugu gögüs kanseri hastalarinin trastuzumab (HERCEPTIN®) ile yapilan tedaviden fayda saglamasi olasi iken ERBB2 gen amplifikasyonu olinayan hastalarin trastuzumab ile tedaviden fayda saglamasi olasi degildir. Bir PD biyo-markeri, bir hasta üzerinde bir ilacin, hastanin ilaci kullandigi siradaki etki(ler)inin göstergesidir. Buna göre PD biyo-markerleri siklikla yeni bir ilacin klinik gelistirmesinin ilk asamalari sirasinda dozaj düzeyine ve dozlaina sikligina dair bilgi almak için kullanilir. Kaiiser biyo- markerlerinin tartismasi için bakiniz örn., Sawyers, 2008, Nature 4521548-552. Rini ve arkadaslari, Clinical Cancer Research, l7(ll), 3841-9 (1 Haziran 2011), kati tüinörlerde aksitinib etkinliginin bir biyo-markeri olarak diastolik kan basincini açiklar.Aksitinib (ayrica lnlyta® olarak bilinir), vasküler endoteliyal büyüme faktörü reseptörleri (VEGFR”ler) üzerinde etkili, oral yoldan uygulanan, küçük moleküllü bir reseptör tirosin kinaz inhibitörüdür.

Aksitinibin anjiyojenezi inhibe ederek tümör büyümesini ve metastazi azalttigi ve bu reseptörleri eksprese eden ve bunlara bagimli hücreler üzerinde direkt etki göstererek tümör büyümesini azalttigi ve gerilemeye neden oldugu düsünülür. Aksitinib, hastalik sitokinler veya sunitinib (ayrica Sutent® olarak bilinir) sonrasinda ilerledikten veya bunlara direnç gösterdikten sonra metastatik renal hücre kanseri(mRCC) tedavisi için birçok ülke tarafindan onaylanmistir.VEGFR inhibitörlerine odakli çok sayida klinik Öncesi ve klinik arastirina olmasina ragmen bu inhibitörlerin anti-tümör aktivitesinden sorumlu mekanizmalar tam olarak anlasilmis degildir. Ozellikle tümöre infiltre eden lenfositlerin, mRCC hastalarinin prognozunun ve anti-anjiyojenik ajanlara duyarli]iginin/direncinin etkilenmesindeki rolü tam olarak anlasilmamistir (6111., bakiniz Polimeno ve arkadaslari, 2013, BJU Int 112:686-696). Hedeflenen terapinin diger tiplerinde oldugu gibi hastalarin tamami olmamakla birlikte bir kismi, aksitinib terapisinden fayda saglar. Bu nedenle aksitinib tedavisine tepki vermesi olasi (veya olasi olmayan) tümörlere sahip hastalarin tanimlanmasinda kullanilabilecek kestirimsel biyo-markerlere dayali tani yöntemlerine ihtiyaç vardir.OZETBurada daha detayli olarak tartisilacagi gibi mevcut açiklama kismen bir memeli tümöründen alinan bir doku örnegi içinde tümör miyeloid (yani farklilasma kümesi 68 "CD68") infiltrasyonunun (örn., pozitif hücrelerin yüzdesi ve CD68 pozitif hücrelerin yogunlugu baglamlarinda yükselmis CD68 düzeyleri), aksitinib ile ilerlemesiz hayatta kalmanin gelistirilmesi ile iliskili oldugu bulgusu ile ilgilidir.

Buna göre mevcut açiklama, aksitiiiib ile yapilan tedaviye pozitif tepki vermesi daha olasi olan bir tümörün tanimlanmasina yönelik yöntemler ve aksitinibe tepki vermesi daha olasi seklinde tanimlanmis tümörlere sahip süjelerin tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib sunar.Örnegin bir düzenekte açiklama, aksitinib tedavisine duyarli bir tümörün tanimlanmasina yönelik, sunlari içeren bir yöntem ile ilgilidir: (a) bir aksitinib ile tedavi edilmesi düsünülen bir insanhastadan elde edilen bir tümörden alinan bir doku örnegi içinde CD68polipeptiti ekspresyon düzeyinin ölçülmesi; ve (b) daha önce aksitinib ile tedavi edilmis ve aksitinibe dirençli oldugu gösterilmis insan hastalardan ve daha önce aksitinib ile tedavi edilmis ve aksitinibe duyarli oldugu gösterilmis insan hastalardan elde edilen tümörlerin doku örnekleri içinde CD68 polipeptiti ekspresyonuiiun ölçülmesi suretiyle belirlenmis bir esik CD68 ekspresyon düzeyi ile adim (aydaki CD68 ekspresyon düzeyinin karsilastirilmasi, burada esik düzeyinin üzerindeki bir CD68 ekSpresyon düzeyi, tümörün aksitinib ile yapilan tedaviye duyarli oldugunu gösterir. Bir baska düzenekte CD68 polipeptiti ekspresyonunun ölçülmesi adimi, immüno- histokimya ile gerçeklestirilir. Bir baska düzeiiekte CD68 polipeptiti ekspresyonunun immüno-histokimya ile ölçülmesi adimi, bir tam slayt taramasindan görüntü analizi yoluyla yapilir, burada örnek içindeki CD68-pozitif hücrelerin yüzdesi belirlenir. Bir baska düzenekte bu yöntemler ayrica örnek içinde CD68-pozitif hücrelerin yogunlugunun belirlenmesi adimini içerir. Bir baska düzenekte bu yöntemlerin herhangi birinde tümör, bir gögüs tümörü, bir akciger tümörü, bir böbrek tümörü, bir kolorektal tümör ve bir pankreatik tümörden olusan gruptan seçilir.Bir baska düzenekte mevcut açiklama, aksitinibin, burada tarif edilen yöntemlerden birine göre aksitinibe duyarli olan bir mRCC tümörüne sahip oldugu belirlenen bir hastaya uygulaiimasini içereii mRCC tedavisinde kullanilniaya yönelik aksitinib sunar.Bir baska düzenekte mevcut açiklama, sunlari içeren kanser tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib sunar: a) bir sü jeden aliiian bir tümör içinde CD68-pozitif hücrelerin yüzdesinin belirlenmesi; ve b) adi geçen yüzde, en az %2, en az %3, en az %4, en az %45, en az%46, en az %4.7, en az %4.8, en az %49, en az %5.0, en az %5.l, enaz %52, en az %53, en az %54, en az %55, en az %56, en az %57, en az %58, en az %59, en az %60, en az %65, en az %70, en az %8, en az %9, en az %10, en az %15 veya en az %20 ise aksitinibin sü jeye uygulanmasi.Bir baska düzenekte mevcut açiklama, sunlari içeren kanser tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib sunar: a) bir sü jeden alinan bir tümör içinde CD68-pozitif hücrelerin hücre yogunlugunun belirlenmesi; ve b) adi geçen hücre yogunlugu, en az 0.05 hücre/mmz, en az 0.06 hücre/mmz, en az 0.07 hücre/mmz, en az 0.08 hücre/mmz, en az 0.09 hücre/mmz, en az 1.0 hücre/mm?, en az 1.1 hücre/mmz, en az 1.2 hücre/inmz, en az 1.3 hücre/mmz, en az 1.4 hücre/mm2 veya en az 1.5 hücre/mm2 ise aksitinibin sü jeye uygulanmasi.Bir baska düzenekte mevcut açiklama, tümörlü bir sü jeye aksitiiiibin uygulanmasini içeren kanser tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib sunar, burada adi geçen tümördeki hücrelerin en az %2, en az %3, en az %4, en az %45, en az %46, en az %4.7, en az %4.8, en az %49, en az %50, en az %51, en az %52, en az %53, en az %54, en az %55, en az %56, en az %57, en az %58, en az %59, en az %60, en az %65, en az %70, en az %8, en az %9, en az %10, en az %15 veya en az %ZOâsi CD68-pozitiftir.Bir baska düzenekte mevcut açiklama, tümörlü bir süjeye aksitinibin uygulanmasini içeren kanser tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib sunar, burada adi geçen tümördeki CD68-pozitif hücrelerin hücre yogunlugu, en az 0.05 hücre/inmz, en az 0.06 hücre/inmz, en az 0.07 hücre/mmz, en az 0.08 hücre/mn?, en az 0.09 hücre/mmz, en az 1.0 hücre/mmz, en az 1.1 hücre/mmz, en az 1.2 hücre/mmz, en az 1.3 hücre/mmz, en az 1.4 hücre/mm2 veya en az 1.5 hücre/nnn2°dir.Bir baska düzenekte inevcut açiklama, sunlari içeren kansertedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib sunar: a) bir sü jeden alinan bir tümör içinde CD68-pozitif hücrelerin yüzdesinin belirlenmesi; b) tümör içinde CD68-pozitif hücrelerin hücre yogunlugunun belirlenmesi; ve 0) adi geçen yüzde, en az %2, en az %3, en az %4, en az %45, en az %46, en az %47, en az %48, en az %49, en az %50, en az %51, en az %52, en az %53, en az %54, en az %55, en az %56, en az %57, en az %58, en az %59, en az %60, en az %65, en az %70, en az %8, en az %9, en az %10, en az %15 veya en az %20 ise ve adi geçen hücre yogunlugu, en az 0.05 hücre/mmz, en az 0.06 hücre/mmz, en az 0.07 hücre/mmz, en az 0.08 hücre/mmz, en az 0.092 2hücre/mm, en az 1.0 hücre/mm 2, en az 1.1 hücre/mm , en az 1.2 hücre/mmz, en az 1.3 hücre/mm& en az 1.4 hücre/mm2 veya en az 1.5 hücre/ mm2 ise aksitinibin sü jeye uygulanmasi.Bir baska düzenekte mevcut açiklama, tümörlü bir süjeye aksitinibin uygulanmasini içeren kanser tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib sunar, burada adi geçen tümördeki hücrelerin en az %2, en az %3, en az %4, en az %45, en az %46, en az %47, en az %48, en az %49, en az %50, en az %51, en az %52, en az %53, en az %54, en az %55, en az %56, en az %57, en az %58, en az %59, en az %60, en az %65, en az %70, en az %8, en az %9, en az %10, en az %15 veya en az %20°si CD68-pozitiftir ve burada adi geçen tümördeki CD68-pozitif hücrelerin hücre yogunlugu, en az 0.05 hücre/mmz, en az 0.06 hücre/mmz, en az 0.07 hücre/mmz, en az 0.08 hücre/mmz, en az 0.09 hücre/mm2, en az 1.0 hücre/mmz, en az 1.1 hücre/mmz, en az 1.2 hücre/1111112, en az 1.3 hücre/mmz, en az 1.4 hücre/mm2 veya en az 1.5 hücre/inm2”dir.Bir baska düzenekte mevcut açiklama, burada açiklanan yöntemlerdenve kullaniinlardan herhangi birini sunar, burada adi geçen tümör, birgögüs tümörü, bir akciger tümörü, bir böbrek tümörü, bir kolorektal tümör ve bir pankreatik tümörden olusan gruptan seçilir. Bir düzenekte mevcut açiklama, burada açiklanan yöntemlerden ve kullanimlardan herhangi birini sunar, buradaki kanser veya tümör, inRCCdir.Diger düzeneklerde burada açiklanan yöntemler ve kullanimlar gerçeklestirilir, burada CD68 pozitif hücrelerin yüzdesinin veya hücre yogunlugunun ölçülmesi adimi, iminüno-histokimya kullanilarak gerçeklestirilir ve ayrica burada bir tümör örneginden alinan bir tam slayt taramasindan görüntü analizi kullanilir.Mevcut açiklamanin bazi düzeneklerinde makrofaj içeriginin ölçülmesi, bir makrofaj marker proteininin varliginin veya miktarinin ölçülmesi suretiyle yapilir. Diger düzeneklerde makrofaj içeriginin ölçülmesi, belirli bir hücre popülasyonu içinde makrofajlarin sayisinin belirlenmesi suretiyle yapilir. Örnegin makrofaj içeriginin ölçülmesi, bir makrofaj marker proteininin saptaninasini içeren iinmüno- histokimya ile yapilabilir. Bir baska düzenekte inakrofaj içeriginin ölçülinesi, bir makrofaj inarker proteinini sifreleyen mRNA”nin varliginin veya miktarinin ölçülmesi suretiyle yapilir. Makrofaj marker proteinlerinin ömekleri arasinda CCRZ, CD14, CD68, CDl63, CSFIR ve MSRl bulunur. Esik belirleme analizi, bir alici operatör karakteristik egri analizini içerebilir. Mevcut açiklamaya ait yöntemler, örn. gögüs tümörleri, akciger tümörleri, böbrek tümörleri, kolorektal tümörler ve pankreatik tümörler dahil çesitli tümörtiplerinin test edilmesi için faydalidir.ÇIZIMLERIN KISA TARIFI Sekil 1, A4061032 çalismasina dahil edilen süjelerin demografik vetaban çizgisi karakteristiklerini gösterir.Sekil 2, A4061032 çalismasinin bir parçasi olarak toplanan bloklara karsi slaytlara göre CD3 ve CD68 biyo-markerleri için pozitif hücrelerin yüzdesinin ve yogunlugunun bir özetini gösterir.Sekil 3, CD68 biyo-markeri için pozitif hücrelerin yüzdesinin ve yogunlugunun medyanindan küçük ile medyan degerlerinden yüksek veya bunlara esit olanlarin karsilastirmasi için PFS”nin bir Kaplan- Meier çiziinini gösterir.Sekil 4, önceden Sutent® tedavisi yapilmis hastalarda CD68 biyo- markeri için pozitif hücrelerin yüzdesinin ve yogunlugunun medyanindan küçük ile medyan degerlerinden yüksek veya bunlara esit olanlarin karsilastirmasi için PFS”nin bir Kaplan-Meier çiziinini gösterir.Sekil 5, CD3 biyo-markeri için pozitif hücrelerin yüzdesinin ve yogunlugunun medyanindan küçük ile medyan degerlerinden yüksek veya bunlara esit olanlariii karsilastirmasi için PFS”nin bir Kaplan- Meier çiziinini gösterir.Sekil 6, önceden Sutent® tedavisi yapilmis hastalarda CD3 biyo- markeri için pozitif hücrelerin yüzdesinin ve yogunlugunun medyanindan küçük ile medyan degerlerinden yüksek veya bunlara esit olanlarin karsilastirmasi için PFS°nin bir Kaplan-Meier çiziinini gösterir.Sekil 7, her CD3 ve CD68 biyo-markeri pozitif hücrelerin yüzdesi ve yogunlugu için medyan kesme noktasi katmanindan düsük ve bundan yüksek veya buna esit seklinde bir OS özetini gösterir.Sekil 8, önceden Sutent® tedavisi yapilmis hastalarda her CD3 ve CD68 biyo-markeri pozitif hücrelerin yüzdesi ve yogunlugu içinmedyan kesme noktasi katinanindan düsük ve bundan yüksek veya10buna esit seklinde bir OS özetini gösterir.Sekil 9, önceden Sutent® tedavisi yapilmis hastalarda pozitif hücrelerin yüzdesi ve yogunlugu için CD3 ve CD68 biyo-markerlerine ait medyandan düsük, bundan yüksek veya buna esit olanlarin karsilastirmasi için OS”nin bir Kaplan-Meier çizimini gösterir.Sekil 10, CD3 ve CD68 biyo-markerlerinin, pozitif hücrelerin yüzdesi ve yogunlugunun tepki kategorisine göre bir özetini gösterir.Sekil ll, önceden Sutent® tedavisi yapilmis hastalarda CD3 ve CD68 biyo-markerlerinin, pozitif hücrelerin yüzdesi ve yogunlugunun tepki kategorisine göre bir özetini gösterir.DETAYLI TARIFTanimlarBurada kullanildigi gibi Inlyta®, "AG-13736" ve "aksitinib", asagidaki kimyasal yapiya sahip, tuzlari ve poliinorflari dahil olmak üzere, 6-[2-(metilkarbam0il)fenilsülfanil]-3-E-[2-(piridin-2-il)eteni1]indazol anlamina gelir: Burada kullanildigi gibi "makrofaj inarker proteini", bir makrofaj hücre yüzeyi proteini anlamina gelmekte olup bunun saptanmasi, bir tümörden alinan bir doku ömeginde bulunan diger hücre tipleri arasindan makrofajlarin tanimlanmasi için faydalidir. Ornek insan makrofaj marker proteinleri, CCRZ, CDl4, CD68, CD163, CSF IR ve MSRl°dir. Diger makrofaj marker proteinleri, mevcut açiklamaninuygulanmasinda kullanilabilir.llBurada kullanildigi gibi "alici isletim karakteristigi" (ROC) egrisi, bir ikili siniflandirici sistemde dogru pozitif oranina (spesifiklik) karsilik yanlis pozitif oraninin (hassaslik) çizimi anlamina gelir. Bir ROCegrisinin yapilandirilmasinda asagidaki tanimlar geçerlidir:Yanlis negatif orani "FNR" = 1 - TPRDogru pozitif orani "TPR" = dogru pozitif / (dogru pozitif + yanlis negatif)Yanlis pozitif orani "FPR" : yanlis pozitif / (yanlis pozitif + dogru negatif)Burada kullanildigi gibi tedaviye "tepki" veya "tepki verme", tedavi edilen bir tümörle alakali olarak, tümörün sunlari göstermesi anlamina gelir: (21) büyümenin yavaslamasi, (b) büyümenin durmasi veya (c) gerileme.Burada kullanildigi gibi "esik belirleme analizi", belirli bir tümör tipini, örn. insan renal hücre karsinomayi temsil eden bir veri setinin, bu belirli tümör tipine yönelik bir esik degerini belirlemek amaciyla analiz edilmesi anlamina gelir. Belirli bir tümör tipini temsil eden veri seti, bu tümörlerin bir grubundan her tümör için sunlari içerebilir: (a) gerçek tümör tepki verileri (aksitinib gibi bir tedaviye tepki ve tepkisizlik) ve (b) makrofaj içerigi ve/veya CD68 ekspresyon düzeyleri.Burada kullanildigi gibi "esik skoru", bunun üzerinde bir tümörün, aksitinible yapilan gibi tedaviye olasilikla duyarli seklinde siniflandirildigi bir skor anlamina gelir.Burada kullaiiildigi gibi "CD68 ekspresyon düzeyi" veya "CD68polipeptiti ekspresyon düzeyi", bir tümör örnegi içinde eksprese edilen12CD68 proteini düzeyi anlainina gelir ve iinmüno-histokimya gibi uygun bir analitik teknik ile belirlenebilir. Ek olarak "CD68 ekspresyon düzeyi", verilen bir 'Örnek içinde "CD68-pozitif" oldugu belirlenen hücrelerin yüzdesi ve verilen bir 'Örnek içinde "CD68- pozitif" oldugu belirlenen hücrelerin yogunlugu dahil çesitli sekillerde ifade edilebilir.Burada kullanildigi gibi "CCRZ" (kemokin (C-C motif) reseptörü 2, ayrica CD 192, CKRZ, CMKBRZ, MCP-I- R, CC-CKR-Z, FLJ78302, MGC103828, MGClll760 ve MGC168006 olarak bilinir), Entrez GenelD No. 729230 ile tanimlanan gen tarafindan sifrelenen insan proteini ve bunun alelik varyantlari anlainina gelir.Burada kullanildigi gibi "CD14", Entrez GenelD No. 929 ile taniinlanan gen tarafindan sifrelenen insan proteini ve bunun alelik varyantlari aiilamina gelir.Burada kullanildigi gibi "CD68" (ayrica GPl 10; SCARDl; ve DKFZp686M 18236 olarak bilinir) , Entrez GeneID No. 968 ile tanimlanan gen tarafindan sifrelenen insan proteini ve bunun alelik varyantlari anlamina gelir.Burada kullanildigi gibi bir "CD68-pozitif" hücre, CD68 varliginin immüno-histokimya gibi uygun bir analitik teknik ile saptandigi bir hücredir.Burada kullanildigi gibi "CD163" (ayrica M1 30 ve MM 130 olarak bilinir), Entrez GeneID No. 9332 ile tanimlanan gen tarafindan sifrelenen insan proteini ve bunun alelik varyantlari anlamina gelir.

Burada kullanildigi gibi "CSFlR" (koloni uyarma faktörü 1 reseptörü, ayrica CSFR, FMS, FIM2, C-FMS ve CD115 olarak bilinir) , Entrez GeneID No. 1436 ile tanimlanan gen tarafindan sifrelenen insanproteini ve bunun alelik varyantlari anlainina gelir.13Burada kullanildigi gibi "MSRI " (makrofaj çöpçü reseptörü l, ayrica CD204, SCARAl, SR-A, phSRl ve phSR2 olarak bilinir), Entrez GeneID No. 4481 ile tanimlanan gen tarafindan sifrelenen insan proteini ve bunun alelik varyantlari anlamina gelir.Burada kullanildigi gibi "HR", tehlike orani anlamina gelir. Sekil 3, 4, , 6 ve 9,da orantili tehlikeler varsayildiginda, lsin üzerinde bir tehlike orani, tehlike oraninda < Medyan lehine bir azalmayi gösterir; 1”in altinda bir tehlike orani, tehlike oraninda >= Medyan lehine bir azalmayi gösterir; ve logrank p degerleri ancak her iki karsilastirma grubunda N>=10 oldugunda üretildi. Sekil 7 ve 8”de orantili tehlikeler varsayildiginda, l,in üzerinde bir tehlike orani, tehlike oraninda < Medyan lehine bir azalmayi gösterir; l”in altinda bir tehlike orani, tehlike oraninda >: Medyan lehine bir azalmayi gösterir; ve logrank p degeri ancak her iki karsilastirma grubunda N>:10 oldugunda üretildi ve tehlike orani istatistigi sadece her iki karsilastirma grubunda N>=5 oldugunda üretildi; bununla birlikte herhangi bir grupta sifir olaygözlendiginde logrank p degeri ve tehlike orani çikarildi.Klinik ÇalismalarBundan böyle aksitinib olarak anilacak olan Inlyta®, vasküler endoteliyal büyüme faktörü reseptörleri (VEGFR°ler) üzerinde etkili, oral yoldan uygulanan, küçük moleküllü bir reseptör tirosin kinaz inhibitörüdür. Aksitinibin anjiyojenezi inhibe ederek tümör büyümesini ve metastazi azaltmasi ve bu reseptörleri eksprese eden ve bunlara bagimli olan hücreler üzerinde direkt etki göstererek tümör büyümesini azaltmasi ve gerilemeye neden olmasi beklenir. Aksitinib, hastalik sitokinler veya sunitinib sonrasinda ilerledikten veya bunlaradirenç gösterdikten sonra metastatik renal hücre kanseri (mRCC)14tedavisi için birçok ülke tarafindan onaylanmistir.A4061032 Çalismasi (ClinicalTrialsgov Kimligi: NCT00678392), "Metastatik renal hücre kanseri için ikinci hat terapisi olarak Aksitinib (AG-013736): Aksis deneyi" baslikli bir faz 3 kayitlamali deneydi.

Deney, bir birinci hat rejimi basarisiz olduktan sonra mRCC'li hastalarda tümör ilerlemesiniii geciktirilmesinde aksitinibin sorafenibden üstün oldugunu göstermek üzere tasarlandi. Toplam 650 hastaniii kaydedilmesi planlandi ve nihayetinde çalismaya 723 süje kaydedildi.Orneklerde daha detayli olarak tarif edildigi gibi formalin ile sabitlenmis, parafine gömülü (FFPE) tümör örnekleri, A4061032”ye katilan ve tümör örneginin alinmasi için özel onay vermis hastalardan toplandi. Tümör miyeloid (farklilasma kümesi 68 "CD68") veya lenfosit (farklilasma kümesi 3 "CD3") infiltrasyonu, aksitinib ile tedavi edilen 52 hastadan alinan tümör örnekleri içinde immüno- histokimya (IHC) ile degerlendirildi. Amaç, miyeloid infiltrasyonunun, VEGF-VEGFRZ yolagini hedefleyen anti- anjiyojenik ajanlara karsi direnç verdigi hipotezi ile tutarli olarak bu biyo-markerlerin etkinlik ile potansiyel bagdasmasini arastirmakti (bakiniz Shojaei ve arkadaslari, (2007) Nat. Biotechnol. 25(8):9ll- 920; ve Lin ve arkadaslari, (2010) Eur. J. Cancer Suppl. 8(7): 191).

CD3 ve CD68 degerlendirmesi, bir tam slayt taramasindan görüntü analizi ile yapildi. Ilgili bölge daire içine alindi ve bir görüntü analizi algoritmasi çalistirildi. Pozitif hücrelerin yüzdesi (pozitif hücre sayisi/toplam hücre sayisi) ve pozitif hücrelerin yogunlugu (örn., pozitif hücre sayisi/mniz) ölçüldü. Bazi hastalar, FFPE bloklari bagisladi ve bazilari, bloklardan kesilmis slaytlar bagisladi. Tümhastalardan alinan örnekler, ister slayt ister blok halinde verilmis15olsun, analiz edildi.IHC verileri için degerlendirilebilecek 52 hasta vardi, bunlarin 33”ü ise daha 'once Sutent® (suntinib) ile tedavi edilmisti. CD3 verileri ile ölçülen uç noktalardan biri arasinda korelasyon yoktu. Orneklerde daha detayli olarak tarif edildigi gibi CD68 için pozitif hücrelerin yüzdesi ve hücre yogunlugu yakindan iliskiliydi ve objektif tepki bulunan hastalarda tepki vermeyenlere göre iki kat daha yüksekti.

Onceki tedaviden bagimsiz olarak 2 inedyan CD68 degerlerine (kesme: %521 pozitif hücreler veya hücre yogunlugu 0.08 hücre/mmz) sahip hastalarda medyan ilerlemesiz hayatta kalma (PFS), her iki kesme noktasi için 12.0 ay iken degerlerine (tehlike orani [HR]=0.42, logrank p degeri $50.01) sahip hastalar için sirasiyla 3.7 ve 3.8 ay idi. Sutent® ile `Önceden tedavi edilmis hastalar için PFS ile benzer bir trend, marjinal istatistiksel anlamlilik ile gözlendi (p degerleri: % pozitif hücreler için 0.066 ve hücre yogunlugu için 0.056). Nispeten daha yüksek CD68 hücre sayisina sahip hastalar için objektif tepki ve genel hayatta kalma (OS) baglaminda benzer istenilen etkinlik gözlenmesine ragmen bu farkliliklar, tüin hastalar birlikte degerlendirildiginde veya sadece Sutent® ile önceden tedavi edilmis hastalar degerlendirildiginde istatistiksel açidan anlamli degildi.Taban çizgisi tümör CD68 düzeylerinin hassasligini ve spesifikligini daha iyi anlamak ve baslangiçta seçilen medyan CD68 degerlerinden CD68 kesme noktalarinin tanimini optimize etmek ainaciyla ilave alici isletim karakteristikleri (ROC) analizleri yapildi. 2, 4, 6 ve 8 aylik PFS varsayilan kesme degerleri seçildi ve yine daha yüksek CD68 pozitif hücre yüzdesine ve hücre yogunluguna sahip hastalarin dörtPFS zaman noktasinin her birinde PFS için daha uzun degerlere (veya16denk sekilde daha düsük hastalik ilerleme veya ölüm sansina) sahip olduklari gözlendi.Orneklerde daha detayli olarak tarif edildigi gibi gözlemlenen en yüksek hassaslik, spesifiklik ve egri altindaki alan (AUC) degerleri, 2 aylik PFS°de gözlenilenirken ROC egrisinin AUC”leri, CD68 pozitif hücre yüzdesi için 0.776 ve hücre yogunlugu için 0.809 idi, bu da PFS için CD68 ekspresyon düzeyleri kullanilarak ikna edici genel tani dogrulugunu gösterir. 6 ayda PFS”nin kestirilmesine yönelik Optimum kesine noktalari, CD68 yüzdesi için %4.41 ve pozitif hücrelerin yogunlugu için 0.06 hücre/mm2 idi. Sutent® ile önceden tedavi edilmis hastalar için degerler benzerdi.ROC analizi de ORR”ye karsilik CD68°in degerlendirilmesi için kullanildi. Orneklerde daha detayli olarak tarif edildigi gibi AUC'ler, CD68 pozitif hücrelerin yüzdesi için 0.791 ve hücre yogunlugu için 0.784 idi, bu da yine CD68 ekspresyon düzeyleri kullanilarak ORR”nin kestirilinesi için ikna edici genel dogruluk gösterir. ORR”nin kestirilmesine yönelik optimum kesme noktalari, CD68 pozitif hücre yüzdesi için %942 ve hücre yogunlugu için 0.13 hücre/mm2 idi.

Sutent® ile önceden tedavi edilmis hastalar için degerler benzerdi. 21 ayda hayatta kalma olasiligi, deneye ait medyan degeri için ROC analizi, 0.559”luk bir AUC ile istatistiksel açidan anlamli bir bagdasma göstermedi.Sonuç olarak önceki tedaviden bagimsiz sekilde istenilen PF S, daha yüksek tümör CD68 düzeylerine sahip hastalar için gözlendi. >Medyan CD68 degerlerine sahip hastalarda medyaii PFS, her iki kesme noktasi için 12.0 ayken (HR:0.42, logrank p degeri 50.01) sahip hastalar için bu 3.7 ve 3.8 aydi. ROC analizi, bu veriler için 2, 4, 6 ve 8 aylarda ikna edici17kestiriin degeri ve rafine kesme noktalari (6 ayda - CD68 pozitif hücrelerin yüzdesi için %4.41 ve hücre yogunlugu için 0.06 hücre/mmz) gösterdi.Buna göre mevcut açiklama, daha yüksek CD68 ekspresyonunun, bir VEGFR inhibitörü, örnegin aksitiiiib ile tedavi edilen hastalar için daha yüksek ORR ve daha uzun PFS ile baglantili oldugu bulgusuna iliskindir. OS ile baglantinin olmainasinin nedeni, aksitinib ile ilerleme üzerine sasirtici ilerleine sonrasi tedaviler olabilir. Bu gözlemler, artan VEGF üretimi mekanizmasi ve daha yüksek inakrofaj infiltrasyonu ile baglantili an jiyojenik durum ve böylelikle aksitinibin tedavi etkilerine daha yüksek duyarlilik ile tutarlidir. PFS”nin ROC analizi, kayitsal uç nokta, iki ay tedavi sonrasinda en yüksek duyarlilik ve spesifiklik gösterdi.CD68 ekspresyonunun daha öiice tivozanib tedavisi alan mRCC hastalari için sonuç ile baglantili oldugu bildirilmisti (Lin ve arkadaslari, (2010) Eur. J. Cancer Suppl. 8(7):19l). Miyeloid (CDl lb Gr+) hücrelerinin de daha önce bir akciger hayvan modelinde bevasizuinaba karsi direnç verdigi gösterilmisti (Shojaei ve arkadaslari, (2007) Nat Biotechnol. 25(8):911-920). Bu veriler, daha yüksek CD68 tümör düzeylerine sahip hastalara ait daha kötü soiiuçlar ile tutarli olacaktir. Bununla birlikte bu çalismada bu gözlenmedi.

RCC hastalari için prognostik biyo-markerlerin taniinlanmasinda anlainli bir ilerleme kaydedildi, ancak aksitinib gibi hedefli VEGFR inhibitörleri için kestirimsel etkinlik markerleri tanimlanmadi. Yeni bir incelemeye göre (Tonini G ve arkadaslari, (2011) Exper Rev Anticancer Ther ll (6):921 -930), RCC hastalari için en uygun terapinin seçilmesi hala risk kriterlerine (MSKCC) ve diger prognostikkriterlere baglidir. Ek olarak yazarlar, bu kombine kriterlerin RCC18hasta sonucu üzerinde bilgi sagladigini ve mRCC için terapiye tepkiye yönelik kestirim faktörlerine ihtiyaç oldugunu belirtirler. Randomize edilmis klinik deneylerde potansiyel inarkerlerin geçerlenmesine ihtiyaç vardir (Id.). Doku toplama ve analizinin standart hale getirilmesinden de terapiye potansiyel kilavuzluk edecek moleküler biyo-markerlerin gelistirilmesinde önemli bir zorluk olarak bahsedilir (Sonpavde G ve Choueiri T, (2012) Br J Cancer 107(7): 1009-1016).Mevcut açiklamanin gerçeklestirilmesinde kullanilabilecek yöntemlerve analitik teknikler asagida ayrica açiklaninistir.Doku ÖrnegiBir insan hastadan alinan bir tümörden bir doku örnegi, immüno- histokimya (IHC) için bir RNA kaynagi, bir protein kaynagi veya bir ince kesit kaynagi olarak kullanilabilir, bu sekilde örnek içindeki CD68 ekspresyon düzeyi, mevcut açiklamada tarif edildigi gibi belirlenebilir. Doku örnegi, geleneksel tümör biyopsi aletleri ve prosedürleri kullanilarak alinabilir. EndoskOpik biy0psi, eksizyonel biyopsi, insizyonel biyopsi, ince igne biyopsisi, punch biyopsi, tiras biyopsisi ve deri biyopsisi, bu konuda uzman kisilerce tüinör örnekleri alinak için kullanilabilecek kabul görmüs tibbi prosedürlere örnektir.

Tümör dokusu örnegi, marker geninin, öm. CD68 ekspresyon düzeyinin ölçülmesi veya niakrofajlarin IHC ile, örn. CD68-pozitif hücre ekspresyonunun görsellestirilmesi için yeterli RNA, protein veya ince kesit saglamak için yeterince büyük olmalidir.Tümör dokusu örnegi, makrofaj içeriginin veya spesifik olarak CD68'in ölçülmesine izin veren herhangi bir formda olabilir. Baska bir deyisle doku örnegi, RNA özüinleinesi, protein özümlemesi veyaince kesitlerin hazirlanmasi için yeterli olmalidir. Buna göre doku19örnegi, taze olabilir, uygun karyogenik tekniklerle korunabilir veya karyogenik olmayan tekniklerle korunabilir. Klinik biyopsi örneklerinin kullanilmasina yönelik standart bir proses, doku örnegini formalin içinde sabitlemek ve sonra buru parafine gömmektir. Bu formdaki örnekler yaygin sekilde forinalin ile sabitlenmis, parafine gömülmüs (FFPE) doku olarak bilinir. Daha sonra analiz edilmek üzere dokunun hazirlanmasi için uygun teknikler bu konuda uzmankisilerce iyi bilinmektedir.Makrofaj IçerigiMevcut açiklamanin uygulanmasinda makrofa j içerigi düzeyinin (örn., makrofaj sayisinin veya bir makrofaj markerinin, örnegin CD68”in ekspresyonunun, örn. bir makrofaj marker proteininin ekspresyonunun veya bir makrofaj marker proteinini örnegin CD68°i sifreleyen bir mRNA”nin ekspresyonunun) bir doku örnegi (öm., bir tümörden) içinde belirlenmesi, herhangi bir uygun yöntemle yapilabilir ve bunlar çoktur. Örnegin makrofaj içeriginin dolayli yoldan ölçülmesi, CD68 gibi makrofaj markerleri olarak faydali oldugu bilinen bir veya daha fazla genin ekspresyonunun ölçülmesi suretiyle yapilabilir. Gen ekspresyonunun ölçülmesine yönelik çesitli yöntemler bu konuda bilinmektedir. Bu yöntemler, makrofaj marker proteinlerinin veya makrofaj marker proteinlerini sifreleyen mRNAHiin düzeyinin belirlenmesinde uygulanabilir. Ornek insan makrofaj marker genleri, CCR2, CDl4, CD68, CD163, CSFIR ve MSR1°dir. Diger inakrofajmarkerleri de kullanilabilir.RNA AnaliziGeleneksel mikro-dizi analizi ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu20(QPCR), makrofaj inarker geni ekspresyonu düzeyinin mRNA düzeyinde belirlenmesine yönelik yöntemlerin örnekleridir.

Açiklamanin bazi düzeneklerinde RNA, ilgili hücrelerden, tüinörden veya dokudan standart protokoller kullanilarak alinir. Diger düzeneklerde RNA analizi, RNA izolasyonu gerektirmeyen tekniklerkullanilarak yapilir.RNA IzolasyonuOkaryotik mRNA°n1n, yani poli(a) RNA°nin doku örneklerinden hizli ve veriinli sekilde özümlenmesine yönelik yöntemler iyi olusturulmustur ve bu. konuda uzman kisilerce bilinmektedir. Bakiniz örn., Ausubel ve arkadaslari, 1997, Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons. Doku örnegi, taze, dondurulmus veya sabitlenmis, parafine gömülmüs (FFPE) örnekleri, örnegin klinik çalismaya yönelik tümör örnekleri olabilir. Genel olarak taze veya dondurulmus doku örneklerinden izole edilen RNA, FFPE örneklerinden gelen RNA”dan daha az parçalanmis olma egilimi gösterir. Bununla birlikte tümör materyalinin FFPE örnekleri daha kolay temin edilebilir ve FFPE örnekleri, mevcut açiklamaya ait yöntemlerde kullanilmaya uygun RNA kaynaklaridir. RT-PCR ile gen ekspresyonu profillemesi için RNA kaynaklari olarak FFPE örneklerinin bir tartismasi için bakiniz, örn. Clark-Langone ve arkadaslari, 2007, BMC Genomics 81279. Ayrica bakiniz De Andres ve arkadaslari, 1995, Biotechniques 18:42044; ve Baker ve arkadaslari, ABD Patent Basvurusu Yayini No. 2005/0095634.

RNA”nin özümlenmesi ve hazirlanmasina yönelik satici talimatlarinin bulundugu ticari olarak temin edilebilen kitlerin kullanilmasi yayginve geneldir. Çesitli RNA izolasyon ürünlerinin ve komple kitlerin21ticari saticilari arasinda Qiagen (Valencia, CA), lnvitrogen (Carlsbad, CA), Ambion (Austin, TX) ve Exiqon (Woburn, MA) bulunur.Genel olarak RNA izolasyonu, doku/hücrenin parçalanmasi ile baslar.

Doku/hücre parçalanmasi sirasinda RNAzlar tarafindan RNA degradasyonunun minimize edilmesi arzu edilir. RNA izolasyonu prosesi sirasinda RNAz aktivitesini sinirlamaya yönelik bir yaklasim, hücreler parçalandigi anda bir denaturanin hücre içerikleri ile temas etmesini saglamaktir. Baska bir yaygin uygulama, bir veya daha fazla proteazi RNA izolasyon prosesine dahil etmektir. Istege bagli olarak taze doku `Örnekleri, toplandiklari anda oda sicakliginda bir RNA stabilizasyon çözeltisi içine batirilir. Stabilizasyon çözeltisi hizla hücrelere nüfuz ederek RNA”li daha sonra izole edilmek üzere 4 santigrat derecede saklanmak için stabilize eder.Bazi protokollerde toplam RNA, parçalanan tümör materyalinden, sesyum klorid dansite gradyanli santritüj yoluyla izole edilir.

Genellikle mRNA, toplam hücresel RNA”nin yaklasik yüzde 1'i ila yüzde 5”ini olusturur. Immobilize edilmis Olig0(dT), örn., olig0(dT) selüloz, mRNAsyi ribozoinal RNA”dan ve transfer RNA”dan ayirmak için yaygin sekilde kullanilir. Izolasyon sonrasinda saklaniyorsa RNA, RNazsiz kosullar altinda saklaninalidir. Izole edilmis RNA”nin stabil saklanmasina yönelik yöntemler bu konuda bilinmektedir. RNA°n1nstabil saklanmasina yönelik çesitli ticari ürünler mevcuttur.Mikro-diziCD68 gibi makrofa j marker proteinlerini sifreleyen bir veya daha fazla genin mRNA ekspresyon düzeyi, geleneksel DNA mikro-dizi ekspresyon profilleme teknolojisi kullanilarak ölçülebilir. Bir DNAmikro-dizisi, cam, plastik veya silikon gibi bir kati yüzeye veya22substrata eklenmis spesifik DNA segmentlerinin veya sondalarinin bir koleksiyonu olup her spesifik DNA segmenti, dizi içinde biliiien bir yeri isgal eder. Bir etiketli RNA örnegi ile genellikle kati hibridizasyon kosullari altinda hibridizasyon, dizi içinde her sondaya karsilik gelen RNA moleküllerinin saptanmasina ve iiicelendirilmesine izin verir. Spesifik olmayan sekilde baglanmis örnek materyalini çikarmak için kati yikama sonrasinda mikro-dizi, koiifokal lazer mikroskobu veya baska bir uygun saptama yöntemi ile taranir` Siklikla DNA çipleri olarak bilinen modern ticari DNA mikro- dizileri tipik olarak on binlerce sonda ihtiva eder ve böylelikle on binlerce genin ekspresyonunu ayni anda ölçebilir. Bu mikro-diziler, mevcut açiklamanin uygulanmasinda kullanilabilir. Alternatif olarak CD68 gibi makrofaj marker proteinlerini sifreleyen bir veya daha fazla genin ekspresyonunu ölçmek için gerekli olanlar kadar az sonda, arti örnegin veri normallestirme için gerekli kontrolleri veya standartlari ihtiva eden bilindik çipler, açiklamanin uygulamasinda kullanilabilir.

Veri normallestirmesi için iki renkli bir mikro-dizi okuyucu kullanilabilir. Iki renkli (iki kanalli) bir sistemde Örnekler, bir birinci dalga boyunda yayina yapan bir birinci florofor ile etiketlenirken bir RNA veya CDNA standardi, farkli bir dalga boyunda yayma yapan bir ikinci florofor ile etiketlenir. Ornegin Cy3 (570 nm) ve Cy5 (670 nm), iki renkli mikro-dizi sistemlerinde siklikla birlikte kullanilir.DNA mikro-dizi teknolojisi iyi gelistirilmistir, ticari olarak temin edilebilir ve yaygin sekilde kullanilmaktadir. Bu nedenle burada açiklanan yöntemlerin ifasinda bu konuda siradan bilgiye sahip bir kisi, gereksiz denemeler yapmadan CD68 gibi makrofaj marker proteinlerini sifreleyen genlerin ekspresyon düzeylerini ölçmek içinmikro-dizi teknolojisi kullanabilir. DNA mikro-dizi çipleri, reaktif23maddeler (ömegin RNA veya cDNA preparasyonuna, RNA veya cDNA etiketlemesine, hibridizasyona ve yikama çözeltilerine yönelik olanlar), aletler (örnegin mikro-dizi okuyuculari) ve protokoller bu konuda iyi bilinmektedir ve çesitli ticari kaynaklardan temin edilebilir.

Mikro-dizi sistemlerinin ticari saticilari arasinda Agilent Technologies (Santa Clara, CA) ve Affymetrix (Santa Clara, CA) bulunur, ancak baska PCR sistemleri de kullanilabilir.Kantitatif RT-PCRCD68 gibi makrofaj marker proteinlerini sifreleyen tekli genleri temsil eden mRNA düzeyi, geleneksel kantitatif geri transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) teknolojisi kullanilarak ölçülebilir. qRT- PCR'nin avantajlari arasinda hassaslik, esneklik, niceliksel dogruluk Ve yakin iliskili mRNA'larin ayirt edilebilinesi bulunur. Doku örneklerinin kantitatif PCR için islenmesine yönelik kilavuz bilgiler, qRT-PCR”ye yönelik ticari ürünlerin üreticileri ve saticilari (om, Qiagen (Valencia, CA) ve Ambion (Austin, TX)) dahil çesitli kaynaklardan temin edilebilir. qRT-PCR°nin otomatik sekilde yapilmasina yönelik alet sistemleri ticari olarak temin edilebilir ve birçok laboratuarda rutin olarak kullanilmaktadir. Iyi bilinen bir ticari sistem örnegi, Applied Biosystems 7900HT Hizli Gerçek Zamanli PCR Sistemidir (Applied Biosystems, Foster City, CA).mRNA izole edildikten sonra RT-PCR ile gen ekspresyon profillemesindeki birinci adim, mRNA sablonunun cDNA halinde geri transkripsiyonudur, bu ise daha sonra bir PCR reaksiyonunda üslü sekilde amplifiye edilir. En yaygin sekilde kullanilan iki ters transkriptaz, aVilo miyeloblastozis Virüsü ters transkriptazi (AMV-RT)ve Moloney murin lösemi Virüsü ters transkriptazidir (MMLV-RT).24Ters transkripsiyon reaksiyonu tipik olarak, spesifik primerler, rasgele heksamerler veya oligo-dT primerler ile prime edilir. Elde edilen cDNA ürünü, takip eden polimeraz zincir reaksiyonunda bir sablon olarak kullanilabilir.PCR adimi, bir termo-stabil DNA'ya bagimli DNA polimerazi kullanilarak yapilir. PCR sistemlerinde en yaygin sekilde kullanilan polimeraz, bir Thermus aquaticus (Taq) polimerazidir. PCR seçiciligi, amplifikasyon için hedeflenen DNA bölgesine, yani CD68 gibi makrofaj marker proteinlerini sifreleyen genlerden geri transkripte edilmis cDNA”larin bölgelerine komplementer primerlerin kullanilinasindan kaynaklanir. Bu. nedenle inevcut açiklamada qRT- PCR kullanildiginda her inarker genine spesifik primerler, genin cDNA sekansina dayanir. SYBR® green veya TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) gibi ticari teknolojiler, saticinin talimatlarina göre kullanilabilir. Haberci RNA düzeyleri, beta-aktin veya GAPDH gibi referans genlerin düzeyleri karsilastirilarak örnekler arasindaki yükleme farkliliklari açisindan nonnallestirilebilir. mRNA ekspresyon düzeyi, normal, tümör harici doku veya hücrelerden alinan mRNA gibi tek bir kontrol örnegine göre ifade edilebilir. Alternatif olarak bu, bir tümör örnekleri veya tümör hücre çizgileri havuzundan veya ticari olarak temin edilebilen bir kontrol mRNA setinden alinan mRNA”ya göre ifade edilebilir.CD68 gibi makrofaj inarker proteinlerini sifreleyen genlerin ekspresyon düzeylerinin PCR analizi için uygun primer setleri, bu konuda uzman kisiler tarafindan gereksiz denemeler yapilmadan tasarlanabilir ve sentezlenebilir. Alternatif olarak mevcut açiklamanin uygulamasina yönelik PCR primer setleri, ticari kaynaklardan, örn.Applied Biosysteins°den satin alinabilir. PCR primerleri tercihen25yaklasik 17 ila 25 nükleotit uzunlugundadir. Primerler, Tm tahminine yönelik geleneksel algoritmalar kullanilarak belirli bir erime sicakligina (Tm) sahip olacak sekilde tasarlanabilir. Primer tasarimi ve Tm tahminine yönelik yazilim, örn. Priiner ExpressTM (Applied Biosystems) ticari olarak temin edilebilir ve ayrica internette mevcuttur, öm. Primer3 (Massachusetts Institute of Technology). PCR priiner tasariminin kabul görmüs prensipleri uygulanarak çok sayida farkli primer, CD14, CD68, MSRl, CSFRl, CD163 ve CCR2 gibi makrofaj inarker genleri dahil belirli bir genin ekspresyon düzeyini ölçmek için kullanilabilir.Açiklamanin bazi düzeneklerinde RNA analizi, RNA özümlemesi veya izolasyonu içermeyen bir teknoloji kullanilarak yapilir. Böyle bir teknoloji, qNPATM adiyla (High Throughput Genomics, Inc., Tucson, AZ) ticari olarak temin edilebilen, niceliksel nükleaz koruma deneyidir. Analiz edilecek tümör dokusu örnekleri, FFPE materyali formunda oldugunda bu teknoloji avantajli olabilir. Bakiniz örn.,Roberts ve arkadaslari, 2007, Laboratory Investigation 87:979-997.Protein analiziAçiklamanin yöntemlerinde CD68 gibi makrofa j marker geni ekspresyonu, protein düzeyinde saptanabilir. Makrofaj marker geni ekspresyonunun protein düzeyinde ölçülmesine yönelik yöntemlerin örnekleri arasinda enzim bagli immünosorbent deneyi (ELISA) veIHC analizi bulunur.ELISA Bir makrofaj marker proteini ELISA'nin, öm. CD68 ELISA°ninyapilmasi, bir makrofaj marker proteinine karsi en az bir antikor, yani26saptaina antikoru gerektirir. Örnek bir düzenekte CD68, makrofaj marker proteinidir. Analiz edilecek bir örnekten gelen CD68 proteini, bir polistiren mikrotiter plaka gibi bir kati destek üzerine immobilize edilir. Bu innnobilizasyon, CD68”in spesifik olmayan baglanmasi, örn. yüzeye adsorpsiyon yoluyla olabilir. Alternatif olarak immobilizasyon, spesifik baglanma yoluyla, örn. örnekten gelen CD68 proteininin bir yakalama antikoru (saptama antikorundan garkli anti- CD68 antikoru) tarafindan, bir "sandviç" ELISA°da baglanmasi suretiyle olabilir. CD68 iniinobilize edildikten sonra saptama antikoru ilave edilir ve saptama antikoru, bagli CD68 ile bir kompleks olusturur. Saptaina antikoru, bir enzime, direkt olarak veya dolayli yoldan, öm. saptama antikorunu spesifik olarak taniyan bir ikinci] antikor araciligiyla baglanir. Tipik olarak her adim adasinda bagli CD68 ile plaka, yumusak bir deterjan çözeltisi ile yikanir. Tipik ELISA protokolleri ayrica protein reaktif maddelerinin plakaya istenmeyen, spesifik olmayan baglanmasini bloke etmek amaciyla inek seruinu albümini gibi Spesifik olinayan bir baglanma proteininin kullanilmasini içeren, bir veya daha fazla bloklaina adimi içerir. Son yikaina adiinindan sonra plaka, Örnek içindeki CD68 miktarini gösteren görünür bir sinyal üretmek ainaciyla uygun bir enzim substrati ilave edilerek gelistirilir. Substrat örn. bir kromogenik substrat veya bir florogenik substrat olabilir. ELISA yöntemleri, reaktif maddeleri ve ekipmanlari bu konuda iyi bilinir ve ticari olarak temin edilebilir.Baska makrofaj marker proteinlerinin, örn. CCR2, CDl4, CD163, CSFlR ve MSRl°in yani sira diger makrofaja spesifik marker proteinlerinin ekspresyon düzeylerinin, her makrofaj inarkerproteinine özgü saptayici antikorlar kullanilarak ELISA ile27ölçülebilecegi anlasilir.Immüno-histokimya (IHC)Belirli bir hücre popülasyonu içindeki makrofajlarin sayisi, immüno- histokimya yoluyla belirlenebilir (öm., görsellestirilebilir). Ek olarak CD68 gibi belirli bir biyo-marker proteini için pozitif olan bir örnek içindeki hücrelerin yüzdesi ve yogunlugu, immüno-histokimya yoluyla belirlenebilir. Bir makrofaj marker proteininin IHC, örn.

CD68 IHC ile deneye tabi tutulmasi, bir makrofaj marker proteinine karsi en az bir antikor, örn. en az bir anti-CD68 antikoru gerektirir.

IHC için uygun sayisiz anti-CD68 aiitikoru ticari olarak temin edilebilir. Omegin uygun antikorlar, Dako North America, Inc.

(Carpinteria, CA), abeam (Cambridge, MA), Abnova (Walnut, CA), R ve D Systems (Minneapolis, MN) veya Invitrogen (Carlsbad, CA)'dan satin alinabilir. Staiidart teknikler kullanilarak anti-CD68 aiitikoru, tümörlerden elde edilen kesitler, örn. 5 mikronluk kesitler, örnegin parafine gömülü. ve dondurulmus tümör kesitleri içinde CD68 proteini varligini saptamak için kullanilabilir. Tipik olarak tümör kesitleri baslangiçta tümör materyalinin ilk toplanma ve korunma prosesinde sabitlenmis proteinlerin anti jenik yapisini elde edecek sekilde isleme tabi tutulur. Slaytlar daha sonra anti-CD68 saptama antikoru ile spesifik olmayan baglanmayi önlemek amaciyla bloke edilir. CD68 proteini varligi, anti-CD68 antikorunun CD68 proteinine baglanmasi ile ölçülür. Saptama (birincil) antikoru, bir enzime, direkt olarak veya dolayli yoldan, örn. saptama (birincil) antikorunu spesifik olarak taniyan bir ikincil antikor veya polimer araciligiyla baglanir. Tipik olarak tümör kesitleri, adimlar arasinda inek serumu albümini gibispesifik oliiiayan protein ile yikanir ve bloke edilir. Slayt, gözle28görülür bir sinyal üretmek için uygun bir enzim substrati kullanilarak gelistirilir. Örnekler, hematoksilin ile karsi boyanabilir.Baska makrofaj marker proteinlerinin, örn. CCR2, CDl4, CD163, CSFlR ve MSRl°in yani sira diger makrofaja spesifik marker proteinlerinin ekspresyonunun, her makrofaj marker proteinine özgü antikorlar kullanilarak benzer bir sekilde IHC ile saptanabilecegianlasilir.Verilerin YorumlanmasiBir tüinör için bir makrofaj skoru, bir esik skoruna göre yorumlanabilir. CD68 gibi belirli bir biyo-markerin, esik skoruna esit veya bundan yüksek bir makrofaj skoru veya ekspresyon düzeyi, tümörün aksitinib gibi bir VEGFR inhibitörü ile tedaviye duyarli (tepkili) olmasi olasi kestirimi olarak yorumlanabilir. Alternatif olarak CD68 gibi belirli bir biyo-markerin, esik skoruna esit veya bundaii düsük makrofa j skorlari veya ekspresyon düzeyi, bir tümörün aksitinib gibi bir VEGFR inhibitörü ile tedaviye dirençli (tepkisiz) olmasi olasi kestirimi olarak yorumlanabilir.Bir optimum esik makrofaj skoru veya CD68 ekspresyon düzeyi, bir esik belirleme analizi yapilarak deney yoluyla belirlenebilir (veya en azindan yaklasik olarak kestirilebilir). Tercihen esik belirleme analizi, alici operatör karakteristigi (ROC) egri analizini içerir. ROC egri analizi, kabul görmüs bir istatistik teknigi olup bunun uygulamasi bu konudaki siradan beceri dahilindedir. ROC egri analizinin tartismasi için genel olarak bakiniz Zweig ve arkadaslari, 1993, "Receiver operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine," Clin. Chem. 39:561-577; ve Pepe, 2003, Thestatistieal evaluation of inedical tests or classification and prediction,29Oxford Press, New York.Makrofaj skorlari, CD68 ekspresyon düzeyleri ve optimuin esik skorlari, tümör tipine göre degisiklik gösterebilir. Bu nedenle bir esik belirleme analizi tercihen mevcut açiklama kullanilarak test edilecek belirli bir tümör tipini temsil edeii bir veya daha fazla veri seti üzerinde yapilir. Esik belirleme analizi için kullaiiilan veri seti sunlari içerir: (a) gerçek tepki verileri (tepki ve tepkisizlik) ve (b) bir tümör grubundan gelen her tümör örnegi için makrofaj skoru veya CD68 ekspresyon düzeyi. Bir makrofaj skoru veya CD68 ekspresyon düzeyi esigi, belirli bir tümör tipine göre belirlendikten sonra bu esik, bu tümör tipine ait tümörlerden makrofaj skorlarini veya CD68 ekspresyon düzeylerini yorumlamak için uygulanabilir.ROC egri analizi su sekilde yapilabilir. Makrofaj skoru veya CD68 ekspresyon düzeyi, esige esit veya bundan yüksek olan bir 'Örnek, tepki veren (duyarli) seklinde tanimlanir. Alternatif olarak inakrofaj skoru veya CD68 ekspresyon düzeyi, esige esit veya bundan düsük olan bir örnek, tepki vermeyen (dirençli) seklinde taniinlanir. Test edilen bir örnek setinden her makrofaj skoru veya CD68 ekspresyon düzeyi için "tepki verenler" ve "tepki vermeyenler" (varsayimsal adlandirmalar), esik olarak bu skor kullanilarak siniflandirilir. Bu proses, varsayimsal adlandirmalarin veri setine ait gerçek tepki verileri ile karsilastirilmasi suretiyle her potansiyel esik için TPR (y vektörü) ve FPR”nin (x vektörü) hesaplanmasini saglar. Ardindan bir ROC egrisi, TPR vektörü ve FPR vektörü kullanilarak bir noktali çizimin yapilmasi suretiyle yapilandirilir. ROC egrisi, (O, 0) noktasindan (1.0, 0.5) noktasina kadar olan kösegenin üzerinde ise bu, makrofaj testi sonucunun, rasgeleden daha iyi bir test oldugunu gösterir.ROC egrisi, en iyi isletiin noktasini tanimlamak için kullanilabilir. En30iyi isletim noktasi, yanlis negatiflerin bedeline karsilik agirliklandirilmis yanlis pozitifler arasindaki en iyi dengeyi veren noktadir. Bu bedellerin esit olmasi sart degildir. ROC uzaminda X,y noktasinda ortalama beklenen siniflandirma bedeli, asagidaki formülile belirlenir.C = (l-p) alfa*x + p*beta(l-y) burada: alfa : bir yaiilis pozitif bedeli, beta = bir pozitifi atlama (yanlis negatif) bedeli vep = pozitif durumlarin orani.Yanlis pozitifler ve yanlis negatifler, alfa ve beta için farkli degerler verilerek farkli sekilde agirliklandirilabilir. Örnegin tepki vermeyenler olan daha fazla hastanin tedavi edilmesi pahasina tepki verenler grubuna daha fazla hastanin dahil edilmesine karar verilirse alfaya daha fazla agirlik verilebilir. Bu durumda yanlis pozitif ve yanlis negatif bedeli ayni kabul edilir (alfa betaya esittir). Bu nedenle ROC uzaininda x,y noktasinda ortalama beklenen siniflandirma bedeli söyledir: C” = (l-P)*x + P*(l-y).Ek küçük C”, tüm yanlis pozitif ve yanlis negatif çiftleri (X, y) kullanildiktaii sonra hesaplanabilir. Optimum skor esigi, C” “deki (x, y) skoru olarak hesaplanir.Bir tümörün aksitinib gibi bir VEGFR inhibitörüne duyarli mi yoksa dirençli nii oldugunun kestirilmesine ek olarak bir makrofaj skoru veya CD68 ekspresyon düzeyi, bir tümörün duyarli veya dirençliolmasi ihtimalinin yaklasik, ancak faydali bir göstergesini saglar.31Test KitleriAçiklama, mevcut açiklamaya ait yöntemlerin gerçeklestirilmesi için bazi bilesenler içeren bir tani testi kiti içerir. Bir tani testi kiti, tani deneylerinin ifasinda elverisliligi, hizi ve tekrar edilebilirligi güçlendirir. Örnegin açiklamaya ait örnek bir qRT-PCR bazli düzenekte basit bir tani testi kiti, makrofaj markerlerinin, örn.

CD68°in ekSpresyonunun analiz edilmesi için PCR primerleri içerir.

Diger düzeneklerde daha kapsamli bir test kiti, sadece PCR primerleri degil, ayrica CD68 ekspresyon düzeylerinin PCR teknolojisi kullanilarak ölçülmesi için tamponlar, reaktif maddeler ve detayli talimatlar ihtiva eder. Bazi düzeneklerde kit, bir test protokolü ve RNA örnek(ler)i hariç test için gerekli tüm sarf bilesenlerini içerir.

Açiklamaya ait öriiek bir DNA mikro-dizi bazli düzeiiekte bir test kiti, belirli bir alet ile kullanilmak üzere tasarlanmis bir mikro-akiskan karti (dizi) içerir. Istege bagli olarak mikro-akiskan karti, makrofaj marker geni ekSpresyonunun ölçülmesi için Spesifik olarak tasarlanmis, özel yapim bir cihazdir. Bu özel yapim mikro-akiskan kartlari ticari olarak temin edilebilir. Örnegin TaqMan Dizisi, Applied Biosystems 7900HT Hizli Gerçek Zamanli PCR Sistemi (Applied Biosystems, Foster City, CA) ile birlikte kullanilmak üzere tasarlanmis, 384 oyuklu bir mikro-akiskan kartidir (dizi). Örnek bir akiskan karti, CCRZ, CDl4, CD68, CD163, CSFlR ve/Veya MSRl ekspresyoiiunun ölçülmesi için bir sonda kombinasyonu ile birlikte örn. veri normallestirmesi için gerekli kontrolleri veya standartlari içerebilir. Diger makrofaj marker proteinleri de açiklamanin uygulanmasi için bir akiskan kartina dahil edilebilir.Açiklamaniii bazi düzeneklerinde test kiti, tümör makrofaj içeriginin32[HC ile belirlenmesi için materyaller ihtiva eder. Bir lHC kiti, örnegin bir insan makrofaj markerine yönelik bir birincil antikor, örn. bir fare anti-insan CD68 antikoru ve bir raportör enzime, örn. yabanturpu peroksidaza konjüge edilmis bir ikinci] antikor ihtiva edebilir. Bazi düzeneklerde ikincil antikor, birincil antikoru spesifik olarak taniyan,konjüge edilmis bir polimer ile degistirilir.ÖRNEKLERMevcut açiklama ayrica asagidaki örneklerle açiklanir.Örnek 1 - Bloklara Karsilik Slaytlarla CD3 ve CD68 Pozitif Hücrelerin Yüzdesi ve YogunluguBu çalisma, asagidaki ajanlardaii birini veya daha fazlasini ihtiva eden, öiiceki sistematik bir birinci hat rejiiiiini takiben basarisizlik sonrasinda, metastatik renal hücre karsinomasi (mRCC) hastalarinda, sorafenibe karsilik aksitinibin 2 kollu, randomize edilmis, açik etiketli, çok merkezli bir faz 3 çalisinasidir: sunitinib, bevasizuinab + IFN (x, temsirolimus veya sitokin(ler). Bütün olarak inRCC”li 723 hasta randomize edildi ve bu çalismaya alindi, bunlar arasinda aksitinib ile tedavi edilen 52 hasta, immüno-histokimya (IHC) analizi için degerlendirilebilir nitelikteydi; ayrica 52 hastanin 33”ü daha önce Sutent® ile tedavi edilmisti.Sekil 1'de gösterildigi gibi IHC analizine dahil edilen hastalarin büyük kismi, beyaz (hastalarin %90.4'ü), erkek (hastalarin %69.2”si) ve Kuzey Amerika (hastalarin %57.7”si) ve Avrupa”dandi (%32.7).

Genel ortalama (staiidart sapmali) yas, boy ve kilo sirasiyla 58.3 (11.0) yas, 1730 (10.0) cm ve 84.6 (19.1) kg idi. Tüm hastalarin ECOG performansi statüsü 0 (hastalarin %51 .9°u) veya 1 (hastalarin33%48.13) idi. Genel olarak hayatta kalma için Memorial Sloan- Kettering Cancer Center (MSKCC) prognostik grup faktörleri modeli için hastalarin %23.11, uygun; hastalarin %34.6”si orta ve hastalarin %42.3,ü kötü seklinde siniflandirildi. Ek olarak MSKCC risk gruplari, su dört risk faktörü kullanilarak türetildi: yüksek laktat dehidrojenaz (>1.5 x üst normal limiti), düsük serum hemoglobin (alt normal limitinin altinda), yüksek düzeltilmis serum kalsiyuinu (>10 mg/dL) ve önceden nefrektomi yapilmamis.52 hastanin tamami, CD3 ve CD68ain her ikisi için degerlendirilebilir nitelikteydi. CD3 ve CD68 için degerlendirilebilen 52 hastadan 26°si, formalin ile sabitlenmis, parafine gömülmüs (FFPE) tümör blogu bagisladi ve 26”si analiz için slayt bagisladi. Mosaic Laboratories, insan norinalini ve insan kanserini temsil eden FFPE materyali sagladi. Örnekler, Insan Arastirmalari Koruma Ofisi tarafindan tanimlanan “Insan Süjeli Arastirmadan Muafiyeti” tanimlayan kilavuzlar kapsaminda in vitro analiz için kalinti, tanimi kaldirilmis veya anonim hale getirilmis insan örneklerinin kullanilmasina izin veren, IRB gözden geçirmeli bir protokol (MOSOOl) kapsaminda edinildi. CD68 fare monoklonal KP] antikoru (Katalog# M0814, Parti# 46406, Son kullanma tarihi: Eylül 2011), Dak0”dan (Carpinteria, California, Birlesik Devletler) satin alindi ve ekindeki dokümanlar uyarinca 2-8°C°de saklandi. Fare IgG izotip kontrol antikoru (Parti# 37211, Son kullanma tarihi: Temmuz 2010), Dak0°dan satin alindi ve ekindeki dokümanlar uyarinca 2-8°C°de saklandi. IHC, Mosaic Laboratories SOP°1erine göre yapildi. CD68 IHC deneyi tasarlandi ve "homebrew" sinif 1 test geçerlemesine yönelik CLIA kilavuzlarina uyumlu oldugu geçerlendi.Boyama, bir patolog tarafindan degerlendirildi ve reaktivite34degerlendirmesi, sunlarin bir kombinasyonunu içeriyordu: CD68 boyaiimasinin hücre lokalizasyonu; boyama yogunlugu; hücre alti lokalizasyon; ve ilgili doku tipinin birincil bileseninde boyanan hücrelerin yüzdesi. Fotomikrografikler (20X büyütme), bir Nikon Eclipse 50i inikroskoba baglanan bir Spot Insight QE Model 4.2 sogutmali sarj takilmis cihaz kamerasi (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan, Birlesik Devletler) ile alindi.CD3 ve CD68 pozitif hücrelerin ortalama yüzdesi, slaytlarda bloklardan bir parça daha düsüktü; CD3 için %13.61'e karsilik %17.95 ve CD68 için %5.83”e karsilik %821. Benzer sekilde slaytlarda bloklardaii bir parça daha düsük ortalama hücre yogunlugu gözlendi; CD3 için 489.15 hücre/mm”ye karsilik 590.50 hücre/mm2 ve CD68 için 0.08 hücre/mm2”ye karsilik 0.13 hücre/mm2 (Sekil 2).Ornek 2 - Daha Yüksek CD68 Ekspresyon Düzeyleri, Istenilen ORR ve PFS ile Pozitif Iliskilidir, Ancak OS ile DegildirIHC biyo-marker analizi için en az bir doz çalisma tedavisi alan tüm hastalari içeren Biyo-marker Analiz Seti kullanildi. Asagidaki etkinlik uç noktalari analiz edildi: PFS, OS ve objektif tepki orani (ORR).

Pozitif hücrelerin yüzdesi ve yogunlugu. için tepki kategorisine göre (her marker için komple tepki [CR]+kismi tepki [PR] ”ye karsilik stabil hastalik [SD]+ilerleyici hastalik [PD])) istatistik 'Özetleri sunuldu.

Tepki kategorileri arasiiidaki farkliligi test etmek için Wilcokson Rank Sum testi yapildi. Kesme noktasi olarak medyan degeri kullanilarak tepki kategorisi ile biyo-marker katmani arasindaki baglantinin test edilmesi için Fisher”s exact testi kullanildi. OS ve PFS dagilimi, biyo- marker katmaiilari arasinda kesme noktasi olarak biyo-marker medyanile Kaplan-Meier yöntemi kullanilarak karsilastirildi; herhangi bir35katinanda N<10 oldugunda p degerleri gösterilmeyecekti. Tahmini tehlike orani (HR) ve bunun 2 tarafli %95 güven araliklari (CI°lar) ve medyan olay zamani ve bunun 2 tarafli %95 CI'si bildirildi. Tümör hacminde en iyi tepki degisim yüzdesi, biyo-marker katmanlari arasinda kesme noktasi olarak medyan degeri ile Wilcokson Rank Sum testi kullanilarak karsilastirildi.Biyo-marker katmanlari arasinda ORR, PFS ve OS analizinde anlamli test sonuçlari (p<0.05) için alici isletme karakteristikleri (ROC) egrisi üretilerek hasta seçim markeri olarak kullanilma potansiyeli ayrica degerlendirildi. ROC analizi, ikili hasta objektif tepkisinin (CR+PR vs. SD+PD) kestirilmesinde sürekli tani markerleri olarak taban çizgisi CD68 degerleri üzerinde yapildi. Zamana bagimli klinik sonuçlar PFS ve OS için ROC(t) olarak gösterilen, buradaki t,nin ilgili zaman noktasini belirttigi, zamana bagimli bir ROC, Kaplan-Meier estimator20 kullanilarak hayatta kalma sonuçlarinin kestirilinesinde taban çizgisi CD68 degerlerini analiz etmek için uygulandi. Klinik sonucun kestirilmesi için CD68 degerinin Optimum kesme noktasi, hem hassaslik hem spesifiklik degerleri 1 olan noktadan minimum mesafeye sahip ROC egrisi üzerindeki noktadan elde edildi. AUC, trapezoid kurali kullanilarak hesaplandi.Daha uzun PFS ve daha yüksek ORR ile iliskili daha yüksek CD68 ekspresyonu gözlendi, bununla birlikte hastalarda CD68 ekspresyonu ile OS arasinda bir korelasyon gözlenmedi. Onceki tedaviden bagimsiz olarak Emedyan CD68 degerlerine (kesme: %521 pozitif hücreler veya 0.08 hücre/1111112) sahip hastalarda medyan PFS, her iki kesme noktasi için 12.0 ay iken tüm hastalar `onceki tedaviden bagimsiz degerlendirildiginde edilmis hastalar için PFS”de benzer ancak istatistiksel açidan anlamli olmayan bir trend gözlendi (Sekil 4). Önceki tedaviden bagimsiz olarak veya önceden Sutent® ile tedavi edilmis hastalar için CD3 düzeyleri ile PF S arasinda istatistiksel açidan anlamli iliskiler yoktu (Sekil 5 ve 6).Ek olarak Önceki tedaviden bagimsiz olarak Zmedyan CD68 degerlerine (kesme: %521 pozitif hücreler veya 0.08 hücre/mmz) sahip hastalarda medyan OS, 20.0 ay ve 22.6 ay iken tüm hastalar `Önceki tedaviden bagimsiz degerlendirildiginde degerlerine (tüm durumlarda HR>0.6, istatistiksel anlamli degil) sahip hastalar için sirasiyla 21.8 ay veya `17.8 ay idi (Sekil 7). Önceden Sutent® ile tedavi edilmis hastalar için OS”de istatistiksel açidan anlamli iliskiler gözlenmedi. Tedaviden bagimsiz olarak veya 'Önceden Sutent® ile tedavi edilmis hastalarda CD3 düzeyleri ile OS arasinda istatistiksel açidan anlamli iliskiler yoktu (Sekil 8). ROC analizi kullanilarak daha yüksek CD68 hücre sayisina sahip hastalar için istenilen OS gözlendi, bununla birlikte 0.559'luk AUC degeri, CD68 düzeylerinin kestiriin degerinde düsük güvenceye isaret eder (Sekil 9).

Son olarak önceki tedaviden bagimsiz sekilde pozitif hücrelerin yüzdesi (p degeri=0.0059) veya hücre yogunlugu (p degeri=0.007l) baglaminda ölçülen CD68 düzeyleri, tepki verenlerde (CR+PR) tepki vermeyenlere (SD+PD) göre 2 kat daha yüksekti (Sekil 10). Önceden Sutent® ile tedavi edilmis hastalar için pozitif hücrelerin yüzdesi (p degeri=0.407) veya hücre yogunlugu (p degeri=0.0762) baglaminda ölçülen CD68 düzeyleri, tepki verenlerde tepki vermeyenlere göre 2 kat daha yüksekti (Sekil 11). Biyo-marker açisindan degerlendirilebilen hastalar için ORR analizinde daha yüksek CD6837yüzdesine ve pozitif hücre yogunluguna sahip hastalar, daha iyi tüinör objektif tepkisi sansina sahip olma egilimi gösterir. ROC analizi, CD68 yüzdesinde O.8l8”lik ve pozitif hücre yogunlugunda 0.795 ,lik bir kestirim dogrulugu gösterir. 0.791 ve 0.784°lük AUC”ler, CD68 biyo-markeri kullanilarak ORR için yüksek genel kestiriin dogrulugu gösterir. ORR”nin kestirilmesine yönelik optimum kesme noktalari, CD68 pozitif hücre yüzdesi için %942 ve hücre yogunlugu için 0.13 hücre/mm2 idi.Onceden Sutent® ile tedavi edilmis, biyo-marker degerlendirmesi yapilabilen hastalar için ORR analizinde benzer sonuçlar bulundu.

Daha yüksek CD68 pozitif hücre yüzdesine ve yogunluguna sahip hastalar, daha iyi tümör objektif tepkisi sansina sahip olina egilimi gösterir. ROC analizi, CD68 pozitif hücre yüzdesinde 0.777'lik ve yogunlugunda 0.852,1ik bir kestiriin dogrulugu gösterir. 0.809 ve 0.764”lük AUC°ler, CD68 biyo-markeri kullanilarak ORR için yüksek genel tanisal dogruluk gösterir. ORR”nin kestirilmesine yönelik Optimum kesme noktalari, CD68 pozitif hücre yüzdesi için %520 veyogunluk için 0.16 hücre/mm2”dir.38TARIFNAME IÇERISINDE ATIF YAPILAN REFERANSLARBasvuru sahibi tarafindan atif yapilan referanslara iliskin bu liste,yalnizca okuyucunun yardimi içindir ve Avrupa Patent Belgesinin birkismini olusturmaz. Her ne kadar referanslarm derlenmesine büyükönem verilmis olsa da, hatalar veya eksiklikler engellenememektedirve EPO bu baglamda hiçbir sorumluluk kabul etmemektedir.Tarifname içerisinde atifta bulunulan patent dökümanlari:. us 20050095634 A, Baker [00541Tarifnamede belirtilen patentlestirilmemis literatür:o SAWYERS. Nature, 2008, vol. 452, 548-552 [0003] [0005]° RINI et al. Clinical Cancer Research, 01 June 2011,vol. 17 (11), 3841-9 [0005]° POLIMENO et al. BJ U Int, 2013, vol. 112, 686-696 [0007] - SHOJAEI et al. Nat.

Biotechnol., 2007, vol. 25 (8), 911-920 [0038]- LIN et al. Eur. J. Cancer Suppl., 2010, vol. 8 (7), 191

[0038] [0047]° SHOJAEI et al. Nat Biotechnol., 2007, vol. 25 (8), 911-920 [0047]° TONINI G et al. Exper Rev Anticancer Ther, 201 l,vol. 1] (6), 921-930 [0048]° AUSUBEL et al. Current Protocols of Molecular Biology.

John Wiley and Sons, 1997

[0054]' CLARK-LANGONE et al.

BMC Genomics, 2007, vol.8, 279 [0054]- DE AN DRES et al.

Biotechniques, 1995, vol. 18, 42044 [0054]- ROBERTS et al. Laboratory Investigation, 2007, vol.87, 979-997 [0064]o ZWEIG et al. Receiver operating characteristic(ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine. Clin. Chem., 1993, vol. 39, 561-577 [0071] 39° SONPAVDE G ; CHOUEIRI - PEPE. The statistical evaluationT. Br J Cancer, 2012, of medical tests orvol. 107 (7), 1009-1016 [0048] Classification and prediction.

Oxford Press, 2003

[0071]SEKILLERDEKI YAZILARIN ANLAMLARISEKIL 1A : ERKEKB : KADINC = TOPLAMD = 811 je Sayisi (%) E = Yas (yil) :F : MedyanG = OrtalamaH = Aralik1 = IrkJ : BEYAZK : ASYALIL = DIGERM = Kilo (kg) :N = Boy (cm) :O : Cografi Bölge P : KUZEY AMERIKA R = AVRUPAS = ASYAT = IstenilenU : OrtaV = Kötü

Claims (18)

ISTEMLER

1. Aksitinib tedavisine duyarli bir tümörün tanimlanmasina yönelik, sunlari içeren bir yöntem: (a) aksitinib ile tedavi edilmesi düsünülen bir insan hastadan elde edilen bir tüinörden alinan bir doku örnegi içinde CD68 polipeptiti ekspresyon düzeyinin ölçülmesi; ve (b) daha önce aksitinib ile tedavi edilmis ve aksitinibe dirençli oldugu gösterilmis insan hastalardan ve daha önce aksitinib ile tedavi edilmis ve aksitinibe duyarli oldugu gösterilmis insan hastalardan elde edilen tümörlerin doku örnekleri içinde CD68 polipeptiti ekspresyonunun ölçülmesi suretiyle belirlenmis bir esik CD68 ekspresyon düzeyi ile adim (a)”daki CD68 ekspresyon düzeyinin karsilastirilmasi, burada esik düzeyinin üzerindeki bir CD68 ekspresyon düzeyi, tümörün aksitinib ile yapilan tedaviye duyarli oldugunu gösterir.

2. Istem lie ait yöntein, burada CD68 polipeptiti ekspresyonunun ölçülmesi adimi, immüno-histokimya ile gerçeklestirilir.

3. Istem 2°ye ait yöntem, burada CD68 polipeptiti ekspresyonunun immüno-histokimya ile ölçülmesi adimi, bir tam slayt taramasindan görüntü analizi yoluyla yapilir, burada örnek içindeki CD68-pozitif

4. Istem 3”e ait yöntem, ayrica örnek içinde CD68-pozitif hücrelerin yogunlugunun belirlenmesi adimini içerir.

5. Istem 1 ila 4°ten herhangi birine ait yöntem, buradaki tümör, bir gögüs tümörü, bir akciger tümörü, bir böbrek tümörü, bir kolorektal tümör ve bir pankreatik tümörden olusan gruptan seçilir ve tercihen bir metastatik renal hücre kanseri (mRCC) tümörüdür.

6. Aksitinibin, istem 5”e göre aksitinibe duyarli olan bir mRCC tümörüne sahip oldugu belirlenen bir hastaya uygulanmasi suretiyle ve metastatik renal hücre kanserinin (mRCC) tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib.

7. (a) Bir sü jeden alinan bir tümör içinde CD68-pozitif hücrelerin yüzdesinin belirlenmesi; ve (b) adi geçen yüzde en az %5 ise süjeye aksitinib uygulanmasi yoluyla kanser tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib.

8. (a) Bir sü jeden alinan bir tümör içinde CD68-pozitif hücrelerin hücre yogunlugunun belirlenmesi; ve (b) adi geçen hücre yogunlugu en az 0.08 hücre/mm2 ise sü jeye aksitinib uygulanmasi yoluyla kanser tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib.

9. Tümörlü bir süjeye aksitinibin uygulanmasi suretiyle kanser tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib, burada adi geçen tümördeki hücrelerin en az %2, en az %3, en az %4, en az %45, en az pozitiftir.

10. Tümörlü bir süjeye aksitinib uygulanmasi suretiyle istem 9°da istemde bulunuldugu gibi kanser tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib, burada adi geçen tümör içindeki hücrelerin en az %5”i CD68-pozitiftir.

11. Tümörlü bir süjeye aksitinibin uygulaninasi suretiyle kanser tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib, burada adi geçen tümördeki CD68-pozitif hücrelerin hücre yogunlugu, en az 0.05 hücre/mm2 veya en az 1.5 hücre/min2”dir.

12. Tümörlü bir süjeye aksitinib uygulanmasi suretiyle istem 11”de istemde bulunuldugu gibi kanser tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib, burada adi geçen tümör içindeki CD68-pozitif hücrelerin hücre yogunlugu, en az 0.08 hücre/mm”dir .

13. (a) Bir süjeden alinan bir tümör içinde CD68-pozitif hücrelerin yüzdesinin belirlenmesi; (b) tümör içinde CD68-pozitif hücrelerin hücre yogunlugunun belirlenmesi; ve (c) adi geçen yüzde, en az %2, az %15 veya en az %20 ise ve adi geçen hücre yogunlugu, en az 0.05 hücre/mmz, en az 0.09 hücre/mmz, en az 1.0 hücre/mmZ, en az 1.1 hücre/ mm2 veya en az 1.5 hücre/mm2 ise aksitinibin süjeye uygulanmasi suretiyle kanser tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib.

14. (a) Bir sü jeden alinan bir tüinör içinde CD68-pozitif hücrelerin yüzdesiniii belirlenmesi; (b) tümör içindeki CD68-pozitif hücrelerin hücre yogunlugunun belirlenmesi; ve (0) adi geçen yüzde, en az %5 ise ve adi geçen hücre yogunlugu en az 0.08 hücre/mm2 ise süjeye aksitinib uygulanmasi yoluyla, istein l3”te istemde bulunuldugu gibi kanser tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib.

15. Istem 7 ila 14'ten herhangi birinde istemde bulunuldugu gibi kanser tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib, burada adi geçen tümör, bir gögüs tümörü, bir akciger tümörü, bir böbrek tümörü, bir kolorektal tümör ve bir pankreatik tümörden olusan gruptan seçilir ve tercihen bir metastatik renal hücre kanseri (inRCC) tümörüdür.

16. Istem 7, 8, 13 veya l4°te istemde bulunuldugu gibi kanser tedavisinde kullanilmaya yönelik aksitinib, burada CD68 pozitif hücrelerin yüzdesinin veya hücre yogunlugunun ölçülmesi adimi, immüno-histokimya kullanilarak gerçeklestirilir.

17. Istem l6°da istemde bulunuldugu gibi kanser tedavisinde kullanilinaya yönelik aksitinib, burada CD68 pozitif hücrelerin yüzdesinin veya hücre yogunlugunun ölçülmesi adimi, immüno- histokimya kullanilarak veya bir tani slayt taramasindan görüntü analizi kullanilarak gerçeklestirilir.

18. Istein 1 ila 15°ten herhangi birine ait yöntemlerin ifasina yönelik bazi bilesenler içeren bir tani testi kitinin kullanilmasi, bu bilesenler sunlari içerir; (a) kantitatif geri transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) bazli bir kit için; makrofaj CD68 markerinin ekspresyonunun analiz edilinesine yönelik PCR primerleri ve istege bagli olarak CD68 ekspresyon düzeylerinin PCR teknolojisi kullanilarak ölçülmesi için tamponlar, reaktif maddeler ve detayli talimatlar; (b) bir DNA mikro-dizi bazli kit için; belirli bir alet ile birlikte kullanilmak üzere tasarlanmis bir mikro-akiskan karti (dizi); veya (o) tümör makrofaj içeriginin IHC ile belirlenmesine yönelik materyaller.