TWI568439B - 癌症治療 - Google Patents

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Description

癌症治療
本揭露的領域涉及分子生物學、腫瘤學及臨床診斷學。
大部分的癌症藥物對某些患者有效，但對其他患者無效。這可能因為腫瘤之間的基因變異，並甚至可在同一名患者體內的腫瘤之間觀察到基因變異。關於標靶治療(targeted therapeutics)，特定地發現各種患者反應。因此，沒有對測定哪些患者將受益於哪種藥物之合適試驗，不能夠瞭解靶向治療的所有潛力。根據美國國立衛生研究院(National Institutes of Health,NIH)，用語「生物標記」定義為「作為正常生物或病原方法或對治療干預(therapeutic intervention)的藥理反應之指標客觀地測量及評估之特徵」。
基於生物標記的發現之改善的診斷學之發展具有藉由預先辨認最可能對特定藥物產生臨床反應的患者以加速新藥開發之潛力。這種診斷學具有顯著地減少臨床試驗的規 模、時間長度及費用之潛力。技術如基因體學、蛋白質體學及分子影像目前能夠快速、敏感且可靠地偵測特定基因突變、特定基因的表現量、及其他分子生物標記。儘管對腫瘤的分子特性分析的多種技術之可用性，因已經發現的癌症生物標記相對少數，仍不瞭解大部分癌症生物標記之臨床效用。例如，最近的評論文章表示：挑戰為發現癌症生物標記。雖然在數種腫瘤類型-如慢性粒細胞白血病(Chronic myeloid leukemia)、胃腸道基質腫瘤(Gastrointestinal stromal tumor)、肺癌及膠質母細胞瘤(Glioblastoma multiforme)之分子標靶定義的子集合中已經有臨床的成功-使用分子標靶試劑，因缺乏在患者體內評估標靶試劑的有效策略而嚴重地限制在更廣泛的情況下應用此成功之能力。問題主要在於不能夠對臨床試驗選擇分子定義癌症的患者以評估這些有展望的新藥物。解決方式需要可靠地辨認最可能受益於特定試劑的患者之生物標記。(Sawyers,2008,Nature 452：548-552,at 548.)評論如上述闡明認同對發現臨床可用的生物標記及基於這些生物標記的診斷方法之需要。
癌症生物標記有三種不同的型：(1)預後 (prognostic)生物標記，(2)預測性生物標記，及(3)藥效性(pharmacodynamic,PD)生物標記。使用預後生物標記以分類癌症，如根據侵略性(即，生長及/或轉移速度，及對治療的反應度)，實性瘤(solid tumor)。這有時被稱為自「壞的結果」的腫瘤區別「好的結果」的腫瘤。使用預測性生物標記以評估特定患者將會受益於特定藥物治療之可能性。例如，ERBB2(HER2或NEU)基因放大的乳癌患者為可能受益於曲妥珠單抗(trastuzumab)(賀癌平®)治療，而無ERBB2基因放大的患者為較不可能曲妥珠單抗治療。藥效性生物標記為當患者使用藥物時藥物對患者的影響之指標。因此，當在新藥臨床開發的早期階段時，經常使用藥效性生物標記以指引劑量及用藥頻率。對癌症生物標記的討論，見，如Sawyers,2008,Nature 452：548-552。
阿西替尼(Axitinib)(亦名為抑癌特®)為作用於血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptors,VEGFRs)之口服施用的小分子受體酪胺酸激酶抑制劑。阿西替尼被認為藉由血管新生以降低腫瘤生長及轉移，及藉由直接作用於表現及依賴這些受體的細胞以降低腫瘤生長及造成腫瘤退化。多個國家許可在疾病惡化之後，或對細胞激素或舒尼替尼(sunitinib)(亦名為索坦®)為抗藥性，對轉移性腎細胞癌(metastatic renal cell cancer,mRCC)以阿西替尼治療。
儘管大量的臨床前或臨床研究專注於VEGFR抑制劑，這種抑制劑之抗腫瘤活動的負責機制沒有被完全瞭解。特別的是，腫瘤浸潤淋巴球在影響mRCC患者的預後及對抗血管新生試劑的敏感程度/抗藥程度中的角色沒有被徹底瞭解(如，見Polimeno et al.,2013,BJU Int 112：686-696)。如同標靶治療得其他類型，某些，但非所有的患者受益於阿西替尼治療。因此，需要可使用於辨認有可能(或較不可能)對阿西替尼治療反應的腫瘤的患者之基於預測性生物標記的診斷方法。
如同本文中將更詳細討論，本發明部分關於與VEGFR抑制劑(如阿西替尼)之改善的無惡化存活期(progression free survival)相關之哺乳類腫瘤的組織樣本中尋找腫瘤髓(即分化68「CD68」的團塊)浸潤(如，就CD68陽性細胞的百分比及CD68陽性細胞的密度而言升高的CD68的量)。因此，本發明提供辨認較可能對VEGFR抑制劑(如阿西替尼)治療腫瘤正面地反應之方法，及有已經被辨認為較可能對VEGFR抑制劑(如阿西替尼)反應的腫瘤的受試者之治療方法。
例如，在一實施態樣中，揭露關於一種辨別對以VEGFR抑制劑治療敏感的腫瘤之方法，其包含：(a)測量取自考慮以VEGFR抑制劑治療之人類病患的腫瘤之組織樣本中CD68多肽表現量；及(b)將步驟(a)中CD68表現量與藉由測量取自先前以VEGFR抑制劑治療且表現對VEGFR抑制劑為抗藥性之人類病患及先前以VEGFR抑制劑治療且表現對VEGFR抑制劑敏感之人類病患的腫瘤之組織樣本中CD68多肽表現而測定之臨界CD68表現量比較，其中高於該臨界量的CD68表現量表 示該腫瘤對以VEGFR抑制劑治療敏感。在一實施態樣中，VEGFR抑制劑為阿西替尼。在另一實施態樣中，測量CD68多肽表現的步驟是藉由免疫組織化學法而進行。 在另一實施態樣中，測量CD68多肽表現的步驟是藉由自全切片掃描之影像分析而進行，其中測定樣本中CD68陽性細胞的百分比。在另一實施態樣中，此方法進一步包含測定樣本中CD68陽性細胞的密度的步驟。在另一實施態樣中這些方法中任一方法之腫瘤為選自由乳腺瘤、肺腫瘤、腎腫瘤、大腸瘤、及胰臟瘤組成之群組。
在另一實施態樣中，本發明提供一種根據本文敘述的任一方法包含施用VEGFR抑制劑於經測定具有對VEGFR抑制劑敏感的mRCC腫瘤的患者之治療mRCC方法。在一實施態樣中，VEGFR抑制劑為阿西替尼。
在另一實施態樣中本發明提供一種治療癌症的方法，包含：a)測定受試者的腫瘤中CD68陽性細胞的百分比；及b)若該百分比為至少2%、至少3%、至少4%、至少4.5%、至少4.6%、至少4.7%、至少4.8%、至少4.9%、至少5.0%、至少5.1%、至少5.2%、至少5.3%、至少5.4%、至少5.5%、至少5.6%、至少5.7%、至少5.8%、至少5.9%、至少6.0%、至少6.5%、至少7.0%、至少8%、至少9%、至少10%、至少15%、或至少20%，於受試者施用VEGFR抑制劑。在一實施態樣中，VEGFR抑制劑為阿西替尼。
在另一實施態樣中，本發明提供一種治療癌症的方 法，包含：a)測定受試者的腫瘤中CD68陽性細胞的細胞密度；及b)若該細胞密度為至少0.05細胞/mm2、至少0.06細胞/mm2、至少0.07細胞/mm2、至少0.08細胞/mm2、至少0.09細胞/mm2、至少1.0細胞/mm2、至少1.1細胞/mm2、至少1.2細胞/mm2、至少1.3細胞/mm2、至少1.4細胞/mm2、或至少1.5細胞/mm2，於受試者施用阿西替尼。在一實施態樣中，VEGFR抑制劑為阿西替尼。
在另一實施態樣中，本發明提供一種治療癌症的方法包含於有腫瘤的受試者施用VEGFR抑制劑，其中在該腫瘤中細胞至少2%、至少3%、至少4%、至少4.5%、至少4.6%、至少4.7%、至少4.8%、至少4.9%、至少5.0%、至少5.1%、至少5.2%、至少5.3%、至少5.4%、至少5.5%、至少5.6%、至少5.7%、至少5.8%、至少5.9%、至少6.0%、至少6.5%、至少7.0%、至少8%、至少9%、至少10%、至少15%、或至少20%為CD68陽性。在一實施態樣中，VEGFR抑制劑為阿西替尼。
在另一實施態樣中，本發明提供一種治療癌症的方法包含於有腫瘤的受試者施用VEGFR抑制劑，其中在該腫瘤中CD68陽性細胞的細胞密度為至少0.05細胞/mm2、至少0.06細胞/mm2、至少0.07細胞/mm2、至少0.08細胞/mm2、至少0.09細胞/mm2、至少1.0細胞/mm2、至少1.1細胞/mm2、至少1.2細胞/mm2、至少1.3細胞/mm2、至少1.4細胞/mm2、或至少1.5 cells/mm2。在一實施態樣中，VEGFR抑制劑為阿西替尼。
在另一實施態樣中本發明提供一種治療癌症的方法，包含：a)測定受試者的腫瘤中CD68陽性細胞的百分比；b)測定腫瘤中CD68陽性細胞的細胞密度；及c)若該百分比為至少2%、至少3%、至少4%、至少4.5%、至少4.6%、至少4.7%、至少4.8%、至少4.9%、至少5.0%、至少5.1%、至少5.2%、至少5.3%、至少5.4%、至少5.5%、至少5.6%、至少5.7%、至少5.8%、至少5.9%、至少6.0%、至少6.5%、至少7.0%、至少8%、至少9%、至少10%、至少15%、或至少20%，於受試者施用VEGFR抑制劑；及該細胞密度為至少0.05細胞/mm2、至少0.06細胞/mm2、至少0.07細胞/mm2、至少0.08細胞/mm2、至少0.09細胞/mm2、至少1.0細胞/mm2、至少1.1細胞/mm2、至少1.2細胞/mm2、至少1.3細胞/mm2、至少1.4細胞/mm2、或至少1.5細胞/mm2。在一實施態樣中，VEGFR抑制劑為阿西替尼。
在另一實施態樣中，本發明提供一種治療癌症的方法包含於有腫瘤的受試者施用VEGFR抑制劑，其中在該腫瘤中細胞至少2%、至少3%、至少4%、至少4.5%、至少4.6%、至少4.7%、至少4.8%、至少4.9%、至少5.0%、至少5.1%、至少5.2%、至少5.3%、至少5.4%、至少5.5%、至少5.6%、至少5.7%、至少5.8%、至少5.9%、至少6.0%、至少6.5%、至少7.0%、至少8%、至少9%、 至少10%、至少15%、或至少20%為CD68陽性；及其中在該腫瘤中CD68陽性細胞的細胞密度為至少0.05細胞/mm2、至少0.06細胞/mm2、至少0.07細胞/mm2、至少0.08細胞/mm2、至少0.09細胞/mm2、至少1.0細胞/mm2、至少1.1細胞/mm2、至少1.2細胞/mm2、至少1.3細胞/mm2、至少1.4細胞/mm2、或至少1.5細胞/mm2。在一實施態樣中，VEGFR抑制劑為阿西替尼。
在另一實施態樣中，本發明提供本文揭露之任何方法，其中該腫瘤為選自由乳腺瘤、肺腫瘤、腎腫瘤、大腸瘤、及胰臟瘤組成之群組。在一實施態樣中，本發明提供本文揭露之任何方法，其中癌症或腫瘤為mRCC。
在另一實施態樣中，進行本文揭露的方法，其中測量CD68陽性細胞的百分比或細胞密度的步驟是使用免疫組織化學法進行，及進一步其中利用使用腫瘤樣本的全切片掃描之影像分析。
在本發明的某些實施態樣中，測量巨噬細胞含量是藉由測量巨噬細胞標記蛋白的存在或量而進行。在另一實施態樣中，測量巨噬細胞含量是藉由測定既定細胞群中巨噬細胞的數量而進行。例如，測量巨噬細胞含量可藉由涉及偵測巨噬細胞標記蛋白之免疫組織化學法而進行。在另一實施態樣中，測量巨噬細胞含量是藉由測量巨噬細胞標記蛋白的mRNA編碼的存在或量而進行。巨噬細胞標記蛋白的實施例包含CCR2、CD14、CD68、CD163、CSF1R及MSR1。臨界測定分析可包含接收者操作特徵曲線分析。 本發明的方法對測試多種腫瘤類型是有用的，包括，如乳腺瘤、肺腫瘤、腎腫瘤、大腸瘤、及胰臟瘤。
圖1顯示在A4061032研究中包括之受試者的人口及基線特徵。
圖2顯示A4061032研究的部分收集之組織切片對組織塊之生物標記CD3及CD68的陽性細胞的百分比及密度之歸納。
圖3顯示比較小於生物標記CD68的陽性細胞的百分比及密度的中位數及大於或等於生物標記CD68的陽性細胞的百分比及密度的中位數的值之PFS的卡本-麥爾(Kaplan-Meier)圖。
圖4顯示比較小於先前以索坦®治療的患者體內的生物標記CD68的陽性細胞的百分比及密度的中位數及大於或等於先前以索坦®治療的患者體內的生物標記CD68的陽性細胞的百分比及密度的中位數的值之PFS的卡本-麥爾圖。
圖5顯示比較小於生物標記CD3的陽性細胞的百分比及密度的中位數及大於或等於生物標記CD3的陽性細胞的百分比及密度的中位數的值之PFS的卡本-麥爾圖。
圖6顯示比較小於先前以索坦®治療的患者體內的生物標記CD3的陽性細胞的百分比及密度的中位數及大於或等於先前以索坦®治療的患者體內的生物標記CD3的陽 性細胞的百分比及密度的中位數的值之PFS的卡本-麥爾圖。
圖7顯示小於生物標記CD3及CD68各者的陽性細胞的百分比及密度的中位數切割點層及大於或等於生物標記CD3及CD68各者的陽性細胞的百分比及密度的中位數切割點層之OS的歸納。
圖8顯示小於先前以索坦®治療的患者體內的生物標記CD3及CD68各者的陽性細胞的百分比及密度的中位數切割點層及大於或等於先前以索坦®治療的患者體內的生物標記CD3及CD68各者的陽性細胞的百分比及密度的中位數切割點層之OS的歸納。
圖9顯示比較小於先前以索坦®治療的患者體內的生物標記CD3及CD68的陽性細胞的百分比及密度的中位數及大於或等於先前以索坦®治療的患者體內的生物標記CD3及CD68的陽性細胞的百分比及密度的中位數之OS的卡本-麥爾圖。
圖10顯示依反應種類陽性細胞的百分比及密度，生物標記CD3及CD68之歸納。
圖11顯示依反應種類先前以索坦®治療的患者體內的陽性細胞的百分比及密度，生物標記CD3及CD68之歸納。
發明詳述 定義
如本文所用，抑癌特®、「AG-13736」及「阿西替尼」意指6-[2-(甲基胺甲醯基)苯基磺醯基]-3-E-[2-(吡啶-2-基)乙烯基]吲唑，其具有下列化學結構(包括其鹽及多型體(polymorph))：
如本文所用，「巨噬細胞標記蛋白」意指巨噬細胞細胞表面蛋白，偵測巨噬細胞細胞表面蛋白對在腫瘤的組織樣本中存在的其他細胞類型之中辨別巨噬細胞是有用的。 示範的人類巨噬細胞標記蛋白為CCR2、CD14、CD68、CD163、CSFIR及MSRl。其他巨噬細胞標記蛋可在本發明的實行中利用。
如本文所用，「接收者操作特徵(receiver operating characteristic,ROC)」曲線意指對二元分類系統，偽陽性率(敏感)對真陽性率(特異性)之圖。在建構ROC曲線時，應用下列定義：偽陰性率(False negative rate)「FNR」=1-TPR
真陽性率(True positive rate)「TPR」=真陽性/(真陽性+偽陰性)
偽陽性率(False positive rate)「FPR」=偽陽性/(偽陽性+真陰性)
如本文所用，對治療「反應」或「回應」意指，關於 被治療的腫瘤，腫瘤呈現：(a)生長趨緩、(b)停止生長、或(c)退化。
如本文所用，「臨界測定分析」意指代表特定腫瘤類型(如人類腎細胞惡性腫瘤)的資料集之分析，以測定對特定腫瘤類型的臨界分數。代表特定腫瘤類型的資料集可包括，此種腫瘤群組的各腫瘤：(a)實際腫瘤反應資料(對治療(如阿西替尼)反應或無反應)，及(b)巨噬細胞含量及/或CD68表現量。
如本文所用，「臨界分數」意指被分類為可能對治療(如阿西替尼)敏感的腫瘤以上的分數。
如本文所用，「CD68表現量」或「CD68多肽表現量」意指在腫瘤樣本中表現的CD68蛋白的量，並可藉由任何合適的分析性技術如免疫組織化學法而測定。此外，「CD68表現量」能以多種用語而表現，包括在特定樣本中經測定為「CD68陽性」的細胞的百分比，及在特定樣本中經測定為「CD68陽性」的細胞的密度。
如本文所用，「CCR2」(趨化激素(C-C型)受體2亦名為CD 192、CKR2、CMKBR2、MCP-1-R、CC-CKR-2、FLJ78302、MGC103828、MGC111760、及MGC168006)意指藉由以Entrez GenelD No.729230及其等位基因變異而辨別基因而編碼的對偶變異人類蛋白。
如本文所用，「CD14」意指藉由以Entrez GenelD No.929及其等位基因變異而辨別基因而編碼的對偶變異人類蛋白。
如本文所用，「CD68」(亦名為GP110；SCARD1；及DKFZp686M 18236)意指藉由以Entrez GenelD No.968及其等位基因變異而辨別基因而編碼的對偶變異人類蛋白。
如本文所用，「CD68陽性」細胞為藉由任何合適的分析性技術(如免疫組織化學法)偵測CD68存在之細胞。
如本文所用，「CD163」(亦名為Ml 30及MM 130)意指藉由以Entrez GenelD No.9332及其等位基因變異而辨別基因而編碼的對偶變異人類蛋白。
如本文所用，「CSF1R」(群落刺激因子1受體亦名為CSFR、FMS、FIM2、C-FMS、及CD115)意指藉由以Entrez GenelD No.1436及其等位基因變異而辨別基因而編碼的對偶變異人類蛋白。
如本文所用，「MSR1」(巨噬細胞清道夫受體(scavenger receptor)1亦稱為CD204、SCARA1、SR-A、phSR1及phSR2)意指藉由以Entrez GenelD No.4481及其等位基因變異而辨別基因而編碼的對偶變異人類蛋白。
如本文所用，「HR」意指風險比(hazard ratio)。 在圖3、4、5、6及9中，假設比例風險，風險比大於1表示風險比減少支持<中位數(Median)；風險比少於1表示風險比減少支持≧中位數；及只有當比較群組兩者N≧10時產生對數秩p-值。在圖7及8中，假設比例風 險，風險比大於1表示風險比減少支持<中位數；風險比少於1表示風險比減少支持≧中位數；及只有當比較群組兩者N≧10時產生對數秩p-值；及只有當比較群組兩者N≧5時產生風險比統計；然而，當在任一群組觀察到零事件，移除對數秩p-值及風險比。
臨床研究
抑癌特®，下文意指阿西替尼，為作用於血管內皮生長因子受體(VEGFR)之口服的小分子受體酪胺酸激酶抑制劑。阿西替尼被認為藉由血管新生以降低腫瘤生長及轉移，及藉由直接作用於表現及依賴這些受體的細胞以降低腫瘤生長及造成腫瘤退化。多個國家許可在疾病惡化之後，或對細胞激素或舒尼替尼(sunitinib)為抗藥性，對轉移性腎細胞癌(mRCC)以阿西替尼治療。
研究A4061032(ClinicalTrials.gov識別碼：NCT00678392)是標題為「阿西替尼(AG-013736)對轉移性腎細胞癌作為第二線藥物：軸試驗(Axitinib(AG-013736)as second line therapy for metastatic renal cell cancer：Axis trial)」之第3期登記試驗。設計試驗以展現在第一線藥物失敗之後在mRCC的患者身上阿西替尼延遲腫瘤惡化較索拉非尼(sorafenib)優良。總共計畫650位患者參與，且最後有723位受試者參與研究。
如實施例中更多細節所述，收集參與A4061032的患者及特別同意提供腫瘤樣本採集者之福馬林固定的石蠟包 埋(formalin-fixed paraffin embedded,FFPE)的腫瘤樣本。腫瘤髓(分化68「CD68」的團塊)或淋巴球(分化3「CD3」的團塊)浸潤在52位以阿西替尼治療的患者的腫瘤樣本中藉由免疫組織化學法(IHC)評估。目標是調查這些生物標記與功效的潛在關聯，與髓浸潤造成對目標為VEGF-VEGFR2路徑的抗血管新生試劑為抗藥性的假說一致(見Shojaei et al.(2007)Nat.Biotechnol.25(8)：911-920；及Lin et al.(2010)Eur.J.Cancer Suppl.8(7)：191)。
藉由全切片影像分析進行CD3及CD68的評估。圈起目標區域，並進行影像分析演算。測量陽性細胞的百分比(陽性細胞/總細胞數的數目)及陽性細胞的密度(如陽性細胞/mm2的數目)。某些患者捐贈FFPE塊，而某些捐贈樣本塊的切片。無論提供的是樣本切片或樣本塊，分析所有患者的樣本。
對IHC資料有52位可評估的患者，其中33位先前以索坦®(舒尼替尼)治療。CD3資料與測量的任何端點之間無關聯。如實施例中更多細節所述，對CD68陽性細胞的百分比及細胞密度為高度相關且有目標物有反應的患者對有目標物沒有反應的患者高出兩倍。
無論先前治療，有≧CD68值的中位數的患者中無惡化存活期(progression free survival,PFS)的中位數對分界點為3.7及3.8個月的兩個分界點個別對有<生物標記值(風險比[HR]=0.42，對數秩p-值≦0.01)的中位數的患 者(分界=5.21%陽性細胞或0.08細胞/mm2的細胞密度)為12.0個月。預先以索坦®治療的患者PFS的相似趨勢觀察到具有邊際統計顯著性(p-值：0.066及0.056分別對陽性細胞%及細胞密度)。對有相對較高CD68細胞數的患者之目標反應及整體存活期(overall survival,OS)觀察到合意的功效之相似趨勢，雖然當所有患者一同評估或當只評估預先以索坦®治療的患者時這些差異無統計顯著性。
進行另外的接收者操作特徵(ROC)分析以更好地瞭解基線腫瘤CD68的量之敏感及特異性，及從最初選擇的CD68的值的中位數最佳化CD68分界點的定義。選擇2、4、6、8個月PFS的預設分界值，及在四個PFS時間點的每一者上再次觀察到有較高CD68陽性細胞及細胞密度的患者對PFS具有較長的值(或相當於較小的疾病惡化或死亡機會)。
如實施例中更多細節所述，在2個月PFS觀察到最高的敏感、特異性及曲線下區域(area under the curve,AUC)的值，其中ROC曲線的AUC對CD68陽性細胞及細胞密度分別為0.776及0.809，其表示對PFS使用CD68表現量促使整體診斷精確度。對預測6個月的PFS的最佳分界點對CD68百分比及陽性細胞密度分別為4.41%及0.06細胞/mm2。對預先以索坦®治療的患者數值為相似的。
ROC分析亦使用於CD68對ORR的評估。如實施例 中更多細節所述，AUC對CD68陽性細胞的百分比及細胞密度分別為0.791及0.784，這再次表示對預測ORR使用CD68表現量促使整體精確度。對預測ORR的最佳分界點對CD68陽性細胞的百分比及細胞密度分別為9.42%及0.13細胞/mm2。對預先以索坦®治療的患者數值為相似的。對在21個月的存活機率，對試驗的中位數值，ROC分析沒有顯示統計上的顯著關聯(AUC為0.559)。
總結，無論先前的治療，對有較高腫瘤CD68的量的患者觀察到優良的PFS。有>CD68值的中位數的患者的PFS中位數對有<生物標記的值的中位數(HR=0.42，對數秩p-值≦0.01)對3.7對3.8個月的分界點的兩者為12.0個月。ROC分析表示對此資料在2、4、6及8個月促使預測的值，及精確的分界點(在6個月-對CD68陽性細胞的百分比及細胞密度為4.41%及0.06細胞/mm2)。
於是，本發明關於對以VEGFR抑制劑(如阿西替尼)治療的患者較高的CD68表現與較高的ORR及較長的PFS相關之發現。與OS不相關可能是因為在於阿西替尼進展之後混雜的進展後治療。這些觀察與增加的VEGF生產的機制及與較高巨噬細胞浸潤相關的血管新生狀態一致，及因此對阿西替尼的治療效果之較高的敏感。PFS的ROC分析，登記的端點，在治療兩個月之後顯示最高的敏感及特異性。
之前CD68表現被指出與接受替伏扎尼汀(tivozanib)治療的患者的成果相關(Lin et al.(2010)Eur.J. Cancer Suppl.8(7)：191)。之前亦顯示髓(CD11b Gr+)細胞在肺臟動物模型中造成對癌思停(bevacizumab)為抗藥性(Shojaei et al.(2007)Nat Biotechnol.25(8)：911-920)。這些資料應與對有較高CD68腫瘤的量的患者之較差的成果一致。然而這在此研究中沒有被觀察到。
對RCC患者，預後生物標記的辨別已有顯著的進展，但目前沒有辨別出目標VEGFR抑制劑(如阿西替尼)功效的預測性標記。根據最近的評論(Tonini G et al.(2011)Exper Rev Anticancer Ther 11(6)：921-930)，對RCC患者最合適的療法的選擇仍取決於風險標準(MSKCC)及其他預後標準。此外，作者們宣稱這些綜合的標準提供RCC患者成果的資訊，及需要對mRCC療法反應的預測性因子。在隨機的臨床試驗中需要潛在標記的驗證(Id.)。亦引用組織採集與分析的標準化作為在研發分子生物標記至潛在指導療法中的主要挑戰(Sonpavde G及Choueiri T,(2012)Br j Cancer 107(7)：1009-1016)。
進行本發明可使用的方法及分析性技術於下文進一步揭露。
組織樣本
人類患者的腫瘤的組織樣本可作為RNA來源、蛋白來源、或免疫組織化學法(IHC)的薄片的來源而使用，因此可如本發明所述測定樣本中CD68表現量。組織樣本 可藉由使用習知腫瘤活體組織切片工具及程序而取得。內視鏡活體組織切片、切除式活體組織切片、切開式活體組織切片、細針穿刺活體組織切片、鑽取式活體組織切片、削取式活體組織切片及皮膚活體組織切片為認可的醫療程序的實施例可藉由熟習此技術領域者使用而獲得腫瘤樣本。腫瘤組織樣本應為十分足夠提供充足的RNA、蛋白或用於測量標記基因的薄片，如，CD68表現量或藉由IHC視覺化巨噬細胞，如CD68陽性細胞表現。
腫瘤組織樣本可為允許測量巨噬細胞含量或對CD68有特異性的任何型態。換而言之，對RNA萃取、蛋白質萃取、或薄片的製備組織樣本必須充足。於是，組織樣本可為新鮮的、經由合適的低溫劑術保存、或經由非低溫技術保存。處理臨床活體組織切片的標準方法為在福馬林中固定組織樣本及接著將其包埋入石蠟。這種型態的樣本普遍稱作福馬林固定的石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)組織。熟習此技術領域者熟知對接續分析之組織製備的合適的技術。
巨噬細胞含量
在本發明的實行中，可藉由任何合適的方法(有多種)進行在組織樣本中(如，來自腫瘤)測定巨噬細胞含量的量(如，巨噬細胞數目或巨噬細胞標記如CD68的表現，如巨噬細胞標記蛋白的表現或編碼巨噬細胞標記蛋白如CD68的mRNA的表現)。例如，可藉由測量已知作為 巨噬細胞標記(如CD68)使用的一或多個基因的表現而完成間接測量巨噬細胞含量。測量基因表現的多種方法已知於本技術領域。這些方法可應用於測定巨噬細胞標記蛋白或編碼巨噬細胞標記蛋白的mRNA的量。示範性人類巨噬細胞標記基因為CCR2、CD14、CD68、CD163、CSF1R及MSR1。其他巨噬細胞標記也可使用。
RNA分析
習知的微陣列分析及定量聚合酶鏈鎖反應(quantitative polymerase chain reaction,QPCR)為對以mRNA的量測定巨噬細胞標記基因表現的量之方法的實施例。在本發明的某些實施態樣中，使用標準規章自細胞、腫瘤或目標組織萃取RNA。在其他實施態樣中，使用不要求分離RNA的技術進行RNA分析。
RNA分離
從組織樣本萃取真核生物的mRNA(如聚(a)RNA)快速且高效率的方法為良好建立的且已知於熟習此技術領域者。見，如，Ausubel et al.,1997，Current Protocols of Molecular Biology,John Wiley and Sons。組織樣本可為新鮮的、冷凍的或固定的石蠟包埋(FFPE)樣本如臨床研究腫瘤檢體。總體上，從新鮮或冷凍組織樣本分離的RNA較從FFPE樣本分離的RNA傾向於較少破碎。然而，腫瘤材料的FFPE樣本為較易取得的，及在本發明的方法中FFPE 樣本為使用RNA的合適來源。對FFPE樣本作為RNA來源藉由RT-PCR記錄基因表現之討論，見，如Clark-Langone et al.,2007,BMC Genomics 8：279。亦見，De Andres et al.,1995,Biotechniques 18：42044；及Baker et al.，美國申請專利No.2005/0095634。商業上可取得的試劑組與廠商對RNA萃取及製備的指示之使用為廣泛且普遍的。多種RNA萃取產品及完整試劑組的商業上廠商包括Qiagen(Valencia,CA)、Invitrogen(Carlsbad,CA)、Ambion(Austin,TX)及Exiqon(Woburn,MA)。
總體而言，以組織/細胞瓦解開始RNA分離。當組織/細胞瓦解時將由RNase分解的RNA最小化是被需求的。在RNA分離過程中限制RNase活性的方法為確保當細胞瓦解時變性劑立刻接觸細胞內容物。其他常見的方法為在RNA分離過程中包括一或多個蛋白酶。隨意地，在收集後立刻於室溫下在RNA穩定溶液中浸泡新鮮組織樣本。穩定溶液快速地滲透細胞，對保存在攝氏4度穩定RNA，用於接續的分離。
在某些規章中，總RNA為藉由氯化銫密度梯度離心而自瓦解的腫瘤材料分離。總體而言，mRNA佔總細胞的RNA的約1百分比至5百分比。固化的Oligo(dT)，如普遍使用oligo(dT)纖維素以從核醣體RNA(ribosomal RNA)和轉運RNA(transfer RNA)分離mRNA。若在分離後保存，必須在無RNase的環境下保存RNA。分離的RNA穩定保存的方法已知於本技術領域。可取得用於穩 定保存RNA的多種商業產品。
微陣列
編碼巨噬細胞標記蛋白(如CD68)的一或多個基因的mRNA表現量可使用習知DNA微陣列表現記錄技術而測量。DNA微陣列為特定DNA片段或附著在固體表面或基質如玻璃、塑膠或矽的探針之集合，其中各個特定DNA片段佔據陣列中的已知位置。以標示RNA的樣本雜合，通常在嚴格的雜合條件下，允許與陣列中各個探針相合的RNA分子之偵測及量化。在嚴格沖洗以移除非特異性結合的樣本材料之後，微陣列藉由共焦雷射顯微鏡或其他合適的偵測方法而掃描。現代商業DNA微陣列，常稱作DNA晶片，典型包含數以萬計的探針，及因此能夠同時測量數以萬計基因的表現。這種微陣列可用於實行本發明。或者，訂製晶片僅包含測量編碼巨噬細胞標記蛋白(如CD68)一或多個基因加上必要的對照或標準(如，用於資料標準化)所需的少數探針，可用於實行本發明。
為了促進資料標準化，可使用雙色的微陣列讀取機。 在雙色(雙頻)系統中，樣本能以發出第一波長的第一螢光標示，而以第二螢光標示的RNA或cDNA標準發出不同的波長。例如，Cy3(570nm)及Cy5(670nm)常在雙色微陣列系統中一起利用。
DNA微陣列技術是完善研發、商業上可取得、及廣泛利用的。因此，進行本文揭露的方法時，非熟習本技術 領域者可使用微陣列技術以測量編碼巨噬細胞標記蛋白(如CD68)的基因表現量而不需過多的實驗。DNA微陣列晶片、試劑(如用於RNA或cDNA製備、RNA或cDNA標示、雜合及沖洗溶液之試劑)、儀器(如微陣列讀取機)及規章熟知於本技術領域且可取自多種商業上的來源。微陣列系統之商業上的廠商包括Agilent Technologies(Santa Clara,CA)及Affymetrix(Santa Clara,CA)，但亦可使用其他PCR系統。
定量RT-PCR
mRNA的量代表編碼巨噬細胞標記蛋白(如CD68)的個別基因可使用習知的定量反轉錄聚合酶鏈鎖反應(quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction,qRT-PCR)技術而測量。qRT-PCR的優點包括敏感、彈性、定量精確性、及分辨高度相關的mRNA的能力。關於用於定量PCR的組織樣本處理的指導手冊可取自多種來源，包括qRT-PCR商業產品的製造商及廠商(如，Qiagen(Valencia,CA)及Ambion(Austin,TX))。 用於qRT-PCR自動化進行的儀器系統為商業上可取得且在許多實驗室中例行地使用。廣為人知的商業系統的實施例為應用生命系統7900HT快速即時聚合酶鏈鎖反應系統(Applied Biosystems,Foster City,CA)。
一旦mRNA被分離，藉由RT-PCR而記錄基因表現的第一步驟為將mRNA模板反轉錄成cDNA，其中接著在 PCR反應中呈指數放大。兩種普遍使用的反轉錄酶為禽類成髓細胞瘤病毒反轉錄酶(avian myeloblastosis virus reverse transcriptase,AMV-RT)及莫洛尼鼠類白血病病毒反轉錄酶(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase,MMLV-RT)。反轉錄反應典型是以特異引子、隨機六聚體、或oligo(dT)引子而啟動。得到的cDNA產物可在接續的聚合酶鏈鎖反應中作為模板使用。
使用熱穩定的DNA依賴的DNA聚合酶進行PCR步驟。在PCR系統中最普遍使用的聚合酶為海棲熱袍菌(Thermus aquaticus,Taq)聚合酶。與用於放大之目標DNA區域互補(即，自編碼巨噬細胞標記蛋白(如CD68)的基因反轉錄的cDNA區域)的引子之使用導致PCR的選擇性。因此，當在本發明中利用qRT-PCR時對各個標記基因為特異性的引子是基於基因的cDNA序列。商業上的科技如SYBR(R)綠或TaqMan(R)(Applied Biosystems,Foster City,CA)可根據廠商的指示而使用。藉由比較管家基因(如β-肌動蛋白或GAPDH)的量可在加入的樣本之間標準化信使RNA量的差異。mRNA表現量可相對任何單控制樣本(如取自正常、非腫瘤組織或細胞的mRNA)而表現。或者，可相對取自腫瘤樣本庫、或腫瘤細胞株、或商業上可取得的mRNA控制組套組之mRNA而表現。
用於PCR分析編碼巨噬細胞標記蛋白(如CD68)的基因的表現量之合適的引子套組可由熟習本技術領域者無 過多實驗而設計及合成。或者，用於實行本發明的PCR引子套組可購自商業上的來源(如應用生命系統)。PCR引子較佳為約17至25核苷酸長。引子可設計成具有特定熔解溫度(melting temperature,Tm)，使用習知演算法以估計Tm。用於引子設計的軟體及估計Tm為商業上可取得的，如，Primer ExpressTM(Applied Biosystems)，及亦可取自於網路，如，Primer3(Massachusetts Institute of Technology)。藉由應用PCR引子設計之建立的原理，可使用大量不同的引子以測量任何給定基因的表現量，包括巨噬細胞標記蛋白如CD14、CD68、MSR1、CSFR1、CD163及CCR2。
在本發明的某些實施態樣中，使用不涉及RNA萃取或分離的技術以進行RNA分析。這種技術的其中一種是定量核酸酶保護分析(quantitative nuclease protection assay)，其在qNPATM(High Throughput Genomics,Inc.,Tucson,AZ)名下是商業上可取得的。當要分析的腫瘤組織樣本是FFPE材料型態時此技術可為有利的。見，如，Roberts et al.,2007,Laboratory Investigation 87：979-997。
蛋白質分析
在本發明的方法中，可於蛋白質尺度偵測到巨噬細胞標記基因表現(如CD68)。用於在蛋白質尺度測量巨噬細胞標記基因表現量的方法之實施例包括酵素結合免疫吸 附分析法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)及IHC分析。
ELISA
進行巨噬細胞標記蛋白ELISA，如，CD68 ELISA，需要至少一種抗巨噬細胞標記蛋白抗體，即，偵測抗體。 在示範性實施態樣中，CD68是巨噬細胞標記蛋白。將要分析之來自樣本的CD68蛋白於固體支撐物(如聚苯乙烯微價盤)上固化。固化可藉由CD68的非特異結合，如經由吸附於表面。或者，固化可藉由特異性結合，如，在「三明治法」ELISA中，經由藉由捕捉抗體(不同於偵測抗體之抗CD68抗體)結合來自樣本的CD68。在固化CD68之後，加入偵測抗體，且偵測抗體與結合的CD68形成複合物。偵測抗體直接或間接地(如經由特異性地辨認偵測抗體之二次抗體)連結至酵素。通常在各步驟之間，結合CD68的盤以溫和的洗滌劑溶液洗滌。典型的ELISA規章亦包括一或多個阻擋步驟，其涉及使用非特異性結合蛋白如牛血清白蛋白以阻擋不想要的蛋白試劑非特異性結合至盤。在最終洗滌步驟之後，藉由加入合適的酵素基質以發展盤，以產生可見的信號，其標示樣本中CD68的量。基質可為，如，產色基質或螢光基質。 ELISA方法、試劑及設備熟知於本技術領域且為商業上可取得的。
瞭解其他巨噬細胞標記蛋白(如，CCR2、CD14、 CD163、CSF1R、及MSR1)的表現量，及可藉由使用對各巨噬細胞標記蛋白為特異性的偵測抗體ELISA測量其他巨噬細胞特異蛋白。
免疫組織化學法(IHC)
在一給定的細胞群中巨噬細胞的數目可藉由免疫組織化學法測定(如，視覺化的)。另外，在樣本中對一給定的生物標記蛋白(如CD68)為陽性的細胞的百分比及密度，可藉由免疫組織化學法測定。藉由IHC鑑定巨噬細胞標記蛋白，如，CD68 IHC，需要至少一種抗巨噬細胞標記蛋白抗體，如，至少一種抗CD68抗體。適於IHC之多種抗CD68抗體為商業上可取得的。例如，合適的抗體可購自Dako North America,Inc.(Carpinteria,CA)、abeam(Cambridge,MA)、Abnova(Walnut,CA),R and D Systems(Minneapolis,MN)或Invitrogen(Carlsbad,CA)。使用標準技術，抗CD68抗體可用於偵測區域中CD68的存在，如5微米的區域，取自腫瘤，包括石蠟包埋且冷凍的腫瘤區域。通常，腫瘤區域最初以收回在採集及保存腫瘤材料的初始過程固定之蛋白的抗原性結構方式施用。切片接著被阻擋以防止由抗CD68偵測抗體的非特異性結合。CD68蛋白的存在接著藉由抗CD68抗體結合至CD68蛋白而偵測。偵測(一次)抗體直接或間接地(如經由特異性辨認偵測(一次)抗體之二次抗體或聚合物)連結至酵素。通常，在步驟之間清洗並以非特異性蛋白如牛血清白蛋白阻 擋腫瘤區域。使用合適的酵素基質發展切片已產生可見的信號。樣本能以蘇木素(hematoxylin)複染。
瞭解其他巨噬細胞標記蛋白(如，CCR2、CD14、CD163、CSF1R、及MSR1)的表現，及可使用對各巨噬細胞標記蛋白為特異性的抗體藉由IHC以相似的方式偵測其他巨噬細胞特異標記蛋白。
數據解讀
對腫瘤的巨噬細胞分數可相對臨界分數而解讀。巨噬細胞分數，或特定生物標記(如CD68)的表現量，相等於或高於臨界分數可解讀成腫瘤可能對以VEGFR抑制劑(如以阿西替尼)的治療敏感(有反應的)之預測。或者，巨噬細胞分數，或或特定生物標記(如CD68)的表現量，相等於或低於臨界分數可解讀成腫瘤可能對以VEGFR抑制劑(如以阿西替尼)的治療為抗藥性(無反應的)之預測。
最佳的臨界巨噬細胞分數，或CD68表現量，可藉由進行臨界測定分析而經驗性地(或至少大約地)偵測。較佳的是，臨界測定分析包括接收者操作特徵(ROC)曲線分析。ROC曲線分析為建立的統計技術，其應用於非熟習本技術領域者。對ROC曲線分析的討論，見總體上Zweig et al.,1993,“Receiver operating characteristic(ROC)plots：a fundamental evaluation tool in clinical medicine”,Clin.Chem.39：561-577；及Pepe,2003,The statistical evaluation of medical tests or classification and prediction,Oxford Press,New York。
巨噬細胞分數，CD68表現量，及最佳臨界分數可能隨著腫瘤類型不同而變化。因此，臨界測定分析較佳為使用本發明進行於代表將要測試的任何給定的腫瘤之一或多個資料集。用於臨界測定分析的資料集包括：(a)實際反應數據(有反應或無反應)，及(b)巨噬細胞分數或對來自一腫瘤群組的各個腫瘤樣本的CD68表現量。一旦巨噬細胞分數或CD68臨界表現量相對一給定的腫瘤類型而測定，臨界表現量可應用於解讀此腫瘤類型的腫瘤的巨噬細胞分數或CD68表現量。
ROC曲線分析可依照下文進行。將任何巨噬細胞分數或CD68表現量高於或等於臨界之樣本作為有反應者(敏感)辨認。或者，將任何巨噬細胞分數或CD68表現量低於或等於臨界之樣本作為無反應者(抗藥性)辨認。對所有來自樣本的試驗的集之巨噬細胞分數或CD68表現量，「有反應者」及「非反應者」(推測性稱呼)使用此分數作為臨界而分類。此方法經由對資料集之推測性稱呼對實際反應數據之比較，使對各潛在臨界能夠計算TPR(y向量)及FPR(x向量)。接著ROC曲線藉由使用TPR向量、及FPR向量做出點曲線而建構。若ROC曲線是在對角線之上從點(0,0)至點(1.0,0.5)，顯示巨噬細胞試驗結果是較隨機為佳的試驗。
可使用ROC曲線以辨別最佳操作點。最佳操作點為 在衡量的偽陽性的成本對偽陰性的成本之間產生最佳平衡的點。這些成本不需為相等的。在ROC空間中於點x、y分類之平均預期成本藉由下式測定。
C=(1-p)alpha*x+p*beta(1-y)
其中：alpha=偽陽性的成本，beta=缺失的陽性(偽陰性)的成本，及p=陽性案例的比例。
偽陽性及偽陰性可藉由對alpha及beta分配不同值而不同地衡量。例如，若決定在非反應者的患者治療的成本包括更多患者於有反應者群組中，可將alpha的量增多。在這情況下，假設偽陽性及偽陰性的成本是相同的(alpha等於beta)。因此，在ROC空間中點x、y分類的平均預期成本為：C’=(1-p)*x+p*(1-y)。
在使用所有偽陽性及偽陰性(x,y)對之後可計算最小的C’。最佳臨界分數計算成在C’的(x,y)分數。
除了預測腫瘤是否將會對VEGFR抑制劑(如阿西替尼)敏感或抗藥性之外，巨噬細胞分數或CD68表現量提供大約但有用之腫瘤會是敏感或抗藥性的可能程度的指標。
試驗套組
本發明包括包含用於進行本發明之方法的特定組件之 診斷性試驗套組。診斷性試驗套組在進行診斷性鑑定中提高便利性、速度及再現性。例如，在本文的基於qRT-PCR的示範性實施態樣中，基本的診斷性試驗套組包括用於分析巨噬細胞標記(如CD68)的表現之PCR引子。在其他的實施態樣中，更精巧的試驗套組不僅包含PCR引子，但亦包含緩衝劑及用於使用PCR技術測量CD68表現量的詳細指示。在某些實施態樣中，套組包括試驗規章及試驗所需的所有消耗性組件((複數個)RNA樣本除外)。
在本文的基於DNA微陣列的示範性實施態樣中，試驗套組包括設計成使用於特定設備之微流體卡(鑑定)。 任意地，微流體卡為設計成用於測量巨噬細胞標記基因表現量之客製的裝置。這種客製的微流體卡為商業上可取得的。例如，TaqMan鑑定為設計成使用於Applied Biosystems 7900HT Fast Real Time PCR System(Applied Biosystems,Foster City,CA)之384槽的微流體卡(鑑定)。示範性流體卡可能包括任何用於測量CCR2、CD14、CD68、CD163、CSF1R及/或MSR1加上必要的控制組或標準(如，用於數據標準化)的引子組合。亦可在用於實行本發明之流體卡上包括其他巨噬細胞標記蛋白。
在本發明的某些實施態樣中，試驗套組包含用於藉由IHC測定腫瘤巨噬細胞含量的材料。IHC套組，例如，可能包含一次抗人類巨噬細胞標記抗體，如，老鼠抗人類CD68抗體，及與回報酵素(reporter enzyme)共軛的二 次抗體，如，山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)。 在某些實施態樣中，以特異性辨認一次抗體的共軛聚合物取代二次抗體。
實施例
本發明由以下實施例進一步說明，其不應以任何方式被理解為限制發明範疇或內容。
實施例1-組織切片對組織塊之CD3和CD68陽性細胞的百分比及密度
本研究為在轉移性腎細胞癌(mRCC)患者身上阿西替尼對索拉菲尼之雙臂、隨機、雙盲、多中心的第3期研究，在一包含一或多以下試劑(舒尼替尼、癌思停+IFN α、西羅莫司(temsirolimus)或(複數種)細胞激素)預先系統的第一線方案失敗之後。總體上，將723位mRCC患者隨機化並參與本研究，其中52位阿西替尼治療的患者以免疫組織化學法(IHC)分析而評估；另外，52位患者中的33位先前以索坦®治療。
如圖1所示，在IHC分析中包括的主要患者為白種人(患者的90.4%)、男性(患者的69.2%)及來自北美(患者的57.7%)及歐洲(32.7%)。總平均(標準差)年齡、身高及體重分別為58.3(11.0)歲、173.0(10.0)公分、及84.6(19.1)公斤。所有患者具有0(患者的51.9%)或1(患者的48.1%)的ECOG表現狀態。總體 上，對Memorial Sloan-Kettering Cancer Center(MSKCC)存活之預後群組因子模型，23.1%的患者歸類為有利的，及34.6%及42.3%的患者分別為中等及不佳的。另外，MSKCC風險群組使用以下四種風險因子而衍生：高的乳酸去氫酶(>1.5倍正常上限)、低的血清血紅素(低於正常下限)、高的修正血清鈣(>10mg/dL)、及先前無腎切除術。
對CD3及CD68評估所有52位患者。在52位可評估CD3及CD68的患者當中，26位捐贈福馬林固定的石蠟包埋(FFPE)腫瘤塊，及26片捐贈的切片用於分析。 Mosaic Laboratories提供代表正常人類及人類癌症的FFPE材料。依按照由人類研究保護辦公室定義的「人類試驗研究豁免」的準則用於體外分析允許使用殘留的、去除個人訊息的、或匿名的人類樣本之IRB評論的規章(MOS001)處理檢體。CD68老鼠單株KP1抗體(Catalog# M0814，Lot# 46406，保存期限：2011年九月)購自Dako(Carpinteria,California,United States)並依照附帶的文件保存在2-8℃。老鼠IgG同型控制組抗體(Lot# 37211，保存期限：2010年七月)購自Dako並依照附帶的文件保存在2-8℃。依照Mosaic Laboratories的SOP進行IHC。CD68之IHC鑑定被設計成且經驗證與用於「自製」的第一級試驗驗證之CLIA準則相合。
由病理學家及涉及以下組合之反應性的評估而評估染色：CD68染色的細胞局部化；染色強度；次細胞局部 化；及目標組織類型的主要組成物中細胞染色的百分比。 顯微照相(20倍放大)以附接於Nikon Eclipse 50i顯微鏡的Spot Insight QE Model 4.2致冷感光耦合元件(cooled charge-coupled device)相機(Diagnostic Instruments,Sterling Heights,Michigan,United States)取得。
CD3及CD68陽性細胞的平均百分比在組織切片中較在組織塊中為稍低；對CD3為13.61%比17.95%及對CD68為5.83%比8.21%。相似地，在組織切片中觀察到較組織塊中為稍低的平均細胞密度；對CD3為489.15細胞/mm2比590.50細胞/mm2，及對CD68為0.08細胞/mm2比0.13細胞/mm2(圖2)。
實施例2-Higher較高的CD68表現量與良好的ORR及PFS(但非OS)呈正相關
對IHC生物標記分析，使用生物標計分析套組，其包括所有接受至少一劑研究治療的患者。分析以下功效端點：PFS、OS、及客觀反應率(objective response rate,ORR)。總結的統計依照反應類別(對各標記，完全反應[CR]+部分反應[PR]對穩態疾病[SD]+惡化疾病[PD])提供於陽性細胞的百分比及密度。對反應類別之間的差異進行威爾克爾遜等級和檢定(Wilcoxon Rank Sum test)。費雪精確檢定(Fisher’s exact test)用於檢定使用中位數值作為分界點之反應類別與生物標記層之間的關聯。OS及PFS的分布使用卡本-麥爾法藉由生物標記中位數值作為 分界點而在生物標記層之間比較；在任何層中當N<10時不顯示p-值。估計的風險比(HR)及其2端的95%信賴區間(CI)，及報告事件時間中位數及其2端的95%信賴區間。使用威爾克爾遜等級和檢定以中位數值作為分界點在生物標記層之間比較腫瘤體積中最佳的反應百分比變化。
在生物標記層之間的ORR、PFS、及OS分析中對顯著試驗結果(p<0.05)，生產接收者操作特徵(ROC)曲線以進一步評估作為患者挑選標記效用的潛力。在預測雙患者客觀反應(CR+PR對SD+PD)中基線CD68值作為連續性診斷標記上進行ROC分析。對時間相依臨床結果PFS及OS，時間相依的ROC，記為ROC(t)，其中t表示目標時間點，應用於使用Kaplan-Meier estimator 20分析基線CD68值以預測存活結果。用於預測臨床結果的CD68值的最佳分界點為取自ROC曲線上的點(其具有從敏感及特異性兩者的值為1的點之最小距離)。使用梯型規則計算AUC。
觀察到較高的CD68表現與較長的PFS及較高的ORR相關，然而，在患者中沒有觀察到CD68表現及OS之間的關聯。無論先前的治療，患者中≧CD68值的中位數(分界=5.21%陽性細胞或0.08細胞/mm2)之PFS中位數當無論先前治療而評估所有患者時對<生物標記值的中位數(HR=0.42，對數秩p-值≦0.01)的患者兩者的分界點分別對3.7及3.8個月為12.0個月(圖3)。然而，對 以索坦®先治療的患者，觀察到與PFS相似但非統計上顯著趨勢(圖4)。無論先前治療或以索坦®先治療的患者，在CD3的量及PFS之間沒有統計上顯著關聯(圖5及6)。
再者，無論先前治療，≧CD68值的中位數(分界=5.21%陽性細胞或0.08細胞/mm2)之患者中OS的中位數當無論先前治療而評估所有患者時對<生物標記值的中位數(所有案例中HR>0.6，非統計上顯著)的患者為20.0個月及22.6個月分別對21.8個月或17.8個月(圖7)。對以索坦®先治療的患者與OS沒有觀察到統計上顯著關聯。無論治療或在先以索坦®治療的患者中，CD3的量及OS亦無統計上顯著關聯(圖8)。使用ROC分析，對較高的CD68細胞計數觀察到良好的OS，雖然0.559的AUC值在CD68的量的預測值中指示低信賴(圖9)。
最後，無論先前治療，藉由陽性細胞百分比(p-值=0.0059)或細胞密度(p-值=0.0071)測量的CD68的量在反應者(CR+PR)對非反應者(SD+PD)中高出2倍(圖10)。對先前以索坦®治療的患者，藉由陽性細胞百分比(p-值=0.407)或細胞密度(p-值=0.0762)測量的CD68的量在反應者對非反應者中高出2倍(圖11)。在ORR分析中對可估計生物標記的患者中，較高CD68百分比及陽性細胞密度的患者傾向於具有腫瘤客觀反應的較好機率。ROC分析顯示CD68百分比及陽性細胞密度分別為0.818及0.795之預測精確度。0.791及0.784的AUC，指 示使用CD68生物標記對ORR高的整體預測精確度。對預測ORR的最佳分界點CD68陽性細胞百分比及細胞密度分別為9.42%及0.13細胞/mm2。
對先前以索坦®治療之可估計生物標劑的患者在ORR分析中發現相似結果。較高CD68陽性細胞百分比及密度的患者傾向於具有腫瘤客觀反應的較好機率。ROC分析顯示CD68陽性細胞百分比及密度分別為0.777及0.852之預測精確度。0.809及0.764的AUC，指示使用CD68生物標記對ORR高的整體診斷精確度。對預測ORR的最佳分界點CD68陽性細胞百分比及細胞密度分別為5.20%及0.16細胞/mm2。

Claims (6)

  1. 一種辨別對以阿西替尼(axitinib)治療敏感的轉移性腎細胞癌(mRCC)之非治療性方法，其包含：(a)測量取自考慮以阿西替尼治療之人類病患的mRCC腫瘤之組織樣本中CD68多肽表現量；及(b)將步驟(a)中CD68表現量與藉由測量取自先前以阿西替尼治療且表現對阿西替尼為抗藥性之人類病患及先前以阿西替尼治療且表現對阿西替尼為敏感性之人類病患的mRCC腫瘤之組織樣本中CD68多肽表現所測定之臨界CD68表現量比較，其中高於該臨界量的CD68表現量表示該mRCC腫瘤對以阿西替尼治療敏感。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該測量CD68多肽表現的步驟是藉由免疫組織化學法進行。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該藉由免疫組織化學法測量CD68多肽表現之步驟是藉由自全切片掃描(whole slide scan)之影像分析進行，其中測定該樣本中CD68陽性細胞之百分比。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其進一步包含測定該樣本中CD68陽性細胞的密度之步驟。
  5. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該mRCC具有至少5% CD68陽性腫瘤細胞。
  6. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該mRCC具有至少0.08 CD68陽性腫瘤細胞/mm2的細胞密度。
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