TR201802202T4

TR201802202T4 - IL-31'e spesifik beşerileştirilmiş antikor molekülleri.

Info

Publication number: TR201802202T4
Application number: TR2018/02202T
Authority: TR
Inventors: Bondensgaard Kent; Beckmann Roland
Original assignee: Merck Serono Sa; Zymogenetics Inc
Priority date: 2007-12-07
Filing date: 2008-12-08
Publication date: 2018-03-21
Also published as: PT2796466T; RS56930B1; IL206147A; NO2796466T3; CY1120412T1; DK2796466T3; US20180305448A1; EP2796466B1; HUE036548T2; US9005921B2; PL2796466T3; US20130295611A1; HK1169127A1; ES2660036T3; US8685669B2; US9982044B2; EA020457B1; CA2708251A1; EP2796466A2; US20150183868A1

Abstract

Burada, insan IL-31'i spesifik olarak bağlayan, bir beşerileştirilmiş ağır zincir değişken alanı ve bir beşerileştirilmiş hafif zincir değişken alanı içeren bir izole edilmiş monoklonal antikor veya bunun antijen-bağlama fragmanı sağlanır, burada beşerileştirilmiş ağır zincir değişken alanı, sırasıyla SEQ ID NO.'ları: 1, 2 ve 3 amino asit dizilerinden oluşan bir CDR1, CDR2 ve CDR3 ve sırasıyla SEQ ID NO:12 (FR1), SEQ ID NO:13 (FR2), SEQ ID NO:14 (FR3) ve SEQ ID NO:15 (FR4) amino asit dizisine en az %90 özdeş olan bir amino asit dizisine sahip olan çerçeve bölgeleri FR1, FR2, FR3 ve FR4 içerir ve burada beşerileştirilmiş hafif zincir değişken alanı, sırasıyla SEQ ID NO.'ları: 5, 6 ve 7 amino asit dizilerinden oluşan bir CDR1, CDR2 ve CDR3 ve sırasıyla SEQ ID NO:17 (FR5), SEQ ID NO:18 (FR6), SEQ ID NO:19 (FR7) ve SEQ ID NO:20 (FR8) amino asit dizisine en az %90 özdeş olan bir amino asit dizisine sahip olan çerçeve bölgeleri FR1, FR2, FR3 ve FR4 içerir.

Description

TARIFNAME lL-31'E SPESIFIK BESERILESTIRILMIS ANTIKOR MOLEKÜLLERI benzeri semptomlar ile sonuçlandigi bulunmustur. Bakiniz, Dillon et al., Nature azaltan, antagonize eden veya nötralize eden ve anti-IL-31 antikorlarini içeren antagonistlerin kullanilmasi ile hafifletilebilir. Ayrica, bakiniz, 21 Ocak 2003'te ABD Patentleri.

Monoklonal antikor teknolojisi, hastaligi tanimlamada ve tedavi etmede kullanilmasi için genis bir terapötikler ayni zamanda tanisallar dizisi saglamistir. Kemirgen antijen- baglama yerleri içeren çok sayida rekombinant veya biyosentetik molekül tarif edilmistir. Özel olarak, tüm degisken alandan ziyade yalnizca kemirgen baglama yerini insan immünoglobülin agir ve hafif zincir alanlarina greft etme ile dogrudan insan antikorlari üzerine insa edilen kemirgen antijen-baglama yerlerine sahip olan moleküller belirleme bölgelerinin (CDR'Ierinin) en az birinin bir mürin monoklonal antikorundan türetildigi ve molekülün geri kalan immünoglobülin-kaynakli parçalarinin insan immünoglobülininden türetildigi bir antijen-baglama yerine sahip olan moleküller 21 edilmistir. Çok sayida tek zincirli antijen-baglama yeri polipeptidi ve tek zincirli (st) Numarali ABD Patenti ve Ladner et al., için 4,946,778 Numarali ABD Patenti.

Fare anti-insan IL-31 monoklonal antikorlari, insan IL-31'i taniyan ve kimerik antikorlar üretmek için kullanilabilen fare monoklonal antikorlarini tarif eden 8 Mayis 200'da Numarali ABD Patent Yayini'nda) önceden tarif edilmistir. Bununla birlikte, kimerik antikorlar immünojenisiteye neden olabilir ve beserilestirilmis fare-anti-insan IL-31 antikorlari arzu edilebilir. Beserilestirilmis antikorlar genel olarak, insan terapisinde kullanilmasi için fare antikorlarina veya baz durumlarda kimerik antikorlara kiyasla en az üç potansiyel avantaja sahiptir: (1) Efektör kisim insana ait oldugundan, bu insan immün sisteminin diger parçalari ile daha iyi etkilesime girebilir (örnegin, kompleman- bagimli sitotoksisite (CDC) veya antikor-bagimli hücresel sitotoksisite (ADCC) ile hedef hücreleri daha etkili bir sekilde yok edebilir); (2) Insan immün sistemi beserilestirilmis antikorun çerçeve veya sabit bölgesini yabanci olarak tanimamalidir ve bundan dolayi bu tarz enjekte edilmis bir antikora karsi antikor yaniti bir bütünüyle yabanci fare antikoruna veya bir kismen yabanci kimerik antikora karsi olan yanitta kiyasla daha az olmalidir ve (3) Enjekte edilmis fare antikorlarinin normal antikorlarin yari-ömrüne kiyasla insan dolasiminda çok daha kisa bir yari-ömre sahip oldugu bildirilmistir (D. olasilikla, dogal olusumlu insan antikorlarina daha çok benzeyen bir yari-ömre sahip olacaktir, bu verilecek olan daha küçük ve daha az sik dozlara olanak saglayacaktir.

Böylelikle, lL-31 aracilik enflamasyonu tedavi etmek amaciyla fare anti-insan IL-31 antikoru için beserilestirilmis degisken bölge amino asit dizileri saglayan moleküllere yönelik bir ihtiyaç vardir.

BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus, istemlerde tanimlandigi üzere, insan lL-31'i baglayan bir izole edilmis antikor ile ilgilidir. Izole edilmis antikor asagidakileri içerir: a) sirasiyla SEQ ID NO: 1, 2 ve 3 amino asit dizilerinden olusan CDR'Ier içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve b) SEQ ID NO: 5, 6 ve 7 amino asit dizilerinden olusan CDR'Ier içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani. Bulusun antikorlarinda, a) söz konusu beserilestirilmis agir zincir degisken alani, asagidakilerden olusan gruptan seçilen amino asit dizisine en az %90 özdes olan bir amino asit dizisine sahip olan çerçeve bölgeleri FR1, FR2, FR3 ve FR4 içerir: sirasiyla SEQ ID NO: 12 (FR1), 13(FR2), 14 (FR3) ve 15 (FR4) amino asit dizisi ve b) söz konusu beserilestirilmis hafif zincir degisken alani, asagidakilerden olusan gruptan seçilen amino asit dizisine en az dizisi. Bir uygulamada, söz konusu özdeslik. en az %95'tir, hatta daha tercihen en az Bulusun izole edilmis antikorunda, agir zincirin FR1'inde pozisyon 29'daki amino asit lösindir ve agir zincirin FR3'ünde pozisyon 32'deki amino asit fenilalanindir. Bulusun izole edilmis antikorunda, agir zincirin FR3'ünde pozisyon 8'deki amino asit lizindir ve hafif zincirin FR7'sinde pozisyonda 15'teli amino asit tirozindir.

Bir yönünde, mevcut açiklama insan IL-31'i baglayan asagidakileri içeren bir izole edilmis antikor ile ilgilidir: a) FR1'de pozisyon 29'daki amino asidin lösin ve FR3'te pozisyon 32'deki amino asidin fenilalanin olmasi sartiyla, sirasiyla SEQ ID NO: 1 ve 3 amino asit dizisine sahip olan CDR1 ve CDR3 ve AIYPGDGDTRYSXaa1Xaa2FXaa3G (SEO lD NO: 22) amino asit dizisine sahip olan CDRS içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani, burada Xaa1, glutamindir veya prolindir, Xaa2i serindir veya lizindir ve Xaa3, glutamindir veya lizindir; söz konusu beserilestirilmis agir zincir degisken alani, asagidaki amino asit dizisine en az %90 özdes olan bir amino asit dizisine sahip olan çerçeve bölgeleri FR1, FR2, FR3 ve FR4 içerir: sirasiyla SEO ID içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani, söz konusu beserilestirilmis hafif zincir degisken alani, sirasiyla SEQ ID NO: 17, 18, 19 ve 20 amino asit dizisine en az FR8 içerir. Mevcut açiklamanin bir yönünde, söz konusu özdeslik, en az %95'tir, hatta daha tercihen en az %98'dir, en tercihen en az %99'dur. Bir baska yönde, açiklama burada tarif edildigi sekilde bir izole edilmis antikor ile ilgilidir, burada agir zincirin FR3'ünde pozisyon 8'deli amino asit lizindir ve hafif zincirin FR7'sinde pozisyon 15'dei amino asit tirozindir. Bir baska yönde, açiklama burada tarif edildigi sekilde bir izole edilmis antikor ile ilgilidir, burada: amino asit Xaa1, glutamindir, Xaa2, lizindir ve Xaa3, lizindir; amino asit Xaa1, prolindir, Xaa2, serindir ve Xaa3, glutamindir veya amino asit Xaa1, glutamindir, Xaa2, lizindir ve Xaa3, glutamindir.

Bir baska yönde, açiklama burada tarif edildigi sekilde bir izole edilmis antikor ile ilgilidir, burada agir zincir degisken alaninin CDR'leri, sirasiyla SEQ ID NO: 1'den, 4'ten ve 3'ten olusur, hafif zincir degisken alaninin CDR'leri, sirasiyla SEQ ID NO: 5'ten, 6'dan ve 7'den olusur, agir zincir degisken alaninin çerçeve bölgeleri, sirasiyla SEO lD NO: 8'den, 9'dan, 10'dan ve 11'den olusur ve hafif zincir degisken alaninin çerçeve bölgeleri, sirasiyla SEO ID NO: 17'den, 18'den, 19'dan ve 20'den olusur.

Bir baska yönde, açiklama burada tarif edildigi sekilde bir izole edilmis antikor ile ilgilidir, burada agir zincir degisken alaninin CDR'Ieri, sirasiyla SEO ID NO: 1'den, 2'den ve 3'ten olusur, hafif zincir degisken alaninin CDR'leri, sirasiyla SEO ID NO: 'ten, 6'dan ve 7'den olusur, agir zincir degisken alaninin çerçeve bölgeleri, sirasiyla SEO ID NO: 12'den, 13'ten, 14'ten ve 15'ten olusur ve hafif zincir degisken alaninin çerçeve bölgeleri, sirasiyla SEO ID NO: 17'den, 18'den, 19'dan ve 20'den olusur.

Bir baska yönde, açiklama burada tarif edildigi sekilde bir izole edilmis antikor ile ilgilidir, burada agir zincir degisken alaninin CDR'Ieri, sirasiyla SEO ID NO: 1'den, Z'den ve 3'ten olusur, hafif zincir degisken alaninin CDR'leri, sirasiyla SEO ID NO: 'ten, 6'dan ve 7'den olusur, agir zincir degisken alaninin çerçeve bölgeleri, sirasiyla SEO ID NO: 12'den, 13'ten, 16'dan ve 15'ten olusur ve hafif zincir degisken alaninin çerçeve bölgeleri, sirasiyla SEO ID NO: 17'den, 18'den, 21'den ve 20'den olusur.

Buradaki Örneklerden ve ögretilerden gösterilebilecegi üzere, burada tarif edilen beserilestirilmis antikorlarin hem FR1'inde pozisyon 29'da bir Iösin hem de FR3'ünde pozisyon ?2'de bir fenilalanin varligi söz konusu antikorlarin afinitesi ve potensi açisindan pozitif bir etkiye sahiptir. Örnegin bir Biacore analizinde gösterildigi üzere, hem FR1'inde pozisyon 29'da bir Iösin hem de FR3'ünde pozisyon 32'de bir fenilalanin tasiyan beserilestirilmis antikorlarin baglama afinitesi, bu pozisyonlarda bir baska amino asit tasiyan beserilestirilmis antikorlar ile karsilastirildiginda daha iyidir (örnegin, Örnek 3'ün Tablo 2'sindeki 7, 10, 13 ve 14 numarali klonlar ile karsilastirin). Agir zincirin FR1'indepozisyon 29'da ve FR3'ünde 94'te bu amino asitlerin, hem afinite hem de potens açisindan, pozitif etkisi ayri iki baska biyolojik test ile de dogrulanmistir (bakiniz, Örnek 4 ve 5).

Mevcut bulusun bir uygulamasinda, istemlerde tanimlanan antikor, bir 0, v, p, 6 veya 8 insan immünoglobülin agir zincirinin sabit bölgesinden olusan gruptan seçilen bir agir zincir immünoglobülin sabit alani içerir. Mevcut bulusun bir uygulamasinda, istemlerde tanimlanan antikor, bir insan lgG1 sabit alanindan; bir insan IgG2 sabit alanindan; bir insan IgG3 sabit alanindan; bir insan IgG4 sabit alanindan; bir insan lgM sabit alanindan; bir insan IgE sabit alanindan ve bir insan IgA sabit alanindan olusan gruptan seçilen bir agir zincir immünoglobülin sabit alani içerir. Bir uygulamada, insan bulunan veya hiç kompleman aktive etme aktivitesi bulunmayan bir mutasyona ugratilmis formdur. Bir uygulamada, agir zincir immünoglobülin sabit bölge alani, pozisyon 241'de (Kabat numaralandirmasi) bir Ser'den Pro'ya mutasyona içeren bir insan IgG4 sabit alanidir.

Bir uygulamada, immünoglobülin hafif zincir sabit bölge alani, bir K veya A insan immünoglobülin hafif zincirinin sabit bölgesinden olusan gruptan seçilir. Tercihen, immünoglobülin hafif zincir sabit bölge alani, bir K insan immünoglobülin hafif zincirinin sabit bölgesidir.

DETAYLI AÇIKLAMA Bulusu detayli bir sekilde izah etmeden önce, bunun anlasilmasina yardimci olmak için asagidaki terimleri tanimlamak yardimci olabilir: Burada kullanildigi sekliyle, "antikorlar" terimi, poliklonal antikorlar, afinite ile saflastirilmis poliklonal antikorlari, monoklonal antikorlari ve antijen-baglama fragmanlarini, örnegin, F(ab')2'yi, Fab proteolitik fragmanlarini ve tek Zincirli degisken bölge fragmanlarini (scFv'leri), içerir. Genetik olarak mühendislik uygulanmis aynen antikorlar veya fragmanlar, örnegin, kimerik antikorlar, Fv fragmanlari, tek zincirli antikorlar ve benzerleri ayni zamanda sentetik antijen-baglama peptitleri ve polipeptitleri de dâhil edilir. Insan-olmayan antikorlar, insan-olmayan CDR'leri insan çerçeve ve sabit bölgelerine greft etme ile veya bütün insan-olmayan degisken alanlari katma (opsiyonel olarak, bunlari açikta kalan rezidülerin degistirilmesi ile bir insan- benzeri düzey ile "gizleme", burada sonuç bir "kaplanmis" antikordur) ile beserilestirilebilir. Bazi durumlarda, beserilestirilmis antikorlar uygun baglama karakteristiklerini arttirmak için insan degisen bölge çerçeve alanlari içinde insan- olmayan rezidüleri muhafaza edebilir. Antikorlari beserilestirme ile, biyolojik yari-ömür arttirilabilir ve insanlara uygulama üzerine advers immün reaksiyonlar için potansiyel azaltilir. olarak genetik mühendisligi ile, farkli türlere ait olan immünoglobülin degisken ve sabit bölge genlerinden yapildigi antikorlari ifade eder. Örnegin, bir fare monoklonal antikorundan elde edilen genlerin degisken segmentleri, insan sabit segmentlerine, örnegin, gama 1'e ve gama 3'e, baglanabilir. Böylelikle, bir tipik terapötik kimerik antikor, diger memeli türlerinin kullanilabilmesine ragmen, bir fare antikorundan elde edilen degisken veya antijen-baglama alanindan ve bir insan antikorundan elde edilen sabit alandan olusan bir hibrit proteindir.

Burada kullanildigi sekliyle, i'immünoglobülin" terimi, agirlikli olarak immünoglobülin genleri tarafindan sifrelenen bir veya birden fazla polipeptitten olusan bir proteini ifade eder. Immünoglobülinin bir formu, bir antikorun temel yapisal birimini olusturur. Bu form, bir tetramerdir ve her bir çiftin bir hafif ve bir agir zincire sahip oldugu iki özdes immünoglobülin zincir çiftinden olusur. Her bir çiftte, hafif ve agir zincir degisken bölgeleri hep birlikte, bir antijeni baglamadan sorumludur ve sabit bölgeler antikor efektör fonksiyonlarindan sorumludur.

Tam-boy immünoglobülin "hafif zincirleri" (yaklasik 25 kD veya 214 amino asit), NH2- ucunda bir degisken bölge geni (yaklasik 110 amino asitlik) ve COOH-ucunda bir kappa veya Iamda sabit bölge geni tarafindan sifrelenir. Tam-boy immünoglobülin "agir zincirleri" (yaklasik 50 kD veya 446 amino asit) benzer bir sekilde, bir degisken bölge geni (yaklasik 116 amino asitlik) veya yukarida bahsedilen diger sabit bölge genlerinin herhangi biri (yaklasik 330 amino asitlik) tarafindan sifrelenir. Agir zincirler gama, mü, alfa, delta veya epsilon olarak siniflandirilir ve antikorun izotipini sirasiyla IgG, IgM, ayrica yaklasik 10 veya daha fazla amino asitlik bir "D" bölgesi de içeren agir zincir ile, yaklasik 12 veya daha fazla amino asitlik bir "J" bölgesi ile baglanir (Bakiniz, genel olarak, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989), Bir immünoglobülin hafif veya agir zincir degisken bölgesi, üç hiper-degisken bölge ile kesintiye ugratilmis bir "çerçeve" bölgesinden olusur. Böylelikle, "hiper-degisken bölge" terimi, antijen baglamadan sorumlu olan bir antikorun amino asit rezidülerini ifade eder.

Hiper-degisken bölge, bir "Tamamlayicilik Belirleme Bölgesi'nden" veya "CDR'den" amino asit rezidüleri (yani, hafif zincir degisken alani içindeki ve rezidülerini (Kabat et al., Sequences of Proteins of lmmunological Interest, 5th Ed.

Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) ve/veya bir içerir. "Çerçeve Bölgesi" veya "FR" rezidüleri, burada tanimlandigi üzere hiper- degisken bölge rezidüleri disindaki degisken alan rezidüleridir. Farkli hafif veya agir zincirlerin çerçeve bölgelerinin dizileri, bir tür içinde görece korunur. Böylelikle, bir bölgesine büyük ölçüde (yaklasik %85 veya daha fazla, genel olarak %90-95 veya daha fazla) özdes olan bir çerçeve bölgesidir. Bir antikorun, hafif ve agir zincir bilesenlerinin birlestirilmis çerçeve bölgeleri olan çerçeve bölgesi CDR'Ieri konumlandirma ve hizalama görevi görür. CDR'Ier primer olarak, bir antijenin bir epitopunu baglamadan sorumludur.

Bu dogrultuda, "beserilestirilmis“ immünoglobülin terimi, bir insan çerçeve bölgesi ve bir insan-olmayan (genel olarak bir fare veya siçan) immünoglobülininden bir veya birden fazla CDR içeren bir immünoglobülini ifade eder. CDR'Ier saglayan insan-olmayan immünoglobülin, i'donör" olarak adlandirilir ve çerçeve saglayan insan immünoglobülini bulunduklarinda, bunlarin insan immünoglobülin sabit bölgelerine büyük ölçüde özdes, yani, en az yaklasik %85-90, tercihen yaklasik %95 veya daha fazla özdes, olmasi gerekir. Bundan dolayi, bir beserilestirilmis immünoglobülinin, büyük olasilikla CDR'ler disindaki, tüm parçalari dogal insan immünoglobülin dizilerinin karsilik gelen parçalarina büyük ölçüde özdestir. Bir "beserilestirilmis antikor", bir beserilestirilmis hafif zincir ve bir beserilestirilmis agir zincir immünoglobülini içeren bir antikordur. Örnegin, bir beserilestirilmis antikor, örn., bir kimerik antikorun tüm degisken bölgesinin insan-olmamasindan dolayi, yukarida tanimlandigi sekilde bir tipik kimerik antikoru kapsa mayaca ktir. gösterdigi antikorlar anlamina gelir. Antikorlarin üretilmesinde rekombinant DNA tekniklerinin ilgililiginden dolayi, bir kisinin dogal antikorlarda bulunan amino asitlerin dizisi ile sinirlandirilmasi gerekmez; antikorlar arzu edilen karakteristikleri elde etmek için yeniden-tasarlanabilir. Olasi varyasyonlar çok sayidadir ve örnegin, degisken veya sabit bölgenin yalnizca bir veya bir kaç amino asidinin degistirilmesi ila tamamen yeniden-tasarlanmasi araligindadir. Genel olarak, sabit bölgedeki degisimler, karakteristikleri, örnegin, kompleman fiksasyonunu, membranlar ile etkilesimi ve diger efektör fonksiyonlari, iyilestirmek veya degistirmek için yapilacaktir. Degisken bölgedeki degisimler, antijen baglama karakteristiklerini iyilestirmek için yapilacaktir.

Antikorlara ek olarak, immünoglobülinler, örnegin, tek-Zincirli veya Fv, Fab ve (Fab')2 ayni zamanda, diyabodileri, lineer antikorlari, çok-degerlikli veya multi-spesifik hibrit antikorlari (yukarida ve asagidakilerde detayli bir sekilde tarif edilir: Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)) içeren çesitli diger formlarda ve tek zincirliler al., "Immunology", Benjamin, N.Y., 2nd ed. (1984) ve Hunkapiller ve Hood, Nature, Burada kullanildigi sekliyle, "tek-Zincirli Fv", "tek-Zincirli antikorlar", “FV" veya “scFv", hem agir hem de hafif zincirlerden elde edilen degisken bölgeler içeren, ancak sabit bölgelerden yoksun olan, ancak bir tek polipeptit zinciri içinde olan, antikor fragmanlarini ifade eder. Genel olarak, bir tek-Zincirli antikor ilaveten, VH ve VL alanlari arasinda, bunun antijen baglamasina olanak saglayacak olan arzu edilen yapiyi olusturmasina olanak saglayan bir polipeptit baglayici içerir. Tek Zincirli antikorlar, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. detayli bir sekilde tartisilir; bakiniz, ayrica, WO 88/01649 Numarali Uluslararasi Patent uygulamalarda, tek-Zincirli antikorlar ayrica bi-spesifik ve/veya beserilestirilmis de olabilir.

Bir "Fab fragmani", bir hafif zincirden ve bir agir zincirin CH1 ve degisken bölgelerinden olusturulur. Bir Fab molekülünün agir zinciri, bir baska agir zincir molekülü ile bir disülfit bag olusturamaz.

Bir "Fab' fragmani", bir hafif zincir ve CH1 ve CH2 alanlari arasinda sabit bölgenin fazlasini içeren bir agir zincir içerir, böylece bir F(ab')2 molekülü olusturmak için iki agir zincir arasinda bir zincir-arasi disülfit bag olusturulabilir.

Bir "F(ab')2 fragmani", iki hafif zincir ve CH1 ve CH2 alanlari arasinda sabit bölgenin bir parçasini içeren iki agir zincir içerir, böylece iki agir zincir arasinda bir zincir-arasi disülfit bag olusturulur.

Polimerlerin kesin olmayan analitik yöntemler (örnegin, jel elektroforezi) ile belirlenmis moleküler agirliklarinin ve uzunluklarinin yaklasik degerler oldugu anlasilacaktir. Bu tarz bir deger, "yaklasik" X veya "yaklasik olarak“ X seklinde ifade edildiginde, X'in ifade edilen degerinin ±%10 için dogru olacagi anlasilacaktir.

Mevcut bulus, istemlerde tanimlandigi üzere, antikorlarin beserilestirilmis fare anti- insan IL-31 degisken bölge dizilerinin kesfine dayanir. lL-31'e antagonistler olarak bu antikorlarin kullanilmasi genel olarak enflamasyonu ve spesifik olarak dermatitin ve pruritik hastaliklarin semptomlarini inhibe edebilir. Bulus, istemlerde tanimlandigi üzere, IL-31 polipeptidini taniyan, baglayan ve/veya nötralize eden antikorlarin beserilestirilmis hafif zincir ve agir zincir bölgelerinin kullanilmasini saglar. Bu tarz beserilestirilmis hafif ve agir zincir bölgeleri bir immünoglobülin sabit bölgesine, örnegin, mesela, IgG4'e veya lgG1'e, kaynastirilabilir ve çesitli konak hücrelerde eksprese edilebilir. Burada tarif edilen beserilestirilmis anti-lL-31 degisken bölge Basvurusu Yayini'nda ( önceden tarif edilen monoklonal antikorlarin fare anti-insan IL-31 hafif zincir ve agir zincir degisken bölgelerinin amino asit dizileri kullanilarak üretilmistir.

Antikorlar, bir hafif zincir degisken bölgesi ve bir agir zincir degisken bölgesi içeren veya bunlardan olusan antikorlar veya antikor fragmanlari içerebilir ve IL-31'in bunun reseptörü üzerindeki etkilerini nötralize eden, inhibe eden, azaltan, önleyen veya minimuma indiren kimerik, beserilestirilmis veya antikor fragmanlari olabilir. Antikorun veya antikor fragmanlarinin klinik sonuçlari, burada ilaveten tarif edildigi üzere, enflamatuvar ve otoimmün hastaliklarda, örnegin, dermatitte, özellikle atopik dermatitte ve pruritik hastaliklarda ve Crohn hastaliginda, bir düsüs olabilir. Bir uygulamada, dermatit atopik dermatittir. Bir baska uygulamada, dermatit, prurigo nodülaristir. Bir baska uygulamada, dermatit, egzamadir. Düsüs ayrica, kasintida, kasimada veya kil dökülmesinde bir düsüs de olabilir. lL-31, farelerde asiri-eksprese edildiginde, dermatit-benzeri semptomlara neden olan yeni kesfedilmis bir T hücresi sitokinidir. Bakiniz, Dillon et al., Nature Immunol. 52752- Basvurusu'nda (, simdi 7,064,186 Seri Numarali ABD Patenti'nde (Sprecher, Cindy et al., 2003), cht017rlig olarak önceden tarif edilmis bir sitokin için HUGO adidir. Bakiniz, ayrica, Dillon et al., Nature analizi, fare IL-31'inin ekspresyonunun testiste, beyinde, CD90+ hücrelerinde, prostat hücrelerinde, tükürük bezinde ve ciltte bulundugunu ortaya çikarmistir. lL-31 için heterodimerik reseptör, OncostatinM reseptörü beta (OSMRbeta) ile bir ABD Patent Yayini'nda tarif edilmistir. IL-31, CD3 için seçilmis aktive edilmis insan periferik kari hücrelerinden (hPBC'Ierinden) üretilen bir cDNA kütüphanesinden izole edilmistir. CD3, lenfoid orijinli hücreler, özellikle T hücreleri için essiz olan bir hücre yüzeyi belirtecidir.

Burada "IL-31 antijen baglama molekülleri" veya "IL-31 antagonistleri" olarak adlandirilan, bir beserilestirilmis fare anti-insan hafif zincir degisken alani ve/veya bir beserilestirilmis fare anti-insan agir zincir degisken alani içeren moleküller tarafindan inhibisyon, nötralizasyon veya sinyal iletimini bloke etme, teknikte uzmanligi olan bir kisi tarafindan bilinen çok sayida analiz ile ölçülebilir. Örnegin, proliferasyonda bir düsüsü ölçen analizler, bir boyanin, örnegin, AIamarBIueTM (AccuMed International, karboksimetoksifeniI-2H-tetrazolyum; 2,3-bis(2-metoksi-4-nitro-5-sülfofeniI)-5- (Polysciences, Inc., Warrington, PA, firmasi tarafindan piyasada satilir), düsüsü için analizleri; mitojenez analizlerini, örnegin, 3H-timidin katilmasinin ölçülmesini; örnegin, naftalen siyahi veya tripan mavisi, kullanilan boya dislama analizlerini; diasetil floresin kullanilan boya alimini ve krominyum salimini içerir. Bakiniz, genel olarak, Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3rd ed., Wiley-Liss, 1994.

Yukaridakine ek olarak, bakiniz, IL-31 RA ve tam-boy OSMRbeta eksprese eden BaF3 (Sprecher, Cindy et al., 2003) veya burada tarif edilen aktivite örneklerinde gösterildigi Burada tarif edilen antikorlari sifreleyen (DNA'yi ve RNA'yi içeren) polinükleotidleri hazirlamak için yöntemler teknikte iyi bilinir. Toplam RNA, guanidinyum izotiyosiyanat ekstraksiyonu, akabinde bir CsCI gradyaninda sentrifügasyon ile izolasyon kullanilarak RNA'dan hazirlanir. Komplementer DNA (CDNA), bilinen yöntemler kullanilarak poli(A)+ RNA'dan hazirlanir. Alternatif olarak, genomik DNA izole edilebilir. Akabinde, lL-31 antikorlarini sifreleyen polinükleotidler tanimlanir ve örnegin. hibridizasyon veya PCR, ile izole edilir.

Mevcut açiklama ayrica, IL-31 polipeptitlerinin fonksiyonel fragmanlarini ve bu tarz fonksiyonel fragmanlari sifreleyen nükleik asit moleküllerini baglayan beserilestirilmis lL-31 antijen baglama moleküllerini veya IL-31 antagonistlerini de içerir. Burada tanimlandigi üzere bir "fonksiyonel" IL-31 veya bunun fragmani bunun proliferatif veya farklilasma aktivitesi ile, bunun özellesmis hücre fonksiyonlarini indükleme veya inhibe etme yetisi ile veya bunun (çözünebilen veya immobilize edilmis) bu reseptörlerin bir anti-IL-31 antikorunu veya lL-31RA/OSMRbeta heterodimerlerini spesifik olarak baglama yetisi ile karakterize edilir. Böylelikle, mevcut açiklama ilaveten, bir veya birden fazla lL-31 fonksiyonel fragmani içeren bir polipeptit molekülünü baglayan beserilestirilmis lL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri saglar.

Mevcut açiklama ayrica, bir lL-31 polipeptidinin bir epitop-tasiyan kismini veya bir immünojenik epitop veya antijenik epitop içeren polipeptit fragmanlarini veya peptitleri baglayan beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri de saglar. Antikorlarin bu epitoplari baglamasi, lL-31'in bunun soydas reseptörü üzerindeki sinyal iletiminde inhibisyon, bloke etme, nötralizasyon ve/veya düsüs ile sonuçlanir.

Fare anti-insan lL-31 monoklonal antikorlari, birlikte-bekleyen 8 Mayis 2006'da Numarali ABD Patenti Yayini'nda) önceden tarif edilmistir. Fare anti-insan IL-31 antikorlarinin degisken bölgelerinin amino asit dizileri, birlikte-bekleyen 4 Eylül 2007'de dosyalanmis 11/850,006 Seri Numarali ABD Patent Basvurusu'nda ve birlikte- edilmistir. Bu amino asit dizileri, burada tarif edilen beserilestirilmis diziler için baslangiç malzemesi olarak kullanilmistir. Spesifik olarak, fare anti-insan IL-31 antikor dizisi, 292.12.3.1 klon numarali bir hibridomdan elde edilmistir.

Burada tarif edildigi üzere antikorlarin aktivitesi, IL-31 RA reseptörünü eksprese eden hücrelerin proliferasyonunu ve/veya bu hücreleri baglamayi ölçen çesitli analizler kullanilarak bunlarin proliferasyonu inhibe etme veya azaltma yetisi ile ölçülebilir. IL-31- bagimli hücrelerdeki degisimler özel olarak söz konusudur. IL-31-bagimli olmasi için mühendislik uygulanmasina uygun olan hücre hatlari, lL-3-bagimli BaF3 hücre hattini ve MO7e'yi (Kiss yayimlanmis yöntemlere göre olusturulabilir (örnegin, Greenberger et al., Leukemia anti-IL-31 antikorlarinin veya antagonistlerinin aktivitesi ayrica, burada tarif edilen BaF3 proliferasyon analizinde, Biacore analizinde veya NHK analizlerinde de ölçülebilir.

Bir uygulamada, immünoglobülin agir zincir sabit bölge alani, bir 0, v, p, 6 veya 8 insan immünoglobülin agir zincirinin sabit bölgesinden olusan gruptan seçilir. Söz konusu sabit bölge, bir y1, y2, v3 veya y4 insan immünoglobülin agir zincirinin sabit bölgesi olabilir.

Bir baska uygulamada, immünoglobülin hafif zincir sabit bölge alani, bir K veya A insan immünoglobülin hafif zincirinin sabit bölgesinden olusan gruptan seçilir.

Bir baska uygulamada, agir sabit zincir, çözelti içinde kararli olan ve çok az kompleman aktive etme aktivitesine sahip olan veya hiç kompleman aktive etme aktivitesine sahip olmayan insan y4'tür. Bir baska uygulamada, agir sabit zincir, insan yi'dir. immünoglobülin, IgA, lgD, IgE, lgG ve IgM'yi içeren majör immünoglobülin siniflarinin herhangi biri veya herhangi bir alt-sinif veya izotip, örn., lgG1, lgG2, IgGS ve lgG4; lgA- 1 ve IgA-2, arasindan seçilebilir. analizlere ek olarak, örnekler reseptör baglamasini. lL-31-bagimli hücresel yanitlarin stimülasyonunu/inhibisyonunu veya lL-31RA reseptörü-eksprese eden hücrelerin proliferasyonunu ölçmek için tasarlanan çesitli analizlerde IL-31 aktivitesinin inhibisyonu için test edilebilir. lL-31 antijen baglama moleküllerini veya IL-31 antagonistlerini içeren bir IL-31-baglama polipeptidi ayrica, Iigandin saflastirilmasi için de kullanilabilir. Polipeptit, bir kati destek, örnegin, agaroz bilyeleri, çapraz-bagli agaroz, cam, selülozik reçineler, silika-bazli reçineler, polistiren, çapraz-bagli poliakrilamid veya kullanim kosullari altinda kararli olan benzer malzemeler üzerinde immobilize edilir. Polipeptitleri kati desteklere baglamak için yöntemler teknikte bilinir, amin kimyasini, siyanojen bromür aktivasyonunu, N-hidroksisüksinimid aktivasyonunu, epoksit aktivasyonunu, sülfidril aktivasyonunu ve hidrazit aktivasyonunu içerir. Elde edilen vasat genel olarak, bir kolon formunda konfigüre edilecektir ve ligand içeren sivilar ligandin reseptör polipeptidini baglamasina olanak saglamak için bir veya birden fazla kere kolondan geçirilir.

Akabinde, ligand, ligand-reseptör baglamasini bozmak için tuz konsantrasyonunda, kaotropik ajanlarda (guanidin HCl'de) veya pH'ta degisimler kullanilarak ayristirilir.

Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama moleküllerinin veya IL-31 antagonistlerinin asagidaki sekilde oldugunda spesifik olarak bagladigi düsünülür: 1) bunlar bir baglama aktivitesi esik-degeri düzeyi gösterdiginde ve 2) bunlar ilgili polipeptit molekülleri ile anlamli bir sekilde çapraz-reaksiyona girmediginde. Baglamanin bir esik-degeri düzeyi, buradaki IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri bir IL-31 polipeptidini, peptidini veya epitopunu, kontrol (IL-31-olmayan) polipeptidini baglama afinitesine kiyasla en az 10-kat daha büyük olan bir afinite ile bagladiginda belirlenir.

Antikorlarin 108 M'1 veya daha büyük, tercihen, 107 M'1 veya daha büyük, daha tercihen 108 M'1 veya daha büyük veya en tercihen 109 M'1 veya daha büyük olan bir baglama afinitesi (Ka) göstermesi tercih edilir. Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama moleküllerinin veya IL-31 antagonistlerinin baglama afinitesi, teknikte normal uzmanligi olan kisiler tarafindan, örnegin, Scatchard analizi (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. molekülleri ile anlamli bir sekilde çapraz-reaksiyona girip girmedigi, örnegin, bir standart Western bot analizi kullanilarak IL-31 polipeptidini saptayan ancak bilinen ilgili polipeptitleri saptamayan lL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri ile gösterilir (Ausubel et al., adi geçen eser). Tarama ayrica, insan-olmayan IL-31 ve IL-31 mutant polipeptitleri kullanilarak da yapilabilir. Dahasi, IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri, IL-31 polipeptitlerini spesifik olarak baglayan bir popülasyonu izole etmek için bilinen ilgili polipeptitlere "karsi taranabilir". Örnegin, IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri çözünmeyen matrikse yapisik ilgili polipeptitlere adsorbe edilir; IL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31'e spesifik Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan et al., (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995.

Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri, saflastirilmis rekombinant proteinleri insan IL-31 varliginda büyütüldügünde, bunlarin reseptör baglamasini bloke etme, inhibe etme, önleme veya azaltma yetisi için karakterize edilir. Örnegin, beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL- 31 antagonistleri, gruplamayi (yani, her bir antikor herhangi bir baska baglamanin baglamasini inhibe edebildiginde belirlemeyi), bagil afiniteyi ve nötralizasyonu içeren çesitli sekillerde karakterize edilebilir.

Bulusun beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri, Tablo 1'de, asagida ve Sekil 1'de gösterilir. 26-36 klonlari) için: "fback" terimi, LC(back) + HC(fback) anlamina gelir; "LC(back)" terimi, LC(G66R, G68E, DTOQ, F71Y, T72S) anlamina gelir ve “HC(back)" terimi, F29L, l69L, S70T, R94F) anlamina gelir.

Tablo 1: Beserilestirilmis 2921231 yapilari Klon Mutasyon Açiklamasi Agir Hafi Numarasi Zincir Zincir 7 12VH1-gly+fback 25 26 8 12VH5-gly+fback 27 26 9 12VH1-gly+HC(fback) 25 28 12VH1-gly+LC(fback) 29 26 1 1 12VH5-gly+HC(fback) 27 28 V78A)+LC(fback) R94F)+LC(fback) T728) R94F)+LC(fback) T72S) Klon Mutasyon Açiklamasi Agir Hafi Numarasi Zincir Zincir 31 12VH1- 42 37 32 12VH1- 43 37 36 12VH1(germ)- 45 37 gly+HC(F29L,T73K,R94F)+LC(F71Y) Burada açiklanan antikorlar, teknikte basli basina bilinen herhangi bir teknik ile, örnegin, rekombinant teknolojiler, kimyasal sentez, klonlama, Iigasyonlar veya bunlarin kombinasyonlari ile, üretilebilir. Bir uygulamada, mevcut bulusun antikorlari, rekombinant teknolojiler ile, örn., uygun bir konak hücre içinde bir karsilik gelen nükleik asidin ekspresyonu ile, üretilir. Üretilen polipeptit, glikosile edilebilir veya edilmeyebilir veya kullanilan konak hücre tipine bagli olarak baska post-translasyonel modifikasyonlar içerebilir. Çok sayida kitap ve derleme, örnegin, Oxford University Press tarafindan yayinlanan “A Practical Approach" ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001) serisindeki bazi basliklar, vektörler ve prokaryotik veya ökaryotik konak hücreler kullanilarak rekombinant proteinlerin nasil klonlandigi ve üretildigi konusunda ögretiler saglar.

Bundan dolayi, mevcut açiklamanin ilave bir amaci, burada yukarida veya asagida tarif edilen antikorlarin herhangi birini sifreleyen bir izole edilmis nükleik asit molekülüdür veya bunun bir komplementer sarmalidir veya dejenere dizisidir. Bu baglamda, "nükleik asit molekülü" terimi, sinirlandirma olmaksizin, deoksiribonükleik asitleri (örnegin, DNA, cDNA, gDNA, sentetik DNA, vb.), ribonükleik asitleri (örnegin, RNA, mRNA, vb.) ve peptit nükleik asitleri (PNA) içeren tüm farkli nükleik asit tiplerini kapsar. Tercih edilen bir uygulamada, nükleik asit molekülü, bir DNA molekülüdür, örnegin, bir çift-sarmalli DNA molekülüdür veya bir cDNA molekülüdür. "Izole edilmis" terimi, tanimlanmis ve bunun dogal kaynakta bununla normal olarak iliskili oldugu en az bir kontaminant nükleik asit molekülünden ayrilmis nükleik asit molekülleri anlamina gelir. Bir izole edilmis nükleik asit molekülü, bunun dogada bulundugu formdan veya kosuldan baskadir. Bundan dolayi, izole edilmis nükleik asit molekülleri, bunun dogal hücrelerde bulundugu spesifik nükleik asit molekülünden ayirt edilir. Bir dejenere dizi, bir referans nükleotid dizisi ile ayni amino asit dizisini sifreleyen, ancak genetik kod dejenerasyonunun bir sonucu olarak farkli bir nükleotid dizisi içeren herhangi bir nükleotid dizisini gösterir.

Bu açiklamanin ilave bir amaci, asagida veya yukarida tarif edilen antikorlarin herhangi birini sifreleyen DNA içeren bir vektördür. Vektör, integratif veya otonom olarak çogalan, herhangi bir prokaryotik veya ökaryotik hücre içinde fonksiyonel olan herhangi bir klonlama veya ekspresyon vektörü olabilir. özel olarak, vektör bir plazmid, kozmid, virüs, faj, epizom, yapay kromozom ve benzeri olabilir. Vektör, hem agir hem hafif zincir için kodlama dizilerini veya hafif ve agir zincir kodlama dizilerinin birini içerebilir.

Vektörün hem agir hem de hafif zincirler için kodlama dizileri içermesi gerektiginde, agir ve hafif zincirlerin her biri bir promotöre operatif olarak bagli olabilir. Promotör, agir ve hafif zincir için ayni veya farkli olabilir. Agir ve hafif zincir ayrica, bir tek promotöre operatif olarak bagli da olabilir, bu durumda, agir ve hafif zincirler için kodlama dizileri tercihen, bir iç ribozomal giris yeri (IRES) ile ayrilabilir. Ökaryotik gen ekspresyonu için uygun promotörler, teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi bilinen, örnegin, viral genlerden, örnegin, mürin veya insan sitomegalovirüsünden (CMV), türetilen promotörlerdir veya rous sarkom virüsü (RSV) promotörüdür. Vektör, regülatör elemanlar, örnegin, bir promotör, sonlandirici, hizlandirici, seleksiyon belirteci, replikasyon orijini, vb., içerebilir. Bu tarz vektörlerin spesifik örnekleri, asagida tartisilacagi üzere, prokaryotik plazmidleri, örnegin, pBR, pUC veya pcDNA plazmidlerini; retroviral, adenoviral veya AAV vektörlerini içeren viral vektörleri; bakulovirüsleri; BAC'i veya YAC'i, vb., içerir. Uygun nükleik asit dizisi, çesitli prosedürler ile vektör içine yerlestirilebilir. Genel olarak, DNA teknikte bilinen teknikler kullanilarak uygun bir restriksiyon endonükleaz yeri (yerleri) içine yerlestirilir. Bu bilesenlerin birini veya birden fazlasini içeren uygun vektörlerin yapilmasi, uzman kisi tarafindan bilinen standart Iigasyon tekniklerini kullanir.

Mevcut açiklamanin ilave bir yönü, bir rekombinant konak hücredir, burada söz konusu hücre, yukarida tanimlandigi üzere bir nükleik asit molekülü veya bir vektör içerir.

Konak hücre bir prokaryotik veya ökaryotik hücre olabilir. Prokaryotik hücrelerin örnekleri, bakterileri, örnegin, E. co/fyi, içerir. Ökaryotik hücrelerin örnekleri, herhangi bir primer hücre kültürünü veya yerlesik hücre hattini (örnegin, 3T3, Véro, HEK293, TN5, vb.) içeren maya hücreleridir, bitki hücreleridir, memeli hücreleridir ve böcek hücreleridir. Glikosile edilmis proteinlerin ekspresyonu için uygun konak hücreler, çok- hücreli organizmalardan türetilir. Omurgasiz hücrelerin örnekleri, böcek hücrelerini, örnegin, Drosophila SZ'yi ve Spodoptera Sf9'u, ayni zamanda bitki hücrelerini içerir.

Yararli memeli konak hücre hatlarinin örnekleri, Çin hamsteri over (CHO) ve COS hücrelerini içerir. Daha spesifik örnekler, SV40 ile transforme edilmis maymun böbregi CV1 hattini (CCS-7, ATCC CRL 1651); insan embriyonik böbrek hattini (293 hücrelerini veya süspansiyon kültürü içinde büyüme için alt-klonlanmis 293 hücrelerini, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); Çin hamsteri over hücrelerini/-DHFR (CHO, ATCC CCL 75); insan karaciger hücrelerini (Hep 82, HB 8065) ve fare mamari tümörünü (MMT , içerir. Mevcut açiklamanin özel olarak tercih edilen memeli hücreleri, CHO hücreleridir. Bulusun antikorlarinin ekspresyonu Için uygun özel olarak tercih edilen memeli hücreleri, mürin hücrelerdir, örnegin, fare miyelom (NSO) hücreleridir.

Burada yukarida açiklandigi üzere, mevcut bulusun antikorlari, teknikte basli basina bilinen herhangi bir teknik ile, örnegin, rekombinant teknolojiler, kimyasal sentez, klonlama, Iigasyonlar veya bunlarin kombinasyonlari ile, üretilebilir. Özel bir uygulamada, çözünebilen reseptörler, rekombinant teknolojiler ile, örn., uygun bir konak hücre içinde bir karsilik gelen nükleik asidin ekspresyonu ile, üretilir. Bundan dolayi, bu açiklamanin bir baska amaci, mevcut bulusun bir antikorunu üretmenin bir yöntemidir, yöntem açiklamanin bir rekombinant konak hücresini nükleik asit molekülünün ekspresyonuna olanak saglayan kosullar altinda kültürlemeyi ve üretilen polipeptidi geri-kazanmayi içerir. Mevcut açiklamanin üretme yöntemi ilaveten, polipeptidi bir farmasötik bilesim içinde formüle etme adimini içerebilir. Üretilen polipeptit, glikosile edilebilir veya edilmeyebilir veya kullanilan konak hücre tipine bagli olarak baska post-translasyonel modifikasyonlar içerebilir. Çok sayida kitap ve derleme, örnegin, Oxford University Press tarafindan yayinlanan "A Practical Approach" ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian serisindeki bazi basliklar, vektörler ve prokaryotik veya ökaryotik konak hücreler kullanilarak rekombinant proteinlerin nasil klonlandigi ve üretildigi konusunda ögretiler Mevcut bulusa göre bir antikor üretmenin yönteminde kullanilacak olan vektörler, uygun herhangi bir araç (transformasyon, transfeksiyon, konjugasyon, protoplast füzyonu, elektroporasyon, kalsiyum fosfat-çökeltmesi, dogrudan mikro-enjeksiyon, vb.) ile uygun konak hücreler içine uygulanabilen epizomal veya homolog olmayan/homolog olan bir sekilde entegre etme vektörleri olabilir. Özel bir plazmid, viral veya retroviral vektör seçmede önemli faktörler asagidakileri içerir: vektör içeren alici hücrenin bununla taninabilmesi ve vektör içermeyen alici hücrelerden seçilebilmesi kolayligi; özel bir konak hücrede arzu edilen vektör kopyalari sayisi ve vektörün farkli türlerin konak hücreleri arasinda "gidip gelebilmesinin" arzu edilip edilmemesi. Vektörler, söz konusu hücre içinde konstitütif olarak aktif veya indüklenebilir olmasi için seçilen uygun transkripsiyonel baslatma / sonlandirma regülatör dizileri kontrolü altinda, prokaryotik veya ökaryotik konak hücrelerde açiklamanin polipeptidinin veya füzyon proteinlerinin ekspresyonuna olanak saglamalidir. Akabinde, bu tarz hücreler içinde kayda deger ölçüde zenginlestirilmis bir hücre hatti, kararli bir hücre hatti saglamak için izole edilebilir.

Konak hücreler, protein üretimi için burada tarif edilen ekspresyon veya klonlama vektörleri ile transfekte edilir veya transforme edilir ve promotörleri indüklemek, transformantlari seçmek veya arzu edilen dizileri sifreleyen genleri çogaltmak için uygun sekilde sekilde modifiye edilmis geleneksel besin vasatlari içinde kültürlenir.

Kültür kosullari, örnegin, vasat, sicaklik, pH ve benzerleri, gereksiz deneyler yapilmadan uzmanligi olan kisi tarafindan seçilebilir. Genel olarak, hücre kültürlerinin üretkenligini maksimuma çikarmak için prensipler, protokoller ve pratik teknikler, Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) ve Sambrook et al., supra, kaynaklarinda bulunabilir. Ökaryotik konak hücreler (örnegin, maya, böcek veya memeli hücreleri) için, konagin dogasina bagli olarak, farkli transkripsiyonel ve translasyonel regülatör dizileri kullanilabilir. Bunlar, viral kaynaklardan, örnegin, adenovirüsten, papilloma virüsünden, Simian virüsünden veya benzerlerinden, türetilebilir, burada regülatör sinyaller yüksek bir ekspresyon düzeyine sahip olan özel bir gen ile iliskilidir. Örnekler, Herpes virüsünün TK promotörüdür, SV40 erken promotörüdür, maya gal4 gen promotörüdür, vb.'dir. Baskilamaya ve aktivasyona olanak saglayan transkripsiyonel baslatma regülatör dizileri seçilebilir, böylece genlerin ekspresyonu modüle edilebilir. Uygulanan DNA ile kararli bir sekilde transforme edilmis hücreler ayrica, ekspresyon vektörünü içeren konak hücrelerin seleksiyonuna olanak saglayan bir veya birden fazla belirteci uygulama ile de seçilebilir. Belirteç ayrica, bir oksotrofik konaga fototrofi, biyosit direnci, örn., antibiyotikler veya agir metaller, örnegin, bakir ve benzerleri, de saglayabilir.

Seçilebilir belirteç geni eksprese edilecek olan DNA dizilerine dogrudan bagli (örnegin, ayni vektör üzerinde) olabilir veya birlikte-transfeksiyon ile ayni hücre içine uygulanabilir. Ilave elemanlara ayrica, proteinlerin optimal sentezi için de ihtiyaç duyulabilir.

Uygun prokaryotik hücreler, bir rekombinant bakteriyofaj, plazmid veya kozmid DNA ekspresyon vektörü ile transforme edilmis bakterileri (örnegin, Bacillus subtilis veya E. coli) içerir. Bu tarz hücreler tipik olarak, bir N-ucu Metiyonin rezidüsü içeren proteinler üretir. Mevcut açiklamada kullanilmasi için tercih edilen hücreler, bunlar protein moleküllerine dogru katlanmayi veya dogru yerlerde glikosilasyonu Içeren post- translasyonel modifikasyon sagladigindan, ökaryotik konak hücrelerdir, örn., memeli hücreleridir, örnegin, insan, maymun, fare ve Çin Hamsteri Over (CHO) hücreleridir.

Uygun memeli konak hücrelerinin örnekleri, Afrika yesil maymunu böbrek hücrelerini (Vero; ATCC CRL 1587), insan embriyonik böbrek hücrelerini (293-HEK; ATCC CRL CRL , Çin hamsteri over hücrelerini (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec.

Genet. , HeLa 83 hücrelerini (ATCC CCL, SV40-transforme edilmis maymun böbrek hücrelerini (CCS-1; ATCC CRL 1650), Bowes melanom ve insan hepatoselüler karsinom hücrelerini (örnegin, Hep G2), mürin embriyonik hücrelerini (NIH- ve çok sayida baska hücre hattini içerir. Alternatif ökaryotik konak hücreler, maya ekspresyon vektörleri ile transforme edilmis maya hücreleridir (örnegin, Saccharomyces, Kluyveromyces, vb.). Maya hücreleri de, glikosilasyonu içeren post-translasyonel peptit modifikasyonlari gerçeklestirebilir. Mayalarda arzu edilen proteinlerin üretilmesi için yararlanilabilen güçlü promotör dizilerinden ve yüksek plazmid kopya sayisindan yararlanan çok sayida rekombinant DNA stratejisi vardir. Maya hücreleri, klonlanmis memeli gen ürünlerinde ön-bilgi dizilerini tanir ve ön-bilgi dizileri tasiyan polipeptitler (yani, pre-peptitler) salgilar.

Bir rekombinant polipeptidin uzun-süreli, yüksek-verimli üretimi için, kararli ekspresyon tercih edilir. Örnegin, söz konusu polipeptidi kararli bir sekilde eksprese eden hücre hatlari, ayni veya farkli bir vektör üzerinde viral replikasyon orijini ve/veya endojen ekspresyon elemanlari ve seçilebilir bir belirteç geni içerebilen ekspresyon vektörleri kullanilarak transforme edilebilir. Vektörün uygulanmasini takiben, bunlar selektif vasatlara degistirilmeden önce hücrelerin bir zenginlestirilmis vasat içinde 1-2 gün boyunca büyümesine izin verilebilir. Seçilebilir belirtecin amaci, seleksiyona direnç saglamaktir ve bunun varligi uygulanan dizileri basarili bir sekilde eksprese eden hücrelerin büyümesine ve geri-kazanilmasina olanak saglar. Kararli bir sekilde transforme edilmis hücrelerin dirençli klonlari, hücre tipine uygun doku kültürü teknikleri kullanilarak çogaltilabilir. Akabinde, bu tarz hücreler içinde kayda deger ölçüde zenginlestirilmis bir hücre hatti, kararli bir hücre hatti saglamak için izole edilebilir.

Bir rekombinant polipeptidin yüksek-verimli üretiminin özel olarak tercih edilen bir yöntemi, US 4,889,803'te tarif edildigi üzere arka arkaya aryan metotreksat düzeylerinin kullanilmasi ile, DHFR-kusurlu CHO hücrelerinde dihidrofolat redüktaz (DHFR) amplifikasyonunun kullanilmasi yoluyladir. Elde edilen polipeptit, bir glikosile edilmis formda olabilir.

Burada açiklanan antikorlar ayrica, diger ökaryotik hücrelerde, örnegin, kus, fungal, böcek, maya veya bitki hücrelerinde, de eksprese edilebilir. Bakulovirüs sistemi, klonlanmis genleri böcek hücreleri içine uygulamak için etkili bir araç saglar.

Bakulovirüs / böcek hücresi ekspresyon sistemleri için malzemeler, inter a/ia, lnvitrogen firmasi tarafindan kit formunda piyasada satilir.

Rekombinant DNA teknolojilerine ek olarak, bu bulusun antikorlari kimyasal sentez teknolojileri ile hazirlanabilir. Kimyasal sentez teknolojilerinin örnekleri, kati faz sentezdir ve sivi faz sentezdir. Bir kati faz sentez olarak, örnegin, sentezlenecek olan polipeptidin karboksi-ucuna karsilik gelen amino asit, organik çözücüler içinde çözünmeyen bir destege baglanir ve reaksiyonlarin alternatif tekrari ile (örnegin, amino asitlerin bunlarin uygun koruyucu gruplar ile korunmus amino gruplari ve yan zincir fonksiyonel gruplari ile sirali kondensasyonu ile), polipeptit zinciri uzatilir. Kati faz sentez yöntemi, kullanilan koruyucu grubun tipine bagli olarak, ekseriyetle tBoc yöntemi ve Fmoc yöntemi olarak siniflandirilir. Total olarak sentetik proteinler literatürde açiklanir (Brown A et al., 1996).

Mevcut bulusun antikorlari, arzu edilen kullanim ve/veya üretim yöntemine göre tercih edilebilen diger alternatif formlarda üretilebilir, formüle edilebilir, uygulanabilir veya jenerik olarak kullanilabilir. Açiklamanin proteinleri, post-translasyonel olarak, örnegin, glikosilasyon ile, modifiye edilebilir. Açiklamanin polipeptitleri veya proteinleri, izole edilmis (veya saflastirilmis) biyolojik olarak aktif formda veya bunlarin öncülleri, türevleri ve/veya tuzlari olarak saglanabilir.

Yararli konjugatlar veya kompleksler ayrica, ilaç aktarim etkinligi açisindan ajanlari iyilestirmek için de üretilebilir. Bu amaç için, burada tarif edilen antikorlar, aktif konjugatlar formunda veya moleküller, ömegin, polietilen glikol ve diger dogal veya sentetik polimerler, ile kompleks hâlinde olabilir (Harris JM ve Chess RB, 2003; Greenwald RB et al., 2003; Pillai O ve Panchagnula R, 2001). Bu baglamda, mevcut açiklama, burada açiklandigi üzere kimyasal olarak modifiye edilmis antikorlari tasarlar, burada antikor bir polimer ile baglidir. Tipik olarak, polimer suda çözünebilir, böylece konjugat bir sulu ortamda, örnegin, bir fizyolojik ortamda, çökmez. Uygun bir polimerin bir örnegi, bir tek reaktif gruba, örnegin, açilasyon için bir aktif estere veya alkilasyon için bir aldehite, sahip olmasi için modifiye edilmis bir polimerdir. Bu sekilde, polimerizasyon derecesi kontrol edilebilir. Bir reaktif aldehitin bir örnegi, polietilen glikoldür, propiyonaldehittir veya bunlarin mono-(Ci-Cio) alkoksi veya ariloksi türevleridir (bakiniz, örnegin, Harris, et al., . Polimer dallanmis veya dallanmamis olabilir. Dahasi, bir polimerler karisimi, konjugatlar üretmek için kullanilabilir. Terapi için kullanilan konjugatlar, farmasötik olarak kabul edilebilir suda çözünebilen polimer kisimlari içerebilir. Suda çözünebilen uygun polimerler, polietilen glikolü (PEG), monometoksi-PEG'i, mono-(Ci-Cm) alkoksi-PEG'i, ariloksi-PEG'i, poli-(N-vinil pirrolidon) PEG'i, tresil monometoksi PEG'i, PEG propiyonaldehiti, bis-süksinimidil karbonat PEG'i, propilen glikol homopolimerleri, bir polipropilenoksit/etilen oksit ko-polimerini, polioksietillenmis poliolleri (örnegin, gliserolü), polivinil alkolü, dekstrani, selülozu veya baska karbonhidrat-bazli polimerleri yaklasik 60.000 araliginda bir moleküler agirliga sahip olabilir. Bir konjugat ayrica, suda çözünebilen bu tarz polimerlerin bir karisimini da içerebilir.

Konjugatlarin örnekleri, burada yukarida açiklanan antikorun herhangi birini ve söz konusu çözünebilen reseptörün N-uouna ekli bir poliallçil oksit kismi içerir. PEG, uygun bir polialkil oksittir. Açiklandigi üzere, burada açiklanan antikorun herhangi biri, PEG ile modifiye edilebilir, "PEGilasyon" olarak bilinen bir proses. PEGilasyon, teknikte bilinen PEGilasyon reaksiyonlarinin herhangi biri ile yürütülebilir (bakiniz, örnegin, EP 0 154 316, Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249 J Hematol 68: 1 (1998)). Örnegin, PEGiIasyon, bir açilasyon reaksiyonu ile veya bir reaktif polietilen glikol molekülü ile alkilasyon reaksiyonu ile gerçeklestirilebilir. Alternatif bir yaklasimda, konjugatlar, aktive edilmis PEG'i kondense etme ile olusturulur, burada PEG'in bir uç hidroksit veya amino grubu bir aktive edilmis baglayici ile degistirilmistir (bakiniz, örnegin, Karasiewicz et al., . Tercihen, tüm bu modifikasyonlar, antikorun insan IL-31'i baglama yetisini anlamli olarak etkilemez.

Burada tarif edilen antikorlar, bir ilave N-ucu amino asit rezidüsü, tercihen bir metiyonin, içerebilir. Aslinda, ekspresyon sistemine ve kosullarina bagli olarak, polipeptitler bir baslangiç Metiyonini ile bir rekombinant konak hücre içinde eksprese edilebilir. Bu ilave amino asit akabinde, elde edilen rekombinant protein içinde idame ettirilebilir veya literatürde açiklanan yöntemlere göre, bir ekzopeptidaz, örnegin, Metiyonin Aminopeptidaz, vasitasiyla yok edilebilir (Van Valkenburgh HA ve Kahn RA, 12:147-59).

Mevcut belgenin örnek kisminda gösterilecegi üzere, fare anti-insan anti-lL-31 antikorlari bunlarin degisken alanlari içinde potansiyel glikosilasyon yerleri içerebilir. Örnegin, 292.12.3.1 klonu, agir zincir degisken alaninin çerçeve bölgesi FR1 içinde bir glikosilasyon yeri tasir. Mevcut bulusun sahipleri simdi, söz konusu glikosilasyon yerinin insan IL-31 için iyi bir baglama afinitesini korumak için gerekli olmadigini bulmustur. Dahasi, bu glikosilasyon yerini (örnegin, mutasyon ile) ortadan kaldirma, antikorun termo-kararliligi üzerinde pozitif bir etkiye sahiptir. Bundan dolayi, mevcut bulusun bir uygulamasinda, burada açiklandigi üzere antikorlar bunlarin degisken alanlari içinde glikosilasyon yerine sahip degildir.

Burada tarif edilen yöntemler ile üretilen lL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri çesitli yöntemler ile nötralizasyon için test edilebilir. Örnegin, Sprecher, Cindy et al., 2003) tarif edildigi üzere Iüsiferaz analizi kullanilabilir. Buna ek olarak, nötralizasyon ligan ve monoklonal antikor varliginda pro-enflamatuvar kemokinlerin, örnegin, keratinosit kültürlerinden TARC'nin ve MDC'nin, üretilmesi bir düsüsü ölçme ile test edilebilir. Nötralizasyon ayrica, burada tarif edilen in vi'vo ve in vitro analizler ile de ölçülebilir.

Burada tarif edilen beserilestirilmis anti-IL-31 antikorlarina ve antagonistlerine yanitta TARC'nin ve MDC'nin düsüsü, asagida oldugu sekilde bir AD fare modelinde ölçülebilir: Yöntem I) Alti-haftalik erkek NC/Nga fareleri (CRL Japan), sirtlarindan haftada üç kere 50 ug toz akar ekstrakti (D. pteronyssinus, Indoor Biotechnologies) ile intradermal olarak duyarlilastirilir ve AD-benzeri Iezyonlari için skorlanir.

Sensitizasyonun 5 haftasindan sonra, farelere ötanazi uygulanir ve sag kulaklari kesip çikarilmistir ve RPMI+%2FBS (GIBCO Invitrogen) ile takviye edilmis bir 48-gözlü kültür kabinin (Coming) bir tek gözüne yerlestirilmistir.

Plakalar %5 C02 nem kontrollü inkübatörlere yerlestirilir. Süpernatantlar, 24 saat sonra toplanir ve ilave analize kadar -20°C'de dondurulur.

Yöntem II) On iki-haftalik disi NC/Nga fareleri (CRL Japan), sirtlarindan haftada üç kere 10 ug SEB (Toxin Technology) ile intradermal olarak duyarlilastirilir.

Fareler AD-benzeri Iezyonlari için skorlanir. Sensitizasyonun 5 haftasindan sonra, farelere ötanazi uygulanir ve 6 mm'lik biyopsi ponksiyonlari her bir farenin enjekte edilmis kulagindan alinmistir ve RPMI+%2FBS ile takviye edilmis bir 48-gözlü kültür kabinin bir tek gözüne yerlestirilmistir. Plakalar %5 C02 nem kontrollü inkübatörlere yerlestirilir. Süpernatantlar, 24 saat sonra toplanir ve ilave analize kadar -20°C'de dondurulur.

Her iki çalismadaki fare gruplarina, sensitizasyonun 1 ila 2 haftasindan sonra baslayarak haftada iki kere intraperitoneal olarak beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya beserilestirilmis IL-31 antikorlari veya antagonistleri ile muamele edilir. 24-saatlik süpernatant örneklerinde TARC ve MDC konsantrasyonlari geleneksel ELIZA (R&D Systems) ile ölçülür.

Bir uygulamada, (istemlerde tanimlandigi üzere) mevcut bulusun beserilestirilmis lL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, Fab, Fab' ve F(ab')2, Fd, tek-Zincirli Fvs (scFv), tek-Zincirli antikorlar, disülfit- bagli Fv'ler (dev) ve bir VL veya VH alani içeren fragmanlar, içerir. Tek-Zincirli antikorlar içeren antijen-baglama antikor fragmanlari, tek basina veya asagidakilerin bütünü veya bir parçasi ile kombinasyon hâlinde, degisen bölge (bölgeler) (yani, SEQ bölgesi, CH1, CH2 ve CH3 alanlari ile degisken bölgenin (bölgelerin) herhangi bir kombinasyonunu da içeren (istemlerde tanimlandigi üzere) antijen-baglama fragmanlari da bulusa dâhil edilir. Açiklamanin bir uygulamasinda, SEQ ID NO.'Iari: 25; zincir degisken bölgesi ile birlestirilebilir.

Bir baska uygulamada, açiklama insan IL-31'i baglayan, bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani içeren bir izole edilmis antikor veya antikor fragmani saglar, burada beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani asagidakilerden olusan gruptan seçilir: a) SEQ ID NO: 25 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; 0) SEQ ID NO: 25 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 28 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; d) SEQ ID NO: 29 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; e) SEQ ID NO: 27 amino amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; f) SEQ ID NO: amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; 9) SEQ SEO ID NO: 26 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; h) SEO ID NO: 25 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 32 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; i) SEO lD NO: 25 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 33 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; j) SEO ID NO: 25 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 34 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; k) SEO ID NO: 35 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; I) SEO ID NO: 27 amino amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; m) SEO ID NO: 27 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 33 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; n) SEO SEO ID NO: 34 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; 0) SEO ID NO: 36 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisini Içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; q) SEO ID NO: 38 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; r) SEO ID NO: 39 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO lD NO: 37 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; 3) SEO ID NO: 40 amino amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; t) SEO lD NO: 41 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; u) SEO SEO ID NO: 37 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; v) SEO ID NO: 43 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; w) SEO ID NO: 44 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; x) SEO ID NO: 36 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 28 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; y) SEO ID NO: 36 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 28 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani ve 2) SEO ID NO: 45 amino amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani.

Bir baska uygulamada, açiklama insan lL-31'i baglayan, bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani içeren bir izole edilmis antikor veya antikor fragmani saglar, burada beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani asagidakilerden olusan gruptan seçilir: a) SEO ID NO: 25 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisine en az lD NO: 27 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; 0) SEO ID NO: 25 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 28 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; d) SEO ID NO: 29 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; e) SEO ID NO: 27 amino asit dizisine en az hafif zincir degisken alani; f) SEO ID NO: 30 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; 9) SEO ID NO: 31 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; h) SEO ID NO: 25 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 32 amino asit dizisine en az agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 33 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; j) SEQ ID NO: 25 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 34 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; k) SEQ ID NO: 35 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; I) SEO ID NO: 27 amino asit dizisine en az hafif zincir degisken alani; m) SEQ ID NO: 27 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 33 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; n) SEQ ID NO: 27 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 34 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; 0) SEO ID NO: 36 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisine en az lD NO: 25 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; q) SEQ ID NO: 38 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; r) SEQ ID NO: 39 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO SEQ ID NO: 40 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisine en az agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; u) SEQ ID NO: 42 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEQ ID NO: 37 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; v) SEQ ID NO: 43 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; w) SEO ID NO: 44 amino asit dizisine en az hafif zincir degisken alani; x) SEQ ID NO: 36 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 28 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; y) SEQ ID NO: 36 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEQ ID NO: 28 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani ve z) SEQ ID NO: 45 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisine en az Bir baska yönde, açiklama asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir izole edilmis antikor saglar: a) SEQ ID NO: 46 amino asitler dizisinden olusan bir hafif zincir ve SEO 48 amino asitler dizisinden olusan bir hafif zincir ve SEO ID NO: 49 amino asit dizisinden olusan bir agir zincir içeren bir antikor ve c) SEQ ID NO: 50 amino asitler dizisinden olusan bir hafif zincir ve SEO ID NO: 51 amino asit dizisinden olusan bir agir zincir içeren bir antikor.

Mevcut açiklama ayrica, yukarida tarif edilenlere fonksiyonel olarak es-deger olan rekombinant beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri de içerir. Iyilestirilmis kararlilik ve/veya terapötik etkinlik saglayan modifiye edilmis beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri de dâhil edilir. Modifiye edilmis antikorlarin örnekleri, amino asit rezidülerin konservatif sübstitüsyonlarina, amino asitlerin, antijen baglama yararliligini anlamli olarak zararli bir sekilde degistirmeyen bir veya birden fazla silinmesine veya ilavesine sahip olanlari içerir. Terapötik yararlilik idame ettirildigi sürece, sübstitüsyonlar, bir veya birden fazla amino asit rezidüsünün degistirme veya modifiye etme ila bir bölgenin tamamen yeniden-tasarlanmasi araliginda olabilir. Mevcut bulusun beserilestirilmis lL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri post-translasyonel olarak (örnegin, asetilasyon ve fosforilasyon) modifiye edilebilir veya sentetik olarak (örnegin, bir etiketleme grubunun eklenmesi) modifiye edilebilir. Mevcut yöntem ile tasarlanan beserilestirilmis IL-31 antijen baglama moleküllerinin veya lL-31 antagonistlerinin antijen baglama veya baska immünoglobülin fonksiyonlari üzerinde kayda deger bir sekilde etkiye sahip olmayan ilave konservatif amino asit sübstitüsyonlarina sahip olabilecegi anlasilir.

(Istemlerde tanimlandigi üzere) mevcut bulusun beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri, modifiye edilmis türevleri içerir, örnegin, herhangi bir sekilde sinirlandirmadan, türevler, örn., glikosilasyon, asetilasyon, pegilasyon, fosforilasyon, amidasyon, bilinen koruma/bloke etme gruplari ile türevlendirme, proteolitik klevaj, bir hücresel Iiganda veya baska proteine baglama, vb., ile modifiye edilmis beserilestirilmis IL-31 antijen baglama moleküllerini veya IL-31 antagonistlerini içerir. Çok sayidaki kimyasal modifikasyonun herhangi biri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, spesifik kimyasal klevaji, asetilasyonu, formilasyonu, tunisamisinin metabolik sentezini, vb., içeren bilinen teknikleri ile yürütülebilir. Ilave olarak, türev bir veya birden fazla klasik-olmayan amino asit içerebilir.

Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri, bir fare donör immünoglobülininin CDR'Ierini ve bir Insan akseptör immünoglobülininin agir zincir ve hafif zincir çerçevelerini içerir. Beserilestirilmis antikor yapmanin yöntemleri, antikorlarin CDR'Ieri akabinde, arzu edilen beserilestirilmis antikoru üretmek için, teknikte bilinen, herhangi bir seçilmis insan çerçevesine greft edilebilir.

Açiklama ayrica, burada tarif edilen bir monoklonal antikorun insan lL-31'ini baglamasini kompetitif olarak inhibe eden beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri de saglar. Kompetitif inhibisyon, teknikte bilinen herhangi bir yöntem ile, örnegin, burada tarif edilen kompetitif baglama analizleri kullanilarak, belirlenebilir. Tercih edilen uygulamalarda, antikor bulusun bir monoklonal antikorunun polipeptidi baglamasini kompetitif bir sekilde en az %90, en az %80, en az Açiklama ayrica, kompetitif baglamayi belirlemek için teknikte bilinen herhangi bir yöntem, örnegin, burada tarif edilen immüno-analizler, ile belirlendigi üzere bir antikorun burada açiklanan bir epitopu baglamasini kompetitif bir sekilde inhibe eden beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri de saglar.

Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama moleküllerinin veya IL-31 antagonistlerinin in vivo yari-ömürleri, Fc alani ve FcRn reseptörü arasindaki etkilesime dâhil edildigi seklinde tanimlanmis amino asit rezidülerini modifiye etme (örn, sübstüte etme, silme Yayinlari) veya polimer moleküller, örnegin, yüksek moleküler agirlikli polietilenglikol (PEG) ekleme ile arttirilabilir. PEG, PEG'in söz konusu antikorlarin veya antikor fragmanlarinin N- veya C-ucuna yer-spesifik konjugasyonu ile veya Iizin rezidüleri üzerinde bulunan epsilon-amino gruplari vasitasiyla bir multi-fonksiyonel baglama ile veya bu baglayici olmadan eklenebilir. Biyolojik aktivitenin minimal kaybi ile sonuçlanan lineer veya dallanmis polimer türevlendirmesi kullanilacaktir. Konjugasyon derecesi, PEG moleküllerinin antikorlara uygun konjugasyonunu garanti etmek için SDS-PAGE ve kütle spektrometrisi ile yakindan izlenecektir. Reaksiyona sokulmamis PEG, antikor-PEG konjugatlarindan, örn., boyut dislama veya iyon-degisim kromatografisi, ile ayrilabilir.

Mevcut açiklama, beserilestirilmis immünoglobülin zinciri içeren bir antikorun afinitesini arttirmak için, bunun vasitasiyla, bir beserilestirilmis immünoglobülin zincirinin çerçevesi içinde sinirli bir sayidaki amino asidin akseptördekinden daha ziyade donör içinde bu pozisyonlardaki amino asitler ile ayni olacak sekilde seçildigi kriterleri içerir.

Burada spesifik olarak tarif edilen beserilestirilmis immünoglobülinlere ek olarak, natif dizilere diger "kayda deger sekilde homolog" modifiye edilmis immünoglobülinler, teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi bilinen çesitli rekombinant DNA tekniklerinden yararlanilarak kolaylikla tasarlanabilir ve üretilebilir. Çesitli farkli insan çerçeve bölgeleri, mevcut bulusun beserilestirilmis immünoglobülinleri için bir temel olarak tek basina veya kombinasyon hâlinde kullanilabilir. Genel olarak, genlerin modifikasyonlari çesitli iyi-bilinen teknik, örnegin, yere-yönlendirilmis mutajenez, ile kolaylikla tamamlanabilir (bakiniz, Gillman ve Smith, Gene, 8, 81-97 (1979) ve S.

Bulusun beserilestirilmis antikorlari, (istemlerde tanimlandigi üzere) fragmanlari ayni zamanda aynen antikorlari içerir. Tipik olarak, bu fragmanlar, antijen baglama için bunlarin bundan türetildigi aynen antikor ile rekabet eder. Fragmanlar tipik olarak, en içinde) bir afinite ile baglar. Beserilestirilmis antikor fragmanlari, ayri agir zincirler, hafif zincirler, Fab, Fab', F(ab')2 ve Fv içerir. Fragmanlar, rekombinant DNA teknikleri ile veya aynen immünoglobülinlerin enzimatik veya kimyasal ayrilmasi ile üretilir. Çesitli teknikler antikor fragmanlari üretmek için gelistirilmistir. Bu fragmanlar, aynen antikorlarin proteolitik sindirimi vasitasiyla türetilebilir (bakiniz, örn., Morimoto et al., Science, 229:81 (1985)) veya rekombinant konak hücreler ile dogrudan üretilebilir. Örnegin, antikor fragmanlari, yukaridaki tartisilan antikor faj kütüphanelerinden izole edilebilir. Alternatif olarak, Fab'-SH fragmanlari, E. co/i`den dogrudan geri-kazanilabilir ve F(ab')2 fragmanlarini olusturmak için kimyasal olarak kuple edilebilir (Carter et al., rekombinant konak hücre kültüründen dogrudan izole edilebilir. Antikor fragmanlarinin üretilmesi için diger teknikler, uzman uygulayici için asikâr olacaktir. Ilaveten, tek- zincirli Fv'ler ve antikorlar üretmek için kullanilabilen tekniklerin örnekleri, 4,946,778 ve 88 ( ve Skerra et al., Science 240:1038- 1040 (1988), kaynaklarinda tarif edilenleri içerir.

Mevcut açiklama, füzyon proteinler üretmek için bir polipeptide (veya bunun kismina, tercihen polipeptidin en az 10, 20 veya 50 amino asidine) rekombinant olarak kaynastirilmis veya (hem kovalent hem de kovalent-olmayan konjugasyonlari içeren) kimyasal olarak konjuge edilmis antikorlari kapsar. Böylelikle, açiklama ayrica burada tarif edilen antikoru içeren, bir sitotoksik ajana, örnegin, bir kemoterapötik ajana, toksine (örnegin, bakteriyel, fungal, bitki veya hayvan orijinli bir enzimatik olarak aktif toksine veya bunun fragmanlarina) veya bir radyoaktif izotopa (yani, bir radyo- konjugata) konjuge edilmis immünokonjugatlar ile de ilgilidir.

Mevcut açiklama ilaveten, heterolog polipeptit dizilerine (örnegin, degisken bölgeler disindaki antikor alanlarina) kaynastirilmis veya konjuge edilmis mevcut açiklamanin polipeptitlerini içeren bilesimleri (örnegin, bir immünojenik veya antijenik epitop içerenleri) içerir. Örnegin, mevcut açiklamanin polipeptitleri, bir antikor Fc bölgesine veya bunun kismina kaynastirilabilir veya konjuge edilebilir. Örnegin, mevcut açiklamanin (bunun fragmanlarini veya varyantlarini içeren) polipeptitleri, immünoglobülinlerin sabit alanlari (lgA, IgE, IgG, IgM) veya bunlarin kisimlari (CH1, CH2, CH3 veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu veya bunlarin kisimlari) ile kaynastirilabilir, bu kimerik polipeptitler ile sonuçlanir. Mevcut açiklamanin bir polipeptidine kaynastirilmis antikor kismi, sabit bölge, mentese bölgesi, CH1 alani, CH2 alani ve CH3 alani veya bütün haldeki alanlarin herhangi bir kombinasyonunu veya bunlarin kisimlarini içerebilir. Polipeptitler ayrica, multimerler olusturmak için yukaridaki antikor kisimlarina da kaynastirilabilir veya konjuge edilebilir. Örnegin, mevcut açiklamanin polipeptitlerine kaynastirilmis FC kisimlari, Fc kisimlari arasinda disülfit baglama yoluyla dimerler olusturabilir. Daha yüksek multimerik formlar, polipeptitleri lgA ve lgM kisimlarina kaynastirma ile yapilabilir. Mevcut açiklamanin polipeptitlerini antikor kisimlarina kaynastirmak veya konjuge etmek için yöntemler teknikte bilinir. açiklamanin (bunlarin fragmanlarini veya varyantlarini içeren) polipeptitleri ve/veya antikorlari, (bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, rekombinant insan serum albüminini veya bunlarin fragmanlarini veya varyantlarini içeren) albümin ile kaynastirilabilir açiklanan polipeptitler ve/veya mevcut bulusun (bunlarin fragmanlarini veya varyantlarini içeren) antikorlari heterolog proteinin (örnegin, immünoglobülin Fc polipeptidinin veya insan serum albümin polipeptidinin) N- veya C-ucu ucuna kaynastirilabilir. Füzyon proteinleri sifreleyen polinükleotidler de burada açiklanir.

Yukarida tartisildigi üzere, mevcut açiklamanin polipeptitleri, polipeptitlerin in vi'vo yari ömrünü arttirma için veya immüno-analizlerde kullanilmasi için teknikte bilinen yöntemler kullanilarak yukaridaki antikor kisimlarina kaynastirilabilir veya konjuge edilebilir. ilaveten, mevcut açiklamanin polipeptitleri, saflastirmayi kolaylastirmak için yukaridaki antikor kisimlarina kaynastirilabilir veya konjuge edilebilir. Bildirilen bir örnek, insan CD4-polipeptidinin ilk iki alanindan ve memeli immünoglobülinlerinin agir veya hafif zincirlerinin sabit bölgelerinin çesitli alanlarindan olusan kimerik proteinleri antijenin epitelyal bariyeri geçerek immün sisteme arttirilmis aktarimi, bir FçRn baglam partnerine, örnegin, IgG veya FC fragmanlarina konjuge edilmis antijenler (örnegin, insülin) için gösterilmistir (bakiniz, örn., .

Mevcut açiklamanin (IgG'den kaynaklanan) disülfit-bagli dimerik yapilara sahip olan bir antikora kaynastirilmis veya konjuge edilmis polipeptitleri ayrica, tek basina monomerik salgilanmis proteine veya protein fragmanina kiyasla diger molekülleri baglamada ve (1995)). Çogu durumda, bir füzyon proteininin Fc parçasi, terapide ve tanida yararlidir ve bundan dolayi, örnegin, iyilestirilmis farmakokinetik özellikler ile sonuçlanabilir (EP A 232,262). Alternatif olarak, füzyon protein eksprese edildikten, saptandiktan ve saflastirildiktan sonra, Fc parçasini silme arzu edilecektir. Örnegin, füzyon proteini immünizasyonlar için bir antijen olarak kullanildiginda, Fc kismi terapiyi veya taniyi engelleyebilir. Ilaç kesfinde, örnegin, insan proteinleri, örnegin, hlL-5, hlL-5'in antagonistlerini tanimlamak için yüksek-girdili-çiktili tarama analizleri amaciyla Fc kisimlarina kaynastirilmistir (Bakiniz, D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52- ayrica, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bifonksiyonel konjuge etme ajanlarinin Dahasi, burada açiklanan polipeptitler (örnegin, bulusun antikorlari veya bunlarin fragmanlari), bunlarin saflastirilmasini kolaylastirmak için, belirteç dizilere, örnegin, bir peptide, kaynastirilabilir. Ilave bir uygulamada, açiklamanin polipeptitlerini sifreleyen (bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, immünojenik ve/veya antijenik epitoplari sifreleyen nükleik asitleri içeren) nükleik asitleri de, eksprese edilen polipeptidin saptanmasina ve saflastirilmasina yardimci olmasi için bir epitop etiketi (örnegin, hemagglutinin etiketi ("HA") veya bayrak etiketi) olarak söz konusu bir gen ile yeniden-birlestirilir. Tercih edilen uygulamalarda, belirteç amino asit dizisi, bir hekza-histidin peptididir, örnegin, digerleri arasinda, çogu piyasada satilan, bir pQE vektörü (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311) içinde saglanan etikettir. Gentz et al., Proc. Natl. histidin füzyon proteinin uygun kolay saflastirilmasini saglar. Saflastirma için kullanisli olan diger peptit etiketleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, influenza hemagglutinin proteininden türetilen bir epitopa karsilik gelen "HA“ etiketini (Wilson et al., Cell 37:76? (1984)) ve "bayram" etiketini, içerir.

Mevcut açiklama ilaveten, bir tanisal veya terapötik ajana konjuge edilmis beserilestirilmis IL-31 antijen baglama moleküllerini veya IL-31 antagonistlerini kapsar. saptama ve/veya önleme rejiminin etkinligini belirlemek için, mesela, bir klinik test prosedürünün parçasi olarak bir pruritik hastaligin gelismesini veya progresyonunu izlemek amaciyla tanisal olarak kullanilabilir. Saptama, antikoru bir saptanabilen maddeye kuple etme ile kolaylastirilabilir. Saptanabilen maddelerin örnekleri, çesitli enzimleri, prostetik gruplari, flüoresan maddeleri, Iüminesan maddeleri, biyolüminesan maddeleri, radyoaktif maddeleri, çesitli pozitron emisyon tomografileri kullanilan pozitron yayan metalleri ve radyo-aktif olmayan paramanyetik metal iyonlarini içerir.

Bakiniz, örnegin, mevcut açiklamaya göre tanisallar olarak kullanilmasi için antikorlara konjuge edilebilen metal iyonlari için 4,741,900 Numarali ABD Patenti. Uygun enzimlerin örnekleri, yaban turpu peroksidazi, alkalin fosfatazi, beta-galaktosidazi veya asetilkolinesterazi içerir; uygun prostetik grup komplekslerinin örnekleri, streptavidin,/biyotini ve avidini/biyotini içerir; uygun flüoresan maddelerin örnekleri, umbelliferonu, floresini, floresin izotiyosiyanati, rodamini, diklorotriazinilamin floresini, dansil klorürü veya fikoeritrini içerir; bir Iüminesan maddenin bir örnegi, lüminolü içerir; Biyolüminesan maddelerin örnekleri, lüsiferazi, Iüsiferini ve aequorini içerir ve uygun ilaveten, beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri, bir terapötik kisma, örnegin, bir sitotoksine, örn., bir sitostatik veya sitosidal ajana, bir terapötik ajana veya bir radyoaktif metal iyonuna, konjuge edilebilir. Bir sitotoksin veya sitotoksik ajan, hücrelere zararli olan herhangi bir ajani içerir. Örnekler, paklitaksolü, siytokalasin B'yi, gramisidin D'yi, etidiyum bromürü, emetini, mitomisini, etoposidi, tenoposidi, vinkristini, vinblastini, oolsisini, doksorubisini, daunorubisini, dihidroksi antrasin dionu, mitoksantronu, mitramisini, aktinomisin D'yi, 1-dehidrotestoster0nu, glukokortikoidleri, prokaini, tetrakaini, Iidokaini, propranololü ve puromisini ve bunlarin analoglarini veya homologlarini içerir. Terapötik ajanlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, anti-metabolitleri (örnegin, metotreksati, 8-merkaptopürini, 6-tiyoguanini, sitarabini, 5-fl0r0urasil dekarbazini), alkilleme ajanlarini (örnegin, mekloretamini, tiyotepa klorambusili, melfalani, karmustini (BSNU) ve Iomustini (CCNU), siklofosfamidi, busülfano, dibromomannitolü, streptozotosini, mitomisin C'yi ve cis- diklorodiamin platinyum (II)'yi (DDP) sisplatini), antrasiklinleri (örnegin, daunorubisini (önceden, daunomisini) ve doksorubisini), antibiyotikleri (örnegin, daktinomisini (önceden, aktinomisini), bleomisini, mitramisini ve antramisini (AMC)), ve anti-mitotik ajanlari (örnegin, vinkristini ve vinblastini), içerir.

Açiklamanin konjugatlari, verilen bir biyolojik yaniti modifiye etmek için kullanilabilir, terapötik ajanin veya ilaç kisminin klasik kimyasal terapötik ajanlar ile sinirlandirildigi seklinde anlam çikarilmaz. Örnegin, ilaç kismi, arzu edilen bir biyolojik aktiviteye sahip olan bir protein veya polipeptit olabilir. Bu tarz proteinler, örnegin, bir toksini, örnegin, abrini, risin A'yi, psödomonas ekzotoksinini veya difteri toksinini; bir protein, örnegin, tümör nekroz faktörü, oi-interferon, .beta.-interferon, sinir büyüme faktörü, platelet kaynakli büyüme faktörü, doku plazminojen aktivatörü, bir trombotik ajan veya bir anti- anjiyojenik ajan, örn., anjiyostatin veya endostatin veya biyolojik yanit modifiye edicileri, örnegin, mesela, Ienfokinler, interlökin-1 ("IL-1"), interlökin-Z ("IL-2"), interlökin-ö ("IL- 6"), granülosit makrofaj koloni stimülan faktörü ("GM-CSF"), granülosit koloni stimülan faktörü ("G-CSF") ve diger büyüme faktörlerini, içerebilir.

Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri ayrica, immüno-analizler veya hedef antijenin saflastirilmasi için özellikle yararli olan kati desteklere de eklenebilir. Bu tarz kati destekler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, cami, selülozu, poliakrilamidi, naylonu, polistireni, polivinil klorürü veya polipropileni, Bu tarz terapötik kismi antikorlara konjuge etmek için teknikler iyi bilinir, bakiniz. örn., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al., (eds.), pp.

Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (eds.), pp. ve Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Alternatif olarak, beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri, 4,676,980 Numarali ABD Patenti'nde Segal tarafindan tarif edildigi üzere bir antikor heterokonjugati olusturmak için bir ikinci antikora konjuge edilebilir.

Tek basina veya sitotoksik faktör (faktörler) ve/veya sitokin (sitokinler) ile kombinasyon hâlinde uygulanan, buna konjuge edilmis bir terapötik kisim içeren veya buna konjuge edilmis bir terapötik kisim içermeyen, beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri bir terapötik olarak kullanilabilir.

Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri, lL-31 eksprese eden hücreleri etiketlemek için; afinite saflastirmasi ile IL-31'i izole etmek için; lL-31 polipeptitlerinin dolasimdaki düzeylerini belirlemek amaciyla tanisal analizler için; altta yatan patolojinin veya hastaligin bir belirteci olarak çözünebilen lL-31'i saptamak veya kantifiye etmek için; FACS kullanilan analitik yöntemlerde; ekspresyon kütüphanelerini taramak için; anti-idiyopatik antikorlar üretmek için ve in vitro ve in vivo lL-31 aktivitesini bloke etmek için nötralize etme antikorlari olarak veya antagonistler olarak kullanilabilir. Uygun dogrudan etiketler tag'ler veya etiketler, radyonüklidleri, enzimleri, substratlari, kofaktörleri, inhibitörleri. flüoresan belirteçleri. kemilüminesan belirteçleri, manyetik parçaciklari ve benzerlerini içerir; dolayli tag'ler veya etiketler ara- ürünler olarak biyotin-aividin ve baska kompleman-anti-kompleman çifti kullanimi özelligi gösterebilir. Buradaki antikorlar ayrica, ilaçlara, toksinlere, radyonüklidlere ve benzerlerine dogrudan veya dolayli olarak konjuge edilebilir ve bunlar konjugatlar in vivo tanisal veya terapötik uygulamalar için kullanilabilir. Dahasi, lL-31'e antikorlar veya bunlarin fragmanlari analizlerde, örnegin, Western Blot'larda veya teknikte bilinen diger analizlerde, denatüre edilmis lL-31'i veya bunun fragmanlarini saptamak için in vitro kullanilabilir.

Uygun saptanabilen moleküller, polipeptide veya antikora dogrudan veya dolayli olarak eklenebilir ve radyonüklidleri, enzimleri, substratlari, kofaktörleri, inhibitörleri, flüoresan belirteçleri, kemilüminesan belirteçleri, manyetik parçaciklari ve benzerlerini içerir.

Uygun sitotoksik moleküller, polipeptide veya antikora dogrudan veya dolayli olarak eklenebilir ve bakteriyel veya bitki toksinlerini (örnegin, difteri toksinini, saporini, Psödomonas ekzotoksinini, risini, abrini ve benzerlerini) ayni zamanda terapötik radyonüklidleri, örnegin, (polipeptide veya antikora dogrudan eklenmis veya örnegin, bir selatlama kismi vasitasiyla dolayli olarak eklenmis) iyodin-131, renyum-188 veya ittriyum-90, içerir. Polipeptitler veya antikorlar ayrica, sitotoksik ilaçlara, örnegin, adriamisine, de konjuge edilebilir. Bir saptanabilen veya sitotoksik molekülün dolayli eklenmesi için, saptanabilen veya sitotoksik molekül bir komplementer/anti- komplementer çiftin bir üyesi ile konjuge edilebilir, burada diger üye polipeptit veya antikor kismina baglanir. Bu amaçlar için, biyotin/streptavidin, bir emsal komplementer/anti-komplementer çifttir.

Burada açiklanan lL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, NC/Nga modelini, Ova epikütanöz modelini, kronik hipersensitivite modelini ve kronik hapten modelini, içeren teknikte bilinen ve burada tarif edilen çesitli in vivo modeller ile belirlendigi üzere bunlarin lL-31 Iigandini inhibe etme, bloke etme veya nötralize etme yetisi için ölçülebilir.

Hem ciltte-yuvalanan T hücreleri hem de epidermal keratinositler, insanlara cilt hastaliklarinin patolojisinde gösterilmistir. IL-31 mRNA ve protein ekspresyonu, insanlarda ciltte-yuvalanan CLA+ T hücre popülasyonu ile sinirlandirilir. Bakiniz, 14 Numarali ABD Patent Basvurusu (.

Böylece, lL-31'e, bir antikoru veya reseptör antagonistini içeren, bir antagonist CLA+ T hücrelerinin ekspresyonuna sahip olan cilt hastaliklarini ve epidermal hastaliklari tedavi etmede yararli olacaktir. Bu tarz hastaliklar, örnegin, atopik dermatiti, kontakt dermatiti, ilaç-indüklü alerjik reaksiyonlari, cilt-tropik virüsler ve viral iliskili pruritusu, vitiligoyu, kütanöz T hücresi Ienfomasini, alopesi aeratayi, akne rozaseayi, akne vulgarisi, prurigo nodülarisi ve büllöz pemfigoidi, içerir. Kemokin belirteçleri, örnegin, TARC ve MDC, IL- 31 için bir nötralize etme monoklonal antikorunun etkisini ölçmek için yararlidir. Burada tarif edilen IL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri ile tedavinin inhibitör etkileri, TARC ve MDC düzeylerini izleme ile Ölçülebilir.

Kontakt dermatit Alerjik kontakt dermatit, cilt ile temas eden hâle gelen bir antijene bir T hücresi aracili immün reaksiyon olarak tanimlanir. Alerjen bagimli T hücresi yanitlari agirlikli olarak CLA+ hücreleri popülasyonu ile sinirlandirildigindan, CLA+ T hücresi popülasyonunun dermatit baslamasina dâhil edildigi düsünülür (Bakiniz, Santamaria-Babi, L.F. et al., J hafiza (CD45RO+) CD4+ CLA+ hücrelerinin, nikele, bir yaygin kontakt hipersensitivite alerjenine, yanitta çogaldigini ve hem tip-1 (IFN-) hem de tip-2 (IL-5) ürettigini bulmustur. Dahasi, CD4, CD45RO (hafiza) veya CD69 ile kombinasyon hâlinde CLA eksprese eden hücreler, nikel-spesifik stimülasyondan sonra arttirilir ve CCRG'yi degil ancak CXCRS, CCR4, CCR10 kemokin reseptörlerini eksprese eder. Bakiniz, Moed H. et al., Br J Dermatol:51, 32, (2004).

Hayvan modellerinde, alerjik kontakt dermatitin T-hücresi bagimli oldugu ve alerjik- yanit veren T hücrelerinin alerjen uygulama yerine göç ettigi gösterilmistir. Bakiniz, 31 stimülasyonu pro-enflamatuvar kemokinleri, örnegin, TARC ve MDC, indükleyebildiginden, IL-31 kontakt dermatitin patofizyolojisine dâhil edilebilir. Kontakt hipersensitivitenin bir fare modelinde bir nötralize etme IL-31 antikoru kullanilarak.

Böylelikle. burada tarif edilen beserilestirilmis lL-31 antijen baglama molekülleri veya kasinmanin inhibisyonu, düsüsü, nötralizasyonu, önlenmesi veya bloke edilmesi ile Kontakt Hipersensitivitenin klinik sonucunu iyilestirmek için kullanilabilir.

Atopik Dermatit Atopik dermatit (AD), son on yillardir bir dramatik olarak artan insidansi olan bir kronik olarak relapse olan enflamatuvar cilt hastaligidir. Klinik olarak, ADhayli pruritik, siklikla derisi soyulmus plaklar ve bir kronik relapse olan seyir gösteren papüller ile karakterize edilir. AD'nin tanisi çogunlukla, majör ve minör klinik bulgulara dayanir. Bakiniz, Hanifin ve fokal parakeratoz ortaya çikarirken, hiper ve parakeratoz ile birlikte göze çarpan epidermal hiperplazi, akantoz/hipergranüloz ve Ienfositler ve bol mast hücreleri içeren dermisin perivasküler infiltrasyonu, kronik Iezyonlarin özellikleridir.

T hücreleri, dokularda lokal immün yanitlarin baslatilmasina merkezi bir rol oynar ve bulgular, özellikle Cildi-infiltre eden T hücrelerinin ciltte disregüle edilmis immün yanitlarin baslatilmasinda ve idamesinde önemli bir rol oynayabilecegini öne sürer.

Kütanöz enflamatuvar yerlerde infiltre eden T hücrelerinin yaklasik olarak %90'i, E- selektini, endotelyum üzerinde bir indüklenebilir adhezyon molekülünü, baglayan kütanöz Ienfosit-iliskili Ag (CLA+) eksprese eder (Santamaria-Babi L.F. et al., Eur J Dermatol: 14, 13, (2004), kaynaginda derlenmistir). Kontrol bireylerine kiyasla AD hastalari arasinda dolasimdaki CLA+ T hücrelerinde anlamli bir artis belgelenmis iken elde edilen hafiza CLA+ T hücrelerinin tercihli bir sekilde CLA- popülasyonuna kiyasla alerjen ekstraktina yanit verdigini göstermistir (Bakiniz, Santamaria-Babi, L.F. et al., J arttirilmis düzeylerde lL-5 ve lL-13 9, 10 gibi Th-2-tipi sitokinleri eksprese eden CLA+ T hücrelerinde artislar ile iliskilendirilmistir. Bakiniz, Akdis M. et al., Eur J lmmunol: 30, NC/Nga Fareleri, yaklasik 6-8 haftalik oldugunda belirtilmemis, patojensiz (SPF- olmayan) kosullarda barindirildiginda, klinik seyri ve bulgulari, histopatolojiyi ve immünopatolojiyi içeren çogu açidan insan AD'ye paralel olan AD-benzeri Iezyonlari spontan bir sekilde gelistirir. Aksine, SPF kosullari altinda tutulan NC/Nga fareleri cilt davranisinin baslamasi ham toz akar antijeninin haftalik intradermal enjeksiyonu ile bir SPF tesisinde barindirilan NC/Nga farelerinde senkronize edilebilir. Bakiniz, Matsuoka H. et al., Allergy: 58, 139 (2003). Bundan dolayi, NC/Nga'da AD'nin gelismesi, AD tedavisi için yeni terapötiklerin degerlendirilmesi için yararli bir modeldir.

Spontan AD'nin NC/Nga modeline ek olarak, farelerin OVA kullanilarak epikütanöz duyarlilastirilmasi da, duyarlilastirilmis farelerin cildinde bir mononükleer infiltrat ile antijen-bagimli epidermal ve dermal kalinlasmayi indüklemek için bir model olarak kullanilabilir. Bu genel olarak, toplam ve spesifik IgE'nin yükseltilmis serum düzeyleri ile örtüsür; bununla birlikte, bu modelde normal olarak cilt bariyeri fonksiyon bozuklugu veya pruritus gerçeklesmez. Bakiniz, Spergel J.M. et al., J Clin Invest, 101: 1614, (1998). Bu protokol, DO11.1O OVA TCR transgenik farelerini OVA ile duyarlilastirma ile vilt bariyeri disregülasyonunu ve pruritusu indüklemek için modifiye edilebilir.

Duyarlilastirma antijenini taniyabilen antijen-spesifik T hücrelerinin sayisini arttirma, görünür kasinma davranisini ve cildin Iikenifikasyonunu/kabuklanmasini indüklemek için ciltte enflamasyon düzeyini arttirabilir.

Hem NC/Nga spontan AD modeli hem de OVA epikütanöz DO11.10 modeli, burada tarif edilen beserilestirilmis IL-31 antijen baglama moleküllerinin veya IL-31 antagonistlerinin IL-31'in etkilerini inhibe etme, azaltma veya nötralize etme yetisini degerlendirmek için kullanilir. Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama moleküllerinin veya IL-31 antagonistlerinin uygulanmasi, kasinmanin kesilmesi, gelismesi kasinmaya bagli olan dermatitin progresyonunu durduracagindan, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, atopik dermatiti, prurigo nodülarisi ve egzamayi içeren proritik hastaliklari tedavi etmede etkili olabilen kasinmada bir azalma ile sonuçlanabilir.

Burada tarif edilen beserilestirilmis IL-31 antijen baglama moleküllerinin veya IL-31 antagonistlerinin inhibitör etkisini ölçmek Için ilave modeller, Umeuchi, H. et al., Böylelikle, burada tarif edilen beserilestirilmis IL-31 antijen baglama moleküllerinin veya ve egzamayi içeren pruritik hastaliklarin klinik sonuçlarini hastalik ile iliskili enflamasyonun ve/veya kasinmanin inhibisyonu, azaltilmasi, önlenmesi veya bloke edilmesi ile iyilestirmek için kullanilabilir.

Beserilestirilmis anti-lL-31 antikorlarinin ve antagonistlerinin kasima yanitini inhibe etme, azaltma veya nötralize etme yetisini ölçmenin yöntemleri, asagidaki analizleri ve modelleri içerir: l) lL-31 ile muamele edilmis farelerin kapsaisin tedavisi On haftalik BALB/c hayvanlarina (CRL) anestezi uygulanir ve %10 etanol içinde kapsaisin + salin içinde %10 Tween-80'in 4 mglml'lik çözeltisinin enseye subkütan olarak 0,25 ml'lik enjeksiyonundan önce 0,1 mg/kg'da subkütan olarak bir uzun-etkili analjezik ajani, buprenorfin hidroklorür, enjekte edilir. Hayvanlar, nörotoksin muamelesini takiben en az 30 dk boyunca anestezi altinda tutulur. Kirk-sekiz saat sonra, 14-günlük ozmotik pompalar 14 gün boyunca 20 ug/gün IL-31'in sürekli aktarimi için subkütan olarak implante edilir. Fareler asagidaki kriterler kullanilarak alopesi ve pruritus için 6 gün boyunca günlük olarak izlenir: O = kasinma yok, hayvanlar normal görünür, 1 = küçük alanlarda kürk incelmesi, kasinma bildirilmistir, 2 = minör kil kaybi (küçük yamalar), kasinma, 3 = orta-düzeyde kil kaybi, kasinma ve 4 = siddetli kil kaybi ve fazla miktarda kasinma.

Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri tarafindan bozukluklarindan muzdarip olan hastalarda, kasinti insidansini ve yogunlugunu ve bundan dolayi dermatiti azaltabilir. ll) Tac1 Geni Ekspresyonu Tac1 geni için homozigot bos (null) olan fareler, saptanabilen madde P veya nörokinin A eksprese etmez. Bu fareler, orta ila yogun derecede stimuluslara anlamli bir sekilde azaltilmis nosispetif agri yanitlarina sahiptir ve bundan dolayi tasikinin peptitlerinin agri/kasinti proseslerine ve enflamatuvar hastalik dummlarina katkisini çalismak için kullanisli bir araçtir. On iki haftalik Tac1 nakavt farelere 1 ug/gün IL-31 proteini aktaran 14-günlük ozmotik pompalari implante edilmistir ve bu fareler asagidaki kriterler kullanilarak alopesi ve pruritus için günlük olarak gözlenmistir: 0 = kasinma yok, hayvanlar normal görünür, 1 = küçük alanlarda kürk incelmesi, kasinma bildirilmistir, 2 = minör kil kaybi (küçük yamalar), kasinma, 3 = orta-düzeyde kil kaybi, kasinma ve 4 = siddetli kil kaybi ve fazla miktarda kasinma.

Bu çalismanin sonuçlari, Tacl kusurlu farelerin dogal-tip kontrol farelerine kiyasla IL-31 indüklü kasinmaya/kil kaybina daha az yatkin oldugunu gösterir. Dogal tip farelerin gelistirirken, Tac1 kusurlu farelerin yalnizca %33,3'ü (2/6) ayni zaman-noktasinda kasinma ve kil kaybi bulgulari göstermistir. Böylelikle, beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri tarafindan lL-31'in nötralizasyonu, inhibisyonu veya azaltilmasi, dermatit baglaminda kasinmanin insidansini ve yogunlugunu azaltabilir.

Yaklasik olarak 8 ila 12 haftalik olan normal disi BALB/c farelerine (CRL), 1 tig/gün mlL-31 aktaran 14-günlük ozmotik pompalar (Alzet, #2002) subkütan olarak implante edilebilir. Farelerin gruplari, IL-31 aktarimindan 1 hafta önce baslayarak haftada iki kere siçan anti-fare IL-31 monoklonal antikoru 10 mg/kg (200 ug/fare) intraperitoneal (I.p.) enjeksiyonlari alir. Farelerin kontrol gruplari, özdes dozlama planlamalari ile i.p. vehikül (PBS/°/ enjeksiyonlari alir. Fareler, asagidaki kriterler kullanilarak alopesi ve pruritus için günlük olarak skorlanir: O = kasinma yok, hayvanlar normal görünür, 1 = küçük alanlarda kürk incelmesi, kasinma bildirilmistir, 2 = minör kil kaybi (küçük yamalar), kasinma, 3 = orta-düzeyde kil kaybi, kasinma ve 4 = siddetli kil kaybi ve fazla miktarda kasinma.

Böylelikle, IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri tarafindan IL- 31'in nötralizasyonu, azaltilmasi veya inhibisyonu, lL-31 tarafindan indüklenen kasinma/kil kaybi yanitlarini geciktirebilir.

Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama moleküllerinin veya lL-31 antagonistlerinin etkileri, kasinmanin, kasintinin, dermatitin inhibisyonu, keratinositlerde IL-31RA ekspresyonunda bir düsüs ve/veya alopesi ve pruritus için skorda bir düsüs ile ölçülür.

Ilaç-indüklü geciktirilmis tip kütanöz alerjik reaksiyonlar, çok heterojendir ve çok sayida farkli patofizyolojik olayi yansitabilir. Bakiniz, Brockow K. et al., Allergy: 57, 45 (2002).

Bu reaksiyonlara dâhil edilen immünolojik mekanizmalar, antikor veya hücre aracili olarak gösterilmistir. Hemen ilaç alerjisinde, bir IgE-aracili antikor reaksiyonu 20 dk sonra bir pozitif cilt prik testi ve/veya intradermal test ile gösterilebilirken, ilaçlara hemen-olmayan reaksiyonlar son ilaç alimindan bir saatten daha uzun süre sonra gerçeklesebilir ve bunlar siklikla T-hücresi aracilidir. Hemen-olmayan T-hücresi aracili geciktirilmis tip reaksiyonlar, örnegin, penisilinlere advers ilaç reaksiyonlari olan hastalarda gerçeklesebilir. Penisilinlere proliferatif T hücresi yanitlarinin penisilin alerjik hastalardan elde edilen T hücrelerinin hafiza (CD45RO+) CLA+ alt-popülasyonu ile sinirlandirildigi gösterilmisken, CD45RO+ CLA- alt-küme proliferatif yanit göstermemistir. Bakiniz, Blanca M., Leyva L. et al., Blood Cells Mol Disz31, 75 (2003).

Geciktirilmis-tip hipersensitivite (DTH) reaksiyonlari, farelerde yapay olarak üretilebilir, bu DTH yanitinin baslatilmasina ve perpetuasyonuna dâhil edilebilen faktörlerin degerlendirilmesine olanak saglar. Beserilestirilmis lL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri bir geciktirilmis tip hipersensitivite reaksiyonunu sinirlandirmada, azaltmada, inhibe etmede etkili olabilir.

Toksik epidermal nekroliz (TEN), kapsamli blisterler ile birlikte epidermisin yaygin apoptozu ile karakterize edilen çok nadir ancak hayli siddetli bir ilaç reaksiyonudur. Çalismalar, blisteri infiltre eden Ienfositlerin CLA+ T hücreleri oldugunu ve epidermal keratinositlere karsi sitotoksisite gösterebilecegini göstermistir. Bakiniz, Leyva L. et al., keratinositlerinde keratin-5 (K5) promotörü kontrolü altinda OVA'nin eksprese edildigi bir transgenik fare sistemi, TEN için bir hayvan modeli olusturmak için üretilmistir. K5- OVA fareleri içinde adoptif bir sekilde transfer edildiginde, OVA spesifik CD8+ T hücreleri cilt-drenaj lenf nodlarinda aktivasyon ve proliferasyon geçirir ve K5-OVA farelerinin cildini hedef alir, bu TEN'i animsatan cilt lezyonlarinin gelismesi ile Böylelikle, burada tarif edilen beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri tarafindan IL-31'in nötralizasyonu, hastalik ile iliskili enflamasyonun ve/veya kasinmanin inhibisyonu, azaltilmasi, önlenmesi veya bloke edilmesi ile TEN'in klinik sonuçlarini iyilestirmek için kullanilabilir.

Büllöz pemfigoid Büllöz pemfigoid, nötrofillerin ve eozinofillerin bir dermal infiltrati ile birlikte sub- epidermal blisterler olarak kendini gösteren bir sub-epidermal bozukluktur. Tani, epidermis ve dermal-epidermal baglantinin spesifik adezyon proteinlerine karsi antijen- spesifik antikorlarin varligi ile karakterize edilir. Bakiniz, Jordon R.E. et al., JAMA: 200, 751 (1967). PBL ve cilt blisteri T hücreleri analizi ile büllöz pemfigoidin patojenezinde T hücrelerinin rolünü analiz eden çalismalar, artmis düzeylerde lL-4 ve IL-13 gibi Th2- sitokinleri eksprese eden CLA+ T hücrelerinin bir üstünlügünü bulmustur. Bakiniz, terapiyi takiben büllöz pemfigoid hastalarinda, CLA- degil ancak CLA+, interlökin-13- üreten hücrelerin sikligi anlamli bir sekilde azaltilir. Kortikosteroid tedavisini takiben CLA+ hücrelerindeki düsüsler, klinik iyilestirme ile iliskilendirilir. Bakiniz, Teraki, adi geçen eser.

Böylelikle, burada tarif edilen beserilestirilmis lL-31 antijen baglama molekülleri veya ve/veya kasinmanin inhibisyonu, azaltilmasi, önlenmesi veya bloke edilmesi ile büllöz pemfigoidin klinik sonuçlarini iyilestirmek için kullanilabilir.

Alogesi areata Alopesi areata (AA), kil foliküllerinin bir doku ile sinirlandirilmis otoimmün hastalik olarak addedilir, burada foliküler aktivite Ienfositik infiltratlarin sürdürülmüs aktivitesinden dolayi durdurulur. AA, kilsiz Iezyonlarda bile, kil foliküllerinin gerçek dökülmesinin gerçeklesmemesine ragmen, vücut üzerinde herhangi bir yerde tam kil kaybi yamalari ile sonuçlanir. Enflamasyonun klinik bulgularinin olmamasina ragmen, aktif hastalik yerlerinden cilt biyopsileri bir CD8+ intra-foliküler infiltrat ile birlikte primer olarak CD4+ hücrelerinin peri-foliküler Ienfositik enflamasyonunu gösterir. Bakiniz, Kalish RS. & Gilhar A. J Investig Dermatol Symp Proc: 8, 164 (2003). Çalismalar, CD4+ veya CD8+ Ienfositlerini infiltre eden kafatasi derisinin CLA eksprese ettigini ve AA'si olan bireylerin periferik kaninda, CLA+ CD4+ veya CD8+ Ienfositlerinin yüzdesinin normal kontrollerinkine kiyasla anlamli olarak daha yüksek oldugunu göstermistir. ilaveten, siddetli veya progresif AA'si olan hastalar, hastaliktan geri- kazanilman hastalara kiyasa çok aha yüksek bir CLA-pozitifligi gösterir ve CLA+ hücrelerinin yüzdesindeki bir düsüs iyi bir klinik seyir ile paralellik gösterir. Bakiniz, Yano S. et al., Acta Derm Venereol: 82, 82 (2002). Bundan dolayi, bu çalismalar, CLA+ aktive edilmis T hücrelerinin büyük olasilikla AA'nin patojenezinde bir rol oynadigini göstermistir. Çiplak farelerin üzerine grefte edilmis AA hastalarindan elde edilen kaybi ile örtüsür ve aktive edilmis Iezyonel T hücrelerinin SCID farelerine transferi, SCID fareleri üzerinde insan kafatasi eksplantlarina kil kaybini transfer edebilir.

Bakiniz, Kalish R.S. & Gilhar A. J Investig Dermatol Symp Proc: 8, 164 (2003). Çesitli immüno-modüle eden terapiler, bu bozukluk için olagan tedavinin parçasidir; bununla birlikte, bu tedavilerin hiç biri bunlarin etkinligi açisindan tutarli degildir. modellerinde bunlarin kullanimlari terapötik etkilerin moleküler mekanizmalarini dikkatle incelemek için bir araç saglar. Bakiniz, Shapiro J. et al., J Investig Dermatol Symp Proc: 4, 239 (1999); Tang L. et al., Old Wine in new bottles: reviving old therapies for alopecia areata using rodent models (2003) ve Verma D.D. et al., Eur J Dermatol:14, 332 (2004).

Böylelikle, burada tarif edilen beserilestirilmis lL-31 antijen baglama molekülleri veya ve/veya kasinmanin inhibisyonu, azaltilmasi, önlenmesi veya bloke edilmesi ile alopesi areatanin klinik sonuçlarini iyilestirmek için kullanilabilir.

Akne Rozasea/Akne vulqaris Akne vulgaris, pilosebasöz aparatin bir bozuklugu, eriskinlerin en yaygin cilt problemidir. Foliküler keratinizasyondaki anormalliklerin, akne Iezyonu ürettigi düsünülür. Akne rozasea, kirmizi papüllerin, püstüllerin, kistlerin ve yaygin telenjiektaziler varligi ile, ancak komedonlarin (beyaz baslarin) yoklugu ile akne vulgaristen farklilik gösterir. Sebasöz bezlerden arttirilmis sebum atilmasi, akne vulgarisin patofizyolojisinde majör bir faktördür. Sebasöz pro-enflamatuvar Iipitleri; lokal olarak üretilen farkli sitokinleri; peri-grandüler peptitleri ve nöropeptitleri, örnegin, sebositler tarafindan Üretilen kortikotrofin-salim faktörünü ve akne hastalarinin saglikli- gözüken bezlerinin dolayinda sinir uçlarinda eksprese edilen madde P'yi içeren diger sebasöz bez fonksiyonlari da akne gelisimi ile iliskilidir. Bakiniz, Zouboulis C.C. Clin Dermatol: 22, 360 (2004).

Akne vulgarisin ve akne rozaseanin patofizyolojisinin bilinmeyen bir sekilde kalmasina ragmen, klinik gözlemler ve histopatolojik çalismalar, pilosebasöz folikülün enflamasyonunun rozasea ve akne vulgaris patojenezi için merkezi olabilecegini öne sürer. Rozasea Iezyonlarini infiltre eden T hücresi alt-kümelerinin analizi hakkinda daha önceki çalismalar, T hücrelerinin büyük çogunlugunun CD4 eksprese ettigini göstermistir. Bakiniz, Rufli T. & Buchner S.A. Dermatologica: 169, 1 (1984).

CD4+ T hücreleri, IL-31 üretir ve IL-31 ekspresyonu için cildin IHC analizi, IL-31'in sebasöz bezlerde ve ter bezlerinde eksprese edildigini öne sürer. Epidermal keratinositlerin IL-31 stimülasyonu, kemokinlerin ekspresyonunu indükler, bu büyük olasilikla, IL-31'in ciltteki pro-enflamatuvar yanita katki saglayabildigini öne süren, hücresel infiltrasyon ile sonuçlanir. Bakiniz, Dillon SR. et al., Nat Immunol: 5, 752 (2004). Bundan dolayi, IL-31 akne rozaseanin ve akne vulgarisin patofizyolojisine katki saglayabilir.

Böylelikle, burada tarif edilen beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya ve/veya kasinmanin inhibisyonu, azaltilmasi, önlenmesi veya bloke edilmesi ile akne vulgarisin klinik sonuçlarini iyilestirmek için kullanilabilir.

Prurigo nodülaris Prurigo nodülaris, tedavi etmesi zor olan inatçi pruritustan kaynaklanan likenifiye olmus veya derisi soyulmus nodüllerin bir erüpsiyondur. Kronik ovalama Iikenifikasyon ve kasinma lineer deri soyulmalari ile sonuçlanirken, kasintili irrite olmus ciltlerini kaziyan veya burada delik açan bireyler, prurigo nodülleri olarak bilinen bariz bir sekilde kalinlasmis papüller üretme egilimindedir. Prurigo nodülarisin atopik dermatite spesifik olmamasina ragmen, bu nodülleri olan çogu hasta ayrica, alerjik rinit, astim veya besin alerjisi olarak kendini gösteren bir atopik reaksiyona da sahiptir. T hücreleri, prurigo lezyonlarinda infiltre eden hücrelerin büyük çogunlugunu temsil eder ve bu lezyonlar siklikla atopi hastalarinda en pruritik cilt Iezyonunu temsil eder.

Prurigo nodüllerinin kapsaisin, küçük duyusal kütanöz sinirlerde madde P gibi nöropeptitlerin deplesyonu ile pruritus ve agri algisina müdahale eden bir anti-pruritik alkaloid, ile topikal tedavisinin, cilt Iezyonlarinin temizlenmesi ile sonuçlanan bir etkili ve güvenli rejim oldugu kanitlanmistir. Bakiniz, Stander S. et al J Am Acad Dermatol: 44, 471 (2001). NC-Nga farelerinde kapsaisin tedavisi kullanilarak kasinti yaniti çalismalari, dermatit Iezyonlarinin spontan gelisiminin neredeyse tamamen önlendigini göstermistir. Dahasi, serum IgE düzeylerinin yükselmesi anlamli bir sekilde baskilanmistir ve kapsaisin ile tedavi edilen farelerin Iezyonel cildinde infiltre eden eozinofiller ve mast hücresi sayilari azaltilmistir. Bakiniz, Mihara K. et al., Br J çesitli immünolojik yanitlari arttirma ile dermatit gelismesine katki saglayabilecegini öne sürer, böylece kasinti duyusunun ve/veya kasinti ile iliskili kasima davranisinin önlenmesinin AD için etkili bir tedavi olabilecegini isaret eder. Bakiniz, Mihara K. et al., kasinma miktarini azalttigi gösterildiginden, burada tarif edilen beserilestirilmis anti-IL- 31 antikorlari AD, prurigo nodülaris ve diger pruritik hastaliklarin etkilerini minimuma indirmede yararli olacaktir. lL-31'in kronik aktarimi, farelerinde pruritusu ve alopesiyi indükler, bu dermatite benzeyen cilt Iezyonlarinin gelismesi izler, bu IL-31'in kasintiyi indükleyebilecegini öne indüksiyonuna dâhil edilmesi, örnegin, iki yöntem (I) lL-31 ile muamele edilmis farelerin kapsaisin tedavisi ve (ii) nöropeptitlerin ekspresyonunun yoklugundan dolayi anlamli bir sekilde azaltilmis nosispetif agri yanitlarina sahip olan Tac1 nakavt farelerinin lL-31 tedavisi, ile ölçülebilir. Buna ek olarak, lL-31 ile muamele edilmis farelerde IL-31'in beserilestirilmis lL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri ile nötralizasyonunun pruritusu ve alopesiyi önleyebilip önleyemedigi bu modellerde test edilebilir.

Böylelikle, burada tarif edilen beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya ve/veya kasinmanin inhibisyonu, azaltilmasi, önlenmesi veya bloke edilmesi ile prurigo nodülarisin klinik sonuçlarini iyilestirmek için kullanilabilir.

Cilt-Tropik Virüsleri ve Viral Iliskili pruritig Periferik kandaki Herpes Simpleks Virüsü (HSV)-spesifik CD8+ T hücreleri ve herpes eksprese ederken, cilt-tropik-olmayan herpes virüsü-spesifik CD8+ T hücreleri CLA ekspresyonundan yoksundur. Bakiniz, Koelle D.M. et al., J Clin Invest: 110, 537 (2002). HSV-2 reaktif CD4+ T Ienfositleri de CLA eksprese eder, ancak bu ekspresyon daha önceden CD8+ T lenfositlerinde gözlenene kiyasla daha düsük düzeylerdedir. enfeksiyonlari ile de iliskilidir (Bakiniz, Hung K.Y. et al., Blood Purif: 16, 147 (1998).

Buna ragmen, HIV gibi diger viral hastaliklar da pruritik cilt lezyonlari ile iliskilidir.

Siddetli, inatçi, siklikla eritematopapüller cilt lezyonlari ve hipereozinofili ile iliskili olan, pruritus bazi atopik-olmayan, HIV ile enfekte olmus hastalarda gözlenen bir Milazzo F., Piconi S. et al., Allergy: 54, 266 (1999).

Cilt-tropik virüslerin pruritus ve CLA+ T hücreleri ile iliskisi, IL-31 üreten hücrelerin viral enfeksiyonlarin patofizyolojisine dâhil edilebildigini öne sürer.

Böylelikle, burada tarif edilen beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya ve/veya kasinmanin inhibisyonu, azaltilmasi, önlenmesi veya bloke edilmesi ile cilt- tropik virüsler ile iliskili pruritusun klinik sonuçlarini iyilestirmek Için kullanilabilir.

Dahasi, enflamasyon bir organizma tarafindan bir istila eden ajani defetmek için bir koruyucu yanittir. Enflamasyon, çok sayida hücresel ve hümoral mediyatörü içeren bir kaskadlama olayidir. Bir taraftan, enflamatuvar yanitlarin baskilanmasi, bir konagi immün-yetmez hâlde birakabilir; bununla birlikte, kontrol edilmeden birakildiginda, enflamasyon kronik enflamatuvar hastaliklari (örnegin, romatoid artriti, multipl sklerozu, enflamatuvar bagirsak hastaligini ve benzerlerini), septik soku ve çoklu organ yetmezligini içeren ciddi komplikasyonlara yol açabilir. Önemli olarak, bu çesitli hastalik durumlar, ortak enflamatuvar mediyatörleri paylasir. Enflamasyon ile karakterize edilen kolektif hastaliklar, insan morbiditesi ve mortalitesi üzerinde büyük bir etkiye sahiptir.

Bunan dolayi, anti-enflamatuvar antikorlarin ve baglama polipeptitlerinin, örnegin, burada tarif edilen anti-IL-31 antikorlarinin ve baglama polipeptitlerinin, astim ve alerjiden otoimmünite ve septik soka kadar çok sayida insan ve hayvan hastaligi için elzem terapötik potansiyele sahip olabilecegi açiktir. Böylelikle, burada tarif edilen anti- enflamatuvar anti IL-31 antikorlarinin ve baglama polipeptitlerinin kullanilmasi, burada tarif edilen IL-31 antagonistleri gibi, özellikle hastaliklarda, örnegin, artritte, endotoksemide, enflamatuvar bagirsak hastaliginda, psöriyaziste, ilgili hastalikta ve benzerlerinde, terapötik olarak kullanilabilir. 1. Artrit Osteoartriti, romatoid artriti, yaralanmanin bir sonucu olarak artritik eklemleri ve benzerlerini içeren artrit, anti-enflamatuvar antikorlarin ve baglama polipeptitlerinin, örnegin, mevcut bulusun anti-IL-31 antikorlarinin ve baglama polipeptitlerinin, terapötik kullanimindan yarar görecek olan yaygin enflamatuvar rahatsizliklardir. Örnegin, romatoid artrit (RA), tüm vücudu etkileyen bir sistemik hastaliktir ve artritin en yaygin formlarindan biridir. Bu, agriya, seitlige, hararete, kizarikliga ve sismeye neden olan eklem astar membraninin enflamasyonu ile karakteriz edilir. Enflamatuvar hücreler kemigi ve kikirdagi sindirebilen enzimleri salar. Romatoid artritin bir sonucu olarak, iltihapli eklem astari, sinoviyum, kemigi ve kikirdagi istila edebilir ve kemige ve kikirdaga zarar verebilir, bu diger fizyolojik etkiler arasinda eklem bozulmasina ve siddetli agriya yol açar. Tutulmus eklem, seklini ve hizalanmasini kaybedebilir, bu agri ve hareket kaybi ile sonuçlanir.

Romatoid artrit (RA), özellikle enflamasyon ve siddetli engellilige ve arttirilmis mortaliteye yol açan müteakip doku hasari ile karakterize bir immün-aracilik hastaliktir. Çesitli sitokinler romatoid eklemlerinde lokal olarak üretilir. Çok sayida çalisma, IL-1'in ve TNF-alfa'nin, iki prototipik pro-enflamatuvar sitokin, sinoviyal enflamasyona ve progresif eklem yikimina dâhil edilen mekanizmalarda önemli bir rol oynar. Gerçekte, RA'si olan hastalarda TNF-alfa'nin ve IL-1 inhibitörlerinin uygulanmasi enflamasyonun klinik ve biyolojik bulgularinin dramatik bir iyilestirilmesine ve kemik erozyonunun ve kikirdak yikiminin radyolojik bulgularinin bir düsüsüne yol açmistir. Bununla birlikte, bu cesaret verici sonuçlara ragmen, hastalarin anlamli bir yüzdesi bu ajanlara yanit vermez, bu diger mediyatörlerin de artritin patofizyolojisine dâhil edildigini öne sürer olabilir ve IL-31'i baglayan veya inhibe eden tarzda bir molekül, örnegin, anti IL-31 antikorlari veya baglama partnerleri, romatoid artritte ve diger artritik hastaliklarda enflamasyonu azaltmak için bir degerli terapötik görevi görebilir.

Romatoid artrit için teknikte bilinen bir kaç hayvan modeli vardir. Örnegin, kollajen- indüklü artrit (CIA) modelinde, fareler insan romatoid artritine yakindan benzeyen kronik enflamatuvar artrit gelistirir. CIA, RA ile benzer immünolojik ve patolojik özellikler paylastigindan, bu, bunu potansiyel insan anti-enflamatuvar bilesiklerini taramak için ideal bir model yapar. Gerçeklesmesi hem bir immün yanita hem de bir enflamatuvar yanita bagli olan CIA modeli farelerde iyi-bilinen bir yöntemdir. immün yanit, antijen olarak verildiginde, kollajene yanitta B-hücrelerinin ve CD4+ T-hücrelerinin etkilesimini içerir ve anti-kollajen antikorlarinin üretilmesine yol açar. Enflamatuvar faz, farenin natif kollajeni ile çapraz-reaksiyona giren ve kompleman kaskadini aktive eden bu antikorlarin bazilarinin bir sonucu olarak, enflamasyon mediyatörlerinden doku yanitlarinin sonucudur. CIA modelini kullanmadaki bir avantaj, patojenezin temel mekanizmalarinin bilinmesidir. Tip II kollajen üzerindeki ilgili T-hücresi ve B-hücresi epitoplari tanimlanmistir ve Immün-aracili artrit ile iliskili çesitli immünolojik (örnegin, geciktirilmis-tip hipersensitivite ve anti-kollajen antikoru) ve enflamatuvar (örnegin, sitokinler, kemokinler ve matriks-parçalayan enzimler) parametreler belirlenmistir ve böylelikle bunlar CIA modelinde test bilesigi etkinligini degerlendirmek için kullanilabilir 1995) Immün ve enflamatuvar yaniti modüle eden bir molekül olarak, lL-31 romatoid artritin patojenezinde gösterilen, SAA üretimini indükleyebilir. Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri, SAA aktivitesini in vitro ve in vivo azaltabilir, lL-31 antijen baglama moleküllerinin veya IL-31 antagonistlerinin sistemik veya lokal uygulamasi, RA'da enflamatuvar yaniti potansiyel olarak baskilayabilir. 2. Endotoksemi Endotoksemi, yaygin olarak enfeksiyöz ajanlardan, örnegin, bakterilerden ve baska enfeksiyöz hastalik ajanlarindan, sepsisten, toksik sok sendromundan kaynaklanan veya firsatçi enfeksiyonlara maruz birakilan immün-yetmezligi olan hastalarda ve benzeri, siddetli bir rahatsizliktir. Terapötik olarak yararli anti-enflamatuvar antikorlari ve baglama polipeptitleri, örnegin, mevcut bulusun anti-IL-31 antikorlari ve baglama polipeptitleri, insanlarda ve hayvanlarda endotoksemiyi önlemeye ve tedavi etmeye yardimci olabilir. Diger potansiyel terapötikler, IL-31RA polipeptitlerini, çözünebilen heterodimerik ve multimerik reseptör polipeptitlerini içerir veya mevcut bulusun anti IL- 31 antikorlari veya baglama partnerleri ve benzerleri endotoksemiyede enflamasyonu ve patolojik etkileri azaltmak için bir degerli terapötik görevi görebilir.

Lipopolisakkarit (LPS) indüklü endotoksemi, enfeksiyöz hastaliklarda patolojik etkiler üreten pro-enflamatuvar mediyatörlerin çogunu iliskilendirir ve kemirgenlerde LPS indüklü endotoksemi, yaygin bir sekilde kullanilir ve potansiyel pro-enflamatuvar veya immüno-modüle eden ajanlarin farmakolojik etkilerini çalismak için kabul edilebilir bir modeldir. Gram-negatif bakterilerde üretilen LPS; septik sokun patojenezinde bir majör nedensel ajandir (Glausner et al., Lancet 338:?32, 1991). Bir sok-benzeri hâl gerçekten hayvanlara bir tek LPS enjeksiyonu ile deneysel olarak indüklenebilir. LPS'ye yanit veren hücreler tarafindan Üretilen moleküller, dogrudan veya dolayli olarak patojenleri hedef alabilir. Bu biyolojik yanitlarin konagi istila eden patojenlere karsi korumasina ragmen, bunlar ayrica zarar da neden olabilir. Böylelikle, siddetli Gram-negatif bakteriyel enfeksiyonun bir sonucu olarak gerçeklesen, dogustan immünitenin masif stimülasyonu sitokinlerin ve diger moleküllerin asiri üretilmesi ve ates, hipotansiyon, dissemine intravasküler koagülasyon ve çoklu organ yetmezligi ile karakterize edilen bir fatal sendrom, septik sok sendromu, gelismesine yol açar (Dumitru et al., Cell LPS'nin bu toksik etkileri çogunlukla, çok sayida enflamatuvar mediyatörün salimina yol açan makrofaj aktivasyonu ile ilgilidir. Bu mediyatörler arasinda, nötralize etme anti- TNF antikorlarinin uygulanmasi ile LPS toksisitesinin önlenmesi ile gösterildigi üzere, C57BI/6 fareye 1 pg E. coli LPS enjeksiyonunun enjeksiyondan yaklasik olarak 2 saat sonra dolasimdaki IL-6'da, TNF-alfa'da, IL-1'de ve akut faz proteinlerinde (örnegin, SAA'da) anlamli artislar ile sonuçlanacagi iyi belirlenmistir. Bu mediyatörlere karsi pasif immünizasyon azaltilmis mortalite ile sonuçlanabileceginden, LPS'nin toksisitesine bu Septik sokun önlenmesi ve/veya tedavisi için potansiyel immüno-müdahale stratejileri, anti-TNF mAb'yi, lL-1 reseptörü antagonistini, LIF'i, IL-10'u ve G-CSF'yi içerir. LPS büyük olasilikla endotokseminin patolojisine katkida bulunan pro-enflamatuvar faktörlerin üretilmesini indüklediginden, lL-31 aktivitesinin, SAA'nin ve diger pro- enflamatuvar faktörlerin antagonize eden lL-31 polipeptidi ile nötralizasyonu endotokseminin, örnegin, endotoksik sokta görülen, semptomlarini azaltmak için kullanilabilir. Diger potansiyel terapötikler, beserilestirilmis lL-31 antijen baglama moleküllerini veya IL-31 antagonistlerini içerir. 3. Enflamatuvar Bagirsak Sendromu, IBD Enflamatuvar Bagirsak Sendromu (IBD), kolonu veya rektumu (Ülseratif kolit) veya her ikisini, ince ve kalin bagirsagi (Crohn Hastaligi) etkileyebilir. Bu hastaliklarin patojenezi belli degildir, ancak bunlar etkilenen dokularin kronik enflamasyonunu içerir. Potansiyel terapötikler, IL-31RA polipeptitlerini, çözünebilen heterodimerik ve multimerik reseptör polipeptitlerini içerir veya mevcut bulusun anti-lL-31 antikorlari veya baglama partnerleri ve benzerleri IBD'de ve ilgili hastaliklarda enflamasyonu ve patolojik etkileri azaltmak için bir degeri terapötik görevi görebilir.

Crohn Hastaligi'nda kronik enflamasyon ve ülserasyon genel olarak, ince bagirsak ile ilgili obstrüksiyon veya akut apandisiti taklit edebilen abdominal agri ile basar; diger sunumlar bunun komplikasyonlari ile ilgili olabilir. Hastaligin seyri kroniktir ve terapiye ragmen alevlenmeler ve remisyonlar olabilir. Baslangiç genellikle, tüm olgularin baslamasi ile, erken eriskin yasamda olur. Kadinlara kiyasla erkekler biraz daha fazla etkilenir.

Mikroskopi, kaba görünüsleri yansitir. Enflamasyon tutulumu, araliklidir; bu fokal veya yamali olabilir. Lenfositlerin ve plazma hücrelerinin koleksiyonlari, genel olarak tüm katmanlari (transmüral enflamasyon) etkileyerek, agirlikli olarak mukozada ve submukozada bulunur. Crohn Hastaligi'nin klasik mikroskobik özelligi, Ienfositlerin bir manseti ile çevrelenmis granül hücrelerinin varligidir. Idiyopatik enflamatuvar bagirsa hastaliklarinin insidansi, kayda deger cografik varyasyon gösterir. Bu hastaliklar, artan sehirlesmenin ve refahin güney Avrupa ve Japonya kisimlarinda daha yüksek bir insidansa yol açmasina ragmen, güney Avrupa'ya, Afrika'ya, Güney Amerika'ya ve Asya'ya kiyasla kuzey Avrupa'da ve Amerika Birlesik Devletleri'nde çok daha yüksek bir insidansa sahiptir (General and Systematic Pathology, Churchill Livingstone, 3rd edition .

Crohn Hastaligi'nda, klinik olarak iki ana grup vardir, birincisi hastaligi baslangicin üçüncü yili ile kalici remisyona giren hastalari içerir, ikincisi üç yilin ötesinde devam eden hastaligi olan hastalari içerir.

Etiyolojisi ne olursa olsun, pro-enflamatuvar sitokinlerin, özellikle interlökinler (IL) 1, 2, 6 ve 8'in Interferon (IFN)- ve Tümör Nekroz Faktörü'nün (TNF) arttirilmis üretimi ile Crohn Hastaligi'nda persistans ve uygun olmayan T-hücresi ve makrofaj aktivasyonu bulgusu vardir. Crohn hastaligi, fibrözün eslik ettigi sürdürülmüs (kronik) enflamasyon ile karakterize edilir. Fibroblastik proliferasyonun ve kollajen depolanmasinin prosesine, belirli anti-enflamatuvar etkilere, yani fibroblast geri-çagrilmasina, matriks sentezine ve enflamatuvar hücrelerin asagi yönde regülasyonuna sahip olan transforme eden büyüme faktörü tarafindan aracilik edilebilir, ancak çok sayida baska mediyatörün de gösterilecek olmasi olasidir. Ülseratif kolit (UC), yaygin olarak kolon denilen, kalin bagirsagin, kolonun mukozasinin ve en iç astarinin enflamasyonu ve ülserasyonu ile karakterize edilen bir enflamatuvar hastaliktir. Bu enflamasyon kolonun, diyareye yol açan, siklikla bosaltilmasina neden olur. Semptomlar, diskinin gevsemesine ve ilgili abdominal kramplari, atesi ve kilo kaybini içerir. UC'nin tam nedeninin bilinmemesine ragmen, yakin tarihli arastirmalar, vücudun dogal savunmalarinin vücut içinde vücudun yabanci oldugunu düsündügü proteinlere karsi çalistigini (bir "otoimmün reaksiyon") öne sürer. Belki, bunlar bagirsaktaki bakteriyel proteinlere benzediginden, bu proteinler kolonun astarinin yikilmasini baslayan enflamatuvar prosesi tesvik edebilir veya stimüle edebilir. Kolonun astari yikildikça, mukus, iltihap ve kan kalan ülserler olusur. Hastalik genellikle, rektal alanda baslar ve nihayetinde tüm kalin bagirsak boyunca yayilabilir. Enflamasyonun tekrarli epizotlari, ince bagirsak ve rektum duvarinin skar dokusu ile kalinlasmasina yol açar. Kolon dokusunun ölümü veya sepsis siddetli hastalik ile gerçeklesebilir. Ülseratif kolitin semptomlari, siddet açisindan çesitlilik gösterir ve bunlarin baslangici kademeli veya ani olabilir. Ataklar respiratuvar enfeksiyonlari veya stresi içeren çok sayida faktör ile provoke edilebilir.

UC için güncel olarak mevcut kür olmamasina ragmen, tedaviler kolon astarinda anormal enflamatuvar prosesin baskilanmasina odaklandirilir. Kortikosteroid immünosüpresifleri (örnegin, azatiyoprini, merkaptopürini ve metotreksati) ve aminosalisilatlari içeren tedaviler hastaligi tedavi etmek için mevcuttur. Bununla birlikte, immünosüpresiflerin, örnegin, kortikosteroidlerin ve .sizatiyoprinini uzun-süreli kullanimi, kemiklerin incelmesini, kataraktlari, enfeksiyonu ve karaciger ve kemik iligi etkilerini içeren ciddi yan etkiler ile sonuçlanabilir. Güncel terapileri basarili olmayan hastalarda, cerrahi bir opsiyondur. Cerrahi, tüm kolonun ve rektumun çikarilmasini içerir.

Kronik ülseratif koliti kismen taklit edebilen bir kaç hayvan modeli vardir. En yaygin sekilde kullanilan model, kolonda kronik enflamasyonu ve ülserasyonu indükleyen, indüklü kolit modelidir. TNBS intra-rektal instilasyon ile duyarli farelerin kolonlarina uygulandiginda, bu kolonik mukozada T- hücresi aracili immün yanit indükler, bu durum kalin bagirsagin tüm duvari boyunca T- hücrelerinin ve makrofajlarin yogun infiltrasyonu ile karakterize edilen bir masif mukozal enflamasyona yol açar. Dahasi, bu histopatolojik tabloya progresif kilo kaybi (asiri zayiflama), kanli diyare, rektal prolaps ve kalin bagirsak duvari kalinlasmasi klinik Bir baska kolit modeli, kanli diyare, kilo kaybi, kolon kisalmasi ve nötrofil infiltrasyonu ile mukozal ülserasyon ile kendini gösteren bir akut koliti indükleyen dekstran sülfat sodyum (DSS) kullanir. DSS-indüklü kolit, Ienfoid hiperplazi, fokal kript hasari ve epitelyal ülserasyon ile, enflamatuvar hücrelerin Iamina propriya içine infiltrasyonu ile histolojik olarak karakterize edilir. Bu degisimlerin, DSS'nin epitelyum üzerindeki bir toksik etkisinden ve Iamina propriya hücrelerinin fagositozu ve TNF-alfa ve IFN-gama üretilmesi ile gelistigi düsünülür. Bunun yaygin kullanimina ragmen, insan hastaligi ile ilgililik hakkinda DSS mekanizmalarina iliskin bir kaç mesela çözülmeden kalmistir.

DSS, bu T hücresi-kusurlu hayvanlarda, örnegin, SCID farelerinde, gözlendiginden, bir T hücresi-bagimsiz model olarak addedilir.

Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama moleküllerinin veya IL-31 antagonistlerinin bu TNBS veya DSS modellerine uygulanmasi, semptomlari iyilestirmek ve gastrointestinal hastaligin seyrini degistirmek amaciyla IL-31 antagonistlerinin kullanimini degerlendirmek için kullanilabilir. IL-31 kolitte enflamatuvar yanitta bir rol oynayabilir ve beserilestirilmis lL-31 antijen baglama moleküllerini veya IL-31 antagonistlerini uygulama ile IL-31 aktivitesinin nötralizasyonu IBD için bir potansiyel terapötik yaklasimdir. 4. Psöriyazis Psöriyazis, yedi milyondan fazla Amerikaliyi etkileyen bir kronik cilt rahatsizligidir.

Psöriyazis, yeni cilt hücreleri anormal olarak büyüdügünde, bu iltihapli, sismis ve eski cilt yeteri kadar çabuk dökülmediginde görülen cildin pullu yamalari ile sonuçlandiginda, gerçeklesir. Plak psöriyazis, en yaygin form, en üstünde gümüsümsü beyaz renkli pullar bulunan iltihapli cilt yamalari ("Iezyonlar") ile karakterize edilir.

Psöriyazis, en yaygin olarak kafatasinda, dizlerde, dirsekte ve gövdede görülen, bir kaç plak ile sinirlandirilabilir veya cildin orta ila genis alanlarini tutabilir. Bunun hayli görülebilir olmasina ragmen, psöriyazis bulasici bir hastalik degildir. Hastaliklarin patojenezi, etkilenen dokularin kronik enflamasyonunu içerir. Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri, psöriyaziste, baska enflamatuvar cilt hastaliklarinda, cilt alerjilerinde ve mukozal alerjilerde ve ilgili hastaliklarda, enflamasyonu ve patolojik etkileri azaltmak için bir degerli terapötik görevi görebilir.

Psöriyazis, cildin, kayda deger ölçüde rahatsizliga neden olabilen, bir T-hücresi aracili enflamatuvar bozuklugudur. Bu, bunun için kürün olmadigi bir hastaliktir ve tüm yaslardaki insanlari etkiler. Psöriyazis Avrupa ve Kuzey Amerika popülasyonlarinin yaklasik olarak yüzdesi ikisini etkiler. Hafif-derecede psöriyazisi olan bireylerin siklikla topikal ajanlar ile hastaliklarini kontrol edebilmesine ragmen, dünya genelinde bir milyondan fazla hasta ultraviyole terapisine veya sistemik immünosüpresif terapiye ihtiyaç duyar. Maalesef, ultraviyole radyasyonun uygunsuzlugu ve riskleri ve çok sayida terapinin toksisitesi, bunlarin uzun-süreli kullanimini sinirlandirilir. Dahasi, hastalar genel olarak psöriyazis reküransina sahiptir. lL-31, önemli immünolojik fonksiyona sahip oldugu bilinen ve immün sistemde bir rol oynayan hücreler içeren dokudan izole edilmistir. lL-31, CD3+ seçilmis, aktive edilmis periferik kan hücrelerinde eksprese edilir ve IL-21 ekspresyonunun T hücresi aktivasyonundan sonra arttigi gösterilmistir. Dahasi, beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri m0nositlerin/makrofajlarin, T- hücrelerinin, B-hücrelerinin, NK hücrelerinin ve/veya monositlerin/makrofajlarin, T- hücrelerinin, B-hücrelerinin, NK hücrelerinin farklilasmis hâlinin veya bu hücrelerin progenitörlerinin büyümesi/genislemesi üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Hem hemotopoietik progenitörlerin proliferasyonunu stimüle eden hem de matür hücreleri aktive eden faktörler genel olarak bilinir; bununla birlikte, proliferasyon ve aktivasyon ayrica ilave büyüme faktörleri de gerektirebilir. Örnegin, IL-7'nin ve Steel Faktörü'nün (c-kit Iigandinin) NK progenitörlerinin koloni olusumu için gerekli oldugu gösterilmistir. ve/veya NK progenitörlerinin spesifik alt-kümelerinin proliferasyonu için elzem olabilir diger sitokinler ile birlikte veya sinerji içinde monositlerin/makrofajlarin, T-hücrelerinin, B-hücrelerinin veya NK hücrelerinin büyümesini, proliferasyonunu, genislemesini ve farklilasmasinin modifikasyonunu arttirmak için etki edebilir.

Mevcut açiklama, enflamatuvar ve immün hastaliklarda veya rahatsizliklarda, örnegin, atopik dermatitte, pruritik hastaliklarda, pankreatitte, tip I diyabette (IDMM), pankreatik kanserde, pankreatitte, Graves Hastaligi'nda, enflamatuvar bagirsak hastaliginda (IBD), Crohn Hastaligi'nda, kolon ve ince bagirsak kanserinde, divertikülozda, otoimmün hastalikta, sepsiste, organ ve kemik iligi naklinde; travmadan, cerrahiden veya enfeksiyondan kaynaklanan enflamasyonda; amiloidozda; splenomegalide; graft versus host hastaliginda ve hematopoietik, immün, enflamatuvar veya Ienfoid hücrelerin, makrofajlarin, (Th1 ve Th2 hücreleri, CD4+ ve CD8+ hücreleri dâhil olmak üzere) T-hücrelerinin enflamasyonunun inhibisyonunda, immün baskilanmasinda, proliferasyonunun azaltilmasinda, bir patojene veya antijene immün yanitin baskilanmasinda, antagonistler olarak beserilestirilmis lL-31 antijen baglama moleküllerinin veya IL-31 antagonistlerinin kullanilmasina dogru yönlendirilir. Dahasi, aktive edilmis immün hücrelerde, örnegin, aktive edilmis CD4+ ve CD19+ hücrelerinde, lL-31 RA ekspresyonunun varligi, IL-31RA reseptörünün yabanci istilacilara, örnegin, mikroorganizmalara ve hücre debrisine, karsi vücudun immün savunmaci reaksiyonlarina dâhil edilebildigini ve enflamasyon ve kanser olusumu sirasinda immün yanitlarda bir rol oynayabilecegini göstermistir. Böylelikle, mevcut açiklamanin, IL- 31RA reseptörü fonksiyonuna agonistik veya antagonistik olan antikorlari ve baglama partnerleri, örnegin, IL-31, immün yaniti ve enflamasyonu modifiye etmek için kullanilabilir.

Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri ayrica, ll- 31'in dolasimdaki düzeylerini saptamak için tanisal sistemlerde de kullanilabilir. Ilgili bir uygulamada, IL-31 polipeptitlerini spesifik olarak baglayan antikorlar veya diger ajanlar, dolasimdaki lL-31 polipeptitleri saptamak için kullanilabilir. Ligand polipeptitlerinin yükselmis veya düsürülmüs düzeyleri, kanseri içeren patolojik kosullarin göstergesi olabilir. IL-31 polipeptitleri, patolojik proseslere katki saglayabilir ve altta yatan bir hastaligin dolayli bir belirteci olabilir.

Aterosklerotik Iezyonlarda, ilk anormalliklerin biri, monositin/makrofajlarin endotelyal hücrelere Iokalizasyonudur. Bu lezyonlar, IL-31 için antagonistlerin kullanilmasi ile önlenebilir. Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri, aterosklerotik Iezyonlarda lL-31'in antagonistleri olarak kullanilabilir. Dahasi, monoblastik lösemi, makrofajin biyolojik ürünlerinin salimini yansitan çesitli klinik anormallik ile iliskilidir, örnekler serum ve idrar içinde yüksek Iizozim düzeylerini ve yüksek atesleri içerir. Dahasi, bu tarz Iösemiler, monositik hücrelerin anormal bir artisini gösterir. Bu etkiler büyük olasilikla, lL-31 için antagonistler, örnegin, burada tarif edilenler, ile önlenebilir. Dahasi, beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya lL-31 antagonistleri, lösemi monositik hücrelerinin öldürülmesini yönlendirmek için burada tarif edildigi üzere moleküllere, örnegin, toksik kisimlara ve sitokinlere, konjuge edilebilir. lL-31'in, aktive edilmis mononükleer hücrelerde eksprese edildigi gösterilmistir ve IL- 31, enflamasyonu regüle etmeye dâhil edilebilir. Böylelikle, mevcut açiklamanin polipeptitleri bunlarin enflamasyonu modifiye etme yetisi için analiz edilebilir ve kullanilabilir veya enflamasyon için bir belirteç olarak kullanilabilir. IL-31'in pro- enflamatuvar ve anti-enflamatuvar kalitelerini belirlemek için yöntemler teknikte bilinir ve burada tartisilir. Dahasi, bu, akut faz reaktantlarinin, örnegin, serum amiloid A'nin (SAA), oi1-antikimotripsinin ve haptoglobinin, üretilmesini yukari yönde regüle etmeye dâhil edilebilir ve lL-31RA reseptör ligandinin bu ekspresyonu, enflamatuvar yanita dâhil edilen Iipopolisakkaritin (LPS) enjeksiyonu üzerine in vi'vo aittirilabilir (Dumoutier, SAA'nin, üretilmesi, enflamasyonun yararli oldugu kisa-süreli sag kalim mekanizmasi olarak düsünülür; bununla birlikte, aut faz proteinlerinin daha uzun periyotlar boyunca idamesi, kronik enflamasyona katki saglar ve insan sagligi için zararli olabilir. Inceleme proteini SAA, bir kaç kronik enflamatuvar hastaligin patojenezinde gösterilir, aterosklerozda ve romatoid artritte gösterilir ve amiloidozda depolanmis amiloid A proteini için öncüldür (Uhlar, CM ve Whitehead, w). Böylelikle, bir Iigand, örnegin, bir pro-enflamatuvar molekül olarak etki eden ve SAA üretimini indükleyen IL-31, durumunda, beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri enflamatuvar hastaligi ve Iigand tarafindan indüklenen akut faz yanit proteinleri ile iliskili diger hastaliklari tedavi etmede yararli olacaktir. Örnegin, enflamasyonu azaltmanin bir yöntemi, enflamasyonu veya kasintisi olan bir memeliye beserilestirilmis enflamasyonu veya kasintiyi azaltmak için yeterli olan bir miktarini uygulamayi içerir.

Dahasi, enflamasyonu olan bir memelide bir enflamatuvar yaniti baskilamanin bir yöntemi asagidakileri içerebilir: (1) serum amiloid A proteininin bir düzeyini belirleme; (2) burada tarif edildigi üzere bir beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya uygulama; (3) serum amiloid A proteininin bir uygulama sonrasi düzeyini belirleme; (4) adim (1)'deki serum amiloid A proteininin düzeyini adim (3)'teki serum amiloid A proteininin düzeyi ile karsilastirma, burada serum amiloid A proteini düzeyinde bir artis olmamasi veya bir düsüs olmasi, bir enflamatuvar yaniti baskilamanin göstergesidir.

Bunun lL-31RA reseptörü cDNA'sina karsilik gelen mRNA doku dagilimi, mRNA düzeyinin monositlerde ve prostat hücrelerinde en yüksek oldugunu ve aktive edilmis monositlerde ve aktive edilmis CD4+, aktive edilmis CD8+ ve aktive edilmis CDß+ hücrelerinde yükselttigini göstermistir. Bundan dolayi, IL-31 reseptörü ayrica, enflamatuvar ve immün yaniti indüklemede de gösterilir. Böylelikle, mevcut açiklamanin özel uygulamalari, enflamatuvar ve immün hastaliklarda veya rahatsizliklarda, örnegin, pankreatitte, tip I diyabette (lDMM), pankreatik kanserde, pankreatitte, Graves Hastaligi'nda, enflamatuvar bagirsak hastaliginda (IBD), Crohn Hastaligi'nda, kolon ve ince bagirsak kanserinde, divertikülozda, otoimmün hastalikta, sepsiste, organ ve kemik iligi naklinde; travmadan, cerrahiden veya enfeksiyondan kaynaklanan enflamasyonda; amiloidozda; splenomegalide; graft versus host hastaliginda ve hematopoietik, immün, enflamatuvar veya Ienfoid hücrelerin, makrofajlarin, (Th1 ve Th2 hücreleri, CD4+ ve CDS+ hücreleri dâhil olmak üzere) T- hücrelerinin enflamasyonunun inhibisyonunda, immün baskilanmasinda, proliferasyonunun azaltilmasinda, bir patojene veya antijene immün yanitin baskilanmasinda, beserilestirilmis lL-31 antijen baglama moleküllerinin veya IL-31 antagonistlerinin kullanilmasina dogru yönlendirilir. Dahasi, aktive edilmis immün hücrelerde, örnegin, aktive edilmis CD3+ hücrelerinde, monositlerde, CD4+ ve CD19+ hücrelerinde, II-31RA reseptörünün ve IL-31 ekspresyonunun varligi, IL-31RA reseptörünün yabanci istilacilara, örnegin, mikroorganizmalara ve hücre debrisine, karsi vücudun immün savunmaoi reaksiyonlarina dâhil edilebildigini ve enflamasyon ve kanser olusumu sirasinda immün yanitlarda bir rol oynayabilecegini göstermistir.

Böylelikle, mevcut açiklamanin, IL-31RA reseptörü fonksiyonuna agonistik veya antagonistik olan beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri, immün yaniti ve enflamasyonu modifiye etmek için kullanilabilir.

Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri asagidakiler için yararlidir: 1) Akut enflamasyon, travmanin, doku yaralanmasinin, cerrahinin, sepsisin veya enfeksiyonun bir sonucu olarak enflamasyon ve kronik enflamatuvar hastaliklar, örnegin, astim, enflamatuvar bagirsak hastaligi (IBD), kronik kolit, splenomegali, romatoid artrit, reküran akut enflamatuvar epizodlar (örnegin, tüberküloz) tedavisinde ve amiloidoz ve ateroskleroz, Castleman Hastaligi, astim ve akut faz yanitin indüksiyonu ile iliskili diger hastaliklarin tedavisinde IL- 31 RA-içeren reseptörler vasitasiyla sinyallemeyi antagonize etme veya bloke monositlerde, lökositlerde) sinyallemeyi önlemek veya inhibe etmek için otoimmün hastaliklar, örnegin, IDDM, multipl skleroz (MS), sistemik Lupus eritematöz (SLE), miyastenia gravis, romatoid artrit ve IBD tedavisinde lL-31 RA reseptörü reseptörleri vasitasiyla sinyallemeyi antagonize etme ve bloke etme örnegin, lL-31 için monoklonal antikorlar (MAb), ayrica otoimmün hastaligi tedavi etmek için istenmeyen immün hücreleri tüketmek için bir antagonist olarak da kullanilabilir. Astim, alerji ve baska atopik hastalik, immün yaniti inhibe etmek için veya sorun yaratan hücreleri tüketmek için, örnegin, anti-IL-31 antikorlarina, çözünebilen lL-31RA reseptörü çözünebilen reseptörlerine veya vasitasiyla sinyallemeyi, mevcut bulusun polipeptitlerini ve antikorlarini kullanarak, bloke etme veya inhibe etme ayrica, pankreas, böbrek, pituiter ve nöronal hücrelerin hastaliklarina da yararli olabilir. IDDM, NIDDM, pankreatit ve pankreatik karsinom yararli olabilir. IL-31RA, kanserin MAb terapisi için bir hedef görevi görebilir, burada bir antagonize etme MAb'si, kanser büyümesini inhibe eder ve immün-aracin öldürmeyi hedef alir (Holliger P, ve Hoogenboom, monomerleri, homodimerleri, heterodimerleri ve multimerleri için Mab'ler ayrica, nefropatileri, örnegin, glomerülosklerozu, membranöz nöropatiyi, (ayrica, diger dokular arasinda böbregi de etkileyen) amiloidozu, renal arteriyosklerozu, çesitli orijinli glomerülonefriti, böbregin fibroproliferatif hastaliklarini ayni zamanda SLE ile iliskili böbrek fonksiyon bozuklugunu, lDDM'yi, tip II diyabeti (NIDDM), renal tümörleri ve diger hastaliklari tedavi etmek için de yararli olabilir.

Genel olarak, uygulanmis beserilestirilmis IL-31 antijen baglama moleküllerinin veya IL- 31 antagonistlerinin dozaji, hastanin yasi, kilosu, boyu, cinsiyeti, genel tibbi durumu ve önceki tibbi öyküsü gibi faktörlere bagli olarak çesitlilik gösterecektir. Tipik olarak, daha düsük veya daha yüksek bir dozajin da kosullarin dikte ettigi üzere uygulanabilmesine ragmen, aliciya yaklasik 1 pg/kg ila 10 mg/kg araliginda (ajanin miktari/hastanin vücut agirligi) olan bir IL-31 polipeptit dozaji saglamak arzu edilebilir. Teknikte uzmanligi olan bir kisi, teknikte bilinen yöntemleri kullanarak, bu tarz dozajlari ve bunlara ayarlamalari kolaylikla belirleyebilir.

Bir süjeye beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri uygulanmasi, tpoikal, solunmus, intravenöz, intraarteriyel, intraperitoneal, intramüsküler, subkütan, intrapevral, intratekal olabilir, bir bölgesel kateter yoluyla perfüzyon ile veya dogrudan intra-Iezyonel enjeksiyon ile olabilir. Enjeksiyon ile terapötik proteinler uygulandiginda, uygulama sürekli infüzyon ile veya tek veya çoklu boluslar ile olabilir.

Uygulamanin ilave yollari, oral, mukozaI-membran, pulmoner ve transkütanöz yollari içerir. Oral aktarim, poliester mikro-küreler, zein mikro-küreler, proteinoid mikro-küreler, polisiyanoakrilat mikro-küreler ve Iipit-bazli sistemler için uygundur (bakiniz, örnegin, DiBase ve Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins," in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages .

Bir intranazal aktarimin uygulanabilirligi, bu tarz bir insülin uygulama modu ile örneklendirilir (bakiniz, örnegin, Hinchcliffe ve Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)). IL-31 içeren kuru veya sivi parçaciklar, hazirlanabilir ve kuru-toz dagiticilar, sivi aerosol üreticiler veya nebülizörler yardimiyla solunabilir (örnegin, Pettit ve Bu yaklasim, aerosolize edilmis insülini akcigerlere aktaran bir tasinabilir elektronik solunum cihazi olan AERX diyabet yönetim sistemi ile açiklanir. Çalismalar, 48.000 kDa kadar büyük olan proteinler transkütanöz uygulamanin uygulanabilirligini gösteren, düsük-frekansli ultrason yardimiyla terapötik konsantrasyonlarda cildi geçerek kullanilarak transdermal aktarim, lL-31 baglama aktivitesine sahip olan bir molekülü uygulamak için bir baska araç saglar (Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)). lL-31 baglama aktivitesine sahip olan beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri içeren bir farmasötik bilesim, farmasötik olarak yararli bilesimler hazirlamak için bilinen yöntemlere göre formüle edilebilir, böylece terapötik proteinler bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici ile bir karisim içinde birlestirilir.

Bir bilesimin, bunun uygulanmasi bir alici hasta tarafindan tolere edilebildiginde, bir bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicinin bir örnegidir. Diger uygun tasiyicilar teknikteki kisiler tarafindan Iyi-bilinir. Bakiniz, örnegin, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995).

Terapi amaçlari için, IL-31 baglama aktivitesine sahip olan moleküller ve bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici, bir hastaya bir terapötik olarak etkili miktarda uygulanir. lL-31 baglama aktivitesine sahip olan bir proteinin, polipeptidin veya peptidin ve bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicinin bir kombinasyonunun, uygulanan miktar fizyolojik olarak anlamli oldugunda, bir "terapötik olarak etkili miktarda" uygulandigi söylenir. Bir ajan, bunun varligi bir alici hastanin fizyolojisinden saptanabilen bir degisim ile sonuçlandiginda, fizyolojik olarak anlamlidir. Örnegin, enflamasyonu tedavi etmek için kullanilan bir ajan, bunun varligi enflamatuvar yanitin en az bir kismini hafiflettiginde, fizyolojik olarak anlamlidir. beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri içeren bir farmasötik bilesim, sivi form içine, bir aerosol içinde veya kati form içinde tedarik edilebilir. Sivi formlar, enjektabl çözeltiler, aerosoller, damlaciklar, topolojik çözeltiler ve oral süspansiyonlar ile açiklanir. Emsal kati formlar, kapsüller, tabletleri ve kontrollü- salim formlarini içerir. Kontrollü-salim formlari, mini-ozmotik pompalar ve implantlar ile açiklanir (Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery," in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (ads), pages 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps," in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages ; Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release lnjectable Implant," in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages . Diger kati formlar, kremleri, macunlari, diger topolojik uygulamalari ve benzerlerini içerir.

Burada açiklanan beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülleri veya IL-31 antagonistleri ayrica, immüno-Iipozomlar olarak da formüle edilebilir. Antikor içeren lipozomlar, teknikte bilinen yöntemler, örnegin, Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

Arttirilmis dolasim süresi olan lipozomlar, 5,013,556 Numarali ABD Patenti'Nde açiklanir.

Lipozomlar, terapötik polipeptitleri bir süjeye intravenöz, intraperitoneal, intratekal, intramüsküler, subkütan olarak veya oral uygulama, inhalasyon veya intranazal uygulama vasitasiyla aktarmak için bir araç saglar. Lipozomlar, sulu kompartimanlari çevreleyen bir veya birden fazla Iipit ikili-katmanindan olusan mikroskopik veziküllerdir (bakiniz, genel olarak, Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 Delivery Using Liposomes as Carriers," in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages . Lipozomlar, bilesim açisindan hücresel membranlara benzer ve bunun bir sonucu olarak, lipozomlar güvenli bir sekilde uygulanabilir ve biyolojik olarak parçalanabilir. Preparasyon yöntemine bagli olarak, lipozomlar unilameler veya multilameler olabilir ve lipozomlar 0,02 pm ila 10 pm'dan daha büyük olan aralikta çaplar ile boyut açisindan çesitlilik gösterebilir. Çesitli ajanlar, ikili-katmanlar içinde lipozomlarzhidrofobik ajanlar bölüntüsü ve iç sulu bosluk (bosluklar) içinde hidrofilik ajanlar bölüntüsü içinde enkapsüle edilebilir (bakiniz, örnegin, Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey boyutunu, ikili-katmanlarin sayisini, Iipit bilesimini ayni zamanda lipozomlarin yük ve yüzey karakteristiklerini çesitlendirme ile enkapsüle edilmis ajanin terapötik kullanilabilirligini kontrol etmek mümkündür. Özel olarak yararli Iipozomlar, fosfatidilkolin, kolesterol ve PEG-türevlendirilmis fosfatidiletanolamin (PEG-PE) içeren bir Iipit bilesimi ile ters faz buharlastirma yöntemi ile üretilebilir. Lipozomlar, arzu edilen çapa sahip olan lipozomlar üretmek için tanimlanan por boyutlu filtreler yoluyla ekstrüze edilir. Mevcut bulusun antikorunun Fab' üzere bir disülfit karsilikli-degisim reaksiyonu vasitasiyla Iipozomlara konjuge edilebilir.

Bir kemoterapötik ajan (örnegin, Doksorubisin), opsiyonel olarak Iipozoma dâhil edilir.

Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama moleküllerinin veya IL-31 antagonistlerinin terapötik formülasyonlari, arzu edilen saflik derecesine sahip olan antikoru opsiyonel fizyolojik olarak kabul edilebilir tasiyici, eksipiyan veya stabilazör ile karistirma ile, liyofilize edilmis formülasyonlar veya sulu çözeltiler formunda saklama için hazirlanir (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). Kabul edilebilir tasiyicilar, eksipiyanlar veya stabilazörler, kullanilan dozajlarda ve konsantrasyonlarda alicilar için toksik-degildir ve tamponlari, örnegin, fosfat, sitrat ve diger organik asitleri; askorbik asidi ve metiyonini içeren antioksidanlari; koruyuculari (örnegin, oktadesildimetilbenzil amonyum klorürü; hekzametonyum klorürü; benzalkonyum klorürü, benzetonyum klorürü; fenolü, bütil veya benzil alkolü; alkil parabenleri, örnegin, metil veya propil parabeni; katekolü; resorsinolü; siklohekzanolü; 3-pentanolü ve m-kresolü); düsük moleküler agirlikli (yaklasik 10 rezidüden daha az olan) polipeptitleri; proteinleri, örnegin, serum albümini, jelatini veya immünoglobülinleri; hidrofilik polimerleri, örnegin, polivinilpirrolidon; amino asitleri, örnegin, glisini, glutamini, asparajini, histidini, arjinini veya lizini; monosakkaritleri, disakkaritleri ve glukozu, mannozu veya dekstrinleri içeren diger karbonhidratlari; selatlama ajanlarini, örnegin, EDTA'yi; sekerleri, örnegin, sükrozu, mannitolü, trehalozu veya sorbitolü; tuz-olusturma karsi-iyonlarini, örnegin, sodyumu; metal komplekslerini (örnegin, Zn-protein komplekslerini) ve/veya iyonik-olmayan sürfaktanlari, örnegin, Tween.TM., Pluronics.TM. veya polietilen glikolü (PEG), içerir.

Buradaki formülasyon ayrica, tedavi edilmekte olan özel endikasyon için gerekli oldugu üzere, birden fazla aktif bilesik, tercihen, birbirini advers bir sekilde etkilemeyen komplementer aktivitelere sahip olanlari, içerebilir. Örnegin. ilaveten bir formülasyon içinde IL-31'i baglayan antikorlar saglamak arzu edilebilir. Alternatif veya ek olarak, bilesim bir kemoterapötik ajan veya bir sitokin içerebilir. Bu tarz moleküller uygun bir sekilde, hedeflenen amaç için etkili olan miktarlarda kombinasyon hâlinde bulunur. standart teknikleri kullanilarak lipOZOmIar içinde enkapsüle edilebilir (bakiniz, örnegin, Technology, 2nd Edition, Vol. III, Gregoriadis (ed.), page , olarak yararli lipozomlar, çesitli bilesenler içerebilir. Örnegin, Iipozomlar poli(etilen glikolün) lipit türevlerini içerebilir (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).

In vivo uygulama için kullanilacak olan formülasyonlar steril olmak zorundadir. Bu, steril filtrasyon membranlari yoluyla filtrasyon ile kolaylikla tamamlanir.

Sürdürülmüs-salimli preparasyonlar hazirlanabilir. Sürdürülmüs-salimli preparasyonlarin uygun örnekleri, antikor içeren kati hidrofobik polimerlerin yari- geçirgen matrikslerini içerir, bu matriksler, sekillendirilmis maddeler, örn., filmler veya mikro-kapsüller, formundadir. Sürdürülmüs-salimli matrikslerin örnekleri, poliesterleri, hidrojelleri (örnegin, poli(2-hidroksietiI-metakrilat) veya poli(vinilalkol)), polilaktitler (, L-glutamik asidin ve gama. etil-L-glutamatin kopolimerlerini, parçalanamayan etilen-vinil asetati, parçalanabilen Iaktik asit-glikolik asit kopolimerlerini, örnegin, Lupron Depot.TM. (laktik asit-glikolik asit kopolimerinden ve Iöprolid asetattan olusan enjektabl mikro-küreleri) ve poIi-D-(-)-3-hidroksibütirik asidi içerir. Polimerler, örnegin, etilen-vinil asetat ve Iaktik asit-glikolik asit 100 günden daha uzun süre boyunca moleküllerin salimina olanak saglarken, belirli hidrojeller daha kisa zaman periyotlari boyunca proteinleri salar. Enkapsüle edilmis antikorlar uzun bir süre boyunca vücut içinde kaldiginda, bunlar 37°C'de neme maruziyetin bir sonucu olarak denatüre olabilir veya çökebilir, bu biyolojik aktivitesinin bir kaybi ve immünojenisitede olmasi degisimler ile sonuçlanir. Makul stratejiler, dâhil edilen mekanizmaya bagli olarak stabilizasyon için tasarlanabilir. Örnegin, agregasyon mekanizmasinin tiyo- disülfit karsilikli-degisimi yoluyla moleküller-arasi S-S bagi olusumu oldugu kesfedildiginde, stabilizasyon sülfidril rezidülerini modifiye etme, asidik çözeltilerden liyofilize etme, nem içerigini kontrol etme, uygun katki maddelerini kullanma ve spesifik polimer matriksi bilesimleri gelistirme ile basarilabilir.

Diger dozaj formlari, örnegin, Ansel ve Popovich tarafindan, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995) ve Ranade ve Hollinger tarafindan, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996), gösterildiginde üzere, teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan tasarlanabilir.

Bir açiklama olarak, farmasötik bilesimler bir beserilestirilmis IL-31 antijen baglama molekülü veya IL-31 antagonisti (örnegin, bir IL-31 polipeptidini baglayan bir antikor veya antikor fragmani) içeren bir kap içeren bir kit olarak saglanabilir. Terapötik polipeptitler, bir tekli veya çoklu dozlar için bir enjektabl çözelti formunda veya enjeksiyondan önce rekonstitüye edilecek olan bir steril toz olarak saglanabilir.

Alternatif olarak, bu tarz bir kit bir terapötik polipeptidin uygulanmasi için bir kuru-toz dagitici, sivi aerosol üretici veya nebülizör içerebilir.

Bulus ilaveten, asagidaki sinirlayici-olmayan örnekler ile açiklanir. ÖRNEKLER Beserilestirilmis Degisken Bölge Dizilerinin Belirlenmesi Fare anti-insan IL-31 monoklonal antikorlari, birlikte-bekleyen 8 Mayis 2006'da Numarali ABD Patent Yayini'nda) tarif edilir. Fare anti-insan IL-31 antikorlarinin degisken bölgelerinin amino asit dizileri, birlikte-bekleyen 4 Eylül 2007'de dosyalanmis, 11/850,006 Seri Numarali ABD Patent Basvurusu'nda ve birlikte-bekleyen 4 Eylül diziler, burada tarif edilen beserilestirilmis diziler için baslangiç malzemesi olarak kullanilmistir. Spesifik olarak, fare anti-insan lL-31 antikor dizisi, 292.12.3.1 klon numarali bir hibridomdan elde edilmistir. 292.12.3.1 klonlarinin CDR bölgelerini sifreleyen nükleotidler, insan IgG'sini sifreleyen bir cDNA vektör içine klonlanmistir, böylece mürin CDR bölgeleri barindiran bir insan münferit amino asitler, yüksek kalitesi (baglama afinitesi, kararliligi ve homojenisitesi) olan bir monoklonal antikorun karakteristiklerini elde etmek için optimize edilmistir. Her bir antikorun üç boyutlu modelleri üretilmistir ve beserilestirilmis degisken bölgeler ve CDR bölgeleri belirlenmistir.

Beserilestirilmis fare anti-insan IL-31 agir ve hafif zincir degisken bölgeleri içeren yapilar, yari antikorlarin olusmasini inhibe etmek için (Kabat numaralandirmasi) pozisyon 241'de bir Ser'den Pro'ya mutasyon içeren bir insan IgG4 sabit bölgesine kaynastirilmistir. Yapilar HEK2923 hücreleri içinde eksprese edilmistir ve bir protein A kolonu üzerinde saflastirilmistir bunu PBS`ye tampon degisimi izlemistir. Baglama afinitesi Biacore ile ölçülmüstür. Potens, bir BAF proliferasyon analizinde ve bir NHK stat3 fosforilasyon analizinde ölçülmüstür. Bifiziksel karakteristikler, örnegin, homojenisite, agregasyon ve katlanma kararliligi, degerlendirilmistir.

Beserilestirilmis lL-31 antiien baglama moleküllerinin HEK293 hücrelerinde ekspresyonu Tüm deneysel prosedürler, üreticilerin talimatlarina göre yürütülmüstür. Anti Il-31 antikoru cDNA'si, Geneart (http://www.Geneart.com) firmasindan siparis verilmistir ve ekspresyon plazmidi pTT5 içine alt-klonlanmistir. Antikor hafif zinciri (Lo) ve agir zinciri (HC) bagimsiz plazmidler üzerinde tutulmustur. pTT5, Yves Durocher (Biotechnology Research Institute, National Research Council Canada) tarafindan Iisanslidir. pTT5 plazmidi, asagidaki yayinlarda karakterize edilmistir: Durocher et al., NAR 2002 ve Pham et al., Biotechn. Bioeng. 2003.

HEK293-GE transfeksiyonu için plazmid elde etmek için, anti lL-31 antikor kodlayan plazmidler, TOP10 E. coli hücreleri (kat no. C4040-06, Invitrogen, Taastrup, Denmark) içine kimyasal olarak transforme edilmistir ve plazmid saflastirma kolonlari (kat no. 27144, Qiagen, Ballerup, Denmark) vasitasiyla izole edilmistir. Yere-yönlendirilmis amino asit degisimi, DNA technology'den (http://www.DNA-technology.dk) primerler ve Dpn1 sindirimi (kat no. 200518, Clontech via Medinova Scientific A/S, Glostrup, Denmark) ile PCR ile gerçeklestirilmistir. Plazmidler, MWG-biotech'de (http://www.mwg-biotech.com/html/aIl/indexph) dizilenmistir.

Denmark) tarif edildigi sekilde transfekte edilmistir. Özet olarak, 15 pg LC ve 15 ug HC plazmid, 1 ml Opti-MEM (kat no. 31985-062, Gibco/Invitrogen, Taastrup, Denmark) içinde seyreltilmistir ve ayrica 1 ml Opti-MEM içinde de seyreltilmis 40 ul 293Fectin ile karistirilmistir. Standart bir transfeksiyon için, 30 milyon HEK293-6E hücreleri pelet hâline getirilmistir ve 28 ml Freestyle vasat (kat no. 12338, Gibco/lnvitrogen, Taastrup, Denmark) içinde yeniden-süspanse edilmistir ve 2 ml plazmid karisimi akabinde eklenmistir. Hücreler bundan sonra, pelet hâline getirmeden ve süpernatant örnegi alinmadan önce, 6 gün boyunca ajitasyon (125 rpm) ile 37°C, %8 COz'de inkübe edilmistir.

Beserilestirilmis IL-31 antijen baglama moleküllerinin Biacore ile ölçülen baglama afinitesi Protein etkilesimleri, yüzey plazmon rezonans (SPR) analizi kullanilarak gerçek zamanli izlenebilir. Bu çalismada, rekombinant insan IL-31'e (hlL-31'e) dogru afinite açisindan anti-IL-31 monoklonal antikorlarini karakterize etmek Için, Biacore 3000 ve Biacore T1OO aygitlari üzerinde SRP analizi gerçeklestiriyoruz.

Afinite çalismalari, sensör çip yüzeyi üzerinde karboksimetillenmis dekstran membranina (CMS) serbest amin gruplari vasitasiyla kovalent olarak kuple edilmis monoklonal antikor ile bir dogrudan baglama prosedürü kullanilarak gerçeklestirilmistir.

Rekombinant hlL-31 çesitli konsantrasyonlarda enjekte edilmistir. bunu sensör çip yüzeyi üzerinde sabit tampon akisi ile bir ayrilma periyodu izler. Bu deneysel tasarim kullanilarak, hIL-31'in immobilize edilmis monoklonal antikoru baglamasi, bir antikor baglama yerini baglayan bir hIL-31 molekülü ile, bir 1:1'Iik baglama olarak addedilebilir.

Etkilesim için kinetik parametreler, bir 1:1'Iik etkilesim Iangmuir uydurma modeli kullanilarak hesaplanabilir.

Yöntem Saflastirilmis monoklonal antikorlar, bir CMS tipi sensör çipi üzerinde münferit akis hücreleri içinde immobilize edilmistir. Immobilizasyonlar, bir standart amin kuplaj prosedürü kullanilarak gerçeklestirilmistir, bu 500 Rezonans Birimi (RU) olan bir immobilizasyon düzeyini amaçlar. Antikorlar, 10 mM NaAc pH 4,5 içinde 1-5 ug/ml'ye seyreltilmistir. araliginda bir 3-katlik seyreltme serisinde test edilmistir. Birlesme (enjeksiyon), 4 dk'dir, bunu bir 20 dk'lik ayrilma (yikama) periyodu izler. Akis hizi, 50 ul/dk'dir. Deneyler, °C'de gerçeklestirilmistir. Yüzeyin rejenerasyonu, 30 uI/dk olan bir akis hizinda, 30 s'lik 10 mM Glisin-HCI pH 1,8 veya 1 M formik asit darbesi enjeksiyonu ile tamamlanmistir. Tüm akis hücrelerinde saptama es-zamanlidir. Akis hücresi #1, immobilize edilmis antikor içermemistir ve arka planin ve yiginin çikarilmasi için kullanilmistir. Tüm deneyler üç kopya hâlinde yapilmistir. referanslamasi için tüm deneylere dâhil edilmistir.

Kinetik parametreler, bir 1:1'Iik langmuir baglama modeli kullanilarak verilerin küresel uydurmasi ile hesaplanmistir. Veriler, kinetik parametrelerin hesaplanmasindan önce kütle-tasima sinirlandirmalari için incelenmistir. Bazi deneylerde, Rmaks lokal olarak uydurulmustur ve Rl, 0'da sabittir.

Deneyler, Biacore 3000 ve T100 aygitlarinda gerçeklestirilmistir. Veriler, Biaeval 4.1 ve Biacore T100 degerlendirme yazilimi kullanilarak degerlendirilmistir. Veriler Tablo 2'de ve asagida gösterilir. Bu analizde, klonlarin bir kaçi ana susa benzer afinite göstermistir.

Klon Numarasi KD kd (1/s) ka (1/Ms) Bagil potens Bagil potens (NM) kaybi (KD) kaybi (kd) 05 benzer benzer 05 benzer benzer 05 benzer ~1,5x 02 ~85X ~245x 05 benzer benzer 03 ~10x ~50x 04 ~5,5x ~12x 05 ~0,5x benzer 05 ~0,4x benzer 05 ~0,5x benzer 05 benzer benzer Klon Numarasi 9.00E- 7.20E- 7.00E- 7.90E- .60E- 8.98E- 9.00E- 7.00E- .90E- 6.80E- 6.90E- 1.00E- 1.08E- 6.5OE+04 8.50E+04 1.00E+05 9.8OE+04 1.2OE+05 9.00E+04 7.80E+04 9.20E+04 9.30E+04 .20E+04 .2OE+04 6.40E+04 6.8OE+04 Bagil potens kaybi (KD) Ana susa göre Ana susa göre Ana susa göre Ana susa göre Ana susa göre Ana susa göre Ana susa göre Ana susa göre Ana susa göre Ana susa göre Ana susa göre Ana susa göre Ana susa göre Bagil potens kaybi (kd) Ana susa göre ~1,5x Ana susa Ana susa Ana susa göre ~1,3x Ana susa Ana susa göre ~1,5x Ana susa göre ~1,5x Ana susa Ana susa Ana susa Ana susa Ana susa göre ~1,5x Ana susa göre ~1,5x Beserilestirilmis lL-31 antijen baglama moleküllerinin BAF Proliferasyon Analizi ile ölçülen potensi A. Vasatlar ve tamponlar Kültür vasati: Glutamax (SKN, NN), %10 isi ile inaktive edilmis FBS, %1 P/S (BioWhitaker Kat. No. DE, Analiz vasati: Glutamax (SKN, NN), %10 isi ile inaktive edilmis FBS, %1 P/S (BioWhitaker Kat. No. DE, içeren RPMI 1640. alamarBIue boyasi (BioScource, Dal1100), proliferasyonu degerlendirmek için kullanilir.

B. Antikorlar, hücreler ve sitokinler Insan anti-IL-31 monoklonal antikorlari, Novo Nordisk'te üretilmistir ve Novo Nordisk'te (Copenhagen, Denmark) saflastirilmistir. BAF-3(hIL-31R), hIL-31R0i ve hOSMRB için genler ile transfekte edilmis bir KZS134-BAF3 hücre hatti olarak ZymoGenetics, Inc.

Numarali ABD Patent Yayini'nda tarif edilen, C1088), ZymoGenetics, Inc. tarafindan E. coli"de üretilmistir. MW 18 kDa.

C. Proliferasyon analizi 1. Stimülasyon analizi BAF-3(hIL-31R) hücreleri, rezidüel IL3'ten kurtulmak için Analiz vasati içinde güzelce yikanmistir. Akabinde, hücreler. her göz için 104 hücre olacak sekilde 96-gözlü mikro- titre plakalari (düz-gözlü görüntü plakasi Packard kat.SOO190) içine ekilir. hlL-31'in seri seyreltmeleri (10'9 M ila 10'15 M) gözlere eklenir ve hücreler içeren ancak hIL-31 içermeyen ilave gözler negatif kontrol görevi görür. Hücreler, 37°C'de %5 C02 içinde üç gün boyunca kültürlenmistir. Kültür periyodunun son 6 saati boyunca, 10 ul alamarBIue her bir göze eklenir. Hücreler 555-12 nm eksitasyonda ve 590 nm emisyonda bir spektrofotometre (bmg POLARstar+ Galaxy) üzerinde flüoresans yogunlugu için analiz edilir. Inhibisyon analizi için, hIL-31'in sabit bir konsantrasyonu hücreleri stimüle etmek için kullanilir. Bu konsantrasyon, proliferasyon analizinde maks. stimülasyonun yaklasik olarak %90'i baz alinarak seçilmistir, bu bizim elimizde 10'10 M hIL20 anlamina gelir. 2. Inhibisyon analizi Yikanmis BAF-3(hIL-31 R) hücrelerinin her göz için 10 X 104 hücresi, analiz vasati içinde mikro-titre gözlerin içine ekilir. 10'10 M (nihai konsantrasyon) hIL-31, (yalnizca hücreler içeren negatif kontrol olarak kullanilan bazi gözler disinda) her bir göze eklenir. Antikorun seri seyreltmeleri (yani, 100 ug ve 2- kat), (yalnizca hücreler + hIL-31 içermesi gereken pozitif kontroller için kullanilan gözler disinda) hâlihazirda hücreler ve sitokinler içeren gözlere eklenir. Hücrelerin, sitokinin ve antikorun karisimi, 37°C'de %5 COz'de 72 saat boyunca 100uI/göz içinde inkübe edilmistir. Inkübasyonun son 6 saati, bir spektrofotometre (bmg POLARstar+ Galaxy) üzerinde flüoresans yogunlugu Için analiz edilir. Prism 4(GraphPad PRISM software Inc.) kullanilarak egriler çizilir ve potens (ICso) hesaplanir. Veriler Tablo 3'te ve asagida gösterilir. Bu analizde klonlarin bir kaçi ana susa benzer potens göstermistir.

Tablo 3: 1E-1OM hIL-31'de beserilestirilmis mAb'Ierin potensi (nM) Klon Numarasi Ortalama 292.12.3.1'e kiyasla potensteki ortalama Potens Kat kaybi 07 4.5 3.3 08 4.1 2.5 09 28.5 15.1 Klon Numarasi Ortalama Potens 109.0 292.12.3.1'e kiyasla potensteki ortalama Kat kaybi Beserilestirilmis lL-31 antijen baglama moleküllerinin NHK stat3 fosforilasyon Analizi ile ölçülen gotensi Normal insan keratinositlerinin kültürü ve STAT3 fosforilasyon analizi: Abdominal ciltten elde edilen normal insan keratinositleri (NHK'Ier), Biopredic Int.

(Rennes, France) firmasindan elde edilmistir ve Cascade Biologios (Portland, OR) firmasindan HKGS kiti ile takviye edilmis Epifliye Medium içinde büyütülmüstür. HBSS, tripsin-EDTA ve tripsin nötralize etme reaktifi içeren bir Detach Kit'i hücreleri hasat etmek için kullanilmistir ve Promocell (Heidelberg, Germany) firmasindan elde edilmistir. NHK'Ier, STAT3 fosforilasyonunu ölçme ve sitokinin ECso'sini belirlemek için düz-tabanli 96-gözlü plakalar (Nunc, Roskilde, Denmark) içinde rekombinant insan IL- 31 ile 15 dakika boyunca stimüle edilmistir. NHK Iizatlari Cell Signaling Technology (Danvers, MA) firmasindan elde edilen PathScan Phospho-STAT3 Sandwich ELISA Kit'inde üreticinin talimatlarina göre test edilmistir. Akabinde, her bir nötralize etme antikorunun ICöO'si, rekombinant insan IL-31'in bir ECgo'i ile 15 dakika boyunca stimülasyondan önce antikorlarin seri seyreltmelerinin NHK'Iere eklenmesi ile belirlenmistir. Fare IgG1'i (R&D Systems, Minneapolis, MN) ve insan IgG4'ü (Sigma- Aldrich, Saint Louis, MO) izotipik kontrol antikorlari olarak kullanilmistir.

Insan lL-31'e karsi yönlendirilmis antikorlarin potensleri Insan IL-31 'e karsi yönlendirilmis her bir antikor için, degerler (nM), Tablo 4'te gösterilir.

Her bir deney için, XL Fit yazilimi ile belirlendigi üzere bir 2' faktörü verilir.

Rekombinant insan IL-31'in bir ECgo'i ile elde edilen stimülasyon indeksi gösterilir. Bu analizde klonlarin bir kaçi ana susa benzer potens veya kabul edilebilir potens göstermistir. indeksi Z' faktörü Numarasi 292.12.3.1 0.98 0.93 1.90 3.66 0.91 0.93 4.48 5.54 3.99 7.74 3.25 7.37 68.83 223.87 46.51 210.90 71.92 242.30 3.84 6.22 6.65 5.29 2.60 2.68 .50 14.79 11.01 11.53 13.16 13.62 12.04 36 8.95 HÜKÜMLER 1. Insan IL-31'i baglayan asagidakileri içeren bir izole edilmis antikordur veya antikor fragmanidir: a) Sirasiyla SEQ ID NO: 1, 2 ve 3 amino asit dizilerinden olusan veya sirasiyla SEQ ID NO: 1, 4 ve 3 amino asit dizilerinden olusan CDR1, CDR2 ve CDR3 içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve b) Sirasiyla SEQ ID NO: 5, 6 ve 7 amino asit dizilerinden olusan CDR1, CDR2 ve CDR3 içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani. 2. Hüküm 1'e göre antikordur veya antikor fragmanidir, burada a) söz konusu beserilestirilmis agir zincir degisken alani asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisine en az %90 özdes olan bir amino asit dizisine sahip olan çerçeve bölgeleri FR1, FR2, FR3 ve FR4 içerir: amino asit dizisi; amino asit dizisi; amino asit dizisi ve b) söz konusu beserilestirilmis hafif zincir degisken alani asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisine en az %90 özdes olan bir amino asit dizisine sahip olan çerçeve bölgeleri FR5, FR6, FR7 ve FR8 içerir: amino asit dizisi ve amino asit dizisi. 3. Hüküm 2'ye göre antikordur veya antikor fragmanidir, burada beserilestirilmis agir amino asit dizisinden olusan çerçeve bölgeleri FR1, FR2, FR3 ve FR4 içerir ve burada beserilestirilmis hafif zincir degisken alani, sirasiyla SEQ ID NO: 17 (FR5), 18 (FR6), 19 (FR7) ve 20 (FR8) amino asit dizisinden olusan çerçeve bölgeleri FR5, FR6, FR7 ve FR8 içerir. 4. Hüküm 2'ye göre antikordur veya antikor fragmanidir, burada beserilestirilmis agir amino asit dizisinden olusan çerçeve bölgeleri FR1, FR2, FR3 ve FR4 içerir ve burada beserilestirilmis hafif zincir degisken alani, sirasiyla SEQ ID NO: 17 (FR5), 18 (FR6), 19 (FR7) ve 20 (FR8) amino asit dizisinden olusan çerçeve bölgeleri FR5, FR6, FR7 ve FR8 içerir.

. Hüküm 2'ye göre antikordur veya antikor fragmanidir, burada beserilestirilmis agir amino asit dizisinden olusan çerçeve bölgeleri FR1, FR2, FR3 ve FR4 içerir ve burada beserilestirilmis hafif zincir degisken alani, sirasiyla SEQ ID NO: 17 (FR5), 18 (FR6), 21 (FR7) ve 20 (FR8) amino asit dizisinden olusan çerçeve bölgeleri FR5, FR6, FR7 ve FR8 içerir. 6. 2 ila 5 arasindaki hükümlerin herhangi birine göre antikordur veya antikor fragmanidir, burada FR1'de (SEQ ID NO: 8 veya SEQ ID NO: 12) pozisyon 29'daki amino asit Iösindir ve FR3'te (SEO lD NO: 14 veya SEO ID NO: 16) pozisyon 32'deki amino asit fenilalanindir. 7. Hüküm 6'ya göre antikordur veya antikor fragmanidir, burada FR7'de (SEQ ID NO:19 veya SEQ ID NO: 21) pozisyon 15'teki amino asit tirozindir. 8. Hüküm 7'ye göre antikordur veya antikor fragmanidir, burada FR3'te (SEQ ID NO: 14 veya SEQ ID NO: 16) pozisyon 8'deki amino asit Iizindir. 9. Hüküm 6'ya göre antikordur veya antikor fragmanidir, burada FR3'te (SEO lD NO: 14 veya SEQ ID NO: 16) pozisyon 8'deki amino asit Iizindir. . Önceki herhangi bir hükme göre antikordur veya antikorfragmanidir, burada antikor asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir agir zincir immünoglobülin sabit alani içerir: e) bir insan IgM sabit alani; f) bir insan IgE sabit alani ve 9) bir insan IgA sabit alani. 11.Önceki herhangi bir hükme göre antikor fragmanidir, burada söz konusu fragman asagidakilerden olusan gruptan seçilir: Fab, Fab', F(ab')2, Fv fragmanlari; diyabodiler; lineer antikorlar; tek-Zincirli antikor molekülleri; monobodiler ve antikor fragmanlarindan olusturulan multi-spesifik antikorlar. 12. Önceki herhangi bir hükme göre antikordur veya antikor fragmanidir, burada söz konusu antikor veya antikor fragmani PEG içerir. 13. Önceki herhangi bir hükme göre antikor veya antikor fragmani içeren bir farmasötik bilesimdir. 14. Asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir izole edilmis antikordur: a) SEQ ID NO:46 amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir ve SEO ID NO: 47 amino asit dizisinden olusan bir agir zincir içeren bir antikor; b) SEQ ID NO: 48 amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir ve SEO ID NO: 49 amino asit dizisinden olusan bir agir zincir içeren bir antikor ve c) SEQ ID NO: 50 amino asit dizisinden olusan bir hafif zincir ve SEO ID NO: 51 amino asit dizisinden olusan bir agir zincir içeren bir antikor.

. Insan IL-31'i baglayan asagidakileri içeren bir izole edilmis antikordur veya antikor fragmanidir: Sirasiyla SEQ ID NO: 1 ve 3 amino asit dizisine sahip olan bir CDR1 ve CDR3 ve AIYPGDGDTRYSXaa1Xaa2FXaaSG (SEQ ID NO: 22) amino asit dizisine sahip olan bir CDR2 içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani, burada Xaa1, glutamindir veya prolindir, Xaa2, serindir veya Iizindir ve Xaa3, glutamindir veya Iizindir ve burada söz konusu beserilestirilmis agir zincir degisken alani asagidakilerden olusan gruptan seçilen amino asit dizisine en az %90 özdes olan bir amino asit dizisine sahip olan çerçeve bölgeleri FR1, FR2, FR3 ve FR4 asit dizisi; amino asit dizisi ve amino asit dizisi; ve burada, FR1'de (SEQ ID No:8 veya SEQ ID NO: 12) pozisyon 29'daki amino asit lösindir ve FR3'te (SEQ ID NO: 14 veya SEQ ID NO: 16) pozisyon 32'deki amino asit fenilalanindir ve b) Sirasiyla SEQ lD NO: 5 (CDR1), 6 (CDR2) ve 7 (CDR3) amino asit dizilerinden olusan bir CDR1, bir CDR2 ve bir CDRS içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani, söz konusu beserilestirilmis hafif zincir degisken özdes olan veya sirasiyla SEQ lD NO: 17, 18, 21 ve 20 amino asit dizisine en az %90 özdes olan bir amino asit dizisine sahip olan çerçeve bölgeleri FR5, FR6, FR7 ve FR8 içerir ve burada, FR7'de (SEQ lD NO: 19 veya SEQ ID NO: 21) pozisyon 'teki amino asit, tirozindir. 16. Hüküm 15'e göre antikordur veya antikor fragmanidir, burada SEQ ID NO: 22'nin Xaa1'i, Xaa2'si ve Xaa3'ü asagidakilerden olusan gruptan seçilir: a) Xaa1, glutamindir, Xaa2, Iizindir ve Xaa3, Iizindir; b) Xaa1, prolindir, Xaa2, serindir ve Xaa3, glutamindir ve C) Xaa1, glutamindir. Xaa2, Iizindir ve Xaa3, glutamindir. 17. Hüküm 15'e göre antikordur veya antikor fragmanidir, burada FR3'te (SEQ ID NO: 14 veya SEQ ID NO: 16) pozisyon 8'deki amino asit, Iösindir. 18. 15 ila 17 arasindaki hükümlerin herhangi birine göre antikordur veya antikor fragmanidir, burada antikor asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir agir zincir immünoglobülin sabit alani içerir: e) bir insan IgM sabit alani; f) bir insan IgE sabit alani ve 9) bir insan IgA sabit alani. 19. 15 ila 18 arasindaki hükümlerin herhangi birine göre antikor fragmanidir, burada söz konusu fragman asagidakilerden olusan gruptan seçilir: Fab, Fab', F(ab')2, Fv fragmanlari; diyabodiler; lineer antikorlar; tek-Zincirli antikor molekülleri; monobodiler ve antikor fragmanlarindan olusturulan multi-spesifik antikorlar. . 15 ila 19 arasindaki hükümlerin herhangi birine göre antikordur veya antikor fragmanidir, burada söz konusu antikor veya antikor fragmani PEG içerir. 21. 15 ila 20 arasindaki hükümlerin herhangi birine göre antikor veya antikor fragmani içeren bir farmasötik bilesimdir. 22. Bir memelide enflamasyonu tedavi etmenin, insan IL-31'i baglayan bir antikoru veya antikor fragmanini baglamayi içeren bir yöntemidir, burada söz konusu antikor veya antikor fragmani asagidakileri içerir a) Sirasiyla SEQ ID NO: 1, 2 ve 3 amino asit dizilerinden olusan veya sirasiyla SEQ ID NO: 1, 4 ve 3 amino asit dizilerinden olusan CDR1, CDR2 ve CDR3 içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve b) SEQ ID NO: 5, 6 ve 7 amino asit dizilerinden olusan CDR1, CDR2 ve CDR3 içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani. 23. Bir memelide pruritusu tedavi etmenin, insan lL-31'i baglayan bir antikoru veya antikor fragmanini uygulamayi içeren bir yöntemidir, burada söz konusu antikor veya antikor fragmani asagidakileri içerir: a) Sirasiyla SEQ ID NO: 1, 2 ve 3 amino asit dizilerinden olusan veya sirasiyla SEQ ID NO: 1, 4 ve 3 amino asit dizilerinden olusan CDR1, CDR2 ve CDR3 içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve b) b) SEQ ID NO: 5, 6 ve 7 amino asit dizilerinden olusan CDR1, CDR2 ve CDR3 içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani. 24. Insan IL-31'i baglayan asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani içeren bir izole edilmis antikordur veya antikor fragmanidir: a) SEQ ID NO: 25 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; b) SEQ ID NO: 27 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; 0) SEQ ID NO: 25 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 28 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; d) SEQ lD NO: 29 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; e) SEQ ID NO: 27 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 28 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; f) SEQ ID NO: 30 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; 9) SEQ ID NO: 31 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEQ ID NO: 26 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; h) SEQ ID NO: 25 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 32 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; i) SEQ lD NO: 25 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 33 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; j) SEQ ID NO: 25 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 34 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; k) SEQ lD NO: 35 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEQ ID NO: 32 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; m) SEQ ID NO: 27 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 33 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; n) SEQ ID NO: 27 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 34 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; 0) SEQ lD NO: 36 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; p) SEQ ID NO: 25 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; q) SEQ ID NO: 38 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; r) SEQ ID NO: 39 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisini içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; 3) SEQ ID NO: 40 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; t) SEQ ID NO: 41 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; u) SEQ ID NO: 42 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEQ ID NO: 37 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; v) SEQ ID NO: 43 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; w) SEQ ID NO: 44 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 26 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; x) SEQ lD NO: 36 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 28 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani; y) SEQ ID NO: 36 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 28 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani ve 2) SEQ ID NO: 45 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve SEO ID NO: 37 amino asit dizisine en az %90 dizi özdesligine sahip olan bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani.

. Hüküm 24'e göre antikordur veya antikor fragmanidir, burada antikor asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir agir zincir immünoglobülin sabit alani içerir: e) bir insan IgM sabit alani; f) bir insan IgE sabit alani ve 9) bir insan IgA sabit alani. 26. Hüküm 24'e veya 25'e göre antikor fragmanidir, burada söz konusu fragman asagidakilerden olusan gruptan seçilir: Fab, Fab', F(ab')2, Fv fragmanlari; diyabodiler; lineer antikorlar; tek-zincirli antikor molekülleri; monobodiler ve antikor fragmanlarindan olusturulan multi-spesifik antikorlar. 27. 24 ila 26 arasindaki hükümlerin herhangi birine göre antikordur veya antikor fragmanidir, burada söz konusu antikor veya antikor fragmani PEG içerir. 28. Bir memelide enflamasyonu tedavi etmek amaciyla bir ilacin üretilmesinde, insan lL-31'i baglayan bir antikorun veya antikor fragmaninin kullanilmasidir, burada söz konusu antikor veya antikor fragmani asagidakileri içerir a) Sirasiyla SEQ ID NO: 1, 2 ve 3 amino asit dizilerinden olusan veya sirasiyla SEQ ID NO: 1, 4 ve 3 amino asit dizilerinden olusan CDR1, CDR2 ve CDR3 içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve b) Sirasiyla SEQ ID NO: 5, 6 ve 7 amino asit dizilerinden olusan CDR1, CDR2 ve CDR3 içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani. 29. Bir memelide pruritusu tedavi etmek amaciyla bir ilacin üretilmesinde, insan IL-31'i baglayan bir antikorun veya antikor fragmaninin kullanilmasidir, burada söz konusu antikor veya antikor fragmani asagidakileri içerir a) Sirasiyla SEQ lD NO: 1, 2 ve 3 amino asit dizilerinden olusan veya sirasiyla SEQ ID NO: 1, 4 ve 3 amino asit dizilerinden olusan CDR1, CDR2 ve CDR3 içeren bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve b) Sirasiyla SEO ID NO: 5, 6 ve 7 amino asit dizilerinden olusan CDR1i CDR2 ve CDR3 içeren bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani.

DIZI LISTESI <110> ZymoGenetics, Inc. ve Merck Serono S.A. <120> IL-31'E SPESIFIK BESERILESTIRILMIS ANTIKOR MOLEKÜLLERI <130> P33301EP-D2-PCT <160> 51 <170> Windows Versiyon 4.0 için FastSEQ <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 1 5 10 15 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Al: :lc Tyr Pro G;y asp Gly &sp Thr Arg Ty: Set ?:0 Se: ?he Sin 1 3 10 15 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221› VARYANT <222> (29) (29) <223> Xaa, Leu'dir veya Phe'dir <400> 8 Glu Val Slr. Leu Va; Gln Ser Sly !da Glu Va; ;ya Lv: Pro Glv Glu So:: Le› Lya Ile 5:: Crs ;ya Al& Se: éîy Ty( Th( Xaa ?hr L 2l2 2'5 32] <210>9 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly <210> 10 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Gln Val 1'1'1: Leu Thr Ala Asp iys Se: Ile Sar Thc A'.: Ty: beu Gln l 5 IC 15 rzp Ser Se: Leu Lys Ala Sex As? Th: Ala Me: Ty: Ty: Cya Ala Ph& zu 2! 33 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser <210> 12 <211> 30 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> VARYANT <222> (29) (29) <223> Xaa, Leu'dir veya Phe'dir <400> 12 Gln '-'al Sir. Leu Va; Gln Ser Gly Ala 610 V:: ;7: Lv: Pro Gly Ala 1 5 IC 15 Her Val Lys 'Jal 50:' Oya Lys Ala Sor Gly Tyr Thr xaa Thr <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly <210> 14 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> VARYANT <222> (8)...(8) <223> Xaa, Lys'dir veya Thr'dir <220> <221› VARYANT <222> (32)...(32) <223> Xaa, Phe'dir veya Arg'dir <400> 14 Ari; Val Tr.: Leu I'hr Ala Mp x.“ Ser Thr St:: th: Ala Ty: Met Glu 1 5 10 15 25 30 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser <210> 16 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221› VARYANT <222> (8)...(8) <223> Xaa, Lys'dir veya Thr'dir <220> <221› VARYANT <222> (32)...(32) <223> Xaa, Phe'dir veya Arg'dir <400> 16 Ara Val Ttr Me: Thr Arq Asp Xaa Ser Thr Ser ?hr Val Ty: Met Glu 1 5 10 15 by, Ser Ser im. Arq 59: ;lu Asp Tur Ala ve] Ty( ?yi Cyti Ala xaa 21'.' 2'5 TH: <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Asp :le Gln Me: Thr Gln 3:: Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va; Gly 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr l 5 10 15 <210> 19 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221› VARYANT <222> (15)...(15) <223> Xaa, Phe'dir veya Tyr'dir <400> 19 Gly '-'al Pro Ser Ara Ph: Ser Sly Se: Ara .Ser i3`.'.i Thr Gln Kan Ser 1 5 IE !5 1.03“ Thr Ile 592' 50:' Lou Cin Pro Glu Asp Ve: Al.) 'l'hi Ty!' Tyr Çya 2G 2'i 321 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg <210> 21 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221› VARYANT <222> (15)...(15) <223> Xaa, Tyr'dir veya Phe'dir <400> 21 Gly 'i'al Pro Ser m; Phe Ser Sly Se: Gly s:: @4 Thi: Asp x“ Ihr <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221› VARYANT <222> (13)...(13) <223> Xaa, Gln'dir veya Pro'dur <220> <221› VARYANT <222> (14)...(14) <223> Xaa, Ser'dir veya Lys'dir <220> <221› VARYANT <222> (16)...(16) <223> Xaa, Gln'dir veya Lys'dir <400> 22 Ala :Lo Ty:: Pro GLy Mp Siy Mp Tr.: Arg Tyr Sor x.“ ini ?hu X:: <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 <210> 24 <211> 164 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 (3] r. (311: A1::. <210> 25 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus 1443;& 50: bu: Ala Ile Ty: Pro 0.3! Mp Gly tup Thr Mg ryr Se: Gln Ly: Pbc Lys <400> 25 frp Mat Gln Trp ValGly Ala ile Tyr PIG 61& Gly hrq Va; Thr!at Glu Lcu Sex 5:: A1; I'm_- Drci Agp. Gly <210> 26 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Ser Am; Ser' Glu T'hr <210> 27 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus -' i.] <400> 27 Gli; Val Gln Lou "al Gly Ala Ile Tyr Ph).

Glr. 513' Ciln vi'. I'm: bu. Gln Trr› Sex SetAla Fta ?to Asp CLy Glv Gln Gly Thr I'hr <210> 28 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 bu; Ala Trp Tyr c“.n Sex Gly si:: Gly 'rhi <210> 29 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus .'7': 1 2 [2' <400> 29 Glr: Val Gln Lou ":1 '3171 ' Sar 'Jul Lyi Va; Sar (Iyi Glr. Gly Arg Ve". I'hr Net Me!. Glu Lou Sex Sex benAla &:9 ?to Asp CLy Ty: Gly Gln (313' 1111' ;ci Val 11.'i <210> 30 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Glri Val Gln buu `Jul Gln ' Star Vai Lyii Va“. Sin' (Ty:frp Met Gln Trp Val Art:(313( Alo Ile Tyr Ph) Gly Glr: Gly Arg Va; Thr ;eu Gly Gln (313' Thr ;eu Val <210> 31 <211>122 <212> PRT <213> Mus musculus .'7': 12 II' (313.' 71'.: <400> 31 Glr: Val rSln Lou V: Ser 'Jal Lya Va“. «er Oya frp Met Gln Trp 'o'al Mg Gly Ala ne Tyr pr.) Gly Glr. 51)' M9 vi'. I'm: ;en Met Glu ben :Sex Sex ;en Gly Gln (313' 1111' ;ci Val <210> 32 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 A::: :la Gln Me: Thr Gln ' MD &:9 Va“. Thr I'.a ?hr ..

Ser Ârg Sev' Glu ?hr (31" Gii; Asp Va_ Ala I'm: Ty:'Il'ir Ph& Gly Gli'i GLy ?hr <210> 33 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 A5:) !la Gln Ma: ?hr Gln ' Mp Ar: Va; Thr I'_o rh:: " ML: Alu Trp Ty: Ggzi Gln Tyr Agri Ala Ly: Thi' Lou 39!" GI? 38" (31)' Thr Glii Giu hap Va- hi.) I'ni: Ty: l '3171 ' 12 II' <210> 34 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Asp :le Gln Me: I'hr Gln ' .up &:9 Va; Thr I'.a ?hz ..

Gii; Asp Vi'_ AJ..! rh:: Ty:Thu' Pr..? üly Glx'i GLy ?hr <210> 35 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Sar Ldu Lyii Ile Sar fiya?tv Met Gln 'frp *:31 AnaGly Alo Ile Tyr Pro Gly (311: 61)* Gln Va; Thr Ile bu. Gln Trr; Ser Ser ;en Gly Gln (31)' Thr rhr Vol <210> 36 <211>122 <212> PRT <213> Mus musculus 61'.' <400> 36 Glr. Val Gln Lou Val Gln ' Sar 'i'ai Ly: Va- Sar Cys Mat Glu Lan Sar Sin' ;au <210> 37 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 A::: :lc Gln Me: Thr Gln ' Mp Mg Va; Thr I“.a I'hr ..

LI:: Al: 'frp 'l'yr Gln Gln Ser Gly ser' Gly T'hr Asp 65 ”'53 Gii; Asp Va- Aia rh: ry:.::'l( Ph& Gly Clfi Giy ?hz <210> 38 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus 1155: <400> 38 Glr: Val Gln (313' <210> 39 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 (31)' <210> 40 <211>122 <212> PRT <213> Mus musculus 1111' 12 II' A1:Ciy 1.','3 71'.: <400> 40 Glr: Val Gln beu ":1 'Sin ' Ser 'Jal Lya Va'. `'311: Met Gln Trp 'i'al Art:Gly Ala ne Tyr pr.) Gly Glr. 51)' Mg vi'. I'm: Mat ".) Gly Gln (313' 1111' ;ci Val <210> 41 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41 Glr. Val Gln buu 'Jul 6111 ' Ser 'Jul Lya Ve”. Ser Cys (313( Alo II& Tyr Ph) Gly Glr. Gly Mg Vi'. I'hr Mct Mel Glu I-eu Ser Ser 3.9“ Ala Ptt: ?:0 A5; Giy I'yr Gly Gln (313' Thr ;eu Val <210> 42 <211>122 <212> PRT <213> Mus musculus 12 II' (313.' 50::: <400> 42 (313' <210> 43 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 (313' <210> 44 <211>122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 1111' 1.811 12 II' (313.' Ala Ph:- pro <210> 45 <211> 122 <212> PRT Lou 'i'ai Th: 'lal <213> Mus musculus <400> 45 <210> 46 <211> 214 <212> PRT 73):: <213> Mus musculus <400> 46 Let; Ala 'frp SerGlu Asp Thr IL.: 'i'al Dr::: Tyr Gly Nél AgpPro 3031' 17'.] (3171 Pro GlyTT..” Arz; Glu 'frp TI.: ?ID'Jul Ala Lys V-:il <210> 47 <211> 449 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 4II|5 1'4'5 SatThr (311; (313' 3:: hr; Trp Gln G;u Gly han ?al A1: Lcu His Ann HL: Ty: rh: Gln <210> 48 <211> 214 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 48 Giu Asp Va; Ala rh: ryr?hr Pt& Gly Gin Giy rh: Pine Asn krq Gly GL.: Cya <210> 49 <211> 449 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Pro SéfIle SetPhc frp <210> 50 <211> 214 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50 1111' “En 1313: 2 .'10 2.0.1 ;- f' 3::::` 2'›.'i (511.1 (31 I.: Glu Asp Va; A1: ?hr ryr?hr Pt& Gly Cin Giy rh: 145 150 GIL- SGI' Va: Thr G::: '31“ Ser: ?tr Leu Thr La:: Sar: <210> 51 <211> 449 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Set Lou Lys 110 501' Cysfrp Met Cln Trp Vol Axq Cir. (31)' Çin V1; Thr ;an 225 230 Sn: 'i'al ?ha Lan Ph& Pro 1.91) GluCLy AspPro P :1.: . 61;: Bese es: m 5 Ant L-31 molek llerinin Hizalanmasi Kabat/ EU adlandirmasina göre N.B. CDR tanimlari ve numaralandirmasi HC = agir zincir; LC = hafifzincir' VD = degisken alan Akseptör olarak insan VH1-46 qerm-hatti qeni kullanilan agir zincir qreftleri QVQLVQSWVKKWVKVSCW GYTITRYWMWGQGIÃWI INEÇC'TRISQKFOGRVTHTRGTS I STVYNELSSLRSE DTÂWYWDGYYWXWWGQGT LVTVSS çvawçscumnusmscus:: TLTRYINÇHVIQAPGQGKAHXGAK Y Kit/;DTRYSQXFQGRVTLTIDKS I STAYNELSSLRSRDTAWYCAFPMYYAAFYGIDYWZCÇTLV'PVSS qvoLvçscEVMMmsCmînermwc Daum: Hacc DTRXSQKFQGRVTLTAJKS [SIAYIELS Suzs EDT AV! !WDGIYMYYGNDXHGQGTLWVSS QVULVÇSGAIVKRRLASVKVSCKASJH TIîkYYHWVRÇARZGLLHmZAI '.' ?Gun i'l'RYSQKFDGkVTIJAEKS l STAYKHIÃSLJQSM'TAVY !L'AHIL-IIY YAAPYCNDYHCQSTLWVSS GVQLVQSGAEVKKPGAEI'IKVSCKAS'IYTIIPYWMÇAPGWLEWWIÂ( Y PCICÜTRYSQK ?GÖRMRISTS l'SWYKEI.SSLI`iS ROT AW"CAFP?“YYMPîxmDT-'GQGTLVTVSS OVÜLVOSGÃSVMPGASVFJSCMS'SYTLTRMDMGUGWLEWSÂî Y ?GDGEITRYSQK FOGIVT LTÜ TS I SMELSSLRSSDTAVYYCAFPDGYYMPYGNDYHGOGTLVIVSS QVCLVCSGAEVHNASVKVSCWGY'ZLTRWWRQÃPGWLEWGA X Y ?CCCCITRYSGKFQGRVTWÃDTS I STVYNELSSUlSBDTAVY'CAFPDGYYMYYMWCOSTLVTVSS GVGLVGSGAEVKKPGASVKVSCMSSYILTR(mGAPGWLKWHGA I 'I YGDG DTRYGQK FDGRVTRIREKS I snmis SÜSBDTAVY!CAFTDGXYMPîGHCYîSQGT LVTVS 5 CVOLVQSGAEVKKNASVKVSC KAS SYTLTRYHNOMÇAPCÇCIÃ »gm E' MDCIITRY SOK now-:m1 S ISTAMLS SLRSE î/TAW !CAFPDC YYMPY'MYHGOGTLVTVSS QVQLVGSGAEVXKPGASVK'ISC M' 1.1' RMWRWGWLENHSA! Y NDGE-TRYSQÄ FQGRVTLTAEJTS I SIAYHZLS SLRS EDTAV! YCAII'DGYYMI'XGHDWGQGTLVTVSS ÇVQI.V"›SCAEVXKI\IASVKVSCKA$CYTISRWHQÃPGÇZUÄHMCA I Y PCICE'TRYSQXFOCRVMAETS I STÃMI..?SUISEDTAVYYCÂFPNYYMPYCDQYHDOSTLWVSS QVQINC-SCAEVKKPCASVKVSCWSYTLTRMWQÂPSWLEHM'ÃÂI Y NIGDIRY SQKFQGRVTLTIDKSTSTÃYICELSSLESEDTAVYYCIFPDGYYUPYGNDYICQG7LVTVSS GV D LVGSGÂEVKIPV-ÂSVKVSC KAS' i LT kYiWÇÂWKZZUâm 1 ”' "GL/»'35 'TRYSQK FC! :HWKTKUKST STVYNICLS 5 HIS F› 97 IVY Y FI PVL-HY YAAPYKQIDYHGQS A VTVSS Beserilestirilmis Anti-IL-31 moleküllerinin Hizalanmasi Kabat/ EU adlandirmasina göre N.B. CDR tanimîari ve numaralandirmasi HC = agir zinoir. LC = hafifzincir VD = degisken alan Akseptor olarak insan VH5751 qermýhatti qeni kulîaniian agir zincir qreftleri 8 , l 1 II . 2 J` . 24 EVQLVQSSÂSVMPJSSUU SCMSGITLTRYKMWVRQIPGKJJ LSII'NGAI l'iVED'ZDTRYSFSFQGQVT :::Al !(5 Beserilestirilmis Ami-IL-31 moleküllerinin Hizalanmasi Kabatl EU adlandirmasina göre NB. CDR tanimlari ve numaralandirmasi HC : agir Zincir: LC : hafifzincir VD : degisken alan Akseptor olarak insan VK1~A20 qerm-hatîi qeni kullanilan hafifzincir qreftleri 7.51Ü411,IG.711J 9,1114.“ 18.75 D I OKTQS PSS LSISVC'JRVT I TCMSCH L HIYLÃUYQ'JKFGKV'PKLL I YNAKTLLE/IVPSRFSGSRSETDFSLT I SSLQPELIVATYYCOHFKST ?ITFCÇCTKVE 1 !R D ! @EF-.`05 PSS ßISVGDRVT ITCRÄSGNZ HNYUII'YQQRPGKVPKLLI YNAKTLÄEGVPSRFSGSGSGTQYSLT I 55 WPEDVA'Fît'CDKNSTPHTFGIGTIG/E !KR D I MQS PSS 1.SISVGUXVT l TCRASGN I RNYUIIYQQKPGKVPKLLI YNAKTIMQW'PSRFS'SSRSETDYT1.1' Z 551& ?KUVITYYCQHTNSS`MFGQJTKVE !XR Ü [NOS I'SS LSASVGURVT [TCMBGN IHNYIJNYQOKPGKVPKLZ. l INAKTML'ÇV PSRFSGGGSGTOXTLT 1 SS WS'EUYAT!YCONE'HSTW'II'UNTKVE IXR SEKIL 1c

Claims

ISTEMLER Insan IL-31'i spesifik olarak baglayan, bir beserilestirilmis agir zincir degisken alani ve bir beserilestirilmis hafif zincir degisken alani içeren bir izole edilmis monoklonal antikor veya bunun antijen-baglama fragmani olup, burada beserilestirilmis agir zincir degisken alani, sirasiyla SEQ ID NO.'Iari: 1, 2 ve 3 amino asit dizilerinden olusan bir CDR1, CDR2 ve CDR3 ve sirasiyla SEQ (FR4) amino asit dizisine en az %90 özdes olan bir amino asit dizisine sahip olan çerçeve bölgeleri FR1, FR2, FR3 ve FR4 içerir ve burada beserilestirilmis hafif zincir degisken alani, sirasiyla SEQ lD NO.'Iari: 5, 6 ve 7 amino asit dizilerinden olusan bir CDR1, CDR2 ve CDR3 ve sirasiyla SEQ ID NO:17 (FR5), SEQ ID NO:18 (FR6), SEQ ID NO:19 (FR7) ve SEO ID NO:20 (FR8) amino asit dizisine en az %90 özdes olan bir amino asit dizisine sahip olan çerçeve bölgeleri FR1, FR2, FR3 ve FR4 içerir; burada, SEQ lD NO: 12'nin (FR1) pozisyon 29'undaki amino asit rezidüsü, bir lösindir, SEQ ID NO: 14'ün (FR3) pozisyon 8'indeki amino asit rezidüsü bir fenilalanindir ve SEO ID NO: 19'un (FR7) pozisyon 15'indeki amino asit rezidüsü bir tirozindir. Istem 1'e göre izole edilmis monoklonal antijen-baglama fragmani olup, burada antijen-baglama fragmani ilaveten bir FC alani içerir. istem 1'e veya 2'ye göre izole edilmis monoklonal antikor veya bunun antijen- baglama fragmani olup, burada antikor veya antijen-baglama fragmani ilaveten asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir agir zincir immünoglobülin sabit alanini içerir: 0) bir insan IgGS sabit alani ve . istem 3'e göre izole edilmis monoklonal antikor veya bunun antijen-baglama fragmani olup, burada agir zincir immünoglobülin sabit alani bir insan IgG4 sabit alanidir. . Istem 4'e göre izole edilmis monoklonal antikor veya bunun antijen-baglama fragmani olup, burada insan IgG4 sabit alani, Kabat ile belirlendigi üzere pozisyon 241'de bir serinden proline mutasyona sahiptir. . istemler 1 ila 5'ten herhangi birine göre izole edilmis monoklonal antikorun veya bunun antijen-baglama fragmaninin kullanimi olup, atopik dermatit, dermatit, prurigo nodülaris, egzema, pruritus, vitiligo, alopesi areata (saçkiran), akne rozasea, akne vulgaris, büllöz pemfigoid veya kontakt dermatit tedavisi amaciyla bir ilacin üretilmesi içindir. . Atopik dermatiti, dermatiti, prurigo nodülarisi, egzemayi, pruritusu, vitiligoyu, alopesi areatayi (saçkirani), akne rozaseayi, akne vulgarisi, büllöz pemfigoidi veya kontakt dermatiti tedavi etmede kullanilmasi için istemler 1 ila 5”ten herhangi birine göre izole edilmis monoklonal antikordur veya bunun antijen- baglama fragmanidir. . Bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici ile kombinasyon hâlinde, istem 6'ya göre kullanimdir veya istem 7'ye göre kullanilmasi için izole edilmis monoklonal antikordur veya bunun antijen-baglama fragmanidir.