TH7610C3 - วิธีการตรวจหาไวรัสแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอายโนดาไวรัส (Macrobrachium rosenbergii nodavirus, MrNV) และชุดตรวจหาไวรัวดังกล่าว - Google Patents

Abstract

DC60 (21/09/55) การประดิษฐ์นี้เกี่ยวข้องกับการตรวจหาไวรัสแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย โนดาไวรัส (Macrobrachium rosenbergii nodavirus, MrNV) ซึ่งเป็นโรคที่ทำให้กล้ามเนื้อกุ้งขาวขุ่น ลูกกุ้งระยะ โพสต์ ลาร์วี (post larvae) ไม่คว่ำตัว และตายทั้งในลูกกุ้งและกุ้งโตเต็มวัย โดยการประดิษฐ์นี้ได้จัดให้ มีการสร้างไพร์เมอร์ใหม่จำนวน 2 คู่ โดยคู่หนึ่งที่ตรวจหาไวรัสแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย ดาโนไวรัสร่วมกับไพรเมอร์ที่มีการเปิดเผยอยู่แล้ว ด้วยเทคนิควิธีรีเวอร์ส ทรานสคริปชั่น พีซีอาร์ 2 ขั้นตอน แบบใช้หลอดพีซีอาร์หลอดเดียว (single tube nested PCR technique) ส่วนไพรเมอร์ที่สร้างขึ้น คู่ที่เหลือทำหน้าที่ควบคุมปฏิกิริยาภายในของพีซีอาร์ ซึ่งการตรวจหาไวรัสด้วยวิธีพีซีอาร์ร่วมกับการใช้ ไพรเมอร์ที่กล่าวนี้สามารถเพิ่มความไว ความแม่นยำของการตรวจได้มากขึ้น และลดโอกาสการ ปนเปื้อนเชื้ออื่นให้น้อยลง โดยใช้เวลาน้อยกว่า การใช้วิธีรีเวอร์ส ทรานสคริปชั่น พีซีอาร์ขั้นตอนเดียว (single PCR) หรือ วิธีรีเวอร์ส ทรานสคริปชั่น พีซีอาร์ 2 ขั้นตอน แบบใช้หลอดพีซีอาร์ 2 หลอด (two tube nested PCR technique) นอกจากนี้ยังได้ผลิตชุดตรวจหาไวรัสแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย ดาโน ไวรัส ขึ้นเพื่อความสะดวก รวดเร็วในการตรวจสอบ และราคาถูก ซึ่งการตรวจหาไวรัสแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย โนดาไวรัส มีความสำคัญและจำเป็นต่อระบบการผลิตพ่อแม่พันธุ์กุ้งก้ามกราม การเลี้ยง กุ้งก้ามกราม ตลอดจนการตรวจสอบยืนยันผลิตภัณฑ์กุ้งก้ามกรามที่นำเข้าและส่งออกไปต่างประเทศ การประดิษฐ์นี้เกี่ยวข้องกับการตรวจวินิจฉัยโรคแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย โนดาไวรัส (Macrobrachium rosenbergil nodavirus, MrNV) ซึ่งเป็นโรคที่ทำให้กล้ามเนื้อกุ้งขาวขุ่น ลูกกุ้งระยะ โพสต์ ลาร์วี (post larvae) ไม่คว่ำตัว และตายทั้งในลูกกุ้งและกุ้งโตเต็มวัย โดยจัดให้มีการสร้างไพร์ เมอร์ของแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย ดาโนไวรัส และนำมาใช้กับวิธีรีเวอร์ส ทรานสคริปชั่น พีซีอาร์ 2 ขั้นตอน แบบใช้หลอดพีซีอาร์หลอดเดียว (single tube nested PCR technique) ซึ่งมีความไว ความ แม่นยำมากขึ้น และใช้เวลาน้อยกว่า การใช้วิธีรีเวอร์ส ทรานสคริปชั่น พีซีอาร์ขั้นตอนเดียว (single PCR) หรือ วิธีรีเวอร์ส ทรานสคริปชั่น พีซีอาร์ 2 ขั้นตอน แบบใช้หลอดพีซีอาร์ 2 หลอด (two tube nested PCR technique) นอกจากนี้ยังได้ผลิตชุดตรวจวินิจฉัยแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย ดาโนไวรัส ขึ้นเพื่อ ความสะดวก รวดเร็วในการตรวจสอบ และราคาถูก โดยการตรวจวินิจฉัยโรคแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอ จิอาย โนดาไวรัส มีความสำคัญและจำเป็นต่อระบบการผลิตพ่อแม่พันธุ์กุ้ง การเลี้ยงกุ้ง ตลอดจนการ ตรวจสอบยืนยันผลิตภัณฑ์กุ้งที่นำเข้าและส่งออกไปต่างประเทศ

Claims (8)

1. ไพร์เมอร์ (primer) จำนวน 2 คู่ ที่ใช้สำหรับตรวจวินิจฉัยแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย โนดา ไวรัส (Macrobrachium rosenbergil nodavirus, MrNV) ได้อย่างจำเพาะ ซึ่งประกอบด้วยลำดับ นิวคลีโอไทด์ ดังนี้ MrNV-F-N 5\'- GAT GTC GAT CAG TTA CTT AGG C-3\' MrNV-R-N 5\'- GTG AAA CTT CCA CTG GTG TAG-3\' MrNV18S-F 5\'- GAG CCA GAG GTA ATG ATA AAG A-3\' MrNV18S-R 5\'- GCT CTT AAT CTG TCA ATC CTT C-3\'

2. การตรวจวินิจฉัยไวรัสแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย โนดาไวรัส ด้วยวิธีรีเวอร์ส ทรานสคริปชั่น พีซีอาร์ 2 ขั้นตอน แบบใช้หลอดพีซีอาร์หลอดเดียว (single tube nested PCR technique) โดยใช้ ไพร์เมอร์จากข้อถือสิทธิที่ 1 มีขั้นตอนดั้งนี้ 2.1 เตรียมตัวอย่างกุ้งที่ต้องการตรวจไวรัสแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย โนดาไวรัส มาสกัด อาร์เอ็นเอ 2.2 นำดีเอ็นเอจากข้อ 2.1 มาตรวจหาไวรัสโดยผ่านกระบวนการรีเวอร์ส ทรานสคริปชั่น พีซีอาร์ ขั้นตอนที่หนึ่ง (First step RT-PCR) 2.3 นำผลผลิตที่ได้จากกระบวนการพีซีอาร์ขั้นตอนที่หนึ่งในข้อ 2.2 มาทำปฏิกิริยาต่อใน กระบวนการรีเวอร์ส ทรานสคริปชั่น พีซีอาร์ขั้นตอนที่สอง (Nested step PCR) 2.4 นำผลผลิตพีซีอาร์ที่ได้จากข้อ 2.3 มาตรวจสอบขนาดโดยใช้เทคนิคเจลอิเล็คโทรโฟรีซิส

3. การตรวจวินิจฉัยแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย โนดาไวรัส ตามข้อถือสิทธิที่ 2 ที่ซึ่ง การทำ ปฏิกิริยากระบวนการรีเวอร์ส ทรานสคริปชั่น พีซีอาร์ ขั้นตอนที่หนึ่ง มีส่วนประกอบของปฏิกิริยา คือ 2X PCR buffer 10 ไมโครลิตร (มิวL) 1มิวM Mr18S-F 0.2 มิลลิลิตร (mL) 1มิวM Mr18S-R 0.2 มิลลิลิตร (mL) 1มิวM MrNV-F 0.5 มิลลิลิตร (mL) 1มิวM MrNV-R 0.5 มิลลิลิตร (mL) RT/Tag Supercript lll 0.5 ไมโครลิตร (mL) Template 2.0 ไมโครลิตร (มิวL) น้ำกลั่น (DW) 1.1 ไมโครลิตร (มิวL) รวม 15.0 ไมโครลิตร (มิวL) ปฏิกิริยาพีซีอาร์ ที่ใช้คือ 94 ํซ. 2 นาที 94 ํซ. 20 วินาที 55 ํซ. 30 วินาที 15 รอบ (cycles) 72 ํซ. 30 วินาที 72 ํซ. 2 นาที 20 ํซ. oc

4. การตรวจวินิจฉัยแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย โนดาไวรัส ตามข้อถือสิทธิที่ 2 ที่ซึ่ง การทำ ปฏิกิริยากระบวนการรีเวอร์ส ทรานสคริปชั่น พีซีอาร์ ขั้นตอนที่สอง มีส่วนประกอบของปฏิกิริยา คือ 10 x PCR buffer 2.5 มิวL 50mM MgCl2 0.75 มิวL 10mM dNTPs 0.5 มิวL 10มิวM Mr18S-F 0.1 มิวL 10มิวM Mr18S-R 0.1 มิวL 10มิวM MrNV-F-N 0.4 มิวL 10มิวM MrNV-R-N 0.4 มิวL 5 Unit Tag DNA Polymerase 0.25 มิวL น้ำกลั่น (DDW) 10.0 มิวL First step PCR 15.0 มิวL รวม 30.0 มิวL ปฏิกิริยาพีซีอาร์ ที่ใช้คือ 94 ํซ. 2 นาที 94 ํซ. 20 วินาที 50 ํซ. 30 วินาที 30 รอบ (cycles) 72 ํซ. 30 วินาที 72 ํซ. 2 นาที 20 ํซ. oc

5. การตรวจวินิจฉัยแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย โนดาไวรัส ตามข้อถือสิทธิที่ 2 - 4 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง ผลิตผลที่ได้จากกระบวนการรีเวอร์ส ทรานสคริปชั่น พีซีอาร์ กรณีกุ้งติดเชื้อแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย โนดาไวรัส แบบรุนแรง จะพบผลิตผลทั้งในกระบวนการพีซีอาร์ขั้นตอนที่หนึ่ง และ กระบวนการพีซีอาร์ขั้นตอนที่สอง

6. การตรวจวินิจฉัยแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย โนดาไวรัส ตามข้อถือสิทธิที่ 2 - 4 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง ผลิตผลที่ได้จากกระบวนการรีเวอร์ส ทรานสคริปชั่น พีซีอาร์ กรณีกุ้งติดเชื้อแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย โนดาไวรัส แบบรุนแรง จะพบผลิตผลในกระบวนการพีซีอาร์ขั้นตอนที่สอง เท่านั้น

7. การตรวจวินิจฉัยแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย โนดาไวรัส ตามข้อถือสิทธิที่ 2 - 6 ข้อใดข้อ หนึ่ง ใช้กับกุ้งก้ามกราม

8. ชุดตรวจวินิจฉัยแมคโคบราเคี่ยม โรเซนเบอจิอาย โนดาไวรัส ด้วยวิธีตามข้อถือสิทธิที่ 2 - 4 ข้อใด ข้อหนึ่ง ที่ประกอบด้วยแต่มิได้จำกัดเฉพาะ ดังนี้ 1 มิวM ของ ไพร์เมอร์ MrNV-F, ไพร์เมอร์ MrNV-R, ไพร์เมอร์ MrNV18S-F, ไพร์เมอร์ MrNV18S-R 10 มิวM ของ ไพร์เมอร์ MrNV-F-N, ไพร์เมอร์ MrNV-R-N, ไพร์เมอร์ MrNV18S-F และไพร์เมอร์ MrNV18S-R 1.5 mM MgCl2, 10mM dNTP และ ตัวควบคุมบวก (positive control)