TH26026Y - ชุดไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนโอเพ่นรีดดิ้งเฟรมแปด (ORF8) ยีนเอ็นเวโลป (E) ยีนนิวคลีโอแคปสิด (N) และยีนเอ็นเอสพีเก้า (NSP9) ของเชื้อไวรัส SARS-CoV-2 และกรรมวิธีการตรวจหาเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ด้วยเทคนิคมัลติเพล็กซ์แลมป์ร่วมกับชุดไพรเมอร์ดังกล่าว - Google Patents

Abstract

OCR 09WP 08/07/2568 การประดิษฐ์นี้เกี่ยวข้องกับชุดไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนโอเพ่นรีดดิ้งเฟรมแปด (ORF8) และยีน เอ็นเวโลป (E) ยีนนิวคลีโอแคปสิด (N) และยีนเอ็นเอสพีเก้า (NSP9) และกรรมวิธีการตรวจเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี- ทู (SARS-CoV-2) ที่ตำแหน่งยีนดังกล่าว ร่วมกับ ยีนนิวคลีโอแคปสิด(N) และยีนเอ็นเอสพีเก้า (NSP9) ด้วย เทคนิคมัลติเพล็กซ์แลมป์ (multiplex, colorimetric LAMP) ที่สามารถอ่านผลได้อย่างชัดเจนด้วยตาเปล่า จากการเปลี่ยนสีของน้ำยาทดสอบได้ ด้วยการใช้สีไซลีนอลออเรนจ์ (Xylenol Orange) เป็นตัวบ่งชี้ปฏิกิริยา ซึ่งเป็นวิธีที่ง่าย (ขั้นตอนเดียว) รวดเร็ว (75 นาที) และไม่เกิดปฏิกิริยาข้าม (Cross reaction) กับเชื้อก่อโรค ทางเดินหายใจอื่น ๆ ปริมาณของเชื้อไวรัสเป้าหมายที่น้อยที่สุดที่เทคนิคนี้สามารถตรวจได้ร้อยละ 100 คือ 4,000 สำเนา/มิลลิลิตร อย่างไรก็ตามที่ 2,000 สำเนา/มิลลิลิตร ก็สามารถตรวจได้เช่นกันที่ร้อยละ 16.7

Claims (9)

OCR 09WP 08/07/2568

1. ชุดไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนโอเพ่นรีดดิ้งเฟรมแปด (ORF8) ยีนเอ็นเวโลป (E) ยีนนิวคลีโอแคปสิด (N) และ ยีนเอ็นเอสพีเก้า (NSP9) ของเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ประกอบด้วย ก. ชุดไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนโอเพ่นรีดดิ้งเฟรมแปด (ORF8) มีลำดับนิวคลีโอไทด์ ดังนี้ • ฟอร์เวิร์ด เอาท์เตอร์ ไพรเมอร์ (F3): 5'-TAGGAATCATCACAACTGTAGC -3' • แบ็คเวิร์ด เอาท์เตอร์ ไพรเมอร์ (B3): 5'-ACAACGCACTACAAGACTAC -3' • ฟอร์เวิร์ด อินเนอร์ ไพรเมอร์ (FIP): 5'-GTGAATAGGACACGGGTCAG-TTTT-CAGTCATGTACTCAACATCAAC -3' • แบ็คเวิร์ด อินเนอร์ ไพรเมอร์ (BIP): 5'-AATCACCCATTCAGTACATCGA-TTTT-CCAATTTAGGTTCCTGGCA -3' • ฟอร์เวิร์ด ลูปไพรเมอร์ (LF): 5'-AGGTGCTGATTTTCTAGCTCCT -3' • แบ็คเวิร์ด ลูปไพรเมอร์ (LB): 5'-TTTAATTGAATTGTGCGTGGATG -3' ข. ชุดไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนเอ็นเวโลป (E) มีลำดับนิวคลีโอไทด์ ดังนี้ • ฟอร์เวิร์ด เอาท์เตอร์ ไพรเมอร์ (F3): 5'-CCGACGACGACTACTAGC -3' • แบ็คเวิร์ด เอาท์เตอร์ ไพรเมอร์ (B3): 5'-AGCAGTACGCACACAATC -3' • ฟอร์เวิร์ด อินเนอร์ ไพรเมอร์ (FIP): 5'-TGTCTCTTCCGAAACGAATGAGTTTTTGTGCCTTTGTAAGCACAAG -3' • แบ็คเวิร์ด อินเนอร์ ไพรเมอร์ (BIP): 5'-AGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTTTTGAAGCGCAGTAAGGATGG -3' • ฟอร์เวิร์ด ลูปไพรเมอร์ (LF): 5'- ACATAAGTTCGTACTCATCAG -3' • แบ็คเวิร์ด ลูปไพรเมอร์ (LB): 5'- GGTATTCTTGCTAGTTACACT -3' ค. ชุดไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนนิวคลีโอแคปสิด (N) มีลำดับนิวคลีโอไทด์ ดังนี้ • ฟอร์เวิร์ด เอาท์เตอร์ ไพรเมอร์ (F3): 5'-CAAGGCGTTCCAATTAACAC-3' • แบ็คเวิร์ด เอาท์เตอร์ ไพรเมอร์ (B3): 5'-TTGGTGTATTCAAGGCTCC-3' • ฟอร์เวิร์ด อินเนอร์ ไพรเมอร์ (FIP): 5'-ACCGTCACCACCACGAATTCTAGCAGTCCAGATGACCAA-3' • แบ็คเวิร์ด อินเนอร์ ไพรเมอร์ (BIP): 5'-CTAGGAACTGGGCCAGAAGCACCCATATGATGCCGTCT-3' • ฟอร์เวิร์ด ลูป ไพรเมอร์ (LF): 5'-TAGCTCTTCGGTAGTAGCCA -3' • แบ็คเวิร์ด ลูป ไพรเมอร์ (LB): 5'-GACTTCCCTATGGTGCTAACAA -3' ง. ชุดไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนเอ็นเอสพีเก้า (NSP9) มีลำดับนิวคลีโอไทด์ ดังนี้ • ฟอร์เวิร์ด เอาท์เตอร์ ไพรเมอร์ (F3): 5'-TAATGAGCTTAGTCCTGTTGC-3' • แบ็คเวิร์ด เอาท์เตอร์ ไพรเมอร์ (B3): 5'-AGGTGGTTCCAGTTCTGTA-3' • ฟอร์เวิร์ด อินเนอร์ ไพรเมอร์ (FIP): 5'-AGCTAACGCATTGTCATCAGTG/TTTT/ACAGATGTCTTGTGCTGC-3' • แบ็คเวิร์ด อินเนอร์ ไพรเมอร์ (BIP): 5'-AACACAACAAAGGGAGGTAGGT/TTTT/GTACCAGTTCCATCACTCTTAG-3' • ฟอร์เวิร์ด ลูป 1 ไพรเมอร์ (LF1): 5'-CAAGCAGTTTGTGTAGTACCG-3' • แบ็คเวิร์ด ลูป 1 ไพรเมอร์ (LB1): 5'-TTGTACTTGCACTGTTATCCGA-3' • ฟอร์เวิร์ด ลูป 2 ไพรเมอร์ (LF2): 5'-TCAGATCCTGTAGAT-3' • แบ็คเวิร์ด ลูป 2 ไพรเมอร์ (LB2): 5'-AATAAGCTAGATTCCC-3'

2. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ด้วยเทคนิคมัลติเพล็กซ์แลมป์ร่วมกับชุด ไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนโอเพ่นรีดดิ้งเฟรมแปด (ORF8) ยีนเอ็นเวโลป (E) ยีนนิวคลีโอแคปสิด (N) และยีน เอ็นเอสพีเก้า (NSP9) ของเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง มีขั้นตอนดังนี้ ก. การนำสารพันธุกรรมที่สกัดได้จากตัวอย่างเป้าหมาย มาทำปฏิกิริยามัลติเพล็กซ์แลมป์ด้วย น้ำยามัลติเพล็กซ์แลมป์และชุดไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนโอเพ่นรีดดิ้งเฟรมแปด (ORF8) ยีน เอ็นเวโลป (E) ยีนนิวคลีโอแคปสิท (N) และยีนเอ็นเอสพีเก้า (NSP9) ข. การอ่านผลการทำปฏิกิริยาจากผลผลิตมัลติเพล็กซ์แลมป์ที่ได้จากข้อ ก.

3. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ด้วยเทคนิคมัลติเพล็กซ์แลมป์ร่วมกับชุด ไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนโอเพ่นรีดดิ้งเฟรมแปด (ORF8) ยีนเอ็นเวโลป (E) ยีนนิวคลีโอแคปสิด (N) และยีน เอ็นเอสพีเก้า (NSP9) ของเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ตามข้อถือสิทธิที่ 2 ที่ซึ่ง สารพันธุกรรม ดังกล่าว คือ อาร์เอ็นเอ

4. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ด้วยเทคนิคมัลติเพล็กซ์แลมป์ร่วมกับชุด ไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนโอเพ่นรีดดิ้งเฟรมแปด (ORF8) ยีนเอ็นเวโลป (E) ยีนนิวคลีโอแคปสิด (N) และยีน เอ็นเอสพีเก้า (NSP9) ของเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ตามข้อถือสิทธิที่ 2 ที่ซึ่ง ตัวอย่างเป้าหมาย ดังกล่าว เลือกได้จาก สารคัดหลั่งจากทางเดินหายใจส่วนบน, สารคัดหลั่งจากทางเดินหายใจส่วนล่าง, น้ำลาย, อุจจาระ, เชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) อย่างใดอย่างหนึ่งหรือหลายอย่างรวมกัน

5. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ด้วยเทคนิคมัลติเพล็กซ์แลมป์ร่วมกับชุด ไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนโอเพ่นรีดดิ้งเฟรมแปด (ORF8) ยีนเอ็นเวโลป (E) ยีนนิวคลีโอแคปสิด (N) และยีน เอ็นเอสพีเก้า (NSP9) ของเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ตามข้อถือสิทธิที่ 2 ที่ซึ่ง น้ำยามัลติเพล็กซ์ แลมป์ดังกล่าวมีองค์ประกอบดังนี้ • เอาท์เทอร์ไพรเมอร์ (F3 และ B3) สำหรับยีนโอเพ่นรีดดิ้งเฟรมแปด (ORF8) อย่างละ 0.1-0.2 ไมโครโมลาร์ • เอาท์เทอร์ไพรเมอร์ (F3 และ B3) สำหรับยีนเอ็นเวโลป (E) อย่างละ 0.1-0.2 ไมโครโมลาร์ • เอาท์เทอร์ไพรเมอร์ (F3 และ B3) สำหรับยีนเอ็นเอสพีเก้า (NSP9) อย่างละ 0.1-0.2 ไมโคร โมลาร์ • เอาท์เทอร์ไพรเมอร์ (F3 และ B3) สำหรับยีนนิวคลิโอแคปสิด(N) อย่างละ 0.1-0.2 ไมโคร โมลาร์ • อินเนอร์ไพรเมอร์ (FIP และ BIP) สำหรับยีนโอเพ่นรีดดิ้งเฟรมแปด (ORF8) อย่างละ 1-2 ไมโครโมลาร์ • อินเนอร์ไพรเมอร์ (FIP และ BIP) สำหรับยีนเอ็นเวโลป (E) อย่างละ 1-2 ไมโครโมลาร์ • อินเนอร์ไพรเมอร์ (FIP และ BIP) สำหรับยีนเอ็นเอสพีเก้า (NSP9) อย่างละ 1-2 ไมโครโมลาร์ • อินเนอร์ไพรเมอร์ (FIP และ BIP) สำหรับยีนนิวคลีโอแคปสิด(N) อย่างละ 1-2 ไมโครโมลาร์ • ลูปไพรเมอร์ (LF และ LB) สำหรับยีนโอเพ่นรีดดิ้งเฟรมแปด (ORF8) อย่างละ 0.5-1 ไมโคร โมลาร์ • ลูปไพรเมอร์ (LF1, LB1, LF2 และ LB2) สำหรับยีนเอ็นเอสพีเก้า (NSP9) อย่างละ 0.5-1 ไมโครโมลาร์ • ลูปไพรเมอร์ (LF และ LB) สำหรับยีนนิวคลีโอแคปสิด(N) อย่างละ 0.5-1 ไมโครโมลาร์ • บัฟเฟอร์ ความเข้มข้น 1 เท่า • สารดีออกซีนิวคลีโอไทด์ไตรฟอสเฟต ความเข้มข้น 1 ถึง 2 มิลลิโมลาร์ • สารละลายแมกนีเซียมซัลเฟต ความเข้มข้น 4 ถึง 10 มิลลิโมลาร์ • สารเบตาอีน ความเข้มข้น 0.2 ถึง 0.8 โมลาร์ • เอนไซม์ บีเอสที ดีเอ็นเอพอลิเมอร์เรส (Bst DNA polymerase) ปริมาณ 4 ถึง 16 หน่วย • เอนไซม์รีเวิร์สทรานสคริปเตส (Reverse Transcriptase) ปริมาณ 3 ถึง 15 หน่วย ต่อตัวอย่างทดสอบปริมาตร 5-10 ไมโครลิตร และปรับปริมาตรสุดท้ายด้วยน้ำกลั่นให้เป็น 25 ไมโครลิตร

6. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ด้วยเทคนิคมัลติเพล็กซ์แลมป์ร่วมกับชุด ไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนโอเพ่นรีดดิ้งเฟรมแปด (ORF8) ยีนเอ็นเวโลป (E) ยีนนิวคลีโอแคปสิด (N) และยีน เอ็นเอสพีเก้า (NSP9) ของเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ตามข้อถือสิทธิ์ที่ 5 ที่ซึ่ง น้ำยามัลติเพล็กซ์ แลมป์ดังกล่าว ประกอบเพิ่มเติมด้วย • ออกทิลฟีนอล อีทอกซีเลต (Octylphenol Ethoxylate) ความเข้มข้น 0 ถึง 0.12 เปอร์เซ็นต์ โดยปริมาตรต่อปริมาตร • สีไซลีนอลออเรนจ์ (Xylenol orange) ความเข้มข้น 0.05 ถึง 0.25 มิลลิโมลาร์

7. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ด้วยเทคนิคมัลติเพล็กซ์แลมป์ร่วมกับชุด ไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนโอเพ่นรีดดิ้งเฟรมแปด (ORF8) ยีนเอ็นเวโลป (E) ยีนนิวคลีโอแคปสิด (N) และยีน เอ็นเอสพีเก้า (NSP9) ของเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ตามข้อถือสิทธิที่ 2 ที่ซึ่ง การทำปฏิกิริยา มัลติเพล็กซ์แลมป์ดังกล่าว กระทำที่ อุณหภูมิ 60 - 70 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 - 75 นาที

8. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ด้วยเทคนิคมัลติเพล็กซ์แลมป์ร่วมกับชุด ไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนโอเพ่นรีดดิ้งเฟรมแปด (ORF8) ยีนเอ็นเวโลป (E) ยีนนิวคลีโอแคปสิด (N) และยีน เอ็นเอสพีเก้า (NSP9) ของเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ตามข้อถือสิทธิที่ 7 ที่ซึ่ง การทำปฏิกิริยา มัลติเพล็กซ์แลมป์ที่เหมาะสม คือ ที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 75 นาที

9. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ด้วยเทคนิคมัลติเพล็กซ์แลมป์ร่วมกับชุด ไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนโอเพ่นรีดดิ้งเฟรมแปด (ORF8) ยีนเอ็นเวโลป (E) ยีนนิวคลีโอแคปสิด (N) และยีน เอ็นเอสพีเก้า (NSP9) ของเชื้อไวรัสซาร์ส-โควี-ทู (SARS-CoV-2) ตามข้อถือสิทธิที่ 2 ที่ซึ่ง การอ่านผลการ ทำปฏิกิริยาจากผลผลิตมัลติเพล็กซ์แลมป์ดังกล่าว ทำได้โดย การมองด้วยตาเปล่าการมองด้วยตาเปล่าโดย ดูจากสีของน้ำยาทดสอบเปลี่ยนจากม่วงเป็นเหลือง การทำเจลอิเล็กโตรโฟเรซีส อย่างใดอย่างหนึ่งหรือ หลายอย่างรวมกัน