TH2003003259C3 - กรรมวิธีการตรวจสอบยีนของเชื้อซาร์-โควี2 (SAR-CoV2) ที่ก่อโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 ด้วยแถบสีแบบขั้นตอนเดียว - Google Patents

Abstract

กรรมวิธีการตรวจสอบยีนของเชื้อซาร์-โควี2 (SAR-CoV2) ที่ก่อโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 ด้วยแถบสี แบบขั้นตอนเดียว เริ่มจากการออกแบบไพรเมอร์ 5 เส้น ที่จำเพาะต่อลำดับเบสของเชื้อซาร์-โควี2 (SAR-CoV2) ก่อโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 บนยีนนิวคลิโอแคปสิด (nucleocapsid ;N) ซึ่งโดยให้ไพรเมอร์ 1 เส้นติดฉลาก ด้วยไบโอติน (biotin) หรือไดกอกซิเจนิน (Digoxigenin) และให้ไพรเมอร์อีก 1 เส้นติดฉลากด้วยสารเรืองแสง (FITC) ในการติดตามปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นบนแผ่นดิพสติค (dipstick) ในระบบนี้ดีเอ็นเอเป้าหมายจะถูกเพิ่มปริมาณ ภายใต้อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 90 นาที ในกล่องให้ความร้อน (heating block) แล้วอ่านผลบน แผ่นติพสติค (dipstick) เมือให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู บริเวณแถบทดสอบ (T) และแถบควบคุม (C) แสดงว่า ในตัวอย่างพบเชื้อซาร์-โควี2 (SAR-COV2) แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น วิธีการนี้เทียบเท่ากับการตรวจสอบด้วยเทคนิคพีซีอาร์ (PCR) แบบเรียลไทม์ (real time) อีกทั้งยังไม่ ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR) และเครื่องแยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้าในการติดตามผลของปฏิกิริยา

Claims (2)

1. กรรมวิธีการตรวจสอบยีนของเชื้อซาร์-โควี2 (SAR-COV2) ที่ก่อโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 ด้วยแถบ สีแบบขั้นตอนเดียวที่ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้แผ่นดิพสติค (dipstick) การทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) 25 ไมโครลิตร ประกอบด้วย ฟอร์เวิร์ดอินเนอรไพรเมอร์ (FIP) และแบ คเวิร์ดอินเนอร์ไพรเมอร์ (BIP) อย่างละ 50 พิโคโมล, ฟอร์เวิร์ดเอาเทอร์ไพรเมอร์ (F3), แบคเวิร์ดเอาเทอร์ไพร เมอร์ (B3) และโพรบไพรเมอร์ (probe) อย่างละ 5 พิโคโมล, ดีเอ็นทีพี (dNTP) 0.8 มิลลิโมลาร์ผสมด้วยสารเบตา อีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์ บีเอสที ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst DNA polymerase) 8 U เอนไซม์ริเวิร์สทรานสคริปเตส (reverse transcriptase)

2.5 U และสารละลาย บัฟเฟอร์ ด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 90 นาที จากนั้นดูด สารละลายดังกล่าวจำนวน 5 ไมโครลิตรใส่ในหลอดใหม่ที่มีสารละลายบัฟเฟอร์ 100 ไมโครลิตรที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจุ่มแผ่นดิพสติค (dipstick) ลงในสารละลาย 5 นาที แล้วอ่านผลบนแผ่นดิพสติค (dipstick) เมื่อให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู บริเวณแถบทดสอบ (T) และแถบควบคุม (C) แสดงว่า ในตัวอย่างพบเชื้อซาร์-โควี2 (SAR-CoV2) แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น และเป็นการตรวจสอบหา เชื้อซาร์-โควี2 (SAR-COV2) ด้วยแผ่นดิพสติค (dipstick) ในผู้ป่วยที่สงสัยการติดเชื้อนี้ เพื่อการตรวจวินิจฉัยและ ป้องกันการระบาดของโรค กรรมวิธีนี้ออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิคแลมป์ (LAMP) ที่ใช้ในการตรวจเชื้อซาร์-โค วี2 (SAR-COV2) ในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ประกอบด้วยไพรเมอร์ 5 เส้น ที่จำเพาะต่อลำดับเบสของเชื้อซาร์-โควี 2 (SAR-CoV2) ก่อโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 บนยีนนิวคลิโอแคปสิด (nucleocapsid ;N) โดยให้ฟอร์เวิร์ดอิน เนอร์ไพรเมอร์ (FIP) ติดฉลากด้วยไบโอติน (biotin) หรือไดกอกซิเจนิน (Digoxigenin) และให้โพรบไพรเมอร์ (probe) ติดฉลากด้วยสารเรืองแสง (FITC) ในการติดตามปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นบนแผ่นดิพสติค (dipstick) ดังนี้ ฟอร์เวิร์ดเอาเทอร์ไพรเมอร์ (F3) ลำดับเบส (5'-3') TGGACCCCAAAATCAGCG แบคเวิร์ดเอาเทอร์ไพรเมอร์ (B3) ลำดับเบส (5'-3') GCCTTGTCCTCGAGGGAAT แบคเวิร์ดอินเนอร์ไพรเมอร์ (BIP) ลำดับเบส (5'-3') CCACTGCGTTCTCCATTCTGGTTTTTTAAATGCACCCCGCATTACG ฟอร์เวิร์ดอินเนอร์ไพรเมอร์ (FIP) ลำดับเบส (5'-3') biotin/Dig-CGCGATCAAAACAACGTCGGCTTTTCCTTGCCATGTTGAGTGAGA โพรบไพรเมอร์ (probe) ลำดับเบส (5'-3') FITC -GTTTACCCAATAATACTGCGTCTTG Dig = ไดกอกซิเจนิน (Digoxigenin)