กรรมวิธีการตรวจสอบยีนของเชื้อซาร์-โควี2 (SAR-CoV2) ที่ก่อโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 ด้วยแถบสี แบบขั้นตอนเดียว เริ่มจากการออกแบบไพรเมอร์ 5 เส้น ที่จำเพาะต่อลำดับเบสของเชื้อซาร์-โควี2 (SAR-CoV2) ก่อโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 บนยีนนิวคลิโอแคปสิด (nucleocapsid ;N) ซึ่งโดยให้ไพรเมอร์ 1 เส้นติดฉลาก ด้วยไบโอติน (biotin) หรือไดกอกซิเจนิน (Digoxigenin) และให้ไพรเมอร์อีก 1 เส้นติดฉลากด้วยสารเรืองแสง (FITC) ในการติดตามปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นบนแผ่นดิพสติค (dipstick) ในระบบนี้ดีเอ็นเอเป้าหมายจะถูกเพิ่มปริมาณ ภายใต้อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 90 นาที ในกล่องให้ความร้อน (heating block) แล้วอ่านผลบน แผ่นติพสติค (dipstick) เมือให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู บริเวณแถบทดสอบ (T) และแถบควบคุม (C) แสดงว่า ในตัวอย่างพบเชื้อซาร์-โควี2 (SAR-COV2) แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น วิธีการนี้เทียบเท่ากับการตรวจสอบด้วยเทคนิคพีซีอาร์ (PCR) แบบเรียลไทม์ (real time) อีกทั้งยังไม่ ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR) และเครื่องแยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้าในการติดตามผลของปฏิกิริยา One-step colored stripe gene detection method for SARS-CoV2 (SAR-CoV2) that causes coronavirus disease 2019 First, we designed five primers specific to the 2019-coronavirus-causing coronavirus (SAR-CoV2) sequencing on the nucleocapsid gene. (nucleocapsid ;N), where one primer is labeled with biotin (biotin) or dioxogenin. One primer is fluorescently labeled (FITC) to monitor the reaction on the dipstick. In this system, the target DNA is amplified. under a temperature of 61 °C for 90 min in a heating block and read the results on a dipstick. When positive, a pink test line appears. The test strip (T) and control strip (C) areas indicate that the sample is infected with SARS-CoV2 (SAR-COV2), but if the result is negative, a pink test line will appear. control band (C) only. This method is equivalent to real-time PCR and does not PCR and electrolysis are required to monitor the reaction.
Claims (2)
1. กรรมวิธีการตรวจสอบยีนของเชื้อซาร์-โควี2 (SAR-COV2) ที่ก่อโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 ด้วยแถบ สีแบบขั้นตอนเดียวที่ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้แผ่นดิพสติค (dipstick) การทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) 25 ไมโครลิตร ประกอบด้วย ฟอร์เวิร์ดอินเนอรไพรเมอร์ (FIP) และแบ คเวิร์ดอินเนอร์ไพรเมอร์ (BIP) อย่างละ 50 พิโคโมล, ฟอร์เวิร์ดเอาเทอร์ไพรเมอร์ (F3), แบคเวิร์ดเอาเทอร์ไพร เมอร์ (B3) และโพรบไพรเมอร์ (probe) อย่างละ 5 พิโคโมล, ดีเอ็นทีพี (dNTP) 0.8 มิลลิโมลาร์ผสมด้วยสารเบตา อีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์ บีเอสที ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst DNA polymerase) 8 U เอนไซม์ริเวิร์สทรานสคริปเตส (reverse transcriptase)1. A one-step color band gene detection method consisting of LAMP reaction (LAMP) and application A 25 μl LAMP reaction dipstick containing 50 p each of forward inner primer (FIP) and back inner primer (BIP) was used. comole, forward outer primer (F3), back outer primer (B3) and probe primer (probe) 5 p.mol each, DNA. TP (dNTP) 0.8 molar with betaine 0.6 molar, magnesium sulfate (MgSO4) 4 molar, BST DNA polymerase. (Bst DNA polymerase) 8 U reverse transcriptase enzyme2.5 U และสารละลาย บัฟเฟอร์ ด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 90 นาที จากนั้นดูด สารละลายดังกล่าวจำนวน 5 ไมโครลิตรใส่ในหลอดใหม่ที่มีสารละลายบัฟเฟอร์ 100 ไมโครลิตรที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจุ่มแผ่นดิพสติค (dipstick) ลงในสารละลาย 5 นาที แล้วอ่านผลบนแผ่นดิพสติค (dipstick) เมื่อให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู บริเวณแถบทดสอบ (T) และแถบควบคุม (C) แสดงว่า ในตัวอย่างพบเชื้อซาร์-โควี2 (SAR-CoV2) แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น และเป็นการตรวจสอบหา เชื้อซาร์-โควี2 (SAR-COV2) ด้วยแผ่นดิพสติค (dipstick) ในผู้ป่วยที่สงสัยการติดเชื้อนี้ เพื่อการตรวจวินิจฉัยและ ป้องกันการระบาดของโรค กรรมวิธีนี้ออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิคแลมป์ (LAMP) ที่ใช้ในการตรวจเชื้อซาร์-โค วี2 (SAR-COV2) ในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ประกอบด้วยไพรเมอร์ 5 เส้น ที่จำเพาะต่อลำดับเบสของเชื้อซาร์-โควี 2 (SAR-CoV2) ก่อโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 บนยีนนิวคลิโอแคปสิด (nucleocapsid ;N) โดยให้ฟอร์เวิร์ดอิน เนอร์ไพรเมอร์ (FIP) ติดฉลากด้วยไบโอติน (biotin) หรือไดกอกซิเจนิน (Digoxigenin) และให้โพรบไพรเมอร์ (probe) ติดฉลากด้วยสารเรืองแสง (FITC) ในการติดตามปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นบนแผ่นดิพสติค (dipstick) ดังนี้ ฟอร์เวิร์ดเอาเทอร์ไพรเมอร์ (F3) ลำดับเบส (5'-3') TGGACCCCAAAATCAGCG แบคเวิร์ดเอาเทอร์ไพรเมอร์ (B3) ลำดับเบส (5'-3') GCCTTGTCCTCGAGGGAAT แบคเวิร์ดอินเนอร์ไพรเมอร์ (BIP) ลำดับเบส (5'-3') CCACTGCGTTCTCCATTCTGGTTTTTTAAATGCACCCCGCATTACG ฟอร์เวิร์ดอินเนอร์ไพรเมอร์ (FIP) ลำดับเบส (5'-3') biotin/Dig-CGCGATCAAAACAACGTCGGCTTTTCCTTGCCATGTTGAGTGAGA โพรบไพรเมอร์ (probe) ลำดับเบส (5'-3') FITC -GTTTACCCAATAATACTGCGTCTTG Dig = ไดกอกซิเจนิน (Digoxigenin)2.5 U and the buffer solution by doing a LAMP reaction at 61 °C for 90 min. Then 5 μl of the solution was aspirated into a new tube containing 100 μl of the buffer solution at room temperature. Then immerse the dipstick in the solution for 5 minutes and read the results on the dipstick when positive. A pink test line will appear. The test strip (T) and control strip (C) regions indicate that the sample has SARS-CoV2 (SAR-CoV2), but if the result is negative, a pink test line will appear. only the control bar (C) and is checked for SARS-CoV2 (SAR-COV2) with a dipstick in patients with suspected infection. for diagnosis and Prevent the spread of the disease. This method designed primers for the LAMP technique (LAMP) used in the detection of SARS-CoV2 (SAR-COV2). The Sar-CoV2 (SAR-CoV2) causative coronavirus 2019 base on the nucleocapsid gene. (nucleocapsid ;N) by forwarding in ner primer (FIP) labeled with biotin (biotin) or dioxogenin (Digoxigenin) and a fluorescently labeled primer probe (FITC) to monitor the reaction on the dipstick as follows: Forward Outer Primer ( F3) Base sequence (5'-3') TGGACCCCAAAATCAGCG Backward outer primer (B3), base sequence (5'-3') GCCTTGTCCTCGAGGGAAT Backward Inner Primer (BIP), base sequence (5'-3') CCACTGCGTTCTCCATTCTGGTTTTTTAAATGCACCCCGCATTACG Forward Inner Primer (FIP) Base Sequence (5'-3') biotin/Dig-CGCGATCAAAACAACGTCGGCTTTTCCTTGCCATGTTGAGTGAGA Probe Primer (probe) Base Sequence (5'-3') FITC -GTTTACCCAATAATACTGCGTCTTG Dig = Dig xigenin (Digoxigenin)
TH2003003259U2020-12-04
One-step colored band gene detection method for SARS-CoV2 (SAR-CoV2) that causes coronavirus disease 2019
TH2003003259C3
(en)
Multiplex real-time fluorescent quantitative PCR (polymerase chain reaction) kit and method for detecting 2019 novel coronavirus and primer probe composition