TH17936Y - กรรมวิธีการตรวจสอบยีนกลายพันธุ์ของเชื้อสแตฟิโลค็อกคัสออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) ด้วยแถบสี - Google Patents

Abstract

หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า บทสรุปการประดิษฐ์ กรรมวิธีการตรวจสอบยีนกลายพันธุ์ของเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อ ยาเมทิซิลิน (methicillin) ด้วยแถบสี เริ่มจากการออกแบบไพรเมอร์ 5 เส้น ที่จำเพาะต่อลำดับเบสของเชื้อสแต ฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) บนยีนเมคเอ (ทาecA) ซึ่งโดย ให้ไพรเมอร์ 1 เส้นติดฉลากด้วยไบโอติน (biotin) หรือไดกอกซิเจนิน (Digoxigenin) และให้ไพรเมอร์อีก 1 เส้นติด ฉลากด้วยสารเรืองแสง (FITC) ในการติดตามปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นบนแผ่นดิพสติค (dipstick) ในระบบนี้ดีเอ็นเอ เป้าหมายจะถูกเพิ่มปริมาณภายใต้อุณหภูมิอุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 45 นาที ในกล่องให้ความร้อน (heating block) แล้วอ่านผลบนแผ่นดิพสติค (dipstick) เมื่อให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู บริเวณแถบ ทดสอบ (T) และแถบควบคุม (C) แสดงว่า ในตัวอย่างพบเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยาเมทีซิลิน (methicillin) แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น วิธีการนี้เทียบเท่ากับการตรวจสอบด้วยเทคนิคพีซีอาร์ (PCR) แบบเรียลไทม์ (real time) อีกทั้งยังไม่ต้องใช้ เครื่องพีซีอาร์ (PCR) และเครื่องแยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้าในการติดตามผลของปฏิกิริยา

Claims (5)

------04/12/2563------(OCR)

1. กรรมวิธีการตรวจสอบยีนกลายพันธุ์ของเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) ด้วยแถบสี ที่ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้แผ่นดิพสติค (dipstick) การทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) 25 ไมโครลิตร ประกอบด้วยไพรเมอร์ 3 และไพรเมอร์ 4อย่างละ 50 พิโคโมล, ไพรเมอร์ 1 ไพรเมอร์ 2 และไพรเมอร์ 5 อย่างละ 5 พิโคโมล, ดีเอ็นทีพี (dNTP) 0.8 มิลลิโมลาริผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาริ, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSOa) 4 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์ บีเอสทีดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst DNA polymerase) 8 U และสารละลายบัฟเฟอร์ ด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP)ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 45 นาที จากนั้นดูดสารละลายดังกล่าวจำนวน 5 ไมโครลิตรใส่ในหลอดใหม่ที่มีสารละลายบัฟเฟอร์ 100 ไมโครลิตรที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจุ่มแผ่นติพสติค (dipstick) ลงในสารละลาย 5นาที แล้วอ่านผลบนแผ่นดิพสติค (dipstick) เมื่อให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู บริเวณแถบทดสอบ (T)และแถบควบคุม (C) แสดงว่า ในตัวอย่างพบเชื้อสแตฟิลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น วิธีการนี้ไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR thermal cycler) และเครื่องแยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้า และเป็นการตรวจสอบหาเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) ด้วยแผ่นดิพสติค(dipstick) ในผู้ป่วยที่สงสัยการติดเชื้อนี้ เพื่อการตรวจวินิจฉัยและป้องกันการระบาดของโรค กรรมวิธีนี้ออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิคแลมป์ (LAMP) ที่ใช้ในการตรวจเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcusaureus) ที่ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) ในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ประกอบด้วยไพรเมอริ 5 เส้น ที่จำเพาะต่อลำดับเบสของเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเพส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยาเมทีซิลิน (methicillin) บนยีนเมคเอ (mecA) โดยให้ไพรเมอร์ 4 ติดฉลากด้วยไบโอติน (biotin) หรือไดกอกซิเจนิน (Digoxigenin) และให้ไพรเมอร์ 5 ติดฉลากด้วยสารเรืองแสง (FITC) ในการติดตามปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นบนแผ่นดิพสติค (dipstick) ดังนี้ ไพรเมอร์ 1 ลำดับเบส (5'-3') CATTgATCgCAACgTTCAA ไพรเมอร์ 2 ลำดับเบส (5'-3') AgATACATTCTTTggAACgATg ไพรเมอร์ 3 ลำดับเบส (5'-3') TgCATT CCT ggAAT AAT gACgCTTTT gTTAAAgAAg AT ggTAT gT ggAAg ไพรเมอร์ 4 ลำดับเบส (5'-3') ไบโอติน (biotin)/ไดกอกซิเจนิน (Digoxigenin) CAg AACgT ggT AAAATTTTAg ACC gTTTT CCTAAT CTC ATAT gT gTT CCTgTA ไพรเมอร์ 5 ลำดับเบส (5'-3') FITC- AAAC AAT gT ggAATT ggCC A ------------ แก้ไข 04/12/2561 หน้า 1 ของจำนวน 2 หน้า ข้อถือสิทธิ

1. กรรมวิธีการตรวจสอบยีนกลายพันธุ์ของเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) ด้วยแถบสี ที่ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้ แผ่นดิพสติค (dipstick) การทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) 25 ไมโครลิตร ประกอบด้วยไพรเมอร์ 3 และไพรเมอร์ 4 อย่างละ 50 พิโคโมล, ไพรเมอร์ 1 ไพรเมอร์ 2 และไพรเมอร์ 5 อย่างละ 5 พิโคโมล, ดีเอ็นทีพี (dNTP) 0.8 มิลลิโม ลาร์ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์ บีเอสที ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst DNA polymerase) 8 U และสารละลายบัฟเฟอร์ ด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 45 นาที จากนั้นดูดสารละลายดังกล่าวจำนวน 5 ไมโครลิตรใส่ในหลอด ใหม่ที่มีสารละลายบัฟเฟอร์ 100 ไมโครลิตรที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจุ่มแผ่นดิพสติค (dipstick) ลงในสารละลาย 5 นาที แล้วอ่านผลบนแผ่นดิพสติค (dipstick) เมื่อให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู บริเวณแถบทดสอบ (T) และแถบควบคุม (C) แสดงว่า ในตัวอย่างพบเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยา เมทิซิลิน (methicillin) แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น วิธีการนี้ไม่ต้อง ใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR thermal cycler) และเครื่องแยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้า และเป็นการตรวจสอบ หาเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) ด้วยแผ่นดิพสติค (dipstick) ในผู้ป่วยที่สงสัยการติดเชื้อนี้ เพื่อการตรวจวินิจฉัยและป้องกันการระบาดของโรค กรรมวิธีนี้ออกแบบ ไพรเมอร์สำหรับเทคนิคแลมป์ (LAMP) ที่ใช้โนการตรวจเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) ในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ประกอบด้วยไพรเมอร์ 5 เส้น ที่จำเพาะต่อ ลำดับเบสของเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยาเมทิซิลิน(methicillin) บนยีน เมคเอ (mecA) โดยให้โพรเมอร์ 4 ติดฉลากด้วยไบโอติน (biotin) หรือไดกอกซิเจนิน(Digoxigenin) และให้ไพร เมอร์ 5 ติดฉลากด้วยสารเรืองแสง (FITC) ในการติดตามปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นบนแผ่นดิพสติค (dipstick) ดังนี้ ไพรเมอร์ 1 ลำดับเบส (5'-3') CATTgATCgCAACgTTCAA ไพรเมอร์ 2 ลำดับเบส (5'-3') AgAT AC ATT CTTT ggAACgAT ไพรเมอร์ 3 ลำดับเบส (5'-3') TgCATT CCT ggAAT AAT gACgCTTTT gTT AAAg AAgAT ggTAT gT ggAAg ไพรเมอร์ 4 ลำดับเบส (5'-3') biotin/Dig- c Ag AACgT ggT AAAATTTTAgACCgTTTT CCTAAT CT CATAT gT gTTCCT gT A ไพรเมอร์ 5 ลำดับเบส (5'-3') FITC- AAAC AAT gT ggAATT ggCCA Dig = Digoxigenin ---------------------------------------------------------------------------------------------------- หน้า 1 ของจำนวน 2 หน้า ข้อถือสิทธิ

1. กรรมวิธีการตรวจสอบยีนกลายพันธุ์ของเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) ด้วยแถบสีที่ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้ แผ่นดิพสติค (dipstick) ภายในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) 25 ไมใครลิตร ประกอบด้วยไพรเมอร์ 3 และไพรเมอร์ 4 อย่างละ 50 พิโคโมล, ไพรเมอร์ 1 ไพรเมอร์ 2 และไพรเมอร์ 5 อย่างละ 5 พิโคโมล, ดีเอ็นทีพี (dNTP) 0.8 มิลลิโม ลาร์ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSOa) 4 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์ บีเอสที ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst DNA polymerase) 8 U และสารละลายบัฟเฟอร์ ใช้โนการตรวจลำดับเบสของยีน กลายพันธุ์ของเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) บนยีน เมคเอ (mecA) การออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิคแลมป์ (LAMP) ที่ใช้โนการตรวจเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) ในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ประกอบด้วยไพรเมอร์ 5 เส้น ที่จำเพาะต่อลำดับเบสของเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) บนยีนเมคเอ (mecA) โดยให้โพรเมอร์ 4 ติดฉลากด้วยไบโอติน (biotin) หรือไดกอกซิเจนิน (Digoxigenin) และให้ไพรเมอร์ 5 ติดฉลากด้วยสารเรืองแสง (FITC) ในการติดตามปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นบนแผ่นดิพส ติค (dipstick) ดังนี้ ไพรเมอร์ 1 ลำดับเบส (5'-3') CATTgATCgCAACgTTCAA ไพรเมอร์ 2 ลำดับเบส (5'-3') AgAT AC ATT CTTT ggAACgAT ไพรเมอร์ 3 ลำดับเบส (5'-3') TgCATT CCT ggAAT AAT gACgCTTTT gTT AAAg AAgAT ggTAT gT ggAAg ไพรเมอร์ 4 ลำดับเบส (5'-3') biotin/Dig- c Ag AACgT ggT AAAATTTTAgACCgTTTT CCTAAT CT CATAT gT gTTCCT gT A ไพรเมอร์ 5 ลำดับเบส (5'-3') FITC- AAAC AAT gT ggAATT ggCCA Dig = Digoxigenin

2. กรรมวิธีการตรวจสอบยีนกลายพันธุ์ของเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) ด้วยแถบสีตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจผลผลิตจากแลมป์ (LAMP) บนแผ่นดิพสติค (dipstick) มีลักษณะเฉพาะคือ ทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 45 นาทีแล้ว ดูดสารละลายดังกล่าวจำนวน 5 ไมโครลิตรใส่ในหลอดที่มีสารละลายบัฟเฟอร์ 100 ไมโครลิตรที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจุ่มแผ่นดิพสติค (dipstick) ลงในสารละลาย 5 นาที แล้วอ่านผล

3. กรรมวิธีการตรวจสอบยีนกลายพันธุ์ของเชื้อสแตฟิโลค็อกคัล ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ ดื้อยาเมทีซิลิน (methicillin) ด้วยแถบสีตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) มีขนตอนการเพิ่มปริมาณ สารพันธุกรรมของเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยาเมทีซิลิน (methicillin) เป็น เวลา 45 นาที ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส โดยให้ไพรเมอร์ 4 ติดฉลากด้วยไบโอติน (biotin) หรือไดกอกซิเจนิน (Digoxigenin) และให้ไพรเมอร์ 5 ติดฉลากด้วยสารเรืองแสง (FITC) ในการติดตามปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นด้วยการอ่าน ผลบนแผ่นดิพสติค (dipstick) เมื่อให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู บริเวณแถบทดสอบ (T) และแถบ ควบคุม (C) แสดงว่า ในตัวอย่างพบเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยาเมทีซิลิน (methicillin) แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏเส้นทดสอบสีซมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น หน้า 2 ของจำนวน 2 หน้า

4. กรรมวิธีการตรวจสอบยีนกลายพันธุ์ของเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) ด้วยแถบสีตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งมีลักษณะเฉพาะคือ ไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR thermal cycler) และเครื่องแยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้า

5. กรรมวิธีการตรวจสอบยีนกลายพันธุ์ของเชื้อสแตฟิโลค็อกคัส ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) ด้วยแถบสีตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งเป็นเทคนิคการตรวจสอบหาเชื้อสแตฟิโลค็อกคัศ ออเรียส (Staphylococcus aureus) ที่ดื้อยาเมทิซิลิน (methicillin) ด้วยแถบสีในผู้ป่วยที่สงสัยการติดเชื้อนี้ เพื่อ การตรวจวินิจฉัยและป้องกันการระบาดของโรค