TH20199Y - กรรมวิธีการตรวจสอบการกลายพันธุ์ของยีนอะโพอี (apoe) ความเสี่ยงอัลไซเมอร์แบบขั้นตอนเดียวด้วยแถบสี - Google Patents

Abstract

------22/01/2564------(OCR) กรรมวิธีการตรวจสอบการกลายพันธุ์ของยีนอะโพอี (APOE) ความเสี่ยงอัลไซเมอร์แบบขั้นตอนเดียวด้วยแถบสี เริ่มจากการออกแบบไพรเมอร์ 10 เส้น ที่จำเพาะต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ตำแหน่งอาร์เอส (rs) 7412 และอาร์เอส (โร) 429358 บนยีนอะโพอี (APOE) ที่มีความเสี่ยงอัลไซเมอร์ โดยความจำเพาะในแต่ละตำแหน่งให้ไพรเมอร์ 1 เส้นติดฉลากด้วยไบโอติน (biotin) หรือไดกอกซิเจนิน (Digoxigenin) และให้ไพรเมอร์อีก 1 เส้นติดฉลากด้วยสารเรืองแสง (FITC) ในการติดตามปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นบนแผ่นดิพสติค (dipstick) ในระบบนี้ดีเอ็นเอจะเพิ่มปริมาณภายใต้อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 60 นาทีในกล่องให้ความร้อน (heating block) แล้วอ่านผลบนแผ่นดิพสติค (dipstick) เมื่อให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู บริเวณแถบทดสอบ (T) และแถบควบคุม(C) แสดงว่าในตัวอย่างพบเบสกลายพันธุ์ตำแหน่งอาร์เอส (rs) 7412 หรือ อาร์เอส (rs) 429358 บนยีนอะโพอี(APOE) ที่มีความเสี่ยงอัลไซเมอร์ แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น วิธีการนี้เทียบเท่ากับการตรวจสอบด้วยเทคนิคพีซีอาร์ (PCR) แบบเรียลไทม์ (real time) อีกทั้งยังไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์(PCR) และเครื่องแยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้าในการติดตามผลของปฏิกิริยา ------------ หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า บทสรุปการประดิษฐ์ กรรมวิธีการตรวจสอบการกลายพันธุ์ของยีนอะโพอี (APOE) ความเสี่ยงอัลไซเมอร์แบบขั้นตอนเดียวด้วย แถบสี เริ่มจากการออกแบบไพรเมอร์ 10 เส้น ที่จำเพาะต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ตำแหน่งอาร์เอส (rs) 7412 และ อาร์เอส (rs) 429358 บนยีนระโพอี (APOE) ที่มีความเสี่ยงอัลไซเมอร์ โดยความจำเพาะในแต่ละตำแหน่งให้ไพร เมอร์ 1 เส้นติดฉลากด้วยไบโอติน (biotin) หรือไดกอกซิเจนิน (Digoxigenin) และให้ไพรเมอร์อีก 1 เส้นติดฉลาก ด้วยสารเรืองแสง (FITC) ในการติดตามปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นบนแผ่นดิพสติค (dipstick) ในระบบนี้ดีเอ็นเอจะเพิ่ม ปริมาณภายใต้อุณหภูมิ 61 องคาเซลเซียส เป็นเวลา 60 นาทีในกล่องให้ความร้อน (heating block) แล้วอ่านผล บนแผ่นดิพสติค (dipstick) เมื่อให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู บริเวณแถบทดสอบ (T) และแถบควบคุม (C) แสดงว่าในตัวอย่างพบเบสกลายพันธุ์ตำแหน่งอาร์เอส (rs) 7412 หรือ อาร์เอส (rs) 429358 บนยีนระโพอี (APOE) ที่มีความเสี่ยงอัลไซเมอร์ แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น วิธีการ นี้เทียบเท่ากับการตรวจสอบด้วยเทคนิคพีซีอาร์ (PCR) แบบเรียลไทม์ (real time) อีกทั้งยังไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR) และเครื่องแยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้าในการติดตามผลของปฏิกิริยา

Claims (2)

------22/01/2564------(OCR) 1. กรรมวิธีการตรวจสอบการกลายพันธุ์ของยีนอะโพอี (APOE) ความเสี่ยงอัลไซเมอร์แบบขั้นตอนเดียวด้วยแถบสี ที่ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้แผ่นดิพสติค (dipstick) การทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) 25 ไมโครลิตร ในแต่ละตำแหน่งที่มีเบสกลายพันธุ์ประกอบด้วยไพรเมอร์ 3 และไพร เมอร์ 4 อย่างละ 50 พิโคโมล, ไพรเมอร์ 1 ไพรเมอร์ 2 และไพรเมอร์ 5 อย่างละ 5 พิโคโมล, ดีเอ็นทีพี (dNTP)0.8 มิลลิโมลาร์ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSOa) 4 มิลลิโมลาร์,เอนไซม์ บีเอสที ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst DNA polymerase) 8 U และสารละลายบัฟเฟอร์ ด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 60 นาที จากนั้นดูดสารละลายดังกล่าวจำนวน 5 ไมโครลิตรใส่ในหลอดใหม่ที่มีสารละลายบัฟเฟอร์ 100 ไมโครลิตรที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจุ่มแผ่นดิพสติค(dipstick) ลงในสารละลาย 5 นาที แล้วอ่านผลบนแผ่นติพสติค (dipstick) เมื่อให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู บริเวณแถบทดสอบ (T) และแถบควบคุม (C) แสดงว่า ในตัวอย่างพบเบสกลายพันธุ์ตำแหน่งอาร์เอส (rs)7412 หรือ อาร์เอส (rs) 429358 บนยีนอะโพอี (APOE) ที่มีความเสี่ยงอัลไซเมอร์ แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น วิธีการนี้ไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR thermal cycler) และเครื่องแยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้า วิธีนี้เป็นการตรวจสอบหาควาผิดปกติของยีนอะโพอี (APOE) ด้วยแผ่นดิพสติค (dipstick)ในบุคคลที่มีสงสัยความเสี่ยงอัลไซเมอร์ เพื่อการตรวจวินิจฉัยและป้องกันของโรค กรรมวิธีนี้ออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิคแลมป์ (LAMP) ที่ใช้ในการตรวจหาเบสกลายพันธุ์ตำแหน่งอาร์เอส (rs) 7412หรือ อาร์เอส (rs) 429358 บนยีนอะโพอี (APOE) ที่มีความเสี่ยงอัลไซเมอร์ ในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) แต่ละชุดประกอบด้วยไพรเมอร์ 5 เส้น ที่จำเพาะต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ตำแหน่งอาร์เอส (rs) 7412 หรือ อาร์เอส (rs)429358 บนยีนอะโพอี (APOE) โดยให้ไพรเมอร์ 4 ติดฉลากด้วยไบโอติน (biotin) หรือไดกอกซิเจนิน(Digoxigenin) และให้ไพรเมอร์ 5 ติดฉลากด้วยสารเรืองแสง (FITC) ในการติดตามปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นบนแผ่นดิพสติค (dipstick) ดังนี้ ไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อเบสกลายพันธุ์ตำแหน่งอาร์เอส (rs) 429358 ดังนี้ ไพรเมอร์ 1 ลำดับเบส (5'-3') ggACgAgACCATgAAggAgT ไพรเมอร์ 2 สำดับเบส (5-3') gCTTgCgCAgggTgggA ไพรเมอร์ 3 ลำดับเบส (5'-3') CgCggACATggAggACgTTT TCTgCACCAggCggCCgTg ไพรเมอร์ 4 ลำดับเบส (5'-3') ไบโอติน (biotin) /ไดกอกซิเจนิน (digoxigenin) -TCCTTggACAgCCgTgCCCTTTTggCCTA CAAATCggAACTgg ไพรเมอร์ 5 ลำดับเบส (5'-3') FITC- ACCggggT CAgTT gTTCCT ไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อเบสกลายพันธุ์ตำแหน่งอาร์เอส (rs) 7412 ดังนี้ ไพรเมอร์ 1 ลำดับเบส (5'-3') gAggTgCAggCCATgCTc ไพรเมอร์ 2 ลำดับเบส (5'-3') CTCgCggATggCgCTgAg ไพรเมอร์ 3 ลำดับเบส (5'-3') AT gCCgAT gACCT gCAgAATTTT CCT ggTACACT gCCAggTA ไพรเมอร์ 4 ลำดับเบส (5'-3')ไบโอติน (biotin) /ไดกอกซิเจนิน (digoxigenin) - ggAggAgCCgCTTACgCA TTTTgCCAgAgCACCgAggAไพรเมอร์ 5 ลำดับเบส (5'-3')FITC- gCTTgCgCAggTgggAg ------------ หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า ข้อถือสิทธิ 1. กรรมวิธีการตรวจสอบการกลายพันธุ์ของยีนอะโพอี (APOE) ความเสี่ยงอัลไซเมอร์แบบขั้นตอนเดียว ด้วยแถบสี ที่ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้แผ่นดิพสติค (dipstick) การ ทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) 25 ไมโครลิตร ในแต่ละตำแหน่งที่มีเบสกลายพันธุ์ประกอบด้วยไพรเมอร์ 3 และไพร เมอร์ 4 อย่างละ 50 พิโคโมล, ไพรเมอร์ 1 ไพรเมอร์ 2 และไพรเมอร์ 5 อย่างละ 5 พิโคโมล, ดีเอ็นทีพี (dNTP) 0.8 มิลลิโมลาร์ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์ บีเอสที ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst DNA polymerase) 8 U และสารละลายบัฟเฟอร์ ด้วยการทำปฏิกิริยา แลมป์ (LAMP) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 60 นาที จากนั้นดูดสารละลายดังกล่าวจำนวน 5 ไมโครลิตรใส่ในหลอดใหม่ที่มีสารละลายบัฟเฟอร์ 100 ไมโครลิตรที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจุ่มแผ่นดิพสติค (dipstick) ลงในสารละลาย 5 นาที แล้วอ่านผลบนแผ่นดิพสติค (dipstick) เมื่อให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบสี ชมพู บริเวณแถบทดสอบ (T) และแถบควบคุม (C) แสดงว่า ในตัวอย่างพบเบสกลายพันธุ์ตำแหน่งอาร์เอส (rs) 7412 หรือ อาร์เอส (rs) 429358 บนยีนอะโพอี (APOE) ที่มีความเสี่ยงอัลไซเมอร์ แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏเส้น ทดสอบสีชมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น วิธีการนี้ไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR thermal cycler) และเครื่อง แยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้า วิธีนี้เป็นการตรวจสอบหาควาผิดปกติของยีนระโพอี (APOE) ด้วยแผ่นดิพส ติค (dipstick) ในบุคคลที่มีสงสัยความเสี่ยงอัลไซเมอร์ เพื่อการตรวจวินิจฉัยและป้องกันของโรค กรรมวิธีนี้ ออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิคแลมป์ (LAMP) ที่ใช้ในการตรวจหาเบสกลายพันธุ์ตำแหน่งอาร์เอส (rs) 7412 หรือ อาร์เอส (rs) 429358 บนยีนอะโพอี (APOE) ที่มีความเสี่ยงอัลไซเมอร์ ในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) แต่ละชุด ประกอบด้วยไพรเมอร์ 5 เส้น ที่จำเพาะต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ตำแหน่งอาร์เอส (rs) 7412 หรือ อาร์เอส (rs) 429358 บนยีนระโพอี (APOE) โดยให้ไพรเมอร์ 4 ติดฉลากด้วยไบโอติน (biotin) หรือไดกอกซิเจนิน (Digoxigenin) และให้ไพรเมอร์ 5 ติดฉลากด้วยสารเรืองแสง (FITC) ในการติดตามปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นบนแผ่นดิพส ติค (dipstick) ดังนี้

1. ไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อเบสกลายพันธุ์ตำแหน่งอาร์เอส (rs) 429358 ดังนี้ ไพรเมอร์ 1 ลำดับเบส (5'-3') ggACgAgACCATgAAggAgT ไพรเมอร์ 2 ลำดับเบส (5'-3') gCTTgCgCAgggTgggA ไพรเมอร์ 3 ลำดับเบส (5'-3') CgCggACATggAggACgTTTTCTgCACCAggCggCCgTg ไพรเมอร์ 4 ลำดับเบส (5'-3') biotin/Dig- TCCTTggACAgCCgTgCCCTTTTggCCTACAAATCggAACTgg ไพรเมอร์ 5 ลำดับเบส (5'-3') FITC- ACCggggTCAgTTgTTCCT

2. ไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อเบสกลายพันธุ์ตำแหน่งอาร์เอส (rs) 7412 ดังนี้ ไพรเมอร์ 1 ลำดับเบส (5'-3') gAggTgCAggCCATgCTC ไพรเมอร์ 2 ลำดับเบส (5'-3') CTCgCggATggCgCTgAg ไพรเมอร์ 3 ลำดับเบส (5'-3') ATgCCgATgACCTgCAgAATTTTCCTggTACACTgCCAggTA ไพรเมอร์ 4 ลำดับเบส (5'-3') biotin/Dig- ggAggAgCCgCTTACgCATTTTgCCAgAgCACCgAggA หน้า 2 ของจำนวน 1 หน้า ไพรเมอร์ 5 ลำดับเบส (5'-3') FITC-gCTTgCgCAggTgggAg Dig = Digoxigenin