TH17656Y - ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบไม่อาศัยการเหนี่ยวนำ และกรรมวิธีการใช้ผลิตภัณฑ์ ดังกล่าว - Google Patents

Abstract

------16/10/2563------(OCR) การประดิษฐ์นี้เป็นการพัฒนาผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบไม่อาศัยการเหนี่ยวนำ และกรรมวิธีการใช้ผลิตภัณฑ์ดังกล่าว ที่ซึ่ง ผลิตภัณฑ์ดังกล่าวประกอบด้วยเซลล์เจ้าบ้านยีสต์ Ogataea thermomethanoiica สายพันธุ์ทนร้อน และพลาสมิดพาหะที่มีความเหมาะสมในการใช้งานควบคู่กับเซลล์เจ้าบ้านยีสต์ O. thermomethanoiica สายพันธุ์ทนร้อน โดยมีส่วนสำคัญในการแสดงออกของยีน คือโปรโมเตอร์แบบไม่อาศัยการเหนี่ยวนำ (โปรโมเตอร์ GAP) ที่คัดแยกได้จาก O. thermomethanoiica ทำให้ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกยีนตามการประดิษฐ์นี้สามารถควบคุมการแสดงออกของยีนเป้าหมายให้สามารถสร้างไปควบคู่กับการเจริญเติบโตของเซลล์เจ้าบ้านยีสต์ โดยไม่ต้องมีการเปลี่ยนชนิดของอาหารเลี้ยงเชื้อและสามารถใช้แหล่งคาร์บอนที่มีราคาถูกใช้เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อได้ นอกจากนี้โปรโมเตอร์ที่ใช้ยังสามารถทำงานได้ดีในอุณหภูมิสูง ซึ่งลักษณะดังกล่าวมีความเหมาะสมกับการนำไปประยุกต์ใช้กับการผลิตโปรตีนเป้าหมายในระดับขยายขนาดซึ่งมีปัญหาความร้อนสะสมสูง เนื่องจากระบบการแสดงออกที่ใช้เซลล์ยีสต์สายพันธุ์ทนร้อนนี้ร่วมกับโปรโมเตอร์ที่สามารถทำงานได้ที่ช่วงอุณหภูมิสูง จะสามารถช่วยลดต้นทุนในการผลิตที่ไม่ต้องใช้ระบบหล่อเย็น นอกจากนี้ ยังมีข้อดีเพิ่มเติมอื่นๆ อาทิ โปรตีนลูกผสมที่ผลิตได้สามารถผลิตออกนอกเซลล์เป็นโปรตีนหลักโดยที่โปรตีนของเซลล์เจ้าบ้านปะปนในปริมาณน้อย ทำให้ง่ายต่อการนำไปทำให้บริสุทธิ์ในขั้นต่อไป ------------ ------27/09/2562------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า บทสรุปการประดิษฐ์ การประดิษฐ์นี้เป็นการพัฒนาผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบไม่อาศัยการเหนี่ยวนำ และกรรมวิธีการใช้ผลิตภัณฑ์ดังกล่าว ที่ซึ่ง ผลิตภัณฑ์ดังกล่าวประกอบด้วยเซลล์เจ้าบ้านยีสต์ Ogataea thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน และพลาสมิดพาหะที่มีความเหมาะสมในการใช้งานควบคู่กับเซลล์เจ้าบ้านยีสต์ O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน โดยมีส่วนสำคัญในการแสดงออกของยีน คือ โปรโมเตอร์แบบไม่อาศัยการเหนี่ยวนำ (โปรโมเตอร์ GAP) ที่คัดแยกได้จาก O. thermomethanolica ทำให้ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกยีนตามการประดิษฐ์นี้สามารถควบคุมการแสดงออกของยีนเป้าหมายให้สามารถสร้างไปควบคู่กับการเจริญเติบโตของเซลล์เจ้าบ้านยีสต์โดยไม่ต้องมีการเปลี่ยนชนิดของอาหารเลี้ยงเชื้อและสามารถใช้แหล่งคาร์บอนที่มีราคาถูกใช้เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อได้ นอกจากนี้ โปรโมเตอร์ที่ใช้ยังสามารถทำงานได้ดีในอุณหภูมิสูง ซึ่งลักษณะดังกล่าวมีความเหมาะสมกับการนำไปประยุกต์ใช้กับการผลิตโปรตีนเป้าหมายในระดับขยายขนาดซึ่งมีปัญหาความร้อนสะสมสูง เนื่องจากระบบการแสดงออกที่ใช้เซลล์ยีสต์สายพันธุ์ทนร้อนนี้ร่วมกับโปรโมเตอร์ที่สามารถทำงานได้ที่ช่วงอุณหภูมิสูง จะสามารถช่วยลดต้นทุนในการผลิตที่ไม่ต้องใช้ระบบหล่อเย็น นอกจากนี้ ยังมีข้อดีเพิ่มเติมอื่นๆ อาทิ โปรตีนลูกผสมที่ผลิตได้สามารถผลิตออกนอกเซลล์เป็นโปรตีนหลักโดยที่โปรตีนของเซลล์เจ้าบ้านปะปนในปริมาณน้อย ทำให้ง่ายต่อการนำไปทำให้บริสุทธิ์ในขั้นต่อไป ------------

Claims (1)

------16/10/2563------(OCR) 1. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบไม่อาศัย การเหนี่ยวนำ ได้แก่ พลาสมิดพาหะสำหรับการแสดงออกยีนเป้าหมายที่มีส่วนประกอบของลำดับเบสที่สำคัญต่อการ แสดงออกของยีนในทิศทางจากปลาย 5’ ไปยังปลาย 3’ ดังนี้ (ก) ลำดับเบสที่เป็นโปรโมเตอร์ที่ควบคุมการสร้างเอนไซม์กลีเซอรอลตีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส ซึ่งคัดแยกได้ จาก O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน โดยมีลำดับเบสดังแสดงใน Seq. ID. No. 1 (ข) ลำดับเบสของแอลฟา-แฟกเตอร์ซีครีชั่นซิกนอล ซึ่งเป็นส่วนนำโปรตีนออกนอกเซลล์ ซึ่งคัดแยกได้จาก O. thermomethanoiica (ค) ลำดับเบสที่เป็นตำแหน่งโคลนยีนแบบมัลติเปิล ซึ่งมีตำแหน่งของเอนไซม์ตัดจำเพาะ ได้แก่ FcoRI, Kpnl, Sacl, Nsil, Apal, Soll, Pmel, BamHl, Nhel (ง) ลำดับเบสที่เป็นทรานสคริปชั่นเทอร์มิเนเตอร์ของยีนที่สร้างเอนไซม์แอลกอฮอล์ออกซิเดส ซึ่งคัดแยกได้จาก O. thermomethanoiica (จ) ยีนต้านยาปฏิชีวนะนีโอมัยซินสำหรับใช้คัดแยกเซลล์ที่มีพลาสมิดลูกผสม ที่ถูกควบคุมด้วยโปรโมเตอร์ 2 ชนิดที่ เชื่อมต่อกัน คือ โปรโมเตอร์ TEF1 ที่แยกได้จาก O. thermomethanoiica และโปรโมเตอร์ L-ldh ที่แยกได้ จาก L. piantarum BCC9546 (ฉ) ทรานสคริปชั่นเทอร์มิเนเตอร์ของยีนที่สร้างเอนไซม์กลีเซอรอลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส ซึ่งคัดแยกได้ จาก O. thermomethanoiica (ช) จุดกำเนิดของการจำลองตัวเอง (pUC origin of replication, pUC ori) สำหรับใช้ในการเพิ่มจำนวนใน E. coli2. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบไม่อาศัย การเหนี่ยวนำ ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง ยีนเป้าหมายที่ใช้กับผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกยีนดังกล่าว คือ ยีนที่คัดแยกได้ จากสิ่งมีชีวิตกลุ่มโปรคาริโอต หรือ ยูคาริโอต อย่างใดอย่างหนึ่ง3. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบไม่อาศัย การเหนี่ยวนำ ตามข้อถือสิทธิที่ 1 หรือ 2 ที่ซึ่ง ยีนเป้าหมายที่ใช้กับผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกยีนดังกล่าว คือ ยีนที่ ประมวลรหัสเป็นโปรตีนที่มีศักยภาพการใช้งานทางการแพทย์ หรือ ทางอุตสาหกรรม อย่างใดอย่างหนึ่งหรือหลายอย่าง รวมกัน4. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบไม่อาศัย การเหนี่ยวนำ ตามข้อถือสิทธิ 1 ถึง 3 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง ยีนเป้าหมายที่ใช้กับผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกยีนดังกล่าว คือ ยีนที่ประมวลรหัสเป็นเอนไซม์ในกลุ่มย่อยองค์ประกอบเซลล์พืชจำพวกลิกโนเซลลูโลส หรือ เฮมิเซลลูโลส หรือ กลุ่ม ฮีสทิดีนแอซิดฟอสฟาเทส อย่างใดอย่างหนึ่งหรือหลายอย่างรวมกัน5. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบไม่อาศัย การเหนี่ยวนำ ตามข้อถือสิทธิ 4 ที่ซึ่ง ยีนที่ประมวลรหัสเป็นเอนไซม์ในกลุ่มย่อยองค์ประกอบเซลล์พืชจำพวก ลิกโนเซลลูโลส หรือ เฮมิเซลลูโลส หรือ กลุ่มฮีสทิดีนแอซิดฟอสฟาเทส ดังกล่าว เลือกได้จาก ยีนที่ประมวลรหัสเป็น เอนไซม์ เบต้ากลูโคซิเดส หรือ เบต้าไซโลซิเดส หรือ ไฟเตส อย่างใดอย่างหนึ่งหรือหลายอย่างรวมกัน6. เซลล์ที่มีผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบ ไม่อาศัยการเหนี่ยวนำ ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง เซลล์ดังกล่าว ประกอบด้วย (1) เซลล์เจ้าบ้านยีสต์ Ogataea thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน (2) พลาสมิดพาหะสำหรับการแสดงออกยีนเป้าหมายที่มีส่วนประกอบของลำดับเบสที่สำคัญต่อการแสดงออกของยีนใน ทิศทางจากปลาย 5’ ไปยังปลาย 3’ ดังนี้ (ก) ลำดับเบสที่เป็นโปรโมเตอร์ที่ควบคุมการสร้างเอนไซม์กลีเซอรอลดีไฮต์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส ซึ่งคัดแยกได้ จาก O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน โดยมีลำดับเบสดังแสดงใน Seq. ID. No. 1 (ข) ลำดับเบสของแอลฟา-แฟกเตอร์ซีครีชั่นซิกนอล ซึ่งเป็นส่วนนำโปรตีนออกนอกเซลล์ ซึ่งคัดแยกได้จาก O. thermomethanolica (ค) ลำดับเบสที่เป็นตำแหน่งโคลนยีนแบบมัลติเปิล ซึ่งมีตำแหน่งของเอนไซม์ตัดจำเพาะ ได้แก่ EcoRI, Kpnl, SacI, Nsil, Apal, Sall, Pmel, BamHI, NheI (ง) ลำดับเบสที่เป็นทรานสคริปชั่นเทอร์มิเนเตอร์ของยีนที่สร้างเอนไซม์แอลกอฮอล์ออกซิเดส ซึ่งคัดแยกได้จาก O. thermomethanolica (จ) ยีนต้านยาปฏิชีวนะนีโอมัยซินสำหรับใช้คัดแยกเซลล์ที่มีพลาสมิดลูกผสม ที่ถูกควบคุมด้วยโปรโมเตอร์ 2 ชนิดที่ เชื่อมต่อกันคือโปรโมเตอร์ TEF1 ที่แยกได้จาก O. thermomethanolica และโปรโมเตอร์ L-ldh ที่แยกได้ จาก L. plantarum BCC9546 (ฉ) ทรานสคริปชั่นเทอร์มิเนเตอร์ของยีนที่สร้างเอนไซม์กลีเซอรอลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส ซึ่งคัดแยกได้ จาก O. thermomethanolica (ช) จุดกำเนิดของการจำลองตัวเอง (pUC origin of replication, pUC ori) สำหรับใช้ในการเพิ่มจำนวนใน E. coli7. เซลล์ที่มีผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีน ตามข้อถือสิทธิ 6 ที่ซึ่ง เซลล์เจ้าบ้านยีสต์ O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน เจริญเติบโตได้ดีในช่วงอุณหภูมิ 30 ถึง 40 องศาเซลเซียส และไม่ดื้อต่อยาปฏิชีวนะนีโอมัยซิน8. เซลล์ที่มีผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีน ตามข้อถือสิทธิ 6 หรือ 7 ที่ซึ่ง เซลล์เจ้าบ้านยีสต์ O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อนที่เหมาะสม คือ ยีสต์ O. thermomethanolica สายพันธุ์ TBRC6569. กรรมวิธีการผลิตโปรตีนเป้าหมายที่ไม่อาศัยการเหนี่ยวนำด้วยผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีน เป้าหมาย ตามข้อถือสิทธิ 1 ถึง 5 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง กรรมวิธีดังกล่าวประกอบด้วยขั้นตอนดังนี้ ก. การสร้างพลาสมิดลูกผสมเพื่อการแสดงออกยีนเป้าหมายที่ต้องการ โดยการเชื่อมยีนเป้าหมายเข้ากับพลาสมิด พาหะ ที่ตำแหน่งโคลนยีนแบบมัลติเปิลที่เหมาะสมกับยีนเป้าหมายและเพิ่มจำนวนพลาสมิดลูกผสมดังกล่าวใน เซลล์ E. coli ข. การเตรียมพลาสมิดลูกผสมจากข้อ (ก) เพื่อให้มีความเหมาะสมต่อการถ่ายโอนและเกิดการสอดแทรกเข้าสู่ โครโมโซมเมื่อเข้าไปอยู่ในเซลล์เจ้าบ้านยีสต์ O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน โดยทำการสกัด พลาสมิดลูกผสมออกจาก E. coli และตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะในบริเวณต้นของลำดับเบสที่เป็นโปรโมเตอร์ที่ ควบคุมการสร้างเอนไซม์กลีเซอรอลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส ซึ่งคัดแยกได้จาก O. thermomethanoiica ค. การสร้างเซลล์ยีสต์ลูกผสม O. thermomethanotica เพื่อการแสดงออกของยีนเป้าหมาย โดยการถ่ายโอน พลาสมิดลูกผสมที่เตรียมได้จากข้อ (ข) เข้าสู่เซลล์เจ้าบ้านยีสต์ O. thermomethanotica สายพันธุ์ทนร้อน และคัดเลือกเซลล์ยีสต์ลูกผสม O. thermomethanotica บนอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งที่มียาปฏิชีวนะนีโอมัยซิน ง. การผลิตโปรตีนเป้าหมายที่ต้องการด้วยการเพาะเลี้ยงเซลล์ยีสต์ลูกผสม O. thermomethanotica เพื่อการ แสดงออกของยีนเป้าหมายแบบไม่เหนี่ยวนำ จากข้อ (ค) ในสภาวะการเพาะเลี้ยงที่เหมาะสมดังนี้ เริ่มจากการ เพาะเลี้ยงเซลล์ยีสต์ลูกผสมในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวที่อุณหภูมิ 25 - 40 องศาเซลเซียส ในสภาวะให้อากาศ แล้ว ทำการถ่ายเชื้อที่มีความขุ่นที่เหมาะสมลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวอีกครั้งและเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 25 - 40 องศาเซลเซียส ในสภาวะให้อากาศ จากนั้นทำการแยกเก็บนํ้าเลี้ยงเชื้อออกจากเซลล์ด้วยการปั่นเหวี่ยง เพื่อ นำไปวิเคราะห์หาโปรตีนที่ต้องการ10. กรรมวิธีการผลิตโปรตีนเป้าหมายที่ไม่อาศัยการเหนี่ยวนำด้วยผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีน เป้าหมาย ตามข้อถือสิทธิ 9 ที่ซึ่ง สภาวะที่เหมาะสมที่สุดในการผลิตโปรตีนเป้าหมายที่ต้องการด้วยการเพาะเลี้ยงเซลล์ ยีสต์ลูกผสม O. thermomethanotica เพื่อการแสดงออกของยีนเป้าหมายแบบไม่เหนี่ยวนำ คือ การเพาะเลี้ยงเซลล์ ยีสต์ลูกผสมในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลววายพีดีที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส ในสภาวะให้อากาศ เป็นเวลา 18 - 24 ชั่วโมง แล้วทำการถ่ายเชื้อที่มีความขุ่น 0.01 ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลววายพีดี 20 มิลลิลิตร และเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส ในสภาวะให้อากาศ เป็นเวลาประมาณ 72 ชั่วโมง จากนั้นทำการแยกเก็บนํ้าเลี้ยงเชื้อออกจากเซลล์ด้วย การปั่นเหวี่ยง เพื่อนำไปวิเคราะห์หาโปรตีนที่ต้องการ ------------ ------27/09/2562------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 3 หน้า ข้อถือสิทธิ1. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบไม่อาศัย การเหนี่ยวนำ ได้แก่ พลาสมิดพาหะสำหรับการแสดงออกยีนเป้าหมายที่มีส่วนประกอบของลำดับเบสที่สำคัญต่อการ แสดงออกของยีนในทิศทางจากปลาย 5’ ไปยังปลาย 3’ ดังนี้ (ก) ลำดับเบสที่เป็นโปรโมเตอร์ที่ควบคุมการสร้างเอนไซม์กลีเซอรอลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส ซึ่งคัดแยกได้ จาก O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน โดยมีลำดับเบสดังรูปที่ 2 (ข) ลำดับเบสของแอลฟา-แฟกเตอร์ซีครีชั่นซิกนอล ซึ่งเป็นส่วนนำโปรตีนออกนอกเซลล์ ซึ่งคัดแยกได้จาก O. thermomethanolica (ค) ลำดับเบสที่เป็นตำแหน่งโคลนยีนแบบมัลติเปิล ซึ่งมีตำแหน่งของเอนไซม์ตัดจำเพาะ ได้แก่ fcoRI, Kpnl, Sacl, Nsil, Apal, Sail, PmeI, BamHI, Nhel (ง) ลำดับเบสที่เป็นทรานสคริปชั่นเทอร์มิเนเตอร์ของยีนที่สร้างเอนไซม์แอลกอฮอล์ออกซิเดส ซึ่งคัดแยกได้จาก O. thermomethanolica (จ) ยีนต้านยาปฏิชีวนะนีโฮมัยซินสำหรับใช้คัดแยกเซลล์ที่มีพลาสมิดลูกผสม ที่ถูกควบคุมด้วยโปรโมเตอร์ 2 ชนิดที่ เชื่อมต่อกัน คือ โปรโมเตอร์ TEF1 ที่แยกได้จาก O. thermomethanolica และโปรโมเตอร์ L-ldh ที่แยกได้ จาก L. plantarum BCC9546 (ฉ) ทรานสคริปชั่นเทอร์มิเนเตอร์ของยีนที่สร้างเอนไซม์กลีเซอรอลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส ซึ่งคัดแยกได้ จาก O. thermomethanolica (ช) จุดกำเนิดของการจำลองตัวเอง (pUC origin of replication, pUC ori) สำหรับใช้ในการเพิ่มจำนวนใน E. coli2. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบไม่อาศัย การเหนี่ยวนำ ตามข้อถีอสิทธิ 1 ที่ซึ่ง ยีนเป๋าหมายที่ใช้กับผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกยีนดังกล่าว คือ ยีนที่คัดแยกได้ จากสิ่งมีชีวิตกลุ่มโปรคาริโอต หรือ ยูคาริโอต อย่างใดอย่างหนึ่ง3. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบไม่อาศัย การเหนี่ยวนำ ตามข้อถือสิทธิที่ 1 หรือ 2 ที่ซึ่ง ยีนเป้าหมายที่ใช้กับผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกยีนดังกล่าว คือ ยีนที่ ประมวลรหัสเป็นโปรตีนที่มีศักยภาพการใช้งานทางการแพทย์ หรือ ทางอุตสาหกรรม อย่างใดอย่างหนึ่งหรือหลายอย่าง รวมกัน4. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบไม่อาศัย การเหนี่ยวนำ ตามข้อถือสิทธิ 1 ถึง 3 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง ยีนเป้าหมายที่ใช้กับผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกยีนดังกล่าว คือ ยีนที่ประมวลรหัสเป็นเอนไซม์ในกลุ่มย่อยองค์ประกอบเซลล์พืชจำพวกลิกโนเซลลูโลส หรือ เฮมิเซลลูโลส หรือ กลุ่ม ฮีสทิดีนแอซิดฟอสฟาเทส อย่างใดอย่างหนึ่งหรือหลายอย่างรวมกัน5. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบไม่อาศัย การเหนี่ยวนำ ตามข้อถือสิทธิ 4 ที่ซึ่ง ยีนที่ประมวลรหัสเป็นเอนไซม์ในกลุ่มย่อยองค์ประกอบเซลล์พืชจำพวก ลิกโนเซลลูโลส หรือ เฮมิเซลลูโลส หรือ กลุ่มฮีสทิดีนแอซิดฟอสฟาเทส ดังกล่าว เลือกได้จากยีนที่ประมวลรหัสเป็น หน้า 2 ของจำนวน 3 หน้า เอนไซม์ เบต้ากลูโคซิเดส หรือ เบต้าไซโลซิเดส หรือ ไฟเตส อย่างใดอย่างหนึ่งหรือหลายอย่างรวมกัน6. เซลล์ที่มิผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทบร้อนแบบ ไม่อาศัยการเหนี่ยวนำ ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง เซลล์ดังกล่าว ประกอบด้วย (1) เซลล์เจ้าบ้านยีสต์ Ogataea thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน (2) พลาสมิดพาหะสำหรับการแสดงออกยีนเป้าหมายที่มีส่วนประกอบของลำดับเบสที่สำคัญต่อการแสดงออกของยีนใน ทิศทางจากปลาย 5’ ไปยังปลาย 3’ ดังนี้ (ก) ลำดับเบสที่เป็นโปรโมเตอร์ที่ควบคุมการสร้างเอนไซม์กลีเซอรอลตีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส ซึ่งคัดแยกได้ จาก O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน โดยมีลำดับเบสดังรูปที่ 2 (ข) ลำดับเบสของแอลฟา-แฟกเตอร์ซีครีชั่นซิกนอล ซึ่งเป็นส่วนนำโปรตีนออกนอกเซลล์ ซึ่งคัดแยกได้จาก O. thermomethanolica (ค) ลำดับเบสที่เป็นตำแหน่งโคลนยีนแบบมัลติเปิล ซึ่งมีตำแหน่งของเอนไซม์ตัดจำเพาะ ได้แก่ EcoRl, Kpnl, Socl, Nsil, Apal, Sall, PmeI, BamHI, Nhel (ง) ลำดับเบสที่เป็นทรานสคริปชั่นเทอร์มิเนเตอร์ของยีนที่สร้างเอนไซม์แอลกอฮอล์ออกซิเดส ซึ่งคัดแยกได้จาก O. thermomethanolica (จ) ยีนด้านยาปฏิชีวนะนีโอมัยซินสำหรับใข้คัดแยกเซลล์ที่มีพลาสมิดลูกผสม ที่ถูกควบคุมด้วยโปรโมเตอร์ 2 ชนิดที่ เชื่อมต่อกัน คือ โปรโมเตอร์ TEF1 ที่แยกได้จาก O. thermomethanolica และโปรโมเตอร์ L-ldh ที่แยกได้ จาก L. plantarum BCC9546 (ฉ) ทรานสคริปชั่นเทอร์มิเนเตอร์ของยีนที่สร้างเอนไซม์กลีเซอรอลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส ซึ่งคัดแยกได้ จาก O. thermomethanolica (ช) จุดกำเนิดของการจำลองตัวเอง (pUC origin of replication, pUC ori) สำหรับใช้ในการเพิ่มจำนวนใน E. coli7. เซลล์ที่มีผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีน ตามข้อถือสิทธิ 6 ที่ซึ่ง เซลล์เจ้าบ้านยีสต์ O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน เจริญเติบโตได้ดีในช่วงอุณหภูมิ 30 ถึง 40 องศาเซลเซียส และไม่ดื้อต่อยาปฏิชีวนะนีโอมัยซิน8. เซลล์ที่มีผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีน ตามข้อถือสิทธิ 6 หรือ 7 ที่ซึ่ง เซลล์เจ้าบ้านยีสต์ O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อนที่เหมาะสม คือ ยีสต์ O. thermomethanolica สายพันธุ์ TBRC6569. กรรมวิธีการผลิตโปรตีนเป้าหมายที่ไม่อาศัยการเหนี่ยวนำด้วยผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกยีนเพื่อผลิตโปรตีน เป้าหมาย ตามข้อถือสิทธิ 1 ถึง 8 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง กรรมวิธีดังกล่าวประกอบด้วยขั้นตอนดังนี้ ก. การสร้างพลาสมิดลูกผสมเพื่อการแสดงออกยีนเป้าหมายที่ต้องการ โดยการเชื่อมยีนเป้าหมายเข้ากับพลาสมิด พาหะ ที่ตำแหน่งโคลนยีนแบบมัลติเปิลที่เหมาะสมกับยีนเป้าหมายและเพิ่มจำนวนพลาสมิดลูกผสมดังกล่าวใน เซลล์ E. coli ข. การเตรียมพลาสมิดลูกผสมจากข้อ (ก) เพื่อให้มีความเหมาะสมต่อการถ่ายโอนและเกิดการสอดแทรกเข้าสู่ โครโมโซมเมื่อเข้าไปอยู่ในเซลล์เจ้าบ้านยีสต์ O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน โดยทำการสกัด พลาสมิดลูกผสมออกจาก E. coli และตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะในบริเวณต้นของลำดับเบสที่เป็นโปรโมเตอร์ที่ หน้า 3 ของจำนวน 3 หน้า ควบคุมการสร้างเอนไซม์กลีเซอรอลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส ซึ่งคัดแยกได้จาก O. thermomethanolica ค. การสร้างเซลล์ยีสต์ลูกผสม O. thermomethanolica เพื่อการแสดงออกของยีนเป้าหมาย โดยการถ่ายโอน พลาสมิดลูกผสมที่เตรียมได้จากข้อ (ข) เข้าสู่เซลล์เจ้าบ้านยีสต์ O. thermomethanolica สายพันธุ์ทนร้อน และคัดเลือกเซลล์ยีสต์ลูกผสม O. thermomethanolica บนอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งที่มียาปฏิชีวนะนีโอมัยซิน ง. การผลิตโปรตีนเป้าหมายที่ต้องการด้วยการเพาะเลี้ยงเซลล์ยีสต์ลูกผสม O. thermomethanolica เพื่อการ แสดงออกของยีนเป้าหมายแบบไม่เหนี่ยวนำ จากข้อ (ค) ในสภาวะการเพาะเลี้ยงที่เหมาะสมดังนี้ เริ่มจากการ เพาะเลี้ยงเซลล์ยีสต์ลูกผสมในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวที่อุณหภูมิ 25 - 40 องศาเซลเซียส ในสภาวะให้อากาศ แล้ว ทำการถ่ายเชื้อที่มีความขุ่นที่เหมาะสมลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวอีกครั้งและเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 25 - 40 องศาเซลเซียส ในสภาวะให้อากาศ จากนั้นทำการแยกเก็บน้ำเลี้ยงเชื้อออกจากเซลล์ด้วยการปั่นเหวี่ยง เพื่อ นำไปวิเคราะห์หาโปรตีนที่ต้องการ10. กรรมวิธีการผลิตโปรตีนเป้าหมายที่ไม่อาศัยการเหนี่ยวนำด้วยผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกยีนเพื่อผลิตโปรตีน เป้าหมาย ตามข้อถือสิทธิ 9 ที่ซึ่ง สภาวะที่เหมาะสมที่สุดในการผลิตโปรตีนเป้าหมายที่ต้องการด้วยการเพาะเลี้ยงเซลล์ ยีสต์ลูกผสม O. thermomethanolica เพื่อการแสดงออกของยีนเป้าหมายแบบไม่เหนี่ยวนำ คือ การเพาะเลี้ยงเซลล์ ยีสต์ลูกผสมในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลววายพีดีที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส ในสภาวะให้อากาศ เป็นเวลา 18-24 ชั่วโมง แล้วทำการถ่ายเชื้อที่มีความขุ่น 0.01 ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลววายพีดี 20 มิลลิลิตร และเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส ในสภาวะให้อากาศ เป็นเวลาประมาณ 72 ชั่วโมง จากนั้นทำการแยกเก็บน้ำเลี้ยงเชื้อออกจากเซลล์ด้วย การปั่นเหวี่ยง เพื่อนำไปวิเคราะห์หาโปรตีนที่ต้องการ ------------ แก้ไข 26/10/2561 ข้อถือสิทธิ

1. ผลิตภัณฑ์สำหรับการแสดงออกของยีนเพื่อผลิตโปรตีนหรือสารชีวภัณฑ์เป้าหมายออกนอกเซลล์ยีสต์ทนร้อนแบบไม่อาศัย การเหนี่ยวนำ ได้แก่ พลาสมิดพาหนะสำหรับการแสดงออกยีนเป้าหมายที่มีส่วนประกอบของลำดับเบสที่สำคัญต่อการ แสดงออกของยีนในทิศทางจากปลาย 5' ไปยังปลาย 3' ดังนี้ (ก) ลำดับเบสที่เป็นโปรโมเตอร์ที่ควบคุมการสร้างเอนไซม์กลีเซอรอลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส ซึ่งคัดแยกได้ จาก O. thermomethanolica สายพันธ์ทนร้อน (ข) ลำดับเบสของแอลฟา-แฟกเตอร์ซีครีชั่นซิกนอล ซึ่งเป็นส่วนนำโปรตีนออกนอกเซลล์ ซึ่งคัดแยกได้จาก O. themomethanolica (ค) ลำดับเบสที่เป็นตำแหน่งโคลนยีนแบบมัลติเปิล ซึ่งมีตำแหน่งของเอนไซม์ตัดจำเพาะ ได้แก่ EcoRl, Kpnl, Sacl, Nsil, Apal, Sall, Pmel, Bamhl, Nhel (ง) ลำดับเบสที่เป็นทรานสคริปชั่นเทอร์มิเนเตอร์ของยีนที่สร้างเอนไซม์แอลกอฮอล์ออกซิเดส ซึ่งคัดแยกได้จาก O. thermomethanolica (จ) ยีนต้านยาปฏิชีวนะนีโอมัยซินสำหรับใช้แยกเซลล์ที่มีพลาสมิดลูกผสม ที่ถูกควบคุมด้วยโปรโมเตอร์ 2 ชนิดที่ เชื่อมต่อกัน คือ โปรโมเตอร์ TEF1 ที่แยกได้จาก O. thermomethanolica และโปโมเตอร์ L-ldh ที่แยกได้ จาก L. plantarum BCC9546 (ฉ) ทรานสคริปชั่นเทอร์มิเนอร์ของยีนที่สร้างเอนไซม์กลีเซอรอลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส ซึ่งคัดแยกได้ จาก O. thermomethanolica (ช) จุดกำเนิดของการจำลองตัวเอง (pUC origin of replication, pUC ori) สำหรับใช้ในการเพิ่มจำนวนใน E. coli ----------