TH14021Y - กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยแถบสี - Google Patents

Abstract

แก้ไข 1 ก.ย. 2560 กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยแถบสี เริ่ม จากการออกแบบไพรเมอร์ 4 เส้น ที่จำเพาะต่อลำดับเบสของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ที่มี เบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 และ 526 ของยีนอาร์โพบี (rpoB) ซึ่งไพรเมอร์ตัวหนึ่งจะติดฉลากด้วยสารไบโอทิน (biotin) ในระบบนี้ดีเอ็นเอเป้าหมายจะถูกเพิ่มปริมาณภายใต้อุณหภูมิอุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ในกล่องให้ความร้อน (heating block) แล้วใช้ตัวตรวจจับติดสารเรืองแสง (FlTC) ด้วยการอ่านผลบน แผ่นดิพสติค (dipstick) เมื่อให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู บริเวณแถบทดสอบ (T) และแถบควบคุม (C) แสดงว่า ในตัวอย่างพบเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 และ 526 ของยีนอาร์โพบี (rpoB) แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏ เส้นทดสอบสีชมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น วิธีการนี้เทียบเท่ากับการตรวจสอบด้วยเทคนิคพีซีอาร์ (PCR) แบบเรียลไทม์ (real time) อีกทั้งยังไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR) และเครื่องแยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้า ในการติดตามผลของปฏิกิริยา ---------------------------------------------------------------------------------------------------- แก้ไขบทสรุปการประดิษฐ์ 10/03/2559 กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยายาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยแถบสี เริ่ม จากการออกแบบไพรเมอร์ 4 ตัว ที่จำเพาะต่อลำดับเบสของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ที่มีเบส กลายพันธืที่ตำแหน่ง 531 และ 526 ของยีนอาร์โบบี (rpoB) ซึ่งไพรเมอร์ตัวหนึ่งจะติดฉลากด้วยสารไบโอทิน (biotin) ในระบบดีเอ็นเอเป้าหมายจะถูกเพิ่มปริมาณภายใต้อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ในกล่องให้ความร้อน (heating block) แล้วใช้ตัวตรวจจับติดสารเรืองแสง (FITC) ด้วยการอ่านผลบน แผ่นดิพสติค (dipstick) เมื่อให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู บริเณแถบทดสอบ (T) และแถบควบคุม (C) แสดงว่า ในตัวอย่างพบเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 และ 526 ของยีนส์อาร์โบบี (rpoB) แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏ เส้นทดสอบสีชมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น วิธีการนี้เทียบเท่ากับการตรวจสอบด้วยเทคนิคพีซีอาร์ (PCR) แบบเรียลไทม์ (real time) อีกทั้งยังไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR) และเครื่องแยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้า ในการติดตามผลของปฏิกิริยา ----------------------------------------------------------- คำขอใหม่ปรับปรุง การประดิษฐ์นี้เกี่ยวข้องกับการป้องกันการกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ที่เป็นปัญหาสำคัญของประเทศ โดยเริ่มจากการออกแบบ primers 4 ตัว ที่ออกแบบจากลำดับเบสในส่วนยีนเชื้อ วัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ที่ออกแบบจำนวน 2 ชุด โดยชุดที่ 1 สำหรับการตรวจหาลำดับเบสกลาย พันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 บนยีน rpoB และ ชุดที่ 2 สำหรับตรวจหาลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 526 บนยีน rpoB ในระบบนี้ DNA เป้าหมายจะถูกเพิ่มปริมาณภายใต้อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ผลการตรวจ พบว่าเทคนิค LAMP มีความจำเพาะในการตรวจสอบเชื้อวัณโรคกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) เทียบเท่ากับการตรวจสอบด้วยเทคนิค PCR แบบ real time ต่อจากนั้นทำการออกแบบตัวตรวจจับ (probe) ที่จำเพาะต่อลำดับเบสของผลผลิต LAMP ที่ได้ แล้วทดสอบสภาวะมี่เหมาะสม ในการตรวจสอบผลผลิต ของ LAMP ที่ได้บนแผ่น Dipstick แทนการตรวจสอบด้วยวิธี gel eletrophoresis ซึ่งจะใช้เวลาอีกเพียง 5-15 นาทีเท่านั้น

Claims (8)

แก้ไข 1 ก.ย. 2560 1. กรรมวิธีในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยแถบสีที่ซึ่ง ประกอบด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้แผ่นดิพสติค (dipstick) ภายในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) 25 ไมโครลิตร มีการใช้ไพรเมอร์ 2 ชุดด้วยการทำปฏิกิริยา 2 ครั้ง ชุดที่ 1 ประกอบด้วย ไพรเมอร์ 3 และ ไพรเมอร์ 4 อย่างละ 2 ไมโครโมลาร์, ไพรเมอร์ 1 และไพรเมอร์ 2 อย่างละ 0.2 ไมโครโมลาร์, ดีเอ็นทีพี (dNTP) 1.6 มิลลิโมลาร์ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 มิลิโมลาร์, เอนไซม์ บีเอสที 2.0 วอร์ม สตาร์ท ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst 2.0 warm start DNA polymerase) 2.5 U และ สารละลายบัฟเฟอร์ ใช้ในการตรวจลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 ของยีนอาร์โพบี (rpoB) ของเชื้อวัณโรค ชุดที่ 2 ประกอบด้วย ไพรเมอร์ 3 และไพรเมอร์ 5 อย่างละ 2 ไมโครโมลาร์, ไพรเมอร์ 1 และไพรเมอร์ 2 อย่างละ 0.2 ไมโครโมลาร์, ดีเอ็นทีพีส์ (dNTPs) 1.6 มิลลิโมลาร์ ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สาร แมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์ บีเอสที 2.0 วอร์ม สตาร์ท ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst 2.0 warm start DNA polymerase) 2.5 U และสารละลายบัฟเฟอร์ สำหรับการตรวจลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 526 ของยีนอาร์โพบี (rpoB) ของเชื้อวัณโรค การออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิคแลมป์ (LAMP) ในการตรวจเชื้อ ที่มีเบสกลายพันธุ์เพียงหนึ่งเบส ไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ประกอบด้วยไพรเมอร์ 4 เส้น ที่จำเพาะ ต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 และ 526 ของยีนอาร์โพบี (rpoB) ของเชื้อวัณโรค ดังนี้ ไพรเมอร์ 1 ลำดับเบส (5’-3’) CCgCAgACgTTgATCAACAT ไพรเมอร์ 2 ลำดับเบส (5’-3’) CAgggTTTCgATTgggC ไพรเมอร์ 3 ลำดับเบส (5’-3’) ggTgCTgAAgAACTCCTTgATTTTgCCggTggTCgCCgCg ไพรเมอร์ 4 ลำดับเบส (5’-3’) AgCgCTTggggCCCgTTTTAgTgCgACgggTgCA ไพรเมอร์ 5 ลำดับเบส (5’-3’) HACAAgCgCCgACTgTCTTTTAgTgCgACgggTgCA H = A/C/T 2. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยแถบสีตาม ข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจผลผลิตจากแลมป์ (LAMP) บนแผ่นดิพสติค (dipstick) มี ลักษณะเฉพาะคือ ทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง แล้วเติมตัว ตรวจจับ (probe) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที ดูดสารละลายดังกล่าวจำนวน 1 ไมโครลิตร ใส่ ในหลอดที่มีสารละลายบัฟเฟอร์ 100 ไมโครลิตร ที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจุ่มแผ่นดิพสติค (dipstick) ลงใน สารละลาย 5 นาที แล้วอ่านผล 3. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยแถบสีตาม ข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งกรรมวิธีการออกแบบตัวตรวจจับ (probe) ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อ ยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยแถบสีบนแผ่นดิพสติค (dipstick) มีลักษณะเฉพาะคือ ตัวตรวจจับติดฉลากด้วย สารเรืองแสง (FITC) ที่ปลายด้าน 5’ เพื่อการตรวจผลผลิตจากแลมป์ (LAMP) บนแผ่นดิพสติค (dipstick) มีลำดับ เบสดังนี้ 5’- FlTC-CATggACCAgAACAAC-3’ 4. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยแถบสี ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) มีขั้นตอนการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยา ไรแฟมพิซิน (rifampicin) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส แล้วใช้ตัวตรวจจับติดสารเรืองแสง (FlTC) ด้วยการอ่านผลบนแผ่นดิพสติค (dipstick) เมื่อให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู บริเวณแถบ ทดสอบ (T) และแถบควบคุม (C) แสดงว่า ในตัวอย่างพบเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 และ 526 ของยีนอาร์โพบี (rpoB) แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น 5. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยแถบสีตาม ข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งมีลักษณะเฉพาะคือ ไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR thermal cycler) และเครื่องแยกสาร พันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้า 6. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยแถบสี ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งเป็นเทคนิคการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยแถบสีในผู้ป่วยที่สงสัยการติดเชื้อดื้อยานี้ เพื่อการตรวจวินิจฉัยและป้องกันการระบาดของโรค ---------------------------------------------------------------------------------------------------- แก้ไข 10/03/2559 1. กรรมวิธีในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะชิด (isoniazid) ด้วยแถบสี ที่ ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้ดิพสติค (dipstick) ภายในปฏิกิริยา แลมป์ (LAMP) 25 ไมโครลิตร มีการใช้ไพรเมอร์ 2 ชุดด้วยการทำปฏิกิริยา 2 ครั้ง ชุดที่ 1 ประกอบด้วย ไพรเมอร์ 3 และไพรเมอร์ 4 อย่างละ 2 ไมโครโมลาร์, ไพรเมอร์ 1 และไพรเมอร์ 2 อย่างละ 0.2 ไมโครโมลาร์, ดีเอ็นทีพีส์ (dNTPs) 1.6 มิลลิโมลาร์ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 มิลิโม ลาร์, เอนไซม์ บีเอสที 2.0 วอร์ม สตาร์ท ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst 2.0 warm start DNA polymerase) 2.5U และสารละลายบัฟเฟอร์ ใช้ในการตรวจลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 ของยีนอาร์โบบี (rpoB) ของเชื้อวัณ โรค ชุดที่ 2 ประกอบด้วย ไพรเมอร์ 3 และไพรเมอร์ 5 อย่างละ 2 ไมโครโมลาร์, ไพรเมอร์ 1 และไพรเมอร์ 2 อย่างละ 0.2 ไมโครโมลาร์, ดีเอ็นทีพีส์ (dNTPs) 1.6 มิลลิโมลาร์ ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4.8 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์ บีเอสที 2.0 วอร์ม สตาร์ท ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst 2.0 warm start DNA polymerase) 3.5-5.0 U และสารละลายบัฟเฟอร์ สำหรับการตรวจลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ ตำแหน่ง 526 ของยีนอาร์โบบี (rpoB) ของเชื้อวัณโรค การออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิคแลมป์ (LAMP) ในการ ตรวจเชื้อ ที่มีเบสกลายพันธุ์เพียงหนึ่งเบส ไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ประกอบด้วยไพรเมอร์ 4 ตัว ที่ จำเพาะต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 และ 526 ของยีนอาร์โบบี (rpoB) ของเชื้อวัณโรค ดังนี้ ไพรเมอร์ 1 ลำดับเบส (5’-3’) CCgCAgACgTTgATCAACAT ไพรเมอร์ 2 ลำดับเบส (5’-3’) CAgggTTTCgATTgggC ไพรเมอร์ 3 ลำดับเบส (5’3’) ggTgCTgAAgAACTCCTTgATTTTgCCggTggTCgCCgCg ไพรเมอร์ 4 ลำดับเบส (5’-3’) AgCgCTTggggCCCgTTTTAgTgCgACgggTgCA ไพรเมอร์ 5 ลำดับเบส (5’-3’) HACAAgCgCCgACTgTCTTTTAgTgCgACgggTgCA H = A/C/T 2. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยแถบสีตาม ข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจผลผลิตจากแลมป์ (LAMP) บนแผ่นดิพสติค (dipstick) มี ลักษณะเฉพาะคือ ทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง แล้วเติมตัว ตรวจจับ (probe) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที ดูดสารละลายดังกล่าวจำนวน 1 ไมโครลิตร ใส่ ในหลอดที่มีสารละลายบัฟเฟอร์ 100 ไมโครลิตร ที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจุ่มแผ่นดิพสติค (dipstick) ลงใน สารละลาย 5 นาที แล้วอ่านผล 3. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์เขื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยแถบสีตาม ข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งกรรมวิธีการออกแบบตัวตรวจจับ (probe) ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อ ยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยแถบสีบนแผ่นดิพสติค (dipstick) มีลักษณะเฉพาะคือ ตัวตรวจจับติดฉลากด้วย สารเรืองแสง (FITC) ที่ปลายด้าน 5’ เพื่อการตรวจผลผลิตจากแลมป์ (LAMP) บนแผ่นดิพสติค (dipstick) มีลำดับ เบสดังนี้ 5’- FITC-CATggACCAgAACAAC-3’ 4. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยแถบสี ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) มีขั้นตอนการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยา ไรแฟมพิซิน (rifampicin) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส แล้วใช้ตัวตรวจจับติดสารเรืองแสง (FITC) ด้วยการอ่านผลบนแผ่นดิพสติค (dipstick) เมื่อให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู บริเวณแถม ทดสอบ (T) และแถบควบคุม (C) แสดงว่า ในตัวอย่างพบเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 และ 526 ของยีนอาร์โบบี (rpoB) แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น 5. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยแถบสีตาม ข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งมีลักษณะเฉพาะคือ ไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR thermal cycler) และเครื่องแยกสาร พันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้า 6. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยแถบสี ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งเป็นเทคนิคการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยแถบสีในผู้ป่วยที่สงสัยการติดเชื้อดื้อยานี้ เพื่อการตรวจวินิจฉัยและป้องกันการระบาดของโรค --------------------------------------------------------------- คำขอใหม่ปรับปรุง

1. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยแถบสี เป็นเทคนิคใหม่ที่ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยา Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) ร่วมกับ การประยุกต์ใช้เทคนิค dipstick

2. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยแถบสี ด้วยเทคนิคใหม่ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจผลผลิตจาก LAMP บนแผ่น dipstick มี ลักษณะเฉพาะคือ ทำปฏิกิริยา LAMP ที่อุณหภูมิประมาณ 61 องศาเซลซียส เป็นเวลาประมาณ 1 ชั่วโมง แล้ว เติมตัวตรวจจับ ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลาประมาณ 5 นาที ดูดสารละลายดังกล่าวจำนวน 1 ไมโครลิตร ใส่ในหลอดที่มีสารละลายบัฟเฟอร์ 100 ไมโครลิตร ที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจุ่มแผ่น Dipstick ลงใน สารละลายประมาณ 5 นาที แล้วอ่านผล

3. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยแถบสี ด้วยเทคนิคใหม่ ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งกรรมวิธีการออกแบบตัวตรวจจับ (probe) ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยแถบสีบนแผ่น dipstick มีลักษณะเฉพาะตัวคือ ตัวตรวจจับ ติดฉลาก FITC ที่ปลายด้าน 5’ เพื่อการตรวจผลผลิตจาก LAMP บนแผ่น dipstick มีลำดับเบสดังนี้ FITC 5’ –CATGGACCAGAACAAC-3’

4. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วย แถบสี ด้วยเทคนิคใหม่ ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งปฏิกิริยา Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) มีขั้นตอนดังนี้ การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) เป็นเวลาประมาณ 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิประมาณ 61 องศาเซลเซียส

5. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วย แถบสี ด้วยเทคนิคใหม่ ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งปฏิกิริยา Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) จะต้องใช้เวลาในการเพิ่มประมาณสารพันธุกรรมของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ที่มีเบสกลาย พันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 และ 526 บนยืน rpoB เป็นเวลาประมาณ 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิประมาณ 61 องศาเซลเซียส และ ภายในปฏิกิริยา LAMP 25 ไมโครลิตร มีการใช้ไพรเมอร์ 2 ชุดด้วยกัน ชุดที่ 1 สำหรับเบสกลายพันธุ์ที่ ตำแหน่ง 531 บนยีน rpoB ประกอบด้วย inner primers FIP-rpoB และ BIP-rpoB531 อย่างละ 2 ?M, outer primers F3-rpoB และ B3-rpoB อย่างละ 0.2 ?M, dNTPs 1.6 mM ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 M, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 mM, 2.5U Bst 2.0 warm start DNA polymerase และ supplied buffer 1x ชุดที่ 2 สำหรับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 526 บนยีน rpoB ประกอบด้วย inner primers FIP-rpoB และ BIP-rpoB526 อย่างละ 2 ?M, outer primers F3-rpoB และ B3-rpoB อย่างละ 0.2 ?M, dNTPs 1.6 mM ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 M, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 mM, 2.5U Bst 2.0 warm start DNA polymerase และ supplied buffer 1x

6. ไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยา LAMP ในข้อถือสิทธิที่ 3 การออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิค LAMP ในการ ตรวจเชื้อ ที่มีเบสกลายพันธุ์เพียงหนึ่งเบส ไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยา LAMP ประกอบด้วยไพรเมอร์ 4 ตัว ที่จำเพาะ ต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 และ 526 บนยีน rpoB ของเชื้อวัณโรคดังนี้ ไพรเมอร์ F3-KatG ลำดับเบส (5’-3’) CCGCAGACGTTGATCAACAT ไพรเมอร์ B3-KatG ลำดับเบส (5’-3’) CAGGGGTTTCGATTGGGC ไพรเมอร์ FIP-KatG1 ลำดับเบส (5’-3’) GGTGCTGAAGAACTCCTTGATTTTGCCGGTGGTGGTCGCCGCG ไพรเมอร์ BIP-rpoB531 ลำดับเบส (5’-3’) CTGGCATCGAGGTCGTATTTTTTCGTCGGGGTGTTCGTCC ไพรเมอร์ BIP-rpoB 526 ลำดับเบส (5’-3’) AGCGCTTGGGGCCCGTTTTAGTGCGACGGGTGCA

7. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อไรแฟนพิซิม (rifampicin) ด้วย แถบสี ในข้อถือสิทธิที่ 1 มีลักษณะเฉพาะคือ ไม่ต้องใช้เครื่อง PCR และเครื่องแยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้า

8. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อไรแฟนพิซิม (rifampicin) ด้วย แถบสี ด้วยเทคนิคใหม่ สำหรับการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อไรแฟนพิซิม (Rifampicin) ด้วย แถบสี ในผู้ป่วยที่สงสัยการติดเชื้อดื้อยานี้ เพื่อการตรวจวินิจฉัยป้องกันการระบาดของโรค