TH13929U - กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) บนยีนไอเอ็นเอชเอ (inhA) ด้วยแถบสี - Google Patents

Abstract

แก้ไขบทสรุปการประดิษฐ์ 10/03/2559 กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยแถบสีที่ พัฒนาขึ้นนี้มีความจำเพาะต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ตำแหน่งโพรโมเตอร์ (promoter) ที่ 15 ซึ่งเบส ซี เปลี่ยนเป็น เบสที (C-15-T) ของยีนไอเอ็นเอชเอ (inhA) ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isniazid) โดยการออกแบบ ไพรเมอร์ที่ใช้ปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ประกอบด้วยไพรเมอร์ 4 ตัว ที่จำเพาะต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ดังกล่าว ของเชื้อวัณโรค ด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เอ็นเวลา 45-60 นาที แล้วใช้ตัว ตรวจจับติดสารเรืองแสง (FITC) ด้วยกานอ่านผลบนแผ่นดิพสติค (dipstick) เมื่อให้ผลบวก จะปรากฏเส้นทดสอบ สีชมพู บริเวณแถบทดสอบ (T) และแถบควบคุม (C) แสดงว่า ในตัวอย่างพบเบสกลายพันธุ์ของยีนไอเอ็นเอชเอ (inhA) แต่ถ้าผลลบ จะปรากฏเส้นทดสอบสีชมพู เฉพาะแถบควบคุม (C) เท่านั้น วิธีการนี้เทียบเท่ากับการ ตรวจสอบด้วยเทคนิคพีซีอาร์ (PCR) แบบเรียลไทม์ (real time) อีกทั้งยังไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR) และเครื่อง แยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้าในการติดตามผลของปฏิกิริยา ------------------------------------------------------------------ คำขอใหม่ปรับปรุง การประดิษฐ์นี้เกี่ยวข้องกับการป้องกันการกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ที่ เป็นปัญหาสำคัญของประเทศ โดยเริ่มจากการออกแบบ primers 4 ตัว ที่ออกแบบจากลำดับเบสในส่วนยีนเชื้อวัณ โรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) บนยีน inhA ที่ออกแบบในระบบนี้ DNA เป้าหมายจะถูกเพิ่มปริมาณ ภายใต้อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 45-60 นาที ผลการตรวจพบว่าเทคนิค LAMP มีความจำเพาะในการ ตรวจสอบการกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) บนยีน inhA เทียบเท่ากับการ ตรวจสอบด้วยเทคนิค PCR แบบ real time ต่อจากนั้นทำการออกแบบตัวตรวจจับ (probe) ที่จำเพาะต่อลำดับ เบสของผลผลิต LAMP ที่ได้ แล้วทดสอบสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจสอบผลผลิตของ LAMP ที่ได้บนแผ่น dipstick แทนการตรวจสอบด้วยวิธี gel eletrophoresis ซึ่งจะใช้เวลาอีกเพียง 5-15 นาทีเท่านั้น

Claims (8)

แก้ไข 1 ก.ย. 2560 1. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) บนยีนไอเอ็น เอชเอ (inhA) ด้วยแถบสี ที่ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้แผ่นดิพสติค (dipstick) ภายในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) 25 ไมโครลิตร ประกอบด้วยไพรเมอร์ 3 และไพรเมอร์ 4 อย่างละ 2 ไม โครโมลาร์, ไพรเมอร์ 1 และไพรเมอร์ 2 อย่างละ 0.2 ไมโครโมลาร์, ดีเอ็นทีพี (dNTP) 1.6 มิลลิโมลาร์ ผสมด้วย สารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (DNA polymerase) 2.5U และ บัฟเฟอร์ (supplied buffer 1x) การออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิคแลมป์ (LAMP) ในการตรวจเชื้อที่มีเบสกลายพันธุ์เพียงหนึ่งเบส ไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ประกอบด้วย ไพรเมอร์ 4 ตัว ที่จำเพาะต่อลำดับเบสกลายพันธุ์เพียงหนึ่งเบสที่ตำแหน่งโพรโมเตอร์ (promoter) ที่ 15 ซึ่งเบส ซี เปลี่ยนเป็นเบส ที (C-15-T) ของยีนไอเอ็นเอชเอ (inhA) ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซโนอะซิด (isoniazid) ดังนี้ ไพรเมอร์ 1 ลำดับเบส (5’-3’) gCTgAgTCACACCgACAAAC ไพรเมอร์ 2 ลำดับเบส (5’-3’) CCggTTTCCTCCggTAACC ไพร์เมอร์ 3 ลำดับเบส (5’-3’) CCACgAgCgTAACgTggCTgCTTTTgTCACgAgCgTAACCCCA ไพรเมอร์ 4 ลำดับเบส (5’ - 3’) AgATAggTTgTCggggTgACTTTTAggACTgAACgggATACgAA 2. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยแถบสีตาม ข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจผลผลิตจากแลมป์ (LAMP) บนแผ่นดิพสติค (dipstick) มี ลักษณะเฉพาะคือ ทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 45 - 60 นาที แล้วเติมตัว ตรวจจับ (probe) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที ดูดสารละลายดังกล่าวจำนวน 1 ไมโครลิตร ใส่ ในหลอดที่มีสารละลายบัฟเฟอร์ 100 ไมโครลิตร ที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจุ่มแผ่นดิพสติค (dipstick) ลงใน สารละลาย 5 นาที แล้วอ่านผล 3. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยแถบสีตาม ข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งกรรมวิธีการออกแบบตัวตรวจจับ (probe) ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อ ยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยแถบสีบนแผ่นดิพสติค (dipstick) มีลักษณะเฉพาะคือ ตัวตรวจจับติดฉลากสาร เรืองแสง (FlTC) ที่ปลายด้าน 5’ เพื่อการตรวจผลผลิตจากแลมป์ (LAMP) บนแผ่นดิพสติค (dipstick) มีลำดับเบส ดังนี้ 5’-FlTC-TggACATACCgATTTCggCCC-3’ 4. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยแถบสี ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งสภาวะปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) มีขั้นตอนดังนี้ การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อวันโรค ดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) เป็นเวลา 45 - 60 นาทีที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส 5. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ในยีนไอเอ็น เอชเอ (inhA) ด้วยแถบสีตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งมีลักษณะเฉพาะ คือ ไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR) และเครื่องแยก สารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้า 6. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ในยีนไอเอ็น เอชเอ (inhA) ด้วยแถบสีตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งใช้สำหรับการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซ ไนอะซิด (isoniazid) บนยีนไอเอ็นเอชเอ (inhA) ด้วยแถบสีที่เปลี่ยนแปลง ในผู้ป่วยที่สงสัยการติดเชื้อนี้ เพื่อการ ตรวจวินิจฉัยและป้องกันการระบาดของวัณโรคดื้อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ---------------------------------------------------------------------------------------------------- แก้ไข 10/03/2559 1. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) บนยีนไอเอ็น เอชเอ (inhA) ด้วยแถบสี ที่ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้แผ่นดิพสติค (dipstick) ภายในปฏิกิริยาเลมป์ (LAMP) 25 ไมโครลิตร ประกอบด้วยไพรเมอร์ 3 และไพรเมอร์ 4 อย่างละ 2 ไม โครโมลาร์, ไพรเมอร์ 1 และไพรเมอร์ 2 อย่างละ 0.2 ไมโครโมลาร์, ดีเอ็นทีพี (dNTP) 1.6 มิลลิโมลาร์ ผสมด้วย สารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (DNA polymerase) และ บัฟเฟอร์ (supplied buffer 1x) การออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิคแลมป์ (LAMP) ในการตรวจเชื้อที่มีเบสกลายพันธุ์เพียงหนึ่งเบส ไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ประกอบด้วย ไพรเมอร์ 4 ตัว ที่จำเพาะต่อลำดับเบสกลายพันธุ์เพียงหนึ่งเบสที่ตำแหน่งโพรโมเตอร์ (promoter) ที่ 15 ซึ่งเบส ซี เปลี่ยนเป็นเบส ที (C-15-T) ของยีนไอเอ็นเอชเอ (inhA) ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซโนอะซิด (isoniazid) ดังนี้ ไพรเมอร์ 1 ลำดับเบส (5’ – 3’) GCTgAgTCACACCgACAAAC ไพรเมอร์ 2 ลำดับเบส (5’ – 3’) CCggTTTCCTCCggTAACC ไพร์เมอร์ 3 ลำดับเบส (5’ – 3’) CCACgAgCgTAACgTggCTgCTTTTgTCACgAgCgTAACCCCA ไพรเมอร์ 4 ลำดับเบส (5’ – 3’) AgATAggTTgTCggggTgACTTTTAggACTgAACgggATACgAA 2. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะชิด (isoniazid) ด้วยแถบสีตาม ข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจผลผลิตจากแลมป์ (LAMP) บนแผ่นดิพสติค (dipstick) มี ลักษณะเฉพาะคือ ทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง แล้วเติมตัว ตรวจจับ (probe) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที ดูดสารละลายดังกล่าวจำนวน 1 ไมโครลิตร ใส่ ในหลอดที่มีสารละลายบัฟเฟอร์ 100 ไมโครลิตร ที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจุ่มแผ่นดิพสติค (dipstick) ลงใน สารละลาย 5 นาที แล้วอ่านผล 3. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยแถบสีตาม ข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งกรรมวิธีการออกแบบตัวตรวจจับ (probe) ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อ ยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยแถบสีบนแผ่นดิพสติค (dipstick) มีลักษณะเฉพาะคือ ตัวตรวจจับติดฉลากสาร เรืองแสง (FiTC) ที่ปลายด้าน 5’ เพื่อการตรวจผลผลิตจากแลมป์ (LAMP) บนแผ่นดิพสติค (dipstick) มีลำดับเบส ดังนี้ 5’ –FITC-TggACATAgATTTCggCCC-3’ 4. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยแถบสี ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งสภาวะปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) มีขั้นตอนดังนี้ การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อวันโรค ดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส 5. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ในยีนไอเอ็น เอชเอ (inhA) ด้วยแถบสีตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งลักษณะเฉพาะ คือ ไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR) และเครื่องแยก สารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้า 6. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ในยีนไอเอ็น เอชเอ (inhA) ด้วยแถบสีตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งใช้สำหรับการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซ ไนอะซิด (isoniazid) บนยีนไอเอ็นเอชเอ (inhA) ด้วยแถบสีที่เปลี่ยนแปลง ในผู้ป่วยที่สงสัยการติดเชื้อนี้ เพื่อการ ตรวจวินิจฉัยและป้องกันการระบาดของวัณโรคดื้อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ---------------------------------------------------------------- คำขอใหม่ปรับปรุง

1. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) บนยีน inhA ด้วยแถบสี เป็นเทคนิคใหม่ที่ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยา Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้ dipstick

2. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วย แถบสีด้วยเทคนิคใหม่ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจผลผลิตจาก LAMP บนแผ่น dipstick มีลักษณะเฉพาะคือ ทำปฏิกิริยา LAMP ที่อุณหภูมิประมาณ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลาประมาณ 1 ชั่วโมง แล้ว เติมตัวจับ ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลาประมาณ 5 นาที ดูดสารละลายดังกล่าวจำนวน 1 ไมโครลิตร ใส่ในหลอดที่มีสารละลายบัฟเฟอร์ 100 ไมโครลิตร ที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจุ่มแผ่น dipstick ลงใน สารละลายประมาณ 5 นาที แล้วอ่านผล

3. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วย แถบสีด้วยเทคนิคใหม่ ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งกรรวิธีการออกแบบตัวตรวจจับ (probe) ในการตรวจสอบเบส กลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยแถบสีบนแผ่น dipstick มีลักษณะเฉพาะคือ ตัว ตรวจจับติดฉลาก FITC ที่ปลายด้าน 5’ เพื่อการตรวจผลผลิตจาก LAMP บนแผ่น dipstick มีลำดับเบสดังนี้ FITC 5’ –TGGACATACCGATTTCGGCCC-3’

4. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วย แถบสี ด้วยเทคนิคใหม่ ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งปฏิกิริยา Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) มีขั้นตอนดังนี้ การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) เป็นเวลาประมาณ 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิประมาณ 61 องศาเซลเซียส

5. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ในยีน inhA ด้วยแถบสี ด้วยเทคนิคใหม่ ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งปฏิกิริยา Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) จะต้องใช้เวลาในการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ในยีน inhA ที่มีเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง promoter C(-15)T ของยีน inhA เป็นเวลาประมาณ 45 – 60 นาที ที่อุณหภูมิ ประมาณ 61 องศาเซลเซียส และ ภายในปฏิกิริยา LAMP 25 ไม่โครลิตร ประกอบด้วย inner primers FIP- INHA และ BIP-INHA อย่างละ 2 ?M, outer primers F3-INHA และ B3-INHA อย่างละ 0.2 ?M, dNTPs 1.6 mM ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 M, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 mM, 2.5U Bst 2.0 warm start DNA polymerase และ supplied buffer 1x

6. ไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยา LAMP ในข้อถือสิทธิที่ 5 การออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิค LAMP ในการ ตรวจเชื้อ ที่มีเบสกลายพันธุ์เพียงหนึ่งเบส ไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยา LAMP ประกอบด้วยไพรเมอร์ 4 ตัว ที่จำเพาะ ต่อลำดับเบสกลายพันธุ์เพียงหน่งเบสที่ตำแหน่ง promoter C(-15)T ของยีน inhA ของเชื้อวัณโรคไอโซไนอะซิด (isoniazid) ดังนี้ ไพรเมอร์ F3-INHA ลำดับเบส (5’-3’) GCTGAGTCACACCGACAAAC ไพรเมอร์ B3-INHA ลำดับเบส (5’-3’) CCGGTTTCCTCCGGTAACC ไพรเมอร์ FIP-INHA ลำดับเบส (5’-3’) CCACGAGCGTAACGTGGCTGCTTTTGTCACGAGCGTAACCCCA ไพรเมอร์ BIP-INHA ลำดับเบส (5’-3’) AGATAGGTTGTCGGGGTGACTTTTAGGACTGAACGGGATACGAA

7. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ในยีน inhA ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลงในข้อถือสิทธิที่ 1 มีลักษณะเฉพาะคือ ไม่ต้องใช้เครื่อง PCR และเครื่อง แยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้า

8. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ในยีน inhA ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลงด้วยเทคนิดใหม่ สำหรับการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อ ต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ในยีน inhA ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลงในผู้ป่วยที่สงสัยการติดเชื้อนี้ เพื่อ การตรวจวินิจฉัยและป้องกันการระบาดของวัณโรคดื้อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid)