SU665635A1 - Способ иммобилизации нуклеиновых кислот - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ НУ]КЛЁ. ИНОВЫХ КИСЛОТ, включающий сорбцию нуклеиновых кислот из водных растворов на целлюлозу, обр^абот'ку, привод щую к ковалентнс»1у св зывани  нуклеиновой кислоты с целлюлозой, и отмывку продукта водными растворами Had и. водой, отличаю?* . щ и и с   тем, что, с целью упрощени  процесса, увеличени  содержа- н^  нуклеиновых кислот в готовом продукте, увеличени  выхода по св зы ванию РНК и повышени  устойчивости продукта к действию нуклеаз, сорбцию нуклеиновых' кислот провод т, на аминоэтилцеллюлозе при 60-100°С в течение 15-40 мин с последующим введением в' реакционную смесь глута- рового альдегида до содержани  его;в смеси, равного 0,25-4%, и выдерживанием смеси при 20-100''с в те-.чение 120-10 мин.'(/)с сО)at) елСП)со ел

Description

Изобретение относитс  к области биохимии, а именно к способам ШФюбилизации нуклеиновых кислот. Способ может быть применен дл  полу.чени  эффективных сорбентов дл  аффинной хроматографии белков.

Известен способ иммобилизации нуклеиновых кислот путем включени  их в гранулы полиакриламидного гел  tlj.

Недостатками этого способа  вл йтс  низкое содержание нуклеиновой кислоты в препаратах, неустойчи .вость препаратов к действию нуклеаз невозможность иммобилизации низкомолекул рных нуклеиновых кислот и плохие гидродинамические свойства hperiapaTOB.

Известен р д способов иммобилизации нуклеиновых кислот посредством св зывани  их с активированной матрицей С2-4 . Эти Способы свод тс  к |следую1цему:: гидрофильную матрицу, чаще всего агарозу, обрабатывают бромистым цианом с целью активации, затем промывают водными растворами солей (NaCl или.КС1) и водой. К активированной матрице приливают раствор нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и Инкубируют смесь. Затем промывают препараты водными растворами солей (NaCl .С) дл  удалени  несв завшихс  нуклеиновых кислот.

Таким образом, получают препараты иммобилизованных нуклеиновых кислот с содержанием ДНК или РНК 0,3-0,6 мг/г матрицы (0,050 ,1 мг/мЛ гел }. Полученные преhapaTH подвержены действию нуклеаз и период их полужизнй составл ет 5-10 дней натийную ДНК таким способом иммобилизовать невозможно.

Недостатками этих способов  вл ютс  использование токсичного вещества, бромистого циана, низкое содержание нуклеиновых кислот в продукте, нестабильность препаратбв Ьри взаимодействии с нуклеазами , невозможность иммобилизации натизвной ДНК.

Р1звестен также способ иммобилизации нуклеиновых кислот, ДНК и РНК С5 , заключающийс  в той, что порошок целлюлозы пропитывают растворами нуклеиновых Кислот, смесь размазывают тонким слоем и сушат в токе вОзду са в течение 16-24 ч. Затем сухой продукт суспендирует в спирте и суспензию облучают ртутной лампой мощностью 100000 эрг/г в течение l5-ЗО МИН. Спирт отфильтровывают , готовьй продукт промывают водным раствором NaCl и водой. Выход по св зыванию ДНК 90%, по св зыванию РНК 23-25%. Этим способом получают препараты, содержащие

13 мг ДНК/г матрицы и 1 мг РНК/г матрицы.

Недостатками этого способа  вл ютс  длительность получени  препарата (2 сут), низкое содержание нуклеиновых кислот в готовом продукте, низкий выход по св зыва- , нию РНК и низка  устойчивость продукта к воздействию . нуклеаз. Цель изобретени  - упрощение

0 процесса иммобилизации, увеличение содержани  нуклеиновых кислот в готовом продукте, увеличение выхода по св зыванию РНК и повышение устойчивости продукта к действию

5 нуклеаз.

Цель достигаетс  за счет того, что сорбцию нуклеиновых кислот производ т на аминоэтилцеллюлозе при 60--100°С в течение 15-40 мин с поQ следующим введением в реакционную смесь глутарового альдегида до содержани  его в смеси, равного 0,254% , и выдерживанием смеси при 20ЮО С в течение 120-10 мин.

5 Процесс провод т следующим образом .

В качестве носител  берут АЭ-целлюлозу отечественного производства (Биохимпрепарат, г.Олайне) или производства Реанал (Венгри ),

0 Иммобилизации подвергают ДНК из тимуса и молок лососевых рыб (СКТБ БАБ и Koch-Light и РНК из печени и E.coli MRE-600 (СКТБ ВДВ).

Способ включает следующие стадии.

5 1. Нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК) собирают из водного раствора на ЛЭ-целлюлозе в течение 15-40 мин. Содержание нуклеиновых кислот в водном растворе составл ет до 60 мг/мл;

0 Увеличение времени сорбции от 15 до 40 мин позвол ет получить препарат с более высоким содержанием нуклеиновых кислот. Дальнейшее увеличение времени сорбции практически не приводит к увеличению св зывани  нуклеиновых кислот. Уменьшение времени (менее 15 мин) приводит к получению препарата с низким содержанием нуклеиновых кислот, что нежелательно.

2, Обрабатывают получаенную суспензию нерастворимого комплекса АЭ-целлюлоза - нуклеинова  кислота водным раствором глутарового альдегида при 20-100°С в течение 12010 мин. Концентрацию глутарового аль дегида в реакционной смеси поддерживают равной объемным 0,25-4,0%. Указанные концентрации глутарового альде гида оптимальны и свойства полученных препаратов идентичны. Уменьшение

0 концентраций приводит к увеличению рабочих объемов, а увеличение концентрации создает неудобства при перемешивании массы. Перемешивание необходимо Дл  равномерного распреде5 .лени  глутарового альдегида по

объему. Увеличение температуры nr iMOбилиэации приводит к сокращению времени обработки.

3, Полученную суспензию отфильтро Бывают на фильтре водным раствором ЫаС1 и водой дл  удалени  несв завшихс  нуклеиновых кислот,

Таким образом, иммобилизуетс  80-90% нуклеиновы5 кислот, внесенных в реакционную смесь. Содержание нуклеиновых кислот в препаратах составл ет до 130 мг/г сорбента. Способ позвол ет получать rtjJenapaTbi, содержавшие заданное коли 1ество нуклеиновых кислот. Длительность процесса тгоЛу 1ений иммйбйлизованных иуклёиновь х кислот составл ет 0,53 ч в зависимости от условий реакЦии , .. ,,..,. -; Препараты йммобилиэованнйх нуклей Новйх кйслот на Аэ-целлюлозе устойчивй к действию нуклеаз как в услови х хроматйграфии, так и в жёстких УСЛОВИЯХ, при йсчерпывакедём гйдролйЭе йз« Му1{Леаэой Serratia marcescens (20 ч при температуре ). В услови х хроматографии сродства на колонке иммббилйзбванной ДНК препаратов терйииальной дезоксинуклеотидйлтрнасфераэы КЗ тимуса, содержащий принеси нуклеаз, иммобилизованмай ДНК пбЛйЪстьй стабильна и получаемый прёпарйт феЕмента не содержит примесей иуклейновых кислот,

При ис ерпыёагощем Гидролизе иммобилизованных ДНК и РНК нуклеазой Serratla marcescens от препаратов, срдер сащйх денатурировайные ДНК и РНК б.тщёпл етс  10-18% нуклеЬтидного материала, а от препаратов,содержащих активную ДНК - 41%. В то же , аналогична  обработка нуклеазой препаратов, не обработанных глу таровым альдегидом, приводит к отщеплению 65% нуклеотидного материала . Препараты иммобилизованных нуклеиновых кислот на АЭ-целлюлозе стабильны в. течение года при многократном использовании и хранении, Использование им юбилизoвaннoй ДНК в качейтйе сорбента дл  хроматографии средства терминальной дезоксинуклеотидилтрансфераэы из тимуса позвол ет провести очистку фермента по белку в 3-5 раз с выходом активности 6075% , очистку от нуклеаз в 15-30 раз, очистку от фосфодиэстераз в 50200 раз.

Пример 1, 25 мл водного раствора денатурированной ДНК или РНК с концентрацией 10 мг/мл (200 об, е,/мл, измеренные при 260 им на приборе СФ-16), погружают в воду, имеющую температуру кип щей вод ной бани, на 10 мин и всыпают в нее 10 г влажной АЭ-целлюлозы (4 г суЗсого веса). Смесь выдерживают в течение 15 мин на кип щей вод ной

бане при посто нном перемемиваНий, Затем добавл ют 6Мп3%-ного водного раствора глутарового альдегида до концентрации его в реакционной смеси 0,5 Об,% и инкубируют смесь еще в течение 10 мин на кип щей вод ной ёане. Полученный осадок, представл ющий сОбоЙ иммобилизованную нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК), перенос т на стекл нный порис0 тый фильтр, промывают водным раствором 1м NaCl до Отсутстви  оптиШской плотности ДНк в промывных водах и водой,

Св зывание нуклеиновых кислот с

5 ДЭ-целлюлозой 80-90%, содержание нуклеиновых кйслОт 50-60 мг/г матрицы .

Иммобилизованна  РНК стабильна в услови х хрОйатрграфйи ферментных препаратов, содержащих нуклеазы.

0 При исчерпывающем гидролизе эндонук-, лeaзoйSerratia/merc.ecsceйs (20 ч При ) от матрицы отщепл етс  не более 18% нуклеотидного материала , Св занного с матрицей. Препара5 ты стабильны в течение года при ЛерирдНЧёском использовании и хранении при 4°С.

П р и м е р 2, №1Мо(ЗйЛизат ;йю нуклеиновых кислОт провод т как в

0 примере 1, за исключением того, что дл  и fr1oбилизaции берут ВО мл водного раствора денатурированной нуклеиновой кислоты и инкубируют с :АЭ-целлюлозой в течение 30-мин. При

5 9ТОМ получают препараты иг««1обилизованных нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) с содержанием ДНК или РНК 100120 мг/г матрицы.

Пример 3, Иммобилизаци 

0 нативной ДНК,

К 2 г влажной АЭ-цёллюлозы (0,66 г сухого веса приливают 11 мЛ раствора ДНК с концентрацией 2,3 мг/мл. Инкубируют смесь в течение 20 мин при 60°С при непрерывном перемешивании.

5 Затем в смесь вливают 1 мл 3% глутарового альдегида до концентрации его в реакционной смеси 0,25 об,% и инкубируют в течение 2 ч при 25с при непрерывном перемешивании. После

0 окончани  выдержки смесь перенос т на стекл нный фильтр, промь вают водным раствором 1М NaCl до отсутстви  оптической плотности ДНК в элюате и водой, .

5

Получают препарат, содержащий 30 мг (ДНК) г сухого веса препарата. Выход по иммобилизации ДНК составил 80%, При проведении исчерпывающего гидролиза энденуклеаэой от мат0 рицы отщепл етс  40% иммобилизованной ДНК, При аналогичной ,обработке образца, необработанного альдегидом, отщепл ют 65% ДНК.

Пример 4. Иммобилйзаци нуклеиновых ки.слот провод т как в при5 мере I, за исключением того, что в смесъ 1обавл ют 5 мл 25%-ного йодйо )адтёо|зй глута ового альдегида (концентраци  глутарового альг егида й реакционной сйеЪи сосгйвл е 4,0 O6.I). тСй эвгоаНиё нуклеиновых кислот с АЭ-целлюлоэой 80-90%, сидержание нуклеиновых кислот 50 ,60 мг/г. При исчертывающем г идролизе эндонуклеазой Sefratla marcecscena от препарате отщепл етс  не 5 более 20% содержащейс  в нем ДНК.

Claims (1)

1. СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ НУКЛЕ. ИНОВЫХ КИСЛОТ, включающий сорбцию нуклеиновых кислот из водных растворов на целлюлозу, обработку, приводящую к ковалентному связыванию нуклеиновой кислоты с целлюлозой, и Отмывку продукта водными растворами ЯаС1 и. Водой, отличаю?* . щ ий с я тем, что, с целью упрощения процесса, увеличения содержания нуклеиновых кислот в готовом продукте, увеличения выхода по связыванию РНК и повышения устойчивости продукта к действию нуклеаз, сорбцию нуклеиновых' кислот проводят, на аминоэтилцеллюлозе при 60-100°С в течение 15-40 мин с последующим введением в' реакционную смесь глутарового альдегида до содержания его в смеси, равного 0,25-4%, й выдерживанием смеси при 20-100°С в те.чение 120-10 мин. ' е