SU641874A3 - Способ получени -лизина - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к технике получени  U -лизина путем культивировани  бактерий вида NocaP ia на питательной среде.

Известен способ получени  L -лизина культивировани  продуцирующих его микроорганизмов рода в услови х аэрации на питательной среде содержащей источник углерода, азота и необходимые питательные соли с поспёдующим выделением Ь -лизина ij.

Недостатком известного способа  вл етс  то, что он не обеспечивает достаточно высокого выхода L-лизина.

Целью изобретени   вл етс  повышени выхода L -лизина.

Это достигаетс  тем, что в предлагаемом способе получени  L,- лизина из рода Nocardia используют штаммы

Mocardia a 1 anoQfeutinousa №22359 (АТСС 31220) и (АТСС 31221), устойчивые к S -(2-аминоэтил ) L - иле тин у.

При этом в качестве источника угле-рода используют животное масло или жир или растительное масло.

Кроме того, в качестве источника углерода используют жирную кислоту.

Кроме того, в качестве источника yi лерода используют этиловый спирт.

Кроме того, в качес-те источника углерода используют глюкозу или фруктозу, или крахмал, или продукт гидролиза мелассы или крахмала.

Кроме того, в качестве источника углерода используют уксусную кислоту или лимонную кислоту.

А также, кроме того, в качестве источника углерода используют П -алкан,. содержащий от 14 до 19 атомов углерода или керосин, или сырую нефть, содержащую П -алкан.

При этом рН питательной среды после культивировани  микроорганизмов довод т до 1-3 и выдержаивают в течение 5-12О мин при 8О-1ОО°С. Кроме того, рН питательной среды после процесса культивировани  микроор. г-анизмов довод т до 7-9 и выдерживают от 5 минут до 5 суток при 8О- 100°С. Способ осуществл ют следующим образом . Продуцирующие L -лизин микроорганизмы из рода iocoiгdidкyльтивиpyют в услови х аэрации на питательной ереде , содержащей источник углерода, азота и необходимые питательные соли. Из рода Nocardio используют щтаммы Nocardios a 1 anog&utihousa № 223-59 (АТСС 31220) и № 22315 (АТСС 31221), устойчивые к S- 2-аминоэтил ) Ь-цистину (ЛЕС). Микробиологические свойства указанных штаммов аналогичны микробиологическим свойствам исходного штамма № 223, за исключением того, что первые два штамма обладшот стойкостью к ЛЕС, а последний нуждаетс  в помосе рине. Морфологи , Форма, Ранн   стади  выращивани : 0,8-1,0x4-15, пр мые или изогнутые палочки, о№1ечаетс  наличие ответвлений; стабильна  стади ; сферическа  или короачса  палочкообраз на , близка  к форме сферы, Грам-травление положительное, быстрое кислотное травление отрицательное, подвижность отсутствует. Эндогенные споры отсутствуют; клетки на стойкой стадии выращивани  выде живают при 80 С одночасового нагрева в физиологическом растворе. Услови  выращивани -. Колони  выращена на агаровой пластинке в течение 3 суток при 33 С, фор ма округла , рост хороший, окраска бледно-ро.зовак, колони  непрозрачна , влажна , гладка . Культивирование на скошенном агаре в течение 3 суток при 33 С, колони  нитевид1-1а , рост хороший, окраска бледно-розова , колони  влажна , гладка , наличи  воздушного мицели  не отмечае с . Культивирование на питательном буль не.при 33 С. На поверхности образуеахз тонка  пленка, отмечаютс  осадки. Питательна  желатина не ожидаетс , выращивание на поверхности и в верхней части, Локмусовое молоко: щелочна  реакци  без коагул ции или пептазашп. Филиологические свойства. Крахмал не гидрализует, восстанавливает нитраты , индол образует, сероводород образует , уреазу не образует, проба V-P-отрицательна , испытание метилкрасным отрицательно , реакци  на каталазу положительна , целлюлозу не разлагает, потребность в питательной среде отсутствует, разложение дезоксирибонуклеиновой,кислоты (ДА) отсутствует, чувствительность к лизошшу имеетс , эскулин разлагает, к пенициллину (5 единиц/мл. метод диска) не чувствителен. Ассимилирует в качестве источника углерода фруктозу, глюкозу, маннитол, сорбитол, фенол, молочную кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту, ацетамид , тирозин, этанол, маннозу, fi-алканы,: текстрин, масла и жиры, жирные кислоты. Образование кислот из Сахаров: кислоты образуют из глюкозы, фруктозы, сорбитола маннитола, глицерина и трехалозы, отсутствует образование кислот из ксилозы, галактозы, сахарозы, лактозы, мальтозы, инозитода, декстрина и крахмала. Оттимальна  температура выращивани  от ЗО до 37 С, рост наблюдаетс  в диапазоне 10-4О С, рН роста 8-9, аэробен относительно кислОрода. Состав клеток. Содер шт 1 11-диаменопималовую кислоту, галактозу, и арабинозу . В питательной среде в качестве источника углерода при выращивании- используют животное масло или жир, растительное масло, жирные кислоты, этиловый спирт, глюкозу,фруктозу или крахмал, или продукт гидролиза мелассы-или крахмала , уксусную или лимонную кислоту, Vi-алканы, содержащие 10-30 атомов углерода, а также углеводороды, такие как керосин -и неочищенна  нефть, В качестве источников азота используют . ацетат аммони , сульфат аммони , х/1бристый аммоний, нитрат аммони , водный раствор аммиака, аминокислоты, смесь аминокислот, экстракт дроио сей, пептон иэкстракт м са. При нeoбxoдимov сти ввод т также соли неорганических кислот, такие как фосфаты, соли кальци , магни , кали , натри , железа, марга иа , цинка и следы металлов. Эти компоненты питательной среды ввод т до стерилизации или отдельными порШ5ЯМ11 в :процессе ферментации. Выращивание осуществл ют со встр хиванием или при аэрации и перемещива-НИИ при рН 6-9, предпочтительно 6-8, температуре от 20 до 4О , предпочтительно от 27 до З7с, Питательный бульон после окончани  процесса культивировани  приобретает значительную в зкость, что преп тствует его фильтрации, вследствие чего в него добавл ют неорганическую кислоту с доведением рН до 1-3 или щелочь с доведением рН до 9 и более, после чего бульон подвергают нагреву при 80 С и выше в течение 5 мин. L,-лизин вьщелшот из фильтрата, например путем адсорбции ионообменной смолой IR -120 или IR-84, промывают водой и элюируют аммиачным раст вором. Эпюат сгущают, нейтрализуют концентрированной сол ной кислотой и высушивают, получа  высокочистый гидрохлорид L-лизина. Количество полученного L-линиза оценивают биопробой с использованием мутантного штамма EsctiericllJCfCOti и с помощью аминокислотного анализато П р и м е р 1 о Выращенные по полной петле в бульоне на скошенном агаре клетки бактерий NocotrdlO aetono eut nousa № 223-59 (АТСС 3122О),. а также № 223-15 (АТСС 31221) выдерживают в чв.чение суток при 33 С в пробирке, содержащей 10 мл питательной среды следующего , г: П-алканы ( )- 50,0; сульфат аммони  - 4О,О; Са СО - ЗО,0; KgHPO 0,5; КН PC -0,5; .: NaC -1,О; Fe504-7H2«- -Ю мг; ЛЛп5Од4Н2О - 10 мг; вода водопроводна  - 940 мл, рН - 7,0, температура 120 С (парообразование в течение 15 мин). Культивирование провод т в течение одних суток при 33 С со встр хиванием 1 мл полученного бульона высевают в 500-миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую ЗО мл той же питательной среды, и выдерживают 5 суток при 33 С со встр хиванием. При этом получают L-лизин (гидрохлорид ), г/л: Nocardia aC-kano Eutinousa № 223-59 (АТСС 31220)-19,5; Nocundia atkanoge.utinousa № 223-15. (АТСС- 31221)-2б,7П р и м е р2. Выращенные в бульоне на скошенном а га ре бактерии Nocar3ia а 1 аWg-euUnosa №223-59 (ЛТСС 3122О) и выдержанные b течение одних суток при 33 С петлей ввод т в 500-миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую 50 мл питательной среды такого же состава , как описано в примере 1, за тем исключением, что вместо Ц-алкана используют кукурузное масло или рыбий жир. Культивирование провод т со встр хиванием . В результате п тисуточного выращивани  получают 5,8 г/л L-лизина (в виде гидрохлорида) в случае введени  в питательную среду кукурузного масла или 6,3 г/л в случае введени  в нее рыбьего жира. П р и м е р 3. Выращенные в бульоне на скошенном агаре в течение одних суток при 33 С бактерии NocotPdia oCtonogCuiinousa № 223-15( АТСС 31221) внос т петлей в 5ООмииллиметровую колбу Сакагучи, содержащую ЗО мл питательной среды такого же состава , как описано в примере 1, за тем исключением, что вместо П-алканов используют стеариновую или маргариновую кислоту. Выращивание провод т в течение 5 суток при 33 С со встр хиванием. Количество накопленного в виде гидрохлоридов Ь-лизина составл ет 15,3 г/л при введении в питательную среду стеариновой кислоты и 14,4 г/л - при введении в питательную среду маргариновой кислоты, П р и м е р 4. Выращенные на скощенном агаре бактерии Nocothclja aClcanogreutinou&a .. № 223-59 (АТСС 3122О) внос тпетпейв 5ОО-МИЛпиметровуюкопбуСакагучи , содержащую ЗО мл питательной среды, имеющей такой же состав, как в примере 1, за тем исключением, что вместо -И-алканов используют этиловый спирт, вводимый порци ми, не превышающими 1%. Выращивание осуществл ют со встр хиванием. В результате п тисуточного выращивани  получают 13 г/л t-лизина (в виде гидрохлоридов). П р и м е р 5. Выращенные в бульоне на скошенном агаре в течение одних суток при 33°С бактерии NOCOrdia CiClcanogeutinousaX )223-15 (АТСС 31221) петлей внос т в 500-миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую ЗО мл питательной среды, как в примере 1, где выращивают при 33 С в теченйе;0 них суток со встр5гхиванием.

5 мл полученного бульона ввод т в 2- питровую колбу Сакагучи, содержацую 2ОО МП такой же питательной среоы , как в примере 1. Выращивание осуиествлают Д в течение одних суток при 33 С со встр хиванием. 600 мл полученного бульона перенос т в-30 - питро рый сосуд, содержащий 10 мл производ щей L-лизин среды указанного ниже состава. Культивирование провод т при 33 С с перемешиванием при 400 об/мин и с пропуском 9 л воэдуха в минуту, В процессе культивировани  среду нейт рализ5 ют водным раствором аммиака до рН 7,0. Спуст  96 часов культивировани  получаю 52,5 г/л L-лизина ( в виде гидрохлоридов). К 1 п полученного бульона добавл ют концентрированную серную кислоту, до достижени  рН 1.5. Затем осуществл ют нагрев при 100 С в течение 20 мин и фильтрацию. Фильтрат пропускают через 1шнообменн5Г о смолу типа . IR-120, NH , адсорбирующую Ij-лизин. Затем промывают водой и эшоируют аммиаком, Элюирован . ные фракции подвергают сгущению, иейт рализации ,концентрированной сол ной кис лотой и сушке. Получают 45 г гидррхлорида L-лизина со степенью чистоты выше 98%.

L ЛИЗИН среды

Состав производ щий

)

И алкан (С - С

100 г„

19

Сульфат аммони 

35,0 г 1,0 г

СаСе,

Масе 1,0 г 1,0 г к 2 HP о. 1,0 г

KHg Р04 0,5 г Mg ЗОд

71-1 О

1ОО мг 711 2 О ре 50

Ми SO,. 20 мг ZnSO.-ТНоО 20 мг

870 мл

Вода из водопровода 7,0

Р

Температура 120 С (парообразование в течение 15 мин)

Примере. К 1 л пол.3ч:еиного в примере 5 питательного раствора добавл ют необходимое дл  доведени  рН до 11 количество гидроокиси калыш . Раствор нагревают 30 мин при 100 С, а затем в течение двух часов через него пропускают воздух. рН раствора довод т добавкой концентрированной серной кислоты до 5,0. Затем раствор фильтруют. Фильтрат пропускают чере. ионообменнук смолу типа 1R 120, NH, котора  адсорбирует «чпизин. Далее промьтают водой и элюируют аммиаком.

Элюированные фракции подвергают сгущению , нейтрализуют концентрированной сол ной кислотой и сушат. Получают46г

L-лизина (в виде гидрохлррида) с чистотой , превыщающей 98%.

Пример7, Выращенные в течение одних суток при 33 С в бульоне на скошенном агаре бактерии atkano Eutinouscs N9 223.15 (АТСС 31221) петлей высевают в 500--миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую 30 мл питательной среды, аналогичной по составу среде, упом н, той в примере 1, за тем исключением, что вместо п-алкана используют глюкозу. Культивирование ведут в течение четырех суток при 33 С.,

Количество накопленного в среде U -лизина составл ет 0,5 г/л ( в виде гидрохлорида).

П р и м е р 8. Выращенные па скошенном агаре бактерии NoccStUics qe,1ca (logtut-inoubo , .№223-15 (АТСС 31221), культивирование велось в течение 1 суток при температуре 33 С петлей ввод т в 500-миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую 30 мл среды, аналогичной по составу среде, использованной в примере 1, за-тем исключением что вместо И-алкана ввод т уксусную кислоту порци ми, не превышающими О, §% Далее выращивают в течение четыреху, и уток при 33 С, со встр хиванием. Количество полученного в виде гидрохлоида

L -лизина составл ет 22 г/л,

П р и м е р 9. Штамм. Nocardia с kanog-eutinousa № 223-59 (АТСС 31270), продуцирующий Ц-лизшг выращивают в питательной среде, содержащей Н-парафин, включающий 14-19 атомов углерода, в качестве основного источника углерода. Питательный жидкий бульон раздел ют на порции по 20 мл кажда . Величину рН разделенного питательного бульона регулируют, довод  до 1,5; 2,0; и 3,0, и

Claims (9)

1. осуществл ют на80°С грев при 8О С 5 мин, при 10 мин, при 10О С - 2 часа. Фильтрацию осуществл ют с использованием стекл нного фильтра ЗО-2 испи.ратора, результаты представлены в таблице. 9 Продолжение табли Формула изобретен и 1.Способ получени  L-лиаина путем культивировани  продуцирующих его мик роорганизмов рода Nocardia в услови х аэрации на питательной среде, с держащей источник углерода, азота и необходимые питательные соли с последующим выделением L-лизина, отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода, из рода NO используют штаммы Nocardia abkano e.uti поиьа № 223-59 ( АТСС 31220) и №223-15 (АТСС 31221), устойчивые к S -(2-аминоэтил ) U -цистину., .
2. 2.Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с   тем, что в качестве источни углерода используют животное масло ил жир, или рж;тительное масло. 4
3. 3.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что в качестве источника углерода используют жирную кислоту .
4. 4.Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с   тем, что в качестве источника углерода используют этиловый спирт.
5. 5.Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с   тем, что в качестве источника углерода используют глюкозу или фруктозу, или крахмал, или продукт гидролиза мелассы или крахмала.
6. 6.Способ по п. 1, отлича ю- щ и и с   тем, что в качестве источника углерода используют уксусную кислоту или лимонную кислоту.
7. 7.Способ йо п. 1, отличающий с   тем, что в качестве источника углерода используют Ц-алкан, содержащий от 14 до 19 атомов углерода или керосин, или сырую нефть, содержащую п -алкай.
8. 8.Способ поп. 1,отличающ и и с   тем, что рН питательной среды после культивировани  микроорга-i низмов довод т до 1-3 и выдерживают в течение 5-120 мин при 80-1ОО С. 9.Способ по п. 1, отличающ и и с   тем, что рН питательной среды после процесса культивировани  микроорганизмов довод т до 7-9 и выдерживают от 5 минут до 5 суток при 80-120 С. Приоритет по пунктам 17а0.75 по п. 1; 22.10.75 по пп.2-
9. 9. Источники информации, прин 1ые во внимание при экспертизе: 1. Акц. за вка Японии № 47-43О73, кл. С 12 Б 13/О6, 1972.