SU584802A3 - Способ получени -галактозидазы - Google Patents

Description

вают 4-8, предпочтительно 5-7. Температура культивировани  и период завис т от рода микроорганизма и состава культуральной среды, в случае культивировани  при перемешивании достаточно 40-60 час при

По окончании культивировани  ми .целий отдел ют фильтрованием, промывают водой и измельчают или обрабатывают автголизом. Извлеченный из мицели  энзим можно примен ть как энзимный препарат

Отфи}1ьтрованный мицелий можно добавл ть к свекловичной мелассе дл  разложени  содержащейс  в ней рафинозы . Кроме того, можно мицелий набивать в сосуд и пропускать через него свекловичную мелассу дл  разло жени  рафинозы.

Пример 1. Сахариды (ксилоза арабиноза, рамноза, глюкоза. г манноза фруктоза, галактоза, мальтоза, целлабиоза , лактоза, мелибиоза, сахароза, рафиноза, растворенный крахмал, дек1 стрин) в количестве 1% добавл ют к различным порци м культургшьной среды , содержащей компоненты (вес.%} глюкоза 1f кукурузный настой 1 г i;KKjW), 8,3; ,0 O.i;

NaCe 0,2 i CaCO, 0,3. i

Культураль%ую засевают спорами вида fasidla « е«ееха ИФО 5874 и культивируют при взбалтывании 72 час при со скоростью 140 об/мин о Затем отдел ют мицелий, промывают ег водой и растирают в ступке с морским

Углевод

Галактоза Лактоза Мелибиоза Рафиноза

песком до получени  пасты. После этого суспендируют в воде такого же объема, как культуральна  жидкость.

Далее суспензию, принимаемую за раствор энзима, испытывают на еС-галактозную активность, котора  представл ет собой энзиматическую активность мицели , полученного из 1 л культуральной среды Энзиматическую активность суспензии мицели  опреде0 л ют путем добавлени , мл суспензии и смеси 0,06 м мелибкозы и 0,5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора при рН 5,2 и реагировани  в течение 2 час при 4ОС, последующего нагре5 вани  смеск в кип щей вод ной бане дл  инактивировани  энзима, добавлени  к реакционному раствору 1 мл 1,8%-ного Ba(OH)j.eHjO и 1 мл 2%-ного ZnSO -7HjO дл удалени  протеина, центрифугировани  раствора и испытани  его верхнего сло  на содержание глюкозы. С учетом пропорциональной зависимости содержани  глюкозы, освобождаемой из мелибиозы, и концентраци  энзима от содержани  1000 мкг глюкозы суспензию заранее разбавл ют дл  попадани  в предел измерени , удовлетвор ющий этой зависимости. Количество свободной глюкозы умножёцот на число разбавлени , сС -галактозидазную активность, освобождающую 1 мкг глюкозы в указанных услови х, принимают за единицу.

Данные определени  продуцировани  -галактозидазы приведены в табл.1

Таблица 1 Единицы А.-галактозидазы

14900 53800 14340 37240

Результаты, приведенные в табл. 1, показывают, что при продуцировании -талактозидазы лактоза дает лучпшй-показатель ,

Пример 2о Спорами штаммов Absidia указанными выше, засевают различные, порции культуральной среда, .содержащей следующие компоненты, Bec,%s лактоза 1} глюкоза 1/( кукурузный настой 1 К НРО 0,3; Mg&0,THjO 0,2; j4ece Q.a и CaCOg 0,J, Культивируют согласно примеру 1

Полученные культуральные растворы испытывёиот на еС-галактозидазную и инвертазную активность мнцели . Инвертазную активность определ ют путем смешивани  1 кш суспензии мицели  с 0,5 мл 0,06 Мсахарозы и 0,5 мл фосфатного буфера при рН 5 и реагировани  при тех же услови х, как при определении вС-галактозидазной активности . Затем раствор центрифугируют дл  удалени  протеина и в верхнем слое определ ют содержание инверторного сахара по методу Сомолжи-Пельсоыа .

Инвертазную активность, продуцирующую 1 мкг сахара в указанных успови х , принимают за единицу.

Сухой вес мицели  опредэл ют после сушки при 105С количества мицели .

раствор испытывали, при этом установили , что штамм рода Absidia обладает большей et -галактоэидазной активностью и более низкой инвертазной активностью.

Дл  штамма AbeldHa cd-галактозидазна  активность, которой обладает 1 г сухого мицели , больше инвертазной активности, адл  штаммаAtepliepeWa vifjacce - инвертазна  активность больше оС -галактоэидазной.

Пример 3. ВЮл воды раствор ют (г) 120 глюкозы; 3 20 ;

в 100 мл культуральной среопределени  приведены в

Таблица

Раствор помещают в ферментатор и стерилизуют 30 мин при , затем охлаждают до 30 С и разбавл ют стерилизованной дистиллированной водой до

общего объема 12 л. В растворе культивируют штамм Jlbsidtb ИФО 5874 при перемешивании со скоростью ЗОР об/мин и пропускании воздуха 3 л/мин. Затем отбирают образцы проб

и испытывают на «d-галактозидазную активность и рн культурального раствора .

Данные испытаний приведены в табл.3

Таблица 3

Из результатов табл, 3 видно, что дл  штамма bsidia pefbexo МФО 5874 достаточно 42 час культивировани . Во окончании 42 час культивировани  вес сухого мицели , полученного из 100 мл культуральной среды, составл ет 1,36 г.

рН культурального

Врем  культивировани , мин

6

12 18 24 30 36 42 -48 54 57

Иэ данных табЛо 4 видно, ) дл  JbsicHa httafe&p&t ИФО 8082 дойтаточно 54 час культивировани , при этом вес сухого мицели , полученного ИЗ 100 мл культуральной среды, сое тавл ет 1,35 г«

Следующие далее приме{ карактёризуют применение энзима дл  разложени  рафиноэы.

Пример 5, Мелассу Стеффена) разбавл ют водой до 30 Брикса и добавкой серной кислоты рН довод т до .

В 200 г полученного раствора, содержащего 5,8 г рафЬнозы, добавл ют мицелий b&idia r eieeiM . ИФО 5874 с сухим весом 2,9 г и 174|10 ед галактозидазной активности, полученный согласно примеру 2, дают реагировать при 50°С и перем&1швании в течение 2 час 30 мин. По окончании реакции 1«1ицелий отдел ют фильтрованием и про шлвакп; водой, фильтрат и промывные воды объедин ют.

Определенный объем этой смеси испытывают хроматографией на бумаге на

Пример 4. Штамм Ab&idia hyo. Eospofo ИФО 8082 культивируют согласно примеру 3, затем определ ют зависимость между длительностью культивировани  и количеством образовавшейс  сС -галактозидазы.

Данные опытов приведены в табл.4.

Таблица 4 ЕДИНИЦЫ Л-галактозидазы

раствора

О О О

. 134

1240

4030

19360

51360

68500

69000

содержание остаточной рафинозы и сахарозы , дл  чего образцы про вл ют в растворителе, содержащем:.(ч) 6 н-бУ таНолЗ; 4 пиридина и 3 вода. Фракции рафинозы и сахарозы П1зомывают и испытывают по цистеинкарбазольному прог. цессу, при этом устанавливгивт, что 78% от первоначсшьного содержани  рафинозы разлагаетс , а содержание сахарозы увеличиваетс  на 2,41 г.

Пример 6. Мицелию Abfiidta .re/eexd ИФО 5874 с 174-10 ед оС-галактозидазной активности, полученному согласно примеру 5, дают реагировать

с 200 г мелассы, разбавленной ДО Брикса и приготовленной согласно примеру 5 „ После реакции мицелий проксывают водой и добавл ют к новой порции мелассы. Таким образом мицелий используют дл  п ти обработок. Полученные разложенные растворы испытывгиот на содержание остаточной рафинозы и на содержание сахарозы.

Данные испытаний приведены в

табл. 5.

Пример 7. Мелассу Стеффена разбавл ют до Брикса и Довод т серной кислотой рН до 5,2.

В 200 г этого раствора, содержащего 9,66 г рафинозы, добавл ют мицелий wieexa ИФО 5874 с сухим весом 6,5 г и 2898-Ю ед .-галактозидазной активности, полученный согласно примеру 2, По окончании реакции определ ют степень разложени  рафинозы и увеличение содержани  сахарозы , которые равны соответственно 56,2% и 3,03 г.

Пример 8.В 100 мл мелассы, содержащей 3.87 г рафинозы и разбавленной до 50 Брикса, с рН 5,2 добавл ют мицелий bsJd-ia пеЛехд ИФО 5874

Из данных табл. 6 следует, что в случае применени  двух родов мицели  с одинаковой -галактозидазной активностью дл  разложени  рафинозы количество компонента, выдел емого мицел.ием, меньше в случае Bbsidia t eftexc( . ИФО 5874.

Предлагаемый способ получени  л-галактозидазы по сравнению с известТаблица 5

с сухим весом 1,74 г и 775-10 ед tf. -галактозидазной активности при в течение Ю час.

По окончании разложени  компонент, выделенный мицелием, разбавл ют водой 1:1000 и испытывают при длине волн 260 и 280 нм на оптическую плотность.

В таком же растйоре мелассы при аналогичных услови х подвергают реакции мицелий Atenfteretta vinaccd сухим весом 3,730 г и 77410 ед rtl-галактозидазной активности. Разложенный раствор испытывают на оптическую плотность при 260 и 280 нм. Контрольным образцов служит меласса с неизменными свойствами.

Данные испытаний приведены в табл.

Таблица 6

ным решением той же задачи обеспечивает получение энзимного препарата с достаточно высокой .-галактозидазной активностью и пониженной инвертазной активностью на единицу веса энзимного препарата дл  разложени  рафинозы, содержащейс  в свеклови чной мелассе/ на гсшактозу и сахарозу, и

увеличение выхода сахарозы.

11

Claims (1)

1. Патен-г США 3647625, кл. 195-11, 07.03.72.