SU1747488A1

SU1747488A1 - Способ получени простатической кислой фосфатазы

Info

Publication number: SU1747488A1
Application number: SU904777246A
Authority: SU
Inventors: Альберт Валерьянович Соколов; Клавдия Макеевна Ледян; Лиана Петровна Пашинцева; Вячеслав Владимирович Светличкин; Леонид Петрович Евсеев
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения
Priority date: 1990-01-05
Filing date: 1990-01-05
Publication date: 1992-07-15

Abstract

Использование: диагностика рака простаты , ранн дифференциальна диагностика с использованием иммуноферментного анализа . Сущность изобретени : фракционирование спермоплазмы на фенилсефарозе и хроматографическа очистка фракций. Фракцию с кислой фосфатазой очищают методами аффинной хроматографии и гельп- роникающей хроматографией (ГПХ). Фракцию с простатическим специфическим антигеном очищают методом ГПХ. Из 20 мл спермоплазмы получают 2 мг кислой фосфа- тазы с удельной активностью 800 ед/мг и 1,45 мг простатического специфического антигена . 2 табл.

Description

Изобретение относитс к биологии и медицине и может быть использовано преимущественно дл диагностики рака простаты , а также дл дифференциальной диагностики других заболеваний с использованием иммуноферментного анализа на ранних стади х заболевани .

Известно получение простатической кислой фосфатазы из ткани простаты, включающее гомогенизирование ткани с твином 80, центрифугирование, осаждение сульфатом аммони 30% насыщени , затем повторное осаждение центрифугированием, растворение осадка дистиллированной водой , длительный диализ (16 ч) и последующую очистку хроматографией и изоэлектрофокусирование.

Однако конечный продукт получаетс с низкой удельной активностью. Процесс получени препарата длителен из-за многократного переосаждени , центрифугировани и длительного диализа.

Известен также способ получени простатической кислой фосфатазы (далее по тексту ПКФ) из э кул та человека.

Наиболее близким к предлагаемому вл етс способ получени простатической кислой фосфатазы, включающий выделение из э кул та спермоплазмы центрифугированием , экстракцию суммарной белковой фракции и ее хроматографическую очистку на фенилсефарозе GL-4B с элюцией снижающимс градиентом сульфата аммоний от 1 до 0,1 М, на сефадексе G-200 и на целлюлозе ДЕ-52 с элюцией возрастающим градиентом хлористого натри от 0,05 до 1 М.

Недостатками этого способа вл ютс недостаточна экспрессность получени препарата из-за многостадийной хроматог- рафической очистки, большой расход сырь и реагентов. Кроме того, из одной пробы

vj

Jb

ч|

Ш 00

такого дефицитного сырь получают только один инградиент - ПКФ.

Целью изобретени вл етс расширение технических возможностей способа путем одновременного выделени специфического простатического антитела.

Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу, включающему получение э кул та, выделение из него спермоплазмы, фракционирование на фенилсефарозе GL- 4В и последующую хроматографическую очистку полученных фракций, после фракционировани на фенилсефарозе выдел ют две фракции, содержащие простатическую кислую фосфатазу и простатический антиген , соответственно, и подвергают фракцию , содержащую простатическую кислую фосфатазу хроматографической очистке на голубой сефарозе в 0,01 М трис-HCt буфере, рН 7,4 и на сефадексе G-150, а фракцию, содержащую простатический специфический антиген, подвергают хроматографической очистке последовательно на сефадексах G-150 и G-100.

Способ выполн ют следующим образом .

Получают э кул т человека, из которого затем получают спермоплазму путем центрифугировани э кул та. Затем к спермоп- лазме добавл ют сульфат аммони (ЬЖфЗСМ) до концентрации 1 М (2,7 г) и провод т гидрофобную хроматографию на колонке с фенилсефарозой GL-4B. Элюцию белков провод т ступенчатым градиентом снижающихс концентраций сульфата аммони . Затем фракции, элюированные 0,4 М (NN4)2804 и содержащие ПКФ-активность, сливают вместе и концентрируют ультрафильтрацией . Фракции, элюированные 0,01 М трис-HCI буфером и содержащие ПСА-ак- тивность, объедин ют и концентрируют ультрафильтрацией . Затем фракцию, содержащую ПКФ-активность, диализуют против 0,01 М трис-буфера и внос т в колонку с голубой сефарозхой, уравновешенную тем же буфером. ПКФ-активность обнаруживалась вофракци х, не сорбировавшихс на обменнике. Эти фракции объедин ют и концентрируют. Сконцентрированный материал подвергают гель-фильтрации на колонке с сефадексомС-150, уравновешенной 0,15 м3 раствором NaCl в 0,01 М трис-НС буфере.

Дл дальнейшей очистки ПСА сконцентрированный материал нанос т на колонку с сефадексом G-150, подвергают гель-фильтрации на колонке с сефадексом, уравновешенной 0,01 М трис-HCI буфером. Фракции, содержащие ПСА-активность объедин ют, концентрируют и повторно подвергают

гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-100.

Пример. Берут 20 мл э кул та. Этот объем центрифугируют 15 мин при 1000 g

дл отделени спермоплазмы от клеточных элементов э кул та. Затем к полученной спермоплазме добавл ют сульфат аммони до концентрации 1 М (2,7 г) и провод т гидрофобную хроматографию на колонке с фе0 нилсефарозой GL-4B (размер колонки 30 100 мм), уравновешенную 1 М (NN4)2804 в 0,01 М трис-НС буфере (рН 7,4) Элюцию белков провод т ступенчатым градиентом снижающихс концентраций сульфата ам5 мони в следующем пор дке: 1 М - 150 мл; 0,8 М - 100 мл; 0,5 М - 100 мл, 0,4 М - 300 мл, далее 0,01 М трис-HCI буфером (рН 7,4). Скорость элюции - 100 мл/ч, фракции по 15 мл. В этой и последующих хроматографиче0 ских процедурах полученные фракции анализируют в иммунопреципитационном анализе со специфическим тест-системами дл ПКФ и ПСА. Фракции, элюированные 0,4 М (NH/j)2S04, содержащие ПКФ-актив5 ность-были слиты вместе и сконцентрированы ультрафильтрацией на фильтре УМ-10 (Amicon) до объема 12 мл, Фракции, элюированные 0,01 М трис-HCI буфером и содержащие ПСА -активность, объедин ют и

0 концентрируют, как указано выше, до объема 12 мл,

Сконцентрированные материалы подвергают анализу на содержание белка по методу Лоури и полуколичественной оценке

5 на содержание инградиентов (ПКФ и ПСА) в преципитзционных тест-системах с чувствительностью 3 мкг/мл. Кроме того, на конечном этапе была определена ферментативна активность препарата

0 ПКФ (данные приведены в таблице).

Таким образом, получают две фракции, одна из которых содержит ПКФ-активность, а друга - ПСА-активность. Далее берут одну из фракций, например содержащую

5 ПКФ-активность, диализуют в течение ночи против 0.01 М трис-буфера (рН 7,4) Отдиа- лмзованный материал внос т в колонку с голубой сефарозой (размеры колонки 20 160 мм), уравновешенную тем же буфером. Э л ю0 цию провод т 0,01 М трис-НС буфером (рН 7,4). В этих услови х ПКФ не сорбировали на колонке. Скорость колонки 20 мл/ч, фракции по 15 мл.

ПКФ-активность обнаруживалась во

5 фракци х, не сорбировавшихс на обменнике . Эти фракции объедин ют и концентрируют до объема 12 мл, как описано выше, Сконцентрированный материал подвергают гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-150, уравновешенной 0,15 М

раствором NaCI в 0,01 М трис-HCI буфере (рН 7,4)(размер колонки 25 1100 мм). Скорость элюции составл ла 15 мл/ч, фракции по 15 мл. Фракции, содержащие ПКФ, объедин ют и концентрируют вышеописанным методом ,

При электрофорезе (ЭФ) в полиакрила- мидном геле (ППАГ) в присутствии додецил- сульфата натри вы вл лась одна белкова полоса, соответствующа по молекул рной массе субъединице ПКФ, что свидетельствует о чистке полученного препарата.

Дл дальнейшей очистки фракции, содержащей ПСА-активность, сконцентрированной после гидрофобной хроматографии, материал нанос т на колонку с сефадексом G-150 (размер колонки 20x1100 мм), уравновешенную 0,01 М трис-HCI буфером (рН 7,4), содержащим 0,15 М NaCI и подвергают гель-фильтрации. Элюцию провод т со скоростью 15 мл/ч, собираютфракции по 15 мл, Фракции, содержащие ПСА, объедин ют, концентрируют до объема 12 мл и повторно подвергают гель-фильтрации на колонке се- фадекса G-100. При электрофорезе этого материала в полиакриламидном геле в присутствии SDS вы вл лась одна белкова полоса , соответствующа молекул рной массе 33000 дильтон, что свидетельствует о чистоте полученного препарата ПСА. Аналогичным образом фракции с ПСА-активностью объедин юти концентрируют как обычно до объема МО мл.

Результаты очистки ПКФ и ПСА приведены в табл.1.

Активность кислой фосфатазы на каждой стадии и удельна активность кислой фосфатазы в исходном сырье и после каждой стадии очистки приведены в табл.2.

Таким образом, в результате очистки удельна активность ПКФ увеличиваетс до 800 Е/мг.

Способ определени содержани специфического антигена вл етс полуколичественным с чувствительностью 10 мкг/мл и определение проводитс по преципитации с соответствующей антисывороткой (по сравнению с контрольной тест-системой антиген-антитело различных разведений).

Использование изобретени позвол ет

из одной пробы сырь получить сразу два инградиента ПКФ и ПСА, что значительно сокращает расход сырь , реактивов, а это делает способ очень экономичным, При этом сокращаетс врем на получение инградиентов . Сначала идет очистка всей пробы , а после разделени на две фракции, их очистку можно вести параллельно, кроме того, стадии очистки другие и количество их сокращено. Способ проще по сравнению с

известными и эффективнее.

Claims

Формула изобретени Способ получени простатической кислой фосфатазы, включающий получение э кул та, выделение из него спермоплазмы,

фракционирование на фенилсефарозе и последующую хроматографическую очистку полученных фракций, отличающийс тем, что, с целью расширени технологических возможностей способа путем одновременного выделени специфического простатического антигена, после фракционировани на фенилсефарозе выдел ют две фракции, содержащие простатическую кислую фосфатазу и простатический специфический антиген соответственно, и подвергают фракцию, содержащую фосфатазу , хроматографической очистке на голубой сефарозе в 0,01 М трис-HCI буфере, рН 7,4, и на сефадексе G-150, а фракцию, содержащую антиген, подвергают хроматографи- чёской очистке последовательно на сефадексах G-150 и G-100.

Таблица 1

Продолжение табл. 1

Таблица 2