SU1675776A1

SU1675776A1 - Способ определени ингибиторов трипсина в сыворотке крови

Info

Publication number: SU1675776A1
Application number: SU894682840A
Authority: SU
Inventors: Мария Васильевна Кинах; Екатерина Андреевна Захария; Ярослав Николаевич Романишин; Богдан Витальевич Западнюк
Original assignee: Львовский государственный медицинский институт
Priority date: 1989-04-24
Filing date: 1989-04-24
Publication date: 1991-09-07

Abstract

Способ определени ингибиторов трипсина в сыворотке кроаи относитс к медицине , а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть исполь зовано дл диагностики острых и хронических воспалительных процессов, обусловленных недостаточностью ингибиторов трипсина в сыворотке крови. Цель - повышение точности . Цель достигаетс тем, что к 0,5 мл сыворотки крови прибавл ют 6,5 мл трипсина

Description

Изобретение относитс к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике , и может быть использовано дл диагностики острых и хронических воспалительных процессов, обусловленных недостаточностью ингибиторов трипсина в сыворотке крови.

Цель изобретени - повышение точности способа.

Поставленна цель достигаетс тем, что в качестве субстрата трипсина используют белок азофибрин, продукты расщеплени которого образуют в щелочной среде раствор красного цвета, по интенсивности соответствующий протеолитической. активности трипсина, затем добавл ют исследуемую сыворотку и по разнице (интенсивности окрашивани ) устанавливают уровень ингибиторов трипсина.

Способ осуществл ют следующим образом .

Используют следующие материалы и реактивы: плазму или сыворотку крови, разбавленную в 50 раз трис-буфером; азофибрин; трис-буфер (рН-8,1. 0,05 М): в мерной колбе на 1000мл раствор ют 1,225/тригид- роксиметиламинометана: в 500 мл дистиллированной11 воды, прибавл ют 7.5 мл 10%-ного раствора CaCla и довод т дистиллированной водой до метки, рН 8,1 довод т 1 н. раствором HCi; 1 н. раствор HCI готов т из фиксанала; раствор кристаллического трипсина: 5 мг препарата раствор ют в 5 мл трис-буфера (матричный раствор), стабилен при +4°С в течение 5-6 дней, перед исследованием готов т рабочий раствор разбавлением матричного трис-буфера в 20 раз

I

VI ч| Os

(1 мл содержит 50 мкг трипсина); 10 н, раствор гидроксидэ натри .

К 0,5 мл разведенной сыворотки прибавл ют 0,5 мл рабочего раствора трипсина (25 мкг). Дл образовани комплекса трипсин-ингибитор смесь выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре. Добавл ют в пробирку 5 мг сухого азофиб- рина, смешивают и став т в термостат на 1 ч при37°С, Вынимают из термостата, добавл ют 3 мл дистиллированной воды, размешивают и центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Отбирают 3 мл надосадочной жидкости и перенос т в другую пробирку, прибавл ют 0,05 мл 10 н.гидроксида натри , колориметрируют на ФЭКе при длине волны 500 нм в кювете 5 мм против воды.

П р и м е р. Из каждой пробирки отбирают по 0,5 мл раствора трипсина, прибавл ют по 0,5 мл изотонического раствора хлорида натри и по 5 мг азофибрина, перемешивают , став т в термостат при 37°С на 1 ч, затем прибавл ют 3 мл дистиллированной воды, перемешивают, центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Отбирают 3 мл надосадочной жидкости, прибавл ют 0,05 мл 10 н.раствора гидроксида натри w колориметрируют на ФЭКе при длине волны 500 нм против дистиллированной воды в кювете 5 мм.

Оптическа плотность пробы, к которой трипсин реагировал в присутствии сыворотки крови, 0,16, По калибровочному графику наход т, что это соответствует 5,48 мкг трипсина. Таким образом, концентраци трипсина, св занна с ингибитором, составл ет 25 мкг - 5,48 мкг 19,52 мкг.

Расчет активности ингибиторов трипсина в исследуемой сыворотке производ т по калибровочному графику.

Калибровочный раствор трипсина при- веден в табл.1.

Содержание ингибиторов рассчитывают по формуле:

У -

19,5 50 1000 0,5 24000

81,33 мкмоль/л.

где 1,52 - количество св занного трипсина (1 моль трипсина св зываетс с 1 моль ингибитора ); 50 - разведение сыворотки;

24000 - молекул рна масса трипсина;

0,5 - количество разведенной сыворотки в пробе.

Данные воспроизводимости предлагае- мого метода исследовани ингибиторов трипсина по исследованию сыворотки крови здоровых лиц приведены в табл.2.

Сравнительные данные содержани ингибиторов трипсина у 32 больных острым панкреатитом, полученные предлагаемым методом и известным, приведены в табл.3.

Claims

Формула изобретени

Способ определени ингибиторов трипсина в сыворотке крови путем добавлени субстрата в исследуемую сыворотку, куда предварительно был добавлен трипсин, с последующим измерением оптической плотности, отличающийс тем. что, с целью повышени точности, в качестве суб- страта используют азофибрин, а оптическую плотность измер ют в щелочной среде.

Таблица 1

40

Таблица 2

Таблица 3