SU918305A1 - Способ определени протеолитической активности ферментов - Google Patents

Description

.. I. . Изобретение о-гаоситс  к биохимии, а именно к способам определени  активное ти ферментоэ,.:; Известен способ определени протеопи тической активности (ПА) ферментов из тем изменени  к(1ичества прогидропизо ваннык Пептидных св зей, включающий подготовку пробы, инкубацию субстрата с ферментом пробы,-обработку анализируем мой пробы реагентом и спектрофотометри рованкв1. . Недостатком этого способа  вл етс  : низка  скцэость образовани  окрашенно гО продукта взаимодействи-  тринитробен зопсульфокислбты с аминогруапамв гвдролизата . Вследствие этого, продолжи тельность определени  аротеопитической активности составл ет 1-2 ч. Цель -изобретени  - сокращение прсьдолжительности определени . Поставленна  цель достигаетс  тем, что соглаою способу определени  проте олитйчёской активности ферменте путем измерени  количества прогидролизованньк Пептидных св зей, включающий подготовку пробы; обработку анализируемой пробы реагентом и спектрофОтометрирование, в качестве реагента используют о -фталё-, вьй реагент и анализируемую пробу обрабатьюаютреагентом при рН 7,5-1О. В качестве О-фтаЛевого реагента используют раствф о-фталевого альдегида в концентрации 0,04-0,12 мг/мл и меркаптоэтшола в концентрации 0,2 0,2 мг/мл в боратнОм буфере. П р и м е р . Приготовление о-фталевого реагента. В мерную колбу емкостью 20О мл приливают 2 мл этанопьного растворе. о-фталевого альдегида ксшцентрации 1О мг/мл и 1 мл этанольного раствора меркаптоэтанопа концентрации 5 мл/100 swi и довод т до метки 0,1 М ёорётньлм буфером рН 9,3. Определение активности нейтральной протеазы из протосубтилин ГЗХ. В 50 мл 0,1 М универсального буфера рН 7,2 раствор ют 1 г протосубтилинаГЗХ в готов т разведение 5 мл/ 59 мл. Концентраци  ферментного раст:Вора 2 мг/мл. 1,5 г белкового субстрата раствсч5 ют в 2ОО мл ОД М универсального ёуфера рН 7,2. Белковьй5 субстрат готов т по способу Г. И. Дениса н др. ts 3 . В 2 пробирки наливают по 1 мл попученного 0,75%-ного раствс ра субстрата, термостатируют при 5 мин. В одну пробирку приливают 1 мл

ферментнот-о раствора, а в другую - 1 Цп ннактйвдгЬванного кип чением ферментного раетйорап(контроль) и инкубируют фи ЗОс 10 мин,, после чего вьшержива ют обе пробирки в кип щей вод ной бане 5 Д мин. В пробирки припивают по Ю мл о-фталевого реагента, взбалтывают и В1 ьдерживают при 30с ,15 мин, после чего определ ют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при 340 нм 30 против контрольной пробы (с инактнвирован- ным ферментом).

Протеолитическую активность в ед/г вычисл ют по формуле:

ответствующа  1 мм глиаина), в данном случае ГЭ-2,8; УИ - количество ферментеого препарата , вз того на протеопвз в . мг;

/fOOO - переводной коэффициент попучев ных единад на 1 г ферментного препарата.

Оптическа  плотность 0,440. Протеолитическа  активность 94 ед/г.

За единицу активности принимаетс  такое количество фермента, которое за 1 мин при образует 1 .ммоль свободньк . аминогрупп..

I

При использхюании предлагаемого способа определени  протеолитвческЫ) активности продолжительность определени  сокращаетс  от 1-2 ч до 35 мин. Это создает экономию рабочего времени.

Линейный характер зависимости оптической плотности от концентрации фермен та сохран етс  .в широком интервале Таким образом, разброс результатов в параллельных оаределени х ПА соответ . ствует среднему значению коэффициента вариации 1,4% дл  метода, основанного на применении о-фталевого альдегида в .1,6% дл  метода. основанаого на применении 2,4,6 1триниаро6ензолсульфокисло1ГЫ Точность первого метода несколько выше. 1 ормула изобретени  1. Способ определени  протерлитичеокой активности ферментов путем измерени  количества прогидролизованных пептидных св зей, включаЕОщий подготовку (фобы, инкубацию субстрата с ферментом пробы, обработку анализируемой ,пробы реагентом и спект)офотометрирование. отличающийс  тем, что, с целью сокращени  продолжительности определени , в качестве реагента исаопьзуют о -фталевый реагент и аналвзируе 4ую .пробу обрабатывают реагентом при рв 7,5-10. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю - щ и и с   тем, что в качестве о-фталево го реагента используют раствор о «фтале г вого альдегида в квнцентравии О,04Ю ,12 мг/мл и мерка тоэтанола в концен- 1рации 0,2 мг/мл в боратеом буфере. Источники информации, прин тые во внимание аре экспертизе l.X&ioe.., 244(4), 1969, 789793 . 2. Авторское свидетельство СССР ао за вке № 2653395, от 15.О8.78.

Claims (2)

1. Формула изобретения

   1, Способ определения' протеолитичеокой активности ферментов путем измерения количества прогидропизованных пеп-- 15 тидных связей, включающий подготовку пробы, инкубацию субстрата с ферментом пробы, обработку анализируемой ,пробы реагентом и спектрофотометрирование, отличающийся тем, что, с целью сокращения продолжительности определения, в качестве реагента используют о-фталевый реагент и анализируемую .пробу обрабатывают реагентом при рн 7,5-10.
2. 2. Способ по п. ^отличающийся тем, что в качестве о-фтапево го реагента используют раствор о-фталэвого альдегида в концентрации 0,04Ό.12 мг/мл и меркаптоэтанола в концентрации 0,2 мг/мл в боратном буфере..