SU1622395A1 - Вектор pPS-4-Neo дл введени и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к генетической инженерии . Целью изобретени   вл етс  конструирование вектора, позвол ющего достигнуть высоких уровней экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих , а также обеспечивающего простые способы клонировани  генов в состав вектора. Вектор pPS-4-neo размером 10 т.п.о. и емкостью до 7 т.п.о. имеет уникальные сайты рестрикции Sail, Hindlll, BamHI и EcoRI дл  клонировани  чужеродных генов под контроль промотора ретровируса, а клонирование генов с собственным промотором осуществл етс  по сайту рестрикции Clal. Вектор обеспечивает устойчивость клеток млекопитаюпщх к гене- тицину и метатрексату, а клеток Е. со- li - к канамицину и ампициллину. с 9 С с

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к генетической инженерии, представл ет интерес дл  различного рода научных исследований, в частности дл  изучени  разного рода факторов дифференци- ровки и пролиферации, а также дл  получени  линий клеток - продуцентов практически ценных белков.

Цель изобретени  - конструирование вектора, позвол ющего достигнуть высоких уровней экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитаюгсих, a rak- же обеспечивающего простые и удобные способы клонировани  генов в состав вектора.

R вектор pPS-neo, содерж гцш синтетический полилинкер, ввод т ген DHFR, наход щийс  под контропом раннего промотора вирус  SV40.

Ретровирусный вектор pPS-4-neo характеризуетс  слелующимн свойствами . Размер вектора около 10 т.п.о., емкость встраиваемой ДНК - до 7 т.п.о.

Вектор состоит из: линейной формы векторной плазмнды pSP64, у которой полилннкер заменен единичным сайтом EcoRI, плазмида содержит ген устойчивости к ампициллину, двух ментов провируса лейкоза мышей Моло- ни, включающих и правый LTP, область ( , ответственную за упаковку полных транскрнптов ретровирус- ной конструкции в вирусоподобные частицы, а также прилегающие к I.TR участки клсточноГг ДНК, полилннкера, содержащего сайты рестрикции (Sail, Hindlll, Sail, ВагоНI, EcoRI), no которым предполагаетс  клонирование чужеродим1- генов, двух участков наО

«

чала репликации вируса SV40, содер- жащих также ранний промотор вируса, гена пео, определ ющего устойчивость клеток млекопитающих к гене- тицину и E.coli - к канамицину, сигнал дл  сплайсинга из ранней области вируса SV40, гена дигидрофолйтре- дуктазы,мыши, обеспечивающего устойчивость к метатрексату, уникальные сайты рестрикции Hindlll, BamHI, EcoRI, NotI, Clal, встраивание чужеродных генов под контроль промотора ретровируса производитс  по сайтам Sail, Hindlll, BamHI, EcoRI, встраивание чужеродных генов, наход щихс  под контролем собственных промоторов, производитс  по сайту Clal, левее гена пео.

В ДНК вектора pPS-3-neo ввод т специально сконструированный блок, состо щий из гена PHFR, наход щегос  под контролем раннего промотора SV40. Конструкци  блока состоит в следующем. Ген DHFR встраивают в плазмиду pSVp.pt вместо гена Opt, сай PvuII слева от промотора замен ют на сайт EcoRI, а сайт Findlll справа от промотора - на сайт- NotI. Зйтем готовый блок встраивают в вектор pPS-3-neo.

Введение чужеродных генов в клетки млекопитающих с помощью вектора pXS-4-neo осуществл етс  в два этапа

1 . ДНК вектора pPS-4-neo с вст.ро- енным в него геном ввод т методом ДНК-трансфекции в клетки, экспрес- сирующие структурные белки вируса лекоза мышей (клетки (f 2 или подобные)

2. После селекции клеток, экспрес снрующих ретровирусный конструкт, на среде с генетицином () производ т сбор вирусоподобных частиц из среды культивировани  клеток и зар жают клетки, в которых предпола- гаетс  проводить экспрессию чужеродного гена. Дл  повышени  уровн  экспрессии гена в клетках используетс  амплификаци  вирусного материала в клетке на среде с метатрексатом.

Наработка ДНК вектора pPS-j -neo производитс  в клетках E.coli.

Пример 1. Конструирование

вектора pPS-A-neo.

А. Получение блока, содержащего ген DHFR мыши,под контролем раннего промотора SVAO.

Клонирование гена DHFR в плазми- де pSCgpt. Плазмиду pSVppt расщрпл ют EcoRI и Hindlll, меньший фрагмент , содержащий промотор SV40, ген устойчивости к ампициллину и oripBR 322 выдел ют электрофорезом в легко- плавкой агарозе (LMPA) и лигируют с большим фрагментом плазмиды MMTVDKFP расщепленной EcoRI и Hindlll, обработанной фосфатазой и очищенной электрофорезом в LMPA. Ff результате получают плазмиду р1, содержащую ген DHFR под контролем раннего промотора SV40.

Получение плазмиды р2. Плазмиду р1 расщепл ют PvuII, дефосфорили- руют с помощью фосфатазы из тимуса теленка (CIP), очищают-электрофорезом в LKPA и лигируют синтетическим 8-членным EcoRI линкером. В результате получают плазмиду рЗ, содержащую слева от промотора SVAO сайт EcoRI.

Получение плаэмиды рЗ. Плазмиду р2 расщепл ют Hindlll, обрабатывают CIP, очищают электрофорезом в ТЛ1РА и лигируют с синтетическим NotI линкером . В результате получают плазмид рЗ, содержащую справа от промотора SV40 сайт NotI.

Б. Получение вектора pPSA.

Удаление двух EcoRI сайтов на концах сегмента pSP64 вектора pPS -T-neo плазмиду pPS-1-neo перевод т в линейную форму частичным гидролизом EcoRI обрабатывают фрагментом Кленова ДНК- полимеразы I в присутствии четырех DNTP и лигируют. Полученную плазмиду pPS-1,5-neo, содержащую два EcoRI сайта - в полилинкере и слева от LTR перевод т в линейную форму частичным гидролизом EcoRI, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I в присутствии четырех dNTR и лигируют. Полученна  плазмида pPS-2-neo.содержит уникальный EcoRI сайт, расположенный в области синтетического полилинкера .

Удаление BamHI сайты справа от гена пео в плазмиде pPS-2-neo. Плазмиду pPS-2-neo перевод т в линейную форму частичным гидролизом BamHI, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I в присутствии четырех dNTP и лигируют. Полученна  плазмида pPS-3-neo содержит уникальный BamHI сайт в области синтетического полилинкера.

Клонирование блока ранний промотор SV40 - ген DHFR в плазмипе pPS-3-neo. Пллзмиду рЗ расщепл ют

16

EcoRI и Bglll, вы вл ют меньший 1,6 т.п.н. фрагмент электрофорезом в LMPA и клонируют его в плаэ- миде pPS3, расщепленной EcoRI и Bglll и очищенной электрофорезом в LMPA. В результате получают плазми- ДУ Р.

Получение вектора pPS-4-neo. Плаз- миду р4 расщепл ют RplTI, достраивают липкие концы фрагментом Кле- нова ДНК-полимеразы I в присутствии четырех dNTP, обрабатывают Hindlll, вьщел ют меньший фрагмент 1,6 т.п.н. электрофорезом в I.MPA и клонируют его в плаэмиде pPS-3-neo, обработанной последовательно FcoRI Лрагментов Кленова ДНК-полнмеразы I в присутствии четырех dNTP, HindTII и CIP и очищенной электрофорезом в I.MFA. По- пученна  плазмидл  вл етс  искомым вектором pPS-4-neo.

Пример 2. Экспресси  гена Г-интерферона человека в клетках RatT.

С помощью вектора pPS-4-neo достигают эффективную экспрессию гена У-интерферона человека в клетках PatI, составл ютс  500 ед./мл в сутки. Увеличение уровн  экспрессии генол, клонированных в векторе pPS-4-neo, достигаетс  за счет увеличени  дозы гена в клетках при их культивировании на среде с метатрексатом.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Вектор pPS-4-neo дл  введени  и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих размеров 10 т.п.о. и мол.м. 6,6 Md и содержащий плазмидную ДНК pPS-1-neo размером 9,6 т.п.о. и мол.м. 6,34 Md, в которой удалены оба участка узнавани  рестрикционной эндонуклеазы. EcoRI в составе EcoRI - EcoRI фраг956

   мента плазмилы pSP 64 и удален участок узнавани  рагтрикциопной эндо- нуклеаэы RamHI, наход щийс  на рассто нии 0,3 т.п.о. от участка узнавани  дл  растрикционной эндонукле- азы Clal в составе ретровирусной части pPS-I-neo, HindTII - PvuII - фрагмент плазмидной ДНК pSVgpt размером 0,4 т.п.о. и мол.м, 0,26 Md с участком начала репликации (Ori) с промотором ранней области вируса SV40, в котором участок узнавани  дл  растриктазы PvuTI заменен на

   участок узнавани  дл  рестриктазы EcoRI, а участок узнавани  дл  рестриктазы Hindlll заменен на участок узнавани  дл  рестриктазы NotI, HindlTI - Bglll - фрагмент плазмидной ДНК pMMTVDHFR размером 1, 2 т.п.о. и мол.м. 0,79 МН с геном дигидрофол- атредуктазы (IWFR) , в котором участок узнавани  дл  рестриктазы HindlTI заменен на NotI и удален

   участок узнавани  дл  рестриктазы Bglll с помощью достраивани  фрагментом Кленова ДНК полимеразы I: ге- 1нетические маркеры; пео - определ ю- 1 щии устойчивость клеток млекопитаюших к генотицпну (0418) и Escheri- chia coli - к канамнцнну, DFRT - обеспечивающий устойчивость к мета- трексату, Арг - обеспечиваюпщй устойчивость к ампициллину, уникальные

   сайты рестрикций: Hindlll, BamHI.,

   EcoRI, Bp.lII, Clal, NotT, емкость вектора - до 7 т,п.о. встраивание чужеродных гонов под контроль промотора ретровирусл по сайтам Sail, Hindlll,

   BamHI и EcoRI, а встраивание чужеродных генов с собственным промотором - по сайту Clal, спектр хоз ев - клетки млекопитающих, например фибробла- сты мыши (NIH3T3, Balb/c) фибробласты крысы (RatI и Rat2), клетки обезъ ны - Cosl.