SU1622396A1 - Вектор pPS-5-Neo дл введени и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к генетической инженерии . Целью изобретени   вл етс  конструирование вектора, позвол ющего достигнуть высоких уровней экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих , а также обеспечивающего простые способы клонировани  генов в состав вектора. Вектор pPS-5-neo размером 10,6 т.п.о., емкостью до 7,0 т.п.о., имеет уникальные спиты рестрикции HindllI, Sail, BamHI и EcoRI дл  клонировани  чужеродных гонов под контроль промотора питомоз тловируса (CMV) а клонирование генов с собственным промотором осу цествл стс  по сайту Clal. Вектор обеспечивает устойчивость клеток млекопитающих к генети- цину и метатрексату, а клеток Е.со- li - к канамнцниу и ампициллину. О с

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к генетической инженерии , представл ет интерес дл  различного рода научных исследований, в частности дл  изучени  разного рода факторов дифференцировки и пролиферации , а также дл  получени  линий клеток - продуцентов практически ценных белков.

Цель изобретени  - конструирование вектора, позвол ющего достигнуть высоких уровней экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих, а также обеспечивающего простые и удобные способы введени  генов в состав вектора .

Вектор на,основе ретровирусного вектора pPS-4-neo, обеспечивающий введение и экспрессию чужеродных генов в клетках млекопитающих. Кроме

того, общим свойством всех прототип- ных векторов  вл етс  отсутствие полилинкерной области.

В состав лектора pPS-5-neo ввод т сильный конститутивный промотор цнто- мегаловируса и инактивации одного из двух сайтов Sail в полнлинксрпой области вектора.

Ретровирусный вектор pPR-5-neo характеризуетс  следую, щми свойствами . Размер лектора околг 10,г т.п.о. фатазой встраиваемо, ДНК около 7 т.п.о. Ректор состоит из: линейной формы векторной платмиды pSP64, у которой по- лилинкер заменен единичным сайтом EcoRI, плазмтма содержит ген устойчивости к ампициллину, двух фрагментов провирусд лейкоза мышей Молони, включающих левый и правый I.TR, область у , ответственную за упаковку

Q

к ts

С СЈ О

полных транскриптов ретровирусной конструкции в вирусоподобные частицы, а также прилегающие к Г.ТК участки клеточной ДНК, двух участков начала репликации вируса SV40, содержащих также ранний промотор вируса; гена пео, определ ющего устойчивость клеток млекопитающих к генетицину и E.coli - к канамицину; сигнала дл  сплайсинга из ранней области вируса SV40, гена дигидрофолатредуктазы мыши, обеспечивающего устойчивость к метатрекса- ту,сильного конститутивного промотора цитомегалловируса; полинкера, содер- жащего уникальные сайты рестрикции Sail, Hindlll, BamHI и EcoRI, по которым производитс  встраивание чужеродных генов под контроль промотора цитомегалловируса.

Конструирование ретровирусного вектора pPS-5-neo приницпиально состоит в следующем. В вектор pPS-4-neo ввод т сильный конститутивный промотор цитомегалловируса с одновремен- ной инактивацией одного из двух сайтов Sail в полилинкерной области.

Введение чужеродных генов в клетки млекопитающих с помощью вектора ,pPS-5-neo осуществл ют в два этапа.

1 . ДНК вектора pPS-5-neo с встроенным в него геном ввод т методом ДНК-трансфекции в клетки, экспресси- рующие структурные болки вируса лейкоза мышей (клетки ф 2 или подобные).

2. После селекции клеток, экспрес- сирующих ретровнрусный конструкт, на среде с генетицином производ т сбор вирусоподобных частиц из среды культивировани  клеток и заражают клет- ки, в которых предполагаетс  проводить экспрессию чужеродного гена. Дл  повышени  уровн  экспрессии гена в клетках используетс  амплификаци  вирусного материала в клетке на ере- де с м татрексатом.

Наработка ДНК вектора pPS-5-neo производитс  в клетках E.coli.

Пример 1 «Конструирование ретро- вирусного вектора pPS-5-neo ДНК вектора pPS-4-neo подвергают неполному гидролизу Sail так,чтобы расщепилс  только один из двух присутствующих в плазмиде сайтов, липкие концы достраивают фраментом Кпенова ДНК-полимеразы I в присутствии всех четырех dNTP, расщепл ют Hrndlll, дефосфорилируют фос фатазой из тимуса теленка, очищают электрофорезом в легкоплавкой  гарозе и лигируют со специально обрабо- тайным промотором цитомегалловируса. Дл  получени  промотора цитомегалловируса (, вначале провод т модификацию сайтов в плазмиде pBC12CMV. Плазмиду перевод т в линейную форму и лигируют в присутствии синтетического линкера, содержащего сайт рест оиктазы Sail. Полученную плазмиду рВС12 CMV-Sall гидролизуют Sail, обрабатывают фрагментом Кленов  ДНК-полимеразы 1 в присутствии четырех dNTP, расщепл ют HindiII и очищают - 600 п.н. фрагмент, содержащий промотор CMV, электрофорезом в легкоплавкой агарозе. Фрагмент лигируют в вектор pPS-4-neo, подготовленный следующим образом: ДНК обрабатывают Sail при условии частичного гидролиза и фрагментом Кленова в присутствии четырех dNTP, затем Hindlll и фосфатазой. Цитирование промотора CMV в вектор pPS-4-neo дает искомый вектор pPS-5-neo.

Пример . Экспресси  гена -интерферона человека   клетках Hat-I.

С помощью вектора pPS-5-neo достигают эффективной экспрессии гена У-интерферона человека в клетках RatI, составл ющей 1000 ед./мл в сутки. Увеличение уровн  экспрессии генов, клонированных в векторе pPS-5-пео, достигаетс  за счет увеличени  дозы гена в клетках при их культивировании на среде с метатрек- сатом.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Вектор pPS-5-neo дл  введени  и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих размером 10,6 т.п.о., содержащий плазмидную ДНК pPS-4-пео-размером 10 т.п.о. и мол.м. 6,6 Md, у кото- рой крайний участок узнавани  рест- риктазы Sail в полнлинкере затуплен, StuI-Hindlll - фрагмент плазмидной ДНК рВС12 CMV размером 0,6 т.п.о. и мол.м. 0,4 Md с конститутивным промотором иитомегаловируса, у которого затуплен участок узнавани  рест- риктаз StuI, генетические маркеры: пео - определ ющий устойчивость клеток млекопитающих к генетицину (G 418), а клеток-Escherichia coli - к канамицину, DFRT - обеспечивающий

   V

   5 16223966

   устойчивость к метатрексату; Ар -миалоннруса по сайтам Hindlll, Sail,

   обеспечиваютс  устойчивость к ампи-BamHI и EcoRI, а чужеродных генов

   циллину; уникальные сайты растрик-с собственным промотором по сайту

   ции Hindlll, BamHI, Sail, EcoRI,, Clal, спектр хоз ев: фибробласты мыBglll , Clal, NotI, емкость вектора -ши (N1H3T3, Balb/c), фибробласты

   до 7 т.п.о., встраивание чужеродныхкрысы (Rat1 и Rat2), клетки обезьгенов под контроль промотора цито- ны - Cosl.