SU1477741A1

SU1477741A1 - Способ получени гидрогеназы

Info

Publication number: SU1477741A1
Application number: SU874323905A
Authority: SU
Inventors: Николай Алексеевич Зорин; Олег Федорович Корсунский; Иван Николаевич Гоготов
Original assignee: Институт почвоведения и фотосинтеза АН СССР
Priority date: 1987-11-02
Filing date: 1987-11-02
Publication date: 1989-05-07

Abstract

Изобретение относитс к области промышленной микробиологии и может быть использовано в инженерной энзимиологии, биокатализе, медицине и в научных исследовани х при изучении биохимии процессов дыхани и фотосинтеза. Целью изобретени вл етс повышение выхода и увеличение удельной активности гидрогеназы и удешевление процесса. При выделении гидрогеназы предлагаетс использовать предварительную обработку биомассы клеток бактерий охлажденным ацетатом, что позвол ет значительно повысить выход гидрогеназы и одновременно получить биологически активные соединени : убихинон Q₈ и менахинон MQ₈. Окончательную очистку гидрогеназы провод т методом повторной хроматографии на фенилсефарозе CL- 4B, в результате чего резко возрастает степень очистки и удельна активность гидрогеназы. 1 табл.

Description

ME.

1

Изобретение относитс к микробиологической промышленности, а именно к микробиологическому синтезу биологически активных веществ, и может быть использовано в инженерной энзи- мологии дл синтеза соединений, меченых изотопами водорода, в научных исследовани х дл изучени процессов биокатализа и преобразовани световой энергии в молекул рный водород.

Целью изобретени вл етс повышение выхода, увеличение удельной активности гидрогеназы, расширение

2

технологических возможностей и удешевление процесса.

Изобретение позвол ет одновременно с гидрогеназой получить биологически активные вещества: убихикон Q& и менахинон MOg.

Сущность изобретени заключаетс в том, что перед разрушением ультразвуком клетки бактерий обрабатывают охлажденным ацетоном, а после отделени ацетона и нерастворимого остатка клеток из растворимой фракции гид- рогеназу выдел ют фракционированием

сульфатом аммони боч предпаритель- ной термообработки, очистку гидро- геназы провод т хроматографией на фенилсефарозе CL-4B, повтор эту операцию дважды. Отдепенный ацетоно- иый экстракт упаривают и после омылени липиднон фракции из него выдел ю убихинон Qa и менахинон MOg.

Предварительна обработка клеток бактерий охлажденным ацетоном позвол ет извлечь каротиноиды, хлорофиллы липиды, хиноны и другие липофильные соединени , частично разрушить структуру мембран, повышает солюбилизацию белков, способству , тем самым, повышению выхода фермента.

При предварительной термообработке бесклеточного экстракта происходит денатураци термолабильных белков, которые, выпада в осадок, соосаждают частично гидрогеназу, что уменьшает выход фермента. Если термообработку проводить после фракционировани сульфатом аммони , то устран ютс сорбционные потери гидроге- назы и при предварительном фракционировании ( устран етс част белка, не обладающа ферментативной активностью, что способствует более полному выделению гидрогеназы.

Пример 1. Клетки Thiocapsa roseopercisina штамм BBS выращивают по известной методике в анаэробных услови х.

150 г сырых клеток суспендируют в 150 мл 0,02 Н кальцийфосфатном буфере (рН 7,0) с помощью магнитной мешалки в течение 1 ч. К полученной суспензии добавл ют 1,5л охлажденного ацетона, перемешивают. Клетки отфильтровывают в воронке Бухнера под вакуумом и промывают 1 л охлажденног ацетона. Экстракты объедин ют дл получени убихинона Qg и менахинона MQg.

Клетки после обработки ацетоном высушивают под вакуумом и суспендируют в дистиллированной воде в соотношении 1:20, суспензию обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе в течение 30 мин при 22 кГц. Растворимую фракцию, содержащую гидрогеназу, отдел ют центрифугированием в течение 30 мин при 5000 g.

К супернатанту добавл ют до 30% насыщени сульфат аммони и выпавшие в осадок примесные белки и мембранные фракции клеток отдел ют

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

центрифугированием в течение 60 мин при 5000 g. Дл осаждени гидрогеназы концентрациюсульфата аммони увеличивают до 70% и суспензию центрифугируют в течение 15 мин при 5000 g. Осадок, содержащий гидрогеназу, раствор ют в 150 мл 0,02 М калий- фосфатного буфера, рН 7,0 и полученный раствор прогревают в течение 10 мин при 70еС дл удалени термо- либильных белков. Денатурированные белки осаждают центрифугированием в течение 30 мин при 5000 g и дл дальнейшей очистки гидрогеназы су- пернатант нанос т на колонку (1,5х х15 см) с фенилсефарозой CL-AB, уравновешенную 0,8 М раствором сульфата аммони в 0,02 М калийфосфатном буфере , рН 7,0. Колонку с адсорбированной на ней гидрогеназой промывают вначале 100 мл 0,8 М, а затем тем же объемом 0,2 М раствором сульфата аммони . Гидрогеназу элюируют дистиллированной водой до полной элюции и подвергают повторной хроматографии на колонке с фенилсефарозой CL-4B. Дл более тонкой очистки фермент элюируют из колонки понижающимс градиентом концентрации раство- ра сульфата аммони объемом 100 мл в диапазоне 0,2-0,004М. Полученные по данной методике препараты гидрогеназы обладают высокой удельной активностью.

Характеристики гидрогеназы приведены в таблице.

Ацетоновый экстракт упаривают на роторном испарителе под вакуумом при 40-456С. К сухому остатку приливают смесь, состо щую из 200 мл 96%-ного этанола, 130 мп дистиллированной воды, 12,6 г КОН и 6 г пирогаллола, нагревают до кипени и провод т омыление в течение 25 мин в токе аргона. Смесь охлаждают на бане со льдом и провод т экстракцию хинонов из неомыленной фракции гекса- ном (3x100 мл). Гексан упаривают на роторном испарителе. Сухой красно- коричневый осадок раствор ют в 3 мл смеси дл элюции и хроматографируют на колонке с окисью алюмини . Элю- цию провод т смесью петролейный эфир (т.кип,40-70°С) - хлороформ - диэтиловый эфир в отношении 85:10:5.

Фракцию в виде рко-желтой полосы с 1-Ц 0,7, содержащую менахинон, и фракцию в виде рко-оранжевой по51

лосы г Rf 0,5, содержащую убихинон собирают отдепьно, упаривают и рехро матографируют на колонке с окисью алюмини в системе петролейный эфир- пиэтиленовый пфир - лед на уксусна кислота в отношении 90:30:1. Элюат упаривают и определ ют количество полученных препаратов спектрофото- метрически в абсолютном этаноле, использу соответствующие коэффициенты экстринкции.

Выход составл ет, мг/г сухих клеток:

Гидрогеназа0,6

Убихинон Оа2,2

Менахинон К080,3

Преимущества предлагаемого способа по сравнению с известным заключаютс в увеличении в три раза выхода фермента, значительном увеличении удельной активности и степени очистки гидрогеназы, в возможности получени из одной порции биомассы дополнительного р да биологически активных соединений, т.е. при получении определенного количества гидрогеназы , убихинона и менахинона происходит экономи сырь реактивов, энергии, рабочего времени. Кроме

Удельна активность, мкмоль Н5 мг белка3,45

Степень очистки51,6 Выход фермента, %6,6

777416

того, отсутствие длительных стадий при очистке гидрогеназы, таких как гель-фильтраци и препаративных- электрофорез в полиакриламидном геле позвол ют значительно сократить врем получени гидрогеназы.

Claims

Формула изобретени

10

Способ получени гидрогеназы с

проведением воздействи на клетки Thiocapsa roseopercisina штамм BBS ультразвука, термообработки, ступен15 чатого фракционировани сульфатом аммони и очистки фермента, отличающийс тем, что, с целью повышени выхода и удельной активности гидрогеназы, расширени

20 технологических возможностей и удешевлени процесса, перед воздействием ультразвуком провод т обработку клеток охлажденным ацетоном, ступенчатое фракционирование провод т перед

25 термообработкой, а очистку осуществл ют двукратной гидрофобной хроматографией на поперечно-сшитом полимере агарозы с ковалентно присоединенными фенильными группами,способном

30 фракционировать белки с мол.массой 6-1Q4 - 2- 107 дальтон.

28,0

350,0

20,0