SU1469464A1 - Способ определени резистентности эритроцитов - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к медицине , точнее к гематологии, к лабораторным способам вьшвлени  степени повреждени  эритроцитов крови, предназначено дл  изучени  физик6-хими ческого состо ни  консервированных эритроцитов и дл  клинической прак- тики в лабораторных методах оценки состо ни  мембран эритроцитов при различной патологии системы крови. Цель изобретени  - ускорение и повышение точ- точности способа. Дл  этого к пробе крови, стабилизированной гепарином иди цитратом натри , добавл ют изотонический р-р NaCl, центрифугируют при 3000g 5 мин. К отдельному осадку эритроцитов добавл ют изотонический р-р NaCl (разведение в 100-150 /раз), дел т суспензию на 2 равнее части, контрольную и опытную. Контрольна  проба используетс  дл  получени  гемо- лизированных эритроцитов (100% гемолиз ) путем добавлени  в суспензию 2%-го р-ра тритона Х-100. Опытную пробу получают путем добавлени  к суспензии эритроцитов изотонического р-ра NaCl аналогично контрольной пробе, прогревают 5{н при 48-50 С. После температурной инкубации суспензию эритроцитов центрифугируют 5 мин при 3000g собирают супернатанты, регистрируют ну их оптической плотности при А 540 нм. Так как в пробирку с контролем добавлен детергент тритон Х-100, все эритроциты гемолизирова- лись и величину оптической плотности этого образца принимают соствет- |ствующей 100%-ному гемолизу (Д 100%). Исход  из этого, подсчитьшают % гемолиза при 48-50°С по формуле: % гемолиза (D48.)/D,oo A, где 4s-3o c величина оптической плотности опытной пробы; 100 - величина разведени  проб. При величине гемолиза 5-9% определ ют умеренное снижение резистентности, при гемолизе более 10% - выраженна  степень снижени  резистентности 3pnTpoipiTOB. «2

Description

1

Изобретение относитс  к области медицины, в частности к гематологии, и именно к лабораторным способам вы влени  степени повреждени  эритроцитов крови, и может быть использовано как в научно-исследовательской работе при изучении физико-химического состо ни  консервированных эритроцитов, так и клинической практике в качестве лабораторного метода,

позвол ющего оценивать мембран эритроцитов при различной патологии системы крови, а также адекватность гемотрансфузиойной терапии.

Целью изобретени   вл етс  ускорение и повышение точности способа.

Способ осуществл етс  следугацим образом.

Берут 0,2-0,4 мл свежей крови, стабилизированной гепарином, либо цитратом натри . К ней добавл ют 20- 40 мл изотонического раствора хлористого натри , перемешивают и затем центрифугируют при 3000g в течение 5 мин. Супернатант сливают, а к полученному осадку эритроцитов добавл ют мл изотонического раствора NaCl (разведение в 100-150 раз) и дел т суспензию эритроцитов на 2 равные части: 1 (контрольна  проба) используетс  дл  получени  полностью гемолизированных эритроцитов (100% гемолиз) путем добавлени  в суспензию 0,1 мл 2%-ного раствора тритона Х-100. Суспензи  стоит 10±1 мин при комнатной температуре; 2 (опытна  проба) - к суспензии эритроцитов добавл етс  0,1 мл изотонического раствора хлористого натри , чтобы разведение эритроцитов было, как в пробирке 1, и прогревают суспензию в течение 10±1 мин при 48т50 С. После температурной инкубации суспензию эритроцитов центрифуги1)уют 5 мин при 3000g и собирают супернатанты. Затем регистрируют величину оптической плотности супернатантов при длине волны 540 нм. Так как в пробирку № 1 был добавлен детергент тритон Х-100, вследствие чего все эритроцит гемолизировались, то величину оптической плотности, полученную дл  этого образца, можно прин ть соответствующей 100%-ному гемолизу. Исход  из этого, подсчитывают процент гемолиза при 48-50°С по формуле.

S-ie O- fJ-lQ

10 о %

Процент гемолиза

где D4j.5()°c величина оптической плот

ности опытной пробы; . величина оптической плот

ности контрольной пробы; После, этого суд т о резистентнос- ти эритроцитов, причем при величине гемолиза 5-9% определ ют умеренное снижение резистентности, а при величине гемолиза более 10% - вьфажент

to

15

ную степень снижени  резистентности эритроцитов.

Проведенными экспериментами установлено , что степень гемолиза эритроцитов , полученных из крови здоровых доноров, при исследовании предлагаемым способом не -превышает 2-4%, а индивидуальные значени  этого показател  колеблютс  от 0,2 до 4%.

Пример 1. В процессе диспансерного наблюдени  за больным М., страдающим врожденной микросфероци- тарной анемией, проводили исследование степени повреждени  эритроцитов крови. Дп  анализа брали 0,2 мл крови , стабилизированной цитратом натри , к ним добавл ли 20 мл изотонического раствора NaCl, содержимое 20 перемешивали и затем центрифугировали 5 мин при 3000g. Супернатант сливали , а к осадку эритроцитов добавл ли 9 1-ш изотонического раствора NaCl (разведение в 100 раз), делили 25 Полученную суспензию на 2 части. К одной части добавл ли О,1 мл 1%-ного раствора тритона Х-100 (100%-ньй гемолиз эритроцитов) и оставл ли ее при комнатной температуре. К другой 30 части добавл ли Oj1 мл изотаничес- кого раствора NaCl и помещали ее в термостат, где t 48 С. Выдерживали в течен ие 10 мин. Затем обе пробирки центрифугировали при 3000g в течение 5 мин. Супернатанты отбирали и на спектрофотомоторе регистрировали величину оптической плотности при длине волны 540 нм в пробирках 1 и 2 и по формуле определ ли процент гемолиза. В данном случае исследование крови больного показало, что гемолиз эритроцитов составл ет 27%, что указывало на выраженное снижение резистентности эритроцитов, а повторное исследование крови через два мес ца после проведенного лечени  показало, что гемолиз равен 5,2%, что указывало на увеличение, резистентности эритроцитов в крови больного и позволило считать пато- 50 логический процесс стабилизировавшимс . Исследование крови по прототипу показало лишь визуально, что в обоих случа х сыворотка крови приобрела красноватьм цвет, что свидетельствовало лишь о наличии гемолиза, но не оценивало количество его в сыворотке , т.е. не оценивало степень повреждени  клеток.

35

40

45

55

51

Пример 2. Больной Б., страдает хронической гипопластической анемией с гемолитическим компонентом в течение 6 лет, У больного отмечаютс  выраженные посттрансфузионкые реакции гемолитического и негемолитического типа. Многократно при каждом поступлении в стационар определ лась осмотическа  резистивность эритроци- то , котора  всегда оказывалась сниженной, независимо от клинического состо ни  больного, от активности трансфузионной терапии.

На фоне проводимого лечени  - в первую очередь трнсфузий отмытых размороженных эритроцитов, у больного наступило ухудшение клинического состо ни , св занное с посттрансфузионт ными реакци ми, что было четко подтверждено исследованием; степени повреждени  эритроцитов предлагаемым способом. Дл  анализа брали 0,2 мл крови, стабилизированной цитратом натри , к ним добавл ли 20 мл изотонического раствора NaCl, содержимое перемешивали и затем центрифугировали в течение 5 мин при 3000g. Супер- натант сливали, а к осадку эритроцитов добавл ли 10 мл изотонического раствора NaCl (разведение в 150 раз) делили полученную суспензию на 2 части . К одной части добавл ли 0,1 мл 2%-ного раствора тритона Х-100 и оставл ли при комнатной температуре. К другой части добавл ли 0,1 мл изотонического раствора NaCl и помещали ее термостат, где при t 50 С вьдерживали 11 мин, затем обе пробирки центрифугировали при SOOOg в течение 5 мин. Супернатанты исследовали при длине волны 540 нм и рассчи- тьтали процент гемолиза эритроцитов. Степень гемолиза эритроцитов до трансфузии составл ла 5%, а после трансфузии - 13%, т.е. до трансфузии у больного наблюдалась умеренна  сте- пе нь повреждени  эритроцитов после трансфузии - степень повреждени  стала выраженной. Стоит отметить, что эти показатели определены на фоне значительной билирубинемии и выраженного ретикулоцитоза, сохран вшихс  на прот жении всего курса лечени .

Пример .3. Больной М., страдает врожденной микроцитарной гемолитической анемие. У больного посто нна  билирубинеми , выраженньй peTHкулоцитоз на фоне вполне удовлетвори

0

5

0

5

9

0

5

0

5

5

4646

тельного общего состо ни  и отсутстви  анемического синдрома. В процессе динамического дисперсного наблюдени  за больным простое нетрудоемкое исследование резистентности эритроцитов дало следующие результаты: исследование, проведенное при поступлении, - 27% гемолиза, а исследование через 1,5 мес. - 9,0% гемолиза , что указьгаало на увеличение резистентности эритроцитов в крови больного и позволило считать патологический процесс стабилизировавшимс .

Предлагаемый способ позвол ет быстро и точно оценить степень повреждени  эритроцитов в крови больного и определить тактику лечени  боль- 1НОГО. При исследовании крови гематологических больных предлагаемым способом (при соблюдении режима, указанного в формуле) наблюдалась умеренна  или выраженна  степень пов- режедни  эритроцитов. Лишь в одном случае при железодефицитной анемии (заболевание, при котором мембрана эритроцитов обычно не повреждаетс ) степень гемолиза эритроцитов бьша в пределах нормы (0,83%). В то же врем  исследование крови здоровых людей показало, что процент гемолиза эритроцитов не превышает 4% во всех случа х .

Таким образом, предлагаемьй способ надежен, прост в исполнении, на осуществление его достаточно 40 мин. По сравнению с прототипом дл  осуществлени  предлагаемого способа времени требуетс  в 10-15 раз меньше , количество образца вз того дл  анализа тоже сокращаетс  примерно в 20 раз, кроме этого предлагаемый способ дает количественную оценку устойчивости эритроцитов.

Использование предлагаемого способа в гематологии обеспечит, прогнозирование развити  т желых осложнений при забапевани х крови. Способ также может быть использован при апробации новых лекарств и при научных исследовани х . Способ доступен любой научной и клинической лаборатории.

Способ позвол ет определить тактику ведени  больного (количество и вид трансфузионной терапии: эритро- цитарна  масса, отмытые размороженные эритроциты), конкретизировать применение различных других лечебных

71469464

Claims (1)

1. меропри тий. Результаты исследовани , полученные данным способом, нар ду с. другими показател ми помогут врачу лучше оценить клиническое состо ние больного, что немаловажно, например , дл  оценки трудоспособности бального, :Формула изобрет.е н .и  

   8

   хлористого натри  с последующим проведением нагревани  одной части смет си 48-50 С в течение 10±1 мин и одновременной обработкой другой части смеси 1-2%-ным раствором тритона Х-100, затем полученные образщл центрифугируют, регистрируют их оптическую плотность при длине волны

   Способ определени  резистентности о 540 им, рассчитывают процент гемоэритроцитов путем их нагревани , отличающийс  тем, что с цепью ускорени  и повышени  точности способа, получают суспензию отмытых эритроцитов, развод т в 100-150 раз изотоническим раствором

   лизировакных эритроцитов и при его величине 5-9% определ ют умеренное снижение резистентности эритроцитов а при величине более 10% - выраженное снижение резистивности эритроцитов .