SU1155601A1 - Способ получени растительного полимера-эпигалохина - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО ПОЛИМЕРА-ЭПИГАЛОХИНА формулы (Л ел :л з: гдеи - целое число, равное 1-5, с молекул рной массой 5000-10000, отличающийс  тем, чтокорни родиолы Семенова экстрагируют А 25-70%-ным ЭТИЛОВЫМ спиртом с последующей обработкой сконцентрированного

Description

экстракта этилацетатом, высушиванием, измельчением экстракта в порошок с последующей счисткой его от низкомолекул рных примесей трехкратным кип чением с этилацетатом и высушиванием полученного порошка при темпера-; туре ЗО-бО С и остаточном давлении 1-10 мм рт.ст. до посто нного веса.

Изобретение относитс  к способу получени  нового растительного полимера -(4,8), (4,6) (-)-2,3-цис-(2Я,31)-3 ,4-транс-(ЗК,45)-3,3 ,4 ,5,7-пен . таоксифлаван: (-)-2,3-цис-(2,ЗК)-3 ,4-транс-(ЗК,45)-3-0-галло-3 ,4 ,5, 6, 7-пентаоксифлавана (эпигалохина) .формулы

3 . 1

oблaдaюD eгo противогипоксической активностью.

Цель достигаетс  тем, что согласно предлагаемому способу корни -родиоЛы Семенова экстрагируют 257Т )%-ным этиловым спиртом с последующей обработкой сгущенного экстракта этилацетатом, высушиванием, измельчением экстракта в порошок с последующей очисткой его от низкомолекул рных примесей трехкратным кип чением с этилацетатом и сушкой полученного порошка при температуре 30-60 Си остаточном давлении 1-10 мм рт.ст. до посто нного веса.

Способ осуществл ют следующим образом.

Воэдушно-сухие измельченные корни родиолы Семенова при комнатной температуре экстрагируют 25-70%-ным этиловым спиртов порци ми, вз тыми в соотношении к сырью 1:5-1:6 (весобъем ) четыре- шестикратно, каждый раз по 12-24 ч. Затем концентрированные в 30 раз упариванием в вакууме при 30-60 С объединенные экстракты п тикратно обрабатывают порци ми этилацетатом, вз тыми в соотношении к экстракту 1:0,4-1:1 (объем-объем). Этилацетатные фракции отдел ют, очищенный водно-спиртовый экстракт упаривают в вакууме при 30-60°С, остаток измельчают в порошок и повторно обрабатывают этилацетатом , вз тым в соотношении к порошку 1:1,5-1:3 (вес-объем), в колбе с обратным холодильником на вод ной бане в течение 15 мин при кип чении. После охлаждении и отстаивани  этилацетатный раствор сливают. Обработку порошка этилацетатом повтор ют 3 раза . Очищенный порошок высушивают при 30-60°С и остаточном давлении 1-10 мм рт.ст. до посто нного веса. Выход целевого продукта 5-15% от веса воздушно-сухих корней, зависит от места сбора сырь  и режима обработки (количества экстракции, крепости используемого дл  экстракции спирта). Полученный эпигалохин представл ет собой аморфный порошок .светло-коричневого цвета с характерным запахом, растворимый в воде, этаноле, метаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, разлагаетс  при 290-300 С J;+40 (с 1,0, этанол ) . ..

При использовании дл  экстракции ЭТШ10ВОГО спирта крепостью менее

01. 4

25% нар ду с эпигалохином извлекаютс  гидрофильные балластные вещества (моно- и полисахариды, минеральные соли и т.п.), что затрудн ет

очистку целевого продукта.

Экстракци  сырь  этиловым спиртом крепостью 70% приводит к значительному снижению выхода эпигалохина и увеличению содержани  гидрофобных низкомолекул рных балластных веществ в экстракте.

Предпо 1тительно использовать этиловый спирт концентрации 30-40%. При получении целевого продукта

эпигалохина упаривать и сушить практически возможно при любой температуре до . Температура в этих пределах гфактически не вли ет на качество и количество получаемого

целевого продукта, а лишь ускор ет процессы упаривани  и сушки. Длительное воздействие на препарат температзфой более 60 С приводит к ухудшению фармакологического действи 

препарата. Остаточное давление определ етс  теьшературой сзшки.

Пример 1. В перкол тор емкостью 20 л внос т 2000 г воздушносухих мелкоизмельчениых корней родиолы Семенова и шестикратно экстрагируют при комнатной температуре смесью вода - этиловый спирт (25% по объему) порци ми по 12, 10, 10, 10, 10, 10 л, каждой порцией в течение 24 ч. Папученные экстракты, хран щиес  в темноте при комнатной температзфе, объедин ют и упаривают в роторном испарителе под вакут умом (при остаточном давлении

30 мм рт.ст., который обеспечиваетс  водоструйным насосом) при АО-50 С до 2 л. Сгущенный экстракт обрабатывают этилацетатом (5 раз по 500 мл). Этилацетатные фракции выбрасывают . Экстракт упаривают на вод ной бане в фарфоровых чашках. Остаток высушивают под вакузтом в сушильном шкафу (10 мм рт.ст. масл т ный вакуумный насос) при 50-60 С и

измельчают в порошок. Последний

в колбе емкостью 1 л заливают этипацетатом (300 мп) и кип т т на вод ной бане с обратным холодильником F течение 15 мин. После охлаждени  и

отстаивани  этипацетатный раствор спивают. Обработку этиладетатом тор ют 3 раза. Затем порошок высушивают в сушильном вакуумном шкафу ( 1 мм рт.ст.) при 50-60 С до посто  ного веса и исчезновени  запаха эти ацетата. Получают 300 г (15% от веса исходного сырь ) целевого продукта , представл ющего собой аморфньй порошок светло-коричневого цвета (с , этанол), разлагающийс  при 290-300 С, ММ 2000-10000. П р и м е р 2. В перкол тор емкостью 20 л внос т 2000 г воздушносухих мелкоизмельченных корней роIдйолы Семенова и шестикратно экстра гируют при комнатной температуре 20-25 смесью вода - этиловый спирт (35% по объему) порци ми по 12,10, 10, 10, 10 л, каждой порцией в тече ние 24 ч. Полученные экстракты, хра н щиес  в темноте при температуре 20-25°С, объедин ют и упаривают в роторном испарителе под вакуумом (30 мм рт.ст.) при 40-50°С до 2 л. Сгущенный экстракт обрабатывают этилацетатом (5 раз по 500 мл) Зтк ацетатные фракции выбрасывают. Экст ракт упаривают на вод ной бане в фарфоровьзг чашках. Остаток высушива ют под вакуумом в сушильном шкафу (10 мм рт.ст,) при 50-60 С н измельчают в порошок. Последний в колбе емкостью 1 л заиливают этилацетатом (300 мл) и кип т т на вод  ной бане с обратным холодильником 3 течение 15 мин. После охлаждени  отстаивани  этилацитатный раствор ели вают. Обработку этилацетатом повтор ют 3 раза. Затем порошок высушиваю в сушильном вакуумном шкафу при 50-60 С до посто нного веса и исчезновени  запаха этилацетата. Получают 200 г (10% от веса исходного сьфь ) эпигалохина (целевой продукт) представ-п н дего собой аморфный порошок светло-коричневого цвета с о11.р+4 ( с 1jO, этанол), разлагающийс  при 2000-10000. 290-300 С, ММ I ПрцмерЗ. В перкол тор емкостью 20 л внос т 2000 г воздушносухих мелкоизмельченных корней родиолы Семенова и шестикратно экстрагируют при комнатной температуре смесью вода - этиловый спирт (70% по объему) порци ми по 12, 10, 10, 10, 10, to л, каждой порцией в течение 24 ч. Полученные экстракты, хран щиес  в темноте при комнатной температзфе (20-25с), объедин ют и упаривают в роторном испарителе под вакуумом (30 мм рт.ст.) при 40-50 С до 2 л. Сгущенный экстракт обрабатывают этилацетатом (5 раз по 500 млХ Этилацетатные фракции выбрасывают. Экстракт упаривают на вод ной бане в фарфоровых чашках. Остаток высушивают под вакуумом в сушильном шкафу (10 мм рт.ст.) при 50-60°С и измельчают в порошок. Последний в колбе емкостью 1 л заливают этнлацетатом (300 мл) и кип т т на вод ной бане с обратным холодильником в течение 15 мин. После охлаждени  и отстаивани  этилацетатный раствор сливают . Обработку этилацетатом повтор ют 3 раза. Затем порошок в 1сушивают в сушильном вакуумном шкафу , (1 мм рт.ст.) при 50-60 с до посто нного веса к изчезновени  запаха этилацетата .Получают 100 г (5% от веса исходного сырь ) эпигалохина (целевой продукт), представл кицего собой аморфный порошок светло-коричневого цвета с Со(р 40 (с 1,0, этанол), разлагаюпшйс  при 290-300 0. ММ 2000-10000. Эпигалохин  вл етс  смесью растительных полимеров с различной степенью полимеризации, где п ( примеры t-3 получени  пигалохина). Структура общей формулы,эпигалохина подтверждена химическими превращени ми и данными УФ-, Ж-спектров, сравне иен этих данных с данными, полученными при изучении полимера с вьщеленного из самого эпигалохиРазделение полимеров И -2, И-3, -5 не представл етс  возможным с технической точки зрени . Активность целевого продукта про вл етс  суммой конденсированных катехинов с различной степенью полимеризации - эпигапохином . Определение молекул рной массы эпигалохина. Молекул рнук массу ММ) устанавливают методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом марки Ь Н-20, растворитель и элюеит - смесь диметипформамвд - вода (9:1). Образец берут в вцде О,5%-ного раствора в указанной смеси растворителей и нанос т на колонку (143 см) с сефадексом. Скорость элюации 6-7 мл/ч. Фракции собирают по 1 мл, концентрацию вещества в них определ ют на спектрофотометре СФ-16 при 278 им. 7 На гель-хроматограмме (элюограмм разграничивают области димеров, три меров, олигомеров и полимеров различной степени полимеризации. Подсчитав площади этих фракций на элюограмме, установили, что соедине ни  с ММ меньше 2000, т.е. составл е 6% от cyMMbii соединени  с ММ до 5000 - 2,5%; 5100-5900 - 20%; 59006600 - 50%; 6600-7400 - 15%; по 10000 - 3,5% и более 10000 - 3%. Из элюограммы и подсчетов видно, что основную часть суммы составл ют полимеры с ММ 5100-7400 (85%). Расщепление эпигалохина. В четьфехгорлую круглодонную кол бу емкостью 50 мл помещают 1,О эпигалохина и 5,Оемкого кали . При посто нном пропускании тока азота и перемешивании нижнюю часть колбы догружают в баню с легкоплавким сплавом при 155-160 С. Температуру поднимают в течение 5 мин до и затем реакционную смесь быстро охлаждают, подкисл ют 20%-ноЙ серной кислотой. Содержимое колбы разбавл ют водой и экстрагируют этилацетатом (50 Mrt X 5 раз). Этилацетатное извлечение сзпват безводным сульфатом натри , фильтруют и отгон ют. Остаток хроматографирую т на колонке с полиамидом (элюёнт - смесь хлороформа с метанолом 9:1). Получают следующие соед нени : С , М 126, т.пл. 218219°С , Rf 0,64, CgHgOs-, М 170, т. Ш1. 220 (с разл.) ftiO,56, М 154j т. Ш1. (с раз ложением), R{0,72 (значени  веществ определены методом бумажной хроматографии в системе Н 6утанол 85%-на  муравьина  кислота - вода 95:10:20). Ползгченные соединени  по физико химическим константам спектральны данным (ИК-, УФ- и масс-спектры) и непосредственным сравнени м с ис пытанньми образцами идентифицирова соответственно с флорог-шоцином, га вой и протокатеховой кислотами. Пр действии сол ной кислоты на разбавленный водный раствор эпигалЪхи образуютс  актоцианидины - цианиди и дельфинйдин. . Выделение полимера с из эп галохина. 30 г эпигалохина смешивают с 20 целлюпозы и помещают в .колонку с 1 целлюлозой (5 X 140 см, 400 г). Элюируют водой, водным этанолом (1:1), этанолом, метанолом, собира  фракции по 20 мп11-45 вода, 46-9.6 (вода-этанол ), 91-134 (этанол), 135160 (метанол). Упариванием растворител  из фракций 1-52 и 58-160 получают соединени  различной степени полимеризации (в граммах): 0,6t; 5,87, 14,53; 4,50;.0,85; 0,52, процентное соотношение которых совпадает с результатами, полученными гель-фильтрацией. При сгущении фракций 52-57 вьщел ют 1,72 г вещества состава , ММ 1947 (ультрацентрифуга), при 290-300°С разлагаетс , Ri 0,01 в системе н-бутанол - уксусна  кислота - вода (3:1:5) и R{0,54 в этаноле (с 1,0; этанол). Вычислено,%: С 59,16t Н 3,87; О 36,97. Найдено,%: С 59,17 Н 3,86; О 36,97. УФ-спектр:/Й 215, 245, 278, 310 нм (gf 5,43, 4,89j 4,45, 4,7). Спектр сн т на спетрофотометре ЕР ЗТ фирма Hitachi (Япони ). ИК-спектр: -9 3500-3200, 2935, 1657, 1610, 1535, 1515, 1495, 1440. 1320, 1250, 1200, 1150, 1105, 1040, 1038} 83, 830, 800, 770, 737 см . .Спектр сн т на приборе ИК-20 Карл-Цейс-Иена (ГДР). Молекул рна  масса и гомогенность определена на ультрацеитрифу ге НОМ 3170 (Венгри ), скорость 8000 об/мин, i , угол ЭО, врем  30 мин, 5 1, D 8,410. Спектр ЯМР С сн т на спектрометре Varian XL-100 в растворе dе (), внутренний стандарт TMS, сигнал которого прин т за О (сГ-шкала). Структура общей формулы эпигалохииа подтверждена химическими превращени ми и данньаш УФ; ИКи ЯМР С-спектроскощю дл  полимера с tl 1. В УФ-спектре имеютс  максимумы при 220, 240, 310 нм. В ИК-спектре по вл ютс  полосы поглощени  при 3200-3500 см (колебани  гидроксильных групп), 1657 см (Я-ООС-Арил), 1610, 1535, 1515, 1440 см (скелетные колебани  ароматического  дра), 1535, 1515, 1150, 1040 и 830, 800, i 770, 737 см (гоюскостные н внештоскостные деформационные колебани  1,3,4- и 1,3,4,5-замещенных аромати ческих колец), 1320, 1200 см (0-Н в фенолах и колебани х С-0 св зи) 1250 1038 (С-0-С-группы),. 1033 (С-0), 1105, 1050 см (С-О-М этерифицированной вторичной ОН-группы) В ЯМР Т-спектре полимера обнаружены резонансные сигналы: при 154157 м,д. (С-9, С-5, С-7 кольца А эпикатехином), 145,9 м.д. (С-3 и С-4) кольца В эпикатехинов, С-3 и С-5 кольца эпигаллокатехина); 133, 9м.д. С-4 кольца В эпигаллокатехина ); 131,5 м.д. (C-t кольца В эпикатехинов) при 119,5 м.д. (С-6 кольца В эпикатехина); при 110,7 м ( С-2, С-5 эпикатехина и С-2, С-6 эпигаллокатехина), при 166,9, 145,9 121,9 и 110,7 м.д. (соответ. С-, С-3, и С-4, С-5; С-1; С-2 и С-6 остатка галловой кислоты), при 107,7 м.д. (С-6, С-8 и С-10 замещенных колец А эпикатехинов), 105,4 м.д. (верхний конечный С-10, приьажающий к замещенному C-4)i при 100,5; 96,5 и 98,5 м.д. (соответ. С-10, С-8 ,и С-6 конечных А-колец эпикатехинов), 76,8-78,6 (С-2 эпикатехинов), 72,1-75,2 (С-3 эпикатехинов), при 37,9, 27,8 м.д. (cootBeT. С-4 замещенньпс и С-4 конечного эпикатехинов). Распределение фракций с различным молекул рным весом в эпигалохи не установлено методом гель-фильтр ции на сефадексе марки ЬН-20. Фармакологическое исследование эпигалохина. Доза 100 w/кг. Экспериментальны ми животными  вл лись белые беспоро , ные мы1ш весом 18-22 г. Представлен ные данные получены на 800 животны Гипоксическа  нормобарическа  гипокси  вызывалась помещением животных g герметически закрывающийс эксикатор. Препараты вводились вну брюшинно за 30 мин до помещени  в эксикатор. Полученные данные показ ли высокую противогипоксическую ак ность эпигалохина на этой модели г поксии. Статистически достоверное УД нение продолжительности жизни мыше начиналось уже с дозы 1 мг/кг. В д 10мг/кг продолжительность жизни мьппей, получивших эпигалохин, сост вила 156% к контрольной группе, в дозе 20 мг/кг - 165% и дозе 40 мг/кг 207%. Противогипоксическа  активность гутамина оказалась значительно слабее: в оптимальной дозе 100 мг/кг он удлинил жизнь животных на 145%, т.е. меньше, чем эпигалохина в дозе 10мг/кг, т.е. эпигалохин значительно активнее гутимина по защитному действию при гипоксической нормобарической гипоксии. Гипоксическа  гипобарическа  гипок си  создавалась в барокамере. Животные поднимались до высоты 11 км со скоростью 1 км/мин. На высоте 11км мыши наблюдались в течение 45 мин. Животные, преодолевшие этот временной барьер, считались выжившими . Препараты вводились за 30 мин до помещени  мышей в барокамеру. Эпигалохин про вл ют высокую противогипоксическуто активность и на этой модели гипоксии. В дозе 20 мг/кг (внутрибрюшинно) он предохран ет гибели 60% животных (в контрольной группе все мьщш погибли за 3,2-0,58 мин) и статистически достоверно удлинил продолжительность жизни на 92,5% по отношению к контролю . Активность гутимина была меньшей: в дозе 100 мг/кг (внутрибрюшинно) он удлинил продолжительность жизни животных на 650% и не предохранил от гибели ни одного животное. Таким образом, эпигалохин превосходит гутимин по защитному действию от гипоксической гипоксии. Цитотоксическа  гипокси  вызьгаалась подкожным введением цианистого натри  в дозе 8 мг/кг. Препараты вводи/шсь внутрибрюшинно за 30 мин до инъекции цианистого натри . Эпигалохин в дозе 40 мг/кг статистически достоверно удлинил продолжительность жизни животных в 5,74 раза Действие гутимина бьшЬ значительно слабее: в дозе 100 мг/кг он удлинил продолжительность жизни лишь в 3 раза. Эпигалохин превосходит гутимин по защитному действию от цитотоксической гипоксии.. Гемическа  гипокси  вызывалась внутрибрюшинным введением нитрита натри  в дозе 160 мг/кг. Препараты вводились на 30 мин до инъекции нитрита натри , внутрибрюшинно. В контрольной группе погибли все животные. Эпигалохин в дозе 20 мг/кг предохранил от гибели 17% мышей

и на 157% удлинил продолжительность j жизни остальных животньпс. Гутимин не1 только не про вил защитного эффекта , а статически достоверно уменьшил врем  их жизни в 2 раза по сравнению с контролем.

Эпигалохин оказывает защитное действие от гемической гипоксии в отличие от гутимина, утсудшающего её течение.

Изучение общего действи  и токсичности эпигалохина показало, что при внутриврюшиннсш введении вещество не вызывает изменений в поведении животных до дозы 50 мг/кг, от которой наступает небольшое уменьшение спонтанной двигательной актив, мости и уреже1 ие дыхани . С увеличением дозы эти  влени  станов тс  . более вьфажеиными, животные группируютс  по йл етс  птоз и расслабление шейных мышц. Спонтанные движени  почти отсутствуют, однако на звуковое и болевое раздражение животные реагируют писком и реакцией,идбегани . рассчитанна  по feipeHcy, составл ет 325 мг/кг. При введении внутрь действие препарата аналогично но начальна  угнетающа  доза составл ет 200 мг/кг, а Щуо по Беренсу - 833 мг/кг. Следовательно, широта фармакологического действи  эпигалохина при внутрибрюшинном введении в оптимальной дозе (20 мг/кг) составл ет 16,2, ГУ И

при подкожном введении составл ет 1325 мг/кг, т.е. широта фармакологического действи  дл  оптимальной дозы 100 мг/кг составл ет 13,2.

Таким образом эпигалохни превосходит гутимин по широте фармакологического действи .

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬ-

   НОГО НОЛИМЕРА-ЭПИГАЛОХИНА формулы

   SU η 1155601 где₍

   И - целое число, равное 1-5, . с молекулярной массой 2000-10000, отличающийся тем, чтокорни родиолы Семенова экстрагируют ή 25-70%-ным этиловым спиртом с последую. щей обработкой сконцентрированного экстракта этилацетатом, высушиванием, измельчением экстракта в порошок с последующей ©чисткой его от низкомолекулярных примесей трехкратным киϋ пячением с этилацетатом и высушиванием полученного порошка при темпера-?

   ' туре 30-60¾ и остаточном давлении

   1-10 мм рт.ст. до постоянного веса.