KR100362394B1 - 활성화합물이 함유된 까치버섯의 에칠알코올 추출물 추출방법과 추출물에서의 활성화합물 정제방법 - Google Patents

활성화합물이 함유된 까치버섯의 에칠알코올 추출물 추출방법과 추출물에서의 활성화합물 정제방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리오젤루스 멀티플렉스(polyozellus multiflex; 한국명 까치버섯으로 본발명에서는 까치버섯으로 언급함) 균주의 자실체로 부터 항치매, 항산화, 항암 활성을 갖는 화합물(Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산)이 함유된 까치버섯 에칠알코올(Ethyl-Alchol;C2H5OH) 추출물을 추출하고, 상기의 추출물로 부터 활성화합물을 정제하는 방법에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 까치버섯 균주의 자실체로 부터 항치매, 항산화, 항암 활성을 갖는 화합물(Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산)이 함유된 까치버섯 에칠알코올 추출물을 추출하고, 상기의 추출물로 부터 활성화합물을 정제하는 방법을 제공하므로서, 노화방지 및 치매치료제로 이용 가능한 활성산소 및 프로릴 엔도펩티다제 활성을 강력하게 저해할뿐만 아니라 B16-BL6 melanoma 세포주에 대해 강한 독성을 나타내면서 성인병 예방 기능성은 물론 성인병 치료를 간단하게 할수 있는 작용·효과가 있다.

Description

활성화합물이 함유된 까치버섯의 에칠알코올 추출물 추출방법과 추출물에서의 활성화합물 정제방법{METHOD OF REFINING ACTIVE CHEMICAL COMPOUND WITH ABSTRACTION AN EXTRACT AND ETHYL-ALCHOL IN A POLYOZELLUS MULTIFLEX HAVE ACTIVATED CHEMICAL}
본 발명은 폴리오젤루스 멀티플렉스(polyozellus multiflex; 한국명 까치버섯으로 본발명에서는 까치버섯으로 언급함) 균주의 자실체로 부터 항치매, 항산화, 항암활성 화합물(Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산)을 함유하는 까치버섯 에칠알코올(Ethyl-Alchol) 추출물을 추출하고, 이 추출물로 부터 활성화합물(Kynapci n-12, Kynapc in-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산)을 정제하는 방법에 관한 것이다.
더욱 상세하게는, 담자균류에 속하는 까치버섯 균주의 자실체로 부터 열수 추출, 에칠알코올 추출, 용해도 차, 실리카젤 및 세파덱스 크로마토그라피 등으로 항치매, 항산화, 항암 활성을 갖는 1,4-dihydroatromentin(Kynapcin-12), 5,6-dihydro xybe nzo[b]furan 2,3-diacetic acid dimethyl ester (Kynapcin-13), 3-(5',6'-di hydroxyben zo[b]furan 2'-acetic acid dimethyl ester)-3' -yl-5,6-dihydroxyben zo[b]furan 2-acetic acid dimethyl ester(Kynapcin-24), 3-(5',6'-dihydroxybenzo [b]furan 2'-ace tic acid dimethyl ester)-3' -yl-5,6-dihydroxybe nzo[b]furan 2-acetic acid (Kynapcin-28), 테레포린 산(thelephoric acid)의 활성화합물을 포함하는 추출물을 추출하고, 상기 추출된 추출물에서 활성화합물을 분리 정제하고자 하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 담자균류의 일종인 폴리오젤루스 멀티플렉스는 굴뚝버섯(thelephoraceae) 또는 까치버섯속(polyozellus)에 속하는 버섯(유풍출판사 1990년 발행, 한국산 버섯도감 271면 참조)으로, 한국명으로는 까치버섯 또는 지방명으로는 곰버섯, 고무버섯 등으로 불리운다.
이 버섯은 한국에서는 오대산 일대에 주로 자생하고, 민간에서는 간혹 위장병 등에 이용하거나 주로 식용으로 사용하며, 기능성 식품 또는 의약품의 재료로서는 적극적으로 사용되고 있지 않다.
상기 까치버섯이 생산하는 화합물과 관련된 기존의 발명으로는 유일하게 대한민국 특허 제 136447 호(한국과학기술 연구원, 발명의 명칭; 폴리오젤루스속 균주가 생산하는 신규 항암 활성물질 폴리오젤린 및 그 제조방법)가 있으나, 상기 특허에서 개시된 화합물은 화학적으로 p-terphenyl의 골격을 갖는 것이다.
따라서, 본 발명은 까치버섯 균주의 자실체로 부터 항치매, 항산화, 항암 활성을 갖는 화합물(Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산)을 함유하는 추출물을 추출하고 이 추출물에서 활성화합물을 분리 정제하는 방법을 제공하므로서, 노화방지 및 치매치료제로 이용 가능한 활성산소 및 프로릴 엔도펩티다제 활성을 강력하게 저해할뿐만 아니라 B16-BL6 melanoma 암세포주에 대해 강한 독성을 나타내면서 성인병 예방 기능성은 물론 성인병 치료를 간단하게 할수 있도록 하는데 그 목적이 있는 것이다.
도 1은 본 발명의 일실시예로서 까치버섯 자실체로 부터 항치매, 항산화, 항암활성 화합물(Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산)이 함유된 까치버섯 에칠알코올 추출물의 추출방법과 추출물로 부터의 활성화합물 정제방법을 보인 흐름도.
도 2는 본 발명의 일실시예로서 a는 Kynapcin-12, b는 Kynapcin-13, c는 Kynapcin-24, d는 Kynapcin-28, e는 테레포린 산의 화학적 구조식을 보인 도면.
도 3은 Kynapcin-12의 수소 핵자기 공명 스펙트럼을 보인 도면.
도 4는 Kynapcin-12의 탄소 핵자기 공명 스펙트럼을 보인 도면.
도 5는 Kynapcin-12의 질량 스펙트럼을 보인 도면.
도 6은 Kynapcin-12의 적외선 흡수 스펙트럼을 보인 도면.
도 7은 Kynapcin-13의 수소 핵자기 공명 스펙트럼을 보인 도면.
도 8은 Kynapcin-13의 탄소 핵자기 공명 스펙트럼을 보인 도면.
도 9는 Kynapcin-13의 질량 스펙트럼을 보인 도면.
도 10은 Kynapcin-13의 적외선 흡수 스펙트럼을 보인 도면.
도 11은 Kynapcin-24의 수소 핵자기 공명 스펙트럼을 보인 도면.
도 12는 Kynapcin-24의 탄소 핵자기 공명 스펙트럼을 보인 도면.
도 13은 Kynapcin-24의 질량 스펙트럼을 보인 도면.
도 14는 Kynapcin-24의 적외선 흡수 스펙트럼을 보인 도면.
도 15는 Kynapcin-28의 수소 핵자기 공명 스펙트럼을 보인 도면.
도 16은 Kynapcin-28의 탄소 핵자기 공명 스펙트럼을 보인 도면.
도 17은 Kynapcin-28의 질량 스펙트럼을 보인 도면.
도 18은 Kynapcin-28의 적외선 흡수 스펙트럼을 보인 도면.
도 19는 테레포린 산의 수소 핵자기 공명 스펙트럼을 보인 도면.
도 20은 테레포린 산의 탄소 핵자기 공명 스펙트럼을 보인 도면.
도 21은 테레포린 산 테트라 아세테이트의 질량 스펙트럼을 보인 도면.
도 22는 테레포린 산의 적외선 흡수 스펙트럼을 보인 도면.
이하, 첨부된 도 1을 참조하여 Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산을 함유하는 까치버섯의 에칠알코올 추출물 추출방법의 일실시예에 대하여 설명하면 다음과 같다.
먼저, 까치버섯의 자실체 또는 그 풍건물 8kg을 잘게 썰은 후 36리터 95%의 에칠알코올에 넣고 95℃에서 3시간 동안 수욕상에서 3회 반복 추출한 후 여과지를 이용하여 자실체 조각을 제거한 추출물을 얻도록 한다.
이후, 상기 얻어진 추출물을 감압 여과 또는 동결건조 후 건조물에 적당량의 물을 가하여 분산한 다음 25리터의 에틸아세테이트로 3회 분배 추출하고, 이를 포화식염수로 세척 후 무수황산나트리움을 가하여 탈수 및 여과한 다음 여액을 감압 농축하여 에틸아세테이트 가용성 추출물 2.2kg을 얻는다.
그리고, 상기 농축물에 5리터의 메탄올을 가하여 분산시킨 다음 감압 여과기를 이용하여 여액인 메탄올 가용성 성분과 침전인 메탄올 불용성 성분으로 나누고 불용성 성분에 대하여는 다시 5리터의 메탄올을 가하여 같은 조작을 반복한다.
따라서, 상기와 같은 조작을 5회 반복하여 가용성 성분을 모두 모은 다음 감압농축하면, Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산이 함유된 까치버섯의 추출물 1.8kg을 추출할수 있게 되는 것이다.
여기서, 상기 추출된 까치버섯 에칠알코올 추출물은 표1에서와 같이,
약제학적 또는 식품학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제 등을 포함하므로, 쉽게 입수할수 있는 성분들을 이용하여 공지의 방법에 따라 제제할수 있다.
일예로, 활성성분을 담체와 혼합하거나, 담체로 희석시키거나, 캡슐, 사셰, 종이 또는 다른 용기의 형태인 담체 내에 담을수 있다.
여기서, 담체가 희석제의 역할을 할 경우에는 활성성분을 위한 비히클, 부형제 또는 매질로 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 물질일수 있다.
따라서, 제제는 정제, 환제, 분산제, 과립제, 앨릭서, 현탁제, 유화제, 용액, 시럽제, 에어로졸제, 연질 및 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사용액, 멸균 또는 포장된 분말제 및 연고 등의 형태일수도 있다.
한편, 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 세률로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 설탕시럽, 메틸세룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필 하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일 등이 있다.
더불어, 상기 까치버섯 에칠알코올 추출물은 상기 성분들 외에도 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할수 있다.
따라서, 본 발명의 까치버섯 에칠알코올 추출물은 환자에게 투여된 후 활성성분을 급속하게 지속적으로 또는 지연시켜 방출하도록 당분야의 공지 기술들을 이용하여 제제할수 있으며, 그 약학적 또는 식품학적 까치버섯 에칠알코올 추출물은 경구 또는 비경구 투여될수 있다.
예를들어, 할성화합물의 1일 투여량은 통상적으로 체중 1kg당 약 0.1 내지 20mg의 범위이며, 기능성 식품으로 사용될 경우 물 또는 에칠알코올 추출물로서 100mg 내지 10g의 범위다.
한편, 상기 까치버섯 에칠알코올 추출물에 함유된 항치매, 항산화, 항암활성을 갖는 화합물(Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산)의 정제방법은,
까치버섯 균주의 자실체를 열수 또는 에칠알코올로 추출한 후 농축하여 조추출물을 얻는 단계와;상기 단계에 의해 얻어진 조추출물을 적당량의 물에 분산시켜 에틸아세테이트로 분배 추출한 후 농축하여 에틸아세테이트 가용성 분획을 얻는 단계와;상기 단계에 의해 얻어진 에틸아세테이트 가용성 분획에 적당량의 메탄올을 가하여 메탄올 가용성 분획과 불용성 분획을 분리시키는 단계와;상기 단계에 의해 분리된 메탄올 불용성 분획으로 부터 용해도 차에 의하여 테레포린 산을 정제하는 단계와;상기 단계에 의해 분리된 메탄올 가용선 분획을 농축하여 실리카젤, 역상실리카젤, 고속액체, 세파덱스 크로마토그라피 등을 항치매, 항산화, 항암 활성을 갖는 화합물(Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28)을 정제하는 단계; 로 진행되는 것이다.
상기 진행단계에 의해 정제된 항치매, 항산화, 항암활성을 갖는 화합물로서 Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산은,
Tode 등(J. Antibiotics, 1992, 45; 1573-1579)이 사용한 프로릴 엔도펩티다제 저해활성 측정법 및 Halliwell 법(Halliwell, B.(1987) FASEB J. 1;P 358-364)에 준한 항산화활성 측정법 및 B1-BL6 melanoma 세포에 대한 성장저해 활성 검정에서 탁월한 프로릴엔도펩티다제 저해활성, 활성산소억제활성 및 암세포에 대한 성장 저해활성을 나타낼수 있게 된다.
이하, 까치버섯 에칠알코올 추출물에 함유된 항치매, 항산화, 항암활성을 갖는 화합물(Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산) 정제방법에 대한 일실시예를 첨부된 도 1 및 도 2를 참조하여 설명한다.
도 1 및 도 2에 도시된 바와같이, 까치버섯 균주의 자실체를 수집하여 이물질을 제거한 후 상기 자실체를 실온 내지 90∼100℃(바람직하게는 95℃)에서 2∼24시간 동안(바람직하게는 5시간) 열수 또는 에칠알코올(바람직하게는 95%의 에칠알코올로 추출)로 추출하는 제 1 단계와;상기 제 1 단계에 의한 추출물을 동결건조, 증류 또는 감압증류, 스프레이 드라이 등으로 건조한 후 그 건조물에 2∼10배량(바람직하게는 5배량의 에틸아세테이트)의 에틸아세이트를 가하여 분배 추출하는 제 2 단계와;상기 제 2 단계에서 가하여지는 에틸아세테이트에 가용성인 성분을 모아 증류 또는 감압증류, 스프레이 드라이 등으로 건조한 후 그 건조물에 3배량의 메탄을 가하여 3∼20℃(바람직하게는 4℃)에서 12∼48시간(바람직하게는 24시간)동안 방치하는 제 3 단계와;상기 제 3 단계에 의한 추출액을 원심분리하거나 여과하여 침전물과 메탄올 가용성 분획을 얻고, 침전물을 메탄올로 2∼10회(바람직하게는 4회)에 걸쳐 세척하고 다시 물로 2∼10회(바람직하게는 4회)에 걸쳐 세척하는 제 4 단계와;상기 제 4 단계의 세척으로 녹는부분은 메탄올 가용성 분획과 합하여 증류, 감압증류 또는 스프레이 드라이어 등으로 건조한 후 실리카젤, 역상 실리카젤 또는 sephadex를 이용한 컬럼크로마토그라피 등에 의하여 분리시켜 항치매, 항산화, 항암 활성을 갖는 화합물로서 Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28를 정제하는 제 5 단계와;상기 제 4 단계의 세척으로 녹지 않는 부분을 따로 모아 건조하여 항치매, 항산화, 항암 활성을 갖는 화합물로서 테레포린 산을 정제하는 제 6 단계; 로 진행되는 것이다.
상기 단계에 의해 얻어지는 Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산의 화합물 정제에 대하여 보다 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
[Kynapcin-12]
에틸아세테이트 가용성 성분 중 메탄올 가용성 성분의 일부(예: 90.7g)를 실리카젤 컬럼크로마토그라피(크로로포름: 메탄올 = 7:1에서 시작하여 최종 농도 메탄올 100%가 되도록 용매의 기울기를 주어 용출) 한다.
이후, 도 1에서와 같이 fr. I 부터 V까지의 다섯개 분획으로 나누고 그 중 항치매, 항산화, 항암활성이 높은 fr. I,Ⅱ,Ⅲ 부분에 대하여 다시 정제를 한다.
즉, fr. Ⅲ에 대하여 실리카젤 컬럼 크로마토그라피(클로로포름: 메탄올 = 8:1부터 시작하여 메탄올 100%까지 농도 기울기를 주어 용출, Merck사 Art. No. 7734)하여 fr. Ⅲ-1부터 Ⅲ-6까지의 여섯개 분획으로 나눈다.
이중 상기 활성이 높은 fr. Ⅲ-2에 대하여 실리카젤 컬럼 크로마토그라피(헥산: 에틸아세테이트 : 초산 = 2:1:0.1에서 시작하여 1:1:0.1이 되도록 용매의 기울기를 주어 용출, Merck사 Art. No. 7734)를 다시 수행하여 fr. Ⅲ-2-1부터 Ⅲ-2-10의 10개 분획을 얻도록 한다.
상기 분획중 fr. Ⅲ-2-9에 대하여 Lobar RP-18(Merck사) 크로마토그라피를 2회(1회째 60% 메탄올, 2회째 40% 메탄올로 용출) 수행하여 짙은 갈색을 띠는 화합물 Kynapcin-12 24.1mg을 순수 정제할수 있게 되는 것이다.
[Kynapcin-13]
상기 KNPC-12에서 얻은 fr. Ⅰ에 대하여 실리카젤 컬럼 크로마토그라피(클로로포름: 메탄올 = 8:1부터 시작하여 메탄올 100%까지 농도기울기를 주어 용출)한 다음 상기 활성이 강한 fr. Ⅰ-3 분획에 대하여 또다시 실리카젤 컬럼 크로마토그라피(헥산: 에탈아세테이트: 초산 = 2:1:0.1에서 시작하여 1:1:0.1의 비율까지 용출액의 농도에 기울기를 주어 용출)하여 fr. Ⅰ-3-1에서 I-3-9까지 9개의 분획으로 나눈다. 이후, 우선 I-3-5에 대하여 80% 수성 메탄올을 용출 용매로 하여 세파덱스 LH-20을 행하면, Kynapcin-13 18.9mg을 순수 정제할수 있다.
[Kynapcin-24]
상기 Kynapcin-13에서 얻은 fr. Ⅰ-3-4에 대하여 65% 메탄올을 용출 용매로 Lobar RP-18하여 fr. Ⅰ3-4-a부터 Ⅰ-3-4-j까지 10개의 분획으로 나눈 후, 이중에서 활성이 높은 fr. Ⅰ-3-4-f를 HPLC(용출용매로 54% 메탄올과 1% 초산을 함유하는 초순수를 사용)하면, Kynapcin-24 23.1mg을 순수 정제할수 있다.
[Kynapcin-28]
상기 Kynapcin-12에서 얻은 fr. Ⅱ를 적당량의 메탄올에 분산시킨 후 에펜도로프튜브에 옮기고, 이를 원심분리하여 침전과 상등액으로 나눈다.
이후, 상기의 침전은 버리고 상등액을 모아 농축한 다음 실리카젤 크로마토그라피(클로로포름: 메탄올: 개미산 = 10:1:0.1, Merck Art. 7734)하고 활성이 있는 분획에 대하여 세파덱스 LH-20 크로마토그라피(클로로포름: 메탄올 = 1:1)하면, Kynapcin-28 47.4mg을 순수 정제할수 있다.
[테레포린 산]
메탄올 불용성 성분을 5리터의 물로 세척하고 다시 1리터의 메탄올로 세척하면, 테레포린 산 100mg을 순수 정제할수 있다.
여기서, 상기 정제된 활성을 갖는 화합물의 이화학적 특성에 대하여 살펴보면 다음과 같다.
[1]. Kynapcin-12는 도 2a 및 표2에서와 같이, 분자식이 C22H18O8이고 분자량(Mw)은 410으로 그 화학구조상의 특징이 파라테르페닐(p-terphenyl) 구조를 가지며, 페놀성 수산기 4개와 아세틸기 두개로 이루어진 대칭성 화합물이다.
[2]. 상기 Kynapcin-13은 도 2b 및 표3에서와 같이 분자식이 C12H10O7이고 분자량(Mw)은 266으로 그 화학구조상의 특징은 벤조퓨란 구조에 두개의 페놀성 수산기와 두개의 초산 메틸에스테르기가 붙어 있는 구조의 화합물이다.
[3]. 상기 Kynapcin-24는 도 2c 및 표4에서와 같이 분자식이 C20H14O10이고 분자량(Mw)은 414으로 그 화학구조상의 특징은 Kynapcin-13 두 분자가 서로 3번과 3'번의 탄소로 연결된 구조를 가지는 화합물이다.
[4]. 상기 Kynapcin-28는 도 2d 및 표5에서와 같이 분자식이 C19H12O10이고 분자량(Mw)은 410으로 그 화학구조상의 특징은 Kynapcin-24에서 에스테르의 메틸기가 한 분자 탈리된 형태를 가지는 화합물이다.
[5]. 상기 테레포린 산은 도 2e 및 표6에서와 같이 분자식이 C18H8O8이고 분자량(Mw)은 352으로 그 화학구조상의 특징은 4개의 페놀성 수산기를 가지며, p- terphenyl quinone의 형태를 가지는 화합물이다.
한편, 상기 정제된 Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산 물질의 프로릴 엔도펩티다제에 대한 저해활성에 대하여 설명하면 다음과 같다.
치매의 종류는 크게 혈관성 치매(cerebrvascular dementia; CVD)와 노인성 치매(alzheimer type dementia; AD)로 나눌수 있는데,
상기 CVD는 주로 혈관내에 형성된 혈전(thrombus)에 의해 뇌출혈, 뇌졸증 등이 발생하는 경우 발병 주변의 뇌세포가 상해를 입어 기억력 상실 등의 치매증상을 유발시키는 것으로 알려져 있다.
상기 AD의 경우에는 아직 확실한 발병기간은 알려져 있지 않으나 최근 AD의 발명 원인 인자의 하나로 β-amyloid가 이 병의 발생 및 진행에 영향을 준다는, 소위 "amyloid 가설"이 발표되었으며 현재로서는 이 가설이 가장 유력한 것으로 평가되고 있다.
즉, 상기 amyloid를 생성하는데 관여하는 효소의 실체는 아직 밝혀져 있지 않으나 가장 가능성 있는 효소의 하나로 prolyl endopetidase가 지목되고 있어 이 효소의 저해제가 치매의 예방, 치료제 효과를 검정하는 방법의 하나로 꼽힌다.
따라서, 본 발명의 일실시예에서 순수 정제된 Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산의 저해활성은,
후라보박테리아(Flavobacterium)으로 부터 얻어진 효소를 사용하였다.
즉, 후라보박테리움 메닝고센티쿰(Flavobacterium meningosepticum)으로 부터 정제된 프로릴엔도펩티다제를 벤질옥시카르보닐글리실 L 프로릴 파라 니트로아닐리드를 기질로 하여 반응시켜 효소작용에 의하여 가수분해되어 생성되는 파라 니트로아닐린의 양을 410nm에서의 흡광도를 특정하여 프로릴 엔도펩티다제의 저해활성을 평가하였다.
여기서, 활성은 상기 화합물이 처리되지 않은 대조군과 비교한 상대적인 저해 백분율(%)로 나타내었다.
[Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산의 저해활성 유효농도(IC50)]
아래의 표7에서 부터 표11에서와 같이 각각 0.51ppm(1.24 μM), 18.28ppm(76.80 μM), 0.47ppm(1.14 μM), 0.39ppm(0.98 μM), 0.16ppm(11.15 μM)로 테레포린 산이 가장 강력한 저해활성을 나타낸다.
[Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산의 항산화 효과]
생명유지에 절대적으로 필요한 산소가 각종 물리적, 화학적 요인등에 의하여 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical,O2) 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, HO·), 과산화수소(hydroxide peroxide, H2O2), 일중항산소(single oxygen, O2)와 같은 반응성이 매우 큰 활성산호(active oxygen)로 전환되면 생체에 치명적인 산소독성을 일으킨다.
즉, 이들 활성산호는 암을 비롯하여 치매, 뇌졸중, 파킨슨병, 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기질환, 염증, 류마티스, 자기면역질환 등의 각종 질병 및 노화를 일으키는 것으로 알려져 있다.
따라서, 이와같은 free radical을 소거할수 있는 화합물(free radical scavengers) 또는 과산화물 생성 억제물질과 같은 항산화 물질들은 이들 산화물들에 의하여 야기되는 각종 질환 치료제 및 노화억제제로서 기대된다.
그러므로, 상기 활성물질의 항산화 활성을 조사하기 위하여 상기의 활성물질을 Halliwell법(Halliwell, B. (1987) FASEB J. 1:P 358-364)에 준하여 활성을 측정하였다.
즉, 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl; DPPH) 5mg을 에칠알코올 37.5mg에 녹여 DPPH용액으로 제조한 후, 이 용액 600μ리터에 DMSO 250μ리터를 첨가시키고, 적당량의 에칠알코올로 희석시켜 10초간 잘 썩는다.
그리고, 518nm의 파장에서 대조군의 흡광도가 0.94 내지 0.97이 되도록 에칠알코올을 첨가시켜 농도를 측정하였다.
이후, 흡광도가 0.94 내지 0.97인 DPPH용액 1m리터에 1mg/mLl도의 시료용액을 50μ리터를 넣고 충분히 섞은 후 5분간 반응시켰다.
그리고, 반응물에 대한 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 흡광도 감소치를 DPPH 라디칼 소거활성에 의한 항산화 활성도로 나타내었다.
그 결과 표12에서와 같이,
모든 화합물들이 양성 대조군으로 사용한 아스코르빈산, 토코페롤, 터시어리부틸히드록시아니솔(BHA), 터시어리부틸히드록시톨루엔(BHT)에 비하여 거의 동등하거나 보다 강력한 활성을 나타내었으며, 그 중에서도 특히 Kynapcin-28이 가장 우수한 활성을 나타냈다.
[Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산의 암세포 독성 활성]
암세포에 대한 세포독성의 활성 측정은 B16-BL6 melanoma 세포주에 대하여 실시하였으며, 그 실시방법은 다음과 같다.
즉, B16-BL6 melanoma 세포를 96-well plate에 well당 2.5×104개의 세포를함유하는 액 50μ리터를 넣고 여기에 시료가 적당량 함유된 EMEM-5%FBS액 50μ리터를 가한 후, 37℃에서 36시간동안 배양한다.
그리고, Cell Counting Kit(일본 Dojindo사 제품)를 사용하여 세포의 성장 저해활성을 %로 나타내며, 그 결과 표13에서 부터 표17에서와 같이,
테레포린 산에서 10 μgml 농도에서 암세포의 성장을 거의 100% 억제하였고, Kynapcin-12의 경우에도 200 μgml 농도에서 암세포의 성장을 거의 100% 억제하였으며, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28의 경우에는 이보다 약하기는 하나 고농도에서 어느 정도 암세포의 성장을 억제하는 활성을 나타낼수 있게 되는 것이다.
이상에서 설명한 바와같이 본 발명은 까치버섯 균주의 자실체로 부터 항치매, 항산화, 항암 활성을 갖는 화합물(Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산)을 포함하는 까치버섯 에칠알코올 추출물을 추출하고, 이 추출물에서 활성화합물을 정제하는 방법을 제공하므로서, 노화방지 및 치매치료제로 이용 가능한 활성산소 및 프로릴 엔도펩티다제 활성을 강력하게 저해할뿐만 아니라 B16-BL6 melanoma 세포주에 대해 강한 독성을 나타내면서 성인병 예방 기능성은 물론 성인병 치료를 간단하게 할수 있는 효과가 있다.

Claims (4)

  1. 까치버섯의 자실체 또는 그 풍건물을 잘게 썰은 후 에칠알코올에 넣고 일정온도에서 일정시간 동안 수욕상에서 Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산을 일정횟수 동안 반복 추출하는 단계와;
    상기 단계에 의해 반복 추출된 Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산에서 여과지를 이용하여 자실체 조각을 제거한 후 순수 Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산의 추출물만을 얻는 단계와;
    상기 단계에 의해 얻어진 추출물을 감압 여과 또는 동결건조 후 건조물에 적당량의 물을 가하여 분산한 후 에틸아세테이트로 3회 분배 추출하는 단계와;
    상기 단계에 의해 3회 분배 추출되는 추출물을 포화식염수로 세척 후 무수황산나트리움을 가하여 탈수 및 여과한 다음 여액을 감압 농축하여 에틸아세테이트 가용성 추출물을 얻는 단계와;
    상기 단계에 의해 얻어진 농축물에 메탄올을 가하여 분산시킨 후 감압 여과기를 이용하여 여액인 메탄올 가용성 성분과 침전인 메탄올 불용성 성분으로 나누는 단계와;
    상기 단계에 의해 나누어진 불용성 성분에 대하여 다시 메탄올을 가한 후 매탄올 가용성 성분을 추출하는 단계와;
    상기 단계의 반복으로 모아진 가용성 성분을 모두 감압농축하여 Kynapcin- 12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산이 함유된 추출물을 추출하는 단계; 로 진행함을 특징으로 하는 까치버섯의 에칠알코올 추출방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 활성화합물(Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산)이 함유된 까치버섯의 에칠알코올 추출물에 부형제, 담체, 희석제 등을 포함시켜 항치매, 항암, 노화방지제의 제조가 가능하도록 함을 특징으로 하는 까치버섯의 에칠알코올 추출방법.
  3. 까치버섯 균주의 자실체를 열수 또는 에칠알코올로 추출한 후 농축하여 조추출물을 얻는 단계와;
    까치버섯 균주의 자실체를 열수 또는 50%~100%의 에칠알코올로 추출한후 농축하여 조추출물을 얻는 단계와;
    상기 단계에 의해 분리된 에틸아세테이트 가용성 분획에 적당량의 메탄올을 가하여 메탄올 가용성 분획과 불용성 분획을 분리시키는 단계와;
    상기 단계에 의해 분리된 에틸아세테이트 가용성 분획에 적당량의 100%메탄올을 가하여 메탄올 가용성 분획과 불용성 분획을 분리시키는 단계와;
    상기 단계에 의해 분리된 메탄올 불용성 분획으로부터 용해도 차에 의하여 테레포린 산을 정제하는 단계와;
    상기 단계에 의해 분리된 메탄올 가용성 분획을 농축하여 실리카젤, 역상실리카젤, 고속액체 및 세파덱스 크로마토그라피를 이용하여 항치매, 항산화, 항암활성을 갖는 화합물(Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산)을 정제하는 단계; 로 진행됨을 특징으로 하는 까치버섯 에칠알코올 추출물에서의 활성화합물 정제방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 Kynapcin-12, Kynapcin-13, Kynapcin-24, Kynapcin-28, 테레포린 산은,
    메탄올, 헥산, 에틸아세테이트, 초산, 개미산, 클로로포름, 벤젠 또는 이들의 혼합용매와 실리카젤, Lobar RP-18, Sephadex LH20 등의 담체를 이용한 각종 크로마토그라피를 사용하여 까치버섯의 에칠알코올 추출물로 부터 정제됨을 특징으로 하는 까치버섯 에칠알코올 추출물의 활성화합물 정제방법.
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