SU1128955A1 - Штамм @ @ А-60-продуцент биологически активного комплекса липидов и способ получени биологически активного комплекса липидов - Google Patents

Abstract

1. Штамм Astasia longa А-60 , (коллекда  Московского Государственного Университета им. В.М.Ломоносова)продуцент биологически активного комплекса липидотз. 2. Способ получени  биологически активного комплекса липидов, включакщий культивирование посевного материала при аэрации на среде, содержащей источникуглерода, минеральные соли, витамины и воду, сепарирование , экстракцию полученной биомассы смесью хлороформа - метанола 2:1, очистку выделенного экстракта промывкой дистиллированной водой и последующее высушивание, отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода и активности целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм простейшего Аз- tasia longa № А-60, аэрацию провод т при режиме 2,0-2,5 объема возсл духа в 1 мин на 1 л среды, при этом посевной материал выращивают на круговой качалке при 220-250 оборотах в 1 мин.

Description

;о ел ел Изобретение относитс  к микробиологическому производству биологически активных веществ - липидов , используемых в медицине, веtepинapии и парфюмерии. Известно использование в каче .стве источника липидов смеси различ ных субстратов, включающей бактерии различных видов и дрожжеподобные организмы р. Известен также способ получени  биологически активного комплекса липидов, включающий культивирование посевного материала при аэрации на среде, содержащей источ1тк углерода , минеральные соли, витамины и воду, сепарирование, экстракцию пол ченной биомассы смесью хлороформаметанола 2:1, очистку вьщеленйого экстракта йромывкой дастилли юван- ной водойи последующее высушивание Однако использование известной смешанной культуры и способа получени  из нее биологически активного комплекса липидов не обеспечивают достаточный выход и активность целевого продукта. Цель изобретени  - повьшение выхода и активности целевого продукта . Поставленна  цель достигаетс  те что используют штамм Astasia Ibnga А-60 (коллекци  Московского Государ ственного Университета им. М.В.Ломо носова) .в качестве продуцента биологически активного комплекса липидов . Кроме того, согласно способу по лучени  биологически активного комплекса липидов, включающему культивирование посевного материала при аэрации на среде, содержащей источник углерода, минеральные соли,, витамины и воду, сепарирование,экстра цию полученной биомассы смесью хлороформа-метанола 2:1, очистку выделенного экстракта промывкой дисти лированной водой и последующее высушивание , в качестве продуцента ис пользуют штамм простейшего Astasia longa № А-60, аэрацию провод т при режиме 2.,0-2,5 объема воздуха в 1 ми на 1 л среды, при этом посевной материал вьфащивают на круговой качал ке при 220-250 обУмин. Полученный штамм Astasia longa №А имеет следующую морфологическую и ф зиологическую характеристики: Astas longa имеет длинуклетки 30-40 мк и ширину 6-10 мк. Цитоплазма заполнена парамилоном , которьй скрывает внутриклеточные структуры. Astasia longa - свободноживущий хегутиконосец, подцарство Protozoa, класс Flagellata пор док Englenomonada. Размножаетс  бесполым путем (бинарное деление). Морфологическа  характеристика: одноклеточньй организм, имеющий удлиненную, почти цилиндрическую форму, задний .конец которого снабжен сосковидным отростком. Снаружи клетка покрыта оболочкой (пелликулой). Передний конец снабжен жгутом. Жгут  вл етс  основным органом передвижени  флагелл т . Astasia longa характерно присутствие хорошо оформленного  дра. Ядро имеет сферическую форму диаметром 4 мк. На тонких срезах Astasia longa обнаружены рибосомы. А.longa имеет хорошо развитую цитоплазматическую сеть. Имеет комплекс Гольджи, состо sifiu из параллельных пластинок. Физиологическа  характеристика: по способу питани  сапрофит, хемогетеротроф . Отношение к углеводам: не использу .ёт глюкозу и другие углеводы. Отношение к спиртам: использует этиловый спирт как источник углерода и энергии. Отношение к органическим кислотам: использует пропионовую, масл ную , валериановую, капроновую, пировиноградную кислоты, как источник углерода и энергии. Оптимальный источник углерода - этанол. Отношение к органическим веществам: не использует аминокислоты. Оптимальным источником азота  вл ютс  аммонийные соли. Способ по сн етс  примерами. Пример 1. Дл  выращивани  , посевного материала готов т среду следующего состава, вес,%: этиловый спирт, ректификат 1,19; KHjPO 0,043; (NH4)HP04 0,062; 5Е„0 0,043, MgeOo 0,0008;CaCl 20,001; микроэлементы Peg (5 0 ) 9 9Н20 0,0001; Cu504 0,0001;CoCej-6H20 0,0001} 7HjO 0,00002; Na MoO -2H20 0,00001; витамин B 0,002; витамин B;,2 0,00001; дистиллированна  вода - остальное, начальное значение рН 6,8. Среду разливают в качалочные колб по 250 МП и стерилизуют при 1 атм 30 мин. Перед засевом рреды добавл ют необходимые количества этилового спирта и витаминов. Колбы засевают культурой A.longa А-60 в количестве 10% от исходного объема среды при накоплении клеток 5-10 в одном мл. Колбы помещают на качалку с числом оборотов 220 об./мин и встр хивают 6 сут. По окончании процесса колбы снимают, отбирают пробы. В пробах определ ют число клеток и содержание липидов в них. Число клеток составл ет 10.«10 в одном мл среды,количество липидов 8% веса сухих кле ток. Дл  проведени  выращивани  A.longa в ферментерах в объеме 60 л готов т среду следующего состава,вес.% этиловьй спирт гидролизньй 1,19 КН2Р04 0,043; (NH4)2 НРО, 0,062; ( 0,043; 0,0008; витамин В 0,0002; витамин 3,0,0001 водопроводна  вода остальное, начальное значение рН 6,8. Среду стерилизуют при 1 атм 1ч. Перед посевом добавл ют спирт этиловый ГИДРОЛИЗНЫЙ и витамины. Фермен тер засевают культурой продуцента в количестве 5% от исходного объёма при накоплении клеток 10-10 в одном мл среды. Устанавливают режим аэриро вани  2,0 объема воздуха на 1 объем среды в 1 МИН. По истечении 6 суток отбирают пробы, в которых определ ют число клеток и количество липидов. Число клеток составл ет 12-10 в рд-ном мл среды. Количество липидов 12% веса сухих клеток. Клетки сепарируют а из полученной сырой биомассы, количество которой составл ет 60 г на один литр среды, выдел ют липиды Дл  этого 200 г ,био 1ассы перенос т в стекл нную колбу, добавл ют экстракционный раствор, состо щий из смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1, в количестве 2 л (на 1 г биомассы необходимо 10 мл смеси). Полученную смесь став т на качалку на 10 ч. Экстракцию провод т при ком натной температуре и посто нном встр хивании . Лизированные клетки отфильт ровывают. К полученному экстракту до бавл ют 1/5 объема 0,74%-ного водного раствора КСЁ. Смесь став т на качалку на 2-5 мин дл  встр хивани  Перенос т в химический стакан и зали вают Дистиллированной водой. После расслоени  экстракта на две фазы: верхнюю - водно-метанольную, нижнюю хлорофорМенную стакан помещают на дно большего по объему сосуда, также заполненного дистиллированной водой дл  удалени  нелипидньх водорастворимых примесей. Сосуд оставл ют на холоду ,в течение 12 ч. Затем верхнюю фазу из химического стакана осторожно удал ют сифоном. Пограничньй слой, состо щий из липопротеидов, раствор ют метанолом. Метанол добавл ют небольшими порци ми по 5-10 мл до полного растворени  белого осадка липопротеидов . Экстракт высушивают над сернокислым натрием 24 ч и отфильтровывают . Органический растворитель отгон ют на роторном испарителе в вакууме при 10-20. мм рт.ст, и температуре 40-45с. Остаток в колбе представл ет собой общую липидную фракцию простейшего A.longa. Целевой продукт имеет следуюшрй состав, %: фосфолипиды 38,5 стерины . 6,2J мрноглицериды 2 диглицериды 6; свободные жирные кислоты 7, триглицериды 34,5; эфиры стеринов 8. Пример 2.. Дл  приготовлени  посевного, материала готов т среду, как это указано в примере.1. Колбы засевают культурой A.longa А-60, помещают на круговую качалку с числом оборотов 250 и встр хивают 6 сут. Отбирают пробы, определ ют число клеток в одном мл среды и количество липидов. Число клеток составл ет 12-10 в одном мл среды, количество липидов 10% веса сухих клеток . Дл  проведени  выращивани  A.longa А-60 готов т среду следующего состава , вес.%: этиловый спирт гидролизный 1,20; KH,jPO 0,046, (МН)НРО 0,064; 0,046; 0,00084, витамин В, 0,00026; витамин 0,000014 водопроводна  вода остальное , начальное значение рН 6,8, Далее провод т все операции, как это указано в примере 1, Устанавливаг ют режим аэрации 2-, 5 объема воздуха на один объём среды в.минуту. По истечении 6 сут отбирают пробы, в которых определ ют число клеток и количество липидов. Число клеток составл ет 14,-10 в одном мл среды, количество липидов - 14% веса сухих клеток. Клетки сепарируют, из сьфой

S 11289556 . ,

биомассы 66 г, вьщел ют липиды, какдержанием aKtHBHbix компонентов - поэто указано в примере 1. Целевойлиеновых жирных кислот (больше в

продукт имеет следующие характерис-1,5 раза), фосфолипидов - в 2 раза

тики: липидов 13% веса сухих клеток.больше, снизить продолжительность

Далее клетки сепарируют и вьдел ют5 культивировани  со 168-193 ч до 144,

липиды,как в примереМ.заменить пищевое сырье (спирт рекПредпагаемьш штамм и способ полу-тификат) на непищевое (спирт гидчени  из него биологически активно-ролизный), снизить себестоимость

го комплекса липидов позвол ет полу-1 кг целевого продукта в 2,0-2,5 раза

чить целевой продукт повьшенным со-Ю по сравнению с прототипом.

Claims (2)

1. Штамм Astasia longa А-60 , (коллекция Московского Государственного Университета им. В.М.Ломоносова)продуцент биологически активного комплекса липидов.

2. Способ получения биологичес ки активного комплекса липидов, включающий культивирование посевного материала при аэрации на среде, содержащей источник углерода, минеральные соли, витамины и воду, сепарирование, экстракцию полученной биомассы смесью хлороформа - метанола 2:1, очистку выделенного экстракта промывкой дистиллированной водой и последующее высушивание, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и активности целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм простейшего Astasia longa № А-60, аэрацию проводят при режиме 2,0-2,5 объема воздуха в 1 мин на 1 л среды, при этом посевной материал выращивают на круговой качалке при 220-250 оборотах в 1 мин.