SK9372003A3 - Low-lipoxygenase 1 barley - Google Patents
Low-lipoxygenase 1 barley Download PDFInfo
- Publication number
- SK9372003A3 SK9372003A3 SK937-2003A SK9372003A SK9372003A3 SK 9372003 A3 SK9372003 A3 SK 9372003A3 SK 9372003 A SK9372003 A SK 9372003A SK 9372003 A3 SK9372003 A3 SK 9372003A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- lox
- plant
- barley
- amino acid
- activity
- Prior art date
Links
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 title claims description 116
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 title description 118
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 143
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 claims abstract description 105
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 70
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 68
- 102100025386 Oxidized low-density lipoprotein receptor 1 Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 16
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 claims abstract 42
- 101710199789 Oxidized low-density lipoprotein receptor 1 Proteins 0.000 claims abstract 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 108
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 103
- BSAIUMLZVGUGKX-BQYQJAHWSA-N (E)-non-2-enal Chemical compound CCCCCC\C=C\C=O BSAIUMLZVGUGKX-BQYQJAHWSA-N 0.000 claims description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 31
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 22
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 17
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 16
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 11
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 7
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 7
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 5
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 4
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 4
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims 1
- 229940053200 antiepileptics fatty acid derivative Drugs 0.000 claims 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims 1
- 108090000128 Lipoxygenases Proteins 0.000 abstract description 234
- 102000003820 Lipoxygenases Human genes 0.000 abstract description 232
- 235000019640 taste Nutrition 0.000 description 50
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 32
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 31
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 21
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 19
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 18
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 17
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 17
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 15
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 15
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 15
- 101150106914 LOX1 gene Proteins 0.000 description 14
- 101150014436 LOX1.1 gene Proteins 0.000 description 14
- 101150086211 OLR1 gene Proteins 0.000 description 14
- 101100455173 Phaseolus vulgaris LOXA gene Proteins 0.000 description 14
- 101100182222 Solanum tuberosum LOX1.2 gene Proteins 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- HCZKYJDFEPMADG-TXEJJXNPSA-N masoprocol Chemical compound C([C@H](C)[C@H](C)CC=1C=C(O)C(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C(O)=C1 HCZKYJDFEPMADG-TXEJJXNPSA-N 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 101100128617 Arabidopsis thaliana LOX3 gene Proteins 0.000 description 10
- 101100455162 Arabidopsis thaliana LOX4 gene Proteins 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- 101100455161 Glycine max LOX1.3 gene Proteins 0.000 description 10
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 10
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 10
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 10
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 10
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 9
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 9
- JARKCYVAAOWBJS-UHFFFAOYSA-N hexanal Chemical compound CCCCCC=O JARKCYVAAOWBJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 8
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 8
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 229940098396 barley grain Drugs 0.000 description 7
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 7
- HCZKYJDFEPMADG-UHFFFAOYSA-N erythro-nordihydroguaiaretic acid Natural products C=1C=C(O)C(O)=CC=1CC(C)C(C)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 HCZKYJDFEPMADG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 7
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 108010050181 aleurone Proteins 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 6
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 6
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 6
- 229960003951 masoprocol Drugs 0.000 description 6
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 6
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 5
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 4
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 4
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091092236 Chimeric RNA Proteins 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 3
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 3
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000013124 brewing process Methods 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 3
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 3
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004890 malting Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 3
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 3
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 3
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- BFKLIGQXXNIIEL-ODZAUARKSA-N (z)-but-2-enedioic acid;hydrazine Chemical compound NN.OC(=O)\C=C/C(O)=O BFKLIGQXXNIIEL-ODZAUARKSA-N 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000252095 Congridae Species 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N Diacetyl Chemical group CC(=O)C(C)=O QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 101100128612 Glycine max LOX1.2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 2
- 101150046318 LOX2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100343701 Mus musculus Loxl1 gene Proteins 0.000 description 2
- ZRKWMRDKSOPRRS-UHFFFAOYSA-N N-Methyl-N-nitrosourea Chemical compound O=NN(C)C(N)=O ZRKWMRDKSOPRRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- YDBYJHTYSHBBAU-YFKPBYRVSA-N S-methyl-L-methioninate Chemical compound C[S+](C)CC[C@H](N)C([O-])=O YDBYJHTYSHBBAU-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000006085 Vigna mungo var mungo Nutrition 0.000 description 2
- 240000005616 Vigna mungo var. mungo Species 0.000 description 2
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- -1 carbon chain aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 150000001728 carbonyl compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- KSMVZQYAVGTKIV-UHFFFAOYSA-N decanal Chemical compound CCCCCCCCCC=O KSMVZQYAVGTKIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009483 enzymatic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 2
- 108010073854 lipoxygenase 3 Proteins 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 229960005173 methiosulfonium chloride Drugs 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 2
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- PMJHHCWVYXUKFD-PLNGDYQASA-N (3z)-penta-1,3-diene Chemical compound C\C=C/C=C PMJHHCWVYXUKFD-PLNGDYQASA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- JDSRHVWSAMTSSN-IRQZEAMPSA-N 13(S)-HPODE Chemical compound CCCCC[C@H](OO)\C=C\C=C/CCCCCCCC(O)=O JDSRHVWSAMTSSN-IRQZEAMPSA-N 0.000 description 1
- FOWNDZJYGGTHRO-DKWTVANSSA-N 2-aminoacetic acid;(2s)-2-aminobutanedioic acid Chemical class NCC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O FOWNDZJYGGTHRO-DKWTVANSSA-N 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241001677738 Aleuron Species 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N Aspartic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- VEJPZXZKCZQONO-UHFFFAOYSA-N CCCCCCCCCC(O)CCCC=CC=CC(=O)OO Chemical compound CCCCCCCCCC(O)CCCC=CC=CC(=O)OO VEJPZXZKCZQONO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical class S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 239000000867 Lipoxygenase Inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940122142 Lipoxygenase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- WRRQLBKKJXSSCZ-UHFFFAOYSA-N OOOC(CCCCCCCC)CCCCCCCCC Chemical compound OOOC(CCCCCCCC)CCCCCCCCC WRRQLBKKJXSSCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108700005079 Recessive Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000052708 Recessive Genes Human genes 0.000 description 1
- 101100473189 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) rpn1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical class OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N acetaldehyde Chemical compound [14CH]([14CH3])=O IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000658 coextraction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- SWULYVBHRSPZCK-UHFFFAOYSA-N diazonio(1,2,3-trihydroxypropyl)azanide Chemical compound OCC(O)C(O)[N-][N+]#N SWULYVBHRSPZCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000001993 dienes Chemical class 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 238000009300 dissolved air flotation Methods 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 150000002432 hydroperoxides Chemical class 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-M hydrosulfide Chemical compound [SH-] RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- PRFXRIUZNKLRHM-UHFFFAOYSA-N l-prostaglandin B2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1=C(CC=CCCCC(O)=O)C(=O)CC1 PRFXRIUZNKLRHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015095 lager Nutrition 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005360 mashing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMFJAHHVKNCGLG-UHFFFAOYSA-N n-Nitrosodimethylamine Chemical compound CN(C)N=O UMFJAHHVKNCGLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- HGBOYTHUEUWSSQ-UHFFFAOYSA-N pentanal Chemical class CCCCC=O HGBOYTHUEUWSSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical class [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N propane-1,1-diol Chemical compound CCC(O)O ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PRFXRIUZNKLRHM-OSJNIVAESA-N prostaglandin b2 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\C1=C(C\C=C\CCCC(O)=O)C(=O)CC1 PRFXRIUZNKLRHM-OSJNIVAESA-N 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
- C12C12/00—Processes specially adapted for making special kinds of beer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
- C12C1/00—Preparation of malt
- C12C1/18—Preparation of malt extract or of special kinds of malt, e.g. caramel, black malt
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
- C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
- C12Y113/11012—Linoleate 13S-lipoxygenase (1.13.11.12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
- C12C2200/00—Special features
- C12C2200/01—Use of specific genetic variants of barley or other sources of fermentable carbohydrates for beer brewing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Cereal-Derived Products (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Non-Alcoholic Beverages (AREA)
Description
Oblasť techniky
Vynález spadá do oblasti rastlinnej biotechnológie. Konkrétnejšie, vynález sa týka mutantného génu jačmennej lipoxygenázy 1 (/ox-í), ktorý kóduje enzým so značne zníženou aktivitou vytvárania kyseliny 9-hydroperoxyoktadekánovú. Vynález sa týka aj použitia kultivarov jačmeňa, ktoré sú homozygotné pre /ox-1, v procesoch varenia, aby sa znížilo vytváranie nežiadúcich chutí v pripravených produktoch, ako napríklad v pive, v priebehu uskladňovania.
Doterajší stav techniky
Lipoxygenázy sú rodinou enzýmov (EC 1.13.11.12), ktoré katalyzujú dioxidáciu voľných a esterifikovaných poly-nenasýtených mastných kyselín zahŕňajúcich 1(Z),4(Z)-pentadiénovú konfiguráciu. Produkty lipoxygenázou katalyzovaných reakcií boli dlho považované za hlavného vinníka objavovania sa stuchnutej vône v rastlinných zrnách/semenách a v potravinárskych produktoch odvodených od týchto zŕn/semien (Robinson a ďalší, 1995, Food Chem., 54: 33-43). Lipoxygenázy sa podieľali na produkcii prchavých hexanalaldehydov generovaných v priebehu spracovania sóje, ktoré majú neželateľnú arómu, obmedzujúcu použitie sójových proteínov v potravinárskych produktoch. Tri lipoxygenázové izozýmy exprimované v sójových semenách sú považované za podieľajúce sa na lipidovej oxidácii a na vytváraní hexanalu. Sójové mutanty, ktorým chýba jeden alebo viacero z týchto izozýmov, boli generované s cieľom znížiť vytváranie hexanalu a zlepšiť ich chuťovú stabilitu. Úspech tohto prístupu bol hodnotený v Hildebrand a ďalší, 1990,
-2J. Agric. Food Chem. 38: 1934-1936. Mutanty bez sójovéj lipoxygenázy 3 produkovali vyššie hladiny hexanalu, čo naznačuje, že tento izozým presmerúva 13hydroxyperoxyoktadekanoidy, produkované lipidovou oxidáciou, smerom k neprchavým produktom. Poľný pokus s trojitými nulovými sójovými líniami, ktorým chýbali všetky tri semenné lipoxygenázy, ukázal, že tieto enzýmy nie sú nevyhnutné pre normálne agronomické vlastnosti a vlastnosti semena (Narvel a ďalší, 1998, Crop Sci. 38: 926-928).
Lipoxygenázy sa podieľali aj na generovaní nežiadúcich chutí v ryži, ktoré sa môžu vyskytnúť v priebehu skladovania zŕn. V skladovaných zrnách je možné detegovať uvoľňovanie voľných mastných kyselín, čo indikuje metabolizovanie triglyceridových zásob. Zistilo sa, že varieta ryže Daw Dam akumuluje nižšie hladiny pentanalov a hexanalov, z čoho vyplýva lepšia chuťová stabilita pri uskladňovaní (Susuki a ďalší, 1999, J. Agric. Food Chem., 47: 1119-1124). Želateľný fenotyp sa prisúdil absencii ryžovej lipoxygenázy-3, ktorá oxiduje nenasýtené lipidové acylové reťazce, aby sa vytvorili 9-hydroxyperoxyoktadekánové pozičné izoméry.
Je dokázané, že lipoxygenázová dráha je komplex s mnohými vetvami a jej úloha v početných aspektoch rastlinného rastu a fyziológie nie je plne pochopená. Modifikácie lipoxygenázovej dráhy, ktoré menia 9-hydroperoxidačnú aktivitu v obilninách, sú navrhnuté na reguláciu ich náchylnosti na kontamináciu mykotoxínom prostredníctvom Aspergillus spp. (WO 97/26364), čo je v súlade so zahrnutím tejto dráhy v rezistencii rastlín voči patogénom, ale netýka sa to cieľov tu opísaného vynálezu.
Spomedzi mnohých aromatických prchavých látok, ktoré sa podieľajú na chuti piva, majú najmä vyššie nenasýtené aldehydy so 6-12 uhlíkovým reťazcom nízke organoleptické chuťové prahy (Meilgard 1975, MBAA Tech. Qart. 12: 151168). 7ra/?s-2-nonenal, ktorý je členom tejto skupiny, má aj extrémne nízky chuťový prah 0,11 ppb, aj sa podieľa na nepríjemnej slamovej, „lepenkovej“ chuti piva. Charakteristická nežiadúca chuť spôsobená ŕrans-2-nonenalom je zvyčajnou charakteristikou pív uskladňovaných 1 až 3 mesiace alebo dlhšie, najmä je škodlivá pre chuť ležiakového piva, ktoré je varené so svetlými sladmi a má delikátnu chuť.
O sírane je už dlho známe, že zlepšuje chuťovú stabilitu piva, nie len prostredníctvom viazania kyslíka a účinkovaním ako anti-oxidant, ale aj vytváraním
-3prchavých bisulfidových adičných zlúčenín s aldehydmi a ketónmi nachádzajúcimi sa v pive. Dvoma hlavnými zdrojmi síranu v pive sú síran produkovaný kvasinkami v priebehu fermentácie prostredníctvom síranovej asimilačnej dráhy, a druhou je síran pridávaný do piva pred balením. Fermentačné podmienky, ktoré zlepšujú produkciu a vylučovanie síranu kvasinkami, umožní vytváranie síranovo karbonylových aduktov z karbonylov nachádzajúcich sa v slade a bude zabraňovať ich ďalšiemu metabolizovaniu kvasinkami (Dufour 1991, Proc. Eur. Brew. Conv. Congr., Lisbon, str. 209-216). Týmto spôsobom sa karbonyly, ako napríklad acetaldehyd a diacetyl, môžu preniesť do piva. Schopnosť síranu zabrániť objaveniu sa karbonylovej zlúčeniny ŕrans-2-nonenalu v priebehu zretia piva bola demonštrovaná prostredníctvom varenia piva s kvasinkovým kmeňom, v ktorom bola blokovaná síranová asimilačná dráha (Johannesen a ďalší, 1999, Proc. Eur. Brew. Conv. Congr., Nice, str. 655-662). Po naliatí do fliaš sa pivo podrobilo urýchlenému zretiu jeho uskladnením pri 37 °C počas 7 dní, a potom sa zistilo, že hladiny frans-2-nonenalu boli dosť vysoko nad chuťovým prahom. Ak sa pridalo 10 ppm síranu do piva s nízkou hladinou síranu tesne pred nalievaním do fliaš, bolo objavenie sa ŕrans-2-nonenalu v priebehu urýchleného zretia významne znížené. Reakcia medzi síranom a karbonylovými zlúčeninami je reverzibilná a pod termodynamickou a kinetickou kontrolou. Rovnovážne konštanty pre bisulfidové zlúčeniny sú zjavne v rozsahu od 10‘6 M pre karbonylové zlúčeniny, ako napríklad acetaldehyd, hexanal a dekanal, do 10’3 pri diacetyl a pyruvát (Dufour 1991, supra). \J priebehu skladovania piva umožní výmena plynov cez balenie vstup kyslíka do piva a síran sa stratí, takže slabšie bisulfidové adukty budú disociovať, čo umožní voľným karbonylom objaviť sa v pive. Hoci síran neodškriepiteľné posiľňuje chuťovú stabilitu piva, najmä krátkodobo, jeho zadržiavanie v zabalenom pive je silne závislé na výmene plynov cez balenie a na teplote. V konečnom pive sú prirodzené hladiny síranu produkovaného v priebehu fermentácie variabilné a pridanie síranu pred napĺňaním do fliaš nie je univerzálne akceptovanou praxou. Z týchto dôvodov samotný síran neposkytuje spoľahlivý spôsob na zlepšenie dlhodobej chuťovej stability piva v rôznych podmienkach skladovania piva na svete.
Všeobecne sa akceptuje, že frans-2-nonenal nachádzajúci sa v pive vedie k oxidácii polynenasýtených mastných kyselín odvodených od lipidov v jačmenných
-4zrnách, kde sú najviac zastúpené mastné kyseliny s reťazcami s 18 uhlíkmi a kyselina linolénová (klasifikovaná ako 18:2, n-6 polynenasýtená mastná kyselina (Broun, Gettner a Sommerville 1999, Annu. Rev. Nutr. 19: 197-216)). Avšak v literatúre je len malý konsenzus čo sa týka mechanizmu ktorým sa vytvára trans2-nonenal. Bola navrhnutá prítomnosť enzymatickej dráhy vedúcej k vytváraniu frans-2-nonenalu z polynenasýtených mastných kyselín, ale jednotlivé enzymatické kroky neboli nikdy experimentálne demonštrované v jačmenných zrnách alebo v priebehu sladového procesu (Gardner 1988, Adv. Cereal Sci. Technol. 9: 161215). Na kontrolu vytvárania nežiadúcej chuti bol navrhnutý koncept použitia antisense alebo kosupresnej génovej technológie na redukciu hladín lipoxygenázy-1 v jačmennom zrne a tým na kontrolu 9-hydroperoxidácie a na zníženie hladín aldehydu a alkoholu v konečnom jačmennom zrne, ale výsledky takéhoto prístupu neboli zverejnené (McElroy a Jacobsen, 1995, Bio/Technology 13: 245-249).
Vyvinul sa test urýchľovania ako spôsob hodnotenia trans-2-nonenalového potenciálu piva, v ktorom sa indukuje vytváranie írans-2-nonenalu v slade alebo v pive vystavením vzoriek zvýšeným teplotám pri zníženom pH (100 °C, pri pH 4,0, 2 hodiny). Pokusy korelovať frans-2-nonenalový potenciál v slade a vo finálnom pive s celkovou úrovňou lipoxygenázovej aktivity v sušenom slade indikovali, že lipoxygenáza sa môže podieľať na objavení sa ŕrans-2-nonenalu v staršom pive (Drost a ďalší, 1990, J. Am. Soc. Brew. Chem. 48: 124-131). Avšak závery, ktoré je možné odvodiť z tejto štúdie sú veľmi limitované skutočnosťou, že lipoxygenázová aktivita v jačmennom slade bola regulovaná na konci sladového procesu prostredníctvom stupňa enzymatickej inaktivácie v priebehu sušenia v sušiarni. Takže sa skúmal len vplyv zvyškovej sladovej lipoxygenázovej aktivity na potenciál ŕrans-2-nonenalu v derivovanom slade a vo finálnom pive. Štúdia nebola schopná zhodnotiť lipoxygenázy, ktoré katalyzujú prvý krok v lipoxygenázovej enzymatickej dráhe v jačmennom zrne v priebehu vývoja a sladového procesu a ich úlohu ako determinantov hladín ŕrans-2-nonenalu nachádzajúcich sa v pive. V skutočnosti absencia jačmenných kultivarov deficientných v jednom alebo viacerých lipoxygenázových izoenzýmoch znemožnila poskytnutie presvedčivého dôkazu úlohy v lipoxygenázovej dráhe v jačmennom slade pri kontrole vytvárania tras-2nonenalu. Takéto experimenty sú potrebné na zhodnotenie podielu enzymatickej
-5dráhy, v porovnaní s auto-oxidatívnou/chemickou dráhou, na vytváraní trans-2nonenalu v pive. Prípravný proces zahŕňa krok varenia sladu pri vysokej teplote, kde sa predpokladá, že nastávajú tieto neenzymatické reakcie (Noel a ďalší, 1999, J. Agric. Food Chem. 47: 4323-4326).
Podstata vynálezu
Tento vynález poskytuje kultivar jačmeňa, ktorý má značne zníženú aktivitu lipoxygenázy-1. V jednom uskutočnení jačmenné rastliny podľa vynálezu obsahujú mutantný lox-1 gén exprimujúci značne znížené hladiny izoenzýmu lipoxygenázy-1. V alternatívnom uskutočnení jačmenné rastliny obsahujú heterológnu nukleokyselinovú sekvenciu exprimujúcu antisense sekvenciu štandardného lox-1, čim sa znižuje enzymatická aktivita.
Ako je tu ukázané, slad a sladina vyrábané z jačmeňa so zníženou aktivitou lipoxygenázy podľa vynálezu, napríklad z jačmenných kultivarov homozygotných v mutantnom lox-1 géne, sú užitočné na výrobu piva, ktoré má významne zlepšenú chuťovú stabilitu a znížené hladiny ŕrans-2-nonenalu, najmä v podmienkach, o ktorých je známe, že podporujú objavenie sa T2N. Vynález demonštruje koreláciu medzi aktivitou jačmennej sladovej lipoxygenázy-1 pri produkcii kyseliny 9hydroxyperoxy-oktadekadiénovej (9-HPOD) a prítomnosťou ŕrans-2-nonenalu v pive. Vynález ďalej demonštruje, že použitie jačmeňa homozygotného pre mutantný lox-1 gén v prípravnom procese zlepšuje chuťovú stabilitu piva, tak v priebehu uskladňovania, ako aj pri vystavení zvýšeným skladovacím teplotám. Tieto vlastnosti zlepšujú kvalitu piva a sú užitočné na predlžovania trvanlivosti a znižujú potrebu chladiť pivo v priebehu transportu a skladovania.
Vynález poskytuje rastliny jačmeňa a ich časti, ktoré majú zníženú aktivitu lipoxygenázy-1, vrátane rastlín jačmeňa exprimujúcich LOX-1 proteín, ako je tu opísaný, ako aj spôsoby výroby takýchto rastlín jačmeňa, častí rastlín, rastlinných produktov a najmä sladových a pivových produktov vyrábaných z rastlín jačmeňa podľa vynálezu.
-6Stručný prehľad obrázkov
Obrázok 1 predstavuje graf znázorňujúci vplyv inhibítora, kyseliny nordihydroguaiaretovej (NDGA), na aktivitu imuno-afinitne purifikovaných lipoxygenáz 1 a 2 z embryí trojdňových klíčiacich jačmenných zŕn.
Obrázok 2 predstavuje graf znázorňujúci čerstvú hmotnosť vyvíjajúceho sa zrna línie G a cv Vintage od 5 dní po kvitnutí do úplnej zrelosti (FM). Každé stanovenie predstavuje priemer hmotnosti jediného zrna zo 6 klasov.
Obrázok 3 predstavuje graf znázorňujúci suchú hmotnosť vyvíjajúceho sa zrna línie G a cv Vintage od 5 dní po kvitnutí do úplnej zrelosti (FM). Každé stanovenie predstavuje priemernú hmotnosť jedného zrna z troch vzoriek po 5 zŕn.
Obrázok 4 predstavuje graf znázorňujúci celkovú lipoxygenázovú aktivitu vo vyvíjajúcom sa zrne línie G a cv Vintage od 5 dní po kvitnutí do úplnej zrelosti (FM).
Obrázok 5 predstavuje graf znázorňujúci 9- a 13-HPOD produkty oxidácie kyseliny linolénovej prostredníctvom lipoxygenázovej aktivity vo vyvíjajúcom sa zrne línie G.
Obrázok 6 predstavuje graf znázorňujúci celkovú lipoxygenázovú aktivitu v embryách klíčiacich zŕn línie G a cv Vintage vyjadrenú v pmol/min/10 embryí (U/10 embryí).
Obrázok 7 predstavuje graf znázorňujúci 9-HPOD a 13-HPOD produkty oxidácie kyseliny linolénovej prostredníctvom lipoxygenázovej aktivity v embryách klíčiacich zŕn línie G a cv Vintage, znázorňujúc hladiny 9-HPOD a 13-HPOD.
Obrázok 8 predstavuje Western blot znázorňujúci imunodetekciu lipogenázy 1 v embryách vyvíjajúceho sa zrna línie G a cv Vintage (wt) od 5 dní po kvitnutí do úplnej zrelosti (FM).
Obrázok 9 predstavuje Western blot znázorňujúci imunodetekciu lipoxygenázy 1 v embryách zŕn línie G a cv Vintage (štandard) klíčiacich 0 až 6 dní.
Obrázok 10 prestavuje Northern blot, pri ktorom bola použitá sonda s 3' netranskribovanou oblasťou lox-1 cDNA, a znázorňuje lipoxygenázové 1 transkripty detegované vo vyvíjajúcich sa zrnách línie G a cv Vintage (štandard) od piatich dní po kvitnutí do úplnej zrelosti (FM).
-7Obrázok 11 prestavuje Northern blot, pri ktorom bola použitá sonda s 3' netranskribovanou oblasťou lox-1 cDNA, a znázorňuje lipoxygenázové 1 transkripty detegované v embryách vyvíjajúcich sa zŕn línie G a cv Vintage (štandard) klíčiacich 0 až 6 dní.
Obrázky 12A až 12G predstavujú zoradenie nukleotidových sekvencií promótorovej a transkribovanej oblasti lox-1 štandardnej cv Vintage alely (WT) a línie G alely (LG). V génových sekvenciách sú transkripčné štartovacie miesto (+1), ATG štartovací kodón (+69) a translačný stop kodón (+4231) podčiarknuté. Nukleotidové mutácie identifikované v línia G alele sú vytlačené hrubou kurzívou a sú označené hviezdičkou.
Obrázok 13 je schematickým znázornením lox-1 génu cv Vintage (štandard) a mutantného lox-1 génu línie G. Transkript od +1 do +4375 je zložený zo 7 exónov (bodkované obdĺžniky) a 6 intrónov (biele obdĺžniky). Označené sú dve mutácie v lox-1 géne.
Obrázok 14 predstavuje schematické znázornenie génových kaziet na prechodnú expresiu štandardnej lox-1 cDNA a lox-1 génu a mutantného lox-1 génu z línie G. Sekvencie klonujúce lipoxygenázu boli klonované medzi konštitutívny kukuričný ubiquitínový promótor s intrónom 1 (Ubi-1) a nos terminátor.
Obrázok 15 predstavuje stĺpcový graf znázorňujúci aktivitu lipoxygenázy 1 v jačmenných aleurónových protoplastoch transfekovaných s génovými kazetami obsahujúcimi štandardnú lox-1 cDNA; mutatný lox-1 gén z línie G; štandardný lox-1 gén; a kontrolný GUS reporterový gén. Lipoxygenázové aktivita v extraktoch transfekovaných protoplastov sa testovala v mikrotitračných platniach prostredníctvom oxidácie Kl a kvantifikovala sa spektrofotometricky. Aktivita lipoxygenázy 1 sa vyjadrila ako jednotky na pg proteínu v extrakte a je znázornená ako priemer 3 meraní z 2 replikačných testov.
Obrázok 16 predstavuje zoradenie sekvencií demonštrujúce, že RFLP medzi štandardným a mutantným lox-1 génom je spôsobený bodovou mutáciou v nukleotide 2347, ktorá vytvára ďalšie Aaffl reštrikčné miesto.
Obrázok 17 predstavuje schematické znázornenie lox-1 PCR fragmentov amplifikovaných a štiepených v polymerázovej reťazovej reakcii - testom štiepenia amplifikovaného polymorfného miesta (PCR-CAPS). Polohy PCR primerov sú
-8označené šípkami a AatU miesta sú znázornené nad génom (ako sekvenčná poloha). Exónové a intrónové oblasti vo vnútri PCR produktu sú rozlíšené ako bodkované obdĺžniky, respektíve ako biele obdĺžniky, a sú uvedené veľkosti Aaŕll štiepnych fragmentov.
Obrázok 18 predstavuje elektroforetický agarózový gél znázorňujúci lox-1 PCR fragmenty (652 bp) amplifikované v prvom kroku PCR-CAPS testu z línie G a z cv Vintage genomickej DNA.
Obrázok 19 predstavuje elektroforetický agarózový gél znázorňujúci RFLP detegované prostredníctvom PCR-CAPS v štandardnom a v mutantnom lox-1 géne. AaíII štiepne fragmenty mutantného génu zahŕňajú jediný 313bp reštrikčný fragment označený hviezdičkou.
Obrázok 20 predstavuje tabuľku znázorňujúcu program na spätné kríženie pre jediný recesívny génový pár II (znak nízkej aktivity lipoxygenázy) línie G s cv Alexis. LL genotyp sú rastliny exprimujúce štandardnú lipoxygenázovú aktivitu (dominantná alela), II genotyp sú rastliny exprimujúce nízku lipoxygenázovú aktivitu (recesívna alela). Ll sú heterozygotné rastliny obsahujúce tak štandardnú alelu, ako aj alelu pre nízku lipoxygenázovú aktivitu. Po každom kole spätného kríženia (vrátane samoopelenia) sa očakáva, že II potomstvo predstavuje 25 % potomstva. Uvedené sú pozorované frekvencie nízkej lipoxygenázovej aktivity. Vypočítané cv Alexis genetické pozadie majúce homozygotnú alelu pre nízku aktivitu lipoxygeázy je označené ako % Alexis.
Obrázok 21 predstavuje elektroforetický agarózový gél znázorňujúci PCRCAPS detekciu mutantného lox-1 génu v II potomstve programu spätného kríženia línie G - Alexis. PCR-CAPS test genomickej DNA línie G (dráha 2), cv Vintage (dráha 3), II potomstvo 3. spätného kríženia (dráha 4) a 4. spätného kríženia (dráhy 5 až 9). DNA rebrík (dráha 1). Kontrola, spätne krížená línia s vysokou lox aktivitou (dráha 10).
Obrázky 22A až 22B predstavujú komparatívne zoradenie aminokyselinových sekvencií sójových lipoxygenáz LOX-1 (Gm1), LOX-2 (Gm2), LOX-3 (Gm3) a jačmenných lipoxygenáz LOX-1 (Hv1) a LOX-2 (Hv2).
-9Podrobny opis vynálezu
V súlade s predmetom vynálezu sú poskytnuté rastlinné materiály, rastlinné produkty a spôsoby na produkciu nápoja, ako napríklad piva, ktorý má znížený obsah ŕrans-2-nonenalu, zlúčeniny s nežiadúcou chuťou, takže sa zlepši chuťová stabilita nápoja, napríklad piva, počas skladovania a vystavenia zvýšeným teplotám, v porovnaní s kontrolnými nápojom. Konkrétnejšie vynález poskytuje variety, ktorých vyvíjajúce sa a klíčiace zrno produkuje značne zníženú aktivitu enzýmu lipoxygenázy-1, označenú LOX-1, ktoré, napríklad, keď sa použijú v procese varenia piva, vedú k pivu so zníženými hladinami ŕrans-2-nonenalu, v porovnaní s kontrolnou jačmennou varietou.
Spôsoby použité na generovanie, charakterizáciu a hodnotenie jačmennej variety majúcej značne zníženú LOX-1 aktivitu, a použitie tohto typu jačmeňa na výrobu chuťovo stabilného piva sú opísané nižšie.
1. Definície
Tak ako sa používajú tu, majú nasledujúce výrazy uvedené definície:
„Rastlinná časť“ znamená rastlinu alebo špecifickú časť rastliny, ako napríklad stonku, listy, korene, kvety, semená, zrná, plody alebo puky.
„LOX-1“ znamená lipoxygenázový-1 proteín; „lox-1“ znamená gén kódujúci LOX-1.
„Mutantný jačmenný lox-1“ znamená mutovaný jačmenný gén kódujúci mutantný lipoxygenázový 1 polypeptid.
„Nemutovaná kontrola“ znamená rastlinu, nukleovú kyselinu, gén, polypeptid, rastlinnú časť alebo rastlinný produkt obsahujúci štandardný gén alebo proteín.
„Heterológny“ znamená inú ako natívnu sekvenciu, napr. sekvenciu odvodenú z iných druhov alebo rekombinantne skonštruovanú alebo syntetickú sekvenciu, ktoré sa líšia od natívnej sekvencie.
„Rastlinný produkt“ znamená produkt, ktorý je výsledkom spracovania rastliny alebo rastlinnej časti, a zahŕňa napríklad slad a sladinu.
„Kyslá aminokyselina“ znamená kyselinu asparágovú alebo glutámovú.
- 10„Zásaditá aminokyselina“ znamená treonín, serín, tyrozín, tryptofán, asparagín alebo glutamín.
„Uvarený produkt znamená produkt pripravený roztlačením, varením a fermentovaním, napr. pivo.
„Redukovaný ŕra/?s-2-nonenaľ‘ znamená znížený na menej ako približne 50 % v porovnaní so štandardnými (kontrolnými) podmienkami.
2. Lipoxygenázová aktivita
Lipoxygenázové enzýmy katalyzujú oxidáciu polynenasýtených mastných kyselín. V jačmeni sú známe izoenzými LOX-1 a LOX-2. LOX-1 primárne katalyzuje 9-hydroperoxidáciu, pričom LOX-2 primárne katalyzuje 13-hydroxyperoxidáciu polynenasýtených oktadekánových mastných kyselín. Údaje uvedené v príkladoch, nižšie, demonštrujú koreláciu medzi aktivitou jačmennej LOX-1 9-hydroperoxidácie a prítomnosťou Mans-2-nonenalu v pive. Z toho vyplýva, že jačmeň majúci zníženú LOX-1 aktivitu je užitočný na výrobu piva so zníženou hladinou a/alebo potenciálom ŕrans-2-nonenalu v porovnaní s kontrolou.
3. Produkcia jačmeňa s nízkou aktivitou lipoxygenázy
Na produkciu rastlín podľa vynálezu, teda na zníženie exprimovanej aktivity enzýmu lipoxygenázy 1 v jačmennej rastline stabilným, dedičným spôsobom, sa môžu použiť rôzne známe genetické prístupy. Tieto prístupy zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na antisense technológiu a mutagenézu, ako napríklad chemicky a žiarením indukovanú mutagenézu, ako aj miestne špecifickú mutagenézu.
Transformácia jačmeňa
Jačmeň sa môže transformovať rôznymi nukleokyselinovými molekulami skonštruovanými na manipuláciu lox-1 génovej expresie alebo na zmenu architektúry lox-1 génu. Na úspešné zavedenie nukleových kyselín do jačmennej bunky, napríklad do protoplastu, kalusu alebo embrya, môžu byť použité rôzne metódy, napríklad transfer sprostredkovaný s Agrobacterium tumofaciens (Tingay a ďalší, 1997, Plánt J., 11: 1369-1376), bombardovanie časticami (Wan a Lemaux, 1994, Plánt Physiol., 104: 37-48) alebo príjem DNA sprostredkovaný polyetylénglykolom (PEG) (Funatsuki a Kihara, 1995,Theor. Appl. Genet., 91:707712).
Na poháňanie expresie daného génu môžu byť použité rôzne promótory. Napríklad môžu byť použité lox-1 obsahujúce vektory zahŕňajúce antisense sekvencie, natívnu lox-1 promótorovú oblasť. Promótorová sekvencia lox-1 je obsiahnutá v nukleotidoch 2602-3511, ktoré zahŕňajú 5' UTR z EMBL s prístupovým číslom U83904. Alternatívne môžu byť použité promótory, ktoré poháňajú expresiu daného génu konštitutívne, napríklad Ubi 1 kukuričný ubiquitínový promótor (Wan a Lemaux, vyššie; Kjaerulff a ďalší, v P. Mathis, vyd. 1995, Photosynthesis: from Light to Biosphere, zv. II, 151-154). Expresné vektory môžu obsahovať aj transkripčnú terminačnú oblasť, napríklad 3' terminátor nopalínového syntázového génu (3'-nos) (Brevan a ďalší, 1983, Nucl. Acids Res., 11: 369-385) môže byť fúzovaný s génmi exprimovanými v transgénnom jačmeni (Wan a Lemaux, vyššie; Funatsuki a Kihara, vyššie).
Expresné vektory môžu obsahovať aj gén, ktorý umožňuje selekciu transformovaných buniek, keď bol vektor úspešne integrovaný do bunky. Tieto gény môžu kódovať antibiotikovú alebo herbicídovú rezistenciu, napríklad neomycín fosfotransferázový (npŕ) alebo fosfinotrién acetyltransferázový (bar) gén. Keď sa exprimujú, takéto rezistenčné gény umožňujú rast transformovanej bunky v médiu obsahujúcom neomycín, respektíve bialofos (pozri napríklad Wan a Lemaux, vyššie; Funatsuki a Kihara, vyššie; Kjaerulff a ďalší, v P. Mathis, vyššie).
Po transformácii môžu bunky určitý čas rásť v selektívnych médiách a potom sa môžu kultivovať, aby sa umožnilo vytvorenie klíčkov, následne koreňových systémov a potom rastliniek. Úspešná procedúra na transformáciu jačmeňa bola vyvinutá Funatsukim a Kiharom (vyššie), kde sú výsledkom transformácie jačmenných protoplastov prostredníctvom PEG s expresnými vektormi obsahujúcimi neomycín fosfotransferázu a následnej selekcie v neomycíne rastliny, obsahujúce transgén. Ukázalo sa, že transgén sa integruje do genómu a väčšina transgénnych rastlín exprimuje proteín kódovaný transgénom. Tieto rastliny boli schopné aj prenášať a exprimovať transgén po kríženiach.
Je zrejmé, že rôzne metódy transformácie, expresné vektory, promótory, selektovateľné markery a podobne, sú známe a užitočné na transformáciu jačmeňa.
- 12Mutagenéza jačmeňa
Lox-1 gén môže byť podrobený miestne špecifickej mutagenéze použitím chimérnych RNA/DNA oligonukleotidov. Ukázalo sa, že tieto chimérne RNA/DNA oligonukleotidy úspešne zavádzajú mutácie do rastlinných buniek (Zhu a ďalší, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8768-8773; a Beetham a ďalší, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8774-8778) a do cicavčích buniek (Yoon a ďalší, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 2071-2076) v požadovaných lokalitách. Chimérne RNA/DNA oligonukleotidy sa môžu transformovať do daných jačmenných protoplastov alebo buniek rôznymi spôsobmi, napríklad použitím PEG-sprostredkovanej transformačnej metódy, alebo transformačnej metódy prostredníctvom bombardovania časticami, ktoré sú opísané vyššie. Jednotlivé protoplasty alebo bunky sa potom môžu regenerovať tkanivovou kultiváciou na kompletné fertilné rastliny a mutovanie môže byť potvrdené a sledované napríklad použitím prístupu založeného na PCR, ako bude podrobne uvedené v nižšie v príkladoch.
Metóda miestne špecifickej mutagenézy môže byť použitá na mutovanie špecifických zvyškov v lox-1 géne. Lox-1 gén môže byť mutovaný v jednej alebo vo viacerých nukleotidových polohách v promótorovej oblasti, aby sa znížila alebo zrušila lox-1 transkripcia. Špecifická mutagenéza sa môže aplikovať aj na zavedenie zmien do lox-1 kódujúcej oblasti, napríklad na zníženie enzýmovej aktivity. Takéto mutácie zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na inzercie, delécie a substitúcie, ktoré vedú k posunu rámca, skráteniu LOX-1 proteínu a/alebo zmene neutrálnej a hydrofóbnej povahy enzýmovej substrátovej kavity.
Antisense expresía
Redukcia lox-1 expresie sa môže dosiahnuť aj prostredníctvom expresie lox1 antisense konštruktu v jačmenných bunkách. Metódy na expresiu antisense konštruktov v jačmeni na zníženie expresie cieľového proteínu boli zverejnené napríklad vGilpin, M.J. a ďalší, 1998, v Photosynthesis: Mechanisms and Effects, G. Garab, vyd., zv. IV, 2983-2986; Kjaernulff a ďalší, 1995, v Photosynthesis: from Light to Biosphere, P. Mathis, vyd., zv. II, 151-154).
- 13Jačmenné bunky sa môžu transformovať s expresným konštruktom obsahujúcim anitsense nukleokyselinovú sekvenciu. Expresný konštrukt produkuje antisense RNA molekulu schopnú špecificky sa viazať aspoň na časť mRNA produkovanej zo štandardného lox-1 génu prostredníctvom komplementárneho párovania báz, a je schopný prerušiť zostrih pre-mRNA alebo transláciu tejto mRNA. Expresiu antisense n u kleo kyselinovej sekvencie môže poháňať konštitutívny alebo tkanivovo/časovo špecifický promótor.
Chemická mutagenéza
Chemický mutagén azid sodný (NaN3) bol bežne používaný na mutagenézu jačmeňa a je známe, že indukuje stabilné mutácie v DNA (kyselina deoxyribonukleová) sekvencii jačmenného genómu (Olsen a ďalší, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8043-8047). Na indukciu DNA mutácií môžu byť použité aj iné chemické mutagény (Rank, J. a ďalší, 1997, Mutat. Res. 390:121-7), ako napríklad etylmetánsulfonát (EMS), azidoglycerol (AG, 3-azido-1,2-propándiol), metylnitrózomočovina (MNU) a hydrazín kyseliny maleínovej (MH), ako aj UV žiarenie.
Ako je uvedené nižšie v príkladoch, na zrná jačmenných kultivarov (cv Vintage a Caruso sa pôsobilo azidom sodným a tieto kultivary sa rozmnožovali samoopelením až do 3. generácie (M3).
4. Identifikácia a selekcia jačmeňa s nízkou aktivitou lipoxygenázy
Identifikácia a selekcia rastlín jačmeňa, ktoré majú zníženú lipoxygenázovú izoenzýmovú aktivitu v zrnách, sa môže dosiahnuť napríklad analýzou lipoxygenázovej aktivity. Enzymatické testy sa môžu použiť na determináciu aktivity dvoch hlavných lipoxygenáz, o ktorých je známe, že sa nachádzajú buď v zrelých, alebo v klíčiacich zrnách, LOX-1, respektíve LOX-2.
Jeden selektívny test LOX-1 a LOX-2 je založený na oxidácii polynenasýtenej mastnej kyseliny lipoxygenázou a na spektrofotometrickej detekcii hydroperoxidového produktu takejto oxidácie. Špecificita tohto testu pre LOX-1 využíva výhodu komparatívnej necitlivosti LOX-1 voči inhibítoru, napríklad NDGA, vzhľadom na LOX-2.
-14Selektivny test sa môže dosiahnuť aj použitím imunoprecipitácie na selektívne odstránenie LOX-1 alebo LOX-2 z testu. Špecifické anti-LOX-1 a antiLOX-2 protilátky, napríklad monoklonálne protilátky, sa môžu pripraviť z purifikovaného LOX-1 alebo LOX-2, ako je opísané v Holtman a ďalší, 1996, vyššie.
Tieto testovacie metódy sa môžu adaptovať pre mikrotitračné platňové testovacie postupy, alebo iné známe opakovacie testovacie formáty s vysokou účinnosťou, čo umožňuje rýchli skríning mnohých vzoriek. Tieto testy sa môžu upraviť na skríning klíčkových vrcholov klíčiacich zŕn nedeštruktívnym spôsobom tak, aby sa sadenice vybrané v skríningu mohli ďalej množiť.
Strata LOX-1 aktivity v domnelých mutantoch sa môže potvrdiť testom na enzymatickú aktivitu. Napríklad, extrakty zŕn sa môžu inkubovať s kyselinou linoleovou a oxidačné produkty kyseliny linoleovej sa môžu analyzovať napríklad reverznou fázovou HPLC. Relatívne množstvá 9-HPOD a 13-HPOD vytvorených z kyseliny linoleovej poskytujú mieru LOX-1 aktivity, ktorej hlavným produktom je 9HPOD.
Ako je ukázané nižšie v príkladoch, približne 20 000 zŕn M3 generácie mutovaného cv Vintage a cv Caruso sa skrínovalo na LOX-1 a LOX-2 aktivitu oxidačným testom v prítomnosti inhibítora a aj prostredníctvom imunoprecipitačných testov. Použitím týchto skríningových metód sa našiel mutant v cv Vintage majúci veľmi redukovanú LOX-1 aktivitu a označil sa línia G. Mutantný fenotyp sa dedil v M4 a M5 generácii.
Semená produkované jačmeňom línie G sa uložili 4. januára, 2001 v National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB243RY, Škótsko, UK, v súlade s Budapeštianskou dohodou pod prístupovým číslom: NCIMB 41078.
5. Genetické sekvencie
Presný opis genotypovej zmeny, ktorá je zodpovedná za fenotyp nízkej lipoxygenázovej aktivity v jačmenných rastlinách podľa vynálezu, je užitočný na identifikáciu rastlín majúcich túto genetickú zmenu a na vkríženie tejto genetickej vlastnosti do iných jačmenných kultivarov v šľachtiteľskom programe. Rôzne známe
- 15molekulárne a biochemické metódy môžu byť použité na determináciu genetických základov fenotypu s nízkou lipoxygenázovou aktivitou.
Je vo všeobecnosti akceptované, že tak c/s-účinkujúce, ako aj transúčinkujúce genetické sekvencie môžu determinovať expresiu daného génu v genóme a aktivitu génového produktu. Riadiace body v génovej expresii zahŕňajú reguláciu časovania, tkanivovej špecificity a rýchlosti génovej transkripcie, stabilitu transkriptu a rýchlosť translácie transkriptu. Tak úroveň génovej expresie, ako aj stabilita a špecifická aktivita kódovaného enzýmu budú determinovať úroveň enzýmovej aktivity detegovanej v tkanive.
Zmeny v rastlinnej génovej sekvencii sa môžu determinovať DNA sekvenovaním známych relevantných častí genómu, zatiaľ čo Northern analýza poskytuje nástroj na monitorovanie hladín stabilných transkriptov v danom rastlinnom tkanive. Enzým exprimovaný v rastlinnom tkanive sa môže hodnotiť prostredníctvom extrahovania enzýmu z tkaniva a merania enzymatickej aktivity.
Ako je ukázané nižšie v príkladoch, identita genetických zmien, ktoré determinujú fenotyp mutantnej línie G s nízkou aktivitou lipoxygenázy indukovaný v cv Vintage, sa determinovala nasledujúcim spôsobom. Štrukturálny gén kódujúci LOX-1 proteín tak v rodičovskom cv Vintage, ako aj v línii G, sa amplifikoval polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) a protiprúdové promótorové sekvencie, ktoré regulujú expresiu génu, ako aj celá kódujúca sekvencia obsahujúca intrónové a exónové sekvencie sa sekvenovali.
Porovnanie nukleotidových sekvencii lox~1 génu z línie G a zo štandardného cv Vintage odhalilo 2 nukleotidové substitúcie v 2 exónoch, z ktorých jedna (v polohe +2347) viedla k nekonzervatívnej aminokyselinovej substitúcii (glycín368 -> aspartát) v exprimovanom proteíne.
Obrázok 22 znázorňuje zoradenie sójových (Gm: Glycine max. L) lipoxygenáz LOX1 (prístup, č. P08170); LOX2 (prístup, č. P08170), LOX3 (prístup, č. AAB41272) a jačmenných (hv: Hordeum vulgare) lipoxygenáz LOX1 (prístup, č. P29114) a LOX2 (prístup, č. AAB70865.1). Konzervatívne aminokyselinové zvyšky a konzervatívne substitúcie nabitých zvyškov sú vytlačené tučné. Nad zoradením sú označené sekundárne štruktúry LOX3 zo sóje Glycine max, kde H = alfa závitnice a E = beta vlákna, a zvyšky relevantné pre funkciu enzýmu (označené hviezdičkou
-16alebo plným krúžkom) sú znázornené ako je opísané v Skrzypczak-Jankun a ďalší, 1997, Proteins 29:15-31.
Aminokyselinové zvyšky, ktoré sa podieľajú na viazaní iného ako hemoglobínového železa, alebo ktoré sú nevyhnutné pre katalýzu (*) sójovej LOX3, zahŕňajú: H518, H523, H709 [3N atómy]; N713, Is57· Ekvivalentné zvyšky v jačmennej LOX1 sú H517, H522, H708> N7i2 a l862- Zvyškami v sójovej LOX3 s predpokladanou úlohou pri katalýze (*) sú: H266, H531, H776, F3e4, F272, F714, W519, R552, R726, D766. D779, K278· Ekvivalentnými zvyškami v jačmennej LOX1 sú: H261> H512> H775, F259, F267, F713, W5I8, Rs51, R735> D778 a K271·
Prolínové (Ρβ6, 109, lez, 171, 223, 234, 291, 311, 324, 343, 345, 371, 381, 382, 426, 541, 548, 600, 616. 627, 685, 726, 734, 788, 829, 833, 839, 857) θ glyCÍnOVÓ (G49, 67, 68, 70, 91, 107, 137, 187, 192, 210, 217, 218, 260, 306, 307, 336, 392, 409, 458, 474, 490, 569, 607, 674, 676, 720, 736, 783, 828, 850, 85δ) ZVyŠky (+) Umiestnené v slučkách a v helixových krycích polohách v proteínových sekundárnych štruktúrach, môžu uľahčovať ostré otočky a skladanie peptidovej kostry.
Zo zoradenia príbuzných rastlinných lipoxygenáz vyplynulo, že glycín 368 v jačmennej LOX-1 je silne konzervatívny. Navyše, tento zvyšok, ktorý zodpovedá glycínu 353 v sójovej LOX-1, je jedným z 35 vysoko konzervatívnych zvyškov z celkovo 58 zvyškov, ktoré lemujú substrátovú dutinu II enzýmu, ako je vidieť z kryštálovej štruktúry. Tieto konzervatívne zvyšky sú zvýraznené (boxy) v zoradení rastlinných lipoxygenázových sekvencii znázornených na obrázku 22 (Minor a ďalší, 1996, Biochemistry 35: 10687-10701) a zahŕňajú nasledujúce jačmenné LOX-1 ZVyŠky: Y234, L268, W364, G368> V369, N370, I374. L424, L4g9, K501, A503, V504, D508, S509, H512. Q513, L514, H517, W518, H522, <556. L559, A56O, L564, Is65, <570. T574· S585, Q715, Y7I8, N724, R725, P726. T727, i-772 a Is62-Všetky okrem 7 z 35 konzervatívnych zvyškov sú neutrálne alebo hydrofóbne zvyšky. Je pravdepodobné, že substitúcia nabitého zvyšku v polohe glycín 368 v jačmeni alebo iného konzervatívneho neutrálneho alebo hydrofóbneho zvyšku lemujúceho substrátovú dutinu II poruší štrukturálne a funkčné vlastnosti enzýmu. G->D168 mutácia v jačmennej LOX1(<) línie G je lokalizovaná medzi alfa závitnicou H6 a beta vláknom E12.
Ako je znázornené na obrázku 22, lipoxygenázová rodina enzýmov zdieľa vysoký stupeň sekvenčnej konzervatívnosti, ktorá sa odráža v konzervatívnej sekundárnej štruktúre determinovanej pre niekoľko členov rastlinnej lipoxygenázovej rodiny vrátane sójovej LOX1 a LOX3 (Skrzypczak-Jankum a ďalší, 1997, vyššie). Jačmenná LOX1 zdieľa 56,9% sekvenčnú identitu a 67,8% sekvenčnú podobnosť so sójovou LOX3. Niekoľko aminokyselinových zvyškov v sójovom LOX3 izoenzýme bolo identifikovaných ako ligandy pre iné ako hemoglobínové železo, alebo sú navrhnuté ako nevyhnutné pre jej aktivitu (označované s * ·). Vzhľadom na vysokú sekvenčnú konzervatívnosť medzi jačmennou LOX1 a sójovou LOX3 je opodstatnené predpokladať, že zvyšky v jačmennej LOX1 sekvencií, ktoré sú homologické so zvyškami identifikovanými ako dôležité pre funkciu LOX3, môžu byť tiež nevyhnutné pre enzymatickú aktivitu. Takže nekonzervatívne aminokyselinové substitúcie v ktorejkoľvek z týchto polôh, vrátanie substitúcií týchto zvyškov v jačmennej LOX1, ktoré zodpovedajú 35 vysoko konzervatívnym zvyškom sójovej LOX3, ktoré lemujú substrátovú dutinu, a v iných polohách nevyhnutných pre enzymatickú aktivitu, pravdepodobne znižujú lipoxygenázovú aktivitu.
Je známe, že aminokyselinové zvyšky prolín a glycín uľahčujú otáčanie v peptidovej väzbe, keď sú umiestnené medzi sekundárnymi štrukturálnymi elementmi, ktoré umožňujú proteínu zaujať poskladanú terciárnu štruktúru. Prolínové a glycínové zvyšky sú bežné aj v závitnicových ukončovacích motívoch (Parker a Hefford, 1997, Protein Eng., 10: 487-496, http://www.expasy.ch). Jediná nekonzervatívna substitúcia v LOX1 línie G, kde je glycín umiestnený medzi dvoma predpokladanými štrukturálnymi elementmi nahradený aspartátom, vedie k významnej strate enzýmovej aktivity. Takže sa predpokladá, že mutácia v lox-1 géne spôsobujúca nekonzervatívne aminokyselinové substitúcie v jednom alebo vo viacerých z prolínových alebo glycínových zvyškov v jačmennej LOX1, ktoré sú umiestnené v oblastiach mimo štrukturálnych elementov, môže podobne zabraňovať poskladaniu natívneho proteínu a tým redukovať aktivitu kódovaného enzýmu.
Takže v jednom uskutočnení obsahuje užitočná mutantná jačmenná rastlina podľa vynálezu, majúca zníženú aktivitu lipoxygenázy 1, mutovanú nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá mení neutrálnu alebo hydrofóbnu povahu substrátovej dutiny enzýmu prostredníctvom inzercie jednej alebo viacerých kyslých, zásaditých alebo polárnych aminokyselín. Napríklad, užitočná nukleokyselinová sekvencia [sekv. č. 11] kóduje jačmenný LOX-1 proteín [sekv. č. 12] majúci
- 18substitúciu aminokyseliny 368 zglycínu na Xaa, kde Xaa znamená kyslú, zásaditú alebo polámu aminokyselinu. Jednou konkrétnou aminokyselinovou sekvenciou jačmennej mutantnej LOX-1 podľa vynálezu je sekvencia, v ktorej Xaa znamená kyselinu asparágovú, napr. línia G.
Ako je ukázané nižšie v príkladoch, genotypové zmeny v línii G nemali detegovateľný vplyv na lox-1 génovú expresiu, ale LOX-1 aktivita detegovaná v zrelých a klíčiacich zrnách línie G predstavovala približne 9 % aktivity detegovanej v zrnách rodičovskej línie cv Vintage. Aby sa poskytol priamy dôkaz, že aminokyselinová mutácia v LOX-1 línie G je zodpovedná za fenotyp nízkej aktivity LOX-1, kódujúca sekvencia línie G lox-1 a cv Vintage lox-1 sa prechodne exprimovala v protoplastoch z jačmenného aleurónu, a ukázalo sa, že aktivita mutantého LOX-1 enzýmu je silno redukovaná v porovnaní so štandardným LOX-1 enzýmom.
6. Prenos medzi šľachtenými líniami
Detekcia zmien v genetickom charaktere jačmenných rastlín s genotypom podľa vynálezu je užitočná na identifikáciu prítomnosti špecifického genetického znaku v jačmennej línii a na uľahčenie prenosu tohto znaku medzi šľachtenými líniami v šľachtiteľskom programe. Na detekciu zmien v genomickej sekvencii sú dostupné rôzne molekulárne nástroje. Takéto metódy zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na detekciu polymorfizmov v dĺžke reštrikčných fragmentov (Gebhardt a Salamini 1992, Int. Rev. Cytology., 135:201-237) a kvantitatívne detekčné metódy založené na PCR, ako napríklad amplifikácia použitím fluorescenčných primerov, napr. TaqMan primerových sondových systémov (Ibraham a ďalší, 1998, Anál. Chem 70, 2013-2017). Voľba detekčnej metódy bude závisieť na špecifickom genetickom znaku, ale prednostne by mala byť rýchla a mala by poskytovať jasne interpretovateľné údaje.
Ako je ukázané nižšie v príkladoch, na detekciu mutantného lipoxygenázového-1 génu v línii G bol použitý PCR test so štiepením amplifikovaného polymorfného miesta (PCR-CAPS). Nukleotidová substitúcia v lox1 géne v línii G v polohe +2347 zaviedla ďalšie miesto rozoznávané Aaŕll reštrikčnou endonukleázou, ktoré môže byť detegované v PCR-CAPS teste.
- 19Vhodné detekčné metódy pre lox-1 nie sú obmedzené na tento test, ale môžu byť rovnako dobre založené na TaqMan technológii a iných známych detekčných metódach.
Nižšie v príkladoch je tiež ukázaná aplikácia PCR-CAPS testu na 4 generácie šľachteného materiálu z programu spätného kríženia, kde sa fenotyp línie G s nízkou aktivitou lipoxygenázy systematicky spätne krížil do cv Alexis. Ukázalo sa, že dedičnosť fenotypu nízkej lipoxygenázovej aktivity sleduje dedičnosť lox-1 génu, a fenotyp sa identifikoval ako recesívny a pozoroval sa len v líniách homozygotných v lox-1 géne.
Z toho vyplýva, že rastlinné potomstvo podľa vynálezu zahŕňa šľachtené línie, napríklad odvodené programom spätného kríženia, ktoré obsahujú mutantný lox-1 a exprimujú fenotyp nízkej lipoxygenázovej aktivity.
7. Varenie
Jačmenné rastliny podľa vynálezu vrátane častí rastlín, rastlinného potomstva, zŕn a rastlinných produktov, ako napríklad sladu a sladiny, majúce nízku aktivitu lipoxygenázy 1, tu boli demonštrované ako užitočné na výrobu nápoja majúceho znížené hladiny voľného ŕrans-2-nonenalu v priebehu primeraného času alebo v podmienkach zvýšenej skladovacej teploty, v porovnaní s nápojom vyrobeným so štandardnej kontrolnej jačmennej variety. Za účelom týchto porovnávaní sa obsah síranu v pive udržiaval na 5 ppm alebo nižšie, pretože sa vie, že vysoké hladiny síranu v čase plnenia do fliaš dočasne odďaľujú objavenie sa voľného ŕrans-2-nonenalu. Napríklad, pivo varené zo sladu získaného z tu opísanej mutovanej jačmennej línie G malo stabilizované organoleptické vlastnosti primerane dlhý čas, v porovnaní s pivom vareným zo sladu získaného z kontrolného, nemutovaného jačmeňa.
Varné testy a hodnotenie fľaškového piva poskytli najlepší spôsob na hodnotenie vplyvu rôznych ingrediencií na kvalitu a stabilitu výsledného piva. Na testovanie vplyvu rôznych jačmenných sladov je potrebné dostatočné množstvo jačmenného zrna na uskutočňovanie sladových a varných pokusov v pilotnom meradle a v polopriemyselnom meradle. V priebehu množenia jačmeňa je možné hodnotiť správanie sa jačmennej línie na poli. Sladové vlastnosti jačmennej línie sa
-20môžu hodnotiť počas vyrábania sladu v pilotnom alebo priemyselnom meradle, a výhodne by mali byť v súlade s národnými odporúčaniami pre kvalitu sladu, napr. s odporúčaniami Európskej konvencie pre varenie piva (Analytica-EBC/European Brewing Convention, 1998, Publ. Hans Carl Getränke-Fachverlag, Numberg, Nemecko). Po varení v pilotnom alebo polopriemyselnom meradle sa pivo zabalí do hnedých fliaš a ochladí sa na 5 °C na optimálne skladovanie. V tomto štádiu sa čerstvé pivo môže analyzovať prostredníctvom trénovaných chuťových panelov schopných detegovať špecifické pivové chute vrátane nežiaducej chute zlúčeniny frans-2-nonenalu. Okrem toho sa pivo chemicky analyzuje na hlavné chuťové komponenty vrátane ŕrans-2-nonenalu. Tieto metódy analýzy chute piva sa potom opakujú s pivom, ktoré prešlo rôznymi skladovacími podmienkami, o ktorých je známe, že odhaľujú stabilitu piva pri dlhom skladovaní, napríklad nútené starnutie.
Ako je uvedené nižšie v príkladoch, jačmenná línia G sa rozmnožovala niekoľko sezón na poli, aby sa na slad spracovalo 10 ton tejto línie v priemyselnej sladovni. V podobných podmienkach sa na slad spracovali kontrolné variety cv Vintage a cv Nevada, ktoré obe majú štandardný LOX-1 fenotyp. Vysušený slad z línie G a z kontrolných jačmenných kultivarov spadal do špecifikácii požadovaných pre polopriemyselné varné pokusy.
Varné pokusy sa uskutočňovali v 30hl meradle a hodnotenie čerstvo nafľaškovaných pív odhalilo, že pivá varené tak zo sladu línie G, ako aj zo sladu z kontrolných kultivarov, majú obsah ŕrans-2-nonenalu pod chuťovým prahom a chuťovým panelom boli považované na uspokojujúce. Na hodnotenie chuťovej stability piva sa použili dve ošetrenia núteného starnutia, buď uskladňovanie pri 37°C počas 7 dní, alebo uskladnenie počas 6 až 12 týždňov pri 30°C. Prostredníctvom hodnotenia chuťovým panelom, ako aj prostredníctvom hladiny voľného ŕrans-2-nonenalu, sa zistilo, že chuťová stabilita piva vareného zo sladu línie G je vynikajúca oproti pivu z kontrolného sladu, a zistilo sa, že toto zlepšenie je štatisticky významné.
-21 Príklady uskutočnenia vynálezu
Predložený vynález je podrobnejšie definovaný nižšie v príkladoch. Malo by byť zrejmé, že príklady, hoci uvádzajú výhodné uskutočnenia, sú poskytnuté len ako ilustrácia.
Príklad 1
Skríning a selekcia lipoxygenázového izoenzýmu Mutanty z mutovaného jačmeňa
1. Mutagenéza jačmeňa
Zrná jačmeňa Hordeum vulgare cv Vintage a cv Caruso sa mutovali azidom sodným v súlade s publikovaným postupom (Kleinhofs a ďalší, 1978, Mutation Research 51: 29-35). Mutagenéza zavádza bodové mutácie do genomickej DNA, ktoré môžu viesť napríklad k aminokyselinovým zmenám v kódovaných proteínoch. Mutované M1 zrná sa množili dve generácie v skleníku a M3 zrná sa zozbierali na skríning. Pozorovaná frekvencia jednogénových znakových mutácií v M2 generácii podľa Kleinhofsa a ďalších, 1978, vyššie, je 1,0-2,7 mutantov na 10000 zŕn z M2 generácie. Keďže väčšina génových mutácií je recesívna a detegovateľná len v homozygotnom stave, mutovaná populácia sa skrínovala v M3 generácii, kde bol očakávaný podiel homozygotných mutantných zŕn vyšší. V mutovanom materiáli v M3 generácii bola očakávaná mutačná frekvencia 0,9 až 2,3 na 10000 zŕn.
2. Nedeštruktívny test lipoxygenázovej 1 (LOX-1) a lipoxygenázovej-2 (LOX-2) aktivity v M3 mutovaných zrnách
Vyvinul sa rýchly skrínovací postup na detekciu mutantných jačmenných zŕn so zníženou LOX-1 aktivitou s nasledujúcimi kritériami:
Skríningový postup by nemal brániť rozmnožovaniu zŕn/sadeníc; vybrané zrnové/sadenicové tkanivo by malo vykazovať kvantifikovateľné hladiny lipoxygenázovej aktivity; test by mal rozlišovať LOX-1 aktivitu od LOX-2 aktivity; a testovací postup by mal zahŕňať multiplicitné vzorky.
-22 Hladiny lipoxygenázovej aktivity v rôznych tkanivách klíčiacich zŕn, konkrétne v klíčkovom, koreňovom a štítkovom tkanive embrya a v endosperme sa testovali nasledovne: Extrakty jačmenného sadenicového tkaniva sa pripravili homogenizovanim tkaniva v ľadovo vychladenej 20mM Tris-HCI, pH 7,5, obsahujúcej 2 mM NaN3 a 0,5 mM fenylmetylsulfonyl fluoridu (PMSF), nasledovalo odstránenie nerozpustného materiálu cetrifugáciou pri 1000 ot./min, 10 minút. Lipoxygenázová aktivita v 100 μΙ extraktu sa testovala pri 25 °C pridaním 2,9 ml 20mM substrátu kyseliny linolovej, pripravenej dispergovaním 35 μΙ kyseliny linolovej (voľná kyselina, L-1376, Sigma, USA) v 5 ml H2O obsahujúcej 1% Tween 20. Reakcia sa sledovala spektrofotometricky, kde rýchlosť zvýšenia absorbancie pri 234 nm (A234 nm), v dôsledku vytvorenia konjugovaného diénu v hydroperoxidovom produkte, je úmerná prítomnej enzýmovej aktivite. Jedna jednotka lipoxygenázovej aktivity je definovaná ako ΔΑ234 - 0,001 na minútu v 3ml reakcii, rovná sa oxidácii 0,12 pmola kyseliny linolovej.
Listové tkanivo zrna klíčiaceho 4 dni v tme malo najvyššie detegovateľné hladiny lipoxygenázovej aktivity (Holtman a ďalší, 1996, Plánt Physiology 111: 569576). Na nedeštruktívny lipoxygenázový skríningový test sa preto vybrali listové vrcholy zo 4-dňových sadeníc. PH optimálne pre celkovú jačmennú lipoxygenázovú aktivitu sa testovalo v rozmedzí pH 4,5 až pH 9,0 a zistilo sa, že je ním pH 6,5. Takže 25mM HEPES tlmivý roztok (pH 6,5) obsahujúci 0,2M kyselinu borovú sa vybral pre skrínovací test.
Keďže v klíčkoch 4-dňových sadeníc bol imunologický detegovaný tak LOX1, ako aj LOX-2 enzým, (Holtman a ďalší, 1996, vyššie), použil sa LOX-1 a LOX-2 špecifický test. Zistilo sa, že lipoxygenázový inhibítor, kyselina nordihydroguaretová (NDGA), identifikovaná Eskinom a ďalšími, 1977, Crit. Rev. Food, Science and Nutrition 9: 1-40, je selektívnym inhibítorom jačmenných lipoxygenáz. NDGA v koncentrácii 1x10’5 M silno inhibuje purifikovanú jačmennú LOX-2, zatiaľ čo LOX-1 si zachováva 47% aktivitu (obrázok 1). Selektivita tohto inhibítora sa testovala v teste listových vrcholkov prostredníctvom determinácie pomeru 9hydroperoxyoktadekanoidu (9-HPOD) k 13-hydroperoxyoktadekanoidu (13-HPOD), ktoré sú výsledkami oxidácie kyseliny linolovej prostredníctvom LOX-1, respektíve
-23LOX-2. V lipoxygenázovom teste cv Vintage listových vrcholov spadal podiel 13HPOD po pridaní 1x10'5 M NDGA do rozsahu 24,5 % až 9,5 %.
Selektívny test na LOX-2 aktivitu v extraktoch z listových vrcholov bol založený na použití LOX-1 špecifickej monoklonálnej protilátky (5D2) (Holtman a ďalší, 1996, vyššie) na imunoprecipitáciu LOX-1 nachádzajúcej sa v extraktoch. Zvyšková lipoxygenázová aktivita detegovaná v extraktoch po LOX-1 precipitácii poskytla mieru LOX-2 aktivity. Účinnosť tejto imunoprecipitácie (opísanej nižšie) sa hodnotila kvantifikáciou zvyškovej LOX-1 a LOX-2 v extraktovom supernatante prostredníctvom ELISA testu použitím špecifických monoklonálnych protilátok proti LOX-1 (označovaná 5D2) a LOX-2 (označovaná 5.8) (Holtman a ďalší, 1996, vyššie). LOX-1 imunoprecipitácia z extraktov cv Vintage listových vrcholov odstránila 85 % LOX-1 proteínu a 15 % LOX-2 proteínu.
Imunoprecipitácia sa uskutočňovala v 96-jamkovej platni s jamkami s dnom v tvare V pridaním 5 μΙ 5D2-potiahnutých Dynabeads (Dynal) a 75 μΙ tlmivého roztoku [20mM Tris-HCI, pH 7,5, 1% v/v hovädzie teľacie sérum (HyClone)J k 20 μΙ každého extraktu listových vrcholov. Platňa sa inkubovala na trepačke pre titračné platne (MTS4, IKA, Labor Technik) 1 hodinu pri 4 °C. Imunoprecipitát sa peletoval centrifugáciou pri 4 °C v Sigma 302-K centrifúge 10 minút pri 2000 ot./min. Supernatant (70 μΙ) z každej vzorky sa testoval na lipoxygenázovú aktivitu v 96 jamkovej platni s jamkami s plochým dnom, ako je opísané nižšie, ale s pridaním 100 μΙ testovacieho tlmivého roztoku (25mM HEPES, 0,2M kyselina borová, pH
6.5) .
LOX-1 a LOX-2 testy sa adaptovali pre skríningovú metódu s vysokou účinnosťou. Vrcholy listov (1 cm) z ôsmych 4-dňových klíčiacich zŕn sa individuálne homogenizovali v 150 μΙ ľadovo vychladeného tlmivého roztoku (20mM Tris-HCI, pH
7.5) 2 x 30 sekúnd v multi-jamkovom homogenizátore (Berg a ďalší, 1992, Electrophoresis 13: 76-81). Po 15 minútovej centrifugácii pri 3000 ot./min. sa 40 μΙ supernatantu každého extraktu prenieslo na 96-jamkovú platňu s plochým dnom. Do každej jamky sa pridalo 170 μΙ tlmivého roztoku (25mM HEPES, 0,2M kyselina borová, pH 6,5, 1x10’5 M NDGA) a 10 μΙ substrátu (20mM kyselina linolová) a potom sa inkubovalo 20 minút pri 25 °C. Reakcia sa ukončila pridaním 20 μΙ nasýteného roztoku jodidu draselného (Kl) a inkubovalo sa ďalších 8 minút pri 25 °C. Výsledkom redoxnej reakcie medzi hydroperoxydiénmi a Kl bol l2, ktorý bol monitorovaný prostredníctvom jeho extinkčného maxima pri 350 nm v snímači mikroplatí (Multiskan MCC/340).
3. Idetifikácia potenciálnych lipogenázových 1 mutantov v M3 a M4 zrnách mutagenizovaného jačmeňa
Zrná M3 generácie cv Vintage a cv Caruso sa uskladňovali 6,5 dňa pri 45 °C, aby sa ukončila dormanencia, čo zaisťuje 95% frekvenciu klíčenia. M3 zrná cv Vintage (9318) a cv Caruso (9633) sa naklíčili a skrinovali sa na línie, ktorých LOX1 aktivita bola 15% alebo ešte menšia v porovnaní so štandardnými zrnami. Predpokladané mutantné línie (50 cv Vintage a 42 cv Caruso línií) sa rozmnožovali v M4 generácii, zožali sa a naklíčené zrná sa znova skrinovali. Mutantný LOX-1 fenotyp sa potvrdil v jednej cv Vintage línii a v šiestich cv Caruso líniách po meraní lipoxygenázovej aktivity v extraktoch 5 listových vrcholov z každej línie. Keď sa skúmali LOX-1 a LOX-2 aktivity v klíčiacich embryách týchto 7 pravdepodobných mutantoch, len cv Vintage mutant (označený Línia G) vykazoval značnú redukciu v LOX-1. V zrelých pokojných zrnách je lipoxigenázovou aktivitou prítomnou v embryu takmer výlučne LOX-1 aktivita v dôsledku diferenciačného expresného vzoru týchto dvoch izoenzýmov (Schmitt aVan Mechelen, 1997, Plánt Sci. 128: 141-150). Celková lipoxygenázová aktivita v extraktoch embryí zo zrelých suchých zŕn línie G (M5 generácia) bola 0,05 ± 0,04 U/mg proteínu v porovnaní s 0,74 ± 0,44 U/mg proteínu v cv Vintage embryových extraktoch, ako bolo determinované spektrofotometrickým lipoxygenázovým testom opísaným v časti 2 príkladu 1. Zistilo sa, že zvyšková lipoxygenázová aktivita v zrelých embryách línie G tak v M4, ako aj v M5 generácií je približne 9 % rodičovskej línie.
Príklad 2
Línia G je cv Vintage mutant s fenotypom nízkej lipoxygenázovej aktivity
Agronomické vlastnosti a mutantný fenotyp línie G sa analyzovali v materiále
M5 generácie. Počiatočné analýzy sa uskutočňovali na potvrdenie toho, že
-25analyzovaný M5 materiál je homozygotný pre mutantný fenotyp. Fenotyp nízkej aktivity LOX-1 v línii G, detegovaný v M3 generácii, by mohol byť výsledkom dominantnej alebo recesívnej mutácie. Ak by bola línia G vyselektovaná v M3 generácii heterozygotná pre dominantnú mutáciu, potom by nasledujúce generácie vykazovali segregáciu vo fenotype. Merala sa lipoxygenázová aktivita v 26 jednotlivých embryách z pokojných zŕn línie G M5 generácie a porovnávala sa s cv Vintage štandardnými embryami. Lipoxygenázová aktivita vo všetkých embryách línie G bola veľmi nízka, s priemerne 0,06 ± 0,04 U lipoxygenázy na mg proteínu v porovnaní s 0,74 ± 0,44 U lipoxygenázy na mg proteínu u štandardných cv Vintage embryí. Tieto údaje potvrdili, že línia G v M5 generácii je homozygotná pre znak nízkej lipoxygenázovej aktivity.
1. Línia G má štandardnú fyziológiu rastu rastliny a vývoja zŕn
Zrná línie G a cv Vintage klíčili a rástli v klimatickej komore pri 16 hodinovom svetle a 15 °C a 8 hodinách tmy pri 12 °C, pri relatívnej vlhkosti 80 %. Rastové vlastnosti línie G a cv Vintage rastlín boli podobné čo sa týka výšky rastliny, počtu výhonkov na rastlinu, nástupu kvitnutia a počtu zŕn na klas. Veľmi podobná bola čerstvá hmotnosť (obrázok 2) a suchá hmotnosť (obrázok 3) zŕn línie G a štandardného cv Vintage v priebehu vývoja od 5 dní po kvitnutí (DAF) po úplnú zrelosť, približne 90 DAF.
2. Zrná línie G majú fenotyp nízkej aktivity lipoxygenázy 1 v priebehu celého vývoja
Lipoxygenázová aktivita sa merala v extraktoch vyvíjajúcich sa jačmenných zŕn línie G (M5 generácie) a štandardného cv Vintage. Zrná sa homogenizovali v ľadovo chladenom 20mM Tris-HCI tlmivom roztoku, pH 7,5, obsahujúcom 0,1 % (v/v) Nonidet P-40, neiónový detergent, ktorý zvyšuje lipoxygenázovú extrakciu, a centrifugovali sa pri 15000 ot./min. 20 minút, aby sa odstránil nerozpustný materiál. Lipoxygenázová aktivita v extraktoch sa merala polarograficky v 200 μΙ kyslíkom nasýteného tlmivého roztoku (0,2M kyselina borová, 25mM HEPES, pH
6,5) obsahujúcom 1,2 mM kyseliny linolovej pri 25 °C, použití Clark typu elektródy na meranie spotreby kyslíka. Lipoxygenázová aktivita sa zvýšila v priebehu prvých dní vývoja zrna tak v línii G, ako a v štandardných zrnách, ale len v línii G úroveň aktivity prudko klesla v priebehu zretia zrna (obrázok 4).
Relatívne množstvá 9-HPOD a 13—HPOD vytvorených v priebehu oxidácie kyseliny linolovej, poskytujú mieru úrovní LOX-1 a LOX-2 aktivity v zrnových extraktoch. V tomto prípade bol vynechaný Nonidet P-40 zo zrnových extrakčných tlmívých roztokov, aby sa vylúčila koextrakcia enzýmov spotrebúvajúcich hydroperoxid. Extrakty (100 μΙ), zmiešané s 10 ml 50mM fosfátového tlmivého roztoku, pH 6,5, obsahujúceho 200μΜ kyselinu linolovú sa inkubovali 20 minút. Reakcia sa ukončila nastavením pH na 3,5 a pridal sa interný štandard. Hydroxyperoxidázy vytvorené v teste sa naviazali na oktadecylovú kolónu na tuhej fáze (Bakerbond, Baker) a eluovali sa s metanolom. 9-HPOD a 13-HPOD sa potom oddelili reverznou fázovou HPLC na C-18 kolóne s izokratickým elučným rozpúšťadlom (zmes tetrahydrofurán:metanol:H20:kyselina octová, 25:30:44,9:0,1 (v/v), ktorej pH bolo nastavené na 5,5 s koncentrovaným amoniakom) pri prietokovej rýchlosti 0,5 ml/minútu, ako je opísané vAarle a ďalší, 1991, FEBS Letters 280: 159-162. Hydroperoxidy sa detegovali pri 234 nm a v HPOD vrcholoch sa upravovali oproti internému štandardu, prostaglandínu B2.
Obrázok 5 ukazuje, že 13-HPOD bol hlavným produktom lipoxygenázovej aktivity prítomnej v zrnách v priebehu prvých 20 DAF, zatiaľ čo 9-HPOD bol vytvorený prostredníctvom lipoxygenázovej aktivity v priebehu zretia zŕn. Hoci tak extrakty zŕn línie G, ako aj štandardných zŕn zdieľali podobný profil 13-HPOD syntetizujúcej aktivity, línia G nevykazovala štandardné zvýšenie 9-HPOD syntetizujúcej aktivity. Tieto údaje sú v súlade so stratou LOX-1 aktivity u zrelých jačmenných zŕn línie G.
3. Zrná línie G majú fenotyp nízkej lipoxygenázovej 1 aktivity pri klíčení
Celková lipoxygenázová aktivita v extraktoch embryí zŕn klíčiacich pri 15 °C sa testovala ako je opísané v príklade 1. Lipoxygenázová aktivita prítomná v pokojných štandardných zrnách klesala v priebehu prvých 4 dni klíčenia a potom sa zvyšovala (obrázok 6). V línii G bola lipoxygenázová aktivita v pokojných zrnách veľmi nízka, ale zvýšila sa po 4 dňoch.
-27Analýza HPODs vytvorených prostredníctvom lipoxygenázovej aktivity v klíčiacich embryách ukázala, že 9—HPOD bol hlavným produktom lipoxygenáz prítomných v pokojových štandardných zrnách (obrázok 7). Úroveň vytvárania 9HPOD bola v súlade s poklesom lipoxygenázovej aktivity v extraktoch. Zvýšenie lipoxygenázovej aktivity po 4 dňoch bolo sprevádzané vytváraním tak 9-HPOD, ako aj 13-HPOD. Nízka lipoxygenázová aktivita v pokojových zrnách línie G bola spojená s absenciou vytvárania HPOD, zatiaľ čo zvýšenie aktivity po 4 dňoch produkovalo najmä 13-HPOD. Tieto údaje poskytujú dôkaz, že LOX-1 aktivita vedúca k vytváraniu 9-HPOD je značne znížená v embryách tak vyvíjajúcich sa, ako aj pokojových, ako aj klíčiacich jačmenných zŕn línie G, zatiaľ čo LOX-2 aktivita, vedúca k vytváraniu 13-HPOD, sa v línii G nemení.
Príklad 3
Línia G má mutantný lipogenázový 1 gén (lox-1) čo spôsobuje fenotyp nízkej lipoxygenázovej aktivity
Skúmal sa molekulárny základ fenotypu nízkej LOX-1 aktivity línie G, aby sa poskytol kompletný opis mutanta. Nasledujúce analýzy sa uskutočňovali na poskytnutie kompletnej charakterizácie fenotypu:
1. Lipoxygenáza 1 sa syntetizuje vo vyvíjajúcich sa a v klíčiacich zrnách línie G
Paralelne sa uskutočňovala Western blot analýza extraktov embryí z vyvíjajúcich sa a z klíčiacich zŕn, pričom sa merala lipoxygenázová aktivita, ako je opísané v príklade 2. Surové extrakty sa separovali polyakrylamidovou gélovou elektroforézou s dodecylsulfátom sodným (SDS-PAGE) podľa Laemmliho, 1970, Náture 227: 680-685. Separované proteíny sa preniesli na nitrocelulózu polosuchým blotingom podľa Towbina a ďalších (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 43504354. Blot sa sondoval s LOX-1 špecifickou monoklonálnou protilátkou, 5D2, ako je opísané v Holtman a ďalší, 1996, Plánt Physiology 111: 569-576, v 500x riedení, potom nasledovala inkubácia s králičou anti-myšacou protilátkou spojenou s alkalickou fosfatázou a detekcia so substrátmi alkalickej fosfatázy, nitro blue tetrazoliom a 5-bróm-4-chlór-3-indolyl-fosfátom, ako je opísané v Holman a ďalší,
-281996, Plat Physiol. 111: 569-576. Western analýza odhalila, že LOX-1 proteín bol detegovaný vo vyvíjajúcich sa zrnách od 10 DAV v cv Vintage embryách a hladina sa zvyšovala v priebehu zretia zŕn (obrázok 8). Proteín bol prítomný aj v embryách cv Vintage pokojných zŕn, ale pomaly klesal v priebehu líčenia (obrázok 9). Hoci LOX-1 je rozoznávaný v extraktoch embryí línie G a migruje v SDS-PAGE ako proteín s podobnou veľkosťou ako cv Vintage LOX-1, imonologicky detegovateľné hladiny proteínu v línii G boli mierne nižšie ako v cv Vintage.
2. Lox-1 gén sa exprimuje vo vyvíjajúcich sa a v klíčiacich zrnách línie G
Celková RNA sa izolovala z embryí vyvíjajúcich sa a klíčiacich jačmenných zŕn podľa postupu Hensgens a Van Os-Ruygrok, 1989, Rice Genet. Newslett. 6: 163-168, súčasne s meraním lipoxygenázovej aktivity ako je opísané v príklade 2. RNA vzorky (7,5 pg) sa separovali na denaturujúcich agarózových géloch a uskutočnil sa ich Northern blot, ako je opísané v Sambrook a ďalší, 1989 v Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Habour Laboratory Press, NY. Bloty sa hybridizovali s 32P-značeou sondou generovanou z jačmennej 3' netranslatovanej oblasti, nukleotidy 2659-2801 [sekv. č. 1] lox-1 cDNA (EMBL prístupové č. L35931), ako je opísané v Holtman a ďalší, 1996 Plat Physiol. 111: 569-576, použitím Amersham Random Prime kitu.
Lox-1 transkripty kódujúce LOX-1 sa detegovali v embryách vyvíjajúcich sa a zrelých cv Vintage zŕn a zŕn línie G od 30 DAF (obrázok 10). Hladiny lox-1 transkriptov sa zvyšovali v priebehu klíčenia tak v cv Vintage embryách, ako aj v embryách línie G, z čoho vyplýva de novo expresia lox-1 génu (obrázok 11). Keďže detegovateľné hladiny lox-1 transkriptov boli podobné v embryách línie G a v cv Vintage embryách, ani zníženie lox-1 transkripcie, ani stability transkriptu, nemôže byť zodpovedné za fenotyp nízkej lipoxygenázovej aktivity línie G.
3. Lox-1 gén línie G kóduje mutantnú formu lipoxygenázy 1
Nukleotidové sekvencie lox-1 génu línie G a cv Vintage sa analyzovali a porovnávali, aby sa determinoval molekulárny základ fenotypu nízkej LOX-1 aktivity línie G, ktorá sa vyznačuje normálnou transkripciou lox-1 génu, ale zníženou akumuláciou a aktivitou exprimovaného lipoxygenázového enzýmu v zrnách.
-29Genomická DNA z línie G a zo štandardného cv Vintage sa izolovala z listového tkaniva sadeníc spôsobom opísaným vPich a Schubert 1993, Nucleic Acids Res. 21: 3328. Lox-1 gén v genomických DNA prípravkoch sa amplifikoval polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) použitím primerov založených na sekvecii jačmenného lox-1 génu (Van Mechein a ďalší, 1995, BBA 1254: 221-225; Rouster a ďalší, 1997, Plánt J. 11: 513-523). Poloha a sekvencia oligonukleotidových primerov použitých na amplifikáciu lox-1 promótora a kódujúcich oblastí, označených na obrázku 12, boli nasledovné:
Priamy primer 5'-GAA AAG CTT GGA GGT AGA CGC TGC-3' [sekv. č. 2] a reverzný primer 5'-TAT AGG ATC CTT GTT CTT GGC CTC CTC TCC TCG-3' [sekv. č. 3] sa použili a PCR amplifikáciu lox-1 promótorovej domény (-361 až +68) línie G a cv Vintage lox-1.
Priamy primer 5'-AGT GAA AAA CAG TGT GCT GGT G-3' [sekv. č. 4] a reverzný primer 5'-GGC TTA AAG AGC AAC TGC TGA-3' [sekv. č. 5] sa použili na PCR amplifikáciu lox-1 kódujúcej oblasti línie G.
Priamy primer 5'-CAA GAT GCA TAT GCT GCT GGG AG-3' [sekv. č. 6] a reverzný primer 5'-CGA TGG TTT AAA TTA GAT GGA GAT GCT GT-3' [sekv. č. 7] amplifikovali prostredníctvom PCR cv Vintage lox-1 kódujúcu oblasť.
PCR reakcie pozostávali z 250 ng genomickej DNA v 50μΙ objeme obsahujúcom 50 pmol primeru a 2 U Pfu DNA polymerázy (Promega) podľa inštrukcií dodávateľa enzýmov. PCR amplifikácie sa uskutočňovali v Stratagene Robocykleri: 1 minútu pri 94 °C, 1 cyklus; 1 minútu pri 94 °C, 2 minúty pri 62 °C a 5 minút pri 72 °C, 30 cyklov; 10 minút pri 72 °C, 1 cyklus. PCR produkty sa separovali na 1,2% agarózových géloch. DNA fragmenty zodpovedajúce dĺžkou amplifikovanej oblasti, sa purifikovali použitím Qiax II gólového extrakčného kitu (Qiagen) a klonovali sa do plazmidu pcDNA2.1 (Invitrogen). Nukleotidová sekvencia oboch vlákien klonovaného lox-1 promótora a kódujúcich oblastí sa determinovala použitím dideoxynukleotidovej reťazcovej terminačnej reakcie so špecifickými oligonukleotidovými primermi a analyzovala sa na ABI PRISM® 310 genetickom analyzátore (PB Biosystems). Porovnávania sekvencií sa uskutočňovali použitím
-30DNA STAR sekvenčného analyzačného softwarového balíka (DNA STAR Inc., USA).
Promótorová oblasť a intrón-exónová štruktúra jačmennej lox-1 kódujúcej oblasti sú znázornené na obrázku 13 a boli odvodené z porovnávania nukleotidovej sekvencie štandardnej lox-1 genomickej sekvencie a cDNA sekvencie (obrázok 12). Sekvenovaná oblasť lox-1 promótorovej oblasti od -363 do +68 (číslované vo vzťahu k determinovanému transkripčnému štartovaciemu miestu; van Mechelen a ďalší, 1995, BBA 1254: 221-225) je dostatočná na riadenie embryo-špecifickej časovo regulovanej génovej expresnej charakteristiky natívneho génu (Rouster a ďalší, 1998, Plánt J 15: 435-440). Promótor a transkribovaná oblasť štandardného lox-1 génu [sekv. č. 8] má dĺžku 4663 nukleotidov a obsahuje 6 intrónov medzi 82. nukleotidom a 634. nukleotidom, ktoré chýbajú v príslušnej cDNA [sekv. č. 10] a musia byť preto odstránené v priebehu zostrihu RNA transkriptu.
Porovnanie nukleotidovej sekvencie lox-1 línie G so štandardnou sekvenciou (obrázok 12) ukázalo, že lox-1 alela línie G má dve bodové mutácie. Jedna je tichá C->T substitúcia v polohe 221 v exóne 1, a druhá je G^A substitúcia v polohe 2347 v exóne 3 (obrázok 13). Štandardný jačmenný lox-1 gén kóduje protein s 862 aminokyselinovými zvyškami [sekv. č. 9], zatiaľ čo mutácia v polohe 2347 v lox-1 alele línie G spôsobuje aminokyselinovú substitúciu glycínu na kyselinu asparágovú vo zvyšku 368 v kódovanom proteíne.
Zo zoradenia príbuzných rastlinných lipoxygenáz vyplýva, že glycín 368 v jačmennom LOX-1 je silno konzervatívny. Navyše, tento zvyšok, ktorý zodpovedá glycínu 353 v sójovom LOX-1, je jedným z 51 neutrálnych alebo hydrofóbnych zvyškov, ktoré lemujú substrátovú dutinu enzýmu, ako je vidieť na kryštálovej štruktúre (Minor a ďalší, 1996, Biochemistry 35: 10687-10701) a ako je vidieť na obrázku 22. Takže je pravdepodobné, že inzercia nabitého aminokyselinového zvyšku v tejto polohe porušuje štrukturálne a funkčné vlastnosti enzýmu.
4. Mutovaný LOX-1 protein kódovaný lox-1 alelou línie G má nízku enzymatickú aktivitu a je zodpovedný za fenotyp nízkej lipoxygenázovej aktivity línie G
Mutagenéza cvVintage zŕn azidom sodným, ktorá indukovala mutovanú lox-1 alelu v línii G, mohla indukovať ďalšie mutácie v genóme línie G. Uskutočnili sa dva
-31 experimentálne prístupy, aby sa demonštrovalo, že mutantná lox-1 alela v línii G je zodpovedná za jej fenotyp nízkej lipoxygenázovej aktivity, a nie iné mutácie v genóme. Bola determinovaná enzymatická aktivita LOX-1 kódovaného mutantnou a štandardnou lox-1 alelou, aby sa potvrdilo, že substitúcia glycín^kyselina asparágová v mutatnom enzýme spôsobuje zníženie stability a aktivity. Dva lox-1 gény sa prechodne exprimovali v aleurónových protoplastoch izolovaných z napučaných zrelých zŕn, keďže sa očakávalo, že hladina endogénnej lipoxygenázovej expresie v týchto bunkách je pod detekčnými limitmi. Žiadny z identifikovaných jačmenných lipoxygenázových génov, ktoré sa exprimujú v klíčiacom jačmeni, sa nedetegoval v aleurónovom tkanive (van Mechelen a ďalší, 1999, vyššie). Na riadenie prechodnej expresie lox-1 génu v aleurónových protoplastoch sa ich kódujúce oblasti prechodne fúzovali s konštitutívnym promótorom, o ktorom je známe, že je aktívny v týchto protoplastoch.
Kódujúce oblasti mutantného (sekvenčné polohy +1 až +4350) a štandardného lox-1 génu (sekvenčné polohy +69 až +4230) a štandardnej lox-1 cDNA (sekvenčné polohy +69 až +2654), z ktorých každý bol klonovaný v plazmide pcDNA2.1 (pozri časť 3), sa vyrezali poštiepením v Kpnl a EcoRV miestach vo vektorovom polylinkeri. Kódujúce oblasti sa klonovali do pUBARN plazmidu (Jensen a ďalší, 1998, Hereditas 129: 215-225) medzi konštitutívne aktívny kukuričný ubiquitínový Ubi promótor (ako je opísaný v US patente č. 005510474A) a Nos terminátor, v mieste bar génu, ktorý kóduje fosfinotricín acetyltransferázu (obrázok 14).
Protoplasty sa izolovali z aleurónového tkaniva napučaného Hordeum vulgare cv Himalaya podľa protokolu podľa Skriver a ďalší 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266-7270. Alikvoty 2x105 protoplastov sa transfekovali pri 0 °C približne 100 pg plazmidovej DNA (ekvimolárne množstvá každého plazmidu) prostredníctvom polyetyléglykolom (PEG) sprostredkovaného príjmu DNA (Lee a ďalší, 1997, Plánt Mol. Biol. 13: 21-29) a potom sa inkubovali v aleurónovom protoplastovom kultivačnom médiu pri 25 °C, ako už bolo opísané (Skriver a ďalší, 1991, vyššie). Po 48 hodinách inkubovania sa kultivačné médium opatrne odstránilo a protoplasty sa resuspendovali a homogenizovali v 300 pl lipoxygenázového testovacieho tlmivého roztoku (0,2mM kyselina borová, 25mM HEPES, pH 6,5).
-32Homogenáty sa centrifugovali pri 15000 ot./min 5 minút, aby sa peletoval nerozpustný materiál a supernatanty (10 μΙ) sa následne testovali na celkovú lipoxygenázovú aktivitu použitím rýchleho skríningového testu opísaného v príklade 1, časti 1, ale s vynechaním NDGA inhibítora. Obsah proteínu v protoplastových extraktoch sa meral prostredníctvom Bradfordovho farbičku viažuceho testu (Bradford 1976, Anál. Biochem., 72: 248), dodávaného od Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornia, USA, a lipoxygenázová aktivita sa vyjadrila na mg proteínu v extrakte.
Protoplasty transfekované s kontrolným plazmidom, pUBI-GUS, kde kukuričný ubiquitínový-1 promótor riadi expresiu β-glukuronizdázového reportérového génu, neposkytli žiadnu detegovateľnú lipoxygenázovú aktivitu. Prechodná expresia štandardného lox-1 génu ako aj cDNA v protoplastoch poskytli vysoké hladiny lipoxygenázovej aktivity v protoplastových extraktoch (obrázok 15). Vyššia expresia štandardnej lox-1 cDNA v porovnaní s genomickou sekvenciou môže byť spôsobená vyššou transfekčnou frekvenciou menšieho lox-1 cDNA expresného plazmidu (4929 bp versus 6505 bp lox-1 génového konštruktu). Prechodná expresia mutantného lox-1 génu poskytla nízke hladiny lipoxygenázovej aktivity, približne 10 % štandardnej lipoxygenázovej aktivity. Tieto údaje jasne demonštrujú, že mutantný lox-1 gén v línii g kóduje lipoxygenázu so značne zníženou aktivitou, ktorá je zodpovedná za fenotyp nízkej lipoxygenázovej aktivity.
Príklad 4
Test PCR-štiepenia amplifikovaných polymorfných miest (PCR-CAPS): Spôsob použitý na identifikáciu mutantného lox-1 génu
Na základe PCR-CAPS testu bola vyvinutá analytická metóda umožňujúca identifikáciu mutantného lox-1 génu línie G na akomkoľvek genetickom pozadí. Test zahŕňa PCR amplifikáciu genomických DNA fragmentov, po ktorej nasleduje štiepenie amplifikovaných sekvencií so špecifickou reštrikčnou endonuleázou, aby sa prejavil polymorfizmus v dĺžke reštrikčných fragmentov (RFLP).
-33Kódujúca sekvencia mutantného lox-1 génu nesie dve bodové mutácie (pozri príklad 3), kde mutácia v polohe 2347 (obrázok 12) zavádza ďalšie Aat II miesto štiepené reštrikčnou endonukleázou, ktoré sa nenachádza v štandardnom lox-1 géne (obrázok 16). Ukázalo sa, že použitie PCR-CAPS testu, na základe polymorfizmu vytvoreného prítomnosťou tohto reštrikčného miesta v lox-1 géne, rozlišuje medzi štandardným lox-1 génom a mutantným lox-1 génom.
Genomická DNA sa izolovala z mladých listov M6 sadeníc Hordeum vulgare L. cv Vintage a línie G spôsobom podľa Pichá a Schuberta (1993, vyššie). DNA sekvencia zahŕňajúca polohu 2347 (mutované miesto lox-1 génu línie G) sa amplifikovala prostredníctvom PCR použitím primerov špecifických pre lox-1 gén [sekv. č. 8]. DNA fragmenty, amplifikované prostredníctvom vybraného priameho primeru 5'-CGCTACGACGTCTACAACGC-3' [sekv. č. 13] a reverzného primeru 5'CAGACTACTTTTGGCGGGA-3' [sekv. č. 14], sú znázornené na obrázku 17. PCR reakcie sa uskutočňovali s 250 ng genomickej DNA v 50μΙ objeme obsahujúcom 50 pmol každého primeru a 1 jednotku Taq DNA polymerázy (Promega) podľa inštrukcií dodávateľov. PCR amplifikácie sa uskutočňovali v Stratagene Robocycleri nasledovne: 1 minúta pri 94 °C, 1 cyklus; 1 minúta pri 94 °C, 1,5 minúty pri 60 °C, a 2 minúty pri 72 °C, 30 cyklov; 10 minút pri 72 °C, 1 cyklus. Amplifikované fragmenty mutantného a štandardného lox-1 génu majúce približne 650 bp (obrázok 18), zodpovedali očakávanej veľkosti (obrázok 17). PCR produkty, purifikované na centrifugačnej kolóne (Qiagen), sa štiepili s 25 jednotkami Aat II reštrikčnej endonukleázy pri 37 °C a analyzovali sa na 1,2% agarózovom géli.
Výsledkom štiepenia štandardného lox-1 PCR produktu boli DNA fragmenty s veľkosťou 10, 179 a 462 bp a fragmenty z mutantného lox-1 PCR produktu mali dĺžku 10, 149, 179 a 313 bp, kde ďalší DNA fragment bol výsledkom čiastočného štiepenia lox-1 PCR produktu (obrázok 19). Vzorka fragmentov zodpovedá očakávanému RFLP, ktorý je výsledkom tejto mutácie, kde 313bp fragment je jedinečný pre mutantný lox-1. Tento PCR-CAPS test poskytuje reprodukovateľný a špecifický nástroj na identifikáciu lox-1 alely v jačmeni a môže tak byť využitý v programoch šľachtenia jačmeňa, ktorých cieľom je zavedenie tohto génu do nových jačmenných odrôd.
-34Príklad 5
Spätné kríženie fenotypu nízkej lipoxygenázovej aktivity línie G s cv Alexis demonštruje genetickú väzbu na mutantný lox-1 gén
Opakované spätné kríženie sa použije na prenos fenotypu nízkej lipoxygenázovej aktivity z línie G na rekurentného rodiča (v tomto prípade cv Alexis). Program spätného kríženia znázornený na obrázku 20 je kombinovaný so selekciou na fenotyp nízkej lipoxygenázovej aktivity, pričom sa progresívne substituuje genóm línie G rekurentným rodičovským genómom. Okrem toho sú eliminované iné mutácie zavedené do genómu línie G v priebehu mutagenézy s azidom sodným. V prvom spätnom krížení línie G homozygotnej v nízkej lipoxygenázovej aktivite (genotyp označený //) s cv Alexis (genotyp označený LL) sú línie potomkov heterozygotné (genotyp označený Lľ). Fenotyp nízkej lipoxygenázovej aktivity nebude v dôsledku recesívnej mutácie detegovateľný v líniách heterozygotných pre mutáciu. Potomstvo je samoopelivé a poskytne populáciu v súlade s normálnou Mendeleovou segregáciou, konkrétne 1LL:2LI:1II. Homozygotný //genotyp s nízkym lox, ktorý je výsledkom prvého spätného kríženia, bude mať 50% cv Alexis genetické pozadie. Po desiatich kolách spätého kríženia bude rekurentné rodičovské pozadie približne 99,9 %.
Hordeum vulgare, L. cv Alexis a línia G sa množili v skleníku programom spätného kríženia. Zrná spätne kríženého potomstva sa nechali naklíčiť v Petriho miskách na filtračnom papieri, nechali sa nasiakavať 4 ml H2O 3 dni pri 22 °C v tme. Línie s nízkou lipoxygenázovou aktivitou sa skrínovali prostredníctvom merania celkovej lipoxygenázovej aktivity v extraktoch koleoptilu (vrcholových 7 mm) z klíčiacich sadeníc, ako je opísané v príklade 1. Potomstvo 3. a 4. spätného kríženia sa analyzovalo aj na dedičnosť mutantného lox-1 génu použitím PCRCAPS testu opísaného v príklade 4.
Očakávaná frekvencia fenotypu s nízkou lipoxygenázovou aktivitou v segregujúcom potomstve štvrtých generácií spätného kríženia bola 25 % pre recesívnu mutáciu. Pozorovaná frekvencia nízkej lipoxygenázovej aktivity v potomstve (24 zŕn) štyroch generácií spätného kríženia je v súlade s očakávanou frekvenciou (obrázok 20). Keď sa analyzovalo potomstvo 3. a 4. spätného kríženia,
-35majúce homozygotný II genotyp nízkej lox, s PCR-CAPS testom, pri všetkých sa zistilo, že majú diagnostický 313bp fragment, zatiaľ čo potomstvu so štandardnou lipoxygenázovou aktivitou tento fragment chýbal (obrázok 21).
Program spätného kríženia demonštruje, že mutantná lox-1 alela sa môže prenášať do nového genetického pozadia a dedí sa recesívnym monofaktoriálnym spôsobom v súlade s Mendeleovou segregáciou. Keďže rekurentné rodičovské pozadie v potomstve 4. spätného kríženia je 93,8 %, spoločné dedenie mutantného lox-1 génu a fenotypu nízkej lipoxygenázovej aktivity poskytuje potvrdenie ich genetickej väzby.
Príklad 6
Pivo varené zo sladu z jačmeňa línie G akumuluje menej ŕrans-2-nonenalu v priebehu uskladňovania, poskytujúc zlepšenú chuťovú stabilitu
Hordeum vulgare L cv Vitage a línia G sa pestovali na poli niekoľko sezón, aby sa poskytlo dostatočné množstvo zrna na priemyselné spracovanie na slad. Na demonštráciu hodnoty jačmeňa línie G s nízkou lipoxygenázovou aktivitou pre zlepšenie chuťovej stability sa uskutočňovali nasledujúce testy výroby sladu a varenia piva v priemyselnom meradle, ako aj analýzy finálneho piva.
1. Priemyselná výroba sladu a sušenie z línie G a cv Vintage
Výroba sladu sa uskutočňovala v10-tonovom meradle v priemyselnej sladovni v dvoch pokusoch nasledovne:
Pokus 1: Jačmenné zrno línie G (žatva 1996)
Podmienky lúhovania: 8 hodín mokro; 14 hodín sucho; 8 hodín mokro; 10 hodín sucho; 4 hodiny mokro v 16°C luhovacej vode. Podmienky výroby sladu: 12 hodín pri 18 °C; 24 hodín pri 16 °C; 24 hodín pri 14 °C; 60 hodín pri 12 °C.
Podmienky sušenia: 12 hodín pri 60 °C; 3 hodiny pri 68 °C; 4 hodiny pri 74 °C; 3 hodiny pri 80 °C.
-36Pokus 2: Jačmenné zrno cv Vintage a línie G (žatva 1996/1997)
Podmienky lúhovania: 8 hodín mokro; 10 hodín sucho; 6 hodín mokro; 15 hodín sucho; 4 hodiny mokro v 15°C luhovacej vode. Podmienky výroby sladu: 5 dní s privádzaním vzduchu pri 15 °C a sprejovanie na udržanie úrovne vlhkosti. Podmienky sušenia: 10 hodín pri 50 °C; 2 hodiny pri 60 °C; 2,5 hodiny pri 80 °C.
Analýzy sladu 2 vzoriek sladu línie G z pokusu 1, porovnávané s kontrolným sladom cv Nevada (tabuľka 1), a z pokusu 2 porovnávané s cv Vintage (tabuľka 2), potvrdili, že slad z línie G je vhodný na pokusy s varením piva.
-37Tabuľka 1
| Výroba sladu Pokus 1 | ||||
| Odroda jačmeňa | cv Nevada | Línia G | Línia G | |
| Obilie z roku | 1996 | 1996 | 1996 | |
| Analýzy sladu | ||||
| Obsah vlhkosti | % | 4,7 | 4,3 | 4,4 |
| Jemný extrakt ako is. | %ai. | 76,9 | 76,1 | 75,3 |
| Jemný extrakt d.m. | %dm. | 81,4 | 79,5 | 78,7 |
| Čas sacharifikácie | min | < 10 | < 10 | < 10 |
| Diastická sila | %WK | 252 | 373 | 365 |
| Farba | EBC | 2,8 | 4,4 | 3,8 |
| pH | 6,16 | 5,97 | 5,99 | |
| Zákal | EBC | 9,0 | 2,5 | 2,4 |
| Celkový proteín d.m. | % | 10,35 | 10,74 | 12,03 |
| Rozpustný dusík | mg/l | 647 | 787 | 765 |
| Rozp. proteín % slad d.m. | %dm. | 3,7 | 4,4 | 4,3 |
| Kolbách | 35,3 | 40,8 | 35,4 | |
| Voľný aminonitrogén | mg/l | 97 | 125 | 118 |
| Drobivosť | % | 89,5 | 85,6 | 89,5 |
| Úplne nemodifikované zrná | % | 1,1 | 0,6 | 0,5 |
| Čiastočne nemodifikované zrná | % | 2,3 | 1,0 | 0,6 |
| β-glukán v sladine | mg/l | 114 | 66 | 36 |
| β-glukán v slade | % w/w | 0,24 | 0,11 | 0,05 |
| S-metylmetionín/DMS eq. | pg/g | 2,4 | 6,4 | 8,4 |
| Voľný DM S | pg/g | 1,0 | 6,6 | 4,7 |
| NDMA | pg/kg | n.d. | 0,380,6 | 0,3/0,3 |
-38Tabuľka 2
| Výroba sladu Pokus 1 | ||||
| Odroda jačmeňa | Vintage | Línia G | Línia G | |
| Obilie z roku | 1996 | 1996 | 1997 | |
| Obsah vlhkosti | % | 4,1 | 4,1 | 4,3 |
| Jemný extrakt ako is. | %ai. | 77,0 | 75,6 | 77,5 |
| Jemný extrakt d.m. | %dm. | 80,3 | 78,8 | 80,9 |
| Jemný/hrubý rozdiel | % dm. | 0,7 | 1,6 | 1,7 |
| čas sacharifikácie | min | < 10 | ||
| Diastická sila | %WK | 343 | 342 | 268 |
| Farba | EBC | 2,5 | 2,8 | 3,4 |
| PH | 6,05 | 6,01 | 6,12 | |
| Zákal | EBC | 1,5 | 1,3 | 2,5 |
| Celkový proteín d.m. | % | 10,98 | 12,22 | 9,82 |
| Rozpustný dusík | mg/l | 696 | 741 | 610 |
| Rozp. proteín % slad d.m. | %dm. | 3,9 | 4,1 | 3,4 |
| Kolbách | 35,2 | 33,7 | 34,6 | |
| Voľný aminonitrogén | mg/l | 110 | 117 | 100 |
| Drobivosť | % | 91,3 | 81,8 | 89,5 |
| Úplne nemodifikované zrná | % | 0,7 | 1,1 | 1,3 |
| Čiastočne nemodifikované zrná | % | 1,0 | 2,7 | 2,7 |
| β-glukán v sladine | mg/l | 97 | 172 | 117 |
| β-glukán v slade | % w/w | - | - | 0,3 |
| S-metylmetionín/DMS eq. | pg/g | - | - | - |
| Voľný DMS | pg/g | - | - | - |
2. Priemyselné varenie piva so sladom z línie G, cv Vintage sladom a kontrolným sladom cv Nevada
Uskutočnili sa dva varné pokusy použitím sladiny pripravenej z Línie G a kontrolného cv Nevada sladu v pokuse 1 a z línie G a kontrolného cv Vintage sladu v pokuse 2.
Pivo sa varilo v 30-hl priemyselnom meradle so 475 kg sladu podľa nasledujúcej schémy: Rmutovanie pri 50 °C; 30 minút pri 50 °C; 30 minút zahrievanie z 50 na 70 °C; 15 minút pri 70 °C. Časť sladiny sa zahrievala 20 minút zo 70 na 100 °C a 5 minút na 100 °C, zatiaľ čo zvyšný rmut sa udržiaval na 70 °C ďalších 25 minút a potom sa tieto dva rmuty spojili a udržiavali 10 minút na 76 °C. V súlade so štandardou praxou vo varení piva sa uskutočňovali kroky varenia sladiny, vírivej separácie použitých zŕn, ochladzovania, fermentácie, odležiavania a balenia do fliaš z hnedého skla.
3. Chuťová stabilita a T2N obsah v pive varenom zo sladu z línie G, cv Vintage sladu a kontrolného cv Nevada sladu
Čerstvo nafľaškované pivo sa uskladňovalo pri 5 °C a analyzovalo sa do 2 mesiacov od výroby. Chuťová stabilita čerstvého a skladovaného piva sa hodnotila v dvoch nezávislých laboratóriách po dvoch rozličných typoch skladovacích podmienok pre pivo. V laboratóriu A sa pivo podrobilo rýchlenému zostarovaciemu procesu, pri ktorom sa pivo uskladňovalo pri 37 °C 7 dní, zatiaľ čo v laboratóriu B sa pivo uskladňovalo pri 30 °C 6 a 12 týždňov. Hladiny ŕrans-2-nonenalu v pive sa determinovali plynovou chromatografiou a hmotnostnou spektrometrickou detekciou po derivatizácii karbonylov v O-(2,3,4,5,6-pentánfluórbenzyl)-hydroxylamíne, v podstate ako je opísané v Grónqvist a ďalší, 1993 Procedings of the 24th EBC Congress, Oslo, 421-428. Panel trénovaný pre chuť piva hodnotil celkové chuťové skóre piva, ktoré zahŕňalo detekciu lepenkovej chuti, ktorá indikuje voľný trans-2nonenal v pive.
-40 Laboratórium A: Tolerancia pri rýchlenom starnutí
Porovnanie piva vareného zo sladu línie G a kontrolného cv Nevada sladu, v prvom varnom pokuse (tabuľka 3) demonštruje, že pivo z línie G malo vyššiu chuťovú stabilitu a nižší obsah ŕra/?s-2-nonenalu po rýchlenom starnutí v porovnaní s kontrolami. Druhý pokus, porovnávajúci pivo varené zo sladu z línie G s pivom vareným z cv Vintage sladu, sladu z rodičovského kultivaru, potvrdil prvé údaje (tabuľka 4).
Tabuľka 3
| Varný pokus 1 | ||
| Jačmenný slad | cv Nevada | línia G |
| SO2 obsah (mg/ml) | 1 | 1 |
| T2N“ (ppb) - čerstvé pivo | 0,009 | 0,005 |
| T2N“ (ppb) -staré pivo (37 °C/7 dní) | 0,117 | 0,025 |
| Chuť* - čerstvé pivo | 5,9 | 5,3 |
| Chuť - staré pivo (37 °C/7 dní) | 1,3 | 5,1 |
‘Chuťová hodnotová škála 1 až 10 zvyšujúcej sa kvality; “ŕrans-2-nonenal
Tabuľka 4
| Varný pokus 2 | ||
| Jačmenný slad | cv Vintage | línia G |
| SO2 obsah (mg/ml) | 2 | 2,5 |
| T2N“ (ppb) - čerstvé pivo | 0,023 | 0,019 |
| T2N“ (ppb) -staré pivo (37 °C/7 dní) | 0,078 | 0,035 |
| Chuť* - čerstvé pivo | 5,5 | 6,1 |
| Chuť - staré pivo (37 °C/7 dní) | 2,9 | 5,9 |
‘Chuťová hodnotová škála 1 až 10 zvyšujúcej sa kvality; “ŕrans-2-nonenal
Laboratórium B: Tolerancia pri uskladňovaní pri 30 °C
Pivo uvarené zo sladu z línie G malo nižšie hladiny ŕrans-2-nonenalu po 6 a 12 týždňov pri zvýšenej skladovacej teplote 30 °C, keď sa porovnávalo z pivom
-41 vareným z jedného z referenčných sladov (tabuľky 5 a 6) a chuťovým panelom bolo posúdené, že malo lepšiu chuťovú stabilitu. Chuťový prah pre írans-2-nonenal v týchto analyzovaných pivách je v blízkosti 0,08 ppb.
Tabuľka 5
| Varný pokus 1 | ||
| Jačmenný slad | cv Nevada | Línia G |
| ŕrans-2-nonenal (ppb) - čerstvé pivo | 0,050 | 0,044 |
| ŕrans-2-nonenal (ppb) - 30 °C/6 týždňov | 0,072 | 0,037 |
| ŕrans-2-nonenal (ppb) - 30 °C/12 týždňov | 0,095 | 0,046 |
| ŕrans-2-nonenalová chuť* - čerstvé pivo | 0,6 | 0,3 |
| ŕrans-2-nonenalová chuť* - 30 °C/6 týždňov | 3,7 | 1,4 |
| ŕrans-2-nonenalová chuť* - 30 °C/12 týždňov | 2,5 | 0,6 |
*trans-2-nonenalové chuťové detekčné skóre v škále 1 až 10
Tabuľka 6
| Varný pokus 2 | ||
| Jačmenný slad | cv Vintage | Línia G |
| ŕrans-2-nonenal (ppb) - čerstvé pivo | 0,070 | 0,062 |
| ŕrans-2-nonenal (ppb) - 30 °C/6 týždňov | 0,093 | 0,070 |
| trans-2-nonenal (ppb) - 30 °C/12 týždňov | 0,133 | 0,080 |
| ŕrans-2-nonenalová chuť* - čerstvé pivo | 0,3 | 0,9 |
| ŕrans-2-nonenalová chuť* - 30 °C/6 týždňov | 2,5 | 1,7 |
| ŕrans-2-nonenalová chuť* - 30 °C/12 týždňov | 2,2 | 1,3 |
*ŕrans-2-nonenalové chuťové detekčné skóre v škále 1 až 10
Z kombinácie údajov z varných pokusov sa ukázalo, že zlepšená chuťová stabilita piva vareného zo sladu línie G, ako bola meraná prostredníctvom hladín ľrans-2-nonenalu detegovaných v pive po skladovaní pri 30 °C, je štatisticky významná (tabuľka 7).
-42Tabuľka 7
7rans-2-nonenal v skladovanom pive
| Čerstvé | priemer | št. odch. | rozdiel | 2-smer. p | Významnosť (P < 0,05) |
| Referencia | 0,060 | 0,012 | 0,007 | 0,34 | nie |
| línia G | 0,053 | 0,011 |
| 6 týždňov, 30°C | priemer | št. odch. | rozdiel | 2-smer. p | Významnosť (P < 0,05) |
| Referencia | 0,083 | 0,013 | 0,029 | 0,031 | áno |
| línia G | 0,054 | 0,021 |
| 12 týždňov, 30 °C | priemer | št. odch. | rozdiel | 2-smer. p | Významnosť (P <0,05) |
| Referencia | 0,114 | 0,023 | 0,051 | 0,003 | áno |
| línia G | 0,063 | 0,020 |
Keďže hladiny prirodzeného sulfidu boli v oboch varných pokusoch nízke, hladiny voľného ŕrans-2-nonenalu v starom pive tesne odrážajú ŕrans-2-nonenalový potenciál rôznych pív, konkrétne hladinu írans-2-nonenalových aduktov nachádzajúcich sa v čerstvom pive. Pridanie sulfidu môže dočasne oddialiť proces tuchnutia prostredníctvom vytvárania komplexu s voľným ŕrans-2-nonenalom, pokiaľ sú hladiny sulfidu redukované prostredníctvom oxidácie vďaka výmene plynov cez balenie.
Opísané varné pokusy so sladom z jačmeňa s nízkou aktivitou LOX-1 poskytujú prvý jednoznačný dôkaz toho, že LOX-1 aktivita v jačmeni v priebehu výroby sladu a varného procesu je kľúčovým determinantom objavenia sa nežiadúcej chuťovej zlúčeniny ŕrans-2-nonenalu v starom pive.
Vyššie uvedený opis zahŕňa citácie mnohých publikácií. Každá publikácia je tu komplete zahrnutá prostredníctvom jej citácie na všetky účely.
Claims (39)
1. Jačmenná rastlina alebo jej časť, ktorá obsahuje mutovaný LOX-1 proteín, kde LOX-1 aktivita rastliny alebo rastlinnej časti je redukovaná alebo chýba v porovnaní s nemutovanou kontrolou.
2. Jačmenná rastlina alebo jej časť podľa nároku 1, kde LOX-1 aktivita zahŕňa katalyzovanie oxidácie voľných a esterifikovaných polynenasýtených mastných kyselín a polynenasýtených oktadekánových mastných kyselín, na vytvorenie derivátov 9-hydroperoxydovej mastnej kyseliny.
3. Jačmenná rastlina alebo jej časť podľa nároku 1 alebo 2, kde LOX-1 proteín je kódovaný mutovanou lox-1 nukleokyselinovou sekvenciou majúcou jednu alebo viacero mutácií.
4. Jačmenná rastlina alebo jej časť podľa nároku 3, kde jedna alebo viacero mutácií je indukovaná chemickou mutagenézou alebo žiarením.
5. Jačmenná rastlina alebo jej časť podľa nároku 3 alebo nároku 4, kde jedna alebo viacero mutácií je/sú indukovaná/indukované miestne špecifickou mutagenézou.
6. Jačmenná rastlina alebo jej časť podľa nároku 3 alebo nároku 4, kde uvedená jedna alebo viacero mutácií je umiestnených vo vnútri promótora alebo transkribovanej oblasti lox-1 nukleokyselinovej sekvencie.
7. Jačmenná rastlina alebo jej časť podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 6, kde mutáciou je nukleokyselinová substitúcia v polohe +2347 lox-1 génu.
8. Jačmenná rastlina alebo jej časť podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde mutovaný LOX-1 proteín obsahuje kyslú, zásaditú alebo polárnu aminokyselinovú substitúciu jedného alebo viacerých konzervovaných neutrálnych
-44alebo hydrofóbnych aminokyselinových zvyškov lemujúcich substrátovú dutinu štandardného jačmenného LOX-1.
9. Jačmenná rastlina alebo jej časť podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde mutovaný LOX-1 proteín obsahuje nekonzervatívne aminokyselinové substitúcie jedného alebo viacerých z nasledujúcich aminokyselinových zvyškov štandardného LOX-1: Y224. ί-26θ. W355> E364, θ368> V369. N370,I374, L424, L499, K501, A502, V504, D508, S509, H512, Osu. L514, H517, W518 H522, I556, L559, A56O, L564. I565, I570. T574, S585, Q715. Y7I8. N724, Rľ25> P726. T727, L772 a Ιβ62·
10. Jačmenná rastlina alebo jej časť podľa nároku 9, kde mutovaný LOX-1 proteín obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú ako sekv. č. 12, kde Xaa znamená kyslú, zásaditú alebo polárnu aminokyselinu.
11. Jačmenná rastlina alebo jej časť podľa nároku 10, kde Xaa znamená kyselinu glutámovú alebo kyselinu asparágovú.
12. Jačmenná rastlina alebo jej časť podľa nároku 11, kde Xaa znamená kyselinu asparágovú.
13. Jačmenná rastlina alebo jej časť podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, kde mutovaný LOX-1 proteín obsahuje nekonzervatívnu aminokyselinovú substitúciu jedného alebo viacerých nasledujúcich aminokyselinových zvyškov jačmenného LOX-1: H517, Hs22> Hzos. 712 θ ľs62-
14. Jačmenná rastlina alebo jej časť podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, kde mutovaný LOX-1 proteín obsahuje nekonzervatívnu aminokyselinovú substitúciu jedného alebo viacerých nasledujúcich aminokyselinových zvyškov štandardného jačmenného LOX-1: Η26ι, H512, H775. F259, F267, F713. W518, R551, R725, D778 a K273·
15. Transgénna jačmenná rastlina alebo jej časť, ktorá obsahuje heterologickú nukleokyselinovú sekvenciu exprimujúcu antisense sekvenciu voči aspoň časti transkribovanej oblasti jačmenného lox-1 génu, pričom táto heterologická sekvencia je operatívne spojená s génovou promótorovou sekvenciou a transkripčnou terminátorovou sekvenciou.
16. Transgénna jačmenná rastlina alebo jej časť podľa nároku 15, kde uvedený génový promótor riadi konštitutívnu expresiu antisense sekvencie.
17. Transgénna jačmenná rastlina alebo jej časť podľa nároku 15 alebo 16, kde uvedený génový promótor riadi tkanivovo špecifickú alebo časovo regulovanú expresiu operatívne pripojenej antisense sekvencie v tkanivách rastliny.
18. Transgénna jačmenná rastlina alebo jej časť podľa nároku 17, kde tkanivom je vyvíjajúce sa, klíčiace alebo zrelé embryotické tkanivo.
19. Transgénna jačmenná rastlina alebo jej časť podľa nároku 18, kde génovou promótorovou sekvenciou je promótor jačmenného lox-1 génu alebo jeho časť.
20. Zrnové alebo rastlinné potomstvo produkované z jačmennej rastliny alebo jej časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 19.
21. Rastlinný produkt, vyznačujúci sa tým, že je vyrobený z jačmennej rastliny alebo jej časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 19 alebo zo zrnového alebo rastlinného potomstva podľa nároku 20.
22. Rastlinný produkt podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že je ním slad.
23. Nápoj, vyznačujúci sa tým, že je vyrábaný použitím rastlinného produktu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 22.
24. Pivo, vyznačujúce sa tým, že je vyrábané použitím rastlinného produktu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 22.
25. Použitie rastlinného produktu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 22 na prípravu nápoja vykazujúceho organoleptické kvality, ktoré ostávajú stabilné počas meranej periódy alebo pri zvýšených uskladňovacích teplotách, v porovnaní s nápojom pripraveným z rastlinného produktu nemutovanej kontroly.
26. Použitie jačmennej rastliny alebo jej časti, zrnového alebo rastlinného potomstva alebo rastlinného produktu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 22 na výrobu nápoja.
27. Použitie jačmennej rastliny alebo jej časti, zrnového alebo rastlinného potomstva alebo rastlinného produktu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 22 na výrobu sladu alebo piva.
28. Použitie jačmennej rastliny alebo jej časti, zrnového alebo rastlinného potomstva alebo rastlinného produktu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 22 na stabilizáciu organoleptických vlastností vareného produktu v priebehu meranej časovej periódy v porovnaní s kontrolným vareným produktom produkovaným použitím nemutovanej jačmennej rastliny alebo jej časti, zrnového alebo rastlinného potomstva alebo rastlinného produktu.
29. Použitie jačmennej rastliny alebo jej časti, zrnového alebo rastlinného potomstva alebo rastlinného produktu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 22 na výrobu vareného produktu majúceho znížené hladiny voľného trans-2-nonenalu v priebehu meranej časovej periódy alebo v podmienkach zvýšenej skladovacej teploty, v porovnaní s kontrolným vareným produktom produkovaným použitím nemutovanej jačmennej rastliny alebo jej časti, zrnového alebo rastlinného potomstva alebo rastlinného produktu.
30. Nápoj vyrobený z jačmennej rastliny alebo jej časti, zrnového alebo rastlinného potomstva alebo rastlinného produktu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 22, vyznačujúci sa tým, že má znížený obsah trans-2-nonenalu v priebehu meranej časovej periódy alebo v podmienkach zvýšenej skladovacej teploty, v porovnaní s kontrolným vareným produktom produkovaným použitím nemutovanej jačmennej rastliny alebo jej časti, zrnového alebo rastlinného potomstva alebo rastlinného produktu.
31. Nápoj podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že ním je pivo.
32. Spôsob výroby piva z jačmeňa, vyznačujúci sa tým, že jačmeň alebo jeho časť obsahuje mutovaný LOX-1 proteín, pričom LOX-1 aktivita uvedenej rastliny alebo rastlinnej časti je znížená alebo chýba v porovnaní s nemutovanou kontrolou.
33. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že mutovaný LOX-1 proteín zahŕňa kyslú, zásaditú alebo polárnu aminokyselinovú substitúciu jedného alebo viacerých konzervovaných neutrálnych alebo hydrofóbnych aminokyselinových zvyškov lemujúcich substrátovú dutinu štandardného jačmenného LOX-1.
34. Spôsob podľa nároku 32 alebo 33, vyznačujúci sa tým, že mutovaný LOX-1 proteín obsahuje nekonzervatívne aminokyselinové substitúcie jedného alebo viacerých z nasledujúcich aminokyselinových zvyškov štandardného LOX-1: Y224, L268. W355, E364, G368> V369> Ν3γο, l374> L424> L499, K501, A502, V504, D508, S509, H512, Q513. L514, H517, W518 H522, l556> L559, A56O, L564, l565, I570. T574, S585, Q715. Y718> N724, R725> P726. T727> L772 a ls62-
35. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 32 až 34, vyznačujúci sa tým, že mutovaný LOX-1 proteín obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú ako sekv. č. 12, kde Xaa znamená kyslú, zásaditú alebo polárnu aminokyselinu.
36. Spôsob podľa nároku 35, vyznačujúci sa tým, že Xaa znamená kyselinu glutámovú alebo kyselinu asparágovú.
37. Spôsob podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým, že Xaa znamená kyselinu asparágovú.
38. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že mutovaný LOX-1 proteín obsahuje nekonzervatívnu aminokyselinovú substitúciu jedného alebo viacerých nasledujúcich aminokyselinových zvyškov jačmenného LOX-1: H517, H522, H708, 712 a Ιδ62·
39. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že mutovaný LOX-1 proteín obsahuje nekonzervatívnu aminokyselinovú substitúciu jedného alebo viacerých nasledujúcich aminokyselinových zvyškov štandardného jačmenného LOX-1: H261l H512, H775, F259, F267> F713, W518, R551, R725, D778 a K273I/29
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/IB2000/002045 WO2002053720A1 (en) | 2000-12-29 | 2000-12-29 | Low-lipoxygenase 1 barley |
| US09/751,687 US6660915B2 (en) | 2000-12-29 | 2000-12-29 | Low lipoxygenase 1 barley |
| PCT/IB2001/000207 WO2002053721A1 (en) | 2000-12-29 | 2001-01-22 | Low-lipoxygenase 1 barley |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK9372003A3 true SK9372003A3 (en) | 2004-05-04 |
Family
ID=26318622
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK937-2003A SK9372003A3 (en) | 2000-12-29 | 2001-01-22 | Low-lipoxygenase 1 barley |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1346030B1 (sk) |
| JP (1) | JP5004402B2 (sk) |
| CN (1) | CN100372930C (sk) |
| AT (1) | ATE531794T1 (sk) |
| BG (1) | BG66243B1 (sk) |
| BR (1) | BR0116579A (sk) |
| CA (1) | CA2433250C (sk) |
| CZ (1) | CZ298689B6 (sk) |
| DK (1) | DK1346030T3 (sk) |
| EA (1) | EA007955B1 (sk) |
| EE (1) | EE05567B1 (sk) |
| ES (1) | ES2376415T3 (sk) |
| HU (1) | HUP0401290A3 (sk) |
| NZ (1) | NZ527171A (sk) |
| PL (1) | PL208246B1 (sk) |
| PT (1) | PT1346030E (sk) |
| SK (1) | SK9372003A3 (sk) |
| UA (1) | UA88130C2 (sk) |
| WO (1) | WO2002053721A1 (sk) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4113795B2 (ja) * | 2003-03-25 | 2008-07-09 | サッポロビール株式会社 | 大麦リポキシゲナーゼ−１遺伝子、大麦の選抜方法、麦芽アルコール飲料用原料及び麦芽アルコール飲料の製造方法 |
| US7420105B2 (en) | 2004-03-11 | 2008-09-02 | Carlsberg A/S | Barley for production of flavor-stable beverage |
| SG171940A1 (en) * | 2008-12-03 | 2011-07-28 | Carlsberg Breweries As | Barley and malt-derived beverages with low dimethyl sulfide level |
| US9587210B2 (en) | 2008-12-03 | 2017-03-07 | Carlsberg Breweries A/S | Energy saving brewing method |
| SA109310019B1 (ar) | 2008-12-30 | 2014-09-10 | Carlsberg Breweries As | شعير له نشاط ليبوأوكسجيناز منخفض |
| CA2783549A1 (en) * | 2009-12-18 | 2011-06-23 | Keygene N.V. | Improved bulked mutant analysis |
| CA2801142C (en) * | 2010-06-03 | 2019-04-30 | Heineken Supply Chain B.V. | Energy saving brewing method |
| JP2017205038A (ja) * | 2016-05-17 | 2017-11-24 | サッポロビール株式会社 | ビールテイスト飲料、ビールテイスト飲料の製造方法、及びビールテイスト飲料の香味向上方法 |
| JP2017205036A (ja) * | 2016-05-17 | 2017-11-24 | サッポロビール株式会社 | ビールテイスト飲料、ビールテイスト飲料の製造方法、及びビールテイスト飲料の香味向上方法 |
| JP6691826B2 (ja) * | 2016-06-01 | 2020-05-13 | サッポロビール株式会社 | 蒸留酒類 |
| EP3736321A1 (en) | 2016-07-01 | 2020-11-11 | Carlsberg Breweries A/S | Refined cereal-based beverages |
| CN106405024B (zh) * | 2016-08-25 | 2018-08-24 | 青岛啤酒股份有限公司 | 一种评价麦芽脂质氧化程度的方法 |
| CN111527192A (zh) | 2017-12-28 | 2020-08-11 | 嘉士伯有限公司 | 生产谷物提取物的方法以及将这种提取物加工成饮料的方法 |
| EP4324902A3 (en) | 2017-12-28 | 2024-05-22 | Carlsberg A/S | Fast methods for preparing cereal extracts |
| JP2021524753A (ja) | 2018-04-25 | 2021-09-16 | カールスバーグ エー／エス | 大麦ベースの飲料 |
| CN111718974B (zh) * | 2020-06-29 | 2021-09-24 | 中食都庆（山东）生物技术有限公司 | 绿豆肽在制备促排铅的药物中的应用、活性肽及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1339684C (en) | 1988-05-17 | 1998-02-24 | Peter H. Quail | Plant ubquitin promoter system |
| EP0859836A1 (en) * | 1995-10-13 | 1998-08-26 | Purdue Research Foundation | Improvement of fruit quality by inhibiting production of lipoxygenase in fruits |
| US5844121A (en) | 1996-01-19 | 1998-12-01 | The Texas A & M University System | Method of inhibiting mycotoxin production in seed crops by modifying lipoxygenase pathway genes |
-
2001
- 2001-01-22 CZ CZ20031872A patent/CZ298689B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 PL PL363480A patent/PL208246B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 JP JP2002555231A patent/JP5004402B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-01-22 WO PCT/IB2001/000207 patent/WO2002053721A1/en active IP Right Grant
- 2001-01-22 CA CA2433250A patent/CA2433250C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-01-22 EE EEP200300257A patent/EE05567B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 ES ES01902597T patent/ES2376415T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 CN CNB01822489XA patent/CN100372930C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-01-22 EP EP01902597A patent/EP1346030B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 DK DK01902597.2T patent/DK1346030T3/da active
- 2001-01-22 HU HU0401290A patent/HUP0401290A3/hu unknown
- 2001-01-22 EA EA200300743A patent/EA007955B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 AT AT01902597T patent/ATE531794T1/de active
- 2001-01-22 EP EP10011413A patent/EP2305797A3/en not_active Withdrawn
- 2001-01-22 PT PT01902597T patent/PT1346030E/pt unknown
- 2001-01-22 UA UA2003077122A patent/UA88130C2/uk unknown
- 2001-01-22 SK SK937-2003A patent/SK9372003A3/sk unknown
- 2001-01-22 BR BR0116579-8A patent/BR0116579A/pt not_active Application Discontinuation
- 2001-01-22 NZ NZ527171A patent/NZ527171A/en not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-07-04 BG BG107971A patent/BG66243B1/bg unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE531794T1 (de) | 2011-11-15 |
| PL208246B1 (pl) | 2011-04-29 |
| UA88130C2 (uk) | 2009-09-25 |
| HUP0401290A2 (hu) | 2004-09-28 |
| EP2305797A2 (en) | 2011-04-06 |
| PL363480A1 (en) | 2004-11-15 |
| CA2433250A1 (en) | 2002-07-11 |
| CZ20031872A3 (cs) | 2003-11-12 |
| JP2004522434A (ja) | 2004-07-29 |
| EE200300257A (et) | 2003-10-15 |
| BR0116579A (pt) | 2004-04-20 |
| EP1346030B1 (en) | 2011-11-02 |
| EA007955B1 (ru) | 2007-02-27 |
| HUP0401290A3 (en) | 2005-06-28 |
| BG107971A (bg) | 2004-09-30 |
| BG66243B1 (bg) | 2012-08-31 |
| PT1346030E (pt) | 2012-02-08 |
| EP1346030A1 (en) | 2003-09-24 |
| DK1346030T3 (da) | 2012-02-13 |
| ES2376415T3 (es) | 2012-03-13 |
| EA200300743A1 (ru) | 2004-02-26 |
| EE05567B1 (et) | 2012-08-15 |
| CZ298689B6 (cs) | 2007-12-19 |
| CA2433250C (en) | 2015-08-11 |
| WO2002053721A1 (en) | 2002-07-11 |
| CN100372930C (zh) | 2008-03-05 |
| EP2305797A3 (en) | 2011-07-13 |
| JP5004402B2 (ja) | 2012-08-22 |
| NZ527171A (en) | 2005-07-29 |
| CN1487995A (zh) | 2004-04-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20190078042A1 (en) | Barley for production of flavor-stable beverage | |
| US9363959B2 (en) | Barley with reduced lipoxygenase activity and beverage prepared therefrom | |
| JP5004402B2 (ja) | 低リポキシゲナーゼ１オオムギ | |
| AU2009321894B2 (en) | Barley and malt-derived beverages with low dimethyl sulfide level | |
| JP6007174B2 (ja) | エネルギーを節約した醸造法 | |
| US20170183611A1 (en) | Energy saving brewing method | |
| US6660915B2 (en) | Low lipoxygenase 1 barley | |
| AU2001230454B2 (en) | Low-lipoxygenase 1 Barley | |
| WO2002053720A1 (en) | Low-lipoxygenase 1 barley | |
| AU2001230454A1 (en) | Low-lipoxygenase 1 Barley |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FB9A | Suspension of patent application procedure |