PL208246B1

PL208246B1 - Roślina jęczmienia, jej część, ziarno, potomstwo rośliny, produkt roślinny, zastosowanie produktu roślinnego i zastosowanie rośliny jęczmienia, jej części, ziarna i potomstwa

Info

Publication number: PL208246B1
Application number: PL363480A
Authority: PL
Inventors: Anna Christiana Douma; Albert Doderer; Varena Cameron-Mills; Birgitte Skadhauge; Lene Molskov Bech; Nathalie Schmitt; Jolanda Carolina Heistek; Mechelen Johannes Reinier Van
Original assignee: Carlsberg Res Lab; Heineken Tech Services; Kronenbourg Brasseries
Priority date: 2000-12-29
Filing date: 2001-01-22
Publication date: 2011-04-29
Also published as: HUP0401290A2; WO2002053721A1; DK1346030T3; EP1346030B1; UA88130C2; PT1346030E; NZ527171A; CA2433250A1; HUP0401290A3; CA2433250C; EP2305797A3; CZ298689B6; BR0116579A; ES2376415T3; PL363480A1; EA200300743A1; CN1487995A; JP2004522434A; CN100372930C; EE200300257A

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy rośliny jęczmienia zawierającej zmutowane białko LOX-1 o obniżonej lub niewystępującej aktywności w porównaniu z nie-zmutowaną kontrolą, części takiej rośliny, jej ziarna, potomstwa, produktu roślinnego, zastosowania takiego produktu roślinnego i zastosowania rośliny jęczmienia, jej części, ziarna lub potomstwa.

Dziedzina wynalazku

Wynalazek ten dotyczy dziedziny biotechnologii roślin. Dokładniej, wynalazek dotyczy zmutowanego genu lipooksygenazy 1 jęczmienia kodującego enzym o silnie zredukowanej aktywności tworzenia kwasu 9-hydroperoksyoktadekanowego. Wynalazek dotyczy również zastosowania odmian uprawnych jęczmienia homozygotycznych pod względem lox-1 w procesie warzenia w celu zredukowania tworzenia obcego smaku w produktach warzonych, takich jak piwo, podczas przechowywania.

Stan techniki

Lipooksygenazy należą do rodziny enzymów (EC 1.13.11.12), które katalizują dioksydację wolnych i zestryfikowanych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych zawierających konfigurację 1(Z), 4(Z)pentadienową. Przez długi czas podejrzewano, że produkty reakcji katalizowanych przez lipooksygenazy są głównymi sprawcami pojawiania się nieświeżego posmaku (ang. stale flavors) w produktach żywnościowych z ziarna/nasion roślin i pochodzących z ziarna/nasion (Robinson i wsp., 1995, Food Chem., 54:33 - 43). Lipooksygenazy są również zaangażowane w wytwarzanie lotnych aldehydów heksanalowych wytwarzanych podczas obróbki soi, które cechują się niepożądanym aromatem, co ogranicza zastosowanie białek soi w produktach żywnościowych. Uważa się, że do oksydacji lipidów i tworzenia heksanali przyczyniają się trzy izoenzymy lipooksygenazy eksprymowane w nasionach soi. W celu zmniejszenia tworzenia heksanalu i poprawienia stabilnoś ci ich smaku wytworzono mutanty soi pozbawione jednego lub więcej z tych izoenzymów. Powodzenie tych eksperymentów oceniane było przez Hilderbrada i wsp., J. Agric. Food Chem., 38:1934 - 1936. Mutanty nieposiadające lipooksygenazy 3 z soi wytwarzały wyższe poziomy haksanalu, co sugeruje, że izoenzym ten przekształca 13-hydroksyperoksyoktadekanoidy, wytwarzane przez oksydację tłuszczy, w produkty nielotne. Badania polowe potrójnie-zerowych linii soi, nieposiadających wszystkich trzech lipooksygenaz z nasion wykazały, że enzymy te nie są niezbędne dla prawidłowej charakterystyki agronomicznej oraz ziarna (Narvel i wsp., 1998, Crop Sci, 38:926 - 928).

Lipooksygenazy uwikłane są również w wytwarzanie obcego smaku (ang. off-flavors) w ryżu, który może się pojawić w trakcie przechowywania ziarna. W magazynowanym ziarnie można wykryć uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych, co wskazuje na metabolizm rezerw trój glicerydów. Stwierdzono, że odmiana ryżu Daw Dam akumuluje mniejsze poziomy pentanali i haksanali, co skutkuje lepszą stabilnością smaku podczas przechowywania. (Susuki i wsp., 1999, J. Agric. Food Chem., 47: 1119-1124). Do tego pożądanego fenotypu przyczyniał się brak lipooksygenazy-3 z ryżu, która utlenia nienasycone łańcuchy lipidowo-acylowe z wytworzeniem pozycyjnych izomerów 9-hydroksyperoksyoktadekanowych.

Stwierdzono, że szlak lipooksygenazowy jest złożony i posiada wiele odgałęzień, a jego rola w szeregu aspektach wzrostu i fizjologii roślin nie została w pełni zrozumiana. Proponuje się, że modyfikacje szlaku lipooksygenazowego, które zmieniają aktywność 9-hydroperoksydacji w plonach nasiennych regulują ich podatność na zanieczyszczenie mykotoksyną przez Aspegillus ssp. (WO 9726364), co pozostaje w zgodzie z udziałem tego szlaku w odporności roślin na patogeny, ale nie jest związane z celami tu opisanego wynalazku.

Wśród wielu zapachowych substancji lotnych, które mają wpływ na smak piwa wyższe nienasycone aldehydy o 6 - 12 węglowym łańcuchu posiadają szczególnie niski organoleptyczny próg wyczuwalności smakowej (ang. flavor treshhold) (Meigaard 19975, MBAA Tech. Quart. 12: 151 - 168). Trans-2-nonenal, który jest członkiem tej grupy, wykazuje zarówno niezwykle niski próg wyczuwalności smakowej 0,11 ppb, jak i przyczynia się do pojawienia się nieprzyjemnego podobnego do słomianego, „kartonowego” smaku piwa. Charakterystyczny obcy smak spowodowany trans-2-nonenalem jest typową cechą piw przechowywanych 1 - 3 miesięcy lub dłużej i jest szczególnie szkodliwy dla piwa typu lager (piwa dolnej fermentacji), które warzy się z lekkimi słodami i które ma delikatny smak.

Długo uważano, że siarczyn poprawia stabilność smaku piwa nie tylko poprzez wiązanie tlenu i działanie jako antyutleniacz, ale również poprzez tworzenie lotnych dwusiarczynowych związków addycyjnych z aldehydami i ketonami obecnymi w piwie. Dwoma głównymi źródłami siarczynu w piwie są siarczyny wytwarzane podczas fermentacji drożdżowej poprzez szlak asymilacji siarki oraz siarczyny

PL 208 246 B1 dodawane do piwa przed rozlewaniem. Warunki fermentacji, które zwiększają wytwarzanie i wydzielanie siarczynów przez drożdże pozwolą na tworzenie siarczynowo-karbonylowych związków addycyjnych z karbonyli obecnych w brzeczce i zabezpieczą przed ich dalszym metabolizowaniem przez drożdże. (Dufour 1991, Proc. Eur. Brew. Conv. Congr., Lizbona, str. 209 - 216). W ten sposób karbonyle, takie jak aldehyd octowy i diacetyl, mogą zostać przeniesione do piwa. Zdolność siarczynu do zapobiegania występowaniu związku karbonylowego, trans-2-nonenalu, podczas starzenia piwa została wykazana poprzez warzenie piwa z użyciem szczepu drożdży z blokadą w szlaku asymilacji siarki. (Johannesen i wsp., 1999, Proc. Eur. Brew. Conv. Congr., Nicea, str. 655 - 662). Po butelkowaniu piwo poddano wymuszonemu starzeniu przez przechowywanie przez 7 dni w 37°C, po którym to okresie poziomy trans-2-nonenalu były dużo powyżej progu wyczuwalności smakowej. Gdy 10 ppm siarczynu dodano do nisko siarczynowego piwa bezpośrednio przed butelkowaniem znacząco zmniejszyło się występowanie trans-2-nonenalu podczas wymuszonego starzenia. Reakcja między siarczynem a karbonylem jest odwracalna i znajduje się pod kontrolą termodynamiczną i kinetyczną. Obserwowane stałe równowagi dla związków dwusiarczynowych mieszczą się w zakresie od 10^-6 dla związków karbonylowych, takich jak aldehyd octowy, heksanal, dekanal, do 10^-3 dla diacetylu i pirogronianu (Dufour 1991, powyżej). Podczas przechowywania piwa wymiana gazowa przez opakowanie pozwoli na wniknięcie tlenu do piwa i siarczyn zostanie utracony, tak, że słabsze dwusiarczynowe związki addycyjne ulegną dysocjacji, pozwalając na wystąpienie w piwie wolnych karbonyli. Podczas gdy siarczyny bezsprzecznie zwiększają stabilność smaku piwa, szczególnie w krótkim okresie, to jego czas utrzymywania się w zapakowanym piwie w dużym stopniu zależy od wymiany gazowej przez opakowanie i temperatury. W końcowym piwie naturalne poziomy siarczynu wytworzonego podczas fermentacji są zróżnicowane a dodanie siarczynu przed butelkowaniem nie jest uniwersalnie akceptowaną praktyką. Z tych powodów sam siarczyn nie dostarcza wiarygodnego sposobu zwiększania długoterminowej stabilności smaku piwa w różnych warunkach przechowywania piwa stosowanych na świecie.

Ogólnie rzecz biorąc przyjmuje się, że wykrywany w piwie trans-2-nonenal jest wynikiem utleniania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych pochodzących z lipidów ziarna jęczmienia, w których 18-węglowy łańcuch kwasu tłuszczowego, kwas linolowy [klasyfikowany jako 18:2, n-6 wielonienasycony kwas tłuszczowy (Broun, Gettner i Somerville 1999, Annu. Rev. Nutr. 19: 197 - 216)] występuje najliczniej. Jednakże nie ma zgodności w literaturze w jaki sposób tworzy się trans-2-nonenal. Sugerowano obecność szlaków enzymatycznych prowadzących do tworzenia trans-2-nonenalu z wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, ale nigdy nie przedstawiono eksperymentalnie poszczególnych etapów w ziarnie jęczmienia lub podczas procesu słodowania (Gardner 1988, Adv. Cereal Sci. Technol., 9: 161 - 215). Zaproponowano koncepcję zastosowania technologii antysensownej lub współ supresji genu w celu zmniejszenia poziomów lipooksygenazy 1 w ziarnie jęczmienia i w ten sposób kontrolowania 9-hydroperoksydacji oraz zmniejszania poziomów aldehydu i alkoholu w końcowym ziarnie jęczmienia w celu kontrolowania tworzenia obcego smaku, ale wyników takiego doświadczenia nie przedstawiono (McElroy i Jacobsen, 1995, Bio/Technology 13: 245 - 249).

Opracowano test tłoczenia (ang. forcing test) jako sposób szacowania potencjału trans-2-nonenalu w piwie, w którym indukuje się tworzenie trans-2-nonenalu w brzeczce lub piwie przez poddanie próbek działaniu podwyższonych temperatur i zmniejszonego pH, (100°C, przy pH 4,0 przez 2 godziny). Próby skorelowania potencjału trans-2-nonenalu w brzeczce i końcowym piwie z całkowitym poziomem aktywności lipooksygenazy w wysuszonym słodzie wskazywały, że lipooksygenaza może przyczyniać się do występowania trans-2-nonenalu w starym piwie (Drost i wsp., 1990, J. Am. Soc. Brew. Chem. 48: 124 - 131). Wnioski, które można wysunąć z tego badania, są jednakże poważnie ograniczone faktem, że aktywność lipooksygenazy w słodzie jęczmiennym regulowano na końcu procesu słodowania przez stopień inaktywacji enzymu podczas suszenia w piecu. Zatem badano jedynie wpływ pozostającej aktywności lipooksygenazy w słodzie na potencjał trans-2-nonenalu w pochodnej brzeczce i końcowym piwie. Badanie nie pozwoliło na okreś lenie lipooksygenaz, które katalizują pierwszy etap w enzymatycznym szlaku lipooksygenazowym w ziarnie jęczmienia w trakcie rozwoju i słodowania, i ich roli jako determinant poziomów trans-2-nonenalu wykrywanych w piwie. Rzeczywiście brak odmian uprawnych jęczmienia pozbawionych jednego lub więcej izoenzymów lipooksygenazy uniemożliwił dostarczenie przekonujących dowodów na to, że szlak lipooksygenazowy w słodzie jęczmiennym odgrywa rolę w kontrolowaniu tworzenia trans-2-nonenalu. Tego rodzaju eksperymenty potrzebne są do oceny udziału szlaku enzymatycznego, w porównaniu do szlaków autooksydacyjnych/chemicznych, w tworzeniu trans-2-nonenalu w piwie. Proces warzenia wymaga etapu

PL 208 246 B1 wysokiej temperatury przy gotowaniu brzeczki, w którym uważa się, że zachodzą reakcje nieenzymatyczne (Noel i wsp., 1999, J. Agric. Food Chem. 47: 4323 - 4326).

Podsumowanie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest roślina jęczmienia lub jej część, charakteryzująca się tym, że zawiera zmutowane białko LOX-1, przy czym aktywność LOX-1 rośliny lub części rośliny jest zmniejszona lub nie występuje w porównaniu z niezmutowaną kontrolą, i przy czym to zmutowane białko LOX-1 zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID NO: 12, w której Xaa oznacza kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, histydynę, lizynę, argininę, treoninę, serynę, tyrozynę, tryptofan, asparaginę albo glutaminę.

Korzystnie aktywność LOX-1 obejmuje katalizę utleniania wolnych i zestryfikowanych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych oraz wielonienasyconych oktadekanowych kwasów tłuszczowych do wytworzenia pochodnych 9-hydroperoksy kwasu tłuszczowego.

Korzystnie Xaa stanowi kwas glutaminowy albo kwas asparaginowy.

Korzystniej Xaa stanowi kwas asparaginowy.

Przedmiotem wynalazku jest także ziarno lub potomstwo rośliny, charakteryzujące się tym, że zawiera zmutowane białko LOX-1, przy czym aktywność LOX-1 tej rośliny lub części rośliny jest zmniejszona lub nie występuje w porównaniu z nie-zmutowaną kontrolą, i przy czym zmutowane białko LOX-1 zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID NO: 12, w której Xaa oznacza kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, histydynę, lizynę, argininę, treoninę, serynę, tyrozynę, tryptofan, asparaginę albo glutaminę, i przy czym ziarno lub potomstwo rośliny jest wytworzone z rośliny lub części rośliny jak określono w jednym z zastrz. 1 do 4.

Przedmiotem wynalazku jest też produkt roślinny, charakteryzujący się tym, że zawiera zmutowane białko LOX-1, przy czym aktywność LOX-1 tej rośliny lub części rośliny jest zmniejszona lub nie występuje w porównaniu z nie-zmutowaną kontrolą, i przy czym zmutowane białko LOX-1 zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID NO: 12, w której Xaa oznacza kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, histydynę, lizynę, argininę, treoninę, serynę, tyrozynę, tryptofan, asparaginę albo glutaminę, i przy czym ten produkt roślinny jest wytworzony z rośliny lub części rośliny jak określono w jednym z zastrz. 1 do 4 albo ziarna lub potomstwa rośliny jak określono w zastrz. 5.

Korzystnie produkt ten stanowi słód.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie produktu roślinnego określonego powyżej, do wytwarzania napoju wykazującego właściwości organoleptyczne, które pozostają stabilne podczas mierzonego okresu czasu lub w podwyższonych temperaturach przechowywania w porównaniu do napoju wytworzonego z produktu roślinnego z niezmutowanej kontroli.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego jak określono powyżej, do wytwarzania napoju.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego jak określono powyżej, do wytwarzania słodu lub piwa.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego jak określono powyżej, do stabilizowania właściwości organoleptycznych produktu warzonego podczas mierzonego okresu czasu w porównaniu z kontrolnym produktem warzonym wytworzonym przy użyciu niezmutowanej rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego jak określono powyżej, do wytwarzania produktu warzonego posiadającego obniżone poziomy wolnego trans-2-nonenalu podczas mierzonego okresu czasu lub w warunkach o podwyższonej temperaturze przechowywania w porównaniu z kontrolnym produktem warzonym wytworzonym z użyciem nie-zmutowanej rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego.

Wynalazek ten dostarcza odmian uprawnych jęczmienia posiadających w dużym stopniu zmniejszoną aktywność lipooksygenazy 1. W jednym wykonaniu rośliny jęczmienia według wynalazku posiadają zmutowany gen lox-1 eksprymujący zmniejszone w dużym stopniu poziomy izoenzymu lipooksygenazy 1. W alternatywnym wykonaniu rośliny jęczmienia zawierają heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego eksprymującą sekwencję antysensowną dla dzikiego typu lox-1, zmniejszając w ten sposób aktywność enzymu.

Jak tu wykazano słód i brzeczka wytworzone z jęczmienia o obniżonej aktywności lipooksygenazy według wynalazku, na przykład z odmian uprawnych jęczmienia homozygotycznych pod względem

PL 208 246 B1 genu lox-1, są użyteczne do wytwarzania piwa o znacząco zwiększonej stabilności smaku i obniżonych poziomach trans-2-nonenalu, zwłaszcza w warunkach o których wiadomo, że promują występowanie T2N. Wynalazek przedstawia korelację między aktywnością lipooksygenazy 1 ze słodu jęczmiennego w wytwarzaniu kwasów 9-hydroksyperoksy-oktadekadienowych (9-HPOD) a obecnością trans-2-nonenalu w piwie. Wynalazek demonstruje ponadto, że zastosowanie jęczmienia homozygotycznego pod względem zmutowanego genu lox-1 w procesie warzenia poprawia stabilność smaku piwa zarówno podczas przechowywania, jak i podczas przechowywania w podwyższonych temperaturach.

Właściwości te zwiększają jakość piwa i są użyteczne do przedłużenia ich przydatności do spożycia oraz zmniejszają potrzebę chłodzenia piwa podczas transportu i przechowywania.

Wynalazek dostarcza roślin jęczmienia i ich części o zmniejszonej aktywności lipooksygenazy 1, w tym roś liny ję czmienia eksprymują ce zmutowane biał ko LOX-1 jak tu opisano. Zgodnie z wynalazkiem opisano również sposoby wytwarzania takich roślin jęczmienia, części roślin, produktów z tych roślin a zwłaszcza produktów słodowych i piwnych wytworzonych z roślin jęczmienia według wynalazku.

Krótki opis figur

Figura 1 przedstawia wykres pokazujący wpływ inhibitora kwasu nordihydrogwajakowego (NDGA) na aktywność oczyszczonej z użyciem chromatografii immunopowinowactwa lipooksygenazy 1 i 2 z zarodków ziarna jęczmienia 3 dni po skiełkowaniu.

Figura 2 przedstawia wykres pokazujący mokrą masę rozwijającego się ziarna Linii G i cv Vintage od 5 dni po kwitnieniu do pełnej dojrzałości (FM). Każdy wynik stanowi średnią masą pojedynczego ziarna z 6 kłosów.

Figura 3 przedstawia wykres pokazujący suchą masę rozwijającego się ziarna Linii G i cv Vintage od 5 dni po kwitnieniu do pełnej dojrzałości (FM). Każdy wynik stanowi średnią masą pojedynczego ziarna z 3 próbek z 5 ziaren.

Figura 4 przedstawia wykres pokazujący całkowitą aktywność lipooksygenazy w rozwijającym się ziarnie Linii G i cv Vintage od 5 dni po kwitnieniu do pełnej dojrzałości (FM).

Figura 5 przedstawia wykres pokazujący produkty 9- i 13-HPOD utlenienia kwasu linolowego powstałe dzięki aktywności liposooksygenazy w rozwijającym się ziarnie Linii G.

Figura 6 przedstawia wykres pokazujący całkowitą aktywność lipooksygenazy w zarodkach kiełkującego ziarna Linii G i cv Vintage wyrażone jako μmol/min/10 zarodków (jednostka/10 zarodków).

Figura 7 przedstawia wykres pokazujący produkty 9- i 13-HPOD utlenienia kwasu linolowego powstałe dzięki aktywności liposooksygenazy w rozwijającym się ziarnie Linii G i cv Vintage i pokazujący poziomy 9-HPOD i 13-HPOD.

Figura 8 przedstawia Western biot pokazujący immunodetekcję lipooksygenazy 1 w zarodkach rozwijającego się ziarna Linii G i cv Vintage [dziki typ] od 5 dni po kwitnieniu do pełnej dojrzałości (FM).

Figura 9 przedstawia Western biot pokazujący immunodetekcję lipooksygenazy 1 w zarodkach się ziarna Linii G i cv Vintage [dziki typ] kiełkowanych przez 0-6 dni.

Figura 10 przedstawia Nothern biot sondowany regionem 3' nie transkrybowanym cDNA lox-1 i obrazujący transkrypty lipooksygenazy 1 wykrywane w rozwijającym się ziarnie Linii G i cv Vintage [dziki typ] od 5 dni po kwitnieniu do pełnej dojrzałości (FM).

Figura 11 przedstawia Nothern biot sondowany z regionem 3' nietranskrybowanym cDNA lox-1 i obrazujący transkrypty lipooksygenazy 1 wykrywane w zarodkach ziarna Linii G i cv Vintage [dziki typ] kiełkowanych przez 0-6 dni.

Figura 12 A - 12 G stanowi dopasowanie sekwencji nukleotydowej promotora i transkrybowanego regionu lox-1 allelu dzikiego typu cv Vintage (DT) oraz allelu Linii G (LG). W sekwencjach genowych pokreślono miejsce startu transkrypcji (+1), kodon startu ATG (+69), oraz kodon stopu dla translacji (+4231). Mutacje nukleotydowe zidentyfikowane w allelu Linii G przedstawione są za pomocą pogrubionej kursywy i wskazane gwiazdką.

Figura 13 schematycznie przedstawia gen lox-1 cv Vintage (dziki typ) oraz zmutowany gen lox-1 Linii G. Transkrypt od +1 do +4375 składa się z 7 eksonów (kropkowane kasetki) i 6 intronów (białe kasetki). Wskazano dwie mutacje genu lox-1.

Figura 14 schematycznie przedstawia kasety genowe dla krótkotrwałej ekspresji dzikiego typu cDNA lox-1 i genu lox-1 oraz zmutowanego genu lox-1 z Linii G. Sekwencje kodujące lipooksygenazę wklonowano pomiędzy konstytutywnym promotorem ubikwityny z kukurydzy z intronem 1 (Ubi-1) a terminatorem nos.

PL 208 246 B1

Figura 15 stanowi wykres słupkowy przedstawiający aktywność Lipooksygenazy 1 w aleuronowych protoplastach jęczmienia transfekowanych kasetami genowymi zawierającymi cDNA dzikiego typu lox-1; zmutowany gen lox-1 z Linii G; gen DT lox-1oraz kontrolny gen reporterowy GUS. Aktywność lipooksygenazy w ekstraktach transfekowanych protoplastów oznaczano na płytkach do mikromianowania przez utlenianie KI i oznaczano ilościowo spektrofotometrycznie. Aktywność lipooksygenazy wyrażono jako jednostki na μg białka w ekstrakcie i przedstawiono jako średnią z 3 pomiarów z dwóch powtórzonych oznaczeń.

Figura 16 stanowi dopasowanie sekwencji wykazujące, że RFLP między dzikiego typu a zmutowanym genem lox-1 wynika z mutacji punktowej nukleotydu 2347, tworzącej dodatkowe miejsce cięcia dla enzymu restrykcyjnego AatII.

Figura 17 schematycznie przedstawia fragmenty PCR lox-1 zamplifikowane i cięte w łańcuchowej reakcji polimerazy - oznaczeniu cięcia zamplifikowanego miejsca polimorficznego (PCR-CAPS). Pozycje starterów do PCR wskazano strzałkami a miejsca Aat II przedstawiono powyżej genu (pozycja sekwencyjna). Regiony eksonów i intronów w obrębie produktów PCR rozróżniono oznaczeniem jako odpowiednio kropkowane lub białe kasetki oraz przedstawiono wielkości fragmentów trawienia Aat II.

Figura 18 stanowi obraz agarozowego żelu elektroforetycznego przedstawiający fragmenty PCR lox-1 (652 pz) zamplifikowane w pierwszym etapie oznaczenia PCR-CAPS na matrycy genomowego DNA Linii G i cv Vintage.

Figura 19 stanowi obraz agarozowego żelu elektroforetycznego przedstawiający RFLP wykryty przez PCR-CAPS w dzikiego typu i zmutowanym genie lox-1. Fragmenty trawienia Aat II zmutowanego genu obejmują unikalny fragment restrykcyjny 313 pz wskazany gwiazdką.

Figura 20 stanowi tabelę przedstawiającą program krzyżowania wstecznego dla pojedynczej recesywnej pary genowej ll (cecha niskiej aktywności lipooksygenazy) Linii G do cv Alexis. Genotyp LL stanowią rośliny eksprymujące aktywność lipooksygenazy dzikiego typu (allel dominujący), genotyp ll stanowią rośliny o niskiej aktywności lipooksygenazy (allel recesywny). LI stanowią heterozygotyczne rośliny zawierające zarówno allel dzikiego typu jak i allel niskiej aktywności lipooksygenazy. Ponieważ cecha niskiej aktywności lipooksygenazy jest cechą recesywną rośliny LI wykazują aktywność lipooksygenazy dzikiego typu. Po każdej rundzie krzyżowania wstecznego (włączając samozapylenie), oczekuje się, że potomstwo ll będzie stanowiło 25% potomstwa. Wskazano zaobserwowane częstotliwości występowania niskiej aktywności lipooksygenazy. Obliczony odsetek genetycznego tła o niskiej aktywności lipooksygenazy dla cv Alexis oznaczono jako % Alexis.

Figura 21 pokazuje agarozowy żel elektroforetyczny przedstawiający wykrywanie przez PCRCAPS zmutowanego genu lox-1 w potomstwie ll z programu krzyżowania wstecznego Linii G - Alexis. PCR-CAPS na genomowym DNA Linii G (linia 2), cv Vintage (linia 3), potomstwa ll trzeciej (linia 4) i czwartej (linie 5-9). Drabinka DNA (linia 1). Kontrola, krzyżowana wstecznie linia z wysoką aktywnością lox (linia 10).

Figury 22A - 22B stanowią porównawcze dopasowanie sekwencji aminokwasowych lipooksygenaz z soi LOX-1 (Gm1), LOX-2 (Gm2), LOX-3 (Gm3) oraz lipooksygenaz z jęczmienia LOX-1 (Hv1) i LOX-2 (Hv2).

Szczegółowy opis wynalazku

Zgodnie z wynalazkiem opisano materiały roślinne, produkty roślinne oraz sposoby wytwarzania napoju, takiego jak piwo, przy czym piwo posiada zmniejszoną zawartość związku przyczyniającego się do obcego smaku, trans-2-nonenalu, tak, że stabilność smaku napoju, np. piwa, w trakcie przechowywania i wystawienia na działanie podwyższonych temperatur jest poprawiona w stosunku do kontrolnego napoju. Dokładniej, wynalazek dostarcza odmian jęczmienia, którego rozwijające się i kiełkujące ziarno wytwarza znacząco zmniejszone poziomy enzymu lipooksygenazy 1, oznaczonej LOX-1, którego zastosowanie, na przykład, w procesie warzenia piwa skutkuje wytworzeniem piwa o zmniejszonych poziomach trans-2-nonenalu w porównaniu do kontrolnej odmiany jęczmienia.

Poniżej opisano sposoby stosowane do wytwarzania, charakteryzowania i oceny odmiany jęczmienia o znacząco obniżonej aktywności LOX-1 oraz zastosowania tego typu jęczmienia do wytwarzania piwa o stabilnym smaku.

1. Definicje

Następujące, użyte tu terminy posiadają wskazane definicje:

„Część rośliny” oznacza roślinę lub specyficzną część rośliny, taką jak łodyga, liście, korzenie, kwiaty, nasiona, ziarna, owoce lub pąki.

PL 208 246 B1 „LOX-1” oznacza białko lipooksygenazy 1; „lox-1” oznacza gen kodujący LOX-1.

„Zmutowany lox-1 z jęczmienia” oznacza poddany mutagenezie gen z jęczmienia kodujący zmutowany polipeptyd lipooksygenazy 1.

„Niezmutowana kontrola” oznacza roślinę, kwas nukleinowy, gen, polipeptyd, część rośliny lub produkt roślinny zawierający dzikiego typu gen lub białko.

„Heterologiczny” oznacza sekwencję niewystępującą naturalnie (nienatywną), np. sekwencję pochodzącą z innego gatunku, wytworzoną rekombinacyjnie lub sekwencję sztuczną, która różni się od sekwencji natywnej.

„Produkt roślinny” oznacza produkt będący wynikiem obróbki rośliny lub części rośliny i obejmuje, na przykład, słód i brzeczkę.

„Aminokwas kwasowy” oznacza kwas asparaginowy lub glutaminowy.

„Aminokwas zasadowy” oznacza histydynę, lizynę lub argininę.

„Aminokwas polarny” oznacza treoninę, serynę, tyrozynę, tryptofan, asparaginę lub glutaminę.

„Właściwości organoleptyczne” oznaczają właściwości ujawniające się zmysłom węchu i smaku, które są analizowane, na przykład przez wyszkolony zespół degustatorów.

„Produkt warzony” oznacza produkt wytworzony przez zacieranie, gotowanie i fermentowanie, np. piwo.

„Zmniejszony trans-2-nonenal” oznacza mniej niż około 50% w porównaniu z warunkami dzikiego typu (kontrolnymi).

2. Aktywność lipooksygenazy

Enzymy lipooksygenazy katalizują utlenianie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Znane są izoenzymy LOX-1 i LOX-2 jęczmienia. LOX-1 zasadniczo katalizuje 9-hydroperoksydację, podczas gdy LOX-2 zasadniczo katalizuje 13-peroksydację wielonienasyconych oktadekanowch kwasów tłuszczowych. Dane ukazane w przykładach poniżej przedstawiają korelację pomiędzy aktywnością 9-hydroperoksydacji LOX-1 jęczmienia a obecnością trans-2-nonenalu w piwie. Zgodnie z tym jęczmień o zmniejszonej aktywnoś ci LOX-1 jest użyteczny do wytwarzania piwa o zmniejszonym poziomie i/lub potencjale trans-2-nonenalu w porównaniu z kontrolą .

3. Wytwarzanie jęczmienia o niskiej aktywności lipooksygenazy

Do wytworzenia roślin według wynalazku można zastosować szereg różnych podejść genetycznych, to jest do zmniejszenia poziomu aktywności enzymatycznej lipooksygenazy 1 eksprymowanej w roślinie jęczmienia w stabilny, dziedzicznie przekazywany sposób. Podejścia te obejmują, ale bez ograniczania, technologię antysensowną i mutagenezę, taką jak mutageneza indukowana chemicznie lub promieniowaniem, jak również mutageneza ukierunkowana.

Transformacja jęczmienia. Jęczmień można transformować różnymi cząsteczkami kwasu nukleinowego zaprojektowanymi do manipulowania ekspresją genu lox-1 lub zmiany architektury genu lox-1. Do udanego wprowadzania kwasów nukleinowych do komórki jęczmienia, na przykład protoplastu, kalusa lub zarodka można stosować różne sposoby na przykład transfer z udziałem Agrobaeterium tumofaciens (Tingay i wsp., 1997, Plant J., 11: 1369 - 1376), bombardowanie cząsteczkowe (Wan i Lemaux, 1994, Plant Physiol., 104: 37 - 48) lub pobieranie DNA wywoł ane glikolem polietylenowym PEG (Funatsuki i Kihara, 1995, Theor. Appl. Genet., 91: 707 - 712).

Do kierowania ekspresją genu będącego przedmiotem zainteresowania można zastosować różne promotory. Do ekspresji wektorów zawierających lox-1, włączając sekwencje antysensowne, można zastosować natywny region promotorowy lox-1. Sekwencja promotorowa lox-1 zawarta jest między nukleotydami 2602 - 3511, obejmując region 5' UTR o numerze dostępu EMBL U83904. Alternatywnie można zastosować promotory, które kierują ekspresją genu będącego przedmiotem zainteresowania konstytutywnie, na przykład promotor ubikwityny Ubi. 1 (Wan i Lemaux, powyżej; Kjaerulff i wsp., w P. Mathis wyd. 1995, Photosynthesis: from light to Biosphere, tom II, 151 - 154). Wektory ekspresyjne mogą również zawierać region terminacji transkrypcji, na przykład terminator 3' genu syntazy nopaliny (3' nos) (Bevan i wsp., 1983, Nuci. Acids res., 11: 369 - 385) poddano fuzji z genami eksprymowanymi w transgenicznym jęczmieniu (Wan i Lemaux, powyżej; Funatsuki i Kihara, powyżej).

Wektory ekspresyjne mogą również zawierać gen pozwalający na selekcję stransformowanych komórek, w przypadku gdy wektor z powodzeniem uległ integracji do komórki. Geny te mogą kodować antybiotyk lub geny oporności na herbicyd, na przykład gen fosfotransferazy neomycyny (npt) lub acetylotransferazy fosfinotrycyny (bar). Gdy takie geny oporności ulegają ekspresji pozwalają na wzrost

PL 208 246 B1 transformowanej komórki w pożywkach zawierających odpowiednio neomycynę lub bialafos. (Patrz na przykład Wan i Lemaux, powyżej; Funatsuki i Kihara, powyżej; Kjaerulff i wsp., w P. Mathis, powyżej).

Po transformacji komórki można hodować w pożywkach selekcyjnych przez pewien okres czasu a nastę pnie moż na je hodować tak, aby pozwolić na tworzenie kieł ków, nastę pnie systemów korzeniowych a następnie roślin. Udana procedura transformacji jęczmienia została opracowana przez Funatsuki i Kihara (powyżej), w której transformacja protoplastów jęczmienia przez PEG wektorami ekspresyjnymi zawierającymi fosfotransferazę neomycyny i następnie selekcja z użyciem neomycyny w efekcie pozwoli ł a na otrzymanie pł odnych roś lin zawierają cych transgen. Wykazano, ż e transgen integrował do genomu a większość roślin transgenicznych wykazywała ekspresję białka kodowanego przez transgen.

Zrozumiałym jest, że wiele różnorodnych sposobów transformacji, wektorów ekspresyjnych, promotorów, markerów selekcyjnych i tym podobnych jest znanych i użytecznych do zastosowania do transformowania jęczmienia.

Mutageneza jęczmienia. Gen lox-1 może być namierzony do mutagenezy ukierunkowanej z uż yciem oligonukleotydów RNA/DNA. Wykazano, że te chimeryczne oligonukleotydy RNA/DNA z powodzeniem wprowadzają mutacje do komórek roślinnych (Zhu i wsp., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci., 96: 8168 - 8773; i Beetham i wsp., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci., 96: 8774 -8778) oraz komórek ssaczych (Yoon i wsp., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 2071 - 2076) w pożądanych położeniach. Chimeryczne oligonukleotydy RNA/DNA mogą być transformowane do protoplastów jęczmienia lub komórek będących przedmiotem zainteresowania szeregiem różnych sposobów opisanych powyżej, na przykład transformacji z PEG lub transformacji z udziałem bombardowania cząsteczkowego. Pojedyncze protoplasty lub komórki mogą być następnie regenerowane z użyciem hodowli tkankowej do całych płodnych roślin a zajście mutacyjne można potwierdzić z użyciem podejścia opartego na PCR jak szczegółowo opisano w Przykładach poniżej.

Ten sposób ukierunkowanej mutagenezy można zastosować do zmutowania specyficznych miejsc w genie lox-1. Gen lox-1 może zostać zmutowany w jednym lub więcej pozycjach nukleotydowych w regionie promotorowym aby obniżyć lub znieść transkrypcję lox-1. Specyficzną mutagenezę można również zastosować do wprowadzenia zmian w regionie kodującym lox-1, które na przykład zmniejszają aktywność enzymu. Takie mutacje obejmują, ale bez ograniczenia, insercje, delecje, substytucje, skutkujące przesunięciem ramki odczytu, skróceniem białka LOX-1 i/lub zmianą natury obojętnej i hydrofobowej kieszeni substratowej enzymu.

Ekspresja antysensowna. Zmniejszenie ekspresji lox-1 można również osiągnąć poprzez ekspresję konstruktu antysensownego lox-1 w komórkach jęczmienia. Donoszono o sposobach ekspresji konstruktów antysensownych w jęczmieniu w celu zmniejszania ekspresji docelowego białka, na przykład w Gilphin, M.J. i wsp., 1998, W: Photosynthesis: Mechanisms and Effects, G. Grab, wyd., Tom IV, 2983 2986; Kjaeruff i wsp., 1995, W: Photosynthesis: from Light to Biosphere, P. Mathis, Wyd., Tom II, 151 - 154.

Komórki jęczmienia można transformować konstruktem ekspresyjnym zawierającym antysensowna sekwencję kwasu nukleinowego. Konstrukt ekspresyjny wytwarza cząsteczkę anysensownego RNA zdolną do specyficznego wiązania się do przynajmniej części mRNA wytworzonego z dzikiego typu genu lox-1, poprzez komplementarne parowanie się zasad oraz zdolny do przerwania składania pre-mRNA lub translacji tego mRNA. Ekspresja antysensownej cząsteczki kwasu nukleinowego może być kierowana przez promotor konstytutywny lub tkankowo/czasowo specyficzny, na przykład opisany powyżej promotor lox-1 z jęczmienia.

Mutageneza chemiczna. Do mutagenezy jęczmienia powszechnie stosowany był chemiczny mutagen, azydek sodu, (NaN3) i wiadomo, że wprowadzał do sekwencji DNA (kwas nukleinowy) genomu jęczmienia stabilne mutacje (Olsen i wsp., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8043 - 8047). Do indukowania mutacji DNA można użyć również inne chemiczne mutageny, na przykład metanosulfonian etylu (EMS), azydoglicerol (AG, 3-azydo-1,2-propanediol), metylo-nitrozomocznik (MNU), hydrazyd maleinowy (MH) (Rank, J. i wsp., 1997, Mutat. Res. 390: 121 - 7), jak również promieniowanie UV.

Jak pokazano w poniższych Przykładach ziarno odmian uprawnych jęczmienia (cv) Vintage i Caruso traktowano azydkiem sodu i propagowano przez samozapylenie do trzeciego pokolenia (M3).

4. Identyfikacja i selekcja jęczmienia o niskiej aktywności lipooksygenazy.

Identyfikację i selekcję roślin jęczmienia posiadających zmniejszoną aktywność izoenzymu lipooksygenazy w ziarnie można przeprowadzić, na przykład poprzez analizę aktywności lipooksygenazy.

PL 208 246 B1

Do oznaczania aktywności dwóch głównych lipooksygenaz o których wiadomo, że występują zarówno w dojrzałym jak i kiełkującym ziarnie, LOX-1 i LOX-2, można zastosować oznaczenia enzymatyczne. Takie oznaczenia powinny rozróżniać aktywność LOX-1 od aktywności LOX-2.

Jedno wybiórcze oznaczenie LOX-1 i LOX-2 opiera się na utlenianiu wielonienasyconego kwasu tłuszczowego przez lipooksygenazę i detekcji spektrofotometrycznej produktu hydronadtlenkowego takiego utleniania. Specyfika tego oznaczenia wykorzystuje porównawczą niewrażliwość LOX-1 na inhibitor, na przykład NDGA, w odniesieniu do LOX-2.

Wybiórcze oznaczenie można również osiągnąć przez immunoprecypitację aby selektywnie usunąć LOX-1 lub LOX-2 z oznaczenia. Specyficzne przeciwciała anty- LOX-1 lub anty-LOX-2, na przykład przeciwciała monoklonalne, można wytworzyć z oczyszczonych LOX-1 lub LOX-2 jak opisano w Holtman i wsp., 1996, powyżej.

Te sposoby oznaczania mogą być przystosowane do procedur oznaczeń na płytkach do mikromianowiania lub innych znanych, powtarzalnych, wysokowydajnych formatów oznaczeniowych, pozwalając na szybkie przeszukiwanie wielu próbek. Jakość tych oznaczeń można ocenić poprzez przeszukiwanie wąsów roślinnych kiełkującego ziarna w sposób nieuszkadzający, tak że wyszukane przy przeszukiwaniu sadzonki mogą być dalej propagowane.

Utratę aktywności LOX-1 przez przypuszczalne mutanty można potwierdzić oznaczeniem aktywności enzymatycznej. Na przykład ekstrakty z ziarna można inkubować z kwasem linolowym i analizowa ć produkty utleniania kwasu linolowego, na przykł ad przez HPLC w odwróconej fazie. Względne ilości 9-HPOD i 13-HPOD wytworzonych z kwasu linolowego stanowi miernik aktywności LOX-1, której głównym produktem jest 9-HPOD.

Jak pokazano w Przykładach poniżej w przybliżeniu 20000 ziarna Pokolenia M3 zmutagenizowanego cv Vintage i Caruso przeszukano ze względu na aktywność LOX-1 i LOX-2 z użyciem oznaczenia utleniania w obecności inhibitora, a także z użyciem oznaczeń immunoprecypitacyjnych. Z uż yciem tych sposobów przeszukiwania wyszukano mutanta cv Vintage o znacznym zmniejszeniu aktywności LOX-1 i oznaczono go jako Linia G. Zmutowany fenotyp dziedziczony był w pokoleniach M4 i M5.

Nasiona wytworzone z jęczmienia Linii G zdeponowano 4 stycznia 2001 roku w Narodowych Kolekcjach Bakterii Przemysłowych, Spożywczych i Morskich (National Collections of Industrial, Food and Marinę Bacteria, NCIMB), Machar Drive, Aberdeen, Szkocja, UK, zgodnie z Traktatem budapeszteńskim jako Numer Dostępu: NCIMB 41078.

5. Sekwencje genetyczne

Dokładny opis zmiany genotypowej, która ma znaczenie dla fenotypu o niskiej aktywności lipooksygenazy w roślinach jęczmienia według wynalazku użyteczny jest do identyfikowania roślin posiadających tę zmianę genetyczną i do krzyżowania tej cechy do innych odmian uprawnych jęczmienia w programie hodowlanym. Do oceny podstaw genetycznych fenotypu o niskiej aktywnoś ci lipooksygenazy można zastosować różnorodne sposoby molekularne i biochemiczne.

Ogólnie wiadomo, że zarówno sekwencje genetyczne działające w cis, jak i trans mogą determinować ekspresję danego genu w genomie oraz aktywność produktu genu. Punkty kontrolne ekspresji genu obejmują regulację czasu trwania, specyficzności tkankowej i szybkości transkrypcji genu, stabilności transkryptu i szybkości translacji transkryptu.

Zarówno poziom ekspresji genu, stabilność i specyficzna aktywność kodowanego enzymu będzie determinować poziom aktywności enzymu wykrywany w tkance.

Zmiany w sekwencji roślinnego genu można oszacować przez sekwencjonowanie DNA istotnych części genomu, podczas gdy analiza metodą Northern zapewnia narzędzia do monitorowania poziomów stabilnego konstruktu w danej tkance roślinnej. Enzym ulegający ekspresji w tkance roślinnej można ocenić przez ekstrakcję enzymu z tkanki i pomiar aktywności enzymatycznej.

Jak pokazano w Przykładach poniżej tożsamość zmian genetycznych, które determinują fenotyp mutanta Linii G o niskiej aktywności lipooksygenazy indukowany w cv Vintage określono w następujący sposób. Gen strukturalny kodujący białko LOX-1 zarówno w rodzicielskim cv Vintage jak i w Linii G zamplifikowano z użyciem łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) a sekwencje powyż ej promotora, które regulują ekspresję genu, jak również całą sekwencję kodującą obejmującą sekwencje intronowe i eksonowe zsekwencjonowano.

Porównanie sekwencji nukleotydowych genu lox-1 z Linii G i dzikiego typu cv Vintage ujawniło substytucje nukleotydowe w 2 eksonach, z których jedna (w pozycji +2347) doprowadziła do niekonserwatywnej substytucji aminokwasowej (glicyna ³⁶⁸ asparaginian) w eksprymowanym białku.

PL 208 246 B1

Figura 22 przedstawia dopasowanie lipooksygenaz z soi (Gm: Glycine max) LOX1 (Nr dostępu P08170), LOX2 (Nr dostępu P08170), LOX3 (Nr dostępu AAB41727) i lipooksygenaz z jęczmienia (hv:Hordeum vulgare) LOX1 (Nr dostępu P29114) i LOX2 (Nr dostępu AAB70865.1). Konserwowane reszty aminokwasowe i konserwowane substytucje aminokwasów obdarzonych ładunkiem przedstawiono pogrubioną czcionką. Dopasowania struktury drugorzędowej dla LOX3 z soi Glycine max, w których H = alfa helisy a E= beta kartki przedstawione są powyżej dopasowania, a reszty istotne dla funkcjonowania enzymu (zidentyfikowane gwiazdką lub wypełnionym kółkiem) przedstawiono jak opisano w Skrzypczak-Jankun i wsp., 1997, Proteins 29: 15 - 31.

Reszty aminokwasowe, które uczestniczą w wiązaniu żelaza nie-hemowego lub zasadnicze dla katalizy (*) w LOX3 z soi obejmują: H518, H523, H709 [atomy 3N]; N713, I857. Równoważne reszty w LOX1 z jęczmienia to H517, H522, H708, N712 i I862. Reszty w LOX3 z soi o przewidywanej roli w katalizie (•) ^{stanowią: H}266^{, H5}13^{, H}766^{, F}264^{, F}272^{, F}714^{, W}519^{, R}552^{, R}726^{, D}766^{, D}779^{, K}278^{. Równoważne reszty w LOX1 z jęczmienia to H}261^{, H}512^{, H}775^{/ F}259^{, F}267^{, F}713^{, W}518^{, R}551^{, R}725^{, D}778 ^{i K}278^.

Reszty proliny ( + ) (P86, 109, 167, 171, 223, 234, 291, 311, 324, 343, 345, 371, 381, 382, 486, 541, 548, 600, 616, 627, 658, 726, 734, 788, 829, 833, 839, 857) i glicyny (G49, 67, 68, 70, 91, 107, 137, 187, 192, 210, 217, 218, 260, 306, 307, 336, 392, 409, 458, 474, 490, 569, 607, 674, 676, 720, 736, 783, 828, 850, 855) zlokalizowane w pętlach i pozycjach przykrywających helisę w strukturze drugorzędowej białka mogą ułatwiać ostre skręty i zwijanie szkieletu peptydowego.

Dopasowania pokrewnych lipooksygenaz soi wskazywały, że glicyna-368 w LOX-1 jęczmienia jest silnie konserwowana. Co więcej reszta ta, odpowiadająca glicynie-353 w LOX-1 soi, jest jedną z 35 wysoce konserwowanych reszt na 58 reszt wyścielających kieszeń substratowa II enzymu, jak widać ze struktury jej kryształu. Te konserwowane reszty są wyróżnione (kasetki) w dopasowaniu sekwencji lipooksygenaz roślinnych przedstawionym na Fig. 22 (Minor i wsp., 1996, Biochemistry 35: 10687 - 10701) i obejmują następujące reszty LOX-1 jęczmienia: Y224, L268, W355, E364, G368, V369, N370, I374, L424, L499, K501, A502, V504, D508, S509, H512, Q513, L514, H517, W518, H522, I556, L559, A560, L564, I565, 1570, T₅₇₄, S₅₈₅, Q₇₁₅, Y₇₁₈, N₇₂₄, R₇₂₅, P₇₂₆, T₇₂₇, L₇₇₂ i I₈₆₂. Wszystkie z 35, z wyjątkiem 7, konserwowanych reszt są resztami obojętnymi lub hydrofobowymi. Substytucja obdarzonej ładunkiem reszty w pozycji glicyna-368 w jęczmieniu lub innej konserwowanej hydrofobowej lub obojętnej reszty wyściełającej kieszeń substratowa II przypuszczalnie zaburzy strukturalne i funkcjonalne właściwości enzymu. Mutacja G D368 LOX1 Linii G jęczmienia (♦) zlokalizowana jest pomiędzy helisą alfa H6 a harmonijką beta E12.

Jak pokazano na Fig. 22 rodzina enzymów lipooksygenaz cechuje się wysokim stopniem konserwowania sekwencji, co znajduje odzwierciedlenie w ich konserwowanej strukturze drugorzędowej, określonej dla kilku członków rodziny lipooksygenaz roślinnych, włączając LOX1 i LOX3 z soi (Skrzypczak-Jankun i wsp., 1997, powyżej). LOX1 z jęczmienia cechuje się 56,9% identycznością sekwencji oraz 67,8% podobieństwem sekwencji do LOX3 z soi. Kilka reszt aminokwasowych w izoenzymie LOX3 z soi zidentyfikowano jako ligandy dla żelaza nie-hemowego lub sugeruje się, że są zasadnicze dla jej aktywności (oznaczone przez * •). W świetle silnego konserwowania sekwencji między LOX1 z jęczmienia a LOX3 z soi nie bezzasadnym będzie przewidywanie, że reszty w sekwencji LOX1 z jęczmienia, które są homologiczne do tych zidentyfikowanych jako ważne dla funkcjonowania LOX3 mogą być również istotne dla jej aktywności enzymatycznej. Zatem, niekonserwatywne substytucje aminokwasowe w dowolnej z tych pozycji, włączając substytucje tych reszt w LOX1 z jęczmienia odpowiadających 35 wysoce konserwowanym resztom LOX3 z soi, które wypełniają kieszeń substratowa oraz w innych pozycjach istotnych dla funkcjonowania enzymu, prawdopodobnie zmniejszą aktywność lipoksygenazy.

Wiadomo, że reszty aminokwasowe proliny i glicyny ułatwiają zwroty szkieletu peptydowego, gdy zlokalizowane są pomiędzy elementami struktury drugorzędowej, które pozwalają na przyjęcie przez białko zwiniętej trzeciorzędowej struktury. Reszty proliny i glicyny są również powszechne w motywach przykrywających helisę (Parker i Hefford, 1997, Protein Eng., 10: 487 - 496, http://www.expasy.ch). Pojedyncza niekonserwatywna substytucja w LOX1 Linii G, w której glicyną zlokalizowaną pomiędzy dwoma przewidywanymi elementami strukturalnymi zastąpiono asparaginianem doprowadziła do znaczącej utraty aktywności enzymatycznej. Przewiduje się zatem, że mutacja w genie LOX1 wywołująca niekonserwatywne substytucje aminokwasowe w jednym lub wielu resztach proliny lub glicyny w LOX1 z jęczmienia zlokalizowanych w regionach poza elementami strukturalnymi może w podobny sposób zapobiegać zwijaniu natywnego białka i w konsekwencji zmniejszać aktywność kodowanego enzymu.

PL 208 246 B1

Zatem, w jednym wykonaniu użyteczna roślina zmutowanego jęczmienia o zmniejszonej aktywności lipooksygenazy 1 według wynalazku zawiera zmutowaną sekwencję kwasu nukleinowego, która zmienia obojętną lub hydrofobową naturę kieszeni substratowej enzymu poprzez insercję jednego lub więcej kwasowego, zasadowego lub polarnego aminokwasu. Na przykład, użyteczna sekwencja kwasu nukleinowego [SEQ ID NO: 11] koduje białko LOX-1 z jęczmienia (SEQ ID NO:12] posiadające substytucję aminokwasu w pozycji 368 z glicyny do Xaa, przy czym Xaa oznacza aminokwas kwasowy, zasadowy lub polarny. Jedną specyficzną sekwencją aminokwasową zmutowanej LOX-1 z jęczmienia według wynalazku stanowi sekwencja, w której Xaa stanowi kwas asparaginowy, np. Linia G.

Jak pokazano w Przykładach poniżej zmiany genotypowe w Linii G nie mają żadnego wykrywalnego wpływu na ekspresję genu lox-1 ale aktywność LOX-1 wykrywana w dojrzałym i kiełkującym ziarnie Linii G stanowiła w przybliżeniu 9% aktywności wykrywanej w ziarnie linii rodzicielskiej, cv Vintage. W celu dostarczenia bezpośredniego dowodu, że mutacja aminokwasową w LOX-1 Linii G była odpowiedzialna za fenotyp o niskiej aktywności LOX-1, poddano przejściowej ekspresji w protoplastach z aleuronu jęczmienia sekwencję kodującą lox-1 Linii G i lox-1 cv Vintage, i wykazano znacząco zmniejszoną aktywność zmutowanego enzymu LOX-1 w porównaniu z enzymem LOX-1 dzikiego typu.

6. Transfer pomiędzy liniami hodowlanymi

Wykrywanie zmian cechy genetycznej roślin jęczmienia genotypu według wynalazku jest użyteczne do wykrywania obecności specyficznej genetycznej cechy w linii jęczmienia oraz do ułatwienia transferu tej cechy pomiędzy liniami hodowlanymi w programie hodowlanym. Dostępnych jest dużo różnorodnych narzędzi molekularnych do wykrywania zmian w sekwencji genomowej. Metody takie obejmują, ale bez ograniczenia, wykrywanie polimorfizmów długości fragmentów restrykcyjnych (Gebhard i Salamini 1992, Int. Rev. Cytology., 135: 201 - 237), sposoby wykrywania oparte na ilościowej reakcji PCR, takie jak amplifikacja z użyciem starterów fluorescencyjnych, np. Systemów sondy starterowej TagMan (Ibraham i wsp., 1998, Anal. Chem., 70, 2013 - 2017). Wybór sposobu wykrywania będzie zależał od specyficznej cechy genetycznej, ale dogodnie powinien być szybki i dostarczać jasno interpretowalnych danych.

Jak pokazano w Przykładach poniżej, oznaczenie PCR-Cięcia Zamplifikowanego Miejsca Polimorficznego (ang. PCR-Cleavage Amplified Polimorphic Site, PCR-CAPS) zapewniło wykrywanie zmutowanego genu lox-1 Linii G. Substytucja nukleotydowa w genie lox-1 Linii G w pozycji +2347 wprowadziła dodatkowe miejsce rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną Aat ll, które może być wykrywane przy pomocy oznaczenia PCR-CAPS. Odpowiednie sposoby wykrywania lox-1 nie są ograniczone do tego oznaczenia, ale równie dobrze mogą być oparte na technologii TaqMan i innych znanych sposobach wykrywania.

Jak pokazano w Przykładach poniżej, oznaczenie PCR-CAPS zastosowano do 4 pokoleń materiału hodowlanego z programu krzyżowania wstecznego, w którym fenotyp o niskiej aktywności lipooksygenazy w Linii G był systematycznie krzyżowany wstecznie do cv Alexis. Wykazano, że dziedziczenie fenotypu o niskiej aktywności lipooksygenazy następuje po dziedziczeniu genu lox-1 a fenotyp określono jako recesywny i obserwowano go jedynie w liniach homozygotycznych pod względem genu lox-1.

W zwią zku z tym, potomstwo roś liny wedł ug wynalazku obejmuje linie hodowlane, na przykł ad pochodzące z programu krzyżowania wstecznego, które zawierają zmutowany lox-1 i wykazują fenotyp o niskiej aktywności lipooksygenazy.

7. Warzenie

Rośliny jęczmienia według wynalazku, w tym potomstwo rośliny, ziarno i produkty roślinne, takie jak słód i brzeczka, o niskiej aktywności lipooksygenazy 1 przedstawiono tu jako użyteczne do wytwarzania napoju o obniżonych poziomach wolnego trans-2-nonenalu w czasie mierzonego okresu czasu lub w warunkach podwyższonej temperatury przechowywania w porównaniu do napoju wytworzonego z kontrolnej odmiany ję czmienia dzikiego typu. W celu przeprowadzenia tych porównań kontroluje się zawartość siarczynu w piwie na poziomie 5 ppm lub niższym, ponieważ stwierdzono, że wyższe poziomy siarczynu na etapie butelkowania będą czasowo opóźniały pojawienie się wolnego trans-2-nonenalu. Na przykład piwo warzone ze słodu uzyskanego ze zmutowanego jęczmienia Linii G tu opisanego posiadało ustabilizowane właściwości organoleptyczne w czasie mierzonego okresu czasu w porównaniu z piwem warzonym ze sł odu uzyskanego z kontrolnego nie-zmutowanego ję czmienia.

Próby warzenia i ocena butelkowanego piwa dostarczają najlepszego sposobu oceniania wpływu różnych składników na jakość i stabilność końcowego piwa. Do przetestowania wpływu różnych słodów jęczmiennych potrzeba wystarczającej ilości ziarna aby przeprowadzić próby słodowania

PL 208 246 B1 i warzenia na skalę pilotażową oraz pół-przemysłową. Podczas okresu propagacji jęczmienia można ocenić polową wydajność linii jęczmienia. Właściwości słodowania linii jęczmienia można ocenić w trakcie słodowania na skałę pilotażową lub pół-przemysłową i powinny się one dogodnie mieścić w krajowych rekomendacjach dotyczących jakości słodowania np. Europejskiej Konwencji dotyczącej Warzenia (ang. European Brewing Convention) (Analytica-EBC/ European Brewing Convention, 1998, Publ. Hans Carl Getranke-Fachverlag, Nijrnberg, Niemcy). Po warzeniu na skalę pilotażową lub półprzemysłową piwo pakuje się do brązowych butelek i schładza do 5 °C dla optymalnego przechowywania. Na tym etapie świeże piwo może być zanalizowane przez zespół wyszkolonych degustatorów zdolny do wykrycia specyficznych smaków piwa, w tym obcego smaku związku trans-2-nonenalu. Ponadto, piwo analizuje się chemicznie pod względem głównych składników, w tym trans-2-nonenalu. Te sposoby analizy jakości piwa stosuje się ponownie po przechowywaniu w różnych warunkach, o których wiadomo, że ujawniają długoterminową stabilność w przechowywaniu piwa, na przykład poddawane wymuszonemu starzeniu.

Jak pokazano w Przykładach poniżej jęczmień Linii G propagowano w warunkach polowych przez kilka sezonów aby poddać słodowaniu 10 ton tej linii w słodowni przemysłowej. Kontrolne odmiany jęczmienia cv Vintage i cv Nevada obydwie o fenotypie typu dzikiego słodowano w podobnych warunkach. Suszony słód z Linii G i kontrolnych odmian uprawnych jęczmienia mieścił się w specyfikacjach wymaganych dla prób warzenia na skalę pół-przemysłową.

Próby warzenia przeprowadzono w skali 30 hl a ocena świeżo butelkowanych piw ujawniła, że piwa warzone z zarówno Linii G jak i kontrolnych odmian uprawnych posiadały zawartość trans-2-nonenalu poniżej progu wyczuwalności smakowej i zostały uznane za satysfakcjonujące przez zespół degustatorów. Aby ocenić stabilność smaku piwa zastosowano dwie procedury poddawania wymuszonemu starzeniu, albo przechowywanie w 37°C przez 7 dni albo przechowywanie w 30°C przez 6-12 tygodni. Stabilność smaku piwa warzonego ze słodu Linii G okazała się najlepsza w porównaniu ze słodem kontrolnym, zarówno z uwagi na ocenę panelu analizującego smak, jak również poziom trans-2-nonenalu i wykazano, że poprawa jest statystycznie znacząca.

Przykłady

Niniejszy wynalazek jest dalej zdefiniowany w Przykładach poniżej. Powinno być zrozumiałym, że Przykłady gdy wskazują zalecane wykonania przedstawia się jedynie na zasadzie ilustracji.

P r z y k ł a d 1

Przeszukiwanie i selekcja mutantów izoenzymu lipooksygenazy w zmutagenizowanym jęczmieniu

1. Mutageneza jęczmienia

Ziarna jęczmienia Hordeum vulgare cv Vintage i cv Caruso zmutagenizowano azydkiem sodu zgodnie z opublikowaną procedurą (Kleinhofs i wsp., 1978 Mutation Research 51: 29 - 35). Mutageneza wprowadza mutacje punktowe w genomowym DNA tak, że może skutkować powstaniem zmian aminokwasowych w kodowanych białkach. Zmutowane ziarna M1 propagowano w szklarni przez dwa pokolenia i ziarno M3 zebrano do przeszukiwania. Obserwowana częstotliwość występowania mutantów pod względem pojedynczej cechy genowej w pokoleniu M2, zgodnie z Kleinhofs i wsp., 1978, powyżej, to 1,0 - 2,7 mutantów na 10,000 ziaren z pokolenia M2. Ponieważ większość mutacji genowych jest recesywna i wykrywalna jedynie w stanie homozygotycznym, zmutagenizowaną populację przeszukiwano na etapie pokolenia M3, gdzie oczekiwana proporcja zmutowanego homozygotycznego ziarna byłaby większa. W zmutagenizowanym materiale na etapie pokolenia M3 oczekiwano częstotliwości mutacji 0,9 0 - 2,3 na 10,000 ziaren.

2. Niedestruktywne oznaczenie aktywności lipooksygenazy 1 (LOX-1) i lipooksygenazy 2 (LOX-2) w zmutagenizowanym ziarnie M3

Opracowano szybką procedurę przeszukiwania do detekcji zmutowanego ziarna jęczmienia o zmniejszonej aktywności LOX-1 w oparciu o następujące kryteria:

Procedura przeszukiwania nie powinna zapobiegać propagacji ziarna/sadzonki; wyselekcjonowana tkanka ziarna/sadzonki powinna eksprymować możliwe do oceny ilościowej poziomy aktywności lipooksygenazy; oznaczenie powinno rozróżniać aktywność LOX-1 od aktywności LOX-2 i procedura oznaczenia powinna obejmować wielokrotne próbki.

Poziomy całkowitej aktywności lipooksygenazy w różnych tkankach kiełkującego ziarna, mianowicie pędu, korzenia i tkanki tarczki zarodka i endospermu oceniano jak następuje: przygotowano ekstrakty tkanki sadzonki jęczmienia przez homogenizowanie tkanki w schłodzonym lodem 20 mM Tris-HCL, pH 7,5 zawierającym 2 mM NaN3 i 0,5 mM fenylometylosulfonylofluorku (PMSF), po czym usuwano materiał nierozpuszczalny przez wirowanie przy 1000 g przez 10 minut. Oceniano aktywność

PL 208 246 B1 lipooksygenazy w 100 μΐ ekstraktu w 25°C przez dodanie 2,9 ml 20 mM substratu kwasu linolowego przygotowanego przez dyspersję 35 μl kwasu linolowego (wolny kwas, L-1376, Sigma, USA) w 5 ml H2O zawierającej 1% Tween 20. Reakcje śledzono spektrofotometrycznie przy czym szybkość wzrostu absorbancji przy 234 nm (A234 nm) spowodowanego tworzeniem skoniugowanego dienu w produkcie hydronadlenkowym jest proporcjonalna do obecnej aktywności enzymatycznej. Jedną jednostkę aktywności lipooksygenazy definiuje się jako Δ A234 = 0, 001 na minutę w 3-ml objętości reakcji, równoważnik utlenienia 0,12 priola kwasu linowego.

Tkanka liścia ziarna kiełkowanego przez 4 dni w ciemności posiadała najwyższe wykrywane poziomy aktywności lipooksygenazy (Holtman i wsp., 1996, Plant Physiology 111: 569 - 576). Wąsy roślinne z 4-dniowych sadzonek wyszukiwano do niedestruktywnego oznaczenia przeszukiwania lipooksygenzy. Optimum pH całkowitej aktywności lipooksygenazy z jęczmienia testowano w zakresie pH 4,5 - 9,0 i stwierdzono że przypada na pH 6,5. Zatem do oznaczenia przeszukiwania wybrano 25 mM bufor HEPES (pH 6,5) zawierający 0,2 M kwas borny.

Ponieważ obydwa enzymy LOX-1 i LOX-2 wykryto testem immunologicznym w pędach 4-dniowych sadzonek (Holtman i wsp., 1996, powyżej) zastosowano specyficzne oznaczenie LOX-1 i LOX-2. Okazało się, że inhibitor lipooksygenazy kwas nordihydrogwajakowy (NDGA), zidentyfikowany przez Eskin'a i wsp., 1997, Crit. Rev. Food, Science and Nutrition 9: 1 - 40), jest selektywnym inhibitorem lipooksygenaz z jęczmienia. NDGA w stężeniu 1 x 10^-5 silnie hamował oczyszczoną LOX-2 z jęczmienia, podczas gdy LOX-1 utrzymywała 47% aktywności (Figura 1). Testowano selektywność tego inhibitora w oznaczeniu wąsów roślinnych przez określanie stosunku 9-hydroperoksyoktadekanoidu (9-HPOD) do 13-hydroperoksyoktadekanoidu (13-HPOD), który powstawał w wyniku utleniania kwasu linolowego przez odpowiednio LOX-1 i LOX-2. W oznaczeniu lipooksygenazy z wąsów roślinnych cv Vintage proporcja 13-HPOD wytworzonego spadła z 24,5% do 9,5% przy dodaniu 1 x 10^-5 M NDGA.

Selektywne oznaczenie aktywności LOX-2 w ekstraktach z wąsów roślinnych oparte było na zastosowaniu przeciwciała monoklonalnego specyficznego wobec LOX-1 (5D2) (Holtman i wsp., 1996, powyżej) do immunoprecypitacji LOX-1 obecnej w ekstraktach. Pozostająca wykrywana aktywność lipooksygenazy w ekstraktach po precypitacji LOX-1 dostarczała pomiaru aktywności LOX-2. Wydajność immunoprecypitacji (opisana poniżej) oceniana była przez ilościową ocenę pozostającej LOX-1 i LOX-2 w nadsączach ekstraktów z użyciem oznaczenia ELISA, stosując specyficzne przeciwciała monoklonalne przeciw LOX-1 (oznaczone 5D2) i LOX-2 (oznaczone 5.8) (Holtman i wsp., 1996, powyżej). Immunoprecypitacja LOX-1 usuwała z ekstraktów wąsów roślinnych cv Vintage 85% białka LOX-1 i 15% białka LOX-2.

Immunoprecypitację przeprowadzano V-dennych płytkach 96-dołkowych przez dodanie 5 μl ziaren Dynabeads pokrytych 5D2 (Dynal) i 75 μl buforu [20 mM Tris-HCL pH 7,5, 1% Wołowej Surowicy Cielęcej (Hyclone) do 20 μl każdego ekstraktu wąsów roślinnych. Płytkę inkubowano na wytrząsarce do płytek (MTS4, IKA, Labor Technik) przez 1 godzinę w 4°C. Immunoprecypitat osadzono przez wirowanie w 4°C w wirówce Sigma 302-K przez 10 minut przy 2000 rpm. Nadsącza (70 μΓ> z każdej próbki oznaczano ze względu na obecność aktywność lipooksygenazy w płaskodennej płytce 96-dołkowej, jak opisano poniżej, ale z dodatkiem 100 μl buforu testowego (25 mM HEPES, 0,2 M kwas borny, pH 6,5).

Oznaczenia LOX-1 i LOX-2 dostosowano do wysokowydajnego sposobu przeszukiwania. Wąsy roślinne (1 cm) z ośmiu 4-dniowych kiełkowanych ziaren pojedynczo homogenizowano w 150 μl schłodzonego lodem buforu (20 mM Tris-HCL, pH 7,5) przez 2 x 30 sekund w homogenizatorze wielopojemnikowym (Berg i wsp., 1992, Electrophoresis 13: 76 - 81). Po wirowaniu przez 15 minut przy 3000 rpm 40 μl nadsączu każdego ekstraktu przeniesiono do płaskodennej płytki 96-dołkowej. Do każdego dołka dodano 170 μl (25 mM HEPES, 0,2 M kwas borny, pH 6,5, 1 x 10^-5 NDGA) oraz 10 μl substratu (20 mM kwas linolowy) i następnie inkubowano przez 20 minut w 25°C. Reakcję zakończono przez dodanie 20 μl wysyconego roztworu jodku potasu (KI) i inkubowano przez następne 8 minut w 25°C. Reakcja redoks pomiędzy dienami hydronadtlenków a KI dawała I2, co było monitorowane przez jego maksimum ekstynkcji przy 350 nm w czytniku do płytek (Multiskan MCC/340).

3. Identyfikacja potencjalnych mutantów lipooksygenazy w ziarnie M3 i M4 zmutagenizowanego jęczmienia

Ziarno pokolenia M3 cv Vintage i cv Caruso przechowywano w 45 °C przez 6,5 dnia aby przerwać stan uśpienia, zapewniając 95% częstotliwość kiełkowania. Ziarno M3 cv Vintage (9218) i cv Caruso (9633) kiełkowano i przeszukiwano pod katem linii, których aktywność LOX-1 stanowiła 15%

PL 208 246 B1 lub mniej aktywności ziarna dzikiego typu. Przypuszczalne zmutowane linie (50 linii cv Vintage i 42 linii cv Caruso) propagowano do pokolenia M4, zebrano i skiełkowane ziarno ponownie poddano przeszukiwaniu. Po pomiarze aktywności lipooksygenazy w ekstraktach z 5 wąsów roślinnych z każdej linii potwierdzono występowanie zmutowanego fenotypu LOX-1 w jednej linii cv Vintage i sześciu liniach cv Caruso. Gdy zbadano aktywności LOX-1 i LOX-2 w kiełkujących zarodkach tych siedmiu przypuszczalnych mutantów okazało się, że jedynie mutant cv Vintage (oznaczony Linia G) wykazywał duże zmniejszenie pod względem LOX-1. W dojrzałym uśpionym ziarnie obecna w zarodku aktywność lipooksygenazy stanowi prawie wyłącznie aktywność LOX-1, ze względu na różnicujący wzór ekspresji tych dwóch izoenzymów (Schmitt i van Mechelen, 1997, Plant Sci. 128: 141 - 150). Całkowita aktywność lipooksygenazy w ekstraktach z zarodków Linii G dojrzałego suchego ziarna (pokolenie M5) wynosiła 0,06 ± 0,04 U/mg białka w porównaniu do 0,74 ± 0,44 U/mg białka w ekstraktach z zarodków cv Vintage, jak określono przez spektrofotometryczne oznaczenie lipooksygenazy opisane w sekcji 2 Przykładu 1. Stwierdzono, że pozostająca aktywność lipooksygenazy w dojrzałych zarodkach Linii G zarówno w pokoleniach M4 jak i M5 stanowiła w przybliżeniu 9% tej z linii rodzicielskiej.

P r z y k ł a d 2

Linia G jest mutantem cv Vintage o fenotypie niskiej aktywności lipooksygenazy

W materiale z pokolenia M5 analizowano właściwości agronomiczne oraz zmutowany fenotyp Linii G. Wstępne analizy przeprowadzono w celu potwierdzenia, czy analizowany materiał M5 był homozygotyczny pod względem zmutowanego fenotypu. Fenotyp o niskiej aktywności LOX-1 w Linii G, wykrywany w pokoleniu M3, mógłby wynikać z dominującej bądź recesywnej mutacji. Jeżeli Linia G wyselekcjonowana na etapie pokolenia M3 była heterozygotyczna pod względem mutacji dominującej, to następne pokolenia wykazywałyby segregację cech fenotypowych. Mierzono aktywność lipooksygenazy w 26 pojedynczych zarodkach Linii G z ziarna w stanie uśpienia pokolenia M5 i porównano do zarodków cv Vintage dzikiego typu. Aktywność lipooksygenazy we wszystkich zarodkach Linii G była bardzo niska, z przeciętną 0,06 ± 0,04 U lipooksygenazy na mg białka, w porównaniu z 0,74 ± 0,44 U lipooksygenazy na mg białka w zarodkach cv Vintage dzikiego typu. Dane potwierdziły, że Linia G w pokoleniu M5 była homozygotyczna pod względem cechy niskiej aktywności lipooksygenazy.

1. Linia G charakteryzuje się fizjologią wzrostu i rozwojem ziarna dzikiego typu.

Ziarno Linii G i cv Vintage kiełkowano i hodowano w komorze klimatycznej przy 16 godzinach światła w 15°C i 8 godzinach ciemności w 12°C oraz wilgotności względnej 80%. Charakterystyka wzrostu roślin Linii G i cv Vintage była podobna w odniesieniu do wysokości rośliny, ilości odrośli na roślinę, występowania kwitnienia i ilości ziaren na kłos. Świeża masa (Figura 2) i sucha masa (Figura 3) ziarna Linii G i cv Vintage dzikiego typu podczas rozwoju od 5 dnia po kwitnieniu (ang. day after flowering, DAF, DPK - Dzień Po Kwitnieniu) do pełnej dojrzałości, w przybliżeniu 90 DPK, były bardzo podobne.

2. Linia G posiada fenotyp o niskiej aktywności lipooksygenazy podczas rozwoju.

Aktywność lipooksygenazy mierzono w ekstraktach z rozwijającego się ziarna jęczmienia Linii G (pokolenie M5) i dzikiego typu cv Vintage. Ziarno homogenizowano w schłodzonym lodem buforze 20 mM Tris-HCL pH 7,5 zawierającym 0,1% (objętościowo) Nonidet-40, niejonowy detergent, który zwiększa ekstrakcję lipooksygenazy, i wirowano przy 15 000 g przez 20 minut aby usunąć nierozpuszczalny materiał. Aktywność lipooksygenazy w ekstraktach zmierzono polarograficznie w 200 ul wysyconego tlenem buforu (0,2 M kwas borny, 25 mM HEPES, pH 6,5) zawierającego 1,2 mM kwas linolowy w 25°C z użyciem elektrody typu Clarka do pomiaru konsumpcji tlenu. Aktywność lipooksygenazy wzrosła podczas pierwszych 20 dni rozwoju ziarna zarówno w ziarnie Linii G jak i ziarnie dzikiego typu, ale jedynie w Linii G poziom aktywności spadł podczas dojrzewania ziarna (Figura 4).

Względne ilości 9-HPPOD i 13-HPOD wytworzonych podczas utleniania kwasu linolowego stanowi pomiar poziomów aktywności LOX-1 i LOX-2 w ekstraktach z ziarna. W tym przypadku pominięto Nonidet P-40 z buforu ekstrakcyjnego do ziarna aby uniknąć współ-ekstrakcji enzymów zużywających hydronadtlenek. Ekstrakty (100 μΐ) zmieszane z 10 ml 50 mM buforu fosforanowego pH 6,5 zawierającymi 200 uM kwas linolowy inkubowano przez 20 minut. Reakcje przerwano przez dostosowanie pH do 3,5 i dodano wewnętrzny standard. Hydronadtlenki wytworzone w oznaczeniu związano na oktadecylowej kolumnie fazy stałej (Bakerbond, Baker) i eluowano metanolem. 9-HPPOD i 13-HPOD oddzielano z użyciem HPLC odwrotnej fazy na kolumnie C-18 z izokratycznym rozpuszczalnikiem do elucji (tetrahydrofuran: Metanol: H2O: kwas octowy; 25:30:44,9:0,1 (objętościowo) doprowadzonym do pH 5,5 stężonym amoniakiem) przy szybkości przepływu 0,5 ml/minutę jak opisano w Aarle i wsp.,

PL 208 246 B1

1991, FEBS Letters 280: 159 - 162. Hydronadtlenki wykrywano przy 234 nm a maksima HPOD korygowano w stosunku do wewnętrznego standardu, prostaglandyny B2.

Figura 5 przedstawia, że 13-HPOD był głównym produktem aktywności lipooksygenazy obecnej w ziarnie podczas pierwszych 20 DPK (Dni Po Kwitnieniu), podczas gdy 9-HPOD tworzony był przez aktywność lipooksygenazy podczas dojrzewania ziarna. Chociaż zarówno ekstrakty z ziarna Linii G jak i dzikiego typu charakteryzowały się podobnym profilem aktywności syntetyzującej 13-HPOD, to Linia G nie wykazywała dzikiego typu wzrostu aktywności syntetyzującej 9-HPOD. Dane te pozostają w zgodzie z utratą aktywności LOX-1 w dojrzewającym ziarnie jęczmienia Linii G.

3. Linia G posiada fenotyp o niskiej aktywności lipooksygenazy na etapie kiełkowania

Oznaczono całkowitą aktywność lipooksygenazy w ekstraktach z zarodków ziarna kiełkowanego w 15°C jak opisano w Przykładzie 1. Aktywność lipooksygenazy obecna w ziarnie dzikiego typu w stanie uśpienia zmniejszyła się podczas pierwszych 4 dni kiełkowania a następnie wzrosła (Figura 6). W Linii G aktywność lipooksygenazy w ziarnie w stanie uśpienia była bardzo niska, ale wzrosła po 4 dniach.

Analiza HPOD wytworzonych przez aktywność lipoksygenazy w kiełkujących zarodkach wykazała, że 9-HPOD był głównym produktem lipooksygenaz obecnych w ziarnie w stanie uśpienia. Poziom tworzenia 9-HPOD spadł wraz ze spadkiem aktywności lipoksygenazy w ekstraktach. Wzrostowi aktywności lipooksygenazy po 4 dniach towarzyszyło tworzenie zarówno 9-HPOD jak i 13-HPOD. Niska aktywność lipooksygenazy w ziarnie Linii G w stanie uśpienia była związana z brakiem tworzenia HPOD, podczas gdy wzrost aktywności po 4 dniach wytwarzał 13-HPOD. Dane te dostarczają dowodu, że aktywność LOX-1 prowadząca do tworzenia 9-HPOD jest w dużym stopniu zmniejszona w zarodkach zarówno rozwijającego się, uśpionego lub kiełkującego ziarna jęczmienia Linii G, podczas gdy aktywność LOX-2 prowadząca do tworzenia 13-HPOD w Linii G pozostaje niezmieniona.

P r z y k ł a d 3

Linia G posiada zmutowany gen Lipooksygenazy (lox-1) wywołując fenotyp o niskiej aktywności lipooksygenazy

Podstawę molekularną fenotypu niskiej aktywności LOX-1 Linii G badano w celu dostarczenia pełnego opisu mutanta. Następujące analizy przeprowadzono w celu dostarczenia pełnej charakterystyki fenotypu:

1. Lipooksygenaza syntetyzowana jest w rozwijającym się i kiełkującym ziarnie Linii G

Równolegle z pomiarem aktywności lipooksygenazy przeprowadzono analizy typu Western biot ekstraktów z zarodków z rozwijającego się i kiełkującego ziarna jęczmienia, jak opisano w Przykładzie 2. Surowe ekstrakty rozdzielano z użyciem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z siarczanem dodecylu (SDS-PAGE) zgodnie z Laemmli, 1970, Nature 227: 680 - 685. Rozdzielone białka przeniesiono na nitrocelulozę z użyciem semi-suchej hybrydyzacji zgodnie z Towbin i wsp., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350 - 4354. Biot sondowano przeciwciałem monoklinalnym specyficznym wobec LOX-1, 5D2, jak opisano w Holtman i wsp., 1996, Plant Physiology 111: 569 - 576, przy 500 x rozcieńczeniu i następującej inkubacji z kozim anty-mysim przeciwciałem sprzężonym z alkaliczną fosfatazą i wykrywano w użyciem substratów alkalicznej fosfatazy błękitem nitrotetrazolowym i 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanem jak opisano przez Holtman i wsp., 1996, Plant Physiol. 111: 569 - 576. Analizy typu Western wykazały, że białko LOX-1 było wykrywane w rozwijającym się ziarnie od 10 DPK w zarodkach cv Vintage a poziom wzrósł podczas dojrzewania ziarna (Figura 8). Białko było również obecne w zarodku ziarna cv Vintage w stanie uśpienia, ale powoli zmniejszało się podczas kiełkowania (Figura 9). Pomimo, że LOX-1 rozpoznaje się w ekstraktach zarodków Linii G i migruje ono w czasie SDS-PAGE jako białko o podobnej masie cząsteczkowej co LOX-1 cv Vintage, to możliwe do immunnodetekcji poziomy białka w Linii G było nieco niższe niż w cv Vintage.

2. Gen lox-1 eksprymowany jest w rozwijającym się i kiełkującym ziarnie Linii G

Równolegle z pomiarem aktywności lipooksygenazy, opisanym w Przykładzie 2, wyizolowano całkowity RNA z zarodków rozwijającego się i kiełkującego ziarna jęczmienia, zgodnie z procedurą Hengens i van Os-Ruygrok, 1989, Rice Genet. Newslett. 6: 163 - 168. Próbki RNA (7,5 μg) rozdzielono w denaturujących żelach agarozowych i przeprowadzono hybrydyzację typu Northern jak opisano przez Sambrook i wsp., 1989 w Molecular Cloning, a Laboratory Manuał, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY. Bioty hybrydyzowano z sondą znakowaną ³²P wytworzoną z regionu nieulegającego translacji 3' jęczmienia, nukleotydy 2659 -2801 [SEQ ID NO: 1] cDNA lox-1 (EMBL Numer Dostępu L35931), jak opisano przez Holtman i wsp., 1996 Plant Physiol. 111: 569 - 576, z użyciem zestawu Amersham Random Prime Kit.

PL 208 246 B1

Transkrypty lox-1 kodujące LOX-1 wyrywano w zarodkach rozwijającego się i dojrzałego ziarna cv Vintage i Linii G od 30 DPK (Figura 10). Poziom transkryptów lox-1 wzrósł podczas kiełkowania zarówno w zarodkach cv Vintage jak i Linii G, wskazując na ekspresję de novo genu lox-1 (Figura 11). Ponieważ wykrywalne poziomy transkryptów lox-1 w zarodkach Linii G i cv Vintage były podobne, to ani zmniejszona transkrypcja lox-1 ani stabilność transkryptu nie mogła przyczyniać się do fenotypu Linii G o niskiej aktywności lipooksygenazy.

3. Gen lox-1 Linii G koduje zmutowaną formę lipoksygenazy-1

W celu określenia molekularnej podstawy fenotypu niskiej aktywności LOX-1, który charakteryzuje się normalną transkrypcją genu lox-1, ale zmniejszoną akumulacją i aktywnością eksprymowanego enzymu lipooksygenazy w ziarnie, analizowano i porównywano sekwencję nukleotydową genu lox-1 Linii G i cv Vintage.

Genomowy DNA izolowano z tkanki liścia sadzonki Linii G i dzikiego typu cv Vintage zgodnie ze sposobem opisanym przez Pich i Schubert 1993, Nucleic Acids Res. 21: 3328. Gen lox-1 w preparatach genomowego DNA zamplifikowano z użyciem łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) stosując startery oparte na sekwencji genu lox-1 z jęczmienia (van Mechelen i wsp., 1995, BBA 1254: 221 - 225; Rouster i wsp., 1997, Plant J. 11: 513 - 523). Pozycja i sekwencja starterów oligonuklotydowych stosowanych do amplifikacji promotora i regionów kodujących lox-1wskazanych na Figurze 12 były jak następuje:

Do amplifikowania za pomocą PCR domeny promotorowej (-361 do 68) lox-1 Linii G i lox-1 cv Vintage użyto lewy starter 5'-GAA AAG CTT GGA GGT AGA CGC TGC -3' [SEQ ID NO: 2] i prawy starter 5'-TAT AGG ATC CTT GTT CTT GGC CTC CTC TCC TGC-3' [SEQ ID NO: 3].

Do amplifikowania za pomocą PCR regionu kodującego lox-1 Linii G użyto lewy starter 5'-AGT GAA AAA CAG TGT GCT GGT G-3' [SEQ ID NO: 4] i prawy starter 5'-GGC TTA AAG AGC AAC TGA-3' [SEQ ID NO: 5].

Lewy starter 5'-CAA GAT GCA TAT GCT GCT GGG AG-3' [SEQ ID NO: 6] i prawy starter 5'-CGA TGG TTT AAA TTA GAT GGA GAT GCT GT-3' [SEQ ID NO: 7] zamplifikowały w PCR region kodujący lox-1 cv Vintage.

Reakcje PCR składały się z 250 ng genomowego DNA w objętości 50 μl zawierajęcej 50 pmola statera i 2 U polimerazy DNA Pfu (Promega) zgodnie z instrukcjami dostawcy enzymu. Amplifikacje PCR przeprowadzono w Stratagene Robocycler: 1 minuta w 94 °C, 1 cykl, 1 minuta w 94°C, 2 minuty w 62°C i 5 minut w 72°C, 30 cykli; 10 minut w 72°C, 1 cykl. Produkty PCR rozdzielono w 1,2% żelu agarozowym. Fragmenty DNA odpowiadające długością amplifikowanemu regionowi oczyszczono z użyciem zestawu do ekstrakcji Qiax II Gel (Qiagen) i wklonowano do plazmidu pcDNA2.1 (Invitrogen). Sekwencje nukleotydowe obydwu nici sklonowanego promotora lox-1 i regionów kodujących określono z użyciem dideoksynukleotydowej terminacji łańcucha ze specyficznymi starterami oligonukleotydowymi i analizowano na ABI PRISM® 310 Analizatorze Genetycznym (PE Biosystems). Porównania sekwencji przeprowadzono z użyciem pakietu oprogramowania do analizy sekwencji DNA STAR (DNA STAR Inc., USA).

Region promotorowy i struktura intron-ekson regionu kodującego lox-1 jęczmienia przedstawione są na Figurze 13, i zostały wydedukowane na podstawie porównania sekwencji nukleotydowej dzikiego typu lox-1 sekwencji genomowej i cDNA (Figura 12). Zsekwencjonowany region od -363 do +68 z regionu promotorowego lox-1 (ponumerowany względem miejsca startu transkrypcji; van Mechelen i wsp., 1995, BBA 1254: 221 - 225) jest wystarczający aby kierować zarodkowo-specyficzną i tymczasowo-regulowaną charakterystyką ekspresji natywnego genu (Rouster i wsp., 1998, Plant J 15: 435 - 440). Promotor i region transkrybowany dzikiego typu genu lox-1 [SEQ ID NO: 8] posiada 4663 nukleotydy długości i zawiera 6 intronów o długości między 82 nt a 634 nt, które nie występują w odpowiednim cDNA [SEQ ID NO: 10] a zatem muszą być usunięte podczas obróbki RNA.

Porównanie sekwencji nukleotydowej lox-1 Linii G z dzikim typem (Figura 12) wykazało, że allel lox-1 Linii G posiada dwie mutacje punktowe. Jedna jest cichą substytucją C >T w pozycji 221 w eksonie 1 a druga jest substytucją G >A w pozycji 2347 w eksonie 3 (Figura 13). Dzikiego typu gen lox-1 jęczmienia koduje białko o 862 resztach aminokwasowych [SEQ ID NO 9], podczas gdy mutacja w pozycji 2347 wywołuje w allelu lox-1 Linii G substytucję aminokwasową glicyny do kwasu asparaginowego w pozycji 368 kodowanego białka.

Porównania pokrewnych lipoksygenaz roślinnych wskazały, że glicyna-368 LOX-1 jęczmienia jest silnie konserwowana. Co więcej reszta ta, która odpowiada glicynie-353 LOX-1 z soi, jest jedną z 51 obojętnych lub hydrofobowych reszt, które wyściełają kieszeń substratowa enzymu, jak zobaczono

PL 208 246 B1 na podstawie jej struktury krystalicznej (Minor i wsp., 1996, Biochemistry 35: 10687 - 10801 i przedstawiono na Figurze 22. Zatem insercja obdarzonej ładunkiem reszty aminokwasowej prawdopodobnie zaburzy właściwości strukturalne i funkcjonalne enzymu.

4. Zmutowane białko LOX-1 kodowane przez allel lox-1 Linii G posiada niską aktywność enzymatyczną i jest odpowiedzialne za fenotyp Linii G o niskiej aktywności lipoksygenazy.

Mutageneza z użyciem azydku sodu ziarna cv Vintage, która zaindukowała powstanie zmutowanego allelu lox-1 w Linii G, mogła również wywołać dodatkowe mutacje w genomie Linii G. Podjęto dwa podejścia eksperymentalne aby wykazać, że to raczej zmutowany allel lox-1 w Linii G jest odpowiedzialny za jej fenotyp o niskiej aktywności lipooksygenazy, a nie inne mutacje w genomie. Aby udowodnić, że substytucja glicyna kwas asparaginowy w zmutowanym enzymie wywołuje zmniejszoną stabilność i aktywność, określono aktywność enzymatyczną LOX-1 kodowanej przez allel zmutowany i dzikiego typu lox-1. Dwa geny lox-1 poddano przejściowej ekspresji w protoplastach aleuronowych izolowanych z dojrzałego zaprawionego ziarna, ponieważ oczekiwano, że poziom endogennej ekspresji lipooksygenazy w tych komórkach będzie poniżej limitów wykrywania. Żadnego ze zidentyfikowanych genów lipooksygenazy jęczmienia, które są eksprymowane w kiełkującym jęczmieniu nie wykrywa się w tkance aleuronowej (van Mechelen i wsp., 1999 powyżej). Aby kierować przejściową ekspresją genu lox-1 w protoplastach aleuronowych poddano fuzji translacyjnej ich regiony kodujące do konstytutywnego promotora, o którym wiadomo było, że jest aktywny w tych protoplastach.

Regiony kodujące zmutowanego (pozycje sekwencyjne +1 do +4350) i dzikiego typu genu lox-1 (pozycje sekwencyjne +69 do +4230) oraz dzikiego typu lox-1 cDNA (pozycje sekwencyjne +69 do +2654) każdy wklonowany w plazmid pc DNA2.1 (patrz sekcja 3), wycięto przez trawienia miejsc KpnI i EcoRV w miejscu polilinkera wektora. Regiony kodujące klonowano w plazmidzie pUBARN (Jensen i wsp., 1998, Hereditas 129: 215 -225) pomiędzy konstytutywnie aktywnym promotorem ubikwityny Ubi (jak opisano w patencie USA o numerze 005510474A) a terminatorem Nos, w miejsce genu bar, który koduje acetylotransferazę fosfoinotricyny (Figura 14).

Wyizolowano protoplasty z tkanki aleuronowej zaprawionego Hordeum vulgare cv Himalaya zgodnie z protokołem Skriver i wsp. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266 - 7270. Wielokrotne rozcieńczenia 2 x 10 protoplastów transfekowano w 0°C z ~100 μg plazmidowego DNA (równomolowe ilości każdego z plazmidów) przez przyjęcie DNA z udziałem glikolu polietylenowego (PEG) (Lee i wsp., 1997, Plant. Mol. Biol. 13: 21 - 29) i następnie inkubowano w pożywkach hodowlanych do protoplastów aleuronowych w 25°C jak wcześniej opisano (Skriver i wsp., 1991, powyżej). Po 48 godzinach inkubacji ostrożnie usunięto pożywkę hodowlaną a protoplasty ponownie zawieszono i homogenizowano w 300 μl buforu do oznaczania lipopksygenazy (0,2 mM kwas borny, 25 mM HEPES, pH 6,5). Homogenaty wirowano przy 15 000 g przez 5 minut aby osadzić nierozpuszczalny materiał a nadsącza (10 μθ następnie oznaczono ze względu na całkowitą aktywność lipooksygenazy z użyciem szybkiego oznaczenia przeszukiwania opisanego w Przykładzie 1, sekcja 1, ale z pominięciem inhibitora NDGA. Zawartość białka w ekstraktach protoplastowych zmierzono z użyciem oznaczenia wiązania barwnika Bradforda (Bradford 1976, Anal. Blochem., 72: 248) dostarczonego przez Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA a aktywność lipooksygenazy wyrażono na mg białka w ekstrakcie.

Protoplasty transfekowane plazmidem kontrolnym, pUBI-GUS, w którym promotor ubikwityny-1 z kukurydzy kieruje ekspresją genu reporterowego β-glukuronidazy, nie dawały wykrywalnej aktywności lipooksygenazy. Przejściowa ekspresja zarówno dzikiego typu genu lox-1 i cDNA w protoplastach dawała wysokie poziomy aktywności lipooksygenazy w ekstraktach protoplastowych (Figura 15). Wyższa ekspresja dzikiego typu cDNA lox-1 w porównaniu z sekwencją genomową może być związana z wyższą częstotliwością transfekcji dla mniejszego plazmidu ekspresyjnego cDNA lox-1 (4929 pz a 6505 pz konstruktu genowego lox-1). Przejściowa ekspresja zmutowanego genu lox-1 dawała niskie poziomy aktywności lipooksygenazy, ~10% aktywności lipooksygenazy dzikiego typu. Dane te jasno pokazują, że zmutowany gen lox-1 w Linii G koduje lipooksygenazę o znacząco zmniejszonej aktywności lipooksygenazy, która przyczynia się do fenotypu o niskiej aktywności lipooksygenazy.

P r z y k ł a d 4

Oznaczenie PCR cięcia zamplifikowanego miejsca polimorficznego (PCR-CAPS) - sposób stosowany do zidentyfikowania zmutowanego genu lox-1.

W oparciu o oznaczenie PCR-CAPS opracowano analityczny sposób pozwalający na zidentyfikowanie zmutowanego genu lox-1 w dowolnym tle genetycznym. Oznaczenie wykorzystuje amplifikację PCR genomowych fragmentów DNA, po której następuje trawienie zamplifikowanych sekwencji

PL 208 246 B1 specyficzną endonukleazą restrykcyjną w celu uwidocznienia polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP).

Sekwencja kodująca zmutowanego genu lox-1 niesie dwie mutacje punktowe (patrz Przykład 3), przy czym mutacja w pozycji 2347 (Figura 12) wprowadza dodatkowe miejsce cięcia endonukleazy restrykcyjnej Aat II, które nie występuje w dzikiego typu genie lox-1. (Figura 16). Ukazano, że następujące oznaczenie PCR-CAPS oparte na polimorfizmie stworzonym przez obecność tego miejsca restrykcyjnego w genie lox-1 rozróżnia dzikiego typu gen lox-1 i zmutowany gen lox-1.

Z młodych liści z sadzonki M6 Hordeum vulgare, L. Cv Vintage i Linii G wyizolowano genomowy DNA zgodnie z procedurą Pich i Schubert (1993), powyżej). Sekwencję DNA obejmującą pozycję 2347 (miejsce mutacji genu lox-1 Linii G) zamplifikowano z użyciem PCR, stosując startery specyficzne dla genu lox-1 [SEQ ID NO: 8]. Fragmenty DNA zamplifikowane przez wybrany lewy starter 5'-CGCTACGACGTCTACAACGA-3' [SEQ ID NO: 13] i prawy starter 5'-CAGACTACTTTTTGGCGGGA-3' [SEQ ID NO: 14] przedstawiono na Figurze 17. Reakcje PCR przeprowadzono z 250 ng genomowego DNA w objętości 50 μl zawierającej 50 pmoli każdego startera i 1 jednostkę polimerazy DNA Taq (Promega) zgodnie z instrukcjami dostawców. Amplifikacje PCR przeprowadzono w Robocycler Stratagene jak następuje: 1 minuta w 94°C, 1 cykl; 1 minuta w 94°C, 1,5 minuty w 60°C i 2 minuty w 72°C, 30 cykli; 10 minut w 72°C, 1 cykl. Zamplifikowane fragmenty zmutowanego i dzikiego typu genu lox-1 stanowiły 650 pz (Figura 18), odpowiadając oczekiwanej wielkości (Figura 17). Produkty PCR, oczyszczone na kolumnie do wirowania (Qiagen) trawiono 25 jednostkami endonukleazy restrykcyjnej Aat II przez 24 godziny w 37°C i analizowano w 1,2% żelu agarozowym.

W skutek trawienia produktu PCR dzikiego typu lox-1otrzymano fragmenty DNA 10, 179 i 462 pz, a z produktu PCR zmutowanego lox-1 fragmenty 10, 149, 179 i 313 pz, przy czym dodatkowe fragmenty DNA związane były z częściowym trawieniem produktu PCR lox-1 (Figura 19). Wzór fragmentowy odpowiada oczekiwanemu RFLP wynikającemu z tej mutacji, przy czym fragment 313 pz jest unikalny dla mutanta lox-1. To oznaczenie PCR-CAPS dostarcza powtarzalnego i specyficznego narzędzia do identyfikacji allelu lox-1 w jęczmieniu i może być zatem wykorzystywany w programach hodowli jęczmienia, których celem jest wprowadzenie tego genu do nowych odmian jęczmienia.

P r z y k ł a d 5

Krzyżowanie wsteczne fenotypu o niskiej aktywności lipooksygenazy Linii G do cv Alexis wykazuje genetyczne sprzężenie ze zmutowanym genem lox-1

Zastosowano powtarzane krzyżowanie wsteczne do przeniesienia fenotypu niskiej aktywności lipooksygenazy do rodzica powtarzającego się (w tym przypadku cv Alexis). Program krzyżowania wstecznego przedstawiony na Figurze 20, w połączeniu z selekcją fenotypu o niskiej aktywności lipooksygenazy, progresywnie zastępuje genom Linii G genomem rodzica powtarzającego się. Co więcej, eliminacji ulegną inne mutacje wprowadzone do Linii G podczas mutagenezy z użyciem azydku sodu. W pierwszej krzyżówce wstecznej homozygotycznej Linii G o niskiej aktywności lipooksygenazy (oznaczonej genotyp ll ) do cv Alexis (oznaczonej genotyp LL) potomstwo będzie heterozygotyczne (oznaczone genotyp LI ). Fenotyp o niskiej aktywności lipooksygenazy ze względu na mutację recesywną nie będzie wykrywany w liniach heterozygotycznych pod względem tej mutacji. Potomstwo poddaje się samozapyleniu i uzyskuje się ulegającą prawidłowej segregacji populację Mendlowską, mianowicie 1 LL: 2 LI: 1 ll. Homozygotyczny genotyp ll o niskiej aktywności lox wynikający z pierwszej krzyżówki wstecznej będzie miał 50% genetycznego tła cv Alexis. Po dziesięciu rundach krzyżowania wstecznego rodzica powtarzającego się tło będzie stanowiło w przybliżeniu 99,9%.

W czasie programu krzyżowania wstecznego Hordeum vulgare, L. cv Alexis i Linię G propagowano w szklarni. Ziarna potomstwa krzyżowanego wstecznie kiełkowano na szalkach Petri'ego na papierze filtrowym, nasączonym 4 ml H2O, przez 3 dni w ciemności w temperaturze 22°C. Linie o niskiej aktywności lipooksygenazy przeszukiwano przez mierzenie całkowitej aktywności lipooksygenazy w ekstraktach koleoptylu (szczyt 7 mm) z kiełkujących sadzonek, jak opisano w Przykładzie 1. Potomstwo trzeciej i czwartej krzyżówki wstecznej poddano również analizie dziedziczności zmutowanego genu lox-1 z użyciem oznaczenia PCR-CAPS opisanego w Przykładzie 4.

Oczekiwana częstotliwość fenotypu o niskiej aktywności lipooksygenazy w ulegającym segregacji potomstwie czterech generacji krzyżówki wstecznej wynosiła 25% dla mutacji recesywnej. Obserwowana częstotliwość fenotypu o niskiej aktywności lipooksygenazy w potomstwie (24 ziarna) czterech generacji krzyżowania wstecznego pozostaje w zgodzie z częstotliwością oczekiwaną (Figura 20). Gdy potomstwo trzeciej i czwartej krzyżówki wstecznej o homozygotycznym genotypie o niskiej aktywności lox analizowano z użyciem oznaczenia PCR-CAPS u wszystkich wykryto diagnostyczny

PL 208 246 B1 fragment 313 pz, podczas gdy potomstwo o dzikim typie aktywności lipooksygenazy było pozbawione tego fragmentu (Figura 21).

Program krzyżowania wstecznego wykazuje, że zmutowany allel lox-1 może być przeniesiony do nowego tła genetycznego i jest dziedziczony w sposób recesywny jednoczynnikowy po segregacji Mendlowskiej. Ponieważ tło rodzica powtarzającego się stanowi w potomstwie czwartej krzyżówki wstecznej 93,8% to współdziedziczenie zmutowanego genu lox-1 i fenotypu o niskiej aktywności lipooksygenazy dostarcza potwierdzenia ich genetycznego sprzężenia.

P r z y k ł a d 6

Piwo warzone ze słodu jęczmiennego z Linii G akumuluje mniej trans-2-nonenalu podczas przechowywania, co skutkuje poprawioną stabilnością smaku.

Hordeum vulgare, L. cv Vintage i Linie G propagowano w warunkach polowych przez kilka sezonów, aby zapewnić wystarczającą ilość ziarna do słodowania przemysłowego. Następujące słodowanie na skalę przemysłową i próby warzenia, jak również analizy ukończonego piwa przeprowadzono w celu wykazania wartości jęczmienia Linii G o niskiej aktywności lipooksygenazy dla poprawionej stabilności smaku.

1. Przemysłowe słodowanie i suszenie Linii G i cv Vintage.

Przeprowadzono słodowanie w skali 10 ton w przemysłowej słodowni w dwóch doświadczeniach jak następuje: Doświadczenie 1: Ziarno jęczmienia Linii G (zbiór 1996)

Warunki moczenia: 8 godzin mokry, 14 godzin suchy, 8 godzin mokry, 10 godzin suchy, 4 godziny mokry w 16°C wodzie do moczenia. Warunki słodowania: 12 godzin w 18°C; 24 godziny w 16°C; 24 godziny w 14°C; 60 godzin w 12°C. Warunki suszenia: 12 godzin w 60°C; 3 godziny w 68°C; 4 godziny w 74°C; 3 godziny w 80°C.

Doświadczenie 2: cv Vintage i Linia G (zbiór 1996/1997)

Warunki moczenia: 8 godzin mokry, 10 godzin suchy, 6 godzin mokry, 15 godzin suchy, 4 godziny mokry w 15°C wodzie do moczenia. Warunki słodowania: 5 dni z wlotowym powietrzem o 15°C i zraszaniu aby utrzymać poziom nawilżenia. Warunki suszenia: 10 godzin w 50°C; 2 godziny w 60°C; 2,5 godziny w 80°C.

Analizy słodowania 2 próbek słodu Linii G z Doświadczenia 1 porównanych ze słodem kontrolnym, cv Nevada (Tabela 1) oraz z Doświadczenia 2 porównanych z cv Vintage (Tabela 2) potwierdziły, że słód Linii G był odpowiedni do prób warzenia.

T a b e l a 1

SŁODOWANIE PRÓBA 1
Odmiana jęczmienia		cv Nevada	Linia G	Linia G
Rok zbioru		1996	1996	1996

Analizy słodu
Wilgotność	%	4,7	4,3	4,4
Ekstrakt czysty jak jest	% j.j.	76,9	76,1	75,3
Ekstrakt czysty sucha masa (s.m.)	% s.m.	81,4	79,5	78,7
Czas scukrzania	Min.	< 10	< 10	< 10
Siła diastatyczna	% WK	252	373	365
Kolor	EBC	2,8	4,4	3,8
PH		6,16	5,97	5,99
Mętność	EBC	9,0	2,5	2,4
Całkowite białko s.m.	%	10.35	10,74	12,03
Azot rozpuszczalny	MG/L	647	787	756
Rozp. białko % słód s.m.	% s.m.	3,7	4,4	4,3
Liczba Kolbacha		35,3	40,8	35,4

PL 208 246 B1 ciąg dalszy Tabeli 1

Wolny azot aminowy	mg/l	97	125	118
Kruchość	%	89,5	85,6	89,5
Całe niemodyfikowane ziarna	%	1,1	0,6	0,5
Częściowo niezmodyfikowane ziarna	%	2,3	1,0	0,6
β-glukan w brzeczce	mg/l	114	66	36
β-glukan w słodzie	%obj.	0,24	0,11	0,05
S-metylometionina/DMS równ.	μg/g	2,4	6,4	8,4
Wolny DMS	μg /g	1,0	6,6	4,7
NDMA	μg /kg	n.d.	β 0,3/0,6	0,3/0,3

T a b e l a 2

SŁODOWANIE PRÓBA 2
Odmiana jęczmienia		Vintage	Linia G	Linia G
Rok zbioru		1996	1996	1997

Analizy słodu
Wilgotność	%	4,1	4,1	4,3
Ekstrakt czysty jak jest	% j.j.	77,0	765,6	77,5
Ekstrakt czysty sucha masa (s.m.)	% s.m.	80,3	78,8	80,9
Różnica czysty/nieobrobiony	% s.m.	0,7	1,6	1,7
Czas scukrzania	Min.	-	-	< 10
Siła diastatyczna	% WK	343	342	268
Kolor	EBC	2,5	2,8	3,4
PH		6,05	6,01	6,12
Mętność	EBC	1,5	1,3	2,5
Całkowite białko s.m.	%	10,98	12,22	9,82
Azot rozpuszczalny	mg/L	696	741	610
Rozp. białko % słód s.m.	% s.m.	3,9	4,1	3,4
Liczba Kolbacha		35,2	33,7	34,6
Wolny azot aminowy	mg/l	110	117	100
Kruchość	%	91,3	81,8	89,5
Całe niemodyfikowane ziarna	%	0,7	1,1	1,3
Częściowo niezmodyfikowane ziarna	%	1,0	2,7	2,7
β-glukan w brzeczce	mg/l	97	172	117
β-glukan w słodzie	% obj.	-	-	0,3
S-metylometionina/DMS równ.	μg/g	-	-	-
Wolny DMS	μg/g	-	-	-

PL 208 246 B1

2. Warzenie przemysłowe ze słodem Linii G, cv Vintage oraz słodem kontrolnym cv Nevada.

Przeprowadzono dwie próby warzenia z użyciem brzeczki przygotowanej ze słodu Linii G i kontrolnego słodu cv Nevada w próbie 1 oraz ze słodu Linii G i kontrolnego słodu cv Vintage w Próbie 2.

Piwo warzono na skalę przemysłową 30-hl z 475 kg słodu zgodnie z następującym schematem: Zacieranie w 50°C; 30 minut w 50°C; 30 minut ogrzewanie od 50 do 70°C; 15 minut w 70°C. Część brzeczki podgrzewano przez 20 minut od 70 do 100°C i 5 minut w 100°C, natomiast główny zacier trzymano w 70°C przez 25 minut a następnie obydwa zaciery łączono i trzymano w 76°C przez 10 minut. Etapy warzenia - gotowanie brzeczki, oddzielanie w leju wodnym wysłodzin, chłodzenie, fermentacja, leżakowanie i butelkowanie do butelek z brązowego szkła były zgodne ze standardową praktyką warzenia.

3. Stabilność smaku oraz zawartość T2N w piwie warzonym ze słodu Linii G, cv Vintage i kontrolnego słodu cv Nevada

Świeżo butelkowane piwo przechowywano w 5°C i analizowano w czasie 2 miesięcy od produkcji. Stabilność smaku świeżego i przechowywanego piwa oceniano w dwóch niezależnych laboratoriach po dwóch różnych typach warunków przechowywania piwa. W laboratorium A piwo poddano przyspieszonemu procesowi starzenia, piwo przechowywano w 37°C przez 7 dni, podczas gdy w laboratorium B piwo przechowywano w 30°C przez 6 i 12 tygodni. Poziomy trans-2-nonenalu w piwie oceniano z użyciem chromatografii gazowej i spektrometrii masowej po derywatyzacji karbonyli 0-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzylo)-hydroksylaminą, zasadniczo jak opisano przez Gronqvist i wsp., 1993 Preeciding of the 24^th EBC Congress, Oslo, 421 - 428. Wyszkolony zespół degustatorów smaku piwa oceniał ogólną punktację smaku piwa, która obejmuje wykrywanie posmaku kartonowego, wskaźnika wolnego trans-2-nonenalu w piwie.

Laboratorium A: Tolerancja na przyspieszone starzenie

Porównanie piwa warzonego ze słodu Linii G i słodu kontrolnego, cv Vintage w pierwszej próbie warzenia (Tabela 3) wykazało, że piwo z Linii G miało większą stabilność smaku i niższą zawartość trans-2-nonenalu po przyspieszonym starzeniu w porównaniu z kontrolami. Druga próba, porównująca piwo warzone ze słodu Linii G z piwem warzonym ze słodu cv Vintage, rodzicielskiej odmiany uprawnej, potwierdziła wstępne dane (Tabela 4).

T a b e l a 3

WARZENIE PRÓBA 1
Słód jęczmienny	cv Nevada	Linia G
Zawartość SO2 (mg/ml)	1	1
T2N** (ppb) - Świeże Piwo	0,009	0,005
T2N** (ppb) - Stare Piwo (37°C/7 dzień)	0,117	0,025
Smak* - Świeże Piwo	5,9	5,3
Smak* - Stare Piwo (37°C/7 dzień)	1,3	5,1

* skala 1-10 oceny smaku o wzrastającej jakości; ** trans-2-nonenal

T a b e l a 4

WARZENIE PRÓBA 2
Słód jęczmienny	cv Vintage	Linia G
Zawartość SO2 (mg/ml)	2	2,5
T2N** (ppb) - Świeże Piwo	0,023	0,019
T2N** (ppb) - Stare Piwo (37°C/7 dzień)	0,078	0,035
Smak* - Świeże Piwo	5,5	6,1
Smak* - Stare Piwo (37°C/7 dzień)	2,9	5,9

* skala 1-10 oceny smaku o wzrastającej jakości; ** trans-2-nonenal

PL 208 246 B1

Laboratorium B: tolerancja przechowywania w 30°C Piwo warzone ze słodu Linii G posiadało niższe poziomy trans-2-nonenalu po 6 i 12 tygodniach w podwyższonej temperaturze przechowywania 30°C w porównaniu z piwem warzonym z obydwu słodów kontrolnych (Tabela 5 i 6) i posiadało lepszą stabilność smaku jak osądził zespół degustatorów. Próg wyczuwalności smaku dla trans-2-nonenalu w tych analizowanych piwach wynosi blisko 0,08 ppb.

T a b e l a 5

WARZENIE PRÓBA 1
Słód jęczmienny	cv Nevada	Linia G
trans-2-nonenal (ppb) - Świeże Piwo	0,050	0,044
trans-2-nonenal (ppb) - 30°C/6 tygodni	0,072	0,037
trans-2-nonenal (ppb) - 30°C/12 tygodni	0,095	0,046
Smak trans-2-nonenalu* - Świeże Piwo	0,6	0,3
Smak trans-2-nonenalu* - 30°C/6 tygodni	3,7	1,4
Smak trans-2-nonenalu* - 30°C/12 tygodni	2,5	0,6

* wynik detekcji smaku trans-2-nonenalu na skali 1-10

T a b e l a 6

WARZENIE PRÓBA 2
Słód jęczmienny	cv Vintage	Linia G
trans-2-nonenal (ppb) - Świeże Piwo	0,070	0,062
trans-2-nonenal (ppb) - 30°C/6 tygodni	0,093	0,070
trans-2-nonenal (ppb) - 30°C/12 tygodni	0,133	0,080
Smak trans-2-nonenalu*- Świeże Piwo	0,3	0,9
Smak trans-2-nonenalu*- 30°C/6 tygodni	2,5	1,7
Smak trans-2-nonenalu*- 30°C/12 tygodni	2,2	1,3

* wynik detekcji smaku trans-2-nonenalu na skali 1-10

Wykazano, że poprawiona stabilność smaku piwa warzonego ze słodu Linii G, po zmierzeniu za pomocą poziomów trans-2-nonenalu wykrywanych w piwie po przechowywaniu w 30°C z połączonych danych z prób warzenia, jest statystycznie znacząca (Tabela 7).

T A B E L A 7

TRANS-2-NONENAL W PRZECHOWYWANYM PIWIE

Świeże	Średnia	Odchylenie standardowe	Różnica	Obustronny p	Znaczący (p < 0,05)
Odniesienie	0,060	0,012	0,007	0,34	nie
Linia G	0,053	0,011

6 tygodni, 30°C	Średnia	Odchylenie standardowe	Różnica	Obustronny p	Znaczący (p < 0,05)
Odniesienie	0,083	0,013	0,029	0,031	tak
Linia G	0,054	0,021

12 tygodni, 30°C	Średnia	Odchylenie standardowe	Różnica	Obustronny p	Znaczący (p < 0,05)
Odniesienie	0,114	0,023	0,051	0,003	tak
Linia G	0,063	0,020

PL 208 246 B1

Ponieważ naturalne poziomy siarczynu były niskie w obydwu próbach warzenia to poziomy wolnego trans-2-nonenalu w dojrzałym piwie odzwierciedlałyby blisko potencjał trans-2-nonenalu różnych piw, mianowicie poziom adduktów trans-2-nonenalu w świeżym piwie. Dodawanie siarczynu może przejściowo opóźniać proces zwietrzania poprzez kompleksowanie wolnego trans-2-nonenalu do czasu gdy poziomy siarczynu zmniejszą się przez utlenianie wynikające z wymiany gazowej przez opakowanie.

Opisane próby warzenia ze słodem jęczmiennym o niskiej aktywności LOX jęczmienia dostarczają pierwszego jednoznacznego dowodu, że aktywność LOX-1 w jęczmieniu podczas procesu słodowania i warzenia jest kluczową determinantą wystąpienia obcego smaku związku trans-2-nonenalu w starym piwie.

PL 208 246 B1

LISTA SEKWENCJI <110» Douma, Anneke Doderer, Albert cameron-Mills, verena Skadhauge, Blrgitte eech, Lene <120» Roślina jęczmienia, jej część, ziarno, potomstwo rośliny, produkt roślinny, zastosowanie produktu roślinnego i zastosowanie rośliny jęczmienia, jej części, ziarna i potomstwa <130» 11225.12WO01 <160» 18 <170» Patentln wersja 3-0 <210» 1 <211» 143 <212» ONA <2l3> Hordeum vulgare <400> 1 ctaagccatc ggcaaccatg gatgaaraaa gggcgttcgc cacgtacgaa acttgtcgag 60 agattggtgt agtgtgtgtc tgtgacagta ctatgtcagc agttgctctt taagccgaat 120 aaataaagca gatttgcttc caa 143 <210» 2 <211» 24 <212» ONA <213» Hordeum yulgare <400» 2 gaaaagcttg gaggtagacg ctgc ²⁴

PL 208 246 B1 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Hordeum vu1gare <40Ο> 3 tataggatcc ttgttcttgg cctcctctcc tcg

<210>	4
<2ii>	22
<212>	DNA
<213>	Hordeum vulgare
<400> 4 agtgaaaaac agtgtgctgg tg
<210>	5
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Hordeum yulgare
<400> S ggcttaaaga gcaactgctg a
<210>	6
<211>	23
<212>	DNA
<213>	Hordeum vulgare
<400> 6 caagatgcat atgctgctgg gag
<210>	7
<211>	29
<212>	DNA
<213>	Hordeum vu1gare

PL 208 246 B1 <400> 7 cgatggttta aattagatgg agatgctgt <210> 8 <2łl> 4663 <212> DNA <213> Hordeum vuTgare

<400> 8 cagccccatg	catgcacatg	cacatgcaca	tgcacatgca	gtgcagccaa	gcaccgctcg	60
atgggcgatc	acccgtcacg	ggaccggagc	gcgccatgcg	aagcacgagg	agggcacgtc	120
accgtccgcg	cgcagcacgt	ggagagcacg	tcgccgtccg	atccatctct	ccaaagccga	180
gcgccacacc	accgggaccg	gacccggacc	ggcctataaa	ttgcccggac	cgagctgcaa	240
gcagctcctc	acacacactc	acgcaacaca	catccatctt	cactgaaaag	tgaaaaacag	300
tgtgctggtg	ccattggttg	gagcagtgaa	agcgaggaga	ggaggccaag	aacaagatgc	360
tgctgggagg	gctgatcgac	accctcacgg	gggcgaacaa	gagcgcccgg	ctcaagggca	420
cggtggtgct	catgcgcaag	aacgtgctgg	acctcaacga	cttcggcgcc	accatcatcg	480
acggcatcgg	cgagttcctc	ggcaagggcg	tcacctgcca	gcttatcagc	tccaccgccg	540
tcgaccaagg	taatcactac	cctectccgg	ccttctcctc	tgtttacaag	atatagtatt	600
tctttcgtgt	gggccggcgg	ccarggatgg	atggatgtgt	ctggatcggc	taaagaagat	660
aggatagcta	gccctggccg	gtcgtcttta	cctgagcatg	ggcatatgcc	atcgaaaaaa	720
gagacaacag	catgcatgca	tggtgcgcgc	accagaccac	gcagagcacc	ggatgctcga	780
gacaaagcaa	cacaacaagc	aaggacgaca	cgtcaaaagc	aacacaacaa	gcaaggacgg	840
cacgtcaaaa	gcaacacaaa	cctaaactaa	agcacaaaga	cgtaagagca	agcacacaat	900
cagcaggcta	taaacagttg	tcatcaaaaa	caacgctgga	agagagagag	aaggaaggaa	960
gtagtagcca	tgaaaaatta	aatcaccggg	cgttgctctt	tgcccaacaa	ttaatcaagc	1020
agggtacgtg	gcatgtatag	ttcttgtaag	taaactaagc	atgtgatatg	agaaggtacg	1080
tggtggtgca	gacaacggcg	gtcgcgggaa	ggtgggcgcg	gaggcggagc	tggagcagtg	1140
ggtgacgagc	ctgccgtcgc	tgacgacggg	ggagtccaag	ttcggcctca	ccttcgactg	1200
ggaggtggag	aagctcgggg	tgccgggcgc	catcgtcgtc	aacaactacc	acagctccga	1260
gttcctgctt	aaaaccatca	ccctccacga	cgtccccggc	cgcagcggca	acctcacctt	1320
cgtcgccaac	tcatggatct	accccgccgc	caactaccga	tacagccgcg	tcttcttcgc	1380
caacgaegtg	cgtggatttt	cctcracttt	CCtCtCCttt	cattttcacc	gccttcgtca	1440

PL 208 246 B1 ttcatggtcg atcattaagt cttgccagga caatagatga tgagctagga gtggttacca 1500 cttagcagta cgtacattat ttattccgtg ttggtagaaa aggatatggt ttggtgcaga 1560 tcgacacaag attgaatgaa agttgcaccg tggcaccgtg gcagcgtggt aggtgaaaat 1620 aactgttgca cggatccacc cacatgattg ttttcatgaa taaacttttt aaggatgtgt 1680 ctagccacat cragatgcat gtcacataat tattgcatac eaaaacgatt aaattaagca 1740 taaaaagaaa aggaaaaaaa tactcacata tctcgacgta agatcaatga tatagtattt 1800 agatatgcaa tatttatctt acatctaaac ctttcttcat tcttaaatat aagacatttg 1860 taagatttca ctatggacaa catacgaaac aaaatcagtg gatctctcta tgcattcatt 1920 atgtagtcta taataaaatc tttaaaagat cgtatatttt gcaacggagg gagtaaaaca 1980 taacttttta atagtaatgt tgcacggctc cacactcgca gaegtacctg ccgagccaga 2040 tgccggcggc gctgaagccg taccgcgacg acgagctccg gaacccgcgt ggcgacgacc 2100 agcagggccc gtaccaggag cacgaccgca rctaccgcta cgacgtctac aacgacctcg 2160 gcgagggccg ccccatcctc ggcggcaact ccgaccaccc ttacccgcgc cgcggccgca 2220 cggagcgcaa gcccaacgcc agcgacccga gcctggagag ccggctgtcg crgctggagc 2280 agatctacgt gccgcgggac gagaagttcg gccacctcaa gacgtccgac ttcctgggct 2340 actccatcaa ggccatcacg cagggcatcc tgccggccgt gcgcacctac gtggacacca 2400 cccccggcga gttcgactcc ttccaggaca tcatcaacct ctatgagggc ggcatcaagc 2460 tgcccaaggt ggccgccctg gaggagctcc gtaagcagtt cccgctccag ctcatcaagg 2520 acctcctccc cgtcggcggc gactccctgc ttaagctccc cgtgccccac atcatccagg 2580 agaacaagca ggcgtggagg accgacgagg agttcgcacg ggaggtgctc gccggcgtca 2640 acccggtcat gatcacgcgt ctcacggtga gtcagcgatt atttgttcat tgtgtgtgta 2700 tggtgtccat ggtgagaaag tgcagatctt gatttgcgtt gggtcgcatg cacgcatgct 2760 gcatgcatgc aggagttccc gccaaaaagt agtctggacc ctagcaagtt tggtgaccac 2820 accagcacca tcacggcgga gcacatagag aagaacctcg agggcctcac ggtgcagcag 2880 graattggtc caagccatcg acatcaacta tgatttacct aggagtaatt ggtagctgta 2940 gataatttgg cttcgttgca attaatttga tgctggccga tcaagtgatc gtattgggrt 3000 tgaaatttgc aggcgctgga aagcsacagg ctgtacatcc ttgatcacca tgaccggttc 3060 atgccgttcc tgatcgacgt caacaacctg cccggcaact tcatctacgc cacgaggacc 3120 ctcttcttec tgcgcggcga cggcaggctc acgccgctcg ccatcgagct gagcgagccc 3180 atcatccagg gcggccttac cacggccaag agcaaggttt acacgccggt gcccagcggc 3240 tccgtcgaag gctgggtgtg ggagctcgcc aaggcctacg tcgccgtcaa tgactccggg 3300 tggcaccagc tcgtcagcca ctggtacgtt ctccacggtc gatgtgattc agtcagtcga 3360

PL 208 246 B1

tgcacaacaa	ctgatcgaaa	tatgattgat	tgaaacgcgc	aggctgaaca	ctcacgcggt	3420
gatggagccg	ttcgtgatct	cgacgaaccg	gcaccttagc	gtgacgcacc	cggtgcacaa	3480
gctgctgagc	ccgcactacc	gcgacaccat	gaccatcaac	gcgctggcgc	ggcagacgct	3540
catcaacgcc	ggcggcatct	tcgagatgac	ggtgttcccg	ggcaagttcg	cgttggggat	3600
gtcggccgtg	gtgtacaagg	actggaagtt	caccgagcag	ggactgccgg	acgatctcat	3660
caagaggtac	gtacctggta	aatgttatga	atgtgtaaaa	caaattgggc	gtctcgctca	3720
ctgacaggaa	cgtggtaaaa	aaaatgcagg	ggcatggcgg	tggaggaccc	gtcgagcccg	3780
tacaaggtgc	ggttgctggt	gtcggactac	ccgtacgcgg	cggacgggct	ggcgatctgg	3840
cacgccattg	agcagtacgt	gagcgagtac	ctggccatct	actacccgaa	cgacggcgtg	3900
ctgcagggcg	atacggaggt	gcaggcgtgg	tggaaggaga	cgcgcgaggt	cgggcacggc	3960
gacctcaagg	acgccccatg	gtggcccaag	atgcaaagtg	tgccggagct	ggccaaggcg	4020
tgcaccacca	tcatctggat	cgggtcggcg	ctgcatgcgg	cagtcaactt	cgggcagtac	4080
ccctacgcgg	ggttcctccc	gaaccggccg	acggtgagcc	ggcgccgcat	gccggagccc	4140
ggcacggagg	agtacgcgga	gctggagcgc	gacccggagc	gggccttcat	ccacaccatc	4200
acgagccaga	tccagaccat	catcggcgtg	tcgctgctgg	aggtgctgtc	gaagcactcc	4260
tccgacgagc	tgtacctcgg	gcagcgggac	acgccggagt	ggacctcgga	cccaaaggcc	4320
ctggaggtgt	tcaagcggtt	cagcgaccgg	ctggtggaga	tcgagagcaa	ggtggtgggc	4380
atgaaccatg	acccggagct	caagaaccgc	aacggcccgg	ctaagtttcc	ctacatgctg	4440
ctctacccca	acacctccga	ccacaagggc	gccgctgccg	ggcrtaccgc	caagggcarc	4500
cccaacagca	tctccatcta	atctaagcca	tcggcaacca	tggatgaata	aagggcgttc	4560
gceacgtacg	aaacttgtcg	agagartggt	gtagtgtgtg	tctgtgacag	tactatgtca	4620
gcagttgctc	tttaagccga	ataaataaag	cagatttgct	tcc		4663

<210> 9 <211> 862 <212> PRT <213> nordeum vulgare

<400> 9

Met Leu Leu Gly Gly Leu ile Asp Thr Leu Thr Gly Ala Asn Lys Ser 15 10 15

Ala Arg Leu Lys Gly Thr val val Leu Met Arg lys Asn val Leu Asp 20 25 30

PL 208 246 B1

Leu Asn

1 ASp 35

i Phe Gly

Ala

; Thr Ile 40

> ile

> Asp Gly

> Ile

! Gly 45

’ Glu

i Phe Leu

Gly

' Lys 50

Gly val Thr

cys

Gir 55

i Leu

Ile

; Ser

ser

• Thr 60

Ala

. val

Asp Gin

ASp 65

i Asn

Gly

Gly Arg

ciy 70

Lys

; val

Gly

- Ala

, Glu 75

Ala

, Glu

Leu

Glu Gin 80

Trp

! val

Thr

Ser

Leu 85

Pro

Ser

Leu

Thr

Thr 90

Gly

Glu

Ser

Lys

Phe Gly 95

Leu

Thr

Phe

ASP 100

Trp

Glu

val

Glu

Lys 105

teu

Gly

val

pro

Gly 110

Ala Ile

val

Asn 115

Α5Π

Tyr

His

Ser

Ser 120

Glu

Phe

Leu

Lys 125

Thr

Ile Thr

Leu

His 130

ASP

val

Pro

Gly

Arg 135

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr 140

Phe

val

Ala Asn

Ser 145

Trp

Ile

Tyr

pro

Ala 150

Ala

Asn

Tyr

Arg

Tyr 155

Ser

Arg

val

Phe Phe 160

Ala

Asn

ASp

Thr

Tyr 165

Leu

Pro

Ser

Gin

Met 170

pro

Ala

Leu

L^S Pro

Tyr

Arg

ASp

Asp 180

Glu

Leu

Arg

Asn

Leu 185

Arg

Gly

Asp

ASP

Gin 190

Gin Gly

Pro

Tyr

Gin 195

Glu

His

Asp

Arg

Ile 200

Tyr

Arg

Tyr

Asp

Val 205

Tyr

Asn Asp

Leu

Gly 210

Glu

Gly

Arg

Pro

Ile 215

Leu

Gly

Asn

Ser 220

A5p

His

Pro Tyr

Pro 225

Arg

Gly

Arg

Thr 230

Glu

Arg

Lys

Pro

Asn 235

Ala

ser

ASP

Pro Ser 240

Leu

Gl u

ser

Arg

Leu 245

Ser

Leu

Glu

Gin 250

ile

Tyr

val

Pro

Arg Asp 255

Glu

Lys

phe

Gly 260

His

Leu

Lys

Thr

Ser 265

ASP

Phe

Leu

Gly

Ser ile

Lys

Ala

Ile 275

Thr

Gin

Gly

Ile

Leu 280

Pro

Ala

val

Arg

Thr 285

Tyr

val ASp

Thr

Thr 290

pro

Gly

Glu

Phe

ASP 295

ser

Phe

Gin

ASP

ile 300

Ile

Asn

Leu Tyr

Glu 305

Gly Gly

ile

Lys

Leu 310

Pro

Lys

val

Ala

Ala 315

Leu

Glu

Leu Arg 320

Lys

Gin

Phe

Pro

Leu 325

Gin

Leu

Ile

Lys

Asp 330

Leu

Pro

val

33? ^61y

Asp

Ser

teu

Leu 340

Lys

Leu

Pro

val

Pro 345

His

He

Ile

Gin

Glu 350

Α5Π Lys

Gin ,

Ala ¹

Trp 355

Arg

Thr

Asp

Glu

Glu 360

Phe

Ala

Arg

Glu

val 365

Leu

Ala Gly

Val .

ASn i

pro ’

val

Met

Ile

Thr

Arg

Leu

Thr.

GlU

Phe

Pro

pro

Lys Ser

PL 208 246 B1

370 375 380

Ser Leu Asp Pro Ser Lys Phe Gly Asp His Thr Ser Thr ile Thr Ala 385 390 395 400

Glu His Ile Glu Lys Asn Leu Glu Gly Leu Thr.val Gin Gin Ala Leu

405

410

415

Glu ser Asr

i Arg

i leu

i Tyr Ile

! Leu Asp His

ί His

; Asp

* Arg

i Phe

! Met

: Pro

420

)

425

430

Phe

i Leu

i Ile

t ASP

val

Asn

Α5Π

i Leu

i Pro

i Gly

' Asn

Phe

ile

Tyr

Ala

Thr

435

440

445

Arg

Thr

Leu

Phe

Leu

Arg

Gly

ASP

Gly

Arg

Leu

Thr

Pro

Leu

Ala

450

455

460

Ile 465

Gl u

Leu

Ser

Glu

Pro 470

Ile

ile

Gin

Gly

55?

Leu

Thr

Ala

Lys 480

ser

Lys

val

Tyr

Thr

Pro

val

Pro

Ser

Gly

Ser

val

Glu

Gly

Trp

val

485

490

495

Trp

Glu

Leu

Ala

Lys

Ala

Tyr

val

Ala

val

Asn

ASp

Ser

Gly

Trp

His

500

505

510

Gin

Leu

val

Ser

His

Trp

Leu

Asn

Thr

His

Ala

val

Met

Glu

Pro

Phe

515

520

525

val

He

Ser

Thr

Asn

Arg

His

Leu

Ser

val

Thr

His

Pro

val

His

Lys

530

535

540

Leu

Ser

Pro

His

Tyr

Arg

ASP

Thr

Met

Thr

ile

ASn

Ala

teu

Ala

545

550

555

560

Arg

Gin

Thr

Leu

Ile

Α5Π

Ala

Gly

ile

Phe

Glu

Met

Thr

val

Phe

565

570

575

Pro

Gly

Lys

Phe 580

Ala

Leu

Gly

Met

Ser 585

Ala

val

Tyr

Lys 590

Asp

Trp

Lys

Phe

Thr

Glu

Gin

Gly

Leu

pro

ASp

ASP

Leu

Ile

Lys

Arg

Gly

Met

595

600

605

Ala

val

Glu

ASp

pro

ser

Ser

pro

Tyr

Lys

val

Arg

Leu

val

Ser

610

615

620

Asp 625

Tyr

Pro

Tyr

Ala

Ala 630

ASP

Gly

Leu

Ala

ile 635

Trp

His

Ala

Ile

Glu 640

Gin

7yr

val

ser

Glu 645

Tyr

Leu

Ala

Ile

Tyr 650

Tyr

Pro

Asn

ASp

Gly 655

val

Leu

Gl n

Gly

ASP

Thr

Glu

val

Gin

Ala

Trp

Lys

Glu

Thr

Arg

Glu

660

665

670

val

Gly

His 675

Gly

Asp

Leu

Lys

Asp 680

Ala

Pro

Trp

Pro 685

Lys

Met

Gin

ser

val

pro

Glu

Leu

Ala

Lys

Ala

Cys

Thr

Ile

Trp

ile

Gly

690

695

700

Ser

Ala

Leu

His

Ala

val

Asn

Phe

Gly

Gin

Tyr

Pro

Tyr

Ala

Gly

705

710

715

720

PL 208 246 B1

Phe teu Pro Asn

Arg 725

Pro Thr val

Ser Arg 730

: Arg Arg Met

Pro

Glu 735

pro

Gly

Thr

Glu

Tyr

Ala

Glu

Leu

Glu

Arg

Asp

Pro

Glu

Arg

Ala

Phe

740

745

750

ile

His

Thr

Ile

Thr

ser

Gin

Ile

Gin

Thr

Ile

Gly

val

Ser

teu

755

760

765

Leu

Glu

val

Leu

Ser

Lys

His

ser

Ser

Asp

Glu

Leu

Tyr

Leu

Gly

Gin

770

775

780

Arg

ASp

Thr

Pro

Glu

Trp

Thr

Ser

ASp

Pro

Lys

Ala

Leu

Glu

val

Phe

785

790

795

800

Lys

Arg

phe

ser

Asp 805

Arg

Leu

val

Glu.,

Ile 810

Glu

Ser

i-ys

val

Val 815

Gly

Met

Α5Π

Hi S

ASP 820

Pro

Glu

Leu

Lys

Asn 825

Arg

Asn

Gly

Pro

Ala 830

Lys

Phe

pro

Tyr

Met

Leu

Tyr

pro

Asn

Thr

ser

Asp

His

Lys

Gly

Ala

835

840

845

Ala

Gly

leu

Thr

Ala

Lys

Gly

Ile

pro

Asn

Ser

ile

Ser

Ile

850

855

860

<2l0>	10
<211>	2818
<212>	ONA
<213»	Kordeum vulgare

<400» 10 agtgaaaaac	agtgtgctgg	tgccattggt	tggagcagtg	aaagcgagga	gaggaggcca	60
agaacaagat	gctgctggga	gggctgatcg	acaccctcac	99999C9aac	aagagcgccc	120
ggctcaaggg	cacggtggtg	ctcatgcgca	agaacgtgct	ggacctcaac	gacttcggcg	180
ccaccateat	cgacggcatc	ggcgagttcc	tcggcaaggg	cgtcacctgc	cagcttatca	240
gctccaccgc	cgtcgaccaa	gacaacggcg	gtcgcgggaa	ggtgggcgcg	gaggcggagc	300
tggagcagtg	ggtgacgagc	ctgccgtcgc	tgacgacggg	ggagtccaag	ttcggcctca	360
ccttcgactg	ggaggtggag	aagctcgggg	tgccgggcgc	catcgtcgtc	aacaactacc	420
acagctccga	gttcctgctt	aaaaccatca	ccctccacga	cgtccccggc	cgcagcggca	480
acctcacctt	cgtcgccaac	tcatggatct	accccgccgc	caactaccga	tacagccgcg	540
tcttcttcgc	caacgacacg	tacctgccga	gccagatgcc	ggcggcgctg	aagccgtacc	600
gcgacgacga	gctccggaac	ctgcgtggcg	acgaccagca	gggcccgtac	caggagcacg	660
accgcatcta	ccgctacgac	gtctacaacg	acctcggcga	gggccgcccc	atcctcggcg	720
gcaactccga	ccacccttac	ccgcgccgcg	gccgcacgga	gcgcaagccc	aacgccagcg	780

PL 208 246 B1 acccgagcct ggagagccgg ctgtcgctgc tggagcagat ctacgtgccg cgggacgaga 840 agttcggcca cctcaagacg tccgacttcc tgggctactc catcaaggce atcacgcagg 900 gcatcctgcc ggccgtgcgc acctacgtgg acaccacccc cggcgagttc gactccttcc 960 aggacatcat caacctctat gagggcggca tcaagctgcc caaggtggec gccctggagg 1020 agctccgtaa gcagttcccg ctccagctca tcaaggacct cctccccgtc ggcggcgact 1080 ccctgcttaa gctccccgtg ccccacatca tccaggagaa caagcaggcg tggaggaccg 1140 acgaggagtt cgcacgggag gtgctcgccg gcgtcaaccc ggtcatgatc acgcgtctca 1200 cggagttccc gccaaaaagt agtctggacc ctagcaagtt tggtgaccac accagcacca 1260 tcacggcgga gcacatagag aagaacctcg agggcctcac ggtgcagcag gcgctggaaa 1320 gcaacaggct gtacatcctt gatcaccatg accggttcat gccgttcctg atcgacgtca 1380 acaacctgcc cggcaactte atctacgcca cgaggaccct cttcttcctg cgcggcgacg 1440 gcaggctcac gccgctcgcc atcgagctga gcgagcccat catccagggc ggccttacca 1500 cggccaagag caaggtttac acgccggtge ccagcggctc cgtcgaaggc tgggtgtggg 1560 agctcgccaa ggcctacgtc gccgtcaatg actccgggtg gcaccagctc gtcagccact 1620 ggctgaacac tcacgcggtg atggagccgt tcgtgatctc gacgaaccgg caccttagcg 1680 tgacgcaccc ggtgcacaag ctgctgagcc cgcactaccg cgacaccatg accatcaacg 1740 cgctggcgcg gcagacgctc atcaacgccg gcggcatctt cgagatgacg gtgttcccgg 1800 gcaagttcgc gttggggatg tcggccgtgg tgtacaagga ctggaagttc accgagcagg 1860 gactgccgga cgatctcatc aagaggggca tggcggtgga ggacccgtcg agcccgtaca 1920 aggtgcggtt gctggtgtcg gactacccgt acgcggcgga egggctggcg atctggcacg 1980 ccattgagca gtacgtgagc gagtacctgg ccatctacta cccgaacgac ggcgtgctgc 2040 agggcgatac ggaggtgcag gcgtggtgga aggagacgcg cgaggtcggg cacggcgacc 2100 tcaaggacgc cccatggtgg cccaagatgc aaagtgtgcc ggagctggcc aaggcgtgca 2160 ccaccatcat ctggatcggg tcggcgctgc atgcggcagt caacttcggg cagtacccct 2220 acgcggggtt cctcccgaac cggccgacgg tgagccggcg ccgcatgccg gagcccggca 2280 cggaggagta cgcggagctg gagcgcgacc cggagcgggc cttcatccac accatcacga 2340 gccagatcca gaccatcatc ggcgtgtcgc tgctggaggt gctgtcgaag cactcctccg 2400 acgagctgta cctcgggcag cgggacacgc cggagtggac ctcggaccca aaggccctgg 2460 aggtgttcaa gcggttcagc gaccggctgg tggagatcga gagcaaggtg gtgggcatga 2520 accatgaccc ggagctcaag aaccgcaacg gcccggctaa gtttccctac atgctgctct 2580 accccaacac ctccgaccac aagggcgccg ctgccgggct taccgccaag ggcatcccca 2640 acagcatctc catctaatct aagccatcgg caaccatgga tgaataaagg gcgttcgcca 2700

PL 208 246 B1 cgtacgaaac ttgtcgagag attggtgtag tgtgtgtctg tgacagtact atgtcagcag 2760 ttgctcttta agccgaataa ataaagcaga tttgcttcca aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2818 <210> 11 <211> 4663 <212> DNA <213> Hordeum vuTgare <22O>

<221> wariant <222> (2346)..(2348) <223> ”n to a, C. t lub g kodujące aminokwas kwasowy, zasadowy lub polarny i

<400> 11 cagccccatg	catgcacatg	cacatgcaca	tgcacatgca	gtgcagccaa	gcaccgctcg	60
atgggcgatc	acccgtcacg	ggaccggagc	gcgccatgcg	aagcacgagg	agggcacgtc	120
accgtccgcg	cgcagcacgt	ggagagcacg	tcgccgtccg	atccatctct	ccaaagccga	180
gcgccacacc	accgggaccg	gacccggacc	ggcctataaa	trgcccggac	cgagctgcaa	240
gcagctcctc	acacacactc	acgcaacaca	catccatctt	cactgaaaag	tgaaaaacag	300
tgtgctggtg	ccattggttg	gagcagtgaa	agcgaggaga	ggaggccaag	aacaagatge	360
tgctgggagg	gctgatcgac	accctcacgg	gggcgaacaa	gagcgcccgg	ctcaagggca	420
cggtggtgct	catgcgcaag	aacgtgctgg	acctcaacga	cttcggcgcc	accatcatcg	480
acggcategg	cgagttcctc	ggcaagggtg	tcacctgcca	gcttatcagc	tccaccgccg	540
tcgaccaagg	taatcactac	cctcctccgg	ccttctcctc	tgtttacaag	atatagtatt	600
tctttcgtgt	gggccggcgg	ccatggatgg	atggatgtgt	ctggatcggc	taaagaagat	660
aggatagcta	gccctggccg	gtcgtcttta	cctgagcatg	ggcatatgcc	atcgaaaaaa	720
gagacaacag	catgcatgca	tggtgcgcgc	accagaccac	gcagagcacc	ggatgctcga	780
gacaaagcaa	cacaacaagc	aaggacgaca	cgtcaaaagc	aacacaacaa	gcaaggacgg	840
cacgtcaaaa	gcaacacaaa	cctaaaetaa	agcacaaaga	cgtaagagca	agcacacaat	900
cagcaggcta	taaacagttg	tcatcaaaaa	caacgctgga	agagagagag	aaggaaggaa	960
gtagtagcca	tgaaaaatta	aatcaccggg	cgttgctctt	tgcccaacaa	ttaatcaagc	1020
agggtacgtg	gcatgtatag	ttcttgtaag	taaactaagc	atgtgatatg	agaaggtacg	1080

PL 208 246 B1 tggtggtgca gacaacggcg gtcgcgggaa ggtgggcgcg gaggcggagc tggagcagtg 1140 ggtgacgagc ctgccgtcgc tgacgacggg ggagtccaag ttcggcctca ccttcgactg 1200 ggaggtggag aagctcgggg tgccgggcgc catcgtcgtc aacaactacc acagctccga 1260 gttcctgctt aaaaccatca ccctccacga cgtccccggc cgcagcggca acctcacctt 1320 cgtcgccaac tcatggatct accccgccgc caactaccga tacagccgcg tcttcttcgc 1380 caacgacgtg cgtggatttt cctctacttt cctctccttt cattttcacc gccttcgtca 1440 ttcatggtcg atcattaagt cttgccagga caatagatga tgagctagga gtggttacca 1500 cttagcagta cgtacattat ttattccgtg ttggtagaaa aggatatggt ttggtgcaga 1560 tcgacacaag attgaatgaa agttgcaccg tggcaccgtg gcaęcgtggt aggtgaaaat 1620 aactgttgca cggatccacc cacatgattg ttttcatgaa taaacttttt aaggatgtgt 1680 ctagccacat ctagatgcat gtcacataat tattgcatac eaaaacgatt aaattaagca 1740 taaaaagaaa aggaaaaaaa tactcacata tctcgacgta agatcaatga tatagtattt 1800 agatatgcaa tatttatctt acatctaaac ctttcttcat tcttaaatat aagacatttg 1860 taagatttca ctatggacaa catacgaaac aaaatcagtg gatctctcta tgcattcatt 1920 atgtagtcta taataaaatc tttaaaagat cgtatatttt gcaacggagg gagtaaaaca 1980 taacttttta atagtaatgt tgcacggctc cacactcgca gaegtacctg ccgagccaga 2040 tgccggcggc gctgaagccg taccgcgacg acgagctccg gaacctgcgt ggcgacgacc 2100 agcagggccc gtaccaggag cacgaccgca tctaccgcta cgacgtctac aacgacctcg 2160 gcgagggccg ccccatcctc ggcggcaact ccgaccaccc ttacccgcgc cgcggccgca 2220 cggagcgcaa gcccaacgcc agcgacccga gcctggagag ccggctgtcg ctgctggagc 2280 agatctacgt gccgcgggac gagaagttcg gccacctcaa gacgtccgac ttcctgggct 2340 actccatcaa ggccatcacg cagggcatcc tgccggccgt gcgcacctac gtggacacca 2400 cccccggcga gttcgactcc ttccaggaca tcatcaacct ctatgagggc ggcatcaagc 2460 tgcccaaggt ggccgccctg gaggagctcc gtaagcagtt cccgctccag ctcatcaagg 2520 acctcctccc cgtcggcggc gactccctgc ttaagctccc cgtgccccac atcatccagg 2580 agaacaagca ggcgtggagg accgacgagg agttcgcacg ggaggtgctc gccnnngtca 2640 acccggtcat gatcacgcgt ctcacggtga gtcagcgatt atttgttcat tgtgtgtgta 2700 tggtgtccat ggtgagaaag tgcagatctt gatttgcgtt gggtcgcatg cacgcatgct 2760 gcatgcatgc aggagttccc gccaaaaagt agtctggacc ctagcaagtt tggtgaccac 2820 accagcacca tcacggcgga gcacatagag aagaacctcg agggcctcac ggtgcagcag 2880 graattggtc caagccatcg acatcaacta tgatttacct aggagtaatt ggtagctgta 2940 gataatttgg cttcgttgca attaatttga tgctggccga tcaagtgatc gtattgggtt 3000

PL 208 246 B1 aagcaacagg ctgtacatcc ttgatcacca tgaccggttc 3060 caacaacctg cccggcaact tcatctacgc cacgaggacc 3120 cggcaggctc acgccgctcg ccatcgagct gagcgagccc 3180 cacggccaag agcaaggttt acacgccggt gcccagcggc 3240 ggagctcgcc aaggcctacg tcgccgteaa tgactccggg 3300 ctggtacgtt ctccacggtc gatgtgattc agtcagtcga 3360 tatgattgat tgaaacgcgc aggctgaaca ctcacgcggt 3420 cgacgaaccg gcaccttagc gtgacgcacc cggtgcacaa 3480 gcgacaccat gaccatcaac gcgctggcgc ggcagacgct 3540 tcgagatgac ggtgttcccg ggcaagttcg cgttggggat 3600 actggaagtt caccgagcag ggaćtgccgg acgatctcat 3660 aatgttatga atgtgtaaaa caaattgggc gtctcgctca 3720 aaaatgcagg ggcatggcgg tggaggaccc gtcgagcccg 3780 gtcggactac ccgtacgcgg cggacgggct ggcgatctgg 3840 gagcgagtac ctggccatct actacccgaa cgacggcgtg 3900 gcaggcgtgg tggaaggaga cgcgcgaggt cgggcacggc 3950 gtggcccaag atgcaaagtg tgccggagct ggccaaggcg 4020 cgggtcggcg ctgcatgcgg cagtcaactt cgggcagtac 4080 gaaccggccg acggtgagcc ggcgccgcat gccggagccc 4140 gctggagege gacccggagc gggccttcat ccacaccatc 4200 catcggcgtg tcgctgctgg aggtgctgtc gaagcactcc 4260 gcagcgggac acgccggagt ggacctcgga cccaaaggcc 4320 cagcgaccgg ctggtggaga tcgagagcaa ggtggtgggc 4380 caagasccgc aacggcccgg ctaagtttcc ctacatgctg 4440 ccacaagggc gcęgctgceg ggcttaccgc caagggcatc 4500 atctaagcca tcggcaacca tggatgaata aagggcgttc 4560 agagattggt gtagtgtgtg tctgtgacag tactatgtca 4620 ataaataaag cagatttgct tcc 4663 tgaaatttgc aggcgctgga atgccgttcc tgatcgacgt ctcttcttcc tgcgcggcga atcatccagg gcggccttac tccgtcgaag gctgggtgtg tggcaccagc tcgtcagcca tgcacaacaa ctgatcgaaa gatggagccg ttcgtgatct gctgctgagc ccgcactacc catcaacgcc ggcggcatct gtcggccgtg gtgtacaagg caagaggtac gtacctggta ctgacaggaa cgtggtaaaa tacaaggtgc ggttgctggt cacgccattg agcagtacgt ctgcagggcg atacggaggt gacctcaagg acgccccatg tgcaccacca tcatetggat ccctacgcgg ggttcctccc ggcacggagg agtacgcgga acgagccaga tccagaccat rccgacgagc tgtacctegg ctggaggtgt tcaagcggtt atgaaccatg acccggagct ccctacccca acacctccga cccaacagca tctccatcta gccacgtacg aaacttgtcg gcagrtgctc tttaagccga <2lO> 12 <211> 862 «212» PRT <213» Hordeum vulgare

PL 208 246 B1 <22 0>

<221> wariant <222> (368)..(368) <223> Χδδ” aminokwas kwasowy, zasadowy lub polarny <400> 12

Met 1

Leu

Gly

Gly 5

Leu

ile

ASP

Thr

Leu 10

Thr

Gly

Ala

Asn

ΪΓ

Ser

Ala

Arg

Leu

Lys

Gly

Thr

val

Leu

Met

Arg

tyś

Asn

val

Leu

Asp

20

25

30

Leu

Asn

ASp

Phe

Gly

Ala

Thr

Ile

ASP

Gly

Ile

Gly

Glu

Phe

Leu

35

40

45

Gly

Lys

Gly

val

Thr

cys

Gln

Leu

Ile

Ser

Thr

Ala

val

Asp

Gln

50

55

60

ASp

Asn

Gly

Arg

Gly

Lys

val

Gly

Ala

Glu

Ala

Glu

Leu

Glu

Gln

65

70

75

80

Trp

val

Thr

Ser

Leu

Pro

Ser

Leu

Thr

Gly

Glu

Ser

Lys

phe

Gly

85

90

95

Leu

Thr Phe

asp Trp 100

Glu val Glu Lys 105

Leu

Gly

val

pro

Gly Ala Ile 110

Val

val

Asn

Tyr

His

Ser

ser

Glu

Phe

Leu

Lys

Thr

Ile Thr

115

120

125

Leu

His

ASp

val

pro

Gly

Arg

ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Phe

val

Ala Asn

130

135

140

Ser

Trp

Ile

Tyr

pro

Ala

Asn

Tyr

Arg Tyr

Ser

Arg

val

Phe Phe

145

150

155

160

Ala

Asn

Asp

Thr

Tyf-

Leu

pro

Ser

Gln

Met

pro

Ala

Leu

Lys Pro

US

170

175

Tyr

Arg

ASp

Asp

Glu

Leu

Arg

Asn

Leu

Arg

Gly

ASP

Asp

Gln

Gin Gly

180

185

190

Pro

Tyr

Gln

Glu

His

ASp

Arg

Ile

Tyr

Arg

Tyr

ASP

val

Tyr

Asn Asp

195

200

205

Leu

Gly

Glu

Gly

Arg

pro

Ile

Leu

Gly Gly

Asn

ser

Asp

His

Pro Tyr

210

215

220

Pro

Arg

Gly

Arg

Thr

Glu

Arg

Lys

pro

ASO

Ala

Ser

Asp

Pro Ser

225

230

235

240

Leu

Glu

ser

Arg

Leu

ser

Leu

Glu

Gln

Ile

Tyr

val

Pro

Arg ASp

245

250

255

Glu

tys

phe

Gly

His

Leu

Lys

Thr

Ser

Asp

Phe

Leu

Gly Tyr

Ser ile

PL 208 246 B1

260

265

270

Lys

Ala

. Ile

Thr

Gin

Gly

Ile

Leu

Pro

Ala val

Arg

Thr

Tyr

val

Asp

275

280

285

Thr

pro

Gly

Glu

Phe

ASP

Ser

Phe

Gin Asp

Ile

Asn

Leu

Tyr

290

295

300

Glu 305

Gly

Ile

Lys

Leu 310

Pro

Lys

val

Ala Ala 315

Leu

Glu

Gl u

Leu

Arg 320

Lys

Gin

phe

Pro

Leu 325

Gin

Leu

ile

Lys

Asp Leu 330

Leu

pro

val

Gly 335

Gly

ASP

Ser

teu

Leu 340

uys

Leu

Pro

val

Pro 345

wis Ile

ile

Gin

Glu 350

Asn

Lys

Gin

Ala

Trp

Arg

Thr

ASP

Glu

Phe

Ala Arg

Glu

val

Leu

Ala

xaa

355

360

365

val

Asn

pro

val

Met

ile

Thr

Arg

teu

Thr Glu

Phe

pro

Pro

Lys

Ser

370

375

380

ser

Leu

ASp

Pro

Ser

Lys

Phe

Gly

Asp

His Thr

Ser

Thr

ile

Thr

Ala

385

390

395

400

Glu

His

ile

Glu

Lys

Asn

Leu

Glu

Gly

teu Thr

Val

Gin

Ala

Leu

405

410

415

Glu

ser

Asn

Arg

Leu

Tyr

ile

Leu

ASp

His His

ASP

Arg

phe

Met

Pro

420

425

430

phe

Leu

ile

ASp

val

Asn

Leu

Pro

Gly Asn

Phe

ile

Tyr

Ala

Thr

435

440

445

Arg

Thr

Leu

Phe

teu

Arg

Gly

Asp

Gly Arg

Leu

Thr

Pro

Leu

Ala

450

455

460

Ile Glu Leu Ser Glu Pro ile Ile Gin Gly Gly Leu Thr Thr Ala Lys

465 470 475 480 ser Lys val Tyr Thr Pro val Pro ser cly Ser val Glu Gly Trp val

485 4 495

Trp Glu Leu Ala Lys Ala Tyr Val Ala val Asn Asp Ser Gly Trp His 500 505 510

Gin Leu val ser His Trp Leu Asn Thr his Ala val Met Glu pro Phe 515 520 525 val ile ser Thr Asn Arg His Leu ser val Thr His Pro val His Lys 530 535 540

Leu Leu Ser Pro His Tyr Arg Asp Thr Met Thr Ile Asn Ala Leu Ala

545 550 555 560

Arg Gin Thr Leu ile Asn Ala Gly Gly Ile Phe Glu Met Thr yal Phe

565 570 575

Pro Gly Lys Phe Ala Leu Gly Met Ser Ala val val Tyr Lys asp Trp

Lys Phe Thr Glu Gin Gly Leu Pro asp Asp Leu Ile Lys Arg Gly Met

S9S 600 605

PL 208 246 B1

Ala val Glu 610

Asp

Pro Ser

Ser Pro Tyr 615

Lys

val

Arg 620

Leu

val

Ser

Asp

Tyr

Pro

Tyr

Ala

Asp

Gly

Leu

Ala

Ile

Trp

His

Ala

ile

Glu

625

630

635

640

Gin

Tyr

val

Ser

Glu

Tyr

Leu

Ala

ile

Tyr Tyr

Pro

Asn

ASP

Gly

val

645

650

655

Leu

Gin

Gly

ASP

Thr

Glu

val

Gin

Ala

Trp Trp

Lys

Glu

Thr

Arg

Glu

660

665

670

Val

Gly

His

Gly Asp

Leu

Lys

ASP

Ala

Pro

Trp

Pro

Lys

Met

Gin

675

680

685

Ser

val

Pro

Glu

Leu

Ala

Lys

Ala

Cys

Thr

Ile

rrp

Ile

Gly

690

695

700

Ser

Ala

Leu

His

Ala

Val

Asn

Phe

Gly

Gin

Tyr

Pro

Tyr

Ala

Gly

705

710

715

720

Phe

ueu

Pro

Asn

Arg

Pro

Thr

val

ser

Arg

Met

Pro

Glu

Pro

725 730 73S

Gly

Thr

Glu

Tyr

Ala

Glu

teu

Glu

Arg

Asp

Pro

Glu

Arg

Ala

Phe

740

745

750

Ile

Hi s

Thr 755

ile

Thr

Ser

Gin

ile 760

Gin

Thr

ile

&

Val

Ser

Leu

teu

Glu

val

Leu

Ser

Lys

His

ser

ASP

Glu

Leu

Tyr

Leu

Gly

Gin

770

775

780

Arg

Asp

Thr

Pro

Glu

Trp

Thr

Ser

Asp

Pro

Lys

Ala

Leu

Glu

val

Phe

785

790

795

800

Lys

Arg

Phe

Ser

ASp

Arg

Leu

val

Glu

Ile

Glu

Ser

Lys

val

Gly

805

810

815

Met

Asn

His

Asp

Pro

Gl u

Leu

LyS

Asn

Arg

Asn

Gly

Pro

Ala

Lys

Phe

820

825

830

Pro

Tyr

Met

Leu

Tyr

Pro

Asn

Thr

Ser

Asp

His

Lys

Gly

Ala

635

840

845

Ala

Gly 850

Leu

Thr

a! a

Lys

&

Ile

Pro

Asr

Ser

ile 860

Ser

Ile

<2l0>	13
<211>	20
<212>	ONA
<213>	Hordeum vulgare
<40G>	13

cgctacgacg tctacaacga <21O> 14

PL 208 246 B1 «211> 20 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 14 cagactactt tttggcggga <210> 15 <211> 839 <212> PP.T <213> Glycine rnax <400> 15

Met 1

Phe

ser

Ala

Gly 5

HiS

Lys

Ile

Lys

Gly 10

Thr

val

Leu

Met 15

pro

Lys

Asn

Glu

Leu 20

Glu

val

Asn

Pro

ASp 25

Gly

Ser

Ala

val

ASp 30

Asn

Leu

Asn

Ala

Phe

Leu

Gly

Arg

Ser

val

Ser

Leu

Gin

Leu

Ile

ser

Ala

Thr

35

40

45

lys

Ala 50

ASp

Ala

HiS

Gly

kf

Gly

Lys

val

Gly

Lys 60

Asp

Thr

Phe

Leu

Glu 65

Gly

Ile

Asn

Thr

Ser 70

Leu

pro

Thr

Leu

Gly 75

Ala

Gly

Glu

ser

Ala 80

phe

Asn

ile

His

Phe

Glu

Trp

ASp

Gly

Ser

Met

Gly

Ile

Pro

Gly

Ala

85

90

95

phe

Tyr

ile

Lys 100

Asn

Tyr

Met

Gin

val 105

Gl U

phe

Phe

Leu

Lys 110

Ser

Leu

Thr

Leu

Glu

Ala

Ile

Ser

Asn

Gin

Gly

Thr

ile

Arg

Phe

val

Cys

Asn

115

120

125

Ser

Trp 130

Val

Tyr

Asn

Thr

kil

Leu

Tyr

Lys

ser

val 140

Arg

Ile

Phe

Ala 145

Asn

His

Thr

Tyr

val 150

Pro

Ser

Glu

Thr

pro 155

Ala

Pr©

teu

val

Ser 160

Tyr

Arg

Glu

Glu 165

Leu

Lys

Ser

Leu

Arg 170

Gly

Asn

Gly

Thr

ciy 175

Glu

Arg

Lys

Glu

Tyr 180

Asp

Arg

Ile

Tyr

ASP 185

Tyr

ASp

val

Tyr

Asn 190

ASp

Leu

Gly

Asn

Pro

ASP

Lys

Ser

Glu

Lys 200

Leu

Ala

Arg

Pro

val 205

Leu

Gly

PL 208 246 B1

Ser Ser Thr Phe Pro Tyr pro Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Pro 210 215 220

Thr val Thr Asp pro Asn Thr Glu Lys Gin Gly Glu val Phe Tyr val

225 230 235 240 pro Arg Asp Glu Asn Leu Gly wis Leu Lys Ser Lys Asp Ala Leu Glu

245 250 255

Ile Gly Thr Lys Ser Leu Ser Gin ile val Gin Pro Ala Phe Glu Ser 260 265 270

Ala Phe Asp Leu Lys Ser Thr Pro ile Glu Phe His Ser Phe Gin Asp 275 280 285 val His Asp Leu Tyr clu Gly Gly ile Lys teu Pro Arg Asp val Ile 290 295 300

Ser Thr ile ile Pro Leu Pro val ile Lys Glu Leu Tyr Arg Thr Asp 305 310 315 320

Gly Gin

Hi s

ile

Leu 325

Lys

Phe Pro

Gin Pro His 330

val

Gin

val 335

Ser

Gin

Ser

Ala

Trp

wet

Thr

Asp

Glu

Phe

Ala

Arg

Glu

Met

ile Ala

340

345

350

Gly

val

Α5Π

Pro

Cys

val

ile

Arg

Gly

Leu

Glu

Phe

Pro

Pro Lys

355

360

365

Ser

Asn

teu

Asp

Pro

Ala

Ile

Tyr

Gly

Asp

Gin

Ser

Lys

ile

Thr

370

375

380

Ala

Asp

ser

Leu

ASp

Leu

ASP

Gly

Tyr

Thr

Met

ASP

Glu

Ala

Leu

Gly

385

390

395

400

Ser

Arę

Arg

teu

Phe 405

Met

Leu

ASp

Tyr

Hi S 410

ASp

Ile

Phe

wet

pro 415

Tyr

Val

Arg

Gin

Ile

Asn

Gin

Leu

Asn

ser

Ala

Lys

Thr

Tyr

Ala

Thr

Arg

420

425

430

Thr

ile

Leu

Phe

Leu

Arg

Glu

Asp

Gly

Thr

Leu

Lys

Pro

val

Ala

Ile

435

440

445

Glu

Leu

ser

Leu

Pro

His

Ser

Ala

Gly

ASP

Leu

5er

Ala

val

Ser

4S0

4 55

460

Gin

val

Leu

Pro

Ala

LyS

Glu

Gly

val

Glu

Ser

Thr

ile

Trp

Leu

465

470

475

480

teu

Ala

tys

Ala

Tyr

val

He

val

Asn

ASP

Ser

cys

Tyr

His

Gin

teu

485

490

495

Met

Ser

His

Trp

Leu

Asn

Thr

His

Ala

Met

Glu

Pro

Phe

val

Ile

500

505

510

Ala

Thr

His

Arg

His

Leu

Ser

val

Leu

His

pro

Ile

Tyr

Lys

Leu

515

520

525

Thr

Pro

His

Tyr

Arg

Asn

Met

Asn

ile

Α5Π

Ala

Leu

Ala

Arg

Gin

530

535

540

Ser

Leu

Ile

Asn

Ala

A$n

Gly

Ile

ll e

Glu

Thr

Phe

Leu

Pro

Ser

PL 208 246 B1

545 550 555 560

Lys Tyr Ser val Glu wet Ser Ser Ala val Tyr Lys Asn Trp val Phe 565 570 575

Thr

ASP

Gin

Ala

Leu

Pro

Ala

ASp

teu

Ile

Lys

Arg

Gly

val

Ala

Ile

580

585

590

Lys

ASP

Pro 595

Ser

Thr

Pro

His

Gly 600

val

Arg

Leu

Ile 605

Glu

ASP

Tyr

Pro

Tyr

Ala

ASp

Gly

Leu

Glu

Ile

Trp

Ala

Ile

Lys

Thr

Trp

610

615

620

val

Gin

Glu

Tyr

val

Pro

Leu

Tyr

Ala

ASP

Asp

val

Lys

625

630

635

640

Asn

Asp

Ser

Glu

Leu

Gin

His

Trp

ΤΓΡ

Lys

Glu

Ala

val

Glu

Lys

Gly

645

650

655

His

Gly

ASp

Leu 660

Lys

Asp

Lys

Pro

Trp 665

Trp

Pro

Lys

Leu

Gin 670

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

val

Gl u

Val

cys

Leu

ile

Ile

ile

Trp

Ile

Al a

Ser

Ala

675

680

685

Leu

Hi s

Ala

val

Asn

phe

Gly

Gin

Tyr

Pro

dy

Gly

Leu

Ile

690

695

700

Met 705

Asn

Arg

Pro

Thr

Ala 710

Ser

Arg

Leu

Leu 715

Pro

Glu

Lys

Gly

Thr 720

pro

Gl u

Tyr

Glu

Glu 725

Met

Ile

Α5Π

Asn

HIS 730

Glu

Lys

Ala

Tyr

Leu 735

Arg

Thr

Ile

Thr

Ser

Lys

Leu

pro

Thr

Leu

Ile

Ser

Leu

Ser

val

ile

Glu

740

745

750

Ile

Leu

Ser

Thr

Hi s

a! a

Ser

A5P

Glu

val

Tyr

Leu

Gly

Gin

Arg

Asp

7S5

760

765

Asn

Pro

His

Trp

Thr

ser

ASP

Ser

Lys

Ala

Leu

Gin

Ala

Phe

Gin

Lys

770

775

780

Phe 785

Gly

Asn

Lys

Leu

tys 790

Gl u

Ile

Glu

Lys 795

Leu

Val

Arg

Asn 800

Asn

Asp

Pro

Ser

Leu 805

Gin

Gly

Asn

Arg

Leu 810

Gly

pro

val

Gin

Leu 815

ΡΓΟ

Tyr

Thr

Leu

Leu 820

Tyr

pro

Ser

Glu 825

Glu

Gly

Leu

Thr

Phe 830

Arg

Gly

ile

Pro

Asn

Ser

Ile

Ser

Ile

835 <210> 16 <211> 855 <212> PRT <213> Glycine max

PL 208 246 B1

<40

0>

16

Met

Phe

ser

val

Pro

Gly

val

Ser

Gly

Ile

teu

Asn

Arg Gly

Gly

1

5

10

15

His

Lys

Ile

uys

Gly

Thr

val

Leu

Met

Arg

Lys

ASn val

Leu

Asp

20

25

30

Phe

Asn

ser

val

Ala

Asp

Leu

Thr

Lys

Gly

Asn

val

Gly Gly

Leu

Ile

35

40

45

Gly

Thr

Gly

Leu

Asn

val

Gly

Ser

Thr

Leu

ASP

Asn Leu

Thr

Ala

50

55

60

Phe

Leu

Gly

Arg

Ser

val

Ala

Leu

Gin

Leu

Ile

Ser

Ala Thr

Lys

pro

65

70

75

80

Leu

Ala

Asn

Gly

Lys

Gly

Lys

val

Gly

Lys

Asp

Thr

Phe Leu

Glu

Gly

85

90

95

ile

Ile

val

Ser

Leu

pro

Thr

Leu

Gly

Ala

Gly

Glu

Ser Ala

Phe

Asn

100

105

110

Ile

Gin

Phe

Glu

Trp

ASP

Glu

Ser

Met

Gly

Ile

Pro

Gly Ala

Phe

Tyr

115

120

125

ile

Lys

Asn

Tyr

Met

Gin

val

Gl u

phe

Tyr

Leu

Lys

Ser Leu

Thr

Leu

130

135

140

Glu Asp val Pro Asn Gin Gly Thr Ile Arg Phe val Cys Asn Ser Trp

145 150 155 160 val Tyr Asn Thr Lys teu Tyr Lys Ser val Arg Ile Phe Phe Ala Asn

165 170 175

His

Thr

Tyr

val

Pro

Ser

Glu

Thr

Pro

a! a

Al a

Leu

val

Gly

Tyr

Arg

180

185

190

Glu

Leu

Lys

Asn

Leu

Arg

Gly

Asp

Gly

Lys

Gly

Glu

Arg

Lys

195

200

205

Glu

His

ASp

Arg

ile

Tyr

Asp

Tyr

ASP

val

Tyr

Asn

ASp

Leu

Gly

Asn

210

215

220

pro

Asp

His

Gly

Glu

Asn

Phe

Ala

Arg

Pro

Ile

Leu

Gly

Ser

ser

225

230

235

240

Thr

His

pro

Tyr

Pro

Arg

Gly

Arg

Thr

Gly

Arg

Tyr

ΡΓΟ

Thr

Arg

245

250

255

Lys

ASp

Gin

Asn

Ser

Glu

Lys

pro

Gly

Glu

val

Tyr

val

pro

Arg

Asp

260

265

270

Glu

Α5Π

Phe

Gly

His

Leu

Lys

Ser

ASp

Phe

Leu

Ala

Tyr

Gly

Ile

275

280

285

Lys

Ser

Leu

Ser

Gin

Tyr

val

Leu

Pro

Ala

Phe

Glu

Ser

val

Phe

ASp

290

295

300

Leu

Asn

Phe

Thr

pro

Asn

Glu

Phe

Asp

Ser

Phe

Gin

ASp

val

Arg

ASP

305

310

315

320

PL 208 246 B1

teu

HIS

Glu Gly Gly 325

ile Lys

Leu Pro Thr Glu val 330

ile

Ser

Thr 335

Ile

Met

Pro

Leu

Pro

val

tys

Glu

Leu

Phe

Arg

Thr

ASP

Gly

Glu

Gin

340

345

350

val

Leu

Lys

Phe

Pro

His

val

Ile

Gin

val

ser

Lys

ser

Ala

355

360

365

Trp

wet

Thr

Asp

Glu

Phe

Ala

Arg

Glu

Met

va1

Ala Gly

val

Asn

370

375

380

Pro

Cys

val

ile

Arg

Gly

Leu

Gin

Glu

Phe

Pro

tys

Ser

Asn

Leu

385

390

395

400

ASp

Pro

Thr

ile

Tyr

Gly

Gllł

Gin

Thr

Ser

Lys

Ile

Thr

Ala

Asp

Ala

405

410

415

Leu

ASp

Leu

ASP

Gly

Tyr

Thr

val

ASp

Glu

Ala

Leu

Ala

Ser

Arg

420

425

430

Leu

phe

Met

Leu

ASp

Tyr

His

Asp

val

Phe

Met

pro

Tyr

He

Arg

435

440

445

ile

Α5Π

Gin

Thr

Tyr

Ala

Lys

Ala

Tyr

Ala

Thr

Arg

Thr

Ile

Leu

Phe

450 455 450

Leu

Arg

Glu

Asn

Gly

Thr

Leu

Lys

Pro

val

Ala

Ile

Glu

Leu

ser

Leu

465

470

475

480

Pro

Hi s

Pro

Ala

Gly

ASP

Leu

Ser

Gly

Ala

val

ser

Gin

val

ile

Leu

485

490

495

Pro

Ala

Lys

Glu

Gly

val

Glu

ser

Thr

ile

Trp

Leu

Ala

Lys

Ala

500

505

510

Tyr

V3l

val

Asn

ASP

ser

cys

Tyr

His

Gin

Leu

Met

Ser

His

Trp

515

520

525

Leu

Asn

Thr

His

Ala

val

Ile

Gl u

Pro

Phe

Ile

ile

Ala

Thr

Asn

Arg

530

535

540

His

Leu

Ser

Ala

Leu

His

Pro

Ile

Tyr

Lys

Leu

teu

Thr

Pro

His

Tyr

545

550

555

560

Arg

Asp

Thr

Met

Asn

Ile

Asn

Ala

Leu

Ala

Arg

Gin

Ser

Leu

Ile

Asrt

565

570

575

Ala

ASP

Gly

ile

Ile

Glu

Lys

Ser

Phe

Leu

Pro

Ser

Lys

His

Ser

val

580

585

590

Glu

Met

ser

Ser

Ala

val

Tyr

Lys

Asn

Trp

val

Phe

Thr

ASP

Gin

Ala

595

600

605

teu

Pro

Ala

ASP

Leu

Ile

tys

Arg

Gly

val

Ala

Ile

Lys

ASP

Pro

Ser

610

615

620

Ala

Pro

His

Gly

Leu

Arg

teu

lcu

Ile

Glu

ASP

Tyr

Pro

Tyr

Ala

val

625

630

635

640

ASP

Gly

Leu

Glu

Ile 645

Trp

Ala

Ile

Lys 650

Thr

Trp

val

Gin

Glu 655

Tyr

val

Ser

teu

Tyr

Ala

Arg

ASp

Asp

ASP

val

Lys

Pro

ASP

ser

Glu

PL 208 246 B1

660 665 670

Leu Gin Gin Trp Trp Lys Glu Ala Va1 Glu Lys Gly His Gly Asp Leu 675 680 685

Lys Asp Lys Pro Trp Trp Pro Lys Leu Gin Thr He Glu Glu Leu va1 690 695 700

Glu Ile Cys Thr ile He Ile Trp Thr Ala Ser Ala Leu His Ala Ala 705 710 715 720

va1

Asn

phe

Gly Gin Tyr 725

pro Tyr

Gly

Gly Phe Ile Leu 730

Asn

Arg 735

Pro

Thr

ser

Ser

Arg

Leu

Pro

Glu

Lys

Gly

Thr

pro

Glu

Tyr

Glu

740

745

750

Glu

Met

va1

Lys

ser

His

Gin

Lys

Ala

Tyr

Leu

Arg

Thr

ile

Thr

ser

755

760

765

Lys

Phe

Gin

Thr

Leu

val

ASP

Leu

ser

val

ile

Glu

Ile

Leu

Ser

Arg

770

775

780

His

Ala

Ser

Asp

Glu

val

Tyr

Leu

Gly

Gin

Arg

ASP

Asn

Pro

His

Trp

785

790

795

800

Thr

Ser

ASP

Ser

Lys

Ala

Leu

Gin

Ala

Phe

Gin

Lys

Phe

Gly

Asn

Lys

805

810

815

Leu

Lys

Glu

Ile

Glu

Lys

Leu

Ala

Arg

Lys

Asn

ASn

Asp

Gin

ser

820

825

830

Leu

Ser

Asn

Arg

Leu

ciy

Pro

va1

Gin

Leu

pro

Tyr

Thr

Leu

His

835

840

845

pro

Asn

Ser

Glu

Gly

Leu

Thr

cys

Arg

Gly

ile

Pro

Asn

Ser

ile

Ser

850

855

860

ile

865 <210> 17 <2ll> 857 <212» PRT <213» Glycine max

<400>

17

Met

Leu

Gly

Leu teu

His

Arg

ciy

His

Lys

ile

tys

Gly

Thr

va1

1

5

10

15

va1

ueu

Met

Arg

Lys Asn

Val

Leu

Asp

va1

Asn

ser

val

Thr

Ser

va1

20

25

30

Gly Gly Ile Ile Gly Gin Gly Leu Asp Leu va1 Gly Ser Thr teu Asp 35 40 45

Thr Leu Thr Ala Phe Leu Gly Arg ser va1 ser Leu Gin Leu Ile Ser 50 55 60

PL 208 246 B1

Ala Thr Lys Ala Asp Ala Asn Gly Lys Gly Lys Leu Gly Lys Ala Thr ¢5 70 75 80

Phe Leu Glu Gly Ile Ile Thr Ser Leu Pro Thr Leu Gly Ala Gly Gln

90 95 ser Ala Phe Lys Ile Asn Phe Glu Trp Asp Asp Gly ser Gly Ile Pro 100 105 110

Gly Ala Phe Tyr ile Lys Asn Phe Met Gln Thr Glu Phe Phe Leu val ^y 115 120 125 ser Leu Thr Leu Glu Asp Ile Pro Asn wis Gly Ser ile His Phe val

130 135 140

Cys Asn ser Trp 145

Ile

Tyr Asn Ala Lys Leu 150

Phe 155

Lys ser Asp Arg Ile 160

Phe

Ala

Asn

Gln

Thr

Tyr

Leu

Pro

Ser

Glu

Thr

pro

Ala

Pro

Leu

165

170

175

val

tys

Tyr

Arg 180

Glu

Leu

His 185

Asn

Leu

Arg

Gly

Asp 190

Gly

Thr

Gly

Glu

Arg 195

Lys

Glu

Trp

Glu

Arg 200

ile

Tyr

ASP

Tyr

ASp 205

val

Ty_r

Asn

ASp

teu

Gly

ASp

Pro

Asp

t/S

Gly

Glu

Asn

His

Ala

Arg

pro

val

Leu

210

215

220

Gly

Asn

ASP

Thr

Phe

Pro

Tyr

Pro

Arg

Gly

Arg

Thr

Gly

225

230

235

240

Lys

Pro

Thr

Arg

Lys

ASP

Pro

Asn

ser

Glu

Ser

Arg

Ser

Asn

Asp

val

245

250

255

Tyr

Leu

Pro

Arg

ASP

Glu

Ala

Phe

ciy

His

Leu

Lys

Ser

ASp

phe

260

265

270

Leu

Thr

Tyr

Gly

Leu

Lys

Ser

val

ser

Gln

Asn

val

Leu

Pro

Leu

275

280

285

Gln

Ser

Ala

Phe

ASp

Leu

Asn

Phe

Thr

Pro

Arg

Glu

Phe

ASP

ser

Phe

290

295

300

ASp

Glu

val

His

Gly

Leu

Tyr

Ser

Gly Gly

Ile

Lys

Leu

Pro

Thr

ASp

305

310

315

320

Ile

He

Ser

Lys

Ile

Ser

Pro

Leu

pro

val

Leu

Lys

Glu

Ile

Phe

Arg

32S

330

335

Thr

Asp

Gly

Glu 340

Gln

Ala

Leu

Lys

Phe 345

Pro

pro

Lys

val 350

Ile

Gln

val

ser

Lys 355

Ser

Ala

Trp

Mex

Thr 360

ASP

Glu

Phe

Ala 365

Arg

Glu

Met

Leu

Ala

Gly

val

Asn

Pro

Asn

Leu

Ile

Arg

Cys

Leu

Lys

Asp

Phe

pro

370

375

380

Pro 385

Arg

Ser

Lys

Leu

ASP 390

ser

Gln

val

Tyr

Gly 395

Asp

His

Thr

ser

Gln 400

PL 208 246 B1

Ile Thr tys Glu His Leu Glu Pro Asn Leu Glu Gly Leu Thr val Asp 405 410 415

Glu Ala Ile Gin Asn Lys Arg leu Phe Leu Leu Asp His His Asp Pro 420 425 430

Ile Met Pro Tyr Leu Arg Arg ile Asn Ala Thr Ser Thr tys Ala Tyr 435 440 445

Ala Thr Arg Thr Ile Leu Phe Leu Lys Asn Asp Gly Thr Leu Arg Pro 450 455 460

Leu Ala ile Glu Leu Ser Leu Pro His Pro Gin Gly Asp Gin Ser Gly

465 470 475 480

Ala Phe Ser Gin val Phe Leu Pro Ala Asp Glu Gly val Glu Ser Ser

485 490 495

Ile Trp Leu Leu Ala Lys Ala Tyr val val val Asn Asp Ser cys Tyr 500 505 510

Hi5 Gin Leu val Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala val val Glu Pro 515 520 525

Phe Ile ile Ala Thr Asn Arg His Leu Ser va! va1 His Pro ile Tyr 530 535 540

Lys 54 5

Leu

Hi s

pro

Hi s 550

Tyr Arg

ASp

Thr Met 555

Asn

Ile

Asn

Gly

¹ Leu 560

Ala

Arg

Leu

Ser

Leu

val

Asn Asp

Gly

val

Ile

Gl u

Gin

Thr

Phe

565

570

575

Leu

Trp

Gly

Arg

Tyr

ser

val Glu

Met

Ser

Ala

val

Tyr

tys

ASP

580

585

590

Trp

val

phe

Thr

ASP

Gin

Ala Leu

pro

Ala

Asp

Leu

Ile

tys

Arg

Gly

595

600

605

Met

Ala

Ile

Glu

ASP

Pro

Ser Cys

Pro

His

Gly

Ile

Arg

Leu

val

He

510

615

620

Glu

Asp

Tyr

Pro

Tyr

Thr

val Asp

Gly

Leu

Glu

Ile

Trp

Asp

Ala

Ile

625

630

63S

640

Lys

Thr

Trp

val

His

Glu

Tyr val

Phe

Leu

Tyr

tys

5er

ASP

ASp

645

650

655

Thr

Leu

Arg

Glu

ASp

Pro

Glu Leu

Gin

Ala

Cys

Trp

Lys

Glu

Leu

val

660

665

670

Glu

val

Gly

His

Gly

Asp

tys Lys

Asn

Glu

Pro

Trp

Pro

tys

Met

675

680

685

Gin

Thr

Arg

Glu

Leu

val Glu

Ala

Cys

Ala

ile

Ile

Trp

Thr

690

695

700

Ala

Ser

Ala

Leu

His

Ala

Ala val

Asn

phe

Gly

Gin

Tyr

Pro

Tyr

Gly

705

710

715

720

Gly

Leu

ile

Leu

Asn

Arg

Pro Thr

Leu

ser

Arg

Phe

Met

pro

Glu

725

730

735

Lys i

Gly

Ser

Ala

Glu

Tyr

Glu Glu

ueu ,

Arg

tys

Asn

Pro

Gin

Lys

Ala

PL 208 246 B1

740

745

750

Tyr

Leu

Lys

Thr

ile

Thr

pro

Lys

Phe

Gin

Thr

Leu

Ile

Asp

Leu

Ser

755

760

765

val

Ile

Glu

Ile

Leu

Ser

Arg

Hi s

Ala

Ser

ASp

Glu

val

Tyr

teu

Gly

770

775

780

Glu

Arg

ASP

Α5Π

Pro

Asn

Trp

Thr

Ser

Asp

Thr

Arg

Ala

Leu

Glu

Ala

785

790

795

800

Phe

Lys

Arg

Phe

Gly

Asn

Lys

Leu

Ala

Gin

Ile

Glu

Asn

Lys

Leu

Ser

805

810

815

Glu

Arg

Asn

ASp

Glu

Lys

Leu

Asn

Arg

Cys

Gly

Pro

val

Gin

820

825

830

Met

pro

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Lys

Glu

Gly

Leu

Thr

Phe

835

840

845

Arg

Gly

ile

PrO

ASrt

Ser

Ile

Ser

Ile

850

855

<210>	18
<211>	864
<212>	PRT
<2l3>	Hordeum vulgare
<400>	18

wet 1

Leu

Gly

val

Gly 5

Gly Ile val

Ser Asp 10

Leu

Thr

Gly

ile 15

Arg

Gly

Ala

His

Leu

Lys

Gly

Ser

Val

Leu

Met

Arg

Lys

Asn

Ala

Leu

20

25

30

ASp

Phe

Asn

ASP

Phe

Gly

Ala

His

val

Met

ASp

Gly

val

Thr

Glu

Leu

35

40

45

Leu

Gly 50

Arg

Gly

val

Thr

Cys 55

Gin

Leu

Ile

Ser

Ser 60

Thr

Asn

val

ASP

Hi s

Asn

Gly

Arg

Gly

Lys

val

Gly

Ala

Glu

Ala

Asn

Leu

Glu

65

70

75

80

Gin

Trp

Leu

Pro

Thr

Asn

Leu

Pro

Phe

Ile

Thr

Gly

Glu

Asn

85

90

95

Lys

Phe

Ala

va1

Thr

Phe

ASp

Trp

Ser

val

ASp

Lys

Leu

Gly

val

Pro

100

105

110

Gly

Ala

Ile

val

Lys

Asn

His

Ala

ser

Glu

Phe

Leu

Lys

115

120

125

Thr

Ile

Thr

Leu

ASp

Asn

val

Pro

Gly

Arg

Gly

Thr

Ile

val

Phe

val

130

135

140

Ala

Asn

ser

Trp

val

Tvr

Pro

Gin

Ala

Lys

Tyr

Arg

Tyr

Asn

Arg

val

145

150

155

160

PL 208 246 B1

Phe Phe Ala Asn Asp Thr Tyr Leu Pro His Gin Met Pro Ala Ala Leu 165 170 175

Lys Pro Tyr Arg Asp Asp Glu Leu Arg Asn Leu Arg Gly Asp Asp Gin ⁷ 180 185 190

Gin Gly Pro Tyr Leu Asp His Asp Arg val Tyr Arg Tyr Asp val Tyr

19S 200 205

Asn Asp Leu Gly Asp ser Arg Asp val Leu Gly Gly ser Lys Asp Leu 210 215 220 pro Tyr Pro Arg Arg cys Arg Thr Gly Arg Lys pro Ser Asp Ser Lys

225 230 235 240 pro asp His Glu Ser Arg Leu Leu Leu teu val Gin Asn val Tyr val

245 250 255

Leu Arg Asp Glu Leu Phe Gly His Leu Lys Gin Ser Asp Leu Leu Gly 260 265 270

Tyr Thr Leu Lys Gly Trp Leu Asp Gly Ile Ile Leu Ala Ile Arg Thr 275 280 285

Tyr val Asp Leu ser Pro Gly Glu Phe Asp Ser Phe Ala Asp Ile Leu 290 295 300

Lys

Leu

Tyr

Glu

Gly

Ile

Lys

Leu

pro

ASn

Ile

Pro

Ala

Leu

Glu

305

310

315

320

Glu

val

Arg

Lys

Arg

Phe

Pro

Leu

Gin

Leu

val

Lys

ASP

Leu

ile

pro

325

330

335

Lys

Gly

Asp

Phe

Leu

Lys

Leu

Pro

Lys

pro

Glu

Ile

Lys

340

345

350

val

ASp

Gin

Lys

Ala

Trp

Met

Thr

ASP

Glu

Phe

Ala

Arg

Glu

Met

355

360

365

Leu

Ala

Gly

val

Α5Π

Pro

Met

Ile

Lys

Arg

Leu

Thr

Glu

phe

Pro

370

375

380

Pro

Lys

Ser

Thr

Leu

ASP

Pro

Ser

Lys

Tyr

Gly

ASP

His

Thr

Ser

Thr

385

390

395

400

Met

Thr

Glu

Hi s

val

Ala

Lys

ser

Leu

Glu

Gly

Leu

Thr

val

Gin

405

410

415

Gin

Ala

Leu

Ala

Gly

Asn

Arg

Leu

Tyr

Ile

val

ASp

Gin

His

ASp

ASn

420

425

430

Leu

Met

Pro

Phe

Leu

Ile

Asp

Ile

Asn

Leu

ASp

Ala

ser

Phe

val

435

440

445

Tyr

Ala

Thr

Arg

Thr

Leu

phe

Leu

Arg

Gly

ASp

Gly

Thr

Leu

Ala

450

455

460

pro

val

Ala

ile

Glu

Leu

Ser

Pro

Leu

ile

Gin

Gly

Glu

Leu

Thr

465

470

475

480

Thr

Al a

Lys

Ser

Ala

val

Tyr

Thr

Pro

Gin

His

Ala

Gly

val

Glu

Gly

485

490

495

PL 208 246 B1

Trp ile Trp Gin Leu Ala Lys Ala Tyr Ala Ser val Asn Asp Tyr Gly 500 505 510

Trp His Gin Leu ile Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala val Met Glu 515 520 525

Pro Phe val Ile Ala Thr Asn Arg Gin Leu Ser val Thr His Pro val 530 535 540

Tyr Lys Leu Leu His Pro His Tyr Arg Asp Thr Met Asn Ile Asn Ala

545 550 555 560

Arg Ala Arg Gly Leu teu Ile Asn Ala Gly Gly val Ile Glu Met Thr

565 570 575 val Phe Pro His Lys His Ala Met Pro Met Ser Ser Met val Tyr Lys 580 585 590

His Trp Asn Phe Thr Glu Gin Ala teu Pro Ala Asp Leu Ile Lys Arg 595 600 605

Gly wet Ala val Glu Asp Ala ser Ser Pro His Lys val Arg Leu teu €10 615 620 ile Lys asp Tyr Pro Tyr Ala Thr Asp Gly Leu Ala val Trp Asp Ala

625 630 635 640

Ile Glu Gin Trp val Ser Asp Tyr Leu Thr Ile Tyr Tyr pro Asn Asp

645 650 655

Gly val

Leu Gin Gly 660

Asp val Glu

Leu 665

Gin Ala

Trp

Lys 670

Glu

val

Arg

Glu

val

Gly

His

Gly

ASP

Leu

Lys

ASp

Ala

Trp

Pro

Lys

675

680

685

wet

Gin

Thr

val

Ala

Glu

Leu

ile

Lys

Ala

Cys

Ala

Thr

Ile

Trp

690

695

700

Thr

Gly

ser

Ala

Leu

His

Ala

val

Asn

Phe

Gly

Gin

Tyr

Pro

705

710

715

720

Ser

Gly Tyr

His

Pro

Asn

Lys

Pro

Ser

Ala

ser

Arg

Pro

Met

Pro

725

730

735

val

Gin

Gly

Ser

Glu

Tyr

Ala

Glu

Leu

Glu

Arg

ASP

pro

Gl u

Lys

740

745

750

Ala

Phe

Ile

Arg

Thr

Ile

Thr

ser

Gin

Phe

His

Ala

Leu

val

Gly

ile

755

760

765

Ser

Leu

Met

Gl U

Ile

Leu

ser

Lys

His

Ser

ASP

Glu

val

Tyr

teu

770

775

780

Gly

Gin

His

ASP

Thr

pro

Ala

Trp

Thr

Ser

ASP

Ala

Lys

Ala

Leu

Glu

785

790

795

800

Ala

Phe

tys

Arg

Phe 805

Gly

Ala

Lys

Leu

Glu 810

Gly

ile

Glu

Lys

Gin 815

val

Ala

Met

Asn

Ser

Asp

pro

Gin

Leu

Lys

Asn

Arg

Thr

Gly

Pro

Ala

820

825

830

Lys

Phe

Pro

Tyr

Met

Leu

Tyr

pro

Asn

Thr

Ser

Asp

His

Thr

Gly

835 840 845

Gin Ala Glu Gly Leu Thr Ala Arg Gly Ile Pro Asn Ser Ile Ser 850 855 860

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Roślina jęczmienia lub jej część, znamienna tym, że zawiera zmutowane białko LOX-1, przy czym aktywność LOX-1 rośliny lub części rośliny jest zmniejszona lub nie występuje w porównaniu z niezmutowaną kontrolą, i przy czym to zmutowane białko LOX-1 zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID NO: 12, w której Xaa oznacza kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, histydynę, lizynę, argininę, treoninę, serynę, tyrozynę, tryptofan, asparaginę albo glutaminę.
2. Roślina jęczmienia lub jej część według zastrz. 1, znamienna tym, że aktywność LOX-1 obejmuje katalizę utleniania wolnych i zestryfikowanych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych oraz wielonienasyconych oktadekanowych kwasów tłuszczowych do wytworzenia pochodnych 9-hydroperoksy kwasu tłuszczowego.
3. Roślina jęczmienia lub część według zastrz. 1, znamienna tym, że Xaa stanowi kwas glutaminowy albo kwas asparaginowy.
4. Roślina jęczmienia lub część według zastrz. 3, znamienna tym, że Xaa stanowi kwas asparaginowy.
5. Ziarno lub potomstwo rośliny, znamienne tym, że zawiera zmutowane białko LOX-1, przy czym aktywność LOX-1 tej rośliny lub części rośliny jest zmniejszona lub nie występuje w porównaniu z nie-zmutowaną kontrolą, i przy czym zmutowane białko LOX-1 zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID NO: 12, w której Xaa oznacza kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, histydynę, lizynę, argininę, treoninę, serynę, tyrozynę, tryptofan, asparaginę albo glutaminę, i przy czym ziarno lub potomstwo rośliny jest wytworzone z rośliny lub części rośliny jak określono w jednym z zastrz. 1 do 4.
6. Produkt roślinny, znamienny tym, że zawiera zmutowane białko LOX-1, przy czym aktywność LOX-1 tej rośliny lub części rośliny jest zmniejszona lub nie występuje w porównaniu z niezmutowaną kontrolą, i przy czym zmutowane białko LOX-1 zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID NO: 12, w której Xaa oznacza kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, histydynę, lizynę, argininę, treoninę, serynę, tyrozynę, tryptofan, asparaginę albo glutaminę, i przy czym ten produkt roślinny jest wytworzony z rośliny lub części rośliny jak określono w jednym z zastrz. 1 do 4 albo ziarna lub potomstwa rośliny jak określono w zastrz. 5.
7. Produkt roślinny według zastrz. 6, znamienny tym, że stanowi słód.
8. Zastosowanie produktu roślinnego określonego w zastrz. 6 albo 7, do wytwarzania napoju wykazującego właściwości organoleptyczne, które pozostają stabilne podczas mierzonego okresu czasu lub w podwyższonych temperaturach przechowywania w porównaniu do napoju wytworzonego z produktu roślinnego z niezmutowanej kontroli.
9. Zastosowanie rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego jak określono w jednym z zastrz. 1-7, do wytwarzania napoju.
10. Zastosowanie rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego jak określono w jednym z zastrz. 1-7, do wytwarzania słodu lub piwa.
11. Zastosowanie rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego jak określono w jednym z zastrz. 1-7, do stabilizowania właściwości organoleptycznych produktu warzonego podczas mierzonego okresu czasu w porównaniu z kontrolnym produktem warzonym wytworzonym przy użyciu niezmutowanej rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego.
12. Zastosowanie rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego jak określono w jednym z zastrz. 1-7, do wytwarzania produktu warzonego posiadającego obniżone poziomy wolnego trans-2-nonenalu podczas mierzonego okresu czasu lub w warunkach o podwyższonej temperaturze przechowywania w porównaniu z kontrolnym produktem warzonym wytworzonym z użyciem niezmutowanej rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego.