SK65994A3

SK65994A3 - Composition comprising coagulation factor viii formulation, process for its preparation and use of a surfactant as stabilizer

Info

Publication number: SK65994A3
Application number: SK659-94A
Authority: SK
Inventors: Thomas Osterberg; Angelica Fatouros
Original assignee: Kabi Pharmacia Ab
Priority date: 1992-10-02
Filing date: 1993-10-01
Publication date: 1995-03-08
Also published as: SK282483B6; AU677797B2; ES2154650T3; DE69333974D1; US5733873A; CA2124690C; FI111443B; JPH07501560A; WO1994007510A1; GR3035472T3; NZ256921A; FI942573A0; DE69333974T2; EP1652534A2; AU5288393A; US5919766A; EP1652534A3; ATE198277T1; HU9401382D0; PT627924E

Description

Oblast techniky

Tento vynález sa týka novej kompozície obsahujúcej koagulačný faktor VIII a neiónovú povrchovo aktívnu látku, ako sú blokové kopolyméry, napríklad polyoxaméry alebo polyoxyetylén (2.0) sorbitan estery mastných kyselín, napríklad polysorbát 20 alebo polysorbát 80. Kompozícia môže taktiež obsahovat chlorid sodný, chlorid vápenatý, L-histidín a/alebo cukry a/alebo cukrové alkoholy.

Doterajší stav techniky

Hemofília je dedičné ochorenie, ktoré je známe po stáročia, ale iba v posledných troch desaťročiach je možné rozlišovať medzi jej rôznymi formami, a to hemofíliou A, hemofíliou B a hemofíliou C. Hemofília A je najčastejšia forma, ktorá postihuje len mužských jedincov a prejavuje sa u jedného alebo dvoch jedincoch na 10 000 živo narodených chlapcov. Choroba je zapríčinená velmi zníženou hladinou alebo neprítomnosťou biologicky aktívneho koagulačného faktora VIII (antihemofilného faktora), čo je proteín bežne prítomný v plazme. Klinickým prejavom hemofílie A je sklon k silnému krvácaniu a pred zavedením ošetrovania koncentrátmi faktora VIII bol priemerný vek takýchto pacientov nižší ako 20 rokov. Koncentráty faktora VIII získané z plazmy sú dostupné približne tri desaťročia. To významne požadovaným spôsobom zlepšilo situáciu v ošetrovaní pacientov trpiacich hemofíliou a poskytuje pacientom možnosť žiť normálnym životom.

I terapeutické koncentráty faktora VIII sa až doteraz pripravujú frakcionáciou plazmy. Jestvujú však nové spôsoby, ktoré umožňujú produkciu faktora VIII v bunečnej kultúre pri použití, technických postupov na báze rekombinantnej DNA, ako uvádza napríklad J. Gitschier a kol. v Náture 312, 330 - 337 (1984) a Európsky patent č. 160 457.

Koncentráty faktora VIII pochádzajúce z ľudskej plazmy obsahujú rôzne fragmentované úplné aktívne formy faktora VIII (Andersson a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2979 - 2983, (1986)). Najmenej aktívna forma má molekulovú hmotnosť 90 kDa a 80 kDa, ktoré sú spolu spojené mostíkom z kovového iónu. V tejto súvislosti sa odkazuje na Európsky patent č. 197 901. Fima Kabi Pharmacia vyvinula produkt na báze rekombinantného faktora VIII, ktorý zodpovedá forme plazmového faktora VIII s molekulovou hmotnosťou 170 kDa v terapeutických koncentrátoch faktora VIII. Tupá molekula rekombinantného faktora VIII je ukončená r-Vlll SQ a je produkovaná v bunkách vaječníka čínskeho škrečka (CHO) procesom v bunečnej kultúre pri použití prostredia zbaveného séra v konečnej pasáži.

Špecifická aktivita r-VIII SQ môže byť väčšia ako 12 000 medzinárodných jednotiek (IU) na mg proteínu a s výhodou vyššia 4 ako 14 000 medzinárodných jednotiek na mg. Bola nameraná aktivita približne 15 000 medzinárodných jednotiek na mg. Pre r-VIII SQ podľa tohto vynálezu bola už prv známa aktivita okolo 10 000 medzinárodných jednotiek VIII:C na mg proteínu.

Rekombinantný faktor VIII SQ je indikovaný pre ošetrovanie klasickej hemofílie. Dávka je podobná dávke koncentrátov plazmového faktora VIII. V dôsledku teraz dosiahnuteľnej vysokej koncentrácie sú pre injekcie potrebné len malé objemy.

Štruktúru a biochémiu produktov na báze rekombinantného faktora VII vo všeoebcnosti popísal Kaufman v Tibtech 9, (1991) a v Hematology 63., ¹⁵⁵ “ 165 (1991). Štruktúra a biochémia r-VIII je popísaná v patentovej prihláške WO 91/09122.

i

Stabilita proteínov je vo všeobecnosti problémom farmaceutického priemyslu. Táto stabilita sa často rieši sušením proteínu v rôznych sušiacich procesoch, ako je vymrazovanie. Proteín sa potom distribuuje a skladuje vo vymrazenej forme.

Roztok pred vysušením, lyofilizovaný materiál, suchý materiál a rekonštituoaný produkt majú byt vždy tak stabilné, aby sa nestrácalo príliš veľa aktivity počas procesu sušenia, skladovania a počas manipulácie.

Faktor VIII, ktorý sa frakcionuje z plazmy, sa zvyčajne, predáva ako lyofilizovaný prášok, ktorý sa môže rekonštituovať vodou.

Kompozícia s malým množstvom proteínu zvyčajne stráca aktivitu počas procesu čistenia', sterilného spracovania, balenia a počas podávania. Tento problém sa zvyčajne rieši prídavkom ľudského albumínu, ktorý vhodne znižuje stratu aktivity aktívneho proteínu. Funkcie ľudského albumínu ako všeobecného stabilizátora počas čistenia, sterilného spracovania a lyofilizácie uvádza prehľadný článok, ktorý publikoval Wang a kol. v J. of Parenteral Sci. and Tech. 42., doplnok 2S (1988). ľudský albumín je taktiež vhodný pre tvorbu koláča v kompozícii z lyofilizácie. Použitie albumínu pre stabilizáciu faktora VIII je známe a bežne sa používa vo všetkých produktoch obsahujúcich vysoko čistený faktor VIII, ktoré sú komerčne dostupné.

Nie je však žiadúce pridávať ľudský albumín k terapeutickému proteínu, ktorý sa vyrába rekombinantnou DNA technológiou. Okrem tohoto použitia ľudského albumínu ako pomocnej látky v prostriedkoch často obmedzuje možnosť využiť rad najvhodnejších a najcitlivejších analytických metód, používaných pre charakterizáciu proteínu.

Preto sú potrebné prostriedky obsahujúce faktor VIII, ktoré neobsahujú albumín a ktoré sú stále počas sušenia vymrazovaním alebo lyofilizácie a ako roztok po rekonštitúcii.

Bolo navrhnutých niekoľko riešení pre stabilizáciu rôznych proteinov.

Európsky patent č. 35 204 (Cutter) uvádza spôsob pre dosiahnutie tepelnej stability proteínovej kompozície v prítomnosti polyolu.

Európsky patent č. 381 345 (Corint) popisuje vodnú kvapalinu I obsahujúcu peptid desmopresín v prítomnosti karboxymetylcelulózy.

Vo WO 89/09614 (Genentech) je uvedený stabilizovaný prostriedok ľudského rastového hormónu, ktorý obsahuje glycín, manitol a tlmivý roztok a pri výhodnom uskutočnení sa pridáva neiónová povrchovo aktívna látka na zníženie agregácie a denaturácie. Prostriedok má zvýšenú stabilitu v lyofilizovanom prostriedku a po rekonštitúcii.

Európsky patent č. 268 110 (Cetus) popisuje roztok obsahujúci proteín interleukín-2 vo forme častíc, ktorý je rozpustený v inertnom nosnom prostredí obsahujúcom neiónovú polymérnu povrchovo aktívnu látku ako solubizér a stabilizátor. Výhodnými povrchovo aktívnymi látkami sú oktylfenoxypolyetoxyetanolové deriváty, deriváty monostearátu, polyetylénglykolu a polyetylén sorbitan estery mastných kyselín.

US patent č. 4 783 441 (Hoechst) uvádza vodný roztok, ktorý obsahuje proteín, ako je inzulín, a povrchovo aktívnu látku.

US patent č. 4 165 370 (Coval) sa zmieňuje o roztoku gamaglobulínu a spôsobe jeho výroby. Tento roztok obsahuje polyetylénglykol (PEG). K roztoku sa môže taktiež pridat neiónová povrchovo akttívna látka.

V Európskom patente č. 77 870 (Green Cross) je popísané pridávanie aminokyselín, monosacharidov, oligosacharidov, cukrových alkoholov alebo karboxylových kyselín odvodených od’ uhľovodíkov na zlepšenie stability roztoku obsahujúceho faktor VIII. Pridávanie cukrového alkoholu alebo disacharidov k vodnému roztoku faktora VIII na zvýšenie stability je uvedené v Európskom patente č. 117 064 (Green Cross).

WO 91/10439 (Octopharma) chráni stabilný injekčný roztok faktora VIII alebo faktora IX, ktorý obsahuje disacharid, s výhodou sacharózu, a najmenej jednu aminokyselinu.

Európske patenty č. 315 968 a 314 095 (Rorer) chránia stabilné prostriedky z faktora VIII, ktoré majú rôznu iónovú silu.

Proteíny sa líšia s ohľadom na svoje fyzikálne a chemické vlastnosti. Pokiaľ sa pripravuje farmaceutický prostriedok, ktorý má byť prijateľný z fyzikálno chemického hľadiska a stabilný počas dlhého obdobia, nemôže sa venovať pozornosť iba fyziologickým vlastnostiam proteínu, ale musia sa vziať do úvahy taktiež iné hľadiská, ako je priemyselná výroba, jednoduchá manipulácia pre pacienta a taktiež bezpečnosť pre pacienta. Výsledky týchto aspektov sa pri testovaní rôznych prostriedkov nedajú vopred predvídať a často je potrebný špeciálny roztok pre každý protein.

V plazme cirkulujúci faktor VIII je stabilizovaný v spojitosti so svojím nosným proteínom, von Willebrandovým faktorom (vWF). V plazme a taktiež v koncentrátoch faktora Vili zvyčajnej intermediálnej čistoty je hmotnostný pomer vWF k faktoru VIII najmenej 50 : 1. V koncentrátoch s veľmi vysokou čistotou faktora VIII, so špecifickou aktivitou väčšou ako 2000 medzinárodných jednotiek na mg proteínu, je hmotnostný pomer vWF k faktoru VIII približne 1 : 1 a v podstate celý faktor VIII je viazaný k vWF.

Napriek tejto stabilizácii sa vyžaduje d'alšja ochrana pridaním albumínu, aby sa dosiahla primeraná stabilita počas lyofilizácie a skladovania.

Všetky superčisté prostriedky na trhu sú stabilizované albumínom (ľudským sérovým albumínom).

Vzniká nová požiadavka získať faktor VIII pre injekcie bez albumínu, ktorý obsahuje minimálne množstvo prísad.

Podstata vynálezu

I

Teraz bol vyvinutý nový prostriedok, ktorý rieši vyššie uvedené problémy faktora VIII.

t i

S./·'...* . i

Na veíké prekvapenie pôvodcov tohto vynálezu sa podarilo zistiť, že faktor VIII, čo je velmi senzitívny proteín, sa môže stabilizovať bez albumínu, ak sa ku nemu pridá neiónová povrchovo aktívna látka.

Tento vynález sa teda týka kompozície, ktorá obsahuje koagulačný faktor VIII a neiónovú povrchovo aktívnu látku ako stabilizátor. Faktor VIII, používaný podlá tohto vynálezu, je vysoko čistený, to znamená, že má špecifickú aktivitu väčšiu ako 5 000 medzinárodných jednotiek na mg proteínu a prostriedok je stabilizovaný bez prídavku albumínu.

Pokial je faktor VIII rekombinantného pôvodu, môže byť alebo vo forme vo svojej plnej dĺžky alebo ako derivát upravený deléciou, ako je napríklad SQ derivát.

r

Množstvo faktora VIII je od 10 do 100 000 medzinárodných jednotiek na ml, s výhodou od 50 do 10 000 medzinárodných jednotiek na ml.

Neiónová povrchovo aktívna látka sa s výhodou zvolí spomedzi blokových kopolymérov, ako je poloxamér alebo polyoxyetylén (20) ester mastných kyselín, ako je polysorbát 20 alebo polysorbát 80. Ako polysorbát 80 sa používa Tween 80**. Neiónová povrchovo aktívna látka má byť prítomná v množstve nad kritickou koncentráciou micell (CMC), pozri Wan a Lee, Journal of Pharm. Sci., 63, 136 (1974).

Polyoxyetylén (20) ester mastných kyselín je s výhodou prítomný v množstve najmenej 0,01 mg/ml a jeho množstvo by malo byť napríklad od 0,02 do 1 mg/ml. Kompozícia môže taktiež obsahovať chlorid draselný, s výhodou v množstve väčšom ako 0,1 mol.

Kompozícia s výhodou obsahuje vápenatú sol, ako je chlorid vápenatý alebo glukonát vápenatý, s výhodou v množstve väčšom ako 0,5 mmol a aminokyselinu, ako je L-histidín v množstve väčšom ako 1 mmol, pričom toto množstvo by sa malo voliť od 0,05 do

500 mmol. Monosacharidy alebo disacharidy, ako je sacharóza alebo cukrové alkoholy, by sa mali pridávať v množstve od 1 do

300 mg/ml.

Kompozícia obsahuje s výhodou L-histidin a sacharózu. V kompozícii je pomer chloridu sodného k L-histidínu s výhodou väčší ako 1:1.

Kompozícia môže obsahovať t

i) 10 až 100 000 medzinárodných jednotiek na ml rekombinantného faktora VIII, ii) najmenej 0,01 mg/ml polyoxyetylén (20) esteru mastnej kyseliny, iii) chlorid sodný, s výhodou v množstve väčšom ako 0,1 mol, iv) vápenatú soľ, ako je chlorid vápenatý alebo glukonát vápenatý, s výhodou v množstve väčšom ako 0,5 mmol a

v) aminokyselinu, ako je L-histidín, v množstve väčšom ako 1 mmol.

K tejto kompozícii sa môžu pridať monosacharidy, disacharidy alebo cukrové alkoholy, s výhodou sacharóza.

Kompozícia môže byť v suchej forme, s výhodou lyofilizovaná, alebo vo vodnom roztoku pred alebo po sušení. Suchý produkt sa rekonštituuje sterilnou vodou pre injekcie alebo roztokom pufru.

Kompozícia chránená v nárokoch môže byť taktiež stabilným roztokom pripraveným pre použitie.

Vynález sa taktiež týka kompozícií, v ktorých špecifická aktivita r-VIII SQ je väčšia ako 12 000 medzinárodných jednotiek na mg proteínu, s výhodou väčšia ako 14 000 medzinárodných jednotiek.

Kompozícia chránená v nárokoch sa môže pripraviť zmiešaním faktora VIII s neiónovou povrchovo aktívnou látkou vo vodnom roztoku, s výhodou spolu s aminokyselinou, ako je L-histidín, soli sodíka, sacharózou a vápenatou soľou alebo eluovaním faktora VIII z posledného čistiaceho stupňa tlmivým roztokom obsahujúcim neiónovú povrchovo aktívnu látku vo vodnom roztoku, s výhodou spolu s aminokyselinou, ako je L-histidín, sodnou sol’ou, sacharózou a vápenatou soľou.

Tento vynález sa taktiež týka použitia neiónovej povrchovo aktívnej látky, s výhodou zvolenej spomedzi blokových kopolymérov, s výhodou polyoxaméru alebo polyetoxylén (20) esteru mastnej kyseliny, s výhodou polysorbátu 20 alebo polysorbátu 80, ako stabilizátora pre kompozíciu obsahujúcu koagulačný faktor VIII.

Aminokyselina sa používa na pufrovanie systému a taktiež chráni proteín v amorfnej fáze. Vhodným tlmivým roztokom môže byť L-histidín, lyzín alebo arginín. L-Histidín sa volí prednostne, pretože dobrá pufrovacia kapacita L-histidínu je okolo pH 7.

Sacharóza alebo cukrový alkohol sa môžu taktiež pridať na ochranu proteínu.

Vápnik (alebo dvojmocné ióny tohto kovu) sa môže pridávať vo forme chloridu vápenatého (CaCl₂), ale môžu sa použiť i iné soli, ako glukonát vápenatý, glubionát vápenatý alebo gluceptát vápenatý, pokiaľ je toto nutné pre udržanie spojenia faktora VIII s ťažkým a ľahkým reťazcom.

Hodnoty obsiahnuté v príkladoch ukazujú, že r-VIII SQ je

I stabilný počas najmenej 12 mesiacov, pokiaľ sa skladuje pri teplote 5 ± 3 °C.

Ďalej uvedené príklady ilustrujú vynález a uvádzajú hodnoty stabilty pre rôzne prostriedky, ktoré vo všetkých prípadoch spadajú do rozsahu patentovej ochrany. Pritom rozsah ochrany nie je obmedzený na tieto príklady.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Ďalej uvedené obrázky sú ilustráciou vynálezu:

Obr. 1 zobrazuje výsledok gélovej filtračnej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC - gelfiltration) zlúčeniny z príkladu 10A, ktorá sa skladovala počas 5 mesiacov pri teplote 25 ’C.

Obr. 2 zobrazuje výsledok gélovej filtračnej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie z príkladu 10B, ktorá sa skladovala počas 5 mesiacov pri teplote 30 ’C.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Experimcntátne údaje

Materiál a metódy

Príprava rekombinantného faktora VIII SQ (r-VIII SQ) sa v podstate uskutočňuje ako je popísané v patente WO 91/09122, v príkladoch 1 až 3. DHFR deficientná CHO bunečná línia (celline) (DG44N.Y.) sa elektroporuje s expresným vektorom obsahujúcim r-VIII SQ gén a expresným vektorom obsahujúcim gén dihydrofolát-reduktázy. Nasledujúce selekcie na kolónie prežívajúce v selektívnom prostredí sa zosilnia rastom v postupne zvyšovanom množstve metotrexátu. Supernatant z výsledných kolónií sa individuálne triedi s ohladom na aktivitu VIII:C. Vyberie sa produkčný kloň, ktorý sa postupne adaptuje na rastovú suspenziu zbavenú séra v definovanom prostredí a napokon sa vyvinie fermentačný procés vo velkom merítku. Po určitých časových obdobiach sa zachytí supernatant a následne sa čistí, ako je popísané ďalej.

Čistené upravené prostredie sa nastaví na hodnotu pH a aplikuje sa na kolónu naplnenú S-Sepharose FF. Po premytí sa eluuje faktor VIII pufrovacej soli, ktorá obsahuje 5 mmol chloridu vápenatého.

Imunoadsorpcia sa uskutočňuje na imunoafinitnej živici, kde ligandom je monoklonálna protilátka (8A4) zameraná na faktor VIII s ťažkým reťazcom. Pred naplnením kolóny sa S-eluát spracuje s 0,3 % TNBP a 1 % Octoxynolu 9.

Kolóna sa ekvilibruje, premyje a faktor VIII sa eluuje tlmivým roztokom, ktorý obsahuje 0,05 mol chloridu vápenatého a 50 % etylénglykolu.

mAb-eluát sa vnesie na kolónu naplnenú Q-Sepharose FF a ekvilibruje sa elučným tlmivým roztokom v imunoafinitnom stupni. Po premytí sa faktor VIII eluuje 0,05-molárnym L-histidínom,

4-milimolárnym chloridom vápenatým a 0,6-molárnym chloridom sodným pri hodnote pH 6,8.

Q-eluát sa aplikuje na gólovú filtračnú kolónu (Superdex 200 p.g.). Ekvilibrácia a eluovanie sa uskutočňuje s formuláciou, ktorá obsahuje chlorid sodný, L-histidín, chlorid vápenatý a polysorbát 80.

Vrcholné množstvo proteínu sa zachytí a roztok sa formuluje pred lyofilizáciou.

Aktivita VIII:C a koncentrácia neaktívnych zložiek sa upraví zriedením vhodným tlmivým roztokom. Roztok sa potom sterilné filtruje (0,22 μιη), rozdelí a lyofilizuje. Vzorky z každej kompozície sa vymrazia a skladujú pri teplote -70 ’C. Tieto vzorky sa nechajú rozmraziť a použijú ako referenčné počas skúšky VIII:C.

Koagulačná aktivita VIII:C sa stanovuje chromogénnou substrátovou skúškou (Coatest Factor VIII, Chromogenix AB, Molndal, Švédsko). Aktivovaný faktor X (Xa) sa tvorí cestou s vnútornou dráhou, kde faktor VIII:C pôsobí ako kofaktor. Faktor Xa sa potom stanoví za použitia syntetického chromogénneho substrátu S-2222 v prítomnosti inhibítora trombínu 1-2581, aby sa zabránilo hydrolýze substrátu trombínom. Reakcia sa zastaví prídavkom kyseliny a VIII:, ktorý je v proporcionálnom množstve k uvoľnenému p-nitroanilínu (pNA), sa stanoví fotometrický pri vlnovej dĺžke 450 nm proti slepému pokusu s reakčnými činidlami. Jednotka faktora VIII:C sa vyjadruje v medzinárodných jednotkách (IU), ako sú definované súčasným medzinárodným koncentrátovým štandardom (IS) založeným Medzinárodnou zdravotníckou organizáciou (WHO).

Výťažok (znovuzískanie) VIII:C je vypočítaný ako percento VIII:C v rekonštituovanom roztoku delené VIII:C vo vymrazenom stave a rozmrazenom roztoku z lyofilizovaného produktu, s príslušnou úpravou riedením.

Rozpustné agregáty sa stanovujú gélovou filtráciou. Kolóna naplnená Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia) sa použije s fluorescenčným detektorom (excitácia pri vlnovej dĺžke 280 nm, emisná vlnová dĺžka 340 nm). Rekonštituovaný prostriedok sa analyzuje. Zhodnotenie výsledkov po gélovej filtrácii sa uskutočňuje vizuálnym hodnotením chromátogramov alebo integráciou plôch píkov, pokial sa zistia agregáty.

Výťažok po lyofilizácii sa vyjadruje v percentách z hodnoty vo vymrazenom stave.

Príklad 1

Porovnanie medzi albumínom a neiónovu povrchovo aktívnou látkou

Rekombinantný faktor VIII sa pripraví spôsobom popísaným pod experimentálnymi údajmi.

i ml roztoku sa lyofilizujú a potom sa rekonštituujú v objeme 5 ml sterilnej vody pre injekcie.

Pracuje sa s týmito kompozíciami:

	1A	1B	1C	ID
L-Ilistidín, mmol	50	50	50	50
Chlorid sodný, mol	0,6	0,6	0,6	0,6
Chlorid vápenatý, mmol	4	4	4	4
Polysorbát 80, %	-	-	0,02	-
Polyetylénglykol-4000, %	0,1	0,1	-	-
Albumín, %	-	1	-	1
VIII:C, dávka medziná-
rodných jednotiek na ml	250	250	250	250
Výťažok, medzinárodných
jednotiek na ml
po rekonštitúcii	83	197	23 2	222
Tento príklad ukazuje,	že nie sú	rozdiely vo	výťažku	(znovu-

získaní) faktora VIII:C, pokiaľ sa použije neiónová povrchovo aktívna látka alebo albumín.

Príklad 2

Porovnanie medzi neiónovými povrchovo aktívnymi látkami s rozličnou silou

ml roztoku sa lyofilizujú a potom sa rekonštituujú v objeme sterilnej vody pre injekcie.

Pracuje sa s týmito kompozíciami:

	2A	2B	2C
L-Histidín, L-glutamát
ekvimolárne množstvo mg/1	10	10	10
Chlorid sodný, %	2	2	2

Chlorid vápenatý, mg/1	0,1	0,1	0,1
Polysorbát 80, %	-	0,001	0,01
VIII:C, dávka medziná-	300	300	300
rodných jendotiek na ml
po rekonštitúcii
Počiatočné	69	133	228
3,5 hodiny*	43	140	222
7 hodín*	49	133	204

• * skladované ako rekonštituovaný roztok pri laboratórnej teplote » Tu sa jasne ukazuje prekvapivo dobrý stabilizačný účinok na faktor VIII, ak sa použije neiónová povrchovo aktívna látka.

Príklad 3

Zmeny koncentrácie neiónovej povrchovo aktívnej látky

Rekombinantný faktor VII sa pripraví spôsobom popísaným pod experimentálnymi údajmi.

2 ml roztoku sa lyofilizujú a	potom sa	rekonš	tituujú v	obje-
me 5 ml sterilnej vody pre	injekcie	•
	3A	3B	3C	3D	3E
L-Histidín, mmol	50	50	50	50	50
Chlorid sodný, mol	0,34	0,34	0,34	0,34	0,34
Chlorid vápenatý, mmol	4	4	4	4	4
Polysorbát 80, %	0,01	0,02	0,03	0,04	0,05
Výťažok po
rekonštitúcii, % ¹	91	90	93	99	100

Výsledky tohoto pokusu ukazujú, že výťažok faktora VIII (VIII:C) je veľmi vysoký po rekonštitúcii a dobrý pre všetky t

koncentrácie použitého polysorbátu 80.

Príklad 4

Zmeny koncentrácie chloridu sodného

ml roztoku sa lyofilizujú, skladujú pri rozdielnych teplotách počas obdobia do 6 mesiacov a potom rekonštituujú v objeme 5 ml sterilnej vody pre injekcie.

	4A	4B
L-Histidín, mmol	50	50
Chlorid sodný, mol	0,3	0,6
Chlorid vápenatý, mmol	4	4
Polyetylénglykol-4000, %	0,1	0,1
Polysorbát 80, %	0,025	0,025
Výťažok, % počiatočný	85	86
Skladované pri 8 ’C
3 mesiace	88	87
4 mesiace	87	83
6 mesiacov	87	83
skladované pri 25 ’C
1 mesiac	92	93
3 mesiace	87	79
4 mesiace	84	81
6 mesiacov	85	85
skladované pri 37 ’C
1 mesiac	88	90
3 mesiace	80	80
4 mesiace	80	77
6 mesiacov	81	80
skladované pri 50 ’C
1 mesiac	84	89
3 mesiace	77	77
4 mesiace	73	70

0,3 alebo 0,6 mol chloridu sodného sa prejavuje velmi dobrou stabilitou. Obidva prostriedky sú stabilné počas 6 mesiacov pri teplote 37 C.

i

Príklad 5 ¹

Zmeny koncentrácie L-histidínu

2,2 ml roztoku sa lyofilizuje, skladuje pri rozdielnych teplotách počas obdobia až 3 mesiacov a potom sa rekonštituuje v objeme 5 ml sterilnej vody pre injekcie.

			5A	5 B
	L-Histidín, mmol		46	59
	Chlorid sodný, mol	0,31	0,31
	Chlorid vápenatý,	mmol	3,7	3,7
	Polyetylénglykol-	4000, %	0,091	0,091
•	Polysorbát 80, % Výťažok, %		0,364	0,364
•	skladované pri 8	’C
	začiatok		78	84
	3 mesiace		70	76
	skladované pri 25	’C
	1 mesiac
	3 mesiace		69	74
	skladované pri 37	’C
	1 mesiac		76	85
	3 mesiace		61	48
	skladované pri 50	’C
•	1 mesiac		60	73
	3 mesiace		44	48
4	Tento príklad ukazuje,	že použitie	rozdielnych množstiev

L-histidínu nemá vplyv na stabilitu.

Príklad 6

	6A	6B
L-Histidín, mmol	65	65
Chlorid sodný, mol	0,3	0,3
Chlorid vápenatý, mmol	4	4
Polyetylénglykol-4000, %	0	0,1
Tween 80, %	0,025	0,025

Tieto roztoky sa lyofilizujú a rozmrazia jedenkrát, päťkrát a desaťkrát a získajú sa takéto výťažky:

6A613

IU/mlIU/ml studený 298291 zmrazenie 293293 zmrazení 295287 zmrazení 290288 %

Tieto štúdie ukazujú, že VIII:C je stabilný po opakovaní cyklov lyofilizácie a rozmrazovania a ďalej že polyotylénglykol-4000, o ktorom sa predpokladá, že pôsobí ako kryoprotektívne činidlo, nie je v tomto prostriedku nevyhnutný.

Príklad 7

Zmeny hodnoty pH

2,2 ml roztoku sa lyofilizujú a potom rekonštituujú v objeme 5 ml sterilnej vody pre injekcie.

	7A	7B	7C	7 D
L-Histidín, mmol	65	65	65	65
Clorid sodný, mol	0,3	0,3	0,3	0,3
Chlorid vápenatý, mmol	4	4	4	4
Polysorbát 80, %	0,025	0,025	0,025	0,025
Hodnota pH	6,0	6,5	7,0	7,5
Výťažok, % začiatok	74	70	78	79
3 hodiny*	73	80	78	77
* skladované ako rekonštituovaný	roztok	pri laboratórnej	teplote

Tento príklad ukazuje, že hodnota pH nemá signifikantný význam približne od hodnoty 6,0 do 7,5.

Príklad 8

Prídavok sacharózy

2,2 ml roztoku sa lyofilizujú a potom rekonstiuujú v objeme 5 ml sterilnej vody pre injekcie.

	8A	8B
L-IIistidín, mmol	58	20,5
Chlorid sodný, mol	0,3	0,3
Chlorid vápenatý, mmol	3,7	3,7
Sacharóza, mmol	0	13,3
Polysorbát 80, %	0,025	0,025

Sacharóza sa pridáva k roztoku B po konečnom čistiacom stupni pred lyofilizáciou.

Výťažok po lyofilizácii činí 76 % pre A a 87 % pre B. Rovnaká aktivita sa stanoví 4 hodiny po rekonštitúcii, počas skladovania pri laboratórnej teplote.

Táto štúdia ukazuje, že prídavok sacharózy je priaznivý pre výťažok VIII:C po lyofilizácii.

f

Príklad 9

Zmeny vápenatej soli i

Rekombinnatný faktor VIII sa pripraví spôsobom popísaným pod experimentálnymi údajmi.

ml roztoku sa lyofilizujú a potom rekonštituujú v objeme ml sterilnej vody pre injekcie.

	9A	9B	9C	9D
L-Histidín, mmol	23	23	23	23
Chlorid sodný, mol	0,34	0,34	0,34	0,34
Chlorid vápenatý, mmol	4	4	0,15	0,15
Polysorbát 80, %	0,025	0,025	0,025	0,025
Sacharóza, mmol	-	10	-	10
Glukonát vápenatý, mmol	0	0	6	6
Výťažok, % počiatočný	63	74	74	78
4 hodiny*	60	73	73	77

* skladované ako rekonštituovaný roztok pri laboratórnej teplote

Tento pokus ukazuje, že chlorid vápenatý sa môže nahradiť glukonátom vápenatým.

t

Príklad 10

2,2 ml roztoku sa lyofilizujú a potom rekonštituujú v objeme

5 ml sterilnej vody pre injekcie. Obsah VIII:C na liekovku v rekonštituovanom prostriedku zodpovedá približne 1000 medzinárodným jednotkám.
		10A	10B
L-Histidín, mmol		14,7	58
Chlorid sodný, mol		0,31	0,31
Chlorid vápenatý, mmol		3,7	3,7
Sacharóza, mmol		19,9	-
Polysorbát 80, %		0,025	0,025
Výťažok,, medzinárodných	jednotiek
J na ml po rekonštitúcii
Počiatočný		213	198
4 hodiny, 25 ’C		213	198
24 hodín, 25 -C		201	182
Výťažok, %
Počiatočný		92	91
5 mesiacov, pri 25 ’C		88	-

mesiacov, pri 30 C * 76 mesiacov, pri 7 ’C 89 97

Výťažok je dobrý, pokial sa časť L-histidínu nahradí sacharózou.

Tieto prostriedky sa skúmajú za použitia gélovej filtrácie po skladovaní počas 5 mesiacov pri teplote 25 °C a 30 ’C a výsledky sú uvedené na obr. la 2. Ako je znázornené, dá sa pozorovať iba pík pri hodnote 42, ktorý poukazuje na faktor VIII:C a pík pri hodnote 70, ktorý zodpovedá histidínu. Agregáty sa majú nachádzať skôr ako je hodnota 40. Z obr. 1 môže byť zrejmé, že žiadne detegovatelné množstvo agregátov sa nezistí po skladovaní počas 5 mesiacov pri teplote 25 ’C pre látku z príkladu 10A. Obr. 2 ukazuje na malé množstvá agregátov, ktoré je menšie ako 2 %, po skladovaní počas 5 mesiacov pri teplote 30 ’C pre látku z príkladu 10B.

Príklad 11

2,2 ml roztoku sa lyofilizujú a potom rekonštituujú v objeme 5 ml sterilnej vody pre injekcie. Obsah VIII:C na liekovku v rekonštituovanom prostriedku je približne 500 medzinárodných jednotiek.

	11A	11B
L-Histidin, mmol	14,7	58
Chlorid sodný, mol	0,31	0,31
Chlorid vápenatý, mmol	3,7	3,7
Sacharóza, mmol	19,9	-
Polysorbát 80, %	0,025	0,025
Výťažok, medzinárodných jednotiek
na ml po rekonštitúcii
Počiatočný	98	105
4 hodiny, pri 25 ’C	96	103

24 hodín, pri 25 'C	93	101
Výťažok, %
Počiatočný	91	93
skladované pri 25 C, 5 mesiacov	89	87
skladované pri 30 C, 5 mesiacov	76	79
skladované pri 7 ’C, 12 mesiacov	88	89

Obidva prostriedky vykazujú dobrú stabilitu. Tieto prostriedky sa študujú pomocou gólovej filtrácie a výsledky sú podobné ako je uvedené na obr. 1 a 2.

Nedochádza k žiadnej agregácii, pokial sa prostriedky skladujú počas 5 mesiacov pri teplote 25 °C a 30 ’C.

Príklad 12

ml roztoku sa lyofilizujú, skladujú pri rozdielnych teplotách až počas obdobia 3 mesiacov a potom sa rekonštituujú v objeme 4 ml sterilnej vody pre injekcie. Obsah VIII:C na liekovku v rekonštituovanom prostriedku je približne 500 medzinárodných jednotiek.

	12Λ	12B
Manitol, mg/ml	20	20
L-Ilistidín, mg/ml	2,67	2,67
Chlorid sodný, mg/ml	18	18
Chlorid vápenatý, mmol	3,7	3,7
Polysorbát 80, %	0,23	0,23
Výťažok, %	1
Počiatočný	91	93
skladované pri 7 ’C, 5 mesiacov	90	85

Prijatelná stabilita sa dosiahne po skladovaní počas 5 mesiacov pri teplote 7 °C.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kompozícia vyznačujúca sa tým, že obsahuje koagulačný faktor VIII a neiónovú povrchovo aktívnu látku ako stabilizátor.
2. Kompozícia podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že v nej obsiahnutý faktor VIII je vysoko čistený a stabilný bez prídavku albumínu.
3. Kompozícia podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že v nej obsiahnutý faktor VIII je plnej dĺžky alebo derivát rekombinantného faktora VIII upravený deléciou.
4. Kompozícia podľa niektorého z nárokov laž 3, vyznačujú c a sa tým, že množstvo faktora VIII je od 10 do 100 000 medzinárodných jednotiek na ml, s výhodou od 50 do 10 000 medzinárodných jednotiek na ml.
5. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 1 až 4, vyznačujúca sa tým, že neiónová povrchovo aktívna látka je prítomná v množstve nad kritickou koncentráciou micel.
6. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 1 až 5, vyznačujúca sa tým, že neiónová povrchovo aktívna látka je zvolená z blokových kopolymérov, s výhodou z po^xaméru alebo polyetylén (20) esteru mastných kyselín, s výhodou sa jedná o polysorbát 20 alebo polysorbát 80.
7. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 1 až 6, vyznačujúca sa tým, že polyoxyetylén (20) ester mastných kyselín je prítomný v množstve najmenej 0,01 mg/ml.
8. Kompozícia podľa niektorého z nárokov laž 7, vyznačujúca sa tým, že obsahuje chlorid sodný alebo chlorid draselný, s výhodou v množstve väčšom ako 0,1 mol.
9. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 1 až 8, vyznačujúca sa tým, že obsahuje vápenatú soľ, ako je chlorid vápenatý alebo glukonát vápenatý, s výhodou v množstve väčšom ako 0,5 mmol.
10. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 1 až 9, vyznačujúca sa tým, že obsahuje aminokyselinu, ako je L-histidín, v množstve väčšom ako 1 mmol.

•
11. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 1 až 10, v y z n a č u- <· júcasatým, že obsahuje monosacharidy alebo disacha- * ridy, s výhodou sacharózu alebo cukrové alkoholy.
12. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 10 a 11, vyznačujúca sa tým, že obsahuje L-histidín a sacharózu.
13. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 8a 10, vyznačujúca sa tým, že pomer chloridu sodného k L-histidínu je väčší ako 1:1.
14. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 1 až 13, v y z n a č u- _Λ júcasatým, že obsahuje _r i) 10 až 100 000 medzinárodných jednotiek na ml rekombinantného faktora VIII, ii) najmenej 0,01 mg/ml polyoxyetylén (20) esteru mastnej kyseliny, iii) chlorid sodný, s výhodou v množstve väčšom ako 0,1 mol, i

iv) vápenatú soľ, ako je chlorid vápenatý alebo glukonát vápenatý, s výhodou v množstve väčšom ako 0,5 mmol a

v) aminokyselinu, ako je L-histidín, v množstve väčšom ako 1 mmol.
15. Kompozícia podlá niektorého z nárokov 1 až 14, v y z n a č ujúca sa tým, že je suchá.
16. Kompozícia pódia nároku 15, vyznačujúca sa tým, že je lyofilizovaná.
17. Kompozícia pódia niektorého z nárokov 1 až 14, vyznačujúca sa tým, že je v stabilnom vodnom roztoku pripravenom pre použitie.

* ⁴
18. Kompozícia podlá niektorého z nárokov 3 až 17, v y z n a č u- júcasatým, že špecifická aktivita r-VIII· SQ jc väčšia ako 12 000 medzinárodných jednotiek (IU) na mg proteínu, s výhodou väčšia ako 14 000 medzinárodných jednotiek na mg.
19. Spôsob výroby kompozície pódia nároku 1,vyznačuj úc i sa t ý m, že sa zmieša faktor VIII s neiónovou povrchovo aktívnou látkou vo vodnom roztoku, s výhodou spoločne s aminokyselinou, ako L-histidínom, soiou sodíka, sacharózou a vápenatou soiou.

,
20. Spôsob výroby kompozície podlá nároku 1, vyznačuj ú• c i s a t ý m, že sa eluuje faktor VIII z posledného čistiaceho stupňa tlmivý roztokom obsahujúcim neiónovú povrchovo aktívnu látku vo vodnom roztoku, s výhodou spoločne s aminokyselinou, ako je L-histidín, soíou sodíka, sacharózou a vápenatou soiou.
21. Použitie neiónovej povrchovo aktívnej látky zvolenej z blokových kopolymérov, s výhododu polyoxaméru alebo polyoxyetylén (20) esteru mastnej kyseliny, s výhodou polysorbátu 20 alebo polysorbátu 80, ako stabilizátora pre kompozíciu obsahujúcu koagulačný faktor VIII.