SK6252002A3

SK6252002A3 - Treatment of viral infections using levovirintm

Info

Publication number: SK6252002A3
Application number: SK625-2002A
Authority: SK
Inventors: Robert Tam
Original assignee: Icn Pharmaceuticals
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2003-02-04
Also published as: NO20022816D0; HUP0400500A2; EP1246832A1; US20030092644A1; ZA200202739B; CA2384110A1; PL356640A1; CN1409721A; HRP20020486A2; BR0016163A; KR20030016213A; CZ2002968A3; NO20022816L; YU47702A; WO2001046212A1; HK1050011A1; SI21042A; JP2003518134A; US6518253B1; IL148510A0

Description

Oblasť techniky i

Oblasťou techniky je použitie modulátoru imunitnej odpovede na liečbu vírusových infekcií.

Doterajší stav techniky

Vela vírusových infekcií je spojených s posunom v cytokinovom profile smerom k Th2 bunkovej odpovedi a nedávne výskumy naznačujú, že ovplyvnenie rovnováhy medzi Thl a Th2 odpoveďou vy mohlo byť výhodné z hľadiska privodenia a/alebo udržania imunity proti vírusovej infekcii. Zvýšená Thl odpoveď sa zdá byť predovšetkým významná u infekcie HIV, kde dlho prežívajúci pacienti vykazujú dominujúcu Thl odpoveď, zatiaľ čo v prípade progresie ochorenia dominuje Th2 odpoveď. Napríklad, Barker a kol. predpokladá, že progresia ochorenia v prípade HIV vyplýva z posunu produkcie cytokinov u infikovaného hostiteľa od Thl smerom k obrazu Th2 (Barker E, Mackewicz CE, Levy JA Proc Natl Acad Sci USA 1995 Nov 21; 92(24): 11135-9). Podobne sa zdá, že zníženie Th2 odpovede má terapeutický význam, vzhľadom na to Reiser a kol. opisuje, že Th2 cytokinové hodnoty sú zvýšené u chronickej vírusovej hepatitídy C (Reiser, M a kol.; J Hepatol 1997 Mar; 26(3): 471-8). Sú známe rôzne spôsoby ovplyvňovania Thl/Th2 rovnováhy a môžu byť približne členené na spôsoby spojené s použitím cytokinov a na spôsoby, ktoré sa s' použitím cytokinov nespájajú.

V prípade spôsobov liečby spojených s použitím cytokinov, sú cytokiny podané s cieľom ovplyvniť rovnováhu smerom k Thl alebo naopak k Th2 typu odpovede. Napríklad, Knight a kol. stanovil, že liečba s použitím IL-12 (interleukín-12), cytokinu podporujúceho vývoj Thl buniek, sa môže využiť ako liečba u AIDS, na základe toho, že podanie IL-12 sa ukázalo ako účinné v obnove bunkami sprostredkovanej imunity u myší infikovaných myšou formou vírusu AIDS alebo Rauscherovým leukemickým vírusom (RVL) (Knight, S. C. and Patterson, S.,

- 2. Annu. Rev. Immunol. 1994, 15: 593 - 615) . V inom príklade,

Grácie, J. A. a kol. opisuje, že podanie IL-18 myši vykazuje rôzne účinky kritické

-ó pre vývoj Thl odpovede (Grácie a kol. J. Clin. Invest 1999 Nov 15; 104(10): 1393 - 1401). Aj keď podanie cytokinov typicky vedie k relatívne špecifickému zvýšeniu požadovaných Thl cytokinov, dlhodobé podávanie cytokinov môže byť z mnohých dôvodov problematické. Napríklad výroba rekombinantných cytokinov je pomerne drahá a izolácia nonrekombinantných cytokinov z prirodzeného zdroja je vo všeobecnosti obtiažna, vzhľadom k velmi nízkej koncentrácii cytokinov v prirodzenom zdroji. Ďalším problémom je požiadavka na vysoký stupeň čistoty cytokinových prípravkov s cieľom zabrániť alergickej reakcii po opakovanom podaní. Navyše, v závislosti na pôvode cytokinu, nemusí pacient cytokiny dobre tolerovať.

U spôsobu liečby, ktorý nie je spojený s použitím cytokinov, sa na ovplyvňovanie rovnováhy medzi Thl a Th2 odpoveďami používajú iné imunomodulačné látky ako , cytokiny. Napríklad, Sprietsma J. E. predpokladá (Sprietsma J. E.; Med. Hypotheses 1999 Jul; 53(1): 6 - 16), že zinkové ióny (Zn⁺⁺) a oxid dusnatý (NO), spolu s glutatiónom (GSH) a jeho oxidovanou formou, GSSG, môžu pomôcť regulovať imunitnú odpoveď na antigén. Autor vo väčších detailoch opisuje, že deplécia Zn⁺⁺, NO a/alebo GSH posúva Thl/Th2 rovnováhu smerom k Th2 a že doplnenie Zn⁺⁺, NO a/alebo GSH môže posunúť Thl/Th2 rovnováhu smerom k Thl. Podávanie Zn^+t alebo GSH/GSSG je predovšetkým výhodné, vzhľadom k tomu, že tieto látky nie sú toxické ani vo zvýšenej koncentrácii a ich výroba nie je drahá. Navyše, Zn⁺⁺ a GSH/GSSG sa môžu podávať perorálne, čím významne znižujú riziko alergických reakcií, najmä v prípadoch, keď prípravky nie sú extrémne čisté. Zdá sa však, že podávanie Zn⁺⁺ a/alebo GSH/GSSG je užitočné len na obnovenie Thl/Th2 rovnováhy zo stavu Th2' dominancie, zatial čo nie je jasné, či môže podanie Zn⁺⁺ a/alebo GSH/GSSG zvýšiť Thl odpoveď zo stavu normálnej Thl/Th2 rovnováhy.

V inom prípade, patentovej prihláške US 09/156 646, uvedenej tu vo forme odkazu, je opisovaný postup, v ktorom vynálezca využíva nukleozidový analóg Ribavirín (1-(5-deoxy-ĎD-ribofuranozyl)-1,2,4-triazol-3-karboxamid) na ovplyvnenie rovnováhy Thl/Th2 odpovede. Použitie Ribavirínu je predovšetkým výhodné u liečby vírusových infekcií, pretože Ribavirín nielen

posúva imunitnú odpoveď smerom k Thl odpovedi, ale pôsobí tiež ako činidlo inhibujúce replikáciu vírusu. Ribavirín bol, napríklad, úspešne použitý v liečbe Hepatitis C. Časť tohto účinku sa pripisovala antivírusovým účinkom a časť cytokinovej balancii.

Aj keď Ribavirín vykazoval požadovaný vplyv na množstvo vírusu a stav imunity, dlhodobé podávanie Ribavirínu v pomerne vysokých dávkach bolo často spojené s množstvom nežiadúcich účinkov, ktoré zahŕňajú leukopeniu a hemolytickú anémiu. S cielom redukovať početné nežiadúce účinky, bolo zavedené spoločné podávanie Ribavirínu s INFa-2B (Reichert, 0. a kol. 1998; Lancet 351: 83 - 87). Spoločné podávanie Ribavirínu s IFNa-2B však výrazne predražilo liečbu. Navyše, dlhodobé podávanie Ribavirínu s IFNa-2B zvýšilo riziko vzniku nových vedľajších účinkov spojených s IFNa-2B.

Napriek pomerne úspešnému podávaniu Ribavirínu pri liečbe vírusových infekcii, zostáva použitie Ribavirínu problematické vzhľadom k vzniku rôznych vedľajších účinkov. Preto tu vzniká potreba poskytnutia lepších spôsobov a prostriedkov ovplyvňujúcich Thl/Th2 rovnováhu s relatívne nízkymi alebo žiadnymi toxickými vedľajšími účinkami vzniknutými pri liečbe vírusových infekcií.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka použitia zlúčeniny majúcej štruktúru 1 na prípravu liečiva na moduláciu lymfokínovej expresie, ktoré zahŕňa dodanie zlúčeniny bunke v koncentrácii účinnej na moduláciu lymfokínovej expresie, pričom štruktúra 1 je:

·- 1 '

-5a modulácia je účinná na liečenie podmienky spojenej s TH1 í cytokinovou expresiou.

Konkrétne sa zameriava na spôsob liečby vírusovej infekcie u pacientov, keď sa pacientom podáva Levovirín™ (1-(B-Lribofuranozyl)-1,2,4-triazol-3-karboxamid) a kde vírusovou infekciou je HIV, HCV alebo HBV infekcia.

Jedným z hľadísk skúmanej problematiky je, že Levovirín™ zvyšuje u pacientov Thl odpoveď v pomere k Th2 odpovedi a že, čo sa predovšetkým predpokladá, Thl odpoveď rastie absolútne. Ďalším hľadiskom skúmanej problematiky je podanie Levovirínu™ in vivo, prednostne intravenóznou injekciou alebo perorálne, pričom odporúčaná dávka Levovirínu™ je medzi 0,1 mg/kg a 1,0 mg/kg.

- 6 Rôzne zámery, znaky, ohľady a výhody prítomného vynálezu budú viac zrejmé z nasledujúceho podrobného opisu odporúčaných podôb vynálezu spolu s priloženými výkresmi, v ktorých sú jednotlivé zložky predstavované číslami.

Výraz vírusová infekcia sa vzťahuje k akémukoľvek štádiu vírusovej infekcie, vrátané inkubačnej doby, latentného alebo dormantného štádia, akútneho štádia a vzniku a pretrvávania imunity proti vírusu, ako bude použitý aj ďalej. V tejto súvislosti, má výraz liečba zahŕňať aspekty vzniku alebo privodenia imunity imunitného systému pacienta, rovnako ako potlačenie alebo inhibíciu vírusovej replikácie.

Ako bude chápané aj ďalej, lymfokiny sú podskupinou cytokinov, ktorú produkujú pomocné T lymfocyty, a vo všeobecnosti sa predpokladá, že patria do dvoch podtried, Thl a Th2. Thl bunky (po novom známe ako bunky typu 1) produkujú interleukín 2 (IL-2), tumor-nekrotizujúci faktor (TNF-α) a interferón gamma (IFN-γ) a sú primárne zodpovedné za bunkami sprostredkovanú imunitu, ako je hypersenzitivita vzdialeného typu alebo protivírusová imunita. V porovnaní s tým, Th2 bunky (po novom nazývané bunky typu 2) produkujú interleukíny IL-4, IL-5, IL-6,IL-9, IL-10 a IL-13 a primárne sa angažujú v podpore humorálnej imunitnej odpovede, ktorú vidíme pri reakcii na alergény, napríklad IgE a IgG4 izotypový priešmyk (Mosmann, 1989, Annu Rev Immunol, 7: 145 - 173).

Termíny Thl a Th2 odpoveď majú zahŕňať celý rozsah účinkov, ktoré vyplývajú z aktivácie Thl a Th2, resp., ako bude použité aj ďalej. Okrem iného, tieto odpovede zahŕňajú zvýšenú produkciu zodpovedajúcich cytokinov, zvýšenú prolifeŕáciu zodpovedajúcich lymfocytov a ďalšie následky spojené so zvýšenou produkciou cytokinov, vrátane migračného účinku. Thl odpoveď je vo všeobecnosti charakterizovaná zvýšením IL-2, TNFα a IFN-γ, zatiaľ čo Th2 odpoveď je typicky charakterizovaná zvýšením IL-4, IL-5, IL-6 a IL-10.

V odporúčanej dávke dostanú pacienti infikovaní HIV s počtom CD4⁺ lymfocytov okolo 500 buniek na mikroliter jedenkrát denne, počas 30 dní, jednu injekciu vodného roztoku

Levovirínu™ v celkovej dávke 0,5 mg/kg telesnej hmotnosti.

- ? Z ďalšieho možného hľadiska skúmanej problematiky, HIV infekcia nemusí byť obmedzovaná na počet CD4’ lymfocytov okolo 500 buniek na mikroliter, ale môže zahŕňať aj nižší počet CD4* lymfocytov, vrátane hodnôt medzi 500 a 300, 300 až 150 a menej ako 150 CD4* lymfocytov. Podobne sa uvažujú aj vyššie hodnoty CD4’ lymfocytov (napríklad > 500). Malo by sa ďalej pripomenúť, že prijateľné môžu byť rôzne ďalšie klinické markery, iné ako titer protilátok a hodnota CD4⁺ lymfocytov, vrátane priamych a nepriamych spôsobov určenia prítomnosti HIV. Priame spôsoby sú, napríklad, kvantitatívna kultivácia PBMCs’a plazmatického HIV, kvalitatívne a· kvantitatívne spôsoby PCR a podobne. Nepriame spôsoby zahŕňajú kvalitatívne a kvantitatívne ELISA metódy atď.

Vzhľadom na typ vírusovej infekcie sa predpokladá, že liečba vírusovej infekcie nie je obmedzená na špecifický typ alebo subtyp HIV vírusu, a je vhodné si uvedomiť, že sa uvažujú tiež iné vírusy ako HIV. Vo všeobecnosti sa predpokladá, že iné vírusové infekcie zahŕňajú tie infekcie, ktoré sa môžu liečiť Ribavirínom, D-izomérom Levovirínu™. Iné, predovšetkým myslené vírusové infekcie, zahŕňajú HCV a HBV infekciu.

Medzi ďalšie pohľady novoopísanej problematiky patrí, že aplikácia Levovirínu™ nemusí byť obmedzená na jednodenné injekcie podávané počas 30 dní, ale môže zahŕňať iné frekvencie aj formy aplikácie. V prípade potreby podania pomerne vysokého množstva Levovirínu™ sa uvažuje o dvoch až štyroch alebo aj viacerých injekciách za deň. Podobne v požadované vysoké plazmatické koncentrácie prípade, kde sú Levovirínu™ počas dlhšieho obdobia, sa uvažuje stála aplikácia.

Stály prísun môže, napríklad, zahŕňať použitie kontinuálnej infúzie, osmotického čerpadla alebo implantátu s uľahčeným uvoľňovaním.

Malo by sa zdôrazniť, že forma podania nie je obmedzená na injekčnú formu, alebo vhodné podanie môže zahŕňať aplikáciu perorálnu, transdermálnu, intranazálnu, inhalačnú atď. V súvislosti s tým, prípravky možných prípravkov Levovirínu™ môžu zahŕňať tablety, sirupy, gély, aerosóly atď. Ďalej sa tiež uvažuje možnosť podania Levovirínu™ in vitro. Určené množstvo celej krvi alebo krvných derivátov tak môže byť, napríklad preinkubované s Levovirínom™ in vitro, s cieľom buď podporiť alebo privodiť imunitnú reakciu smerujúcu k imunitnej obrane.

- δ Vzhľadom na dávkovanie Levovirinu™ sa uvažuje, že sú prípustné aj rôzne možnosti dávkovania, ktoré zahŕňajú dávky medzi 0,5 mg/kg a 0,1 mg/kg a menej, ale tiež dávky medzi 0,5 a 1,0 mg/kg a viac. Vo všeobecnosti bude vhodné dávkovanie závisieť na mnohých faktoroch, vrátane typu vírusovej infekcie, požadovanej plazmatickej koncentrácii Levovirinu™, trvaní liečby atď. Zatial čo u niektorých vírusových infekcií sa môže, napríklad, dosiahnuť úspešná liečba pri pomerne nízkych plazmatických koncentráciách Levovirinu™, iné vírusové infekcie môžu vyžadovať pomerne vysoké dávky.

Medzi ďalšie pohľady novoopísanej problematiky ešte patri možnosť kombinácie Levovirinu™ s inými farmaceutický aktívnymi látkami, ktoré podporujú liečbu vírusovej infekcie. Prídavné farmaceutický aktívne látky, ktoré sa uvažujú, zahŕňajú antivírusové činidlá a imunomodulátory. Príkladom antivírusových činidiel sú inhibítory proteázy, nukleotidy alebo nukleozidové analógy a imunomodulátory môžu zahŕňať cytokiny.

Aj keď nie je žiadúce obmedziť sa na nejakú konkrétnu teóriu, predpokladá sa, že podanie Levovirinu™ koreluje u pacientov so zvýšením odpovede Thl relatívne k odpovedi Th2 a predovšetkým sa predpokladá, že pomerné zvýšenie Thl odpovede vzhľadom k Th2 odpovedi sa uskutočňuje na základe absolútneho nárastu Thl odpovede. Hladiny cytokinov sa tak môžu zvýšiť jednotlivo alebo spoločne. Predpokladá sa napríklad, že ošetrenie aktivovaných ľudských PBMCs Levovirínom™ môže viesť k priemernému pikovému nárastu hodnoty IL-2 najmenej o 70 % hmotn. vyššiemu, ako je hodnota aktivovanej kontroly. Prípadne sa predpokladá, že pridanie Levovirinu™ k aktivovaným PBMCs môže viesť k priemernému pikovému nárastu hodnoty IFN-γ najmenej o 20 % hmotn. vyššiemu, ako je hodnota aktivovanej kontroly alebo k priemernému pikovému nárastu hodnoty TNF-a najmenej o 50 % hmotn. vyššiemu, ako je hodnota aktivovanej kontroly (viď. tiež obr. 3A-C). V inom príklade sa predpokladá, že zvýšenie Thl odpovede môže zahŕňať priemerný pikový nárast v porovnaní s hodnotami aktivovanej kontroly u IL-2, IFN-γ a TNFα o 42 % hmotn., 125 % hmotn. a 72 % hmotn., resp.

Malo by sa predovšetkým zdôrazniť, že zatiaľ čo spektrum liečiteľných vírusových infekcii sa medzi Ribavirinom a Levovirinom™ čiastočne prekrýva, Levovirín™ má podstatne zníženú toxicitu. Napríklad, zatiaľ Ribavirínu krysám v dávke 180 mg/kg viedlo k vážnej hemolytickej anémii a čo perorálne podanie počas štyroch týždňov leukopenii, .Levovirín™ nespôsobil žiadnu klinicky pozorovateľnú patológiu. Ďalej sa predovšetkým posudzuje, že liečba vírusových ochorení Levovirinom™ je prednostne založená na ovplyvnení Thl/Th2 rovnováhy v prospech prevažujúcej Thl odpovede a nezakladá sa predovšetkým na priamom antivírusovom účinku. Výraz priamy antivírusový účinok alebo aktivita, ako je použité aj ďalej, sa vzťahuje k bezprostrednému účinku alebo aktivite na prežitie vírusu alebo replikáciu. V porovnaní s tým, vírusovej aktivity alebo replikácie aspoň sprostredkovanej jednou alebo viacerými zložkami potlačenie čiastočne imunitného systému, sa nepovažuje za priamy protivírusový účinok alebo aktivitu. Podobne je dobre zdôrazniť, že relatívna redukcia Th2 odpovede počas liečby zodpovedajúcej skúmanej problematike, by mohla byť predovšetkým výhodná u chorôb spojených so zvýšenou odpoveďou Th2 (napríklad HCV infekcia).

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje štruktúru Levovirínu™.

Obr. 2 ukazuje schému syntézy Levovirínu™.

Obr. 3A-C ukazujú grafy zobrazujúce rôzne biologické účinky Levovirínu™ a Ribavirínu na , jednotlivé súčasti > Thl odpovede.

Obr. 4 ukazuje graf zobrazujúci sérové hodnoty ALT u myší injikovaných Con A v závislosti na liečbe Levovirinom™ a Ribavirinom.

- /10 Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady ilustrujú ukážkovú syntézu a rôzne aplikácie Levovirínu™.

Príklad 1

Syntéza Levovirínu™

1,2,3,5-tetra-0-acetyl-5-L-ribofuranóza (1): Do roztoku Lríbózy (50,0 g, 333,33 mmol) v neriedenom metanole (500 ml) rozmiešaného pri izbovej teplote sa pridala čerstvo pripravená suchá metanolovaná HC1 (40 ml, pripravená prebublávaním suchého plynu HC1 metanolom pri 0 °C do hmotnostného prírastku 4 g) pomocou striekačky, počas 15 minút, v 'prostredí argónovej atmosféry. Po pridaní metanolovej HC1 sa reakčná zmes nechala pri izbovej teplote v trepačke, počas 3 až 4 hodín. Pridal sa suchý pyridín (100 ml) a odparil sa do vysušenia pri vysokej hodnote vákua s teplotou menšou ako 40 °C. Tento postup sa opakoval druhýkrát s pridaným suchým pyridínom (100 ml). Zostatok sa rozpustil v suchom pyridíne (250 ml) a ochladil sa v ľadovom kúpeli na 0 °C v prostredí argónovej atmosféry. K tomuto vychladenému, pretrepanému roztoku sa pridal acetánhydrid (100 ml) po kvapkách pomocou nálevky počas 15 minút. Po pridaní acetánhydridu sa reakcia nechala v trepačke pri izbovej teplote za vylúčenia prístupu vlhkosti počas 24 hodín. Reakčná zmes sa odparila až do vysušenia. Zvyšok sa rozdelil medzi etylacetát (400 ml) a vodu (400 ml) a extrahoval sa v EtOAc. Vodná vrstva sa opäť oddelila pomocou EtOAc (100 ml). Celkový EtOAc extrakt sa premýval vodou (400 ml), nasýteným NaHCO₃ (2 x 300 ml), vodou (300 ml) a fyziologickým roztokom (200 ml) . Organický extrakt sa vysušil pomocou anhydrogénneho Na2SO₄, prefiltroval sa a filtrát sa odparil do sucha. Zvyšok sa odparoval v prítomnosti suchého toluénu (2 x 150 ml) pri vysokej hustote vákua. Vysušený olejový zvyšok (92 g, 95 %) sa ako taký, bez ďalšej charakterizácie, použil na nasledujúcu reakciu.

Sirup (92 g) z vyššie opísanej reakcie sa rozpustil vo vychladenej kyseline octovej (300 ml) a zmiešal sa s acetánhydridom (75 ml) pri izbovej teplote. Roztok sa ochladil v ľadovom kúpeli na 0 až 5 °C v prostredí argónovej atmosféry.

Pomaly sa pridala počas časovej periódy 15 minút koncentrovaná H?SO₄ (21 ml) . Po pridaní H₂SO₄ sa reakčná zmes 14 hodín pretrepávala pri izbovej teplote a naliala sa na ľadovú drť (500 g) a miešala sa, pokiaľ sa ľad neroztopil. Pridala sa voda (500 ml) a extrahovala sa pomocou CHC1₃ (2 x 300 ml) . Chloroformový extrakt sa premýval vodou (3 x 400 ml), nasýteným NaHCCh (2 x 300 ml), vodou (200 ml) a fyziologickým roztokom (200 ml) . Premytý organický extrakt sa vysušil pomocou anhydrogénneho MgSCh, prefiltroval sa a odparil sa do sucha za vzniku olejovitého zvyšku (99 g). Zvyšok sa odparoval v prítomnosti suchého toluénu (200 ml) a rozpustil sa v etyléteri (200 ml), ktorý následne po chladení na 10 °C počas jedného dňa vytvoril bezfarebné kryštály. Kryštály sa filtrovali, premývali sa zmesou hexán : éter (2 : 1, 50 ml) a vysušili sa za vzniku 60,5 g produktu.

Metyl-1-(2,3,5-tri-0-acetyl-B-L-ribofuranozyl)-1,2,4triazol-3-karboxylát (3) a metyl-l-(2,3,5-tri-O-acetyl-fi-Lribofuranozyl)-1,2,4-triazol-5-karboxylát (4): Zmes metyl1,2, 4-triazol-3-karboxylátu (25,4 g, 200 mmol), 1,2,3,5-tetraO-acetyl-B-L-ribofuranózy (63,66 g, 200 mmol) a bis-(pnitrofenyl)fosfátu (1 g) sa umiestnila do RB-fľaše (500 ml). Fľaša sa na 25 minút vložila do olejového kúpeľa predohriatého na 165 až 175 °C do podmienok vákua vytvoreného vodnou vývevou a pretrepávala sa. Vytesnená kyselina octová sa zachytávala vo vychladenom lapači umiestnenom medzi aspirátorom vývevy a RBfľašou. Fľaša sa vybrala z olejového kúpeľa a chladila sa. Keď teplota fľaše dosiahla približne 60 až 70 °C, zmiešali sa EtOAc (300 ml) a nasýtený NaHCO3 (150 ml) a extrahovali sa v EtOAc.

I

Vodná vrstva sa extrahovala opäť pomocou EtOAc (200 ml). Spoločný EtOAc extrakt sa premyl nasýteným NaHCO₃ (300 ml), vodou (300 ml) a fyziologickým roztokom (200 ml) . Organický extrakt sa vysušil v prostredí anhydrogénneho Na₂SO₄, prefiltroval sa a filtrát sa odparil do sucha. Zvyšok sa rozpustil v EtOH (100 ml) a zriedil sa MeOH (60 ml), ktorý po ochladení na 0 °C počas 12 hodín vytvoril bezfarebné kryštály. Tuhá fáza sa prefiltrovala, premývala sa minimálne vychladeným EtOH (20 ml) a vysušila sa pri vysokých hodnotách vákua nad tuhým NaOH za vzniku 60 g (78 %). Filtrát sa odparil do sucha a čistil sa na kremičitom nosiči s použitím CHCI³ : EtOAc (9 : 1) ako eluátu. Z filtrátu sa izolovali dva produkty: rýchlo sa pohybujúci 8,5 g (11 %) produkt a pomaly sa pohybujúci 5 g (6,5 %) produkt. Pomaly sa pohybujúci produkt sa zhodoval s produktom kryštalizácie. Rýchlo sa pohybujúci produkt sa identifikoval ako (4) a získal sa vo forme peny. Celkový zisk (3) bol 65 g (84 %).

Ι-β-ribofuranozyl-l,2,4-triazol-3-karboxamid (5): Metyl-1(2,3,5-tri-0-acetyl-5-L-ribofuranozyl)-1,2,4-triazol-3-karboxylát (62 g, 161 mmol) sa umiestnil do oceľovej bomby a ošetril sa s čerstvo pripraveným metanolovým amoniakom (350 ml, pripravený pasážou suchého HC1 plynu suchým metanolom pri 0 °C do nasýtenia). Oceľová bomba sa uzavrela a pretrepávala sa pri izbovej teplote 18 hodín. Oceľová bomba sa potom ochladila na 0 °C, otvorila sa a obsah sa odparil do sucha. Zvyšok sa ošetril suchým etanolom (100 ml) a odparil sa do sucha. Získaný zvyšok sa rozmelil s acetónom za vzniku tuhej fázy, ktorá sa filtrovala a premyla sa acetónom. Tuhá fáza sa sušila cez noc pri izbovej teplote a rozpustila sa v zmesi horúceho EtOH (600 ml) a vody (10 ml). Objem roztoku EtOH sa znížil na 150 ml jeho ohrievaním a miešaním na horúcej platni. Horúci roztok EtOH po ochladení poskytol bezfarebné kryštály, ktoré sa filtrovali, premývali sa acetónom a sušili sa v podmienkach vákua. Ďalšia koncentrácia filtrátu poskytla ďalší materiál. Celkový zisk predstavoval 35 g (89 %) produktu.

Príklad 2

Určenie cytokinového profilu v odpovedi na Levovirín™ a Ribávirín

Od zdravého darcu sa pomocou centrifugácie podľa hustotného gradientu izolovali mononukleárne bunky periférnej krvi s následným obohatením T bunkami s použitím Lymphowiku (One Lambda, Canoga Park, CA). Kontaminujúce monocyty sa odstránili pomocou adhézie na plast. Čisté T bunky predstavovali > 99 % CD2⁺, < 1 % HLA-DR⁺, < 5 % CD25⁺ a udržiavali sa v RPMI-AP5 (médiu RPMI1640 s obsahom 5 % autológnej plazmy, 1 % glutamínu, 1 % penicilín/streptomycínu a 0,05 % 2-merkaptoetanolu). Na určenie hodnôt cytokinových

- tá proteínov sa T bunky (0,2 x 10^fc v objeme 0,2 ml) aktivovali pridaním 80 ng stafylokokového enterotoxinu B (SEB, Sigma, St. Louis, MI) a inkubovali sa v prítomnosti 0 až 10 μΜ Levovirínu™ alebo Ribavirínu v 96-jamkových platniach počas 48 hodín pri 37 °C. Po následnej aktivácii sa supernatanty analyzovali na bunkovú cytokinovú produkciu. Určenie cytokinov sa uskutočnilo s použitím ELISA gitov špecifických pre IL-2, IFN-γ, TNF-α (Biosource, Camarillo, CA). Všetky výsledky ELISA metódy boli vyjadrené v pg/ml. Údaje sú zobrazené ako percentá aktivovaných kontrol, počítané ako pomer cytokinov aktivovaných T buniek nachádzajúcich sa v prítomnosti Levovirínu™ alebo Ribavirínu v porovnaní s hodnotami cytokinov neošetrených aktivovaných T buniek násobený 100 %. Nulový účinok na cytokinové hodnoty by tiež vykazoval percentuálnu hodnotu aktivovaných kontrol 100 %. Obr. 3A-C ukazuje, podobnosť na dávke závislých odpovedí T buniek ošetrených Ribavirínom alebo Levovirínom™ a rôznymi Thl cytokinmi. Tabulka 1 ukazuje účinok Ribavirínu a Levovirínu™ u SEB stimulovaných T buniek na expresiu Thl cytokinov IL-2, IFN-γ a TNF-α. Prítomné údaje jasne naznačujú, že Levovirín™ poskytuje významný potenciál na liečbu tých ochorení, kde hrajú kritickú úlohu cytokiny typu 1.

Liečba	IL-2	IFN-γ		TNF-	a
SEB	100	100		100
SEB + Ribavirín	143 ± 18	. 131 ±	6	124	± 4
SEB + Levovirín™	131 ± 12	122 ±	3	144	±7
Tabulka 1: Všetky	údaje sú	spoločne	ukázané	ako	priemerné

percentuálne hodnoty aktivovaných kontrol (± štandardná odchýlka - ďalej št.o.) pre všetky cytokiny. Celkové hodnoty (pg/ml ± št.o.) SEB indukovaného vylučovania cytokinov typu 1 boli pre IL-2 640 + 36, pre IFN-γ 462 + 37 a pre TNF-a 223 + 27. Kludové hodnoty boli u všetkých cytokinov < 30 pg.

Μ

Príklad 3

Spôsoby určenia priamej antivírusovéj aktivity a cytotoxicity

In vitro testovanie priamej antivírusovej aktivity Levovirínu™ a Ribavirínu proti influenze A a B, parainfluenze 1 a 2 a respiračnému syncytiálnemu vírusu sa uskutočnilo rovnako, ako opisuje Huffman, J. H. a kol. Antiviral Chem. and Chemother. 1997, 8: 75-83 a Bernard, D. L. a kol. Antiviral Chem. a Chemother. 1997, 8: 223 - 233. Určenie anti-HIV aktivity uskutočnil National Cancer Inštitúte, ktorý používa postupy navrhované na detekciu agens pôsobiaceho v akomkoľvek štádiu reprodukčného cyklu vírusu (Weislow, 0. W. a kol., J. Natl. Cancer Inst. 1989, 81: 577 - 586). Aktivita proti hepatitíde B sa sledovala s použitím spôsobov, ktoré opisuje Marion a kol., Hepatology 1987, 7: 724 - 731. Anti-HIV aktivita a cytotoxicita Ribavirínu sa určila zo skôr známych údajov (McCormick, J. B._z Lancet 1998, II, 1367 - 1369).

Tabuľka 2 ukazuje porovnanie priamej antivírusovej aktivity a cytotoxicity Levovirínu™ a Ribavirínu na bunky infikované rôznymi vírusmi.

Prípravok	Účinok	HBV	HIV	INFL.A	INFL.B	PARA 1	PARA 3	RSV
Levovi- ' TM nn	Priamy antivírusový	>100	>600	>200	>200	>1000	>1000	>1000
	Cytotoxický	>100	>600	>200	>200	>1000	>1000	>1000
Ribavirín	Priamy antivírusový	>100	40	6,1 ^V	1,9	40	4	5
	Cytotoxický	53	>40	56	40	>1000	480	100

Tabuľka 2: Testovali sa vírusy hepatitis B (HBV), vírus ľudskej imunodeficiencie (HIV), influenza (INFL) A a B, parainfluenza (PARA) 1 a 3 a respiračný syncytiálny vírus (RSV). Antivirusová aktivita (EC_S0) alebo cytotoxicity (CC₅o) sú znázornené v μΜ.

Príklad 4

Protizápalový účinok Levovirínu™ u hepatitídy indukovanej

Concavalinom A

BALB/c myši (6 v skupine) sa intraperitoneálne injektovali jednou dávkou 20 pg (1 mg/kg) Ribavirínu alebo Levovirínu™ alebo 200 μΐ PBS, 1 hodinu pred intravenóznou injekciou 0,3 mg Concavalinu A (Con A, Calbiochem, San Diego, CA) aplikovanou do chvostovej žily. Po 24 hodinách sa myši anestezovali Penthranom a kardiálnou punkciou im bola odobratá všetka krv (exsanguinácia) .

Sérum získané zo zrazenej krvi sa použilo na určenie sérovej hladiny alanínaminotransferázy (ALT). Sérové hodnoty ALT sa určili s použitím spôsobu stanovenia enzýmovej aktivity (Sigma) založenom na kalorimetrickom meraní produktov (kyseliny pyrohroznovej a glutámovej) vzniknutých pri katalýze substrátov, alanínu a kyseliny α-ketoglutarovej. Obr. 4 ukazuje množstvo sérovej ALT v závislosti na Ribaviríne alebo Levoviríne™ alebo' PBS. Obidva, Ribavirín a Levovirín™, boli schopné podstatne znížiť Con A-indukované hodnoty ALT z asi 1900 U/ml na 969 U/ml ± 192 u Ribavirínu a na 954 U/ml + 179 u Levovirínu™.

Takto boli objasnené špecifické podoby a aplikácie zlúčenín a spôsoby liečby vírusovej infekcie pomocou Levovirínu™. Malo by byť však zrejmé, vzhľadom k znalostiam v odbore, že okrem bežne opisovaných, sú možné mnohé ďalšie modifikácie, bez odchýlenia sa od novoopísaného chápania. Novoopísaný objav preto nie je obmedzený inak, ako v zmysle pripojených nárokov. Navyše, v interpretácii obidvoch, presného opisu a nárokov, by sa mali všetky výrazy interpretovať najširším možným spôsobom v súlade s kontextom. Najmä výrazy obsahuje a obsahujúci by sa mali interpretovať ako odkazujúce na časti, zložky alebo postupy nevylučujúcim spôsobom ukazujúcim, že uvedené časti, zložky alebo postupy môžu byť prezentované alebo použité alebo kombinované spolu s

- /16 inými časťami, zložkami alebo postupmi, ktoré neboli priamo uvedené.

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

-Ab r r r r r - . .

/ C Γ ' r r r t r ŕ r ' f r r r r pf>625-02

1. Použitie zlúčeniny majúcej štruktúru 1 na prípravu liečiva na moduláciu lymfokínovej expresie, ktoré zahŕňa dodanie zlúčeniny bunke v koncentrácii účinnej na moduláciu lymfokínovej expresie, pričom štruktúra 1 je:

a modulácia je účinná na liečenie podmienky spojenej s TH1 cytokínovou expresiou.
2. Použitie podlá nároku 1, v ktorom dodávanie zlúčeniny zvyšuje Thl odpoveď relatívne k Th2 odpovedi.
3. Použitie podlá nároku 2, v ktorom nárast Thl odpovedi je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z priemerného pikového nárastu hodnoty IL-2 v porovnaní s hodnotou aktivovanej kontroly najmenej o 70 % hmotn., priemerného pikového nárastu hodnoty IFN-γ v porovnaní s hodnotou aktivovanej kontroly najmenej o 20 % hmotn., priemerného pikového nárastu hodnoty TNF-α· v porovnaní s hodnotou aktivovanej kontroly najmenej o 50 % hmotn., a priemerného pikového nárastu hodnoty IL-2, IFN-γ a TNF-α v porovnaní s hodnotou aktivovanej kontroly o 42 % hmotn., 125 % hmotn a 72 % hmotn.
4. Použitie podlá nároku 2, v ktorom nárast TH1 odpovedi zahŕňa priemerný pikový nárast hodnoty IL-2 v porovnaní s hodnotou aktivovanej kontroly najmenej o 70 % hmotn.

_r r r C r c <· c '

J8-
5. Použitie podlá nároku 2, v ktorom nárast TH1 odpovedi zahŕňa priemerný pikový nárast hodnoty IFN-γ v porovnaní s hodnotou aktivovanej kontroly najmenej o 20 % hmotn.
6. Použitie podlá nároku 2, v ktorom nárast TH1 odpovedi zahŕňa priemerný.pikový nárast hodnoty TNF-α. v porovnaní s hodnotou aktivovanej kontroly najmenej o 50 % hmotn.
7. Použitie podlá nároku 2, v ktorom nárast TH1 odpovedi zahŕňa priemerný pikový nárast hodnoty IL-2, IFN-γ a TNF-α v porovnaní s hodnotou aktivovanej kontroly o 42 % hmotn., 125 % hmotn a 72 % hmotn.
8. Použitie podlá nároku 1, v ktorom fáza dodávania zahŕňa dodanie in vivo.
9. Použitie podlá nároku 1, v ktorom podmienkou je vírusová infekcia vybraná zo skupiny pozostávajúcej z HIV infekcie, HCV infekcie a HBV infekcie.