SK288508B6 - Použitie 5-karboxymetyl-3-merkapto-1,2,4-triazino-[5,6-b]indolov a farmaceutický prostriedok s ich obsahom - Google Patents

Abstract

Opísané je použitie 5-karboxymetyl-3-merkapto-l,2,4- triazino-[5,6-b]indolov všeobecného vzorca (I) a ich farmaceuticky akceptovateľných solí, hydrátov a solvátov na výrobu liečiva na liečenie humánnych a veterinárnych chorôb, pri ktorých aktivity aldo-keto reduktáz AKRI BI a AKR1B10 sú kľúčovými etiologickými faktormi pre ich vývoj a progresiu.

Description

Vynález sa týka použitia 5-karboxymetyl-3-merkapto-l,2,4-triazino-[5,6-b]indolov a farmaceutického prostriedku s ich obsahom na liečenie humánnych a veterinárnych chorôb.

Doterajší stav techniky

Aldo-keto reduktázy sú NAD(P)H-dependentné oxidoreduktázy, ktoré sú najlepšie charakterizované ako činidlá redukujúce glukózu. Podieľajú sa na patofyziológii diabetických komplikácií. Tieto enzýmy taktiež metabolizujú produkty lipidovej peroxidácie, čím prispievajú za určitých okolností k vzniku zápalovej odozvy.

Aldózareduktáza (AR, ALR2, AKR1B1), okrem toho, že sa podieľa na diabetických komplikáciách prostredníctvom redukcie glukózy, účinne redukuje aldehydy, vznikajúce peroxidáciou lipidov, a ich konjugáty s glutatiónom (Ramana, BioMol Concepts 2:103-114, 2011). Aldehydy vznikajúce peroxidáciou lipidov, ako 4-hydroxy-trans-2-nonenal (HNE), a ich glutatiónové konjugáty (napr. GS-HNE), sú účinne redukované pôsobením AR na zodpovedajúce alkoholy, DHN (1,4-dihydroxynonén) a GS-DHN (glutationyl-l,4-dihydroxynonén), ktoré sprostredkúvajú zápalové signály. Redukovaný konjugát GS-DHN sa považuje za nový signálny intermediát v transdukcii bunkových signálov iniciovaných reaktívnymi formami kyslíka, ktoré môžu v konečnom dôsledku viesť k zápalovej odpovedi (Srivastava et al. Chem Biol Interaction 191:330-338,

2011) . Na bunkových a zvieracích modeloch inhibícia AR účinne eliminovala zápalové signály indukované cytokínmi, rastovými faktormi, endotoxínmi, vysokou glukózou, alergénmi a auto-imunitnými reakciami (Ramana and Srivastava, Int. J. Biochem. Celí Biol. 42: 17-20, 2010).

Inhibítory aldózareduktázy (ARIs) tak predstavujú nový terapeutický prístup k liečbe širokého spektra zápalových ochorení, ako sú ateroskleróza, astma, uveitída, sepsa, artritída, periodontitída a iné poruchy, ktoré majú potenciál stimulovať imúnny systém a generovať veľké množstvá zápalových cytokínov a chemokínov, vrátane rakoviny hrubého čreva (Ramana, BioMol Concepts 2:103-114, 2011; Srivastava et al. Chem Biol Interaction 191:330-338, 2011; Tammali et al. Curr Cancer Drug Targets. 11(5):560-571,2011; Kador et al. J Periodontol. 2011;82:926-933,2011; Yadav et al. Curr Mol Med 10, 540-549, 2010).

Je veľmi dobre zdokumentované, že chronický zápal je spojený s progresiou rakoviny (Solinas et al. Cancer Metastasis Rev. 29, 243-248, 2010) a bola zaznamenaná zvýšená expresia aldoketoreduktáz v tumoroch pľúc, prsníka, prostaty, krčka maternice, testes a hrubého čreva (Liu et al. Recent Pat Anticancer Drug Discov. 4(3):246-53, 2009; Laffin and Petrash, Front Pharmacol. 3:104, 2012, Terzig et al. Gastroenterology .138(6):2101-2114, 2010). Navyše zvýšená expresia AKR1B1 v rôznych typoch rakoviny spôsobuje rezistenciu na doxorubicín, čo sa vysvetľuje zvýšenou detoxifikáciou doxorubicínu redukciou karbonylu sprostredkovanou AKR1B1 (Lee et al. Anticancer Drugs (2):129-32 2001).

Okrem AKR1B1 sa na viacerých typoch rakoviny podieľa aj príbuzný enzým AKR1B10 (Penning, Clin Cancer Res. 11 (5):1687-90, 2005; Fukumoto et al. Clin Cancer Res. 11(5):1776-1785, 2005; Yan et al. Int J Cancer. 121(10):2301-6 2007; Zhao et al. Eur J Med Chem. 45(9):4354-7, 2010; Matsunaga et al. Front Pharmacol. 3:5.2012; Laffin and Petrash, Front Pharmacol. 3:104, 2012; Liu et al. Biochem J. 442(2):27382, 2012). AKR1B10 je 36-kDa cytozolická reduktáza, ktorá je podobná AKR1B1 sekvenciou aminokyselín (71 % identita) ako aj terciárnou štruktúrou s ,,(α/β)8 barrel“ topológiou. Podobne ako AKR1B1 enzým AKR1B10 redukuje rozmanité aromatické a alifatické aldehydy, dikarbonylové zlúčeniny a niektoré ketónové liečivá s využitím NADPH ako koenzýmu.

Zvýšená expresia AKR1B1 aj AKR1B10 bola pozorovaná pri rôznych typoch rakoviny a bola zaznamenaná veľká variabilita podľa typu rakoviny a pôvodu tkaniva (Laffin and Petrash, Front Pharmacol. 3:104,

2012) . Významné zvýšenie expresie AKR1B10 bolo pozorované pri rakovine pľúc a pečene. Zvýšená expresia AKR1B1 je zväčša pozorovaná pri rakovine u ľudí, i keď vo všeobecne na nižšej úrovni. Farmakologická inhibícia alebo genetická ablácia AKR1B1 a AKR1B10 zabraňuje šíreniu zápalových signálov indukovaných cytokínmi a rastovými faktormi ako aj proliferáciu rakovinových buniek v bunkových kultúrach a v xenograftových modeloch nahých myší. Napr. Antitumorová aktivita protizápalového liečiva sulindaku bola nedávno interpretovaná v kontexte inhibície AR Steuber, ChemMedChem. 6(12):2155-7, 2011). Umlčanie expresie AKR1B10 viedlo k inhibícii buniek kolorektálneho karcinómu (Yan et al. Int J Cancer. 121 (10):2301 -6 2007).

Bol navrhnutý podiel AKR1B10 na vývoji rezistencie na protirakovinové agens (Jin et al. Front Biosci. 11:2767-73 2006; Matsunaga et al. Front Pharmacol. 3:5.2012; Laffin and Petrash, Front Pharmacol. 3:104, 2012).

Zmienené zistenia naznačujú, že inhibítory AKR1B1 a AKR1B10 majú predpoklad uplatniť sa v terapii rakoviny ako nové agens.

Taktiež bola opísaná aj syntázová aktivita AKR1B1, kde katalyzuje transformáciu PGH2 na PGF2a za prítomnosti kofaktora NADPH. PGF2a zohráva rôzne fyziologické úlohy v organizme ako napríklad kontrakcia maternice, bronchiálneho vaskulárneho a arteriálneho hladkého svalstva, regulácia očného tlaku, renálna filtrácia, stimulácia rastu vlasov, regulácia ovariálneho cyklu cez indukciu luteolýzy a iné (Nagata et al., FEBS Journals 278:1288-98, 2011). Je spojený s ochoreniami ako diabetes, osteoporóza, menštruačné poruchy a má významný vplyv na ženský reprodukčný systém (Madore et al., J.Biol.Chem. 278 (13):11205-12, 2003). Zvýšená hladina PGF2a bola zistená počas pôrodu ako prostriedok indukcie myometriálnych kontrakcií a cervikálnej dilatácie (Breuiller-Fouche'et al., Biol.Reprod. 83: 155-162, 2010).

Enzým AKR1B1 je tiež schopný katalyzovať izomerizáciu PGH2 na PGD2 bez prítomnosti NADPH (Nagata et al., FEBS Journals 278:1288-98, 2011). PGD2 je vazodilatátor a zabraňuje agregácii krvných doštičiek. Najviac je produkovaný v mozgu, kde má dôležitú úlohu v centrálnom nervovom systéme (regulácia spánku, alergická odpoveď či odpoveď na bolesť...) (Cebola at Peinado, Progress in Lipid Research 51: 301 -313, 2012). Je tiež súčasťou regulácie menštruačného cyklu a mediátor zápalu (Catalano et al., Mol.Hum.Reprod. 17(3): 182-192,2011).

Inhibítory AKR1B1, ako sú deriváty kyseliny octovej (tolrestat, zenarestat), spirohydantoíny (sorbinil) alebo zlúčeniny zo skupiny sukcínimidov (ranirestat) sa hlavne skúmali z hľadiska ich úlohy v prevencii diabetických komplikácií (Hotta, Biomed Pharmacother. 5, 244-250 1995; Costantino et al. Expert Opin Ther Patents. 10, 1245- 1262, 2000; Miyamoto, Expert Opin Ther Patents. 2002,12, 621-631 2002; Srivastava et al. Endocr Rev. 26, 380-392 2005). Pri hľadaní lepších AKR inhibítorov sa záujem posunul v posledných rokoch smerom k novým chemotypom Alexiou et al. Curr Med Chem. 16(6):734- 52,2009; Chatzopoulou et al. Expert Opin Ther Pat. 11:1303-23 2012).

Popri liečbe chronických diabetických komplikácií bolo publikované použitie inhibítorov aldoketoreduktáz AKR1B1 a AKR1B10 pri liečbe nasledovných zdravotných potiaží: sepsa (Srivastava et al. Chem Biol Interaction 191:330-338, 2011; Ramana, BioMol Concepts 2:103-114, 2011; Ramana and Srivastava, Int. J. Biochem. Celí Biol. 42: 17-20, 2010, Ramana and Srivastava, Int. J. Biochem. Celí Biol. 42: 17-20, 2010, Reddy et al. Cytokine 48:170-176. 2009), periodontitída (Kador et al. J Periodontol. 2011;82:926-933,2011), astma (Yadav et al. Chemico-Biological Interactions 191:339-345,2011; Srivastava et al. Chem Biol Interaction 191:330-338, 2011; Ramana and Srivastava, Int. J. Biochem. Celí Biol. 42: 17-20, 2010;) uveitis (Srivastava et al. Chem Biol Interaction 191:330-338, 2011; Yadav et al. IOVS 48(10): 4634-4642, 2007; Ramana and Srivastava, Int. J. Biochem. Celí Biol. 42: 17-20, 2010; Yadav et al. Curr Mol Med 10, 540-549, 2010), ateroskleróza (Ramana and Srivastava, Int. J. Biochem. Celí Biol. 42: 17-20, 2010), endotoxémia (Pandey et al. Expert Opin Investig Drugs 21(3):329-339, 2012) a rakovina (Tammali et al. Carcinogenesis.32(8): 1259-1267, 2011; Fukumoto et al. Clin Cancer Res. 1;11(5):1776-85, 2005; Laffin and Petrash, Front Pharmacol. 3:104, 2012; Ma et al. Int. J. Cancer: 131, E862-E871, 2012; Kang et al. J Int Med Res 39: 78-85, 2011) a neurologické a psychiatrické ochorenia či poruchy nálad (Alexiou et al., Curr.Med.Chem. 16: 734-752, 2009; Regenold et al., Mol. Psych. 9: 731-733, 2004).

Patent US 2011092566 sa týka metód liečby rakoviny pľúc, prsníka a prostaty a supresie metastáz spojených s rakovinou hrubého čreva s využitím inhibítorov aldózareduktázy.

Patenty US 2013023529, US 8273746 sa týkajú metód a kompozícií obsahujúcich inhibítory aldózareduktázy na liečbu zápalu, vrátane uveitídy a astmy.

Patent US 20100292287 sa týka metód prevencie a liečby periodontitídy cicavcov, vrátane ľudí a psov, založených na podaní účinného množstva inhibítora aldózareduktázy.

Patent CN 102346193 sa týka AKR1B10 ako diagnostického markera rakoviny prsníka a cieľa liečiv.

Patent RU 2374647 opisuje diagnostickú techniku pre rakovinu hrubého čreva založenú na detekcii hladiny mRNA génu AKR1B10.

Patent US 20111236394 opisuje metódu modulácie a monitorovania hladininy PGF2a pomocou modulácie hladiny AKRI BI resp. jej PGFS aktivity, pričom AKR1B1 je predstavený ako terapeutický cieľ.

Patent WO 02/098421 sa zaoberá liečbou psychiatrických a neurologických poškodení a ochorení inhibíciou aldózareduktázy.

Patent US 6696407 predkladá metódy modulácie aktivity asociovanej neurotropným faktorom použitím inhibítorov aldózareduktázy.

I keď sa extenzívne študoval rad inhibítorov aldo-ketoreduktáz AKR1B1 a AKR1B10, žiaden z nich nepreukázal dostatočnú účinnosť v humánnych klinických skúškach bez nežiaducich vedľajších účinkov. Teda stále je požiadavka na nové, účinné a bezpečné inhibítory aldo-ketoreduktáz AKR1B1 a AKR1B10 ako potencionálne liečivá diabetických komplikácií, zápalových ochorení a rakoviny.

Látka 5-karboxymetyl-3-merkapto-l,2,4-triazino-[5,6-b]indol (la) bola podrobená HTS skríningu v 372 testoch. Biologická aktivita bola zaznamenaná v 12 prípadoch, žiaden z nich nepredstavoval inhibíciu aldo-ketoreduktáz AKR1B1 a AKR1B10 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/ entrez?db=pccompound& cmd=Link&Link Name =pccompound pcassav active&fŕom uid=685919).

(la)

Doteraz opísané a patentované zlúčeniny najviac súvisiace s týmto vynálezom sú predmetom nasledovných dokumentov: WO2013041859 Al, US2004127499 Al, RU1487415 C, RU1804067 C, RU1487413 C, RU1665679 C, GB 1023720 A and Aswar et al. Asian Pac J Trop Biomed 2, 992-998 (2012). V štruktúrach definovaných v uvedených dokumentoch substituent v polohe 5 nie je definovaný ako karboxymetylová skupina -CH₂COOH. V publikácii M Stefek et al. J Med Chem 58:2649 (2015) bolo jednoznačne preukázané, že prítomnosť skupiny -CH₂COOH v polohe 5 základného l,2,4-triazino[5,6-b]indolového skeletu neočakávane a nepredvídateľne ovplyvňuje farmakologické účinky. V citovanej publikácii bolo preukázané, že zlúčenina 19, pri ktorej absentuje karboxymetylová skupina CH₂COOH v polohe 5, je neúčinná ako inhibítor aldózareduktázy. Inhibícia enzýmu aldózareduktáza je rozhodujúca pre farmakologické účinky, ktoré sú predmetom patentových nárokov. Zlúčeniny, ktoré sú definované v predmetnej prihláške, sa nedajú odvodiť od zlúčenín nárokovaných v dokumentoch WO2013041859 Al, US2004127499 Al, RU1487415 C, RU1804067 C, RU1487413 C, RU1665679 C, GB 1023720 A and Aswar et al. Asian Pac J Trop Biomed 2, 992-998 (2012).

Doteraz opísané inhibítory aldózareduktázy najviac súvisiace s týmto vynálezom zahŕňajú štrukturálne príbuzné triazíny (DaSettimo et al. J Med Chem. 44(25):4359-4369, 2001) ako aj štrukturálne odlišné triazíny (Mavel et al. Chem Pharm Bull (Tokyo) 40(6):1411-1414, 1992). Pri rade tricyklických karbolínov bola zaznamenaná aldózareduktázová inhibičná aktivita (Minehira et al. Bioorg Med Chem 20(1):356-67, 2012). Zlúčeniny, ktoré sú definované v predmetnej prihláške, sa nedajú odvodiť od zlúčenín nárokovaných v uvedených dokumentoch.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka 5-karboxymetyl-3-merkapto-l,2,4-triazino-[5,6-b]indolov všeobecného vzorca (I),

R2 je -H, alebo Ri je a R2 je -CH3.

Vynález sa týka aj farmaceutického prípravku obsahujúceho ako účinnú látku jednu zo zlúčenín všeobecného vzorca (I) a farmaceutický prijateľný nosič na použitie na liečenie humánnych a veterinárnych chorôb, pri ktorých aktivity aldo-keto reduktáz AKR1B1 a AKR1B10 sú kľúčovými etiologickými faktormi pre ich vývoj a progresiu, ako sú diabetické komplikácie makro- a mikroangiopatia, ateroskleróza, retinopatia, katarakta, nefropatia, neuropatia a strata kostnej masy, zápalové ochorenia, ako sú uveitída, sepsa, periodontitída, astma a rakovina hrubého čreva, abnormálna proliferácia vaskulárnych hladkosvalových buniek počas aterosklerózy a restenózy, karcinóm pľúc u fajčiarov, rakovina pľúc, prsníka, pečene, prostaty, pankreasu, rakovina endometria, cervikálna rakovina a adenokarcinóm krčka maternice, ochorenia ženského reprodukčného systému, ako sú poruchy menštruačného cyklu afertility, menštruačné ťažkosti, časovanie pôrodu, poruchy nálad, psychiatrické a neurologické ochorenia.

Vynález sa týka aj farmaceutického prostriedku obsahujúceho ako účinnú látku jednu zo zlúčenín všeobecného vzorca (I) v pevnej, orálnej alebo injekčnej liekovej forme na systémové podanie, alebo vo forme kvapiek, pást, gélov alebo mastí na lokálne podanie, na použitie na liečenie humánnych a veterinárnych chorôb, pri ktorých aktivity aldo-keto reduktáz AKR1B1 a AKR1B10 sú kľúčovými etiologickými faktormi pre ich vývoj a progresiu, ako sú diabetické komplikácie makro- a mikroangiopatia, ateroskleróza, retinopatia, katarakta, nefropatia, neuropatia a strata kostnej masy, zápalové ochorenia, ako sú uveitída, sepsa, periodontitída, astma a rakovina hrubého čreva, abnormálna proliferácia vaskulárnych hladkosvalových buniek počas aterosklerózy a restenózy, karcinóm pľúc u fajčiarov, rakovina pľúc, prsníka, pečene, prostaty, pankreasu, rakovina endometria, cervikálna rakovina a adenokarcinóm krčka maternice, ochorenia ženského reprodukčného systému, ako sú poruchy menštruačného cyklu a fertility, menštruačné ťažkosti, časovanie pôrodu, poruchy nálad, psychiatrické a neurologické ochorenia.

Vynález sa týka aj farmaceutických prostriedkov obsahujúcich ako účinnú látku jednu zo zlúčenín všeobecného vzorca (I), ich použitia ako aj terapeutických metód predstavujúcich podanie látky (I) cicavcom.

Látky všeobecného vzorca (I), ktoré sú predmetom vynálezu, sú užitočné ako činidlo so schopnosťou inhibovať aldo-ketoreduktázy AKR1B1 a AKR1B10.

Látky všeobecného vzorca (I) môžu byť pripravené syntetickými postupmi dobre známymi odborníkovi v danej oblasti, ktoré sú opísané v štandardných prácach ako Romanchick and Joullie Heterocycles 9, 1631 (1978); Neunhoeffer, H.;Wiley, P. E. In Chem. Heterocycl. Compd.; Wiley-Interscience: New York, 1978, 33, 749; E1 Ashry, E. S. H.; Rashed, N.; Taha, M. In Advances in Heterocyclic Chemistry; Katritzky, A.R. Ed.; Academic Press: New York, 1994, 59.

Všeobecná schéma na prípravu 5H-[l,2,4]triazino[5,6]indolo-3-tiolov pozostáva z krokov, ako je uvedené:

λ.

h₃c a

kde Ri je h₃c

ch₃ ch₃ ch₃

Ríje-H, alebo Ri je

o a Ržje -CH3.

lH-indol-2,3-dión (1, substituovaný isatín) plus tiosemikarbazid poskytnú isatin tiosemikarbazón (2), ktorý v alkalickom roztoku podlieha cyklizácii za vzniku substituovaného 5H-[l,2,4]triazino[5,6]indol-3-tiolu (3a) (tautomérna forma 2,5-dihydro-3H- [l,2,4]triazino [5,6]indol-3-tión, 3b). Alternatívne je tento produkt alkylovaný vhodným halogénovým derivátom za vzniku derivátu s požadovaným substituentom na atóme síry (4). Reakčné podmienky, ako sú opísané v Gupta et al. Eur J Med Chem 45(6):2359-2365 (2010); Hamid J. Chem. Res. 183-185 (2004); Shelke and Bhosale Bioorg Med Chem Lett 20(15):4661-4664 (2010); Abdel-Sayed Bulgarian Chem. Commun 41(4) 362 (2009); Mohan and Kumar Indián J. Chem 41B, (11), 2364-2370 (2002); Pal et al. Indián J. Chem. B 1991, 30, 1098-1102 (1991), US 5830894, GB 1023720, sú dobre známe odborníkovi v danej oblasti.

Na potreby orálneho terapeutického podania môže byť aktívna zlúčenina kombinovaná s jedným alebo viacerými nosičmi a použitá vo forme ingestívnych tabliet, bukálnych tabliet, pastiliek, kapsúl, elixírov, suspenzií, sirupov, oblátok a pod. Množstvo aktívnej zlúčeniny v takýchto terapeuticky používaných zmesiach je také, aby sa dosiahla efektívna dávková hladina.

Tablety, pastilky, pilulky, kapsuly a pod. môžu tiež obsahovať nasledovné: spojivá, ako tragakant, agátová guma, obilný škrob alebo želatína; pomocné látky, ako hydrofosforečnan vápenatý; látky na zvýšenie rozpadavosti, ako obilný škrob, zemiakový škrob, kyselina algínová a pod.; lubrifikátory ako stearan horčíka; a sladidlá, ako sacharóza, fruktóza, laktóza alebo aspartát, alebo esenciálne oleje, ako mentol, olej wintergreen alebo sa môže pridať čerešňová aróma. Ak je jednotkovou dávkovou formou kapsula, môže okrem vymenovaných látok obsahovať rozpúšťadlo ako rastlinný olej alebo polyetylénglykol. Prítomné môžu byť rôzne ďalšie látky ako povrchové polevy alebo látky inak modifikujúce fyzikálnu formu pevnej jednotkovej dávkovej formy. Napríklad tablety, pilulky alebo kapsuly môžu byť potiahnuté želatínou, voskom, šelakovou živicou, cukrom a pod. Forma sirupu alebo elixíru môže obsahovať aktívnu zlúčeninu, sacharózu alebo fruktózu ako sladidlo, metyl a propylparabény ako konzervačné prostriedky, farby a čerešňovú alebo pomarančovú arómu ako dochucovadlá. Prirodzene, každá látka použitá na prípravu akejkoľvek jednotkovej dávkovej formy by mala byť farmaceutický akceptovateľná a v použitom množstve netoxická. Navyše, aktívna zlúčenina môže byť inkorporovaná do preparátov a prostriedkov s riadeným uvoľňovaním.

Zlúčeniny alebo zmesi môžu byť tiež podané intravenózne alebo intraperitoneálne infúziou alebo injekciou. Roztoky aktívnej zlúčeniny alebo jej soli sa môžu pripraviť vo vode, prípadne sa môžu miešať s netoxickým surfaktantom. Disperzie sa môžu pripraviť v glycerole, tekutých polyetylenglykoloch, triacetíne a v ich zmesiach a v olejoch. Za normálnych podmienok uskladnenia a použitia obsahujú tieto prípravky konzervačné prostriedky na ochranu pred rastom mikroorganizmov.

Farmaceutické dávkové formy vhodné na injekcie alebo na infúzie môžu obsahovať sterilné vodné roztoky alebo disperzie, alebo sterilné prášky obsahujúce aktívnu zložku, ktoré sú prispôsobené na okamžitú prípravu sterilných injekčných alebo infúznych roztokov alebo disperzií, prípadne sú enkapsulované v lipozómoch. Vo všetkých prípadoch by mala byť konečná dávková forma sterilná, tekutá a stabilná v podmienkach výroby a uskladnenia. Tekutý nosič alebo vehikulum môže byť rozpúšťadlo alebo tekutá disperzia obsahujúca napr. vodu, etanol, polyol (napr. glycerol, propylenglykol, tekuté polyedtylénglykoly a pod.), rastlinné oleje, netoxické estery glycerolu a ich vhodné zmesi. Náležitá tekutosť sa môže udržať napr. tvorbou lipozómov dodržaním požadovanej veľkosti častíc v prípade disperzií alebo použitím surfaktantov. Prevencia pôsobenia mikroorganizmov sa môže dosiahnuť rôznymi antibakteriálnymi a antifungálnymi látkami, napr. parabénmi, chlórbutanolom, fenolom, kyselinou sorbovou, timerosalom a pod. V mnohých prípadoch je vhodnejšie použiť izotonické látky, napr. cukry, pufre alebo chlorid sodný. Predĺžená absorpcia injekčných zmesí sa môže dosiahnuť použitím látok spomaľujúcich absorpciu, ako napr. monosterát alumínia a želatína.

Sterilné injekčné roztoky sa môžu pripraviť inkorporovaním aktívnej zlúčeniny v požadovanom množstve do vhodného rozpúšťadla s rôznymi ďalšími uvedenými zložkami a v prípade potreby s následou filtračnou sterilizáciou. V prípade sterilných práškov na prípravu sterilných injekčných roztokov sú preferovanými me6 tódami prípravy techniky vákuového a zmrazovacieho sušenia, ktoré ponechávajú prášok aktívnej zložky plus požadované aditívum prítomné v predtým sterilné filtrovaných roztokoch.

Na lokálne podávanie môžu byť prítomné zlúčeniny aplikované v čistej forme, t. j. ak sú to tekutiny. Vo všeobecnosti je však žiaduce podávať ich na kožu ako zmesi alebo zostavy v kombinácii s dermatologicky prijateľným nosičom, ktorý môže byť pevný alebo tekutý.

Použiteľné pevné nosiče zahŕňajú jemne rozmelnené tuhé látky, ako sú talok, hlina, mikrokryštalická celulóza, kremeň a pod. Použiteľné tekuté nosiče zahŕňajú vodu, alkoholy alebo glykoly, alebo zmesi voda-alkohol/glykol, v ktorých môže byť prítomná zlúčenina rozpustená alebo dispergovaná na účinnú úroveň, voliteľne s pomocou netoxických surfaktantov. Adjuvanty, ako sú voňavky a ďalšie antimikrobiálne látky, sa môžu pridať na optimalizáciu vlastností na dané použitie. Výsledné tekuté zlúčeniny sa môžu aplikovať z absorbujúcich podušiek, na impregnáciu bandáží a iných obväzov, alebo sprejovať na zasiahnutú oblasť pomocou pumpovacích alebo aerosólových sprejov. Zahusťovadlá, ako syntetické polyméry, mastné kyseliny, soli a estery mastných kyselín, mastné alkoholy, modifikované celulózy alebo modifikované minerálne materiály sa môžu tiež použiť s tekutými nosičmi na tvorbu rozoberateľných pást, gélov, mastí, mydiel a pod. na aplikáciu priamo na kožu používateľa.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález je ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi, ktoré prezentujú merania inhibície aldo-ketozareduktáz látkami (la) - (Ie). Uvedené príklady neobmedzujú rozsah nárokov patentu. Odborníkom v danej oblasti je zrejmé, že mnohé modifikácie z hľadiska materiálov a metód možno uplatniť bez zúženia účelu a obsahu tohto vynálezu.

N

SH .O

OH (Ial

OH (Ibl

íle')

He')

Príklad 1

Inhibícia aldózareduktázv (ALR2) na úrovní izolovaného enzýmu in vitro

Príprava ALR2. ALR2 z potkaních šošoviek bola čiastočne purifikovaná metódou adaptovanou podľa

Hayman a Kinoshita [J Biol Chem. 240: 877-882 (1965)] nasledovne: šošovky boli rýchlo vypreparované z potkanov po ich eutanázii a homogenizované v sklenenom homogenizátore s teflónovým piestom v 5 objemoch chladnej destilovanej vody. Homogenát sa centrifugoval pri 10 000 g pri 0 až 4 °C počas 20 min. Supernatant sa precipitoval nasýteným sulfátom amónnym postupne pri 40 %, 50 %, potom pri 75 % nasýtení.

Po prvých dvoch precipitáciách sa použil supernatant. Sediment z posledného kroku, obsahujúci ALR2 aktivitu, sa dispergoval v 75 % sulfáte amónnom a bol uložený v menších alikvotných častiach v kontajneri s tekutým dusíkom.

Enzýmová skúška. ALR2 aktivita sa merala spektrofotometricky [Stefek et al. Bioorg Med Chem. 16:4908-4920 (2008)] prostredníctvom stanovenia spotreby NADPH pri 340 nm a vyjadrila sa ako pokles optickej denzity (O.D.)/s/mg proteínu. Reakčná zmes obsahovala 4,67 mM d,l-glyceraldehyd ako substrát, 0,11 mM NADPH, 0,067 M fosfátový pufer, pH 6,2 a 0,05 ml enzýmového preparátu v celkovom objeme 1,5 ml. Referenčná prázdna vzorka obsahovala všetky menované zložky s výnimkou substrátu d,l-glyceraldehydu, aby sa korigovala oxidácia NADPH nasúvisiaca s redukciou substrátu. Enzýmová reakcia sa iniciovala pridaním d,l-glyceraldehydu a monitorovala sa počas 4 min. po úvodnej 1 minútovej perióde pri 30 °C. Aktivity enzýmu sa adjustovali zriedením enzýmových preparátov destilovanou vodou tak, aby 0,05 ml preparátu poskytlo priemernú reakčnú rýchlosť pre kontrolné vzorky v rozsahu 0,020 ± 0,005 jednotiek absorbancie/min. Vplyv inhibítorov na enzýmovú aktivitu sa stanovil pridaním inhibítora do reakčnej zmesi v požadovaných koncentráciách. Inhibítor s rovnakou koncentráciou bol pridaný do referenčnej vzorky. Hodnoty IC50 (koncentrácia inhibítora potrebná na dosiahnutie 50 % inhibície enzýmovej reakcie) sa stanovila metódou najmenších štvorcov z lineárnej časti semilogaritmických inhibičných kriviek. Každá krivka bola tvorená prinajmenšom použitím štyroch koncentrácií inhibítora spôsobujúce inhibíciu v rozsahu od prinajmenšom 25 do 75 %.

Tabuľka 1

Inhibičný účinok látok Ia-Ie na ALR2 z potkanej šošovky

Látka	ICso(gM)
la	0,106 + 0,004
lb	2,25 + 0,06
Ic	4,18 ±0,80
ld	0,319 + 0,031
Ie	2,06 + 0,17

Výsledky sú priemerné hodnoty ± SD z minimálne troch meraní.

Príklad 2

Inhibícia aldehydreduktázy (ALR1) na úrovni izolovaného enzýmu in vitro Príprava ALR1. ALR1 sa čiastočne purifikovala z potkaních ľadvín, ako je opísané podľa Constantino et al. [Chem. 42:1881-1893 (1999)] nasledovne: ľadviny sa rýchlo vyňali potkanom po eutanázii a homogenizovali nožovým homogenizátorom a následným spracovaním v sklenenom homogenizátore s teflónovým piestom v 3 objemoch 10 mM natrium fosfátového pufru, pH 7,2, obsahujúcom 0,25 M sacharózu, 2,0 mM EDTA dvojdraselná soľ a 2,5 mM β-merkaptoetanol. Homogenát sa centrifugoval pri 16 000 g pri 0 až 4 °C počas 30 min. a supernatant sa podrobil frakčnej precipitácii sulfátom amónnym pri 40 %, 50 % a 75 % saturácii. Sediment získaný z poslednej precipitácie, majúci ALR1 aktivitu, sa znova rozpustil v 10 mM sodného fosfátového pufru, pH 7,2, obsahujúcom 2,0 mM EDTA dvojdraselnú soľ a 2,0 mM β-merkaptoetanol, aby sa dosiahla koncentrácia proteínov približne 20 mg/ml. Do roztoku sa pridala živica DEAE DE 52 (33 mg/ml) a po miernom miešaní počas 15 min. sa odstránila centrifngáciou. Supernatant obsahujúci ALR1 sa potom skladoval v menších alikvotných častiach v tekutom dusíku. Žiadna významná kontaminácia ALR2 v preparátoch ALR1 nebola zaznamenaná, keďže žiadna spotreba NADPH nebola zaznamenaná v prítomnosti glukózy až do koncentrácie 150 mM.

Enzýmová skúška. Aktivita ALR1 sa merala spektrofotometricky [Stefek et al. Bioorg Med Chem. 16:4908-4920 (2008)] stanovením spotreby NADPH pri 340 nm a vyjadrila sa ako pokles optickej denzity (O.D.)/s/mg proteínu. Reakčná zmes obsahovala 20 mM D-glukuronátu ako substrátu, 0,12 mM NADPH v 0,1 M fosfátovom pufŕe pH 7,2 a 0,05 ml enzýmového preparátu v celkovom objeme 1,5 ml. Referenčná prázdna vzorka obsahovala všetky menované zložky s výnimkou substrátu D-glukuronátu, aby sa korigovala oxidácia NADPH nasúvisiaca s redukciou substrátu. Enzýmová reakcia sa iniciovala pridaním D-glukuronátu a monitorovala sa počas 4 min. po počiatočnej perióde po úvodnej 1 minútovej perióde pri 37 °C. Aktivity enzýmu sa adjustovali zriedením enzýmových preparátov destilovanou vodou tak, aby 0,05 ml preparátu poskytlo priemernú reakčnú rýchlosť pre kontrolné vzorky v rozsahu 0,020 ± 0,005 jednotiek absorbancie/min. Vplyv inhibítorov na enzýmovú aktivitu sa stanovil pridaním inhibítora do reakčnej zmesi v požadovaných koncentráciách. Inhibítor s rovnakou koncentráciou sa pridal do referenčnej vzorky. Hodnoty IC50 (koncentrácia inhibítora potrebná na dosiahnutie 50 % inhibície enzýmovej reakcie) sa stanovili metódou najmenších štvorcov z lineárnej časti semilogaritmických inhibičných kriviek. Každá krivka bola tvorená prinajmenšom použitím štyroch koncentrácií inhibítora spôsobujúce inhibíciu v rozsahu od prinajmenšom 25 do 75 %.

Tabuľka 2

Inhibičný účinok látok Ia-Ie na ALR1 z potkanej obličky

Látka	ICso/I (%, c = 10 pM)
la	40,6 + 2,1/22,71 +4,41
lb	> 10/1,18 + 4,35
lc	> 10 / 23,48 + 2,11
Id	19,56 + 5,38/27,06 + 7,38
Ie	14,13 + 0,36/35,67 + 0,89

Výsledky sú priemerné hodnoty ± SD z minimálne troch meraní.

Príklad 3

Inhibícia aldo-ketoreduktáz AKR1B1 a AKR1B10 na úrovni izolovaných enzýmov in vitro

Príprava bunkových frakcií obohatených na rekombinantný enzým AKR1B10. Bunky COS-7, získané z ATCC, boli kultivované v DMEM (Dulbecco's Modlified Eagle's Médium) obsahujúcom 10 % FBS (fetálne bovinné sérum), 2 mM glutamín, 100 U/ml penicilín a 100 pg/ml streptomycín. Na uskutočnenie transfekcie sa bunky nechali rásť do 70 % - 80 % konfluencie. Tesne pred transfekciou kultivačné médium bolo nahradené DMEM s prídavkom 10 % FBS. Uskutočnila sa prechodná transfekcia buniek plazmidom pCEFLKZ- AU5 obsahujúcim AKR1B10 ORF, s použitím činidla Lipofectamin 2000, v pomere 1 pg DNA na 3 pl Lipofectaminu. Po 5-hodinovej inkubácii médium na transfekciu bolo nahradené kompletným médiom. Bunky boli inkubované 48 hodín. Následne bunky boli zoškrabané a zhromaždené v chladnom izotonickom fosfátovom pufri a lyzované v 50 mM fosfátovom pufri, pH 6,8 v prítomnosti 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 320 pg/pl Pefablock, 0,1 mM nátrium ortovanadátu, a proteázových inhibítorov (leupeptín, aprotinín a inhibítor trypsínu, 2 pg/pl každého), núteným prechodom cez 261/2G striekačku.

Enzýmová skúška AKR1B1 a AKR1B10. Testovacie zmesi obsahovali natrium fosfátový pufor (0,1 M; pH 6,8), definovanú váhu (pg) proteínov, 0,2 mM NADPH kofaktor, 10 mM _DL-glyceraldehyd. Látka I bola pridaná ako roztok v DMSO, pri finálnej koncentrácii DMSO 1 %. Skúška aktivita začala pridaním AKR proteínu do kyvety. Po 4 min. inkubácii pri laboratórnej teplote enzýmová aktivita sa vyhodnotila na základe spotreby NADPH pri 340 nm (ε₃₄₀ nadph = 6200 M'Ám¹) na Ultrospec 4300 spektrofotometri (GE Biosciences). Uskutočnilo sa blankovanie na príspevok inhibítorov k absorbancii pri 340 nm. Enzýmová aktivita bola vyjadrená v nmol/min/mg proteínu. S100 frakcie z COS-7 buniek bez transfekcie neobsahovali AKR aktivitu.

Tabuľka 3

Inhibičný účinok látky la na humánne enzýmy AKRI B1 a AKR1B10

Látka	ICso(pM)
AKR1B1	AKR1B10
la	0,48 + 0,29	3,69 + 0,53

Výsledky sú priemerné hodnoty ± SD z najmenej troch meraní.

Príklad 4

Inhibícia aldózareduktázy (ALR2) na orgánovej úrovni (izolovaná očná šošovka) in vitro

Stanovenie sorbitolu v očných šošovkách. Zvieratá v ľahkej éterovej anestéze boli usmrtené odkrvením po prerušení krčnej tepny a očné buľvy boli oddelené. Očné šošovky sa rýchlo vypreparovali a opláchly fyziologickým roztokom. Látka I rozpustená v DMSO sa pridala do skúmaviek obsahujúcich čerstvo vypreparované šošovky (1 šošovka v skúmavke) v médiu M-199 pri pH 7,4, prebublaného pri 37 °C pneumoxidom (5 % CO₂, 95 % O₂), v požadovaných koncentráciách, 30 min. pred pridaním glukózy. Konečná koncentrácia DMSO vo všetkých inkubáciách bola 1 %. Inkubácie sa začali pridaním glukózy v konečnej koncentrácii 50 mM a pokračovali pri 37 °C, za občasného (približne 30 min. intervaly) prebublávania zmesi (počas 30 s) pneumoxidom. Inkubácie sa ukončili po 3 hodinách ochladením zmesi na ľadovom kúpeli, a následným krátkym premytím 3x s vychladeným izotonickým fosfátovým pufŕom (1 ml). Uprednostňovali sa krátkodobé kultivácie, aby sa zabránilo podstaným zmenám permeability šošovky. Premyté šošovky sa udržovali hlboko zamrazené až do stanovenia sorbitolu, ktoré sa uskutočnilo, ako bolo opísané predtým [Juskova et al. General Physiology and Biophysics, 28, 325-330 (2009). Po odčítaní príslušných blankov obsah sorbitolu v nmol/g vlhkej hmotnosti šošovky sa stanovil porovnaním s kalibračnou priamkou sorbitolových štandardov.

Tabuľka 4

Vplyv látky la na akumuláciu sorbitolu v izolovaných očných šošovkách potkana inkubovaných s glukózou“

Inkubácia	Sorbitol (nmol/g)	n
- Glukóza	233,99 + 7,80 b	15
+ Glukóza	772,90 + 19,70	17
+ Glukóza + la (1.0 μΜ)	668,66 + 54,15	4
+ Glukóza +Ia (10 μΜ)	536,01 + 25,90°	7
+ Glukóza + la (50 μΜ)	478,71 +30,99°	4
+ Glukóza + la (100 μΜ)	395,06 + 23,83°	10

Výsledky sú priemerné hodnoty ± SEM z n nezávislých meraní. “Glukóza, 50 mM; čas inkubácie, 3 h; 37 °C. ^bp<0.001 vs. (+)Glukóza (Študentov t-test).

°p<0.001 vs. (+)Glukóza (Študentov t-test).

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (3)

1. 5-Karboxymetyl-3-merkapto-l,

2,4-triazino-[5,6-b]indoly všeobecného vzorca (I), v ktorom

Ri je a ich farmaceutický akceptovateľné soli, hydráty a solváty, na použitie na liečenie humánnych a veterinárnych chorôb, pri ktorých aktivity aldo-keto reduktáz AKR1B1 a AKR1B10 sú kľúčovými etiologickými faktormi pre ich vývoj a progresiu, ako sú diabetické komplikácie makro- a mikroangiopatia, ateroskleróza, retinopatia, katarakta, nefropatia, neuropatia a strata kostnej masy, zápalové ochorenia, ako sú uveitída, sepsa,

20 periodontitída, astma a rakovina hrubého čreva, abnormálna proliferácia vaskulárnych hladkosvalových buniek počas aterosklerózy a restenózy, karcinóm pľúc u fajčiarov, rakovina pľúc, prsníka, pečene, prostaty, pankreasu, rakovina endometria, cervikálna rakovina a adenokarcinóm krčka maternice, ochorenia ženského reprodukčného systému, ako sú poruchy menštruačného cyklu afertility, menštruačné ťažkosti, časovanie pôrodu, poruchy nálad, psychiatrické a neurologické ochorenia.

25 2. Farmaceutický prostriedok obsahujúci ako účinnú látku jednu zo zlúčenín všeobecného vzorca (I) a ťarmaceuticky prijateľný nosič na použitie na liečenie humánnych a veterinárnych chorôb, pri ktorých aktivity aldo-keto reduktáz AKR1B1 a AKR1B10 sú kľúčovými etiologickými faktormi pre ich vývoj a progresiu, ako sú diabetické komplikácie makro- a mikroangiopatia, ateroskleróza, retinopatia, katarakta, nefropatia, neuropatia a strata kostnej masy, zápalové ochorenia, ako sú uveitída, sepsa, periodontitída, astma a rakovina hrubého čreva, abnormálna proliferácia vaskulárnych hladkosvalových buniek počas aterosklerózy a restenózy, karcinóm pľúc u fajčiarov, rakovina pľúc, prsníka, pečene, prostaty, pankreasu, rakovina endometria, cervikálna rakovina a adenokarcinóm krčka maternice, ochorenia ženského reprodukčného systému, ako sú poruchy menštruačného cyklu a fertility, menštruačné ťažkosti, časovanie pôrodu, poruchy nálad, psychiatrické

5 a neurologické ochorenia.

3. Farmaceutický prostriedok obsahujúci účinné množstvo látky všeobecného vzorca (I), v pevnej, orálnej alebo injekčnej liekovej forme na systémové podanie, alebo vo forme kvapiek, pást, gélov alebo mastí na lokálne podanie, na použitie na liečenie humánnych a veterinárnych chorôb, pri ktorých aktivity aldo-keto reduktáz AKRI BI a AKR1B10 sú kľúčovými etiologickými faktormi pre ich vývoj a progresiu, ako sú diabe10 tické komplikácie makro- a mikroangiopatia, ateroskleróza, retinopatia, katarakta, nefŕopatia, neuropatia a strata kostnej masy, zápalové ochorenia, ako sú uveitída, sepsa, periodontitída, astma a rakovina hrubého čreva, abnormálna proliferácia vaskulárnych hladkosvalových buniek počas aterosklerózy a restenózy, karcinóm pľúc u fajčiarov, rakovina pľúc, prsníka, pečene, prostaty, pankreasu, rakovina endometria, cervikálna rakovina a adenokarcinóm krčka maternice, ochorenia ženského reprodukčného systému, ako sú poruchy

15 menštruačného cyklu a fertility, menštruačné ťažkosti, časovanie pôrodu, poruchy nálad, psychiatrické a neurologické ochorenia.