SK289100B6 - Zlúčenina cemtirestat disulfid, prekurzor inhibítora aldoketoreduktáz, spôsob jej prípravy, farmaceutický prostriedok s jej obsahom a jej použitie - Google Patents

Abstract

Vynález sa týka prekurzora cemtirestatu, ktorým je cemtirestat disulfid vzorca (I), spôsobu jeho prípravy, farmaceutického prostriedku s jeho obsahom, jeho použitia na liečenie stavov, kde je požadovaná inhibícia aldoketoreduktáz AKR1B1 a/alebo AKR1B10 v bunkách/tkanivách s vysokým obsahom redukovaného glutatiónu GSH, a tiež jeho použitia na liečenie rakoviny, ktorá má pôvod v chronickom zápale, menovite rakoviny hrubého čreva, pľúc, prsníka, pečene, prostaty, pankreasu, endometria a krčka maternice. Vynález sa týka aj použitia cemtirestat disulfidu vzorca (I) na liečbu rakoviny ako adjuvantného terapeutika v kombinácii s klinicky používanými chemoterapeutikami, ktoré sú substrátom aldoketoreduktáz, ako sú napríklad doxorubicín a daunorubicín.

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka farmaceutický použiteľného prekurzora farmakologicky aktívnej zlúčeniny cemtirestatu, ktorá je inhibítorom aldoketoreduktáz, hlavne aldózareduktázy (AR, AKR1B1), spôsobu jeho prípravy, farmaceutického prostriedku s jeho obsahom a jeho použitia na liečenie humánnych a veterinárnych chorôb.

Doterajší stav techniky

Aldoketoreduktázy sú NAD(P)H-závislé oxidoreduktázy, ktoré sú najlepšie charakterizované ako činidlá redukujúce glukózu. Podieľajú sa na patofyziológii diabetických komplikácií. Tieto enzýmy taktiež metabolizujú produkty lipidovej peroxidácie, čím prispievajú za určitých okolností k vzniku zápalovej odozvy.

Aldózareduktáza (AR, AKR1B1) okrem toho, že sa podieľa na diabetických komplikáciách prostredníctvom redukcie glukózy, účinne redukuje aldehydy, vznikajúce peroxidáciou lipidov, ako aj ich konjugáty s glutatiónom (Ramana, BioMol Concepts 2:103-114, 2011). Aldehydy vznikajúce peroxidáciou lipidov, ako 4hydroxy-trans-2-nonenál (systémový názov trans 4-hydroxynon-2-én-1-ál) (HNE), a ich glutatiónové konjugáty (napr. GS-HNE), sú účinne redukované pôsobením AR na zodpovedajúce alkoholy, DHN (1,4dihydroxynonén, systémový názov trans non-2-én-1,4-diol) a GS-DHN (glutationyl-1,4-dihydroxynon-2-én), ktoré sprostredkúvajú v organizme zápalové signály. Redukovaný konjugát GS-DHN sa považuje za signálny intermediát v prenose bunkových signálov iniciovaných reaktívnymi formami kyslíka, ktoré môžu v konečnom dôsledku viesť k zápalovej odpovedi (Srivastava et al., Chem Biol Interaction 191:330-338, 2011; Balestri et al., Antioxidants (Basel). 8(10). pii: E502, 2019;; Srivastava et al., Free Radic. Biol. Med. 29: 642-651, 2000; Shoeb et al., Curr. Med. Chem. 21:230-237, 2014). Na bunkových a zvieracích modeloch inhibícia AR účinne eliminovala zápalové signály indukované cytokínmi, rastovými faktormi, endotoxínmi, vysokou glukózou, alergénmi a autoimunitnými reakciami (Ramana and Srivastava, Int. J. Biochem. Cell Biol. 42: 17-20, 2010).

Je veľmi dobre zdokumentované, že chronický zápal je spojený s progresiou rakoviny (Solinas et al. Cancer Metastasis Rev. 29, 243-248, 2010; Khayami et al., J Cell Mol Med. 2020;10.1111/jcmm.15581).

Epidemiologické štúdie naznačujú, že > 25 % všetkých prípadov rakoviny má úzky vzťah k chronickej infekcii a chronickému zápalu (Vendramini-Costa and Carvalho, Curr Pharm Des 18:3831-52, 2012). Bola zaznamenaná zvýšená expresia aldoketoreduktáz v tumoroch pľúc, prsníka, prostaty, krčka maternice, testes a hrubého čreva (Liu et al., Recent Pat Anticancer Drug Discov. 4:246-53, 2009; Laffin and Petrash, Front Pharmacol. 3:104, 2012; Terzig et al. Gastroenterology. 138:2101-2114, 2010; Reddy et al., Breast 31:137-143, 2017). Navyše zvýšená expresia AKR1B1 v rôznych typoch rakoviny spôsobuje rezistenciu na doxorubicín, čo sa vysvetľuje zvýšenou detoxifikáciou doxorubicínu redukciou jeho karbonylu sprostredkovanou AKR1B1 (Lee et al., Anticancer Drugs 2:129-32, 2001). Viaceré štúdie naznačili, že inhibícia AKR1B1 ako adjuvantná terapia zvýšila senzitivitu tumorov na protirakovinovú terapiu alebo zmiernila nežiaduce vedľajšie účinky (Banala et al., Biomater Sci. 7:2889, 2019; Khayami et al., J Cell Mol Med. 2020;10.1111/jcmm.15581).

Okrem AKR1B1 sa na viacerých typoch rakoviny podieľa aj príbuzný enzým AKR1B10 (Penning, Clin Cancer Res. 11:1687-90, 2005; Fukumoto et al., Clin Cancer Res. 11:1776-1785, 2005; Yan et al., Int J Cancer. 121:2301-6, 2007; Zhao et al., Eur J Med Chem. 45(9):4354-7, 2010; Matsunaga et al. Front Pharmacol. 3:5.2012; Laffin and Petrash, Front Pharmacol. 3:104, 2012; Liu et al., Biochem J. 442:273-82, 2012). AKR1B10 je 36-kDa cytosolická reduktáza, ktorá je podobná AKR1B1 sekvenciou aminokyselín (71 % identita), ako aj terciárnou štruktúrou s „(α/β)8 barrel topológiou. Podobne ako AKR1B1 aj enzým AKR1B10 redukuje rozmanité aromatické a alifatické aldehydy, dikarbonylové zlúčeniny a niektoré liečivá obsahujúce karbonylovú skupinu s využitím NADPH ako koenzýmu. AKR1B10 je za normálnych okolností produkovaný v gastrointestinálnom trakte. K zvýšenej expresii dochádza v mnohých tumoroch, ako je hepatálny, pľúcny a prsníkový karcinóm. AKR1B10 sa môže podieľať na vzniku karcinómov viacerými mechanizmami a môže byť užitočným biomarkerom na diagnózu rakoviny a potenciálnym terapeutickým cieľom (Huang et al., Recent Pat Anticancer Drug Discov. 11: 184-196, 2016). Umlčanie expresie AKR1B10 viedlo k inhibícii proliferácie buniek kolorektálneho karcinómu (Yan et al. Int J Cancer. 121:2301-6 2007).

Bola potvrdená úloha aldoketoreduktáz v etiológii kolorektálneho karcinómu (Tammali et al., Cancer Res. 66, 9705-9713, 2006; Tammali et al., Cancer Lett. 252, 299-306, 2007). Analýza bunkových línií kolorektálneho karcinómu naznačila, že vysoké hladiny expresie AKR1B1 and AKR1B10 významne korelovali s progresiou ochorenia (Taskoparan et al., Cell Oncol (Dordr). 40:563-578, 2017). Inhibícia aldózareduktázy sa tak javí ako perspektívny terapeutický cieľ pri liečbe kolorektálneho karcinómu (Grewal et al., Mini Rev Med Chem. 16, 120162, 2016; Saxena, et al. Cancer Lett. 355, 141-147, 2014; Saxena et al., Eur J Cancer. 49(15):3311-9, 2013;

Tammali et al., Carcinogenesis, 32:1259-1267, 2011; Shoeb et al., Free Radic. Biol. Med. 63:280-290, 2013, Tammali et al., Carcinogenesis 8:1259-67, 2011; Tammali et al., Curr Cancer Drug Targets. 11:560-71, 2011; Ramana et al., Mol Cancer Ther. 9:813-24, 2010; Shukla et al., Cancer Lett. 28; 411: 57-63, 2017).

V štúdiách na bunkových kultúrach HeLa (Ji et al., Mol Biol Rep 47:6091-6103, 2020) inhibítor aldózareduktázy epalrestat inhiboval progresiu tumorov inhibíciou AKR1B1 a bol navrhnutý ako nové liečivo rakoviny krčka maternice (cervical cancer). V štúdii na myšiach SCID (Wu X, et al., J Exp Med. 214:1065-1079, 2017) epalrestat dramaticky inhiboval progresiu bazálneho typu rakoviny prsníka.

Inhibítor aldózareduktázy fidarestat in vitro a in vivo zvyšoval citlivosť rakovinových buniek k oxidačnému stresu a potláčal ich rast (Shukla et al., Cancer Lett. 411:57, 2017), inhiboval angiogenézu a potláčal tumorovú proliferáciu (Tammali et al., Angiogenesis 14:209, 2011).

Patent US 2011092566 sa týka metód liečby rakoviny pľúc, prsníka a prostaty a potlačenia metastáz spojených s rakovinou hrubého čreva s využitím inhibítorov aldózareduktázy.

Autori Banala a spol. (Biomater Sci. 7:2889, 2019) vyvinuli micelárny nosič inhibítora aldózareduktázy epalrestatu (EPR) na báze disulfidového (systémový názov „disulfánového) konjugátu s tokoferol-polyetylén-glykol-sukcinátom (TPGS). V redukujúcom prostredí došlo k riadenému uvoľňovaniu epalrestatu štiepením disulfidickej (systémový názov „disulfánovej) väzby konjugátu EPR-S-S-TGPS.

Patent P 285588 opisuje biologicky prijateľné disulfidy kyselinu tioktovú, kyselinu tetranorlipoovú, kyselinu bisnorlipoovú a kyselinu 8-hydroxy-bisnorlipoovú v zmesi s esenciálnymi mastnými kyselinami na liečenie a prevenciu diabetu, inzulínovej rezistencie alebo komplikácií pri diabete.

Patenty WO2019040825 a WO2017064675 opisujú použitie chemoterapeutického činidla v konjugáte na báze disulfidu na liečbu rakoviny.

Patent US 20010036926 opisuje látky s labilnou disulfidickou väzbou, ktoré sa aktivujú za fyziologických podmienok vplyvom voľných tiolov.

Zmienené zistenia naznačujú, že inhibítory AKR1B1 a AKR1B10 majú predpoklad uplatniť sa v liečbe rakoviny ako nové terapeutiká. Inhibítory AKR1B1, ako sú deriváty kyseliny octovej (epalrestat, tolrestat, zenarestat), spirohydantoíny (sorbinil) alebo zlúčeniny zo skupiny sukcínimidov (ranirestat) sa skúmali hlavne z hľadiska ich úlohy v prevencii diabetických komplikácií (Hotta, Biomed Pharmacother. 5, 244-250 1995; Costantino et al. Expert Opin Ther Patents. 10,1245-1262, 2000; Miyamoto, Expert Opin Ther Patents. 2002, 12, 621-631 2002; Srivastava et al. Endocr Rev. 26, 380-392 2005). Pri hľadaní lepších AKR inhibítorov sa záujem posunul v posledných rokoch smerom k novým chemotypom (Alexiou et al., Curr Med Chem. 16:73452, 2009; Chatzopoulou et al., Expert Opin Ther Pat. 11:1303-23, 2012).

I keď sa extenzívne študoval rad inhibítorov aldoketoreduktáz, žiaden z nich nepreukázal dostatočnú účinnosť v humánnych klinických skúškach bez nežiaducich vedľajších účinkov. Teda stále je požiadavka na vývoj nových, účinných a bezpečných inhibítorov aldoketoreduktáz AKR1B1 a AKR1B10 ako potenciálnych liečiv diabetických komplikácií, zápalových ochorení a rakoviny.

Kyselina 3-merkapto-5H-l,2,4-triazino[5,6-Ď]indol-5-octová (cemtirestat (II), systémový názov kyselina 2-(3-tioxo-2,3-dihydro-5H-[l,2,4]triazino[5,6-ó]indol-5-yl)octová, bola navrhnutá a patentovaná ako vysoko účinný a selektívny inhibítor aldózareduktázy s antioxidačnými vlastnosťami (Stefek et al., Patent 288508; Stefek et al., J Med Chem. 58:2649-57, 2015; Prnova et al., RedoxRep. 20:282-8 2015; Soltesova Prnova et al., Physiol Res. 64:587-91, 2015; Stefek et al. IJASEAT 4:41-44, 2016; Zhan et al., J Biomol Struct Dyn. 37:17241735, 2018, Soltesova Prnova et al,. Neuroscience 443:206-217, 2020; Valachová et al., Int J Mol Sci. 21: E5609,2020). Nedávno bola opísaná schopnosť cemtirestatu (II) zmierňovať symptómy periférnej neuropatie pri ZDF a STZ-indukovaných diabetických potkanoch. (Soltesova Prnova et al., Neurochem Res. 44:1056-1064, 2019; Prnova et al., Naunyn Schmiedebergs Árch Pharmacol. 393:651-661 2020). Bola preukázaná mimoriadne nízka cytotoxicita cemtirestatu (II) in vitro a navyše neboli zaznamenané žiadne významné zmeny pri potkanoch Wistar v 120-dňovom toxikologickom teste (Soltesova Prnova etal., Interdiscip. Toxicol. 12:120128 2019).

(II) Cemtirestat (II) vjeho dvoch tautomérnych formách

Hoci cemtirestat (II) vykazuje účinnú inhibíciu aldoketoreduktáz AKR1B1 a AKR1B10 charakterizovanú hodnotami IC₅o = 0,48 ±0,29, resp. 3,69 ±0,53 pM (Stefek et al., J Med Chem. 58:2649-57, 2015), bolo by výhodné zlepšiť jeho farmakokinetické vlastnosti tak pri orálnom, ako aj pri parenterálnom podaní, pričom takéto žiaduce zlepšenia zahŕňajú predovšetkým zlepšenú absorpciu z gastrointestinálneho traktu, predĺženie trvania účinku aktívnej zlúčeniny a najmä cielenú distribúciu do rakovinových buniek. Orálne a parenterálne podávanie aktívnych inhibítorov aldoketoreduktáz môže viesť k neželaným účinkom v dôsledku vysokej lokálnej koncentrácie v zdravých tkanivách, ako je hepatotoxicita, poruchy trávenia, poruchy funkcie obličiek, spermií a iné.

Vynález navrhuje uvedené problémy riešiť využitím terapeutickej stratégie založenej na podaní prekurzora účinného liečiva. Pri tejto stratégii („prodrug strategy) založenej na podaní prekurzora liečiva dochádza k uvoľneniu aktívneho liečiva po chemickej alebo metabolickej aktivácii neaktívneho prekurzora v mieste požadovaného účinku. Týmto prístupom sa môže výrazne zvýšiť dostupnosť liečiva v mieste účinku a znížiť toxicita v porovnaní s priamym podaním liečiva.

Cemtirestat disulfid I bol syntetizovaný a testovaný s cieľom získať prekurzor účinného inhibítora aldózareduktázy. S ohľadom na kľúčovú úlohu aldoketoreduktáz AKR1B1 a AKR1B10 v etiológii viacerých typov rakoviny súvisiacich s chronickým zápalom, ako je uvedené, sa prijala hypotéza, podľa ktorej uvoľnenie cemtirestatu (II) vnútri nádorových buniek redukciou jeho prekurzora glutatiónom GSH by zvýšilo účinnosť a hlavne selektivitu pôsobenia liečiva. Tento koncept je založený na skutočnosti, že hladiny redukovaného glutatiónu v tumoroch sú 10- až 1000-násobne vyššie v porovnaní so zdravými tkanivami alebo extracelulárnym prostredím (Saito et al., Adv Drug Deliv Rev. 55:199, 2003; Wang et al., Current Organic Chemistry. 20:1477, 2016; Turell et al., Free Radic Biol Med. 65:244, 2013). Očakáva sa, že disulfidová väzba zostane stabilná v krvnej cirkulácii, zatiaľ čo sa rozštiepi po vstupe do tkaniva tumoru vďaka vysokej hladine GSH v jeho bunkách. Prodrug stratégia založená na využití redox senzitívnych disulfidov je široko rozpracovaná predovšetkým v terapii rakoviny ako prostriedok cielenej distribúcie chemoterapeutík do rakovinových buniek (Meng et al., Biomaterials. 30:2180, 2009; Yang et al. J Phys Chem B. 118:12311, 2014; Brulisauer et al., J Control Release. 195:147, 2014; Li et al., Asian J Pharm Sci. 15:311, 2020).

Podľa získaných vedomostí je toto prvý príklad prekurzora inhibítora aldózareduktázy na báze disulfidu. Doposiaľ patentované a publikované prekurzory inhibítorov aldózareduktázy sú na báze esterov (Bruno et al., Bioorg Med Chem. 10:1077, 2002; Da Settimo et al., J Med Chem. 46:1419-28, 2003; Da Settimo et al., Med Chem. 48: 6897-907,2005; Rakowitz et al., Eur J Pharm Sci. 15:11-20,2002; Sunkara et al., J Pharm Pharmacol. 52:1113, 2000) alebo amidov (Wrobel et al. J Med Chem. 34:2504,1991).

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je zlúčenina cemtirestat disulfid {kyselina 2,2'-(disulfandiyl-bis(5H-[l,2,4]triazino[5,6-ô]indol-3,5-diyI))dioctová} vzorca (I):

,COOH

HOOC (D alebo jej farmaceutický prijateľná forma: mono či dvojsýtna soľ, mono- či di-estery amidy, alebo ich kombinácie.

Podstatou vynálezu popri štruktúre cemtirestat disulfidu vzorca (I) je aj spôsob jeho prípravy, ktorý zahŕňa nasledujúce kroky:

- pôsobenie miernym oxidačným činidlom NaNO2 v kyseline octovej na zlúčeninu cemtirestat vzorca (II) n-nh

pri laboratórnej sa teplote;

pričom produkt vzorca (I) vypadáva už počas reakcie z reakčnej zmesi;

-filtrácia, premytie produktu ľadovou vodou a vychladeným metanolom;

- sušenie produktu vzorca (I) pomocou postupného vákua získaného vodnou vývevou a následne olejovou vývevou z 3 000 Pa na 0,1 Pa.

V jednom uskutočnení vynálezu je zlúčenina cemtirestat disulfid vzorca (I) alebo jej farmaceutický prijateľná forma spomenutá na použitie ako liečivo.

V ďalšom uskutočnení vynálezu je zlúčenina cemtirestat disulfid vzorca (I) alebo jej farmaceutický prijateľná forma spomenutá na použitie na liečenie stavov, kde je požadovaná inhibícia aldoketoreduktáz AKR1B1 a/alebo AKR1B10 v bunkách/tkanivách s vysokým obsahom GSH (redukovaného glutatiónu).

V ďalšom uskutočnení vynálezu je zlúčenina cemtirestat disulfid vzorca (I) alebo jej farmaceutický prijateľná forma spomenutá na použitie na liečenie rakoviny, ktorá má pôvod v chronickom zápale, menovite rakovina hrubého čreva a konečníka, rakovina pľúc, prsníka, pečene, pankreasu, prostaty, endometria a krčka maternice.

V ďalšom uskutočnení vynálezu je zlúčenina cemtirestat disulfid vzorca (I) alebo jej farmaceutický prijateľná forma spomenutá na použitie na liečenie rakoviny ako adjuvantné terapeutikum v kombinácii s klinicky používanými chemoterapeutikami, ktoré sú substrátom aldoketoreduktáz, ako sú napríklad doxorubicín a daunorubicín.

V ešte ďalšom uskutočnení vynálezu je prekurzor cemtirestatu (II), ktorým je zlúčenina cemtirestat disulfid vzorca (I) alebo jej farmaceutický prijateľná forma spomenutá na použitie ako liečivo.

V ešte ďalšom uskutočnení vynálezu je farmaceutický prostriedok obsahujúci ako účinnú látku zlúčeninu cemtirestat disulfid vzorca (I) alebo jej farmaceutický prijateľnú formu spomenutú v zmesi s farmaceutický prijateľným činidlom, riedidlom alebo nosičom (s pomocnou látkou).

Vynález sa tiež týka zlúčeniny vzorca (I) na použite ako liečivo, ako je definované.

Príprava

Zlúčenina I, ktorá je predmetom vynálezu, môže byť pripravená viacerými spôsobmi, ktoré sú dobre známe odborníkom v oblasti organickej syntézy vrátane opísaných metód, alebo ich variáciami. Opísané metódy sú preferované, ale možné metódy prípravy sa neobmedzujú len na tieto.

Vo všeobecnosti, symetrické aromatické disulfidy (systémový názov disulfány) možno pripraviť oxidáciou príslušných aromatických tiolov podľa reakcie uvedenej v schéme 1, postupmi dobre známymi odborníkom v danej oblasti. Ako oxidačné agens možno použiť peroxydisulfáty, napr. (ΝΗ₄)₂5₂Ο₈ alebo K₂S₂O₈ pri zvýšenej teplote v acetonitrile, jód, H₂O₂ alebo NaNO₂ pri laboratórnej teplote v etanole alebo v slabej kyseline, alebo NalO₄ v tuhom stave (Montazerozohori, et al: Molecules 12, 694-702, 2007; Ramadas et al: Organic Preparations and Procedures Int. 28, 352-355, 1996; Phakdeeyothin and Yotphan, Org. & Biomol. Chem. 17, 6432-40, 2019; Firouzabadi et al., Synth. Comm. 28, 1179-87, 1998; Parida, K et al., Chem. Select 1, 490-4, 2016; Carbonnel et al., Chem. Comm. 53, 5706-9, 2017; Owen et al., US6566384, 2003; Teplyakov et al., Org. Lett. 15: 4038-41, 2013; Bráne 2011, ale et al., PCT Int. Appl. 209125191, 2009; Rubino, et al., Chem.Med.Chem. 6,1258-68).

Oxidačné agens

R-SH ---------------► R-S-S-R

Solvent, t °C

Schéma 1

Napríklad možno použiť odskúšaný postup na prípravu zlúčeniny I, znázornený v schéme 2, za podmienok, ktoré použili aj iní autori na inom type substrátu (Abazid, M. et al. Phosphorus, Suifur, and Silicon and the Related Elements 1994, 88 (1-4), 195-206) pri syntéze iných disulfidov.

Schéma 2 Príprava cemtirestat disulfidu I

Cemtirestat vzorca (II), východiskový materiál na syntézu zlúčeniny vzorca (I), môže byť pripravený syntetickými postupmi dobre známymi odborníkom v danej oblasti, ktoré sú opísané v štandardných prácach ako Romanchick and Joullie, Heterocycles 9, 1631, 1978; Neunhoeffer, H.;Wiley, P. E. In Chem. Heterocycl. Compd.; Wiley-lnterscience: New York, 1978, 33, 749; El Ashry, E. S. H.; Rashed, N.; Taha, M. In Advances in Heterocyclic Chemistiy; Katritzky, A.R. Ed.; Academic Press: New York, 59 (1994).

Na prípravu cemtirestatu vzorca (II) môže byť použitý už skôr publikovaný postup Hlaváč et al. J MedChem. 63:369-381, 2020, využívajúci východiskový izatín (a, schéma 3). Reakcia sa uskutočnila deprotonáciou hydridom vápenatým, kedy sa zlúčenina a alkylovala na b v nadbytku etyl-chlóracetátu v DMF za miešania pri 100 °C počas 5 hodín. Následnou kondenzáciou s tiosemikarbazidom v DMF pri 100 °C sa získal semikarbazón c. Nakoniec sa medziprodukt c refluxoval vo vodnom roztoku uhličitanu draselného počas dvoch dní, čím sa získal cemtirestat vzorca (II) v celkovom výťažku 39 %.

Schéma 3 Syntéza cemtirestatu vzorca (II) z izatínu a

Použitie v medicíne a farmácii

Podstatou vynálezu je aj použitie disulfidu I, ktoré spočíva v tom, že je táto látka reduktívne metabolizovaná v tele za tvorby dvoch molekúl cemtirestatu (II), ktoré majú farmakologickú aktivitu. Preto je indikovaná ako farmaceutikum a obzvlášť ako prekurzor pre aktívnu zlúčeninu II.

Aj keď zlúčenina I podľa vynálezu neinteraguje s aldózareduktázou (AKR1B1) a inými aldoketoreduktázami per se, metabolizuje sa v tkanivách charakterizovaných zvýšeným redukčným potenciálom, napríklad nádorové bunky, na cemtirestat (II), ktorý je účinným inhibítorom aldoketoreduktáz AKR1B1 a AKR1B10. Pod „zlúčenina I podľa vynálezu neinteraguje s aldoketoreduktázami AKR1B1 a AKR1B10 per se sa rozumie, že vykazuje hodnotu ICso na inhibíciu AKR1B1 alebo AKR1B10 vyššiu ako 100 pmol/l.

Očakáva sa teda, že zlúčenina I podľa vynálezu bude užitočná pri stavoch charakterizovaných zvýšeným redukčným potenciálom, kde je vyžadovaná inhibícia AKR1B1 alebo AKR1B10, ako sú napríklad nádorové bunky. Tieto sa vyznačujú významne zvýšenými hladinami redukovaného glutatiónu (GSH) v porovnaní s fyziologicky zdravými bunkami a obzvlášť v porovnaní s extracelulárnym priestorom (gastrointestinálny trakt, centrálny krvný kompartment atď.). Chorobné stavy, v liečbe ktorých môže zlúčenina I podľa vynálezu nájsť využitie, zahŕňajú rakovinu hrubého čreva, pľúc, prsníka, pečene, prostaty, pankreasu, endometria, maternicového krčka atď., a to v terapeutickom a/alebo profylaktickom režime.

Ďalším aspektom tohto vynálezu je spôsob liečenia stavu, kde je požadovaná inhibícia aldoketoreduktáz AKR1B1 alebo AKR1B10 účelovo cielená do tkanív charakterizovaných zvýšeným redukčným potenciálom, ako sú napríklad nádorové bunky charakterizované významne zvýšenými hladinami redukovaného glutatiónu (GSH) v porovnaní so zdravými bunkami alebo v porovnaní s extracelulárnym priestorom (gastrointestinálny trakt, centrálny krvný kompartment atď.). Táto metóda zahŕňa podávanie terapeuticky efektívneho množstva disulfidu vzorca (I), alebo jej spomenutej farmaceuticky akceptovateľnej formy, osobe trpiacej na taký stav alebo náchylnej k takému stavu.

Ďalším aspektom tohto vynálezu je použitie disulfidu I na liečbu rakoviny ako adjuvantné terapeutikum v kombinácii s klinicky používanými chemoterapeutikami, ktoré sú substrátom aldoketoreduktáz, ako sú napríklad doxorubicín a daunorubicín či podobné typy chemoterapeutík. Táto metóda zahŕňa podávanie terapeuticky efektívneho množstva disulfidu I, alebo jeho spomenutej farmaceuticky akceptovateľnej formy, v kombinácii s terapeutickou dávkou klinicky používaného chemoterapeutika, ako sú napríklad doxorubicín, daunorubicín atď., osobe trpiacej na taký stav alebo náchylnej k takému stavu.

Disulfid vzorca (I) podľa vynálezu je neaktívna zlúčenina proti AKR1B1 a iným aldoketoreduktázam. Zlúčenina vzorca (I) teda zostáva v zdravých bunkách a v extracelulárnom priestore (gastrointestinálny trakt, centrálny krvný kompartment atď.), ktoré sú charakterizované zníženým redukčným potenciálom (nízka hladina GSH), neaktívna, a týmto sa dá vyhnúť potenciálnym vedľajším nežiaducim účinkom známym pri orálne podávaných aktívnych inhibítoroch aldózareduktázy, ako je hepatotoxicita, poruchy trávenia, poruchy funkcie obličiek, spermií a iné.

Výhodou terapie s použitím disulfidu vzorca (I) v porovnaní s cemtirestatom vzorca (II), alebo inými inhibítormi aldózareduktázy, je cielená distribúcia účinného liečiva do buniek tumoru, čím sa môže dosiahnuť vyššia účinnosť a menšie vedľajšie účinky v porovnaní s cemtirestatom vzorca (II).

Disulfid I podľa vynálezu môže mať taktiež výhodu aj v tom, že v kyslom prostredí tumorov je táto zlúčenina lepšie absorbovateľná v porovnaní so samotným cemtirestatom vzorca (II), čo je zdokumentované v príklade 3 opisujúcom takmer 4-násobne vyšší rozdeľovací pomer v systéme voda/oktanol pre zlúčeninu I v porovnaní s cemtirestatom (II), v kyslom prostredí pri pH 4,6.

Disulfid I, podľa vynálezu, môže mať výhodu aj v tom, že vzhľadom na jeho molekulárnu symetriu poskytne naraz až dve molekuly účinného AR inhibítora cemtirestatu (II), a tým môže byť liečba ešte účinnejšia.

Disulfid I, podľa vynálezu, môže mať aj iné užitočné farmakologické vlastnosti, ktoré sú výhodnejšie oproti známym inhibítorom aldoketoreduktáz, ktoré sú aktívne per se.

Disulfid I, podľa vynálezu, bude normálne podávaný orálne, bukálne, rektálne, dermálne, nazálne, tracheálne, bronchiálne či akoukoľvek inou parenterálnou cestou alebo pomocou inhalácie, alebo vo forme farmaceuticky akceptovateľných netoxických organických alebo anorganických solí, či definovaných farmaceuticky prijateľných foriem I. V závislosti od ochorenia a pacienta, ktorý sa má liečiť, a cesty podávania, kompozície sa môžu podávať v rôznych dávkach.

Vynález sa tiež týka farmaceutických prostriedkov obsahujúcich zlúčeninu vzorca (I), ako je definované, alebo jej farmaceuticky prijateľnej formy, ako je uvedené v zmesi s farmaceuticky akceptovateľnými činidlami, stabilizátorom, riedidlom alebo nosičom.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1. Kinetika štiepenia disulfidu I vplyvom rastúcich koncentrácií GSH za vzniku cemtirestatu (II) (CMTI). Uvedené sú typické výsledky z jednotlivých experimentov. Disulfid I, 50 pM; GSH 0 (▲); GSH 25 pM (); GSH 50 pM (o); GSH 100 pM (·); experimenty boli uskutočnené jednotne v 20 mM fosfátovom pufri pri pH 7,4 a 37 ^oC.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález je ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi, ktoré prezentujú prípravu disulfidu I, meranie kinetiky redukcie zlúčeniny I v prítomnosti rôznych koncentrácií GSH, meranie inhibície aldózareduktázy (AKR1B1) disulfidom I, ako aj stanovenie rozdeľovacieho pomeru v systéme vodný roztok/oktan-1-ol. Uvedené príklady uskutočnené pre disulfid I neobmedzujú rozsah nárokov patentu. Odborníkom v danej oblasti je zrejmé, že mnohé modifikácie z hľadiska materiálov a metód možno uplatniť bez zúženia účelu a obsahu tohto vynálezu.

Všeobecné experimentálne postupy

Merania ¹H-NMR a ¹³C-NMR sa uskutočňovali na spektrometri Varian Gemini (300 MHz alebo 600 MHz pre ^XH a 75 MHz alebo 150 MHz pre ¹³C-NMR) v rozpúšťadle CDCI3 alebo DMSO-ds. Chemické posuny sú udávané v ppm vzhľadom na zvolený štandard TMS a interakčné konštanty J v Hz. IČ spektrá boli merané na prístroji Agilent Technologies Čary 630 FTIR v oblasti 650-4 002 cm^-1 na diamantovom detektore v tuhej fáze bez rozpúšťadla a referenčne oproti vzduchu. UV spektrá boli zaznamenávané na prístroji Agilent Technologies Čary 8454 UV-Vis. Analýza kvapalinovou chromatografiou a hmotnostnou spektrometriou (LC-MS) sa uskutočnila na prístroji Agilent Technologies 1200 Šerieš vybaveného hmotnostným spektrometrom Agilent Technologies 6100 Quadrupole s použitím elektrosprejovej ionizácie (ESI). Teploty topenia boli stanovené pomocou prístroja Buchi Melting Point M-565 a neboli korigované. Elementové analýzy (C, H, N) boli uskutočnené pomocou prístroja Carlo Erba Strumentazione Model 1106.

Príprava východiskového materiálu

Cemtirestat (II) (kyselina 2-(3-tioxo-2,3-dihydro-5H-[l,2,4]triazino[5,6-b]indol-5-yl)octová) bol pripravený podľa metód opísaných v publikácii Hlaváč et al.; J Med Chem. 63:369-381, 2020.

Príklad 1

Syntéza disufidu I - kyseliny 2,2'-(disufandiylbis(2,3-dihydro-5H-[l,2,4]triazino[5,6^Jo]indol-3,5-diyl))dioctovej

K roztoku 200 mg (0,768 mmol, 1,00 mol ekv) cemtirestatu (II) v 20 ml bezvodej kyseliny octovej sa za stáleho miešania pri laboratórnej teplote pridal nadbytok bezvodého dusitanu sodného 138 mg (2,000 mmol, 2,60 mol ekv). Počas pridávania NaNO₂ reakčná zmes menila farbu zo žltej na tehlovočervenú, pričom dochádzalo k uvoľňovaniu na červeno sfarbených pár oxidov dusíka. V priebehu desiatich minút z reakčnej zmesi vypadla zrazenina. Zmes sa nechala stáť ešte 1 hodinu. Produkt I sa izoloval z reakčnej zmesi filtráciou. Zrazenina na filtri sa postupne premyla ľadovou vodou a ľadovo vychladeným CH₃OH. Tuhý zvyšok sa vysušil pomocou vákua, čím sa získalo 163 mg (0,314 mmol, 82 %) disulfidu I v podobe slabohnedej tuhej látky. M. p.: 220-250 °C (dec);

^XH-NMR (600 MHz, DMSOd_s): δ 13,23 (široký signál, 2H, 2 x -COOH), 8,06 (dd, 2H, 7(8,9) = 7,6 Hz, 7(7,9) = 1,4 Hz, 2 x H-C(9)), 7,68 - 7,65 (m, 4H, 2 x H-C(6) and 2 x H-C(7)), 7,41 (ddd, 2H, 7(7,8) = 8,2 Hz, 7(8,9) = 7,6 Hz, 7(6,8) = 1,4 Hz, 2 x H-C(8)), 5,06 (s, 4H, 2 x NCH₂COOH);

¹³C-NMR (150 MHz, DMSOd_s): δ 168,9 and 164,6 (2 x C-Sand 2 x -COOH), 145.9,142.9,142.1,132.1,123.8, 122.3, 117.3, 112.1 and 42.9 (2 x -CH₂-).

FT-IR (merané v tuhom stave, cm ^x): 1730 (m), 1619 (w), 1577 (m), 1508 (w), 1467 (m), 1438 (m), 1413 (w), 1369 (m), 1334 (m), 1210 (m), 1174 (s), 1149 (m), 1089 (m), 1033 (w), 968 (m), 932 (m), 886 (w), 802 (m), 748 (s), 702 (w), 667 (m), 615 (m), 562 (w), 514 (w), 447 (m).

UV-VIS (DMSO): Ä_max = 269 nm; HPLC-MS čistota 98 %; elementová analýza C22H14N8O4S2 (518.526), vypočítané: C, 50.96; H, 2.72; N, 21.61 nájdené: C, 50.87; H, 3.05; N, 21.80.

Príklad 2

Test A

Redukcia disulfidu I pôsobením GSH

Kinetika štiepenia disulfidu I vplyvom rastúcich koncentrácií GSH za vzniku cemtirestatu (II) sa študovala takto: K roztoku disulfidu I (50 pM) v 20 mM fosfátového pufra (pH 7,4) sa pridal GSH v postupne narastajúcich koncentráciách v rozpätí 0 - 100 pM. Okamžite po pridaní GSH sa začala monitorovať absorbancia vznikajúceho cemtirestatu (II) pri 302 nm. Koncentrácia cemtirestatu (II) sa vypočítala použitím extinkčného koeficientu ε = 38,4 mM^-1.cm^-1.

Redukcia disulfidu I pôsobením GSH

Zlúčenina I z príkladu 1 sa testovala v teste A na kinetiku redukcie disulfidu I na monomér cemtirestat (II) v prítomnosti rastúcich koncentrácií GSH a zistilo sa, že dimér I sa za prítomnosti GSH štiepi za vzniku monoméru (cemtirestat (II)), a to tak, že s rastúcimi koncentráciami GSH sa zvyšuje rýchlosť aj výťažok reakcie (obr. 1, tabuľka 1).

Tabuľka 1 Počiatočná rýchlosť štiepenia disulfidu I za vzniku cemtirestatu (II) a finálny stupeň redukcie disulfidu I v prítomnosti rastúcich koncentrácií GSH

GSH (pM)	0	25	50	100
Počiatočná rýchlosť vzniku cemtirestatu (II) (nmol/ml/s)	n. d.	4,46 ±1,68	7,30 ±1,46	9,83 ±2,09
Finálny stupeň redukcie disulfidu I (%)*	n. d.	39,68 ±1,59	67,70 ±3,72	85,16 ±5,11

*Vypočítané po dosiahnutí maxima v 60. sekunde. Disulfid I, 50 pM; 20 mM fosfátový pufer (pH 7,4) pri 37 °C. Výsledky sú aritmetickým priemerom ±SD z troch paralelných experimentov. Skratka n. d. znamená „nedetekovateľná hodnota“.

Príklad 3

Test B

Inhibícia ALR2 disufidom I za prítomnosti GSH

Príprava ALR2. Enzým ALR2 z potkaních šošoviek sa izoloval metódou podľa Hayman a Kinoshita (J Biol Chem. 240: 877-882, 1965), následne sa šošovky rýchlo vypreparovali z potkanov po ich eutanázii a homogenizovali sa v sklenenom homogenizátore s teflónovým piestom v 5 objemoch chladnej destilovanej vody. Homogenát sa centrifugoval pri 10 000 g pri 0 až 4 °C počas 20 min. Supernatant sa vyzrážal nasýteným roztokom síranu amónneho postupne pri 40 %, 50 % a nakoniec pri 75 % nasýtení. Po prvých dvoch zrážaniach sa použil supernatant. Sediment z posledného kroku, obsahujúci ALR2 aktivitu, sa rozsuspendoval v 75 % sírane amónnom a uložil v menších alikvotných častiach v kontajneri s tekutým dusíkom.

Enzýmová skúška. ALR2 aktivita sa merala spektrofotometricky (Stefek et al. Bioorg Med Chem. 16:4908-4920, 2008) prostredníctvom stanovenia spotreby NADPH pri 340 nm a vyjadrila sa ako pokles optickej hustoty (denzity) (O.D.)/s/mg proteínu. Reakčná zmes obsahovala 4,67 mM D,L-glyceraldehydu ako substrátu, 0,11 mM NADPH v 67 mM fosfátového pufra (pH 7,4), GSH v požadovanej koncentrácii a 0,05 ml enzýmového preparátu v celkovom objeme 1,5 ml. Referenčná (prázdna) vzorka obsahovala všetky menované zložky s výnimkou substrátu D,L-glyceraldehydu a slúžila na korekciu oxidácie NADPH nesúvisiacej s redukciou substrátu. Enzýmová katalýza sa iniciovala pridaním D,L-glyceraldehydu a reakcia sa monitorovala počas 4 min. po úvodnej 1-minútovej perióde pri 37 °C. Aktivity enzýmu sa nastavili zriedením enzýmových preparátov destilovanou vodou tak, aby 0,05 ml preparátu poskytlo priemernú reakčnú rýchlosť pre kontrolné vzorky v rozsahu 0,020 ±0,005 jednotiek absorbancie/min. Vplyv inhibítora na enzýmovú aktivitu sa stanovil pridaním zásobného roztoku inhibítora v DMSO do reakčnej zmesi vo finálnej koncentrácii 100 pM tak, aby finálna koncentrácia DMSO bola 1 %. Inhibítor s rovnakou koncentráciou sa pridal do referenčnej vzorky. Enzýmová aktivita sa naštartovala 2 min. po pridaní GSH do reakčnej zmesi pridaním D,Lglyceraldehydu použitého ako substrát a z nameraných hodnôt poklesu absorbancie sa stanovili hodnoty I (%).

Inhibícia aldózareduktázy disulfidom I za prítomnosti GSH

Zlúčenina I z príkladu 1 sa testovala v teste B a zistilo sa, že vykazovala hodnoty I (%) v závislosti od koncentrácie GSH, ako je uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 2 Inhibícia aldózareduktázy izolovanej z očných šošoviek potkana disulfidom I v prítomnosti rastúcich koncentrácií GSH

Pridaný GSH (pM)*	0	5	10	20	40	100	1 000	5 000
Inhibícia I (%)	< 1 %	< 1 %	8,9 ± 0,6	12,4 ± 1,4	16,1 ± 6,9	72,6 ± 9,1	94,0 ± 1,6	91,1 ± 1,5

*Prirodzený obsah GSH v použitých preparátoch ALR2 bol < 0,1 nmol/ml. Disulfid I sa v pokuse použil pri konc. 100 pM; fosfátový pufer mal koncentráciu 67 mM (pH 7,4) a bol použitý pri 37 °C. Enzýmová aktivita sa merala 2 min. po pridaní GSH do reakčnej zmesi obsahujúcej všetky komponenty okrem D,L-glyceraldehydu použitého ako substrát. Výsledky sú aritmetickým priemerom ±SD z troch paralelných experimentov.

Príklad 4

Test C

Stanovenie rozdeľovacieho pomeru v systéme pufer/oktán-1-ol

Rozdeľovací pomer v systéme pufer/1-oktanol (systémový názov oktán-1-ol), definovaný ako rovnovážny pomer celkovej koncentrácie rozpustenej látky v organickej fáze k celkovej koncentrácii rozpustenej látky vo vodnej fáze, sa stanovil vytrepávacou metódou (shake-flask method) pri laboratórnej teplote. Na stanovenie sa ako organická fáza použil oktán-1-ol nasýtený požadovaným pufrom. Disulfid I alebo cemtirestat (II), ako referenčnú látku, sa rozpustili v príslušnom pufri (4 mL) vo finálnej koncentrácii 100 pM za prítomnosti DMSO (1 %). Vodný roztok sa trepal s oktán-1-olom (20 mL) počas 3 hodín. Následne sa fázy oddelili v rozdeľovacom lieviku a koncentrácia rozpustenej látky sa v oboch fázach stanovila spektrofotometricky pomocou kalibračnej závislosti.

Stanovenie rozdeľovacieho pomeru disulfidu I v systéme pufer/oktán-1-ol

Disulfid I z príkladu 1 sa testoval v teste C a zistila sa hodnota rozdeľovacieho pomeru v systéme fosfátový pufer (pH 7,4)/oktán-1-ol, ako je uvedené v tabuľke 3.

Tabuľka 3 Rozdeľovací pomer disulfidu I v systéme pufer/oktán-1-ol v porovnaní s cemtirestatom (II)

Zlúčenina	D
pH 7,4*	pH 4,6**
Disulfid I	0,0095 ±0,0019	0,1136 ±0,0022
Cemtirestat (II)	0,0097 ±0,0007	0,0353 ±0,0007

*Fosfátový pufer (0,1M; pH 7,4) + 0,15 M KCl; **acetátový pufer (0,1M; pH 4,6) + 0,15 M KCl; disulfid I (100 pM); laboratórna teplota. Výsledky sú aritmetickým priemerom ±SD z troch paralelných experimentov.

Priemyselná využiteľnosť

Priemyselná využiteľnosť spočíva v tom, že zlúčenina vzorca (I) je prekurzor vhodný na výrobu vysoko účinného inhibítora aldózareduktázy vzorca (II) s cielenou distribúciou do rakovinových buniek, s predpokladanou vyššou účinnosťou a menšími vedľajšími účinkami, ako má samotný cemtirestat II, ktorá je však v kyslom prostredí tumorov lepšie absorbovateľná ako samotný cemtirestat II.

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Zlúčenina cemtirestat disulfid vzorca (I), t. j. kyselina 2,2'-(disulfándiylbis(5H-[l,2,4]triazino [5,6-b]indol-3,5-diyl))dioctová, vzorca (I):

   ^COOH \ _/ V /s w A—//

   HOOC^ (D alebo jej farmaceutický prijateľná forma: mono alebo dvojsýtna soľ, mono- alebo di-estery, amidy alebo ich kombinácie.
2. 2. Spôsob prípravy zlúčeniny cemtirestat disulfidu vzorca (I) podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky: na zlúčeninu cemtirestat vzorca (II)

   N-NH a//

   Vⁿ

   N ^COOH (II) sa pôsobí miernym oxidačným činidlom NaNO2 v kyseline octovej pri laboratórnej teplote; pričom produkt vzorca (I) vypadáva už počas reakcie z reakčnej zmesi; produkt vzorca (I) sa odfiltruje a premyje ľadovou vodou a vychladeným metanolom; produkt vzorca (I) sa suší pri postupne znižovanom tlaku z 3 000 Pa na 0,1 Pa.
3. 3. Zlúčenina cemtirestat disulfid vzorca (I) alebo jej farmaceutický prijateľná forma podľa nároku 1 na použitie ako liečivo.
4. 4. Zlúčenina cemtirestat disulfid vzorca (I) alebo jej farmaceutický prijateľná forma podľa nároku 1 na použitie na liečenie stavov, kde je požadovaná inhibícia aldoketoreduktáz AKR1B1 a/alebo AKR1B10 v bunkách/tkanivách s vysokým obsahom redukovaného glutatiónu GSH.
5. 5. Zlúčenina cemtirestat disulfid vzorca (I) alebo jej farmaceutický prijateľná forma podľa nároku 1 na použitie na liečenie rakoviny, ktorá má pôvod v chronickom zápale, menovite rakovina hrubého čreva a konečníka, rakovina pľúc, prsníka, pečene, pankreasu, prostaty, endometria a krčka maternice.
6. 6. Zlúčenina cemtirestat disulfid vzorca (I) alebo jej farmaceutický prijateľná forma podľa nároku 1 na použitie na liečenie rakoviny ako adjuvantné terapeutikum v kombinácii s klinicky používanými chemoterapeutikami, ktoré sú substrátom aldoketoreduktáz, ako sú napríklad doxorubicín a daunorubicín.
7. 7. Použitie cemtirestatu (II) ako východiskovej látky na výrobu zlúčeniny cemtirestat disulfid vzorca (I) alebo jej farmaceutický prijateľnej formy.
8. 8. Farmaceutický prostriedok obsahujúci ako účinnú látku zlúčeninu cemtirestat disulfid vzorca (I) alebo jej farmaceutický prijateľnú formu podľa nároku 1 v zmesi s farmaceutický prijateľným činidlom, riedidlom alebo nosičom a prípadne ďalšou pomocnou látkou.