SK281472B6 - Použitie lys-plazminogénu na prípravu farmaceutickej kompozície - Google Patents

Abstract

Je opísané použitie lys-plazminogénu na prípravu farmaceutickej kompozície na ošetrenie reperfúzneho poškodenia a na zlepšenie mikrocirkulácie. Uvedená farmaceutická kompozícia je vhodná na ošetrenie cerebrálnej ischémie a tranzitórnych ischemických atakov, na prevenciu reperfúzneho poškodenia u pacientov, prijímajúcich transplantované tkanivo alebo orgán, a na ošetrovanie reperfúzneho poškodenia u darcu tkaniva alebo orgánu.ŕ

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka použitia lys-plazminogénu na prípravu farmaceutickej kompozície na prevenciu a liečbu reperfuzneho poškodenia, vzniknutého z ischemických príhod.

Doterajší stav techniky

Mŕtvica zostáva treťou najobvyklejšou príčinou úmrtia v industrializovanom svete, po ischemickej srdcovej chorobe a rakovine. Mŕtvice sú zodpovedné za asi 300 000 úmrtí ročne v Spojených štátoch a asi za 11 000 úmrtí ročne v Rakúsku. Mŕtvice sú tiež hlavnou príčinou príjmov do nemocníc a dlhodobých neschopností. V súlade s tým je socioekonomický dopad mŕtvice a s ňou spojené zaťaženie spoločnosti prakticky nemerateľné.

„Mŕtvica“ je definovaná Svetovou zdravotníckou organizáciou ako rýchlo sa vyvíjajúci klinický znak miestnej alebo globálnej poruchy cerebrálnej funkcie so symptómami trvajúcimi aspoň 24 hodín. Mŕtvice sú tiež zahrnuté v úmrtiach, ktoré nie sú zjavne spôsobené inak ako vaskulárne.

Mŕtvice sú typicky spôsobené blokáciou alebo oklúziou krvných ciev k mozgu alebo v mozgu, pri kompletnej oklúzii uzatvorenie cerebrálnej cirkulácie spôsobí zastavenie neuronálnej elektrickej aktivity počas sekúnd. V niekoľkých málo minútach po poškodení energetického stavu a iónovej homeostasis sa objavujú deplécie vysokoenergetických fosfátov, zlyhanie membránovej iónovej pumpy, odtok celulámeho draslíka, prítok chloridu sodného a vody a membránová depolarizácia. Ak oklúzia pretrváva viac ako päť až desať minút, dochádza k nevratnému poškodeniu. S neúplnou ischémiou je obťažné hodnotenie a závisí od zvyškovej perfúzie a dostupnosti kyslíka. Po trombotickej oklúzii cerebrálnych ciev je ischémia vzácne úplná. Určitá zvyšková perfuzia obvykle pretrváva v ischemickej ploche, v závislosti od kolaterálneho krvného toku a miestneho perfúzneho tlaku.

Cerebrálny krvný tok môže kompenzovať poklesy v priemernom arteriálnom krvnom tlaku od 90 do 60 mm Hg autoreguláciou. Tento fenomén zahŕňa dilatáciu v smere toku zostávajúcich ciev. Pod nižšou hladinou autoregulácie (asi 60 mm Hg) je vazodilatácia neadekvátna a cerebrálny krvný tok klesá. Mozog má však perfúzne rezervy, ktoré môžu kompenzovať pokles v cerebrálnom mozgovom krvnom poklese. Táto rezerva existuje, pretože za normálnych podmienok len asi 35 % kyslíka doručovaného krvou je extrahovaných. Preto zvýšená extrakcia kyslíka môže nastať za predpokladu, že existuje normoxía a normocapnea. Ak distálny krvný tlak klesá pod približne 30 mm Hg sú dva kompenzačné mechanizmy (autoregulácia a perfúzna rezerva) neadekvátne pre zabránenie zlyhania prísunu kyslíka.

Keď klesá tok pod ischemický prah 23 ml/100 g/minúta, vyvíjajú sa symptómy tkanivovej hypoxie. Niektoré ischémie môžu byť letálne. Ak je ischémia zmiernená, povedie k „penumbre“. V neurologickom kontexte sa penumbra týka zóny mozgového tkaniva s moderovanou ischémiou a paralyzuje neuronálnu funkciu, ktorá je reverzibilná s reštaurovaním adekvátnej perfúzie. Penumbra vytvára zónu kolaterálne perfundovaného tkaniva, obklopujúceho jadro ischémie, v ktorom sa vyvinul infarkt. Inými slovami je penumbra tkanivová plocha, ktorá môže byť chránená aje v podstate stavom medzi životom a smrťou.

Ak je zrazenina degradovaná a krvný tok do penumbry je obnovený, môže sa objaviť fenomén známy ako reper fúzne poškodenie. Časti poškodeného tkaniva v penumbre môžu byť usmrtené alebo ďalej poškodené obnoveným vstupom kyslíka alebo iných substancií do plochy ovplyvnenej ischémiou. Z hľadiska tohto fenoménu je rozsah tkanivového poškodenia vzniknutého z ischémie determinovaný ako dobou vyžadovanou na dosiahnutie otvorenia okludovaných ciev a sériami reakcií, ktoré sú výsledkom reperfúzie a obnovením vstupu kyslíka na ovplyvnenie tkaniva.

I keď sa ischemický prípad môže objaviť kdekoľvek vo vaskulámom systéme, sú vidlice arteria carotis a počiatok vnútornej arteria carotis najčastejšími miestami trombotických oklúzii cerebrálnych krvných ciev, ktoré vedú k cerebrálnej ischémii. Symptómy zníženého krvného toku spôsobené stenózou alebo trombózou sú podobné symptómom vyvolaným chorobou cerebrálnej artérie. Prietok oftalmickou artériou je často dostatočne ovplyvnený pre prejav amaurosis fugax alebo tranzitórnej monokulárnej slepoty. Niektoré stenózy bilaterálnej internej arteria carotis môžu viesť k cerebrálnej hemisférickej hypoperfúzii. Táto sa prejavuje akútnou ipsilaterálnou bolesťou hlavy v akútnej ischemickej hemisfére. Oklúzia alebo zníženie krvného toku so vzniknutou ischémiou jednej anterior cerebrálnej artérie distálne k anterior komunikačnej artérii poskytuje motorické a kortikálne scnzorické symptómy v kolaterálnej nohe a menej často proximálnom ramene. Iné prejavy oklúzii alebo podperfuzií anterior cerebrálnej artérie zahŕňajú krokovú ataxiu a súčasne urinámu inkontinenciu spôsobenú poškodením parasagitálneho frontálneho laloku. Poruchy reči prejavujúce sa ako zníženie spontánnej reči môžu vo všeobecnosti byť v súvislosti s potlačením psychomotorickej aktivity.

Najviac ischemických mŕtvie zahrnuje časti alebo celú oblasť strednej cerebrálnej artérie s embóliou srdca alebo extrakraniálnych artérii carotis vo väčšine prípadov. Embólia môže okludovať hlavný kmeň strednej cerebrálnej artérie, ale najčastejšie produkuje distálnu oklúziu buď superíor alebo inferior vetvy. Oklúzia superior vetvy spôsobuje slabosť a stratu citlivosti, ktoré sú najväčšie na tvári a na ramene. Oklúzia posterior cerebrálnej artérie distálne k jej penetrujúcim vetvám spôsobuje kompletnú kontralaterálnu stratu videnia. Ťažkosti pri čítaní (dyslexia) a pri počítaní (dyscalculia) môžu sprevádzať ischémiu dominantnej posterior cerebrálnej artérie. Proximálna oklúzia posterior cerebrálnej artérie spôsobuje ischémiu vetiev -penetrujúcich do calamických a limbických štruktúr. Klinickými výsledkami sú hemisenzorické poruchy, ktoré môžu chronicky prechádzať na intraktabilnú bolesť defektného miesta (talamická bolesť).

Významný prípad cerebrálnej ischémie je známy ako tranzitórny ischemický atak („TIA“). TIA je definovaný ako neurologický deficit s trvaním menším ako 24 hodín. TIA je dôležitým signálom vývoja ischémie, ktorá môže viesť k cerebrálnemu infarktu. V súčasnosti neexistuje žiadna ideálna liečba TIA a nie sú ani všeobecne prijaté pravidlá, ktoré liečebné alebo chirurgické procedúry by mali byť vykonané na účely zníženia výskytu mŕtvice u subjektov s TIA.

Etiológia TIA zahŕňa hemodynamické prípady a tromboembolický mechanizmus. Pretože TIA mizne počas jednej hodiny, je deficit, ktorý je väčšinou dlhší, často klasifikovaný ako prezumptlvna mŕtvica a je v súlade s tým spojený s trvalým poškodením mozgu. Preto sa používa počítačová tomografia mozgu pre výskum cerebrálneho infarktu v plochách ovplyvnených TIA, trvajúcimi dlhšie, ako niekoľko hodín. Súhrnne relevantným klinickým rozdielom medzi TIA a mŕtvicou je, že ischémia spôsobila poškodenie mozgu, ktoré je typicky klasifikované ako infarktová alebo ischemická nekróza. Subjekty so zhoršenými klinickými znakmi by mohli mať vyvíjajúcu sa mŕtvicu alebo sú klasifikované ako majúce progresívnu mŕtvicu. V tomto klinickom triedení je propagácia zrazeniny možným dôležitým faktorom v progresii choroby.

Existuje obrovské množstvo chorôb spôsobených alebo spojených s ischémiou. Verterobaziláma ischémia je výsledkom oklúzie vertebrálnej artérie. Oklúzia vertebrálnej artérie a interferencie s tokom ipsilaterálnou posterior inferior cerebrálnou artériou spôsobujú laterálny medulámy syndróm, ktorý má symptomológiu zahŕňajúcu vertigo, nauzeu, dáviaci nystagmus, ipsilaterálnu ataxiu a ipsilaterálny Hemerov syndróm. Verterobaziláma ischémia často produkuje multifokálne lézie rozptýlené na oboch stranách mozgového kmeňa po značnej dĺžke. Ak nevezmeme do úvahy cerebrálny infarkt a laterálny medulámy syndróm, sú klinické syndrómy diskrétnych lézií tak zriedka zrejmé v čistej forme. Vertebrobaziláma ischémia sa prejavuje rôznymi kombináciami symptómov ako sú závrate, obvykle vertigo, diplopia, faciálna síabosť, ataxia a znaky dlhých nervov.

Oklúzia bazilámej artérie produkuje masívne deficity. Jeden z týchto deficitov je známy ako „uzavretý v stave“ (locked in state). Za týchto podmienok paralýza limbov a väčšiny bulbámych svalov umožňuje subjektu len schopnosť komunikovať pohybom očí alebo očných viečok podľa kódu. Oklúzia bazilámeho apexu alebo hornej časti bazilaru je obvykle spôsobená embóliou, ktorá uzatvára spojenie medzi bazilámou artériou a dvoma posterior cerebrálnymi artériami. Stav začína znížením prebudenia nasledovaným slepotou a amnéziou spôsobenou prerušením toku do posterior cerebrálnych artérií, ako aj abnormalitami vertikálneho pohľadu a pupilámej reaktivity vďaka tegmentálnemu poškodeniu.

Venózna oklúzia môže spôsobiť masívne poškodenie a smrť. Táto choroba je menej obvyklá ako arteriálna cerebrálna vaskuláma choroba. Ako pri ischemickej mŕtvici spôsobenej arteriálnou chorobou, je primárnym mechanizmom mozgového poškodenia zníženie kapilárneho krvného toku, v tomto prípade spôsobeného zvýšenou rezistenciou odtoku z blokovaných vén. Spätná transmisia vysokého tlaku do kapilárneho lôžka obvykle vedie k začiatku edému mozgu a hemoragickému infarktu v subkortikálnej bielej hmote. Najväčšie poškodenie spôsobené venóznou chorobou sa dostaví, ak je okludovaný superior sagitálny sínus. Venózna oklúzia sa prejavuje v spojení s koagulačnými poruchami, často v purpurálnej perióde alebo u subjektov s roztrúsenými rakovinami alebo nákazlivými chorobami. Ak sa nezačne s antikoagulačnou terapiou, má oklúzia superior sagitálneho sinú mortalitu 25 až 40 %.

Krátka difúzia cerebrálnej ischémie môže pôsobiť synkopu bez akejkoľvek permanentnej následnej choroby. Prolongovaná difúzia ischémie v iných orgánoch má devastujúce následky. Najbežnejším prípadom je srdcová asystola alebo iné kardiopulmorálne zlyhania, vrátane infarktu. Disekcia aorty a globálna hypoxia alebo otrava oxidom uhoľnatým môžu spôsobiť podobné obrazy. Difiizia hypoxie/ischémie typicky zabíja neuróny v hipocampe, cerebeláme Purkyňove bunky, striatum alebo kortikálne vrstvy. Klinicky takáto difúzia hypoxie/ischémie vedie k bezvedomiu a ku kóme, nasledovaným v mnohých prípadoch chronickým vegetatívnym stavom. Ak sa subjekt z bezvedomia nepreberie počas niekoľkých dní, je prognóza návratu nezávislých mozgových funkcií veľmi zlá.

Hyperviskozitný syndróm je ďalšou chorobou spojenou s prietokom krvi a ischémiou. Cerebrálny krvný tok je v prevrátenom vzťahu k viskozite krvi. Táto je priamo úmerná počtu cirkulujúcich červených a bielych buniek, agregačnému stavu, počtu doštičiek a koncentrácii plazmového proteínu. Krvný tok je nepriamo úmerný deformibilite erytrocytov a krvnej rýchlosti (strihová rýchlosť).

Subjekty s hyperviskóznym syndrómom môžu byť prezentované buď fokálnou neurologickou dysfunkciou, alebo difúznymi, alebo multifokálnymi znakmi, alebo symptómami, zahŕňajúcimi bolesť hlavy, vizuálne poruchy, kognitívne zhoršenie alebo záchvaty.

Pri tvorbe a lýze zrazenín je zahrnutých mnoho substancií. Plazminogén, známy tiež ako glu-plazminogén, a plazmín sú dve primáme substancie zahrnuté v lýze.

Plazminogén je proteín zložený zo 791 aminokyselín, ktorý cirkuluje v ľudskej plazme v koncentrácii asi 200 pg/ml. Plazminogén je zymogénová forma fibrinolytického enzýmu, plazmínu, ktorý má širokú substrátovú špecifitu a je bezprostredne zodpovedný za degradáciu krvných zrazenín. Z najväčšej časti je proteolýza fibrínu sprostredkovaná generovaním plazmínu vo fibrinovej zrazenine z plazminogénu, zachyteného v zrazenine. Fredenburgh a Nesheim, J. Biol. Chem. 267: 26150 - 56 (1992).

Plazminogén má päť okrajových domén vo svojom regióne aminoterminálneho ťažkého reťazca, ktoré majú lyzín viažuce miesta pre rozpoznávanie lyzínových zvyškov vo fibríne. Konverzia plazminogén-plazmín, tak v zrazenine, ako na jej povrchu, je uľahčená afinitou tkanivového plazminogénového aktivátora („t-PA“) pre fibrín, ktorá vedie k fibrínu dependentnej t-PA-indukovanej plazminogénovej aktivácii. Fredenburgh, loc.cit.

Ak je iniciovaná, vedie fibrinolýza k niekoľkým pozh tívnym spätne pôsobiacim reakciám. Napríklad plazmínom katalyzované štepenie fibrínu generuje karboxy-terminálne lyzínové zvyšky, ktoré naopak poskytujú ďalšie väzobné, miesta tak pre t-PA, ako aj plazminogén. Taktiež uľahčuje plazmínom katalyzovanú konverziu glu-plazminogénu na lys-plazminogén špecifickým štiepením, ktoré je predaktivačným stupňom. Shih a Hajjar, P. S. E. B. M. 202: 258.- 64 (1993). V literatúre výraz „lys-plazminogén“ sa vzťahuje k formám plazminogénu, kde je N-terminálnou aminokyselinou lyzín, valín alebo metionín. Nieuwenhuizen.a kol., Eur. J. Biochem. 174: 163 - 69 (1988). Konverzná aktivita spôsobuje pozitívnu spätne pôsobiacu reakciu, pretože lys-plazminogén je výrazne lepší substrát ako glu-plazminogén tak pre t-PA, ako aj urokinázu, ktorá môže byť vyvolaná zvýšenou afinitou lys-plazminogénu k fibrínu. Pomer Kcat/Km pre t-PA katalyzovanú aktiváciu lys-plazminogénu prevyšuje rovnaký pomer pre glu-plazminogén asi desaťkrát. Fredenburgh, loc. cit.

Pri fibrinolýze bolo už skôr zistené, že je urýchľovaná prídavkom lysplazminogénu in vivo a in vitro. Ďalej pri porovnaní použitia exogénneho lys-plazminogénu s použitím exogénneho glu-plazminogénu v rovnakých experimentoch, produkuje 0,08 pmol lys-plazminogénu rovnaký stupeň zvýšenej fibrinolýzy ako 0,67 pmol glu-plazminogénu. Tak aj keď obe formy plazminogénu skracujú čas fibrinolýzy, lys-plazminogén je asi osemkrát viac potentný z tohto hľadiska ako glu-plazminogén. Pozri Fredenburgh, supra.

Predchádzajúce štúdie lys-plazminogénu neudávajú použitie tohto proteínu pri liečbe reperfuzneho poškodenia. Obvyklým ošetrením repcrfúzneho poškodenia je flunarizín, ktorý je účinný len vtedy, ak je podávaný profylaktický.

SK 281472 Β6

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je použitie lys-plazminogénu na prípravu farmaceutickej kompozície na ošetrenie reperfuzneho poškodenia a na zlepšenie mikrocirkulácie.

Predovšetkým je predmetom vynálezu použitie uvedenej látky na prípravu farmaceutickej kompozície na ošetrenie ischémie a sprievodného reperfúzneho poškodenia, reperfúzneho poškodenia po ischemickej príhode, poškodenia tkaniva po reperfuzii a poškodenia mozgu po reperfuzii, obzvlášť keď je reperfúzne poškodenie dôsledkom mŕtvice, infarktu alebo chirurgického zákroku.

Uvedená farmaceutická kompozícia je vhodná aj na ošetrenie cerebrálnej ischémie a tranzitómych ischemických atakov.

Ďalej je taká farmaceutická kompozícia vhodná na prevenciu reperfúzneho poškodenia u pacientov, prijímajúcich transplantované tkanivo alebo orgán a na ošetrovanie reperfuzneho poškodenia u darcu tkaniva alebo orgánu.

Uvedená farmaceutická kompozícia obsahuje predovšetkým 10 až 1 000 CU lys-plazminogénnu na kg subjektu, obzvlášť 100 až 600 CU lys-plazminogénu na kg subjektu, napríklad 500 CU lys-plazminogénu na kg subjektu.

Predložený vynález umožňuje liečbu ischemickej príhody, vrátane cerebrálnej ischémie a reperfúzneho poškodenia spojeného s ischemickou príhodou. Ďalej poskytuje predložený vynález liečbu ischemickej príhody spôsobom, ktorý vylučuje alebo minimalizuje nežiaduce účinky spojené s konvenčnými liečbami, ako je reperfúzne poškodenie. Výraz „ošetrovanie“ vo svojich mnohých rôznych gramatických formách označuje prevenciu, zmiernenie, minimalizáciu alebo liečbu chorôb alebo iných nežiaducich stavov.

Bolo objavené, že plazmín a plazmín tvoriace proteíny, kategórie, ktorá zahŕňa lys-plazminogén, pre-aktivovaný zymogén plazmínu, môžu byť použité v súlade s predloženým vynálezom na zoslabenie alebo vylúčenie reperfúzneho poškodenia nasledujúceho po ischemickej príhode. Tento zlepšujúci účinok je možné dosiahnuť aj vtedy, keď už reperfuzia začala.

Lys-plazminogén samotný môže byť použitý ako liečba. Všetky formy plazminogénu sú považované za vhodné pre použitie podľa vynálezu pokiaľ si udržujú schopnosť spôsobiť zlepšenia skôr opísané. Na použitie podľa vynálezu sú tiež vhodné fragmenty lys-plazminogénu a varianty lys-plazminogénu, ako sú analógy, deriváty, muteíny a napodobeniny prirodzenej molekuly, ktoré si udržujú schopnosť spôsobiť opísané zlepšenia.

Fragmenty lys-plazminogénu označujú časti aminokyselinovej sekvencie lys-plazminogénového polypeptidu. Tieto fragmenty môžu byť generované priamo z lys-plazminogénu samotného chemickým štiepením, trávením proteolytickými enzýmami alebo ich kombináciami. Ďalej môžu byť takéto fragmenty vytvorené rekombinačnými technikami s použitím genóm alebo cDNA klonujúcich metód. Ďalej existujú metódy syntézy polypeptidov priamo z aminokyselinových zvyškov. Varianty lys-plazminogénu môžu byť produkované týmito a inými metódami. Môžu byť použité techniky miestne špecifickej a región-riadenej mutagenézy. Pozri CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, vol. 1, kap. 8 (Ausubel a spol., vyd., J. Wiley and Sons 1989 and Supp. 190-93); PROTEÍN ENGINEERING (Oxender and Fox eds., A. Liss, Inc. 1987). Ďalej môžu byť pre mutagenézu použité techniky linker-scanningu a PCR. Pozri PCR TECHNOLOGY (Erlich ed., Stockton Press 1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, vol. 1 a 2, supra. Nepeptidové zlúčeniny, ktoré napodobňujú väzbu a funkciu peptidu („mitne tiká“), môžu byť produkované postupom podľa práce Saragovi a spol., Science, 253: 792-95 (1991). Sekvencovanie proteínu, štruktúra a modelovanie priblíženia pre použitie akoukoľvek z opísaných techník sú opisované v PROTEÍN ENGINEERING, loc. cit. a CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, vol. 1 a 2, supra.

Len čo sa získa požadovaný fragment alebo variant lys-plazminogénu, môžu byť tu opísané techniky použité na stanovenie, ktorý fragment alebo variant je účinný pre uvedené terapie, ako je liečba reperfúzneho poškodenia a ak je to tak, na stanovenie vhodného dávkového rozsahu. Model potkanej mŕtvice, opísaný v ďalej uvedených príkladoch, je jednoduchý a predstavuje lacnú metódu na uskutočnenie týchto testov in vivo.

Predložený vynález sa týka tiež použitia progenitorov lys-plazminogénu, to znamená prekurzorov lys-plazminogénu ako i substancií, ktoré pôsobia na lys-plazminogénový prekurzor pre generovanie lys-plazminogénu. Ilustrativnym lys-plazminogénovým progenitorom je glu-plazminogén, ktorý sa štiepi vhodnou proteázou pre generovanie lys-plazminogénu. Substanciou, ktorá spôsobuje takéto proteolytické štepenie je plazmín, ktorého použitie spadá do rozsahu tohto vynálezu ako bolo už skôr uvedené. Takýto potkan! model mŕtvice je tiež vhodný na hodnotenie účinnosti lys-plazminogénových progenitorov.

Lys-plazminogén môže byť získaný proteolytickým štiepením glu-plazminogénu na odstránenie aminokyselinových sekvencií z glu-plazminogénu.

Spôsoby produkcie lys-plazminogénu sú opísané podrobnejšie v európskej prihláške 0 353 218. Pozri tiež Neuwenhuizen, supra.

Príklad uvedený ďalej demonštruje doposiaľ neznámy účinok lys-plazminogénu, ktorý implikuje jeho účinnosť a účinnosť lys-plazminogénových variantov a progenitorov ako i plazmínu a plazmín tvoriacich proteínov, pri liečbe reperfúzneho poškodenia. Doteraz bolo o lys-plazminogéne známe iba, že pôsobí pri fibrinolýze. Je neočakávané, že plazmín alebo plazmín tvoriaci proteín, ako je lys-plazminogén, by mali umožňovať prekonanie bariéry krv-mozog, čo bolo predpokladané ako nevyhnutné pre pôsobenie na mieste cerebrálnej ischemickej príhody.

Existuje aj iné použitie lys-plazminogénu. Lys-plazminogén pomáha pri liečbe subjektov po srdcovom zastavení. Podanie lys-plazminogénu môže chrániť pred ischemickým poškodením neorálnej bunky. Lys-plazminogén môže tiež byť použitý pri liečení celkovej telesnej ischémie (šok), ischémie čriev a dolných končatín a pre ochranu orgánov pre transplantáciu prevenciou ischémie.

Spôsoby podania zahŕňajú tie, ktoré sa používajú na liečbu zrazenín lýzou a typicky sú to intravenózne spôsoby. Dávka lys-plazminogénu používaná podľa vynálezu by mala byť založená na hmotnosti subjektu a podaní v dávke asi 10 až 1000 kaseinolytických jednotiek („CU“)/kg. Výhodne by dávka mala byť asi 100 až 600 CU/kg a výhodnejšie by dávka mala byť asi 500 CU/kg. Lys-plazminogén môže byť podávaný počas krvnej reperfúzie, ktorá by sa mohla objaviť, keď je lys-plazminogén podávaný spolu s konvenčnými liečbami zrazenín lýzou ako je tpa. Navyše, zlepšujúci účinok lys-plazminogénu môže byť dosiahnutý ešte aj vtedy, ak sa podáva potom, keď začala reperfuzia. Výhodne by lys-plazminogén mal byť podávaný pred alebo počas asi 30 minút po začatí reperfúzie. Lys-plazminogénové varianty a progenitory by mali byť podávané v dávkach, ktoré spôsobujú rovnaký účinok, ako uvedené dávkové rozsahy.

Liečba v súlade s predloženým vynálezom môže byť výhodne uskutočnená podaním opísaných substancií vo forme injektovateľných prípravkov. Typický prípravok na takýto účel zahŕňa farmaceutický prijateľný nosič. Príkladom kompozície v tomto kontexte je vehikulum lys-plazminogénového pufra (9 g/1 NaCl, 1 g/1 Na₃citrátu.2H₂O, 3 g/1 L-lyzínu, 6 g/I NaIl₂PO₄.2H₂O a 40,000 KIU/1 aprotonínu). Farmaceutický prijateľné nosiče v tomto kontexte zahŕňajú iné vodné roztoky, netoxické prísady, zahŕňajúce soli, ochranné látky, pufre (tlmivé roztoky), a podobne, ako sú opísané v REMINGTON S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15. vyd. Easton: Mack Publishing Co. str. 1405 - 1412 a 146-487 (1975) a v THE NATIONAL FORMÚL ARY XIV., 14. vyd. Washington: Američan Pharmaceutical Association (1975), ktorých obsahy sú tu zahrnuté ako referencie. Príklady nevodných rozpúšťadiel sú propylénglykol, polyetylénglykol, rastlinný olej a injektovateľné organické estery, ako je etyloleát. Vodné nosiče zahŕňajú vodu, alkoholické/vodné roztoky, salinické roztoky, parenterálne vehikulá, ako je chlorid sodný, Ringerova dextróza atď. Intravenózne vehikulá zahŕňajú kvapalné a výživné doplnky. Ochranné látky zahŕňajú antimikrobiálne, antioxidačné, chelatačné činidlá a inertné plyny. pH a presná koncentrácia rôznych zložiek vo väzbovej kompozícii sú upravené spôsobom rutinným pre odborníkov v odbore. Pozri GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (7. vyd.).

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 predstavuje systém hodnotenia použitý pri neurologických defektoch.

Obr. 2 je súhrnom experimentálnych údajov pri použití potkanieho modelu na hodnotenie terapeutického prínosu lys-plazminogénu v porovnaní s kontrolou.

Obr. 3 je grafickým znázornením hodnôt z riadeného experimentu hodnotenia účinku lys-plazminogénu na obsah mozgovej vlhkosti (edém) pri potkanoch s indukovanou ischémiou. „A“ je potkan s chirurgicky indukovanou ischémiou, ktorý dostával 500 j/kg lys-plazminogénu i. v. s krvnou reperfúziou; „B“ je potkan s chirurgicky indukovanou ischémiou, ktorý dostával 1,0 ml/kg izotonického salinického roztoku i. v. s krvnou reperfuziou; a „C“ sú potkany po simulovanej operácii, dostávajúce 1,0 ml/kg izotonického salinického roztoku i. v. (ΔΑΒ: p < 0,001; ABC: p < <0,01; AAC: p <0,05).

Obr. 4 je grafickým znázornením hodnôt z experimentu hodnotenia vplyvu pufra na obsah mozgovej vlhkosti (edém) pri potkanoch s indukovanou ischémiou, ktorý slúži ako ďalšia kontrola experimentu na obr. 3. „A“ je potkan s chirurgicky indukovanou ischémiou, dostávajúci 1,0 ml/kg pufra i. v. s krvnou reperfuziou (n = 7); „B“ je potkan s chirurgicky indukovanou ischémiou, dostávajúci 1,0 ml/kg izotonického salinického roztoku i. v. s krvnou reperfuziou (n = 7) a „C“ je potkan po simulovanej operácii, dostávajúci 1,0 ml/kg izotonického salinického roztoku i. v. (n = 8). (Δ AB n. s„ ABC: p < 0,01, AAC: p < 0,01).

Obr. 5 je grafickým znázornením hodnôt z riadeného experimentu hodnotenia vplyvu lys-plazminogénu na neurologický deficit potkanov s indukovanou ischémiou. Celkové hodnotenie je založené na individuálnych hodnoteniach stavu vedomia, držania tela, svalového tonusu a performancie (priemer 3 dni na zviera). Maximálne skóre je 54 (n = 10 na skupinu). „A“ je potkan s chirurgicky indukovanou ischémiou, dostávajúci 500 j/kg lys-plazminogénu i.v. s krvnou reperfúziou, „B“ je potkan s chirurgicky induko vanou ischémiou, dostávajúci 1,0 ml/kg izotonického salinického roztoku i. v. s krvnou reperfúziou a „C“ je potkan so simulovanou operáciou, dostávajúci 1,0 ml/kg izotonického salinického roztoku i. v. (ΔΑΒ: p < 0,001, ABC: p < <0,001, AAC: p = 0,05).

Obr. 6 je grafickým znázornením hodnôt z experimentu hodnotenia vplyvu pufra na neurologický deficit potkanov s indukovanou ischémiou, ktorý slúži ako ďalšia kontrola experimentu z obr. 5. Celkové skóre je založené na individuálnych hodnoteniach stavu vedomia, držania tela, svalového tonusu a performancie (priemer 3 dní na zviera). Maximálne skóre je 54 (n = 6 na skupinu). „A“ je potkan s chirurgicky indukovanú ischémiou, dostávajúci 1,0 ml/kg pufra i. v. s krvnou reperfúziou, „B“ je potkan s chirurgicky indukovanou ischémiou, dostávajúci 1,0 ml/kg izotonického salinického roztoku i. v. s krvnou reperfúziou a „C“ je potkan po simulovanej chirurgickej operácii, dostávajúci 1,0 ml/kg izotonického salinického roztoku i. v. (ΔΑΒ; n. s., ABC: p <0,01, AAC: p <0,01).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Vplyv lys-plazminogénu na následné choroby cerebrálnej ischémie pri potkanoch.

V tejto experimentálnej sérii boli hodnotené vplyvy lys-plazminogénu na následné choroby pokusne indukovanej ischémie pri potkanoch. Na hodnotenie neurologických následkov ischémie boli použité dva spôsoby. Ischémia pri potkanoch bola indukovaná ako je ďalej opísané.

Najskôr sa samce potkanov Sprague-Dawley (hmotnosť 300 - 400 g) anestetizujú s 350 mg/kg chloral-hydrátu i., p. a do jugulámej vény sa zasunie katéter. Päť mililitrov krvi sa odoberie jugulámym katétrom (100 m. j. heparínu v striekačke), aby sa znížil priemerný arteriálny krvný tlak na 50 mm Hg. Sprístupnia sa preparované arterie carotis a..uzavrú sa súčasne s odberom krvi. Svorky sa odstránia po 30 minútach a odobratá krv je znova infúndovaná (reperfúzia). Na rany sa aplikuje fibrínový tesniaci materiál (Tisseel®). Zvieratá sa udržiavajú pod anastézou celkom 24 hodín (23,5 h po reperfúzii). Po vrátení sa ku bdelému stavu prechádza každé zviera jedným z nasledujúcich postupov:

Hodnotenie edému mozgu:

Zvieratá sa udržujú pri konštantnej telesnej teplote počas 24 hodín, usmrtia sa éterom a vyberú sa mozgy. Hodnotenie edému mozgu bolo uskutočnené s použitím modifikácií metód publikovaných pre iné druhy. Oh a Betz, Stroke 22: 914-21 (1991).

Obsah vlhkosti, ktorý je vynikajúcim parametrom na hodnotenie edému mozgu, indukovaného ischémiou/reperfuziou, sa stanoví nasledovne: Odvážia sa obidve hemisféry, sušia sa 17 hodín pri 200 °C a znova sa odvážia. Obsah vlhkosti sa vypočíta podľa nasledujúceho vzorca:

vlhká hmotnosť - suchá hmotnosť ------------------------------ _x 100 .

vlhká hmotnosť

Hodnotenie neurologických deficitov:

Pri zvieratách sa hodnotia neurologické deficity v prvom, druhom a treťom pooperačnom dni. Wauquier a spol.,

Neuropharmacology 28: 837-46 (1989). Boli hodnotené stav bdelosti, držanie tela, svalový tonus, pokus s vysunutým rebríkom so sklonom 45° a pokus s vertikálne sa otáčajúcim rotačným diskom, na základe systému hodnotenia uvedeného na obr. 1. Spočíta sa kumulatívne skóre pre tri dni (maximálne skóre = 54).

Lys-plazminogén (IMMUNO AG) bol podávaný intravenózne pomocou katétra buď do jugulámej, alebo chvostovej vény. Tieto podania boli uskutočnené vo zvýšených koncentráciách v rôznom čase. Ischemické zvieratá ošetrené izotonickým salinickým roztokom slúžia ako pozitívne kontroly, zatiaľ čo zvieratá podrobené simulovanej operácii a ošetrované izotonickým salinickým roztokom slúžia ako negatívne kontroly.

Opísaný lys-plazminogénový pufer bol testovaný s použitím každého z týchto postupov v separátnych experimentoch. Súčet dávky, režim podania, experimentálne postupy a výsledky sú uvedené na obr. 2.

Výsledky pre 500 CU/kg lys-plazminogénu (a pufra, použitého ako kontrola) sú uvedené na obr. 3 a 4 pre edém a obr. 5 a 6 pre neurologické deficity. Významné hodnoty sú založené na t-testoch pre edém a Kruskal-Wallisovom teste, zahŕňajúcom „chi-square“ distribúciu neurologických deficitov.

Dávka 500 CU/kg lys-plazminogénu ukazuje významný ochranný účinok na následky experimentálne indukovanej cerebrálnej ischémie pri potkanoch. Režim podania nehrá podstatnú úlohu. Je treba uviesť, že lys-plazminogén ešte poskytuje ochranný účinok aj keď bol podaný 30 minút po začiatku reperfúzie. Toto je v rozpore s výsledkami získanými pre štandardné terapeutické meranie flunarizínu, ktorý je kalciovým antagonistom používaným v klinickej praxi. Flunarizín (0,63 mg/kg podaný intravenózne) bol účinný, ak bol podaný v reperfudovanej krvi, ale nemal žiadny účinok, ak bol podaný 30 minút po reperíuzii (údaje neuvedené).

Lys-plazminogén (500 CU/kg) bol schopný reverzie účinkov cerebrálnej ischémie podľa hodnotenia mozgového edému a neurologických deficitov na potkaňom modeli experimentálnej ischémie. Pufer použitý v lys-plazminogénovom prípravku nemal žiadny účinok. Na rozdiel od štandardného terapeutického merania (flunarizín), bol lys-plazminogén účinný, aj keď bol podaný 30 minút po reperfúzii.

Príklad 2

Vplyv lys-plazminogénu na chirurgické postupy

Chirurgické postupy typicky zahŕňajú prerušenie krvného toku k určitým orgánom alebo tkanivu, ktoré je obvykle zabezpečené svorkovaním. Takéto prerušenie krvného toku k orgánu alebo tkanivu spôsobí vývoj ischemického stavu v orgáne alebo tkanive, ktorý následne vedie k reperfúznemu poškodeniu len čo je obnovený krvný tok. Tento ischemický stav a nasledujúce reperfúzne poškodenie je zvlášť problematické v chirurgických procedúrach, ktoré zahŕňajú transplantáciu orgánov alebo tkanív príjemcovi.

Transplantácie zahŕňajú predĺžený čas svorkovania orgánu alebo tkaniva, ktoré majú byť transplantované, predovšetkým keď sa používajú orgány alebo tkanivá alogénnych alebo xenogénnych darcov. Toto svorkovanie vyvoláva prerušenie krvného prietoku orgánom alebo tkanivom, ktoré je nasledované odstránením orgánu alebo tkaniva z darcu. Svorkovanie a odstránenie vyvoláva ischémiu v transplantovanom orgáne alebo tkanive. Obnovenie krvného toku do transplantovaného orgánu alebo tkaniva počas dokončenia postupu bude vyvolávať reperfúzne poškodenie, objavujúce sa v orgáne alebo tkanive ako i v okolitých orgánoch a tkanivách príjemcu. V situácii podobnej transplantácii obličiek, keď darca často je a zostáva nažive, by telesná plocha darcu, obklopujúca odstránenú obličku, mala byť tiež chránená proti ischémii a reperfúznemu poškodeniu.

V súlade s predloženým vynálezom, ischemické podmienky a následné reperfúzne poškodenie spôsobené chirurgickými procedúrami môže byť liečené alebo mu môže byť zabránené pomocou proteínov, majúcich účinok lys-plazminogénu alebo progenitorov lys-plazminogénu. Takéto proteíny môžu mať aj kladný vplyv na transplantované orgány darcu alebo na takéto tkanivá, ako aj na okolité orgány a tkanivá darcu a príjemcu. Podanie proteínov s účinkom lys-plazminogénu alebo progenitorov lys-plazminogénu umožňuje orgánom a tkanivám tolerovať predĺžené periódy ischémie, ako aj fyziologický stres spôsobený reperfúziou.

Poškodenie orgánu alebo tkaniva môže byť znížené alebo mu môže byť zabránené spoločným podaním proteínov s účinkom lys-plazminogénu alebo progenitorov lys-plazminogénu pred začatím chirurgického výkonu. V prípade transplantácie môžu byť proteíny podľa predloženého vynálezu podávané darcovi pred odobratím orgánu alebo tkaniva. Darca môže byť ošetrovaný systémovo alebo lokálne do artérie, zásobujúcej orgán alebo tkanivo, pred odobratím orgánu alebo tkaniva. Podobne môže byť príjemca orgánu alebo tkaniva ošetrovaný pred transplantáciou na účely ochrany orgánov a tkaniva, obklopujúcich transplantačnú plochu, ako aj orgánu alebo tkaniva, ktoré majú byť umiestnené do príjemcu. Proteíny, majúce účinok lys-plazminogénu alebo progenitorov lys-plazminogénu môžu byť podávané tiež počas reperfuzie alebo po nej.

Výhodne sa lys-plazminogén podáva na ošetrenie reperfuzneho poškodenia. Účinná dávka lys-plazminogénu pre systémové podanie by mala byť v rozmedzí od 10 do 1000 CU/kg. Výhodne by dávka mala byť asi 100 až 600 CU/kg a výhodnejšie by dávka mala byť asi 500 CU/kg. Pri použití lokálneho podania by dávka mala byť vypočítaná priblížením sa k systémovým dávkam opísaným v ošetrovanej ploche.

Je treba uviesť, že opis, obrázky a špecifické príklady, ktoré opisujú výhodné uskutočnenia vynálezu sú tu uvedené výlučne na ilustráciu a nie sú mienené ako obmedzujúce. Rôzne zmeny a modifikácie v duchu a rozsahu vynálezu budú zrejmé odborníkom v odbore z tu uvedenej diskusie a opisu.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie lys-plazminogénu na prípravu farmaceutickej kompozície na ošetrenie reperfuzneho poškodenia a na zlepšenie mikrocirkulácie.
2. 2. Použitie podľa nároku 1 na ošetrenie ischémie a sprievodného reperfuzneho poškodenia, reperfúzneho poškodenia po ischemickej príhode, poškodenia tkaniva po reperíuzii a poškodenia mozgu po reperíuzii.
3. 3. Použitie podľa nároku 1, kde reperfúzne poškodenie je dôsledkom mŕtvice.
4. 4. Použitie podľa nároku 1, kde reperfúzne poškodenie je dôsledkom infarktu.
5. 5. Použitie podľa nároku 1, kde reperfúzne poškodenie je dôsledkom chirurgického zákroku.
6. 6. Použitie podľa nároku 1, kde uvedená farmaceutická kompozícia je na ošetrenie cerebrálnej ischémie.
7. 7. Použitie podľa nároku 1, kde uvedená farmaceutická kompozícia je na ošetrenie tranzitómych ischemických atakov.

   SK 281472 Β6
8. 8. Použitie podľa nároku 1, kde uvedená farmaceutická kompozícia je na prevenciu reperfuzneho poškodenia u pacientov, prijímajúcich transplantované tkanivo alebo orgán.
9. 9. Použitie podľa nároku 1 na výrobu farmaceutickej kompozície na ošetrovanie reperfuzneho poškodenia u darcu tkaniva alebo orgánu.
10. 10. Použitie podľa nároku 1, kde uvedená farmaceutická kompozícia obsahuje 10 až 1000 CU lys-plazminogénnu na kg subjektu.
11. 11. Použitie podľa nároku 10, kde uvedená farmaceutická kompozícia obsahuje 100 až 600 CU lys-plazminogénu na kg subjektu.
12. 12. Použitie podľa nároku 11, kde uvedená farmaceutická kompozícia obsahuje 500 CU lys-plazminogénu na kg subjektu.