HU217961B

HU217961B - Eljárás ischaemia és reperfúziós károsodás megelőzésére és kezelésére alkalmas Lys-plazminogén tartalmú gyógyászati készítmény előállítására

Info

Publication number: HU217961B
Application number: HU9401983A
Authority: HU
Inventors: Johann Eibl; Ludwig Pichler; Hans-Peter Scwarz
Original assignee: Baxter Ag
Priority date: 1993-07-02
Filing date: 1994-07-01
Publication date: 2000-05-28
Also published as: HRP940381B1; HRP940381A2; ES2119934T3; ZA944522B; DE69411084T2; GR3027778T3; EP0631786B1; NO942367L; AU680492B2; SI0631786T1; SK79894A3; US5520912A; EP0631786A1; CA2127199C; SK281472B6; HU9401983D0; RU94022754A; JPH07145076A; US5597800A; HUT67225A

Abstract

A találmány tárgya ischaemia és a következményes reperfúziós károsodásmegelőzésére és kezelésére alkalmas Lys-plazminogén-tartalmúgyógyászati készítmény előállítása. A Lys-plazminogén, ami a Glu-plazminogén proteolízisével nyerhető, protektív hatásúnak mutatkozottischaemiás ártalom következtében károsodott szövetekre. A Lys-plazminogén-adagolás felhasználható a betegek kezelésére a reperfúzióideje alatt és a reperfúzió megtörténte után is. A Lys-plazminogénadagolható a trombusoldást célzó terápiákkal összefüggésben is,amelyek szövetiplazminogén-aktivátort és hasonló anyagokatalkalmaznak. ŕ

Description

A találmány hatóanyagként egy Lys-plazminogén-hatású proteint (mely anyag eddig csupán fibrinolitikus szerként volt ismert) tartalmazó olyan gyógyászati készítmények előállítására vonatkozik, melyek ischaemia és/vagy reperfuziós károsodás megelőzésére és/vagy kezelésére alkalmasak.

A síroké a harmadik leggyakoribb halálokként szerepel az ipari országokban az ischaemiás szívbetegség és a rák után. A stroke felelős körülbelül 300 000 elhalálozásért az Egyesült Államokban évente, és körülbelül évi 11 000 elhalálozásért Ausztriában. A stroke ugyancsak vezető oki szerepet játszik a kórházi kezelésekben és a hosszú távú munkaképesség-csökkenésben. Ennek megfelelően a stroke és a vele járó terhek szociális és gazdasági kihatásai a társadalomra gyakorlatilag mérhetetlenek.

A stroke-ot a World Health Organisation definiálta: az agyi funkciók helyi vagy általános zavarának gyorsan kifejlődő klinikai tünetei, melyek legalább 24 óráig tartanak. A stroke oka lehet elhalálozásnak is, amennyiben nincs más ok, mint egy ér eredetű elváltozás.

A stroke okozója tipikusan az agyi vagy az agyhoz vezető erek átáramlási zavara vagy elzáródása. Teljes elzáródás esetén az agyi keringés megszűnése másodperceken belül megszünteti az idegsejtek elektromos aktivitását. Az energiaszint és ionhomeosztázis zavarát követő néhány percben a nagy energiájú foszfátok csökkenése, a membránionpumpa zavara, sejtkálium-kiáramlás, nátrium-klorid-beáramlás és membrándepolarizáció következik be. Ha az elzáródás öt-tíz percnél tovább tart, irreverzíbilis károsodást eredményez. Nem teljes (inkomplett) ischaemia esetén azonban a kimenetel nehezen prognosztizálható, és nagymértékben függ a fennmaradt átáramlástól és a rendelkezésre álló oxigéntől. Egy agyi ér trombotikus elzáródása utáni ischaemia ritkán teljes. Valamennyi átáramlás általában fennmarad az ischaemiás területen a kollaterális keringéstől és a helyi átáramlási (perfúziós) nyomástól függően. Az agyi vérátáramlás autoreguláció révén képes kompenzálni 12-10³ Pa-ról 8-10³ Pa-ra történő átlagos artériás vérnyomásesés esetén. Ez a jelenség magában foglalja az átáramlással szemben ellenállást kifejtő véredények tágulását. Az autoreguláció alsó szintje alatt (körülbelül 8-10³ Pa) az értágulás inadekvát, és az agyi vérátáramlás szintje esik. Az agynak azonban van átáramlási tartaléka, ami agyi keringéscsökkenés esetén kompenzál. Ez a tartalék azért áll fenn, mert normál körülmények között a vérből származó oxigénnek csak körülbelül 35%-a használódik fel. Ezáltal létrejöhet megnövekedett oxigénfelhasználás, feltéve, hogy normoxia és normocapnia fennáll. Ha a perifériás vérnyomás körülbelül 4-10³ Pa alá esik, ez a két kompenzálómechanizmus (az autoreguláció és az átáramlási tartalék) nem elegendő az oxigénszolgáltatás hiányának kivédésére.

Ha az átáramlás az ischaemiás küszöb, azaz 23 ml/100 g/min alá esik, kifejlődnek a szöveti hipoxia jelei. A súlyos ischaemia halálhoz vezethet. Ha az ischaemia közepes mértékű, akkor „penumbra” alakul ki. Ideggyógyászati vonatkozásban a penumbra egy olyan agyszövetzónának felel meg, amelyre a közepes mértékű ischaemia és a neuronok működésének zavara jellemző, amely megfelelő átáramlással (perfuzióval) helyreállítható. A penumbra egy kollaterálisok által ellátott szövetzónát képez a súlyosan ischaemiás centrum körül, amelyben infarktus (elhalás) fejlődött ki. Más szóval a penumbra az a szövetterület, amelyik megmenthető, és lényegében élő és elhalt állapot között van.

Ha a trombust megszüntetjük, és a vérátáramlás a penumbra területén helyreáll, egy reperfuziós (újraátáramláshoz kapcsolódó) károsodásnak nevezett jelenség léphet fel. A penumbra károsodott szövetének részei elhalhatnak vagy tovább károsodhatnak az oxigén és más anyagoknak az ischaemia által érintett területre való újrabejutásával. E jelenség miatt az ischaemia okozta szövetkárosodás kiterjedése függ mind az elzáródás és az újbóli átjárhatóság között eltelt időtől, mind azon reakciósortól, amit a reperfüzió és az oxigénnek az érintett szövetbe való újrabejutása eredményez.

Noha ischaemiás történés előfordulhat bárhol az érrendszerben, az artéria carotis elágazódása és az artéria carotis intema eredése az agyi véredények trombotikus elzáródásának leggyakoribb helyei, ami agyi ischaemiát eredményez. A szűkület vagy trombózis okozta csökkent vérátáramlás tünetei hasonlóak az artéria cerebri média megbetegedése által okozottakhoz. Az artéria ophtalmica átáramlása gyakran érintett annyira, hogy amaurosis fugaxot (átmeneti vakságot) okozzon. Súlyos kétoldali artéria carotis intema szűkület féltekei csökkent vérátáramlást eredményezhet. Ez akut azonos oldali fejfájásban nyilvánul meg az akutan ischaemiás félteke oldalán. Az egyik artéria cerebri anteriomak az artéria communican anteriortól perifériásán elhelyezkedő szakaszán elzáródás vagy vérátáramlás-csökkenés révén létrejött ischaemiája motoros és érző kérgi tüneteket okoz az ellenoldali alsó végtagokon, és ritkábban a felső végtag proximális (testhez közeli) végén. Az artéria cerebri anterior elzáródásának vagy vérátáramlás-csökkenésének további manifesztációi közé tartoznak az ataxiás járás és néha a frontális lebeny parasagittális (középvonalhoz közeli) részének károsodása miatt az incontinencia urinae (vizeletelfolyás). A spontán beszédcsökkenésben megnyilvánuló nyelvi nehézség a pszichomotoros aktivitás általános csökkenésének velejárója lehet.

A leggyakoribb ischaemiás stroke esetén részben vagy egészben az artéria cerebri média területe érintett a szívből vagy az artéria carotisok extracraniális (koponyán kívüli) szakaszából származó embólia révén, ami a legtöbb esetért felelős. Embólusok elzárhatják az artéria cerebri média főágát, de gyakrabban okoznak perifériásabb elzáródást akár a superior-, akár az inferiorágban. A superiorág elzáródása főleg az arcon és a felső végtagon okoz gyengeséget és érzészavart. Az artéria cerebri posterior elzáródása a penetráló ágak leadása után teljes ellenoldali vakságot okoz. A domináns oldali artéria cerebri posterior ischaemiáját olvasási és számolási problémák (dyslexia, dyscalculia) követhetik. Az artéria cerebri posterior centrális elzáródása a thalamikus és limbikus rendszerbe penetráló ágak ischaemiáját okozza. A klinikai tünetek féloldali érzészavarok, ame2

HU 217 961 Β lyek hosszú távon károsodott oldali makacs fájdalmakhoz (thalamuszfájdalom) vezethetnek.

Az agyi ischaemiák között jellemző történésként ismert a TIA (tranziens ischaemiás attack). A TIA definíciója neurológiai deficit, ami kevesebb, mint 24 óráig áll fenn. A TIA fontos jele az ischaemia kifejlődésének, ami agyi infarktushoz vezethet. Jelenleg a TIA-nak nem létezik ideális kezelése, és nincs általánosan elfogadott koncepció arra vonatkozólag, hogy gyógyszeres vagy sebészi beavatkozást kell-e végezni a stroke incidenciájának csökkentésére olyan betegek esetén, akiknél előfordult TIA.

A TIA etiológiájához tartoznak hemodinamikai zavarok és tromboembóliás mechanizmusok. Minthogy a legtöbb TIA egy órán belül lezajlik, az ennél tovább tartó deficitet gyakran a presumptív (valószínű) stroke-ok közé sorolják, és ennek megfelelően állandósult agyi károsodással van összefüggésben. Ezért komputertomográfiás agyvizsgálatot (CT) használunk a néhány óránál tovább tartó TIA-k által érintett területeken lévő agyi infarktus kimutatására. Összegezve: a lényeges klinikai különbség a TIA és a stroke között az, hogy az utóbbinál az ischaemia agykárosodást okoz, ami típusosán az infarktusok vagy az ischaemiás necrosisok közé sorolható. Súlyosbodó klinikai tünetekkel rendelkező páciensnek lehet kifejlődőben lévő stroke-ja, amit nevezhetünk progresszív stroke-nak. Ebben a klinikai állapotban a vérrög növekedése lényeges tényező lehet a megbetegedés súlyosbodásában.

Számos más megbetegedés fordul elő ischaemiával összefüggésben vagy annak következtében. A vertebrobasilaris ischaemia az artéria vertebrális elzáródásának következménye. Az artéria vertebrális elzáródása és az azonos oldali artéria cerebellaris posterior inferior áramlási zavara laterális agytörzsi szindrómát okoz, melynek tünetei szédülés, hányinger, nystagmus (szemtekerezgés), azonos oldali ataxia és azonos oldali Homer-triász. A vertebrobasilaris ischaemia gyakran okoz az agytörzs mindkét oldalán szétszórt multifokális károsodást tekintélyes hosszúságban. A kisagyi infarktustól és a laterális agytörzsi szindrómáktól eltekintve az enyhe károsodás klinikai tünetei ritkán láthatók tiszta formában. A vertebrobasilaris ischaemia különböző tünetekkel kombinálva manifesztálódik, mint például szédülés, általában forgó jellegű kettős látás, arcizomgyengeség, ataxia és hosszúpálya-tünetek.

Az artéria basilaris elzáródása súlyos tüneteket okoz. E tünetek egyike a „locked in” (bezártsági) állapot. Ebben az esetben a végtagok és a bulbáris izmok többségének bénulása csak szemmozgással vagy szemhéjmozgással való jelbeszéddel történő kommunikációt enged meg. A basilaris végág elzáródását általában olyan embólus okozza, amelyik az artéria basilaris és a két artéria cerebri posterior találkozásánál akad meg. Ez a körülmény csökkent kezdeti vigilitást eredményez, amit az artéria cerebri posteriorok átáramlásának megszakadása okozta vakság és emlékezetzavar, valamint a szegmentum károsodása következtében vertikális tekintésbénulás és abnormális pupillareakciók követnek.

A vénás elzáródás súlyos elváltozásokat és halált is okozhat. Ez a megbetegedés kevésbé általános, mint az artériás agyérelváltozások. Az artériás megbetegedésből származó stroke-hoz hasonlóan az agykárosodás elsődleges mechanizmusa a kapilláris vérátáramlás csökkenése, ebben az esetben a blokkolt vénák okozta megnövekedett kiáramlási ellenállás miatt. A nagy nyomás visszahatása a kapilláriságyra általában korai agynyomás-fokozódáshoz (vizenyőhöz) és a szubkortikális fehérállomány vérzéses infarktusához vezet. A legveszélyesebb formája a vénás elzáródásnak, ha a sinus sagittalis superior záródik el. Vénás elzáródás véralvadási zavarokkal kapcsolatban jöhet létre, gyakran purpurák megjelenéséval egy időben vagy szétszórt tumorban, illetve fertőző betegségben szenvedő pácienseknél. Amennyiben az antikoaguláns kezelést nem kezdik el, a sinus sagittalis superior elzáródásának mortalitása 25-40%.

Rövid ideig tartó diffúz agyi ischaemia okozhat syncopét (általában eszméletvesztéssel járó összeesés) minden permanens következmény nélkül. Más szervek elhúzódó ischaemiája káros következményekkel jár. A legáltalánosabb ok cardiális asystolia (szívmegállás) vagy egyéb cardiopulmonális működészavar, például infarktus. Az aorta dissectio és a globális hypoxia vagy a szén-monoxid-mérgezés hasonló képet mutathat. A diffúz hypoxia/ischaemia jellemzően elöli az idegsejteket a hippocampusban, érinti a kisagyi Purkinje-sejteket, a striatum vagy az agykéreg sejtjeit. Klinikailag egy ilyen hypoxia/ischaemia eszméletvesztést és kómát eredményez, amit sok esetben egy krónikus vegetatív állapot követ. Amennyiben a beteg nem nyeri vissza az eszméletét pár napon belül, a független agyi funkciók visszatérésének esélye nagyon csekéllyé válik.

A hiperviszkozitásszindróma további olyan megbetegedés, ami összefüggésben áll a vérátáramlással és az ischaemiával. Az agy vérátáramlása fordított arányban van a vér viszkozitásával. Ez utóbbi egyenes arányban áll a keringő vörös- és fehérvérsejtek számával, a véralvadási tényezőkkel, a trombociták számával és a szérumfehérje-koncentrációval. A vérátáramlás mértéke fordított összefüggést mutat a vörösvértestek flexibilitásával és a véráramlás sebességével (nyírási sebesség). A hiperviszkozitásszindrómás betegek rendelkezhetnek helyi neurológiai funkciózavarokkal vagy diffúz vagy multifokális tünetekkel vagy panaszokkal, mint például fejfájás, látászavar, tudatzavar vagy roham.

A trombus képződésében és feloldódásában számos anyag vesz részt. A plazminogén - ami Glu-plazminogénként is ismert - és a plazmin a trombusoldódásban szerepet játszó két elsődleges résztvevő.

A plazminogén egy 791 aminosavból álló protein, ami az emberi szérumban 200 pg/ml koncentrációban fordul elő. A plazminogén a fibrinolitikus hatású plazm inenzim inaktív előanyaga, ami széles szubsztrátspecifitású és végeredményben a vérrögök feloldásáért felelős. A fibrin proteolízisét elsősorban a rögbe bejuttatott plazminogénből történő, a fibrinrögön belüli plaz3

HU 217 961 Β minképződés okozza [Fredenburg & Nesheim, J. Bioi. Chem., 267: 26150-56.(1992)].

A plazminogénnek az aminoterminális nehézláncrégiójában öt kringle doménje van, ami lizinkötő helyeket mutat a fibrinben lévő lizincsoportok felismerésére. A plazminogén-plazmin átalakulást mind a trombusban, mind annak felszínén elősegíti a szöveti plazminogén aktivátorának (t-PA) a fíbrinhez való affinitása, ami fibrinfüggő t-PA indukálta plazminogénaktivációt eredményez [Fredenburg & Nesheim, J. Bioi. Chem., 267: 26150-56.(1992)].

Ha elkezdődött a fibrinolízis, akkor az néhány pozitív feedback reakciót is eredményez. Például a fibrinből származó karboxiterminális lizinmaradványok plazmin által katalizált lehasítása, ami sorjában további kötőhelyeket biztosít mind a t-PA-nak, mind a plazminogénnek. Ez a Glu-plazminogénnek Lys-plazminogénné történő, plazmin által katalizált specifikus hasítását is elősegíti, ami az első aktiváció egyik lépése [Shih & Hajjar, P.S.E.B.M., 202: 258-64. (1993)]. Az irodalomban a Lys-plazminogén a plazminogén azon formáira vonatkozik, amelyek N-terminális aminosava lizin, valin vagy metionin [Nieuwenhuizen és munkatársai, Eur. J. Biochem., 174: 163-69. (1988)]. Az átalakulási aktivitás egy pozitív feedback reakciót tükröz, minthogy a Lysplazminogén előnyösebb szubsztrát a Glu-plazminogénnél mind a t-PA, mind az urokináz számára, amit a Lysplazminogén erősebb, fíbrinhez való affinitása okozhat. A Lys-plazminogén t-PA katalizálta akti vációjának Kcat/Km aránya körülbelül egy tízszeres szorzóval meghaladja a Glu-plazminogénét (Fredenburgh, loc. cit.).

A korábbiakban a fibrinolízis in vivő és in vitro vizsgálattal gyorsabbnak mutatkozott Lys-plazminogén hozzáadására. Ha hasonló kísérletek során exogén Lysplazminogén hatását vetették össze Glu-plazminogénével, 0,08 pmol Lys-plazminogén hozta létre ugyanazt a fibrinolízisnövekedést, mint 0,67 pmol Glu-plazminogén. így, miközben a plazminogén mindkét formája lerövidíti a fibrinolízis idejét, a Lys-plazminogén körülbelül nyolcszorta hatékonyabb ebben a tekintetben, mint a Glu-plazminogén (lásd Fredenburgh, fent).

A Lys-plazminogénnel kapcsolatos előző tanulmányok nem vonják be ezt a fehérjét a keringési zavarok kezelésébe. A keringési zavarok szokványos kezelésére a Flunarizine szolgál, ami csak profilaktikus alkalmazás esetén hatékony.

Meglepő módon azt találtuk, hogy a korábban fibrinolitikus hatása révén vérrögoldóként alkalmazott Lysplazminogént pontosan a reperfúziós állapotok megelőzésében és kezelésében lehet hasznosítani. Ez azért váratlan elsősorban, mert az érelzáródást feloldó anyagok általában az okozott hirtelen reperfúzió miatt - közvetett módon - inkább erősítik a reperfúzióval kapcsolatos negatív hatásokat.

A találmány tárgya eljárás hatóanyagként egy Lysplazminogént tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot szokásosan alkalmazott segédanyagokkal ischemia és/vagy reperfúziós károsodás megelőzésére és/vagy kezelésére alkalmas gyógyászati készítménnyé alakítjuk.

A jelen találmány szerinti készítmény alapvetően ischaemia, infarktus és agyödéma kezelésének, továbbá a mikrocirkuláció javítására alkalmazható.

A jelen találmány szerinti készítmény különösen hatásos ischaemiás történéseket követő reperfúziós károsodás kezelésénél.

A jelen találmány szerinti készítmény ischaemiás történéseket követő reperfúziós károsodás kezelésénél történő felhasználás esetén előnyösen plazmint vagy plazminképző proteint tartalmaz, beleértve a plazmin zimogénjeit és előaktivált zimogénjeit.

A jelen találmány szerinti készítmény felhasználható reperfúziós károsodás kezelésére, ami abból áll, hogy a páciensnek egy plazmint vagy egy plazminképző proteint és gyógyászatilag alkalmazható vivőanyagot tartalmazó gyógyászati készítményt adagolunk.

A jelen találmány tárgya alkalmazható továbbá a következő területeken: sebészeti beavatkozások, köztük transzplantációk eredményezte ischaemia és reperfúziós károsodás kezelésére.

Ez a felhasználás abból áll, hogy a sebészeti beavatkozás előtt vagy után álló páciensnek a találmány szerinti készítmények segítségével Lys-plazminogént adagolunk. Transzplantáció esetén ezen protein adagolása a szövetet vagy szervet kapó páciensnek megvédi az átültetésre kerülő szövetét vagy szervét csakúgy, mint a műtéti területet környező szöveteket és szerveket. Hasonlóképpen, ezen proteinek adagolása a szövetét vagy szervét adó páciensnek megvédi az átültetésre kerülő szövetet vagy szervet, és a műtéti terület körüli szöveteket és szerveket is.

A jelen találmány további tárgyát, sajátosságait és előnyeit a következő leírás és ábrák világítják meg.

Az ábrák rövid ismertetése

Az 1. táblázat a neurológiai deficit értékelésére szolgáló pontrendszer ismertetése.

A 2. táblázat egy patkánymodell alkalmazásával nyert kísérleti adatok összegzése a Lys-plazminogén kontrolihoz hasonlított terápiás hatásának értékelésére.

Az 1. ábra egy kontrollált kísérlet adatainak grafikus ábrázolása, amely a Lys-plazminogén hatását elemzi az agy nedvessétartalmára (ödéma) patkányoknál indukált ischaemia esetén. Az „A” olyan patkányokat jelöl, amelyeknél sebészeti úton idéztünk elő ischaemiát, és amelyek 500 egység/kg Lys-plazminogént kaptak iv. vér-újraátáramoltatással. A „B” olyan patkányokat jelöl, amelyeknél sebészeti úton idéztünk ischaemiát és 1,0 ml/kg izotóniás fiziológiás sóoldatot kaptak iv. vér-újraátáramoltatással. A „C” olyan patkányokat jelöl, amelyek egy áloperáción estek át és 1,0 ml/kg izotóniás NaCl-oldatot kaptak iv. (AB: p<0,001; BC: p<0,01; AC: p<0,05).

A 2. ábra puflfer agyi nedvességtartalomra (ödémára) való hatását értékelő kísérlet adatainak grafikus ábrázolása, patkányoknál előidézett ischaemiánál végezve, ami járulékos kontrollként szolgál a 3. ábra kísérletéhez. Az „A” olyan patkányokat jelöl, amelyeknél sebészeti úton idéztünk elő ischaemiát, és amelyek 1,0 ml/kg puffért kaptak iv. vér-újraátáramoltatással (n-7). A „B” olyan patkányokat jelöl, amelyeknél sebészeti úton idéztünk

HU 217 961 Β elő ischaemiát, és amelyek 1,0 ml/kg izotóniás NaCloldatot kaptak iv. vér-újraátáramoltatással (n=7). A „C” álműtéten átesett patkányokat jelöl, amelyek 1,0 ml/kg izotóniás NaCl-oldatot kaptak iv. (n=8). (AB n.s.; BC: p<0,01; AC: p<0,01).

A 3. ábra a Lys-plazminogénnek a neurológiai deficitre gyakorolt hatását értékelő kontrollált kísérlet adatainak grafikus ábrázolása, patkányon indukált ischaemiánál végezve. Az összpontszám egyedi értékelésén alapul, figyelembe véve a tudatállapotot, a járásmódot, az izomtónust és működést (átlagosan 3 napig állatonként). A maximális pontszám 54 (n=10 csoportonként). Az „A” olyan patkányokat jelöl, amelyeknél sebészeti úton hoztunk létre ischaemiát, és amelyek 500 egység/kg Lys-plazminogént kaptak iv. vér-újraátáramoltatással. A „B” olyan patkányokat jelöl, amelyeknél sebészeti úton idéztünk elő ischaemiát, és amelyek 1,0 ml/kg izotóniás NaCl-oldatot kaptak iv. vér-újraátáramoltatással. A „C” olyan patkányokat jelöl, amelyek álműtéten estek át, és 1,0 ml/kg izotóniás NaCl-oldatot kaptak iv. (AB: p<0,001; BC: p<0,001; AC: p=0,05).

A 4. ábra puffer neurológiai deficitre gyakorolt hatását értékelő kísérleti adatok grafikus ábrázolása patkányokon előidézett ischaemia esetén, ami az 5. ábrához tartozó kísérlet járulékos kontrolljaként szolgál. Az összpontszám egyedi értékelésen alapul, figyelembe véve a tudatállapotot, a járást, az izomtónust és működést (átlag 3 nap állatonként). A maximális pont 54 (n=6 csoportonként). Az „A” olyan patkányokat jelöl, amelyeknél sebészi úton ischaemiát idéztünk elő, és amelyek 1,0 ml/kg puffért kaptak iv. vér-újraátáramoltatással. A „B” olyan patkányokat jelöl, amelyeknél sebészi úton ischaemiát idéztünk elő, és amelyek 1,0 ml/kg izotóniás NaCl-oldatot kaptak iv. vér-újraátáramoltatással. A „C” olyan patkányokat jelöl, amelyek álműtéten estek át, és 1,0 ml/kg izotóniás NaCl-oldatot kaptak iv. (AB: p<0,001;BC: p<0,001; AC: p=0,05).

A jelen találmány szerinti készítmények lehetővé teszik ischaemiás történések kezelését, köztük agyi ischaemia és ischaemiás történés következtében fellépő reperfüziós károsodás kezelését. Jelen találmány lehetővé teszi továbbá az ischaemiás történések oly módon való kezelését, melynek során a konvencionális kezelésekkel összefüggésben álló káros hatások, mint a reperfüziós károsodás, elkerülhetők, illetve minimalizálhatók. A „kezelés” kifejezés - különböző nyelvi jelentéseinek megfelelően - a megelőzés enyhítésére, a betegségek vagy egyéb nemkívánatos körülmények minimalizálására vagy gyógyítására vonatkozik. Kimutattuk, hogy a plazmin és a plazminképző proteinek - ebbe a kategóriába tartozik a Lys-plazminogén, a plazmin egy előaktivált zymogénje - felhasználhatók a jelen találmány szerint az ischaemiás történést követő reperfüziós károsodás csökkentésére vagy kivédésére. Ez a jó hatás akkor is észlelhető, ha a reperfüzió már megkezdődött.

A Lys-plazminogén minden olyan formáját alkalmasnak tartjuk a jelen találmány szerinti felhasználásra, amelyik megőrzi a fentiekben ismertetett jótékony hatást.

Amennyiben a Lys-plazminogént előállítottuk, az itt ismertetett technikákat felhasználhatjuk annak eldöntésére, hogy a kapott anyag hatékony-e a fenti kezelésekben, azaz a reperfüziós károsodás terápiájára, és ha igen, a dózissáv meghatározására. Az ismertetett patkánystroke-modell egy egyszerű és relatíve olcsó módja az alkalmazott Lys-plazminogén hatásosságának in vivő vizsgálatára.

Lys-plazminogén nyerhető a Glu-plazminogén proteolitikus hasításával, a Glu-plazminogénről aminosavszekvenciák eltávolításával. A Lys-plazminogén előállítási módjait részletesebben a 0 353 218 számú európai szabadalmi bejelentés ismerteti. Lásd továbbá Neuwenhuizen, supra.

Az alábbiakban ismertetésre kerülő példa bemutatja egy - korábban nem ismert - hatását a Lys-plazminogénnek a reperfüziós károsodás kezelésében. Mostanáig a Lys-plazminogénnek csak a fibrinolízisben játszott szerepe volt ismert. Váratlan volt, hogy a plazmin vagy bármelyik plazminképző protein, mint a Lys-plazminogén, képes átjutni a vér-agy gáton, aminek a hatékonyságát szükségesnek tartották az agyi ischaemiás történés helyén.

A Lys-plazminogénnek más felhasználási területei is léteznek. A Lys-plazminogén segítséget jelent a szívmegállás utáni kezelésben. A Lys-plazminogén-adagolás megelőzheti az idegsejtek ischaemiás károsodását. A Lys-plazminogén használható továbbá a teljestestischaemia (shock) kezelésében, belszervek és az alsó végtagok ischaemiája esetén és a transzplantációra kerülő szervek előkezelésére, az ischaemia megelőzésére.

Az adagolási módok közé tartozik a trombus oldáskezelése tipikusan intravénás úton. A Lys-plazminogén alkalmazandó dózisának megállapításához a jelen találmány szerint figyelembe kell venni a páciens tömegét, és körülbelül 10-1000 kazeinolitikus egység (CU) adandó kilogrammonként. Előnyösen a dózis körülbelül 100-600 CU/kg, és még előnyösebben körülbelül 500 CU/kg. A Lys-plazminogén adagolható a vér újraátáramoltatása közben, ami akkor történik, ha a Lys-plazminogént konvencionális trombolitikus terápiával, mint például a t-PA-val együtt alkalmazzuk. A Lys-plazminogén előnyös hatást fejthet ki továbbá akkor is, ha a reperfüzió megkezdődése után adagoljuk. Előnyösen a Lys-plazminogént a reperfüzió megkezdődése előtt vagy annak kezdete után 30 perccel kell adagolni. A Lys-plazminogén-variánsokat és -progenitorokat olyan dózisban kell adagolni, ami a fent ismertetett dózistartománynak megfelelő hatást nyújtja.

A jelen találmány szerinti készítmény előnyös megvalósulási formája a fenti vegyületeket tartalmazó injektálható készítmények. Az e célra szolgáló készítmény szokásos módon tartalmaz gyógyászatilag alkalmazható vivőanyagot. Ebben a vonatkozásban például egy készítmény alapulhat egy Lys-plazminogén-puffer hordozón (9 g/1 NaCl, 1 g/1 Na₃-citrát χ 2H₂O, 3 g/1 L-lizin, 6 g/1 NaH₂PO₄x2H₂O és 40 000 KIU/1 aprotonin). A gyógyászatilag alkalmazható vivőanyagok közé tartoznak ebben a vonatkozásban egyéb vizes oldatok, nemtoxikus vivőanyagok, beleértve a sókat, konzerválóanyagokat, puffereket és hasonlókat, amint azt az

HU 217 961 Β alábbiakban ismertetik: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15. kiadás, Easton: Mack Publishing Co. 1405 1412. és 14611487. oldalak (1975) és The National Formulary XIV., 14. kiadás, Washington: American Pharmaceutical Association (1975); ezek tartalma hivatkozási alapként szolgál számunkra. Példák a nemvizes oldatokra: propilénglikol, polietilénglikol, növényi olaj és injektálható szerves észterek, mint az etil-oleát. A vizes vivőanyagok közé tartozik a víz, alkoholos/vizes oldatok, fiziológiás sóoldatok, parenterális hordozók, mint a nátrium-klorid, Ringer-dextróz stb. Az intravénás hordozók közé a folyékony és tápláló töltőanyagok tartoznak. A tartósítószerek közé tartoznak antimikrobás szerek, antioxidánsok, kelátképző szerek és inért gázok. A kötőkészítmény különböző komponenseinek pH-ja és pontos koncentrációja a területnek megfelelő rutingyakorlat szerint kerül beállításra (Goodman és Gilman’s The Pharmacological Basis Fór Therapeutics, 7. kiadás).

I. példa

A Lys-plazminogén hatása agyi ischaemia következményeire patkányban

Ebben a kísérletsorozatban Lys-plazminogén (gyártó: IMMUNO AG) hatását elemeztük kísérletesen előidézett ischaemia következményeire patkányban. Két különböző megközelítést használtunk az ischaemia neurológiai következményeinek becslésére. Az ischaemiát patkányban az alábbiak szerint idéztük elő.

Először hím Sprague-Dawley-patkányokat (300-400 g tömegűek) 350 mg/kg choral-hidrát ip. beadásával elaltattuk, majd katétert vezettünk be a véna jugularisba. Öt milliliter vért szívtunk le a juguláris katéteren keresztül (100 IU heparin a fecskendőben), hogy az átlagos artériás vérnyomás 6,67 · 10³ Pa-ra csökkentsük. A kipreparált artéria carotisok szabadon lévén, azokat a vérvétellel egy időben leszorítottuk. A leszorítást 30 perc múlva felfüggesztettük, és a levett vért visszaadtuk (reperfúzió). Fibrinkészítményt (Tisseel®) helyeztünk a sebre. Az állatok altatásban voltak teljes 24 óráig (23,5 óra a reperfúzió után). Miután visszanyerték az eszméletüket, mindegyik állatot alávetettük a következő procedúrának:

Az agyödéma becslése

Az állatokat állandó testhőmérsékleten tartottuk teljes 24 órán keresztül, éterrel elöltük, és az agyukat eltávolítottuk. Az agyödéma becslését a más fajról közzétett eljárások módosításával végeztük [Oh & Betz, Stroke, 22: 915-21.(1991)].

A nedvességtartalmat - ami különösen lényeges paraméter az ischaemia/reperfúzió indukálta agyödéma megbecslésénél - a következők szerint határoztuk meg: mindkét félteke tömegét megmértük, 17 órán keresztül 200 °C-on szárítottuk, majd a tömegüket ismét megmértük. A nedvességtartalmat a teljes nedvestömeg százalékos arányával fejeztük ki az alábbi képlet szerint:

nedvestömeg-száraztömeg nedvestömeg

A neurológiai deficit becslése

Az állatok idegrendszeri érintettségét az első, második és harmadik posztoperatív napon vizsgáltuk [Wauquier és munkatársai, Neuropharmacology, 28: 837-46. (1989)]. A tudatállapotot, járást, izomtónust, 45°-os dőlésszögű létrán mutatott teljesítményt és egy vertikálisan emelkedő forgó korongon nyújtott teljesítményt értékeltük az 1. táblázatban bemutatott pontrendszer alapján. Kiszámoltuk a három napra vonatkozó összpontszámot (maximális pontérték: 54).

1. táblázat

A neurológiai deficitet értékelő pontrendszer

	Leírás	Pont
Tudatállapot	normális nyugtalan apatikus zavart rohamok	0 1 2 3 4
Mozgáskészség	normális merev végtagok forgás mozgásszegénység állásképtelenség	0 1 2 3 4
Létrára mászás (45°)	felmászik 5 másodpercig lóg és emeli a hátsó lábát 5 másodpercig lóg <5 másodpercig lóg nincs megragadási reflex	0 1 2 3 4
Függőleges, forgó asztal	180°-os forgást kompenzál >5 másodpercig 180°-os forgást kompenzál <5 másodpercig 90°-ig tartja magát nem tud kompenzálni	0 1 2 3
Izomtónus	normális gyenge	0 1
Teljes pontszám		16
Halálozás (kivéve műtéti)		18

Lys-plazminogént (IMMUNO AG) adagoltunk intravénásán, katéteren keresztül mind a vénajugularisba, mind a farokvénába. Az adagolások növekvő koncentrációban történtek különböző időpontokban. Ischaemiás állatok izotóniás NaCl-oldattal kezelve pozitív kontrollként, míg álműtétnek kitett állatok izotóniás NaCl-oldattal kezelve negatív kontrollként szolgáltak.

A fentiekben ismertetett Lys-plazminogén-puffert mindezen eljárások felhasználásával vizsgáltuk különböző kísérletekben. A dózis, adagolási táblázat, kísérleti eljárások és eredmények összegzése a 2. táblázatban látható.

HU 217 961 Β

2. táblázat

Az intravénás Lys-plazminogén és puffer értékelésének összegzése patkánystroke-modell felhasználásával

Hatóanyag, dózis/kg	Adagolás	Eljárás	Eredmények
Lys-plazminogén, 200 CU	vérreperfüzióval	ödéma (3 csoport, n=9 vagy 10 mindegyikben)	protektívhatás-tendencia, nem szignifikáns
Lys-plazminogén, 250 CU	15 perccel az ischaemia kezdete előtt	ödéma (3 csoport, n = 15 vagy 17 mindegyikben)	hatástalan
Lys-plazminogén, 500 CU	az ischaemia kezdete előtt és vérreperfüzióval	ödéma (3 csoport, n = 1,5 mindegyikben)	szignifikáns védőhatás
Puffer analóg, 500 CU	az ischaemia kezdete előtt és vérreperfüzióval	ödéma (3 csoport, n = 6 mindegyiknél)	hatástalan
Lys-plazminogén, 500 CU	vérreperfüzióval	ödéma (3 csoport, n=6 mindegyiknél)	szignifikáns védőhatás (lásd 1. ábra)
Pufferanalóg, 500 CU	vérreperfüzióval	ödéma (3 csoport, n = 7 vagy 8 mindegyiknél)	hatástalan (lásd 2. ábra)
Lys-plazminogén, 500 CU	vérreperfüzióval	neurológiai deficit (3 csoport, n= 10 mindegyikben i	szignifikáns védőhatás (lásd 3. ábra)
Pufferanalóg, 500 CU	vérreperfüzióval	neurológiai deficit (3 csoport, n-6 mindegyiknél)	hatástalan (lásd 4. ábra)
Lys-plazminogén, 500 CU	30 perccel a vérreperfüzió után	ödéma (3 csoport, n = 8 vagy 9 mindegyikben)	szignifikáns védőhatás
Lys-plazminogén, 500 CU	60 perccel a vérreperfüzió után vagy előtt	ödéma (3 csoport, n = 5 vagy 6 mindegyikben)	hatástalan

Az 500 CU/kg Lys-plazminogén (és a kontrollként alkalmazott puffer) hatását ödémára az 1. és 2. ábra, a neurológiai deficitre a 3. és 4. ábra mutatja. A szignifikanciaértékek t-teszten alapultak ödéma esetén és a 35 Kruskal-Wallis-teszten, ami egy chi-négyzeteloszlást feltételez a neurológiai deficit esetén.

A Lys-plazminogén 500 CU/kg dózisa szignifikáns védőhatást mutatott a kísérletesen előidézett agyi ischaemia előfordulásában patkányban. Az adagolás eloszlása 40 nem játszott lényeges szerepet. Figyelemre méltó, hogy a Lys-plazminogén akkor is kifejtette védőhatását, ha 30 perccel a reperfúzió kezdete után adagoltuk. Ez ellentétben áll a flunarizin (egy, a klinikai gyakorlatban alkalmazott kalciumantagonista) standard terápiás mérésé- 45 vei nyert adatokkal. A flunarizin (0,63 mg/kg iv.) hatékony volt, ha a reperfüziós vérbejuttattuk, de hatástalannak bizonyult, ha 30 perccel a reperfuzió után alkalmaztuk (az adatokat nem adjuk meg).

A Lys-plazminogén (500 CU/kg) képes volt vissza- 50 fordítani az agyi ischaemia hatásait a kísérletes ischaemia patkánymodelljében nyert agyödéma- és neurológiaideficit-vizsgálatok alapján. A Lys-plazminogén-készítményben használt puffer hatástalan volt. A standard terápiás méréssel szemben (flunarizin) a Lys-plazmino- 55 gén hatékony volt, még ha 30 perccel a reperfúzió után alkalmaztuk is.

2. példa

A Lys-plazminogén hatása a sebészi beavatkozásokra 60

A sebészi beavatkozások szokásos velejárója a vérátáramlás megszüntetése egyes szervekben vagy szövetekben, amit általában érlefogással végeznek.

Az érintett szerv vagy szövet vérátáramlásának megszüntetése ischaemiás körülmények kifejlődését hozza létre a szervben vagy szövetben, ami azután reperfüziós károsodáshoz vezethet, amikor a vérátáramlás helyreáll. Ez az ischaemiás körülmény és az azt követő reperfúziós károsodás jelentős problémát jelent sebészeti beavatkozások esetén, amelyek közé tartozik a szervek vagy szövetek átültetése a befogadó személybe.

A transzplantáció magában foglalja az átültetésre kerülő szerv vagy szövet hosszú időtartamú vértelenítését, különösen, ha allogén vagy xenogén donorszervet vagy -szövetet használunk. A vértelenítés a szerv vagy szövet véráramlásának megszűnését okozza, amit a szerv vagy szövet eltávolítása követ a donorból. A vértelenítés a szerv vagy szövet véráramlásának megszűnését okozza, amit a szerv vagy szövet eltávolítása követ a donorból. A vértelenítés és a kivétel ischaemiát okoz az átültetendő szervben vagy szövetben. A transzplantált szerv vagy szövet véráramlásának helyreállítása az eljárás befejezése során reperfüziós károsodást okoz a szervben vagy szövetben csakúgy, mint a befogadó környező szerveiben és szöveteiben.

Azokban az esetekben, mint például a vesetranszplantáció, ahol a donor gyakran életben marad, a donor eltávolított veséje körüli testterületeket is meg kell védeni az ischaemiától és a reperfúziós károsodástól.

HU 217 961 Β

A jelen találmány szerint a sebészeti beavatkozások okozta ischaemiás körülmények és az azt követő reperfűziós károsodás megelőzhetők vagy kezelhetők olyan Lys-plazminogén-proteinekkel, amelyek rendelkeznek a Lys-plazminogén hatásával. Ezek a proteinek jótékony hatást fejthetnek ki a transzplantált donorszervekre vagy -szövetekre csakúgy, mint a donor és a recipiens környező szerveire és szöveteire. A Lys-plazminogén-hatású proteinek alkalmazása lehetővé teszi, hogy a szervek és szövetek prolongált ideig tolerálják az ischaemiát, valamint a reperfüzió okozta fiziológiás stresszt.

A szerv- és szövetkárosodás csökkenthető vagy teljesen megelőzhető Lys-plazminogén-hatású proteinek adagolásával a sebészeti beavatkozás kezdete előtt. Transzplantáció esetén a találmány szerinti proteinek adagolhatok a donornak a szerv vagy szövet eltávolítása előtt. A donor kezelhető szisztémásán vagy helyileg, a szervet vagy szövetet ellátó artériába a szerv vagy szövet eltávolítása előtt. Hasonló módon a szervet vagy szövetet befogadó is kezelhető az átültetés előtt azért, hogy a transzplantációs területet körülvevő szerveket és szöveteket, valamint a befogadóba ültetett szervet vagy szövetet is védjük. A Lys-plazminogén-hatású proteinek alkalmazhatók a reperfüzió alatt és után is.

Előnyösen a tiszta Lys-plazminogént alkalmazzuk a reperfúziós károsodás kezelésére. A szisztémásán alkalmazandó Lys-plazminogén hatékony dózisa 10-1000 CU/kg tartományban van. Előnyösen a dózis 100-600 CU/kg körüli, még előnyösebben a dózis körülbelül 500 CU/kg. Amennyiben helyi adagolást végzünk, a dózist úgy kell kiszámolni, hogy megközelítse a fent ismertetett szisztémás dózist a kezelt területen.

Megjegyzendő, hogy a leírás, az ábrák és a specifikus példák, amelyek a találmány előnyös megjelenési formái mutatják, illusztrációként szerepelnek és nem a jelen találmány korlátozását szolgálják. A találmány tárgykörében és szellemében történő különböző változtatások és módosítások az e területen képzettek számára világossá válnak a fenti tárgyalásokból és kinyilvánításokból.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás hatóanyagként egy Lys-plazminogént tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot szokásosan alkalmazott segédanyagokkal és ischaemia és/vagy reperfúziós károsodás megelőzésére és/vagy kezelésére alkalmas gyógyászati készítménnyé alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ischaemiás történést követő reperfúziós károsodás kezelésére alkalmas gyógyászati készítményt alakítunk ki.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ischaemiát követően kialakuló ödéma kezelésére alkalmas gyógyászati készítményt alakítunk ki.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szisztémás adagolásra alkalmas gyógyászati készítményt alakítunk ki.
5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lokális adagolásra alkalmas gyógyászati készítményt alakítunk ki.