SK18312002A3

SK18312002A3 - Derivát alebo analóg kyseliny pamoovej, spôsob jeho prípravy, farmaceutický prostriedok, diagnostická súprava a použitie

Info

Publication number: SK18312002A3
Application number: SK1831-2002A
Authority: SK
Inventors: Maria Grazia Gallo; Maria Grazia Cima; Fabrizio Giorgi; Maria Ornella Tinti; Paola Piovesan; Orlando Ghirardi
Original assignee: Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A.
Priority date: 2000-06-23
Filing date: 2001-06-15
Publication date: 2003-06-03
Also published as: US20060205967A1; CA2412568A1; EP1301463A1; AU784980B2; AU6942101A; KR100764886B1; KR20030017554A; US20080293812A1; BR0111933A; HK1058515A1; ITRM20000340A1; CN1449375A; ITRM20000340A0; CN1185210C; MXPA02012730A; PL360492A1; IT1317048B1; US20040029963A1; CZ20024123A3; WO2002000603A1

Description

Oblasť techniky

Predmetný vynález uvádza derivát alebo analóg kyseliny parnoovej. alebo jednu z ich iannaceulicky prijateľných solí, spôsob ich prípravy, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie na prípravu lieku na liečenie chorôb vyznačujúcich sa ukladaním amyloidných z.hlukov-agregátov.

Doterajší stav techniky

Prítomnosť uložených amyloidov a odchýlky neurónového cytoskeletonu patria medzi najznámejšie prejavy Alzheimerovej choroby (ACH). Tieto dve skutočnosti, ktoré zasahujú najmä cerebrálny kortex (kôru mozočka) v ranom štádiu, aj keď finálny patologický obraz choroby zasahuje celu centrálnu nervovú sústavu, sú dôležité, hoci nie sú samy o sebe dostatočnou podmienkou na prepuknutie choroby (Che M.(l988) rrontiers in Bioscience 3a. 32-37).

Vo všeobecnosti, a bez ohľadu na proteín, z ktorého sa tvorí, látku amyloid charakterizuje tcy že sa skladá z vláken s priemerom 7-8 nm. že má afinitu na C'ongo Red a je vo vode nerozpustná. Pri ACH sa vlákna amyloidu zhromažďujú mimo buniek, do mozočkového medzibunkového priestoru spodných obalov kortikálnych a meningálnych arteriol a vedú k vytváraniu troch rozličných makroskopických odchýlok: postihnutiu senilitou a difúznemu postihnutiu, ktoré sa však líšia podľa prítomnosti alebo ináč odchýlkou nervových procesov okolo centra uloženého amyloidu. a amyloidná angiopatia, ktorá je prejavom infiltrácie vláken amyloidu do stien artérií, medzi hladké svalstvo vlákna a vnútornú elastickú blanu.

Bez ohľadu na tvorenie amyloidov a špirálovitých íHamcntov bola zistená tažká synaptická rarcľrakcia v korlexe ľudí trpiacich na ACH. Približne 80 až 90 % neurónových spojení sa zničí v poslednej laze tejto choroby a táto odchýlka má aktuálny vzájomný patologický vzťah k dcmcncii. Pri analyzovaní trendu demencie by sa potvrdilo, že amyloid je skorá primárna odchýlka tejto choroby a že vnútroneurónové špirálovité filamenty sú medzistupňovým prejavom distresu neurónov, ktoré napokon strácajú svoje synaptické spojenia, s výsledným klinickým účinkom postupného úpadku mentálnych funkcií.

Rozpustná forma určitého typu amyloidu β. βA1-42- až doteraz považovaná za toxickú len vo forme zhlukov, sa podieľa na progresívnej strate pamäte a poznávacích funkcií pacientov s ACH. βΑι.42, ktorý sa produkuje v počiatočnej fáze choroby, potláča aktivitu dehvdrogenázy pyruvátu. ktorá zásobuje syntézu ACH. poskytujúc transport acetylu-CoA, znižujúc uvoľňovanie neurotransmiterov. upravujúc synaptické spojenia a spôsobujúc cholinergickú nedostatočnosť, ktorá je zodpovedná za chorobu.(Hoshi M., Takashima A., Murayama M., Yasutake K., Yoshida N., Ishiguro K., Hoshino T., Imahori K. (1997) The Journal of Biological Chemistry 272:4, 2038-2041).

Je známe, že mnohé farby sa viažu na amyloidné vlákna špecifickým spôsobom a najdôležitejšia z nich je Congo Red (CR). (Lorenzo A a Yankner B. A. 1994 PNAS 91: 12243-12247).

Farba vyvoláva zvyšovanie dvojitej refrakcie amyloidných vláken, a tak vzniká charakteristický cirkulárny dichroizmus vyvolaný špecifickou interakciou medzi farbou a substrátom (vlákna) a umožňuje diagnostické zisťovanie amyloidózy v tkanive.

β-amyloidný proteín (βΑ) sa derivuje proteolytickým pôsobením mnohých špecifických enzýmov na prekurzore amyloidného proteínu (βΑΡΡ) (Vassar R. et.al. 1999 Science 286'; 735-740).

Existujú početné mechanizmy ako zlomok β-amyloidu môže vyvolal neurotoxické účinky. Po prvé, imunohistochemické štúdie preukázali prítomnosť, pri postihnutí senilitou, zápalových interleukínov (IL-1, IL-6), doplnkových faktorov, iných zápalových faktorov a lyzozómových hydroláz. Preukázalo sa, že β-amyloid je schopný stimulovať syntézu a oddeľovanie IL-1, IL-6 a IL-8 mikrogliálnymi bunkami, a tak aktivovať cytotoxické mechanizmy akútneho zápalu (Sabbagh M. N., Galasko D., Thal J.L. (1997) Alzheimer's Disease Review 3, 1-19).

Choroby vyznačujúce sa ukladaním amyioidových zhlukov zahŕňajú, okrem Alzheimerovcj choroby. Downov syndróm, dedičnú mozgovú hemorágiu spojenú s ..holandským typom“ amyloidózy, amyloidózu spojenú s chronickým zapalom, amyloidózu spojenú s multimyelanózou a iné dyskrázie B krvných lymfatických buniek, amyloidózu spojenú s diabclom typu II. amyloidózu spojenú s priónovými chorobami

J ako napr. Creulzíeldi-Jakobova choroba, Gerstniann-Slrasslerov syndróm, kuru a chorobu oviec (scrapie).

Všeobecne však možno škody spôsobené βΑ zhrnul'ako:

1. odchýlky amyloidnej genézy:

2. vzrast náchylnosti neurónov na exocytózu;

3. vzrast náchylnosti neurónov na hypoglykemické poškodenia;

4. odchýlky homeostázy vápnika;

5. vzrast oxidatívnych škôd;

6. aktivovanie zápalových mechanizmov;

7. aktivovanie mikroglií;

8. vyvolanie lyzozómovej proteázy;

9. odchýlky tau proteínovej fosforylácie;

10. vyvolanie apoptózy;

11. poškodenie membrán.

Z čisto teoretického hľadiska možno redukciu poškodení vyvolaných βΑ riešiť rôznymi liečebnými postupmi:

1. znížením produkcie βΑ použitím sekrečných inhibítorov na zmenu metabolizmu APP ( zvýšením a alebo znížením β a y sekrétov);

2. prevenciou alefeo blokovaním agregácie-zhlukovania βΑ;

3. zvýšením čírenia βΑ;

4. blokovaním neurotoxických účinkov βΑ zavedením kalciovej homeostázy;

5. prevenciou proti toxicite, ktorú produkujú voľné radikály;

6. prevenciou proti exocytóze;

7. redukciou poškodenia spôsobeného zápalovou reakciou;

8. úpravou zmenenej rovnováhy med’-zinok;

9. inhibovaním neurónovej apoptózy;

(Sabbagh M.N., Galasko D., Thal J.L. (1997) Alzheimer's Disease Revievv 3, 1-19). Doteraz neexistuje žiadna špecifická terapia schopná robiť prevenciu, spomalil alebo zastaviť amyloidogénny proces, ktorý tvorí základ Alzheimerovej choroby.

V súčasnosti sú terapie používané na liečenie tejto choroby výlučne symptomatické, a hoei pôsobia z rozdielnych aspektov, v zásade sa nezhodujú len na mechanizmoch neurotransmiteľov regulujúcich učenie a pamäť. Medzi molekulami, ktoré sa najbežnejšie vyskytujú, sú reverzibilné inhibitory acetylcholín esterázy. napr. tacrín. donezepil a ri\astigmin.

V súčasnosti navyše, jedinými diagnostickými nástrojmi, ktoré sú k dispozícii na diagnostikovanie Alzheimerovej choroby je vyšetrenie správania a klinické výsledky, zatial čo rádiografické a scintigrafické vyšetrenia ešte nie sú schopné presne rozlišovať medzi formami degenerácie Alzheimerovho typu a inými degeneratívnymi javmi, presným dôvodom je nedostatok vhodných predchádzajúcich zistení.

Pri zvládaní Alzheimerovej choroby bojujeme najmä s jej krutosťou a problém riešenia pri jej diagnostikovaní nie je významný len na určenie nových liekov schopných liečiť túto chorobu, alebo spomalenie jej vývoja, ale aj na objavenie zlúčenín¹používaných na jej diagnostikovanie pri rádiografických a scintigrafických vyšetreniach.

Je preto prekvapujúce, že kyselina pamoová, alebo jeden z jej derivátov alebo analógov, alebo jedna z jej farmaceutický prijateľných solí, alebo deriváty spomínanej kyseliny opísané,a známe z literatúry, sa preukázali ako potenciálne účinné lieky pri liečení a prevencii Alzheimerovej choroby a chorôb vyznačujúcich sa ukladaním amyloidných zhlukov.

Podstata vynálezu

V súvislosti s týmto zistením sú teraz opísané deriváty kyseliny pamoovej, ktoré sú potenciálne účinné pri liečení hore uvedených chorôb a ktoré sa preukázali ako užitočné činitele na prípravu liečiva na liečenie chorôb vyznačujúcich sa ukladaním amyloidných zhlukov.

Podstatou vynálezu sú teda deriváty kyseliny pamoovej všeobecného vzorca I

(D v klory’Oi:

i;¹ - p. ' - -cgocí· hCrii-h

R.² = ŕ.” ’= -OH

P? - -CH?-

2. R ^!-R⁵ = -COOCJi(CH₃)₂

R² - R⁴ - -OH

R' = -CH_?-

3. R¹ - R' - -COOCjlL

R² = R⁴ - -OH

P? - -CH_;-

4. R^; = R' = -COOC₆H_!1

R² = R⁴ = -OH

R³ --- CI-R-

5. . R^: =·· R⁵ - -COOCI-b,

R² R⁴ - -OH

R³ - -CH,··

6. R¹ = R -COOCíCi-hh

R² 10 - -OH

R- · -; II·:sú op,.sané v patente ES 432416, a pre tieto zlúčeniny nie je opísané ani nárokované

7. R¹ = R⁵ = -CONHC₆Hs

R² = R⁴ = -OH

R’ = -Cbbje opísaný v patente JP 71 38347 ako užitočné činidlo na prípravu nylonových \ láken;

8. R¹ = R⁵ = -CON H-01(01(0 Iý)₂)-COOH

R² = R⁴ = -OH

R ’=-·-Obje opísaný v Reetz. Manfred T.et al; Chem. Commun, (Cambridge) (1998), (19), 20752076 ako inhibitor proteázy HIV-1;

9. R¹ = R⁵ =-COOH

R² = R⁴ = -COOH

R³ = -CH₂je opísaný v Poupelin, Jean Pierre; Eur. J. Med. Chem. -Chim. Ther. (1978), 13(4), 3815, ako činidlo s protizápalovou aktivitou;

10. R¹ = R⁵ =-COOH

R² = R⁴ = -OCOCH2CH3

R³ = -Obje opísaný v patente DE 1945254, ktorý uvádza, že soli tejto zlúčeniny so streptomycínom vytvárajú dlhšie trvajúci účinok ako činidlo na liečenie tuberkulózy;

11. r' = r⁵ = -h

R² = R⁴ = - OCOCôHs

R³ = -Cl-b12 R' = R⁵ = -H

sú opísané v Dorogov, M. V.; Khim. Khim. Tekhnol. (1996). 39 (4-5), 170-172; nie je uvedené žiadne použitie;

13. R' = R^S = -1I

R² = R⁴ =-OCOCH=CI-l·

R' - -Cl-l·je opísaný v Kielkiewicz. Jedrzej. et al.; Polimery (W’arsaw) (1984).29 (6). 216-19; neuvádza sa žiadne použitie: ¹ _:

14. R¹ -R⁵ = -H

R^? = R’* = -OH

R' - -CH_?táto zlúčenina je 1.1 -metylén-di(2-naftol). ktorá je opísaná v US 4,147,806 ako protizápalové a analgetické liečivo;

15. R¹ = R⁵ --COOH

R² - R⁴ = -OH

R' - -CH₂táto zlúčenina je kyselina pamoová; je opísaná ako činidlo užitočné ako protiión v liekoch používaných ako antihelmintické činidlá (Pyrantel pamoate) alebo pri liečení rakoviny (Octreotide pamoate).

Predmetom tu opísaného vynálezu je teda použitie kyseliny pamoovej alebo jedného z jej derivátov, alebo jedného z jej analógov, alebo jednej z ich farmaceutický prijateľných solí všeobecného vzorca I

0) v ktorom:

R¹ a R’’, ktoré môžu byť rovnaké alebo rozdielne, sú COOR⁶, C'ONHR⁶, SCbR⁶, SO<NHR, SO_?R⁶. OR⁶. COR⁶, NHR⁶. R⁶;

kde R⁶ je H alebo priamy, rozvetvený, nasýtený alebo nenasýtený alkylový reťazec s 1 až 5 atómami uhlíka, alebo fenyl substituovaný R⁷;

kde R⁷ je OH. COOH, SO₃H, NR^XR⁹.

v ktorých:

R^S a R'. ktoré môžu byť rovnaké alebo odlišné, sú H. alkyl s I až 5 atómami uhlíka;

R a R⁴, ktoré môžu byť rovnaké alebo odlišné, sú H, OH, NHR⁶. OCO-R¹⁰NR^SR⁹,

CH,

CH₃

v ktorých R¹⁰ je priamy alebo rozvetvený, nasýtený alebo nenasýtený alkvlový reťazec s 1 až 5 atómami uhlíka;

R³ je -[CH₂]n-, -CH₂-O-, -CH(R)-, v ktorom n je celé číslo od 1 do 4,

R¹¹ je priamy alebo rozvetvený alkyl s 1 až 5 atómami uhlíka, substituovaný aminoskupinou, alkylamino C|-C>. dialkylamino C|-Cs, OH, alkyloxy C i-C5;

na prípravu liečiva na liečenie chorôb vyznačujúcich sa ukladaním amyloidných zhlukov.

Spomedzi zlúčenín vzorca I sa uprednostňuje kyselina pamoovä, a najmä pamoál sodný.

Ďalším predmetom tu opísaného vynálezu je použitie hore uvedených zlúčenín vzorca I na prípravu súpravy na diagnostikovanie chorôb vyznačujúcich sa ukladaním amyloidných zhlukov.

V skutočnosti zlúčeniny podľa tu opísaného vynálezu môžu vo svojej molekulovej štruktúre obsahovať atómv prvkov bežne používaných pri modelových diagnostických vyšetreniach. Napríklad, rádioaktívne izotopy uhlíka, dusíka, kyslíka, jódu a india sa môžu zaviesť do ich molekulovej štruktúry. Presnejšie, zlúčenina vzorca

I môže mať najmenej jeden z prvkov, uhlík, vodík, dusík, kyslík \ lastnej molekulovej štruktúry substituovaný zodpovedajúcim rádioaktívnym izotopom: alebo bude niesť najmenej jeden atóm rádioaktívneho jódu; alebo je vo forme zlúčeniny s rádioaktívnym indiom.

Také izotopy sú užitočné pre také techniky ako napr. PET (Positron Emission Tomography). SPĽCT (Single Photon Emission Computerized Tomography) a planárna scintigrafia. Prípadne sa zlúčeniny podľa vynálezu, či už obsahujú alebo neobsahujú rádioaktívne izotopy, alebo atómy prvkov užitočných ako rádioblokátory ( napr. jód), môžu používať ako zlučujúce činitele pre prvky bežne používané pri modelových diagnostických technikách, ako napr. gadolínium (NMR) a technécium (scintigrafická technika).

Na základe tejto diagnostickej aplikácie sú zlúčeniny podľa vynálezu užitočné tiež pri prevencii hore uvedených chorôb.

Ďalším predmetom tu opísaného vynálezu sú nové zlúčeniny všeobecného vzorca I

(D v ktorých:

R¹ a R\ ktoré môžu byť rovnaké alebo odlišné, sú COOR⁶, CONHR⁶, SO2R⁶, SO2NHR^Ó. SO₃R⁶, OR⁶, COR⁶, R⁶;

v ktorých:

R⁶ je H alebo priamy alebo rozvetvený, nasýtený alebo nenasýtený alkylový reťazec s 1 až 5 atómami uhlíka, alebo fenyl substituovaný R⁷;

v ktorom:

R⁷ jc Ol-I. COOH, SO3H, NR^SR⁹,

OH

v ktorých:

R⁸ a R⁹, ktoré môžu byt rovnaké alebo odlišné, sú H. alkyl s 1 až 5 atómami uhlíka;

R’ a R⁴, ktoré môž.u byť rovnaké alebo odlišné, sú H, OH. NHR⁶, OCO-R¹⁰NR^SR⁹.

v ktorých:

R¹⁰ je priamy alebo rozvetvený, nasýtený alebo nenasýtený alkylový reťazec s 1 až 5 atómami uhlíka;

R³ je [CH₂]_n., -CH2-O-, -CH(R)-, v ktorom n je celé číslo od 1 do 4,

R¹¹ je priamy alebo rozvetvený alkyl s 1 až 5 atómami uhlíka, substituovaný aminoskupinou. alkylamino C1-C5, dialkylamino C1-C5, OH, alkyloxy Cj-Cs;

s podmienkou, že substituenty R¹, R², R³, R⁴ a R⁴ nie sú:

R¹ = R⁵--COOCH₂C₆H₅

R² = R⁴ = -OH

R³ = -Cl-b-

R¹ - R⁵ = -COOCH(CH₃)₂ r² = r⁴ = -oh·

R³ - -CH₂-

R¹ = R⁵ =-COOC2H5

R² = R⁴ = -OH

R³ = -CH₂-

R¹ - R⁵ = -COOCJ I11

R² - R⁴ = -OH

R’ - -Cl 1₂-

R¹ = R^? =-COOCI I;,

I I

R² - R⁴ = -01-1

R³ = -CH_?-

R¹ = R⁵ =-COOCíCIT,)·

R² = R⁴ - -OH

R³ = -CH₂-

R¹ = R⁵ = -CONHCcJ-l?

R² = R⁴ = -OH

R’ = -CH₂-

R' = R^? = -H

R² = R⁴ = -OCOC₆H₅

R³ = -CH₂-

R¹ = R⁵ =-H

R³ =-CH-₂-

R¹-R⁵--H

R² = R⁴ = -OCOCH-CH₂

R³ = -CH₂-

R¹ -R⁵--H

R² = R⁴ = -OI-I

R³ = -CH₂-

R¹ = R⁵ =-COOH

R² = R⁴ = -OH

R³ - -CH₂Ďalším predmetom tu opísaného vynálezu je spôsob prípravy zlúčenín všeobecného vzorca I

R5 (1) v ktorých:

R¹ a R⁵ sú -COOR'’.

R'. R'. R⁴ a R' majú hore definovaný význam, vyznačujúce sa tým. že na zlúčeninu všeobecného vzorca I. v ktorej R⁶ je H. sa pôsobí halogeniz.ujúcim činidlom, napr. SOCC alebo PCIs. aby sa získal zodpovedajúci acvlchlorid. ktorý potom reaguje pri teplote 25 až 60 °C v časových úsekoch od 2 do 24 hodín, pri miešaní s alkoholom R^b-OH v molárnom pomere 1 až 6, alebo v inertnom bezvodom rozpúšťadle, ako je napr. dimetylíbrmamid, so stechiometrickým množstvom R^-OH-.

Ďalším predmetom tu opísaného vynálezu je spôsob prípravy zlúčenín vzorca 1

v ktorom R¹ a R” sú CONHR⁶;

R², R^J a R° majú už vyššie uvedený význam, vyznačujúci sa tým, že na zlúčeninu všeobecného vzorca I, v ktorom R⁶ je H, sa pôsobí halogenizujúcim činidlom ako SOCb alebo PCls. aby sa získal zodpovedajúci acylchlorid, alebo párové činidlo napr. DCC, EEDQ, ktorý potom reaguje počas miešania pri teplote 25 až 60 °C v časových úsekoch od 2 do 24 hodín s R⁶-NH₂ amínom v molárnom pomere 6 ku 1. alebo v inertnom bezvodom rozpúšťadle so stechiometrickým množstvom R⁶-NH2Ďalším predmetom tu opísaného vynálezu je spôsob prípravy zlúčenín vzorca I

(I) v ktorom

R² a R⁴ sú OH;

R' a R⁵ sú SO₃R⁶. SO2NHR⁶;

R' je-CH(R)-.

v ktorom R¹¹ má vyššie uvedený význam:

vyznačujúci sa tým, že spomínané proces je uskutočňovaný podľa reakčnej schémy 1, kde zlúčenina vzorca ,,a^;' reaguje s R^h-CHO aldehydom v glaciálnej kyseline octovej pri teplote 90 až 150 °C, aby sa získali zlúčeniny všeobecného vzorca „b“. Následne sa na zlúčeninu všeobecného vzoica „b^;i pôsobí halogenizujúcim činidlom, napr. SÔCH alebo PCI5. aby sa získal zodpovedajúci sulfonylchlorid. ktorý potom reaguje s R^Ď-OH alkoholom, aby sa získali zlúčeniny všeobecného vzorca ,.d, alebo s R⁶-NH2 aminom, aby sa získali zlúčeniny všeobecného vzorca

Schéma 1

SO₂NHR_e

v ktorom

R¹, R², R⁴ a R^? sú OR⁶ a / alebo NHR⁶; R³ je -CH(R'¹)-.

v ktorom R⁶ a R¹¹ majú vyššie uvedený význam, vyznačujúci sa tým, že spomínaný spôsob je uskutočňovaný podľa reakčnej schémy 2, kde zlúčenina vzorca A reaguje s R” -CHO aldehydom v kyslom prostredí, napr. v kyseline octovej, aby sa získala zmes zlúčenín zodpovedajúcim vzorcom B, C a D, ktoré sa chromatograficky oddelia a čistia. Tieto zlúčeniny reagujú s alkylhalidom R⁶-X v prítomnosti zásady a potom sa odchránia v kyslom alebo zásaditom prostredí, aby sa získali odpovedajúce naftvlétery E, F a G. Po pôsobení NäNO₂ na posledný v kyseline sírovej sa získajú zlúčeniny H, I a L.

Schéma 2

PG = chrániaca skupina (napríklad acetyl, tosyl)

R11 — CHO ’’

Ďalším predmetom tu opísaného vynálezu je farmaceutická zmes obsahujúca zlúčeninu všeobecného vzorca I ako aktívnu zložku

(I) v ktorom

R¹, R², R^J. R⁴ a R’ majú vyššie uvedený význam, s podmienkou, že R¹, R², R³, R⁴ a R? nie sú :

R = R⁵ = -COOCH₂C₆H₅

R² = R⁴ = -OH

R’ = -CH₂-

R¹ = R⁵ =-COOCH(CH₃)₂

R^ľ - R⁴ =; -OH

R’ = -CH₂-

R¹ = R^s = -COOC₂H₅

R² - R⁴ = -011

R ' - -Cll₂-

R¹ = R⁵ = -0000(.11,,

R^: = R⁴ =-OH

R³ = -011₂-

R¹ - R⁵ = -000011;

R = R* = -OH

R³ = -CH₂-

R¹ = R⁵ =-0000(0H₃)₃R- = R⁴ = -OH

R³ = -CH₂-

R^: = R⁵ = - CONHCôH;

R² = k⁴ = -oh

R³ = -CH₂-

R’=R⁵ = -H

R² = R⁴ = -OCOCôHs

R³ = -CH₂-

R‘ = R⁵ = -H

R³ = -CŕĹ-

R'=R⁵ = -H

R² = R⁴ = -OCOCH = CH₂

R^J = -CH₂-

R' = R⁵ = -H ^!

R² = R⁴ = -OH

R³ = -CH₂-

R' = R⁵ = -COOH

R² = R⁴ = -OH

R³ = -CII₂a farmaceutický prijateľný excipient a/alebo riedidlo.

Dole uvedené početné príklady majú ďalej objasniť vynález.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava (2/?)-2-(acetyloxy)-4-( i 3-karboxy-1 -[(3-karboxy-2-hydroxy-1 -naftyľ)metyl]-2- , nafty! Joxy)- N. N. N- trimeiyl-4-oxo-l-butanamínchlorid (ST 1722)

COOH

Roztok 2,39 g (0,01 mol) acetylchloridu L-karnitínu, 2 ml bezvodého CH2CI2 a 1,1 ml (0,015mol) tionylchloridu sa miešal 4 hodiny pri izbovej teplote Rozpúšťadlo sa odstránilo a zvyšná pevná látka sa trikrát premývala s bezvodým CH2CI2. Bol získaný olej, menovite chlorid acetylchloridu L-karnitínu, ktorý bol použitý v nasledujúcom kroku.

Suspenzia 2,58 g (0,01 mol) acylchloridu acetylchloridu L-karnitínu, 3,88 g (0,01 mol) kyseliny pamoovej a 10 ml N-metyl- 2-pyrolidinónu sa miešala jednu noc. Po vyzrážaní etyléterom sa získala pevná žltá látka (7 g ). Takto získaný surový produkt sa chromatografický čistil na kremíkovom gélovom stĺpci, najprv sa vymýval s CLHCHMeOH 90:10, aby sa pozbierala nezreagovaná kyselina pamoová, a potom s Cl-bCH MeOH 85: 15, aby sa pozbieral produkt. Po odstránení rozpúšťadla sa získalo 1,2 gramov (27?)-2-(acetyloxy)-4-({ 3-karboxy-1 -[(3-karboxy-2-hydroxy-1 -naftyl)metyl ]-2naftyl }oxy)-N,N,N-trimetyl-4-oxo-1 -butanaminínchloridu.

Výťažok = 19,7 %, MP = rozkladá sa pri 185 °C, [a]d²⁰ = -175°, 'H NMR (DMSO, 300 MHz), δ 7,1 - 8,5 (m, 10H, H_- Ar), 5,50 (m, 1 H, -C-CH-C-N), 4,76 ( s, 2H, Ar-CH_rAr), 3,70 (m, 2H, -CH_Z-N), 3,11 (s, 9H, -N-CH3), 2,85 (m. 2H, CH2-COOH-), 2.01 (s. 3H. CH3.COO-).

Kí·’ = 1.4 %

Hodnoty C, H, N počítané pre C32H32NO9CI a upravené pre množstvo vody predstavujú: C, 63,00; H, 5.29, N, 2,30; nájdené C. 60,45; H, 5,83, N, 2,87.

IS

Príklad 2

Príprava (2/?)-2-(acelyloxy)-4-({ 1 -((2-hydroxy-l -naíÍyl)metyl]-2-naťlyi }oxy)-N,N.Ntrimety 1-4-oxo-1 -butanaminchlorid (ST 1 745)

Roztok 2.39 g (0.01 mol) acetylchloridu L-karnitínu, 2 ml bezvodého CHjCl? a 1. ml (0,015 mol) tionylchloridu sa miešal 4 hodiny pri izbovej teplote. Rozpúšťadlo bolo odstránené a zvyšná pevná látka sa trikrát premývala bezvodým CH2CI2· Získal sa olej, menovite acylchlorid acetylchloridu L-karnitínu, ktorý sa použil pri nasledujúcom kroku.

K roztoku 2,58 g (0.01 mol) acylchloridu acetylchloridu L-karnitínu v CH3CN (5 ml) sa pridali 3g (0,01 mol) l,ľ-metylén-di(2-naftolu) (ST 1859). Zmes sa miešala cez noc pri izbovej teplote. Po vyzrážaní s etyléterom sa získal surový produkt. Tento produkt sa premýval dietyléterom, sušil sa vo vákuu a čistil sa silikagélovou chromatografiou (zmes 9:1 CbLCL/MeOH). Úlomky, ktoré obsahovali produkt, kontrolovaný TLC, sa skombinovali. Rozpúšťadlo sa odstránilo a získali sa 2g (0,0038 mol) (27?)-2-(acetyloxy)-4-({ 1-[(2-hydroxy-l -naftyl)metyl]-2-naftyl}oxy)-N.N,N-trimetyl-4-oxo-l -butanamínchloridu (ST 1745). Výťažok = 38 % '1-1 NMR (DMS0.300 MHz), δ 10,05 (s, 1H, -OH). 7,15-8,3 (m, 12H, H-Ar), 5,55 (m, 1H, -C-CH-C-N), 4,65 (s,2H, Ar-CH_Z-Ar), 3,6-3.9 (m, 2H, -CH_Ž-N), 3,10 (s, 9H, -N-CH₂). 2.95 (m, 2H, -CHj-COO-), 2,00 (s, 3H, CHj-COO-).

K.F = 4.4 %

Hodnoty C. H. N vypočítané pre C30H32NO5CI pre množstvo vody predstavujú: C. 69.02; H. 6.18: N. 2.68; nájdené C. 68,6; I I, 6,3; N, 2,61.

Príklad 3

Príprava 2-(! I -[(2-hydroxy-1 -naítyľ)melyl]-2-naftyl}oxy)-2-o.xoeanamínchloridu (ST

1913)

Do roztoku 2 g (0.011 mol) N-f/Ĺ’/'c-buloxykarbonylj-glycínu (BOC-GLY-OH) v 2 ml toluénu sa pridalo 0,62g (0,011 mol) KOH a 2 ml l-HO.

Zmes bola podrobená azeotropickej destilácii (150 °C), aby sa odstránila voda. Získaný roztok sa schladil pri 0 °C a pridalo sa 0,85 mi izobutanolu, 11 μΙ (d = 0,92, 0,1 mmol) N-metylmorfolínu a 1,68 ml izobutylchloroformu (d - 1,044, 0,0128 mol). Reakčná zmes sa miešala 2 hodiny pri 0 °C'.

Následne sa pripravil roztok 1,65g I,ľ-metylén-di(2-naftolu) (ST 1859) (0,0055 mol) a 0,62g KOH v 15 ml H₂O. Tento roztok sa pridal do reakčnej zmesi a miešal sa pri izbovej teplote. Po 1 hodine sa pH upravilo na 3 s 3N HCI a fázy sa rozdelili. Organická fáza, toluén, bola vylúčená s 20 ml H₂O upravenej na pH 9 s 3N NaOH a premývaná vodou, až kým nebola neutrálna. Oddelená organická fáza sa sušila nad Na₂SO₄ a rozpúšťadlo sa odstránilo, aby sa získal surový produkt. Po rekryštalizácii z n-hexán/etyloctänu 8:2 sa získalo 0,2g produktu, ktorý sa rozpustil v 1 ml kyseliny trifluóroctovej pre hvdrolýzu /ŕvc-butoxykarbonylu. Po 20 minútach sa získala vyzrážaná pevná látka, ktorá sa filtrovala a premývala zmesou /7-hexán/dietyléter 8:2. Získaný produkt sa rozpustil v metanole a prešiel cez živicu A21/ C1 premývajúc sa v 100 ml MeOH, aby sa získalo 60 mg 2-({ )-[(2-hydiOxy-l-naftyl)metyl]-2-nafty!}oxy)2-oxoetanamínchloridu (ST 1913).

'H NMR (DMSO, 300 MHz), δ 9,6 (s, 1H, -OH), 8,7 (s, 3H,-NH3), 7,2-8,4 (m, 121-1, H-Ar), 4,7 (s, 2H, Ar-CH₂-Ar), 3,72 (s, 2H, C-CH₂-N).

Kf= 1,2%

I íodnoly C, H, N vypočítané pre C₂ J-I₂(NO',CI a upravené pre množstvo vody predstavujú: C, 70,14; í l, 5,12; N. 3,56; nájdené C, 69,1; I I, 5,4; N, 3,3.

Príklad 4

Príprava 2-(.; 4-[( 3-{[2-dietylamónium)etoxy]karbonyl)-2-hydroxy-l -naftyljmetyi J-3hydroxy-2-natioyl}oxy)- N.N-dielylelaiiamíndicliloridu (ST 1800)

3,88g (0.0) mol) kyseliny panicovej (ST 1641) bolo rozptýlených v 4.36 ml tyonilchloridu (0.06 mol) a znovu roztavených počas 5 hodín pri teplote 80 °C. Nakoniec sa rozpúšťadlo odstránilo vo vákuu a zvyšky bolo premyté dietyléterom. Získaný acylchlorid bol rozptýlený v 30 ml CHjCb a bolo pridaných 0,7 ml N,Ndietyletanolu po kvapkách. Zmes sa cez noc miešala pri izbovej teplote. Nakoniec sa získala pevná biela látka, ktorá sa filtrovala a premývala zmesou /7-hexán/ety octanu 8:2 a získalo sa 0,?g 2-({4-[(3-{[2-dietylamónium)etoxy]karbonyl}-2-hydroxy-l-naftyl) metyl]-3-hydroxy-2-naftoyl}oxy)-N,N-dietyletanamíndichloridu (ST 1800).

^lH NMR (CDCR, 300 MHz), δ 10,05 (s, 2H, -OH), 7,1-8,4 (m, 10H, H-Ar), 4,85 (s, 2H, Ar-CH_;-Ar), 4,55 (t, 4H, -O-CH2-CH2-N), 3,0 (t, 4H, -O-CH₂-CH₂-N), 2,75 (m, H, -N-CH2-CH3), 1,0 (t, 12H, -N-CH2-CH3)

KF = 0.S %.

Hodnoty C, H, N vypočítané pre C35H44N2O6CI2 a upravené pre množstvo vody predstavujú: C. 63,72; H, 6,72; N, 4,24; nájdené C, 63,5; H, 5,87; N, 4,6.

Príklad 5

Vyhodnotenie prolizhlukových účinkov pamoátu sodného (ST 1641) na β-amyloid 25-35 peptid

Do 250 μΙ roztoku obsahujúceho pamoát sodný 2mM a fosfátový pufer 200mM s pl I 5 bolo pridaných 250 μΙ vodného roztoku βΑ25-3> 2mM (cat. Bachem n° 11

1192.0001). Bolo získaných 500 μΐ roztoku pamoátu sodného 1 mM. βΑ2?-35 1 mM a fosfátového pufra 100 mM s pH 5.

Rovnaký proces bol uskutočnený pri kontrolnej vzorke, kde nebol prítomný pamoál sodný.

Po 24 hodinách pri izbovej teplote boli vzorka a kontrola odstreďované 20 minút pri 12 000 otáčkach za min., čím sa oddelili usadené pevné látky zo supernatanlov. K usadeným pevným látkam sa pridalo 250 μΐ vody. Po 3 hodinách sa pri izbovej teplote vzorky opäť odstred’ovali 20 minút pri 12000 otáčkach za minútu. Po odstredení nebola pozorovaná vo vzorke prítomnosť pevnej látky na rozdiel od kontrolnej vzorky. Tento výsledok demonštroval úplnú inhibiciu zhlukovania QAas-as peptidu vo ftbrilách pomocou pamoátu sodného.

Príklad 6

Vyhodnotenie protizhlukových účinkov pamoátu sodného (ST 1641) na P-amyloid|.42 peptid

Protizlilukové účinky pamoátu sodného na β A 1.42 peptid sa vyhodnocovali meraním tiofíavínu T viažúceho sa podľa nasledujúceho postupu.

βAi-4i peptid (cat. Bachem n° H- 1368.0500) s koncentráciou 0,22 mM bol inkubovaný 5 dní pri 37 °C v tris pufri 100 mM pH 7,4 samostatne alebo v prítomnosti pamoátu sodného. Molárne pomery peptidu k pamoátu sodnému všeobecne boli 1:8, 1:4 a 1:2.

Roztok sa odstreďoval 5 minút pri 13 000 otáčkach za min. a supernatant sa vylúčil. Vyzrážaná látka sa premývala v 500 μΐ vody a odstreďovala sa 5 minút pri 13 000 oláč. za min. Vo vyzrážanej látke sa zistil zhluk 600 μΐ tiofíavínu T (ThT) 2 μΜ rozpusteného v glycín-NaOH pufri 50mM, pH 9,4. Po 5 minútovej inkubácii bolo 500 μΙ vzorky premiestnenej do štvorcovýcch kyviet a fluorimetrický signál bol určený v spcktrolbiofluorimetri pri cxcilácii 420 nm a emisii 480 nm. Za týchto podmienok je íluorimeirický signál úmerný množstvu amjloidného zhluku (i.c Vine, Methods in Enzymology, zv. 309,sir. 274-284).

Pri tomto experimente sa potvrdilo, že pamoál sodný je schopný vytvárať konzistentnú a na dávkovaní závislú redukciu pri tvorení zhlukov βΑι.,ι? vo forme ľibrilov·. Účinok je významný a redukcia dosahuje až 70 % pri porovnaní s kontrolnými vzorkami.

Bola meraná tiež inhibícia tvorenia ľibrilov ako pôsobenie inkubačného času. V čase od I do 5 dní vykazoval pamoát sodný progresívny vzrast účinku pri redukovaní väzby lioflavínu T.

Príklad 7

Vyhodnotenie prolízhlukových účinkov ST zlúčenín na β-amyloid 1.42 peplid

Schopnosť ST1641, STÍ722, ST1859, STÍ745, STÍ800, STÍ913 neutralizovať polymerizáciu βΑι.42 bola vyhodnotená použitím analýzy tioflavínovej väzby T s nasledujúcim postupom (M.A. Findeis, S.M. Molineaux; Methods in Enzymology 309, 487-488 (1999)): βΑ₍.₄2 peptid (lmg/nil) sa rozpustil v H2O/CH3CN (1:1), lyofilyzoval a solubilizoval v DMSO + PBS a inkuboval pri teplote 37 °C počas 8 dní. Peptid bol sonikovaný a rozpustený v PBS (1:5). Bolo pripravených 96 jamkových platničiek s roztokom βΑι.4'2 (40 μΙ/jamka) a skúšobné zlúčeniny ST (50 μΙ/jamka), s koncentráciou medzi 0,8 a 100 μΙ). Do každej jamky sa pridalo po 15 minútach 50 μΙ neagregovaného βΑι.42 a platničky sa cez noc inkubovali pri teplote 37 °C a premiešavali. 200 μΐ reakčnej zmesi obsahujúcej tioflavínovú „T“ väzbu (10 μΜ ) a roztok (pH 6,5) Na_?HPO4 x 2 H₂O (50 μΜ) sa potom pridalo do každej jamky. Fluorescencia bola nameraná pri excitácii 450 nm a emisii 482 nm 96-jamkovým fluorimetrickým platničkovým čitačom za 60 sekúnd. Pri týchto experimentálnych podmienkach sa fluorimetrické miery vzťahujú na množstvo polymerizovaného peptidu βΑι.42.

Tabuľka 1 ukazuje DE?o hodnoty ST testovaných zlúčenín.

Tabuľka 1

Zlúčenina	DE_5o (pM)
STÍ 641	38.2
STÍ 745	90.3
STÍ 859	5.4
STÍ 745	8.0
STÍ 800	>50
STÍ 913	7.<8

Príklad 8

Rozpustenie zhlukov predpripraveného β-amyloidu vo fibrilovej forme pomocou pamoátu sodného (STÍ641)

Tento experiment bol vykonaný preto, aby sa vyhodnotila protizhluková schopnosť pamoátu sodného na predtým agregovanom peptide βA 1.42 podľa nasledujúceho postupu.

Peptid βΑι.47 sa nechal agregovať 48 hodín pri 37 °C v podmienkach opísaných v Príklade 6. Pridal sa parnoát sodný (pomerné množstvo peptid:pamoát 1:8).

V týchto podmienkach sa potvrdila vysoká aktivita pamoátu sodného pri redukovaní T väzby tioflavínu.

Inkubácia s pamoátom sodným viedla k 70 % redukcii fluorescencie v porovnaní s kontrolnými vzorkami, ktoré neboli inkubované s pamoátom sodným.

Tento výsledok ukazuje, že parnoát sodný bol schopný následne vyvolať protizhlukoyý účinok na fibrilové štruktúry βA1-42Príklad 9

Zníženie rezistencie β-πηιγΙοίό|.₄2 peptidti na trávenie trypsínu spôsobené pamoátom sodným (STÍ641) βΑ|.42 peptid bol rozpustený s 15 pl 0,1 M NaOH. Roztok bol upravený na pH 7,4 15 pl TRIS pufru lOOmM, do ktorého sa pridalo 30 pl samotného pufru alebo pufrového roztoku, ktorý obsahuje parnoát sodný. Konečná koncentrácia βΑ|.₄₂ pcptidu bola 0,22 mM. a lá s pamoátom sodným bola v rozsahu od 0,055 do 1,76 mM, leda pomer βΑ|..ι₂ peptid : parnoát sodný bol od 4:1 do 1:8.

Takto pripravené vzorky boli inkubované pri 37 °C' počas piatich dní; v týchto podmienkach vytváral βΑ|.₄₂ peptid zhluk)· vo forme Cibril a menil svoje štruktúry od náhodných špirál po β-hárok (Zagorski M.G. 1999 „Methodological and Chemical Factors Aľfecting Amvloid β ľeptide Amyloidogenecity Methods in Enzymology 309; l<89-204). Po 5-dňovej inkubácii sa do každej vzorky pridalo 24 pg trypsínu (Merck). miešali sa a odstreďovali I minútu pri 13000 otáčkach za min.; vzorky sa potom nechali hodinu inkubovať pri 37 °C.

Po uplynutí tohoto času sa zmes odstred’ovala 5 minút pri 13000 otáčkach za min., odstránilo sa 50 pl supernatantu, vyzrážaná látka bola rozpustená v 40 pl HCOOH a 10 pl FEO s obsahom 0.1 % kyseliny trifluóroctovej (TFA).

V tomto kroku boli vzorky pripravené na kvantitatívnu analýzu HPLC. Výsledok analýzy HPLC vzoriek inkubovaných s pamoátom sodným sa porovnal s výsledkami získanými zo vzoriek so samotným peptidom, tak sa kvantifíkoval βΑ|.₄₂peptid.

Trypsín bol v hore uvedených podmienkach schopný hydrolyzovať od 30 do 50% βΑι.42 peptidu.Trypsínová hydrolýza βΑ|.₄₂ sa zvýšila pomocou pamoátu sodného o viac ako 50 % pri najvyššej dávke (pomer peptid:pamoát 1:8) a o viac ako 40 % pri najnižšej dávke (1:4).

Príklad 10

Inhibícia neurotoxicity spôsobenej p-amyloidom₂5-35 pomocou pamoátu sodného

Na overenie potenciálnej nervovoochrannej aktivity pamoátu sodného boli použité primárne kortikálne nervové kultúry získané mikrodisekciou embryonálneho mozgu potkana na 16. až 18. deň od oplodnenia. Mozgové tkanivo sa kultivovalo v prítomnosti embryonálneho séra a gliálna proliferácia bola utlmená tak. že sa do inkubačného média pridalo anlimiloiickc činidlo cytozín arabinozid na 3. až 5. deň (Andrconi et al. 1997 E.xp. Ncurology 148:281-287). Bunkové kultúry boli 5 až 7 dní vystavené pôsobeniu pA25-?,s peptidu v prítomnosti alebo neprítomnosti pamoátu sodného. Nervovoochranné pôsobenie bolo vyhodnotené v neurotoxických podmienkach spôsobených kyselinou kainovou, aby sa overilo špecifikum pôsobenia pamoátu sodného a jeho účinná protizluková aktivita voči neurotoxickému činidlu.

Schopnosť pamoátu sodného chrániť bunky pred degeneráciou sa vyhodnotila na nervových bunkách vypestovaných v prítomnosti embryonálneho séra v kultivačnom médiu. λ'’ tomto prípade. 24 hodín po zasiatí, bolo médium nahradené iným, bez séra obsahujúceho glulamín. inzulín, transíerín, putrescín, progesterón. selenit sodný a 1-Iepes.

Experimentálny postup

Primárne kultúry neurónov mozgovej kôry boli na 16. až 18. deň po oplodnení odobrané z mozgu embrya potkana a kultivované v embryonálnom sére. Na 3. a 5. inkubačný deň bola utlmená gliálna proliferácia použitím cytozínu arabinózy ako antimitotického činidla.

Kultúry boli vystavené pôsobeniu βΑ25-35 peptidu pri koncentráciách 25 a 50 pM 5 až 7 dní odo dňa zasadenia.

βΑ?>35 peptid bol pridaný do kultúr spolu s pamoálom sodným, ktorý' mal rovnaké molárne koncentrácie, alebo koncentrácie nižšie ako peptid.

Ochrana pred neurotoxicitou sa vyhodnocovala použitím kolorimetrickej metódy a denzitometrickej analýzy modelovým analyzérom.

Získané výsledky ukazujú, že pamoát sodný bol schopný zabezpečiť úplnú ochranu pred ťóxicitou vyvolanou βΑ25-35 peptidom. Získané výsledky sú v Tabuľke 2

Tabuľka 2

kontrola	β A25-35 50 μΜ	pamoát sodný 25 μΜ	pamoát sodný 25 μΜ + βΑ2?-35 50 μΜ
% S	% S	% S	% S
100	16	88	100

% S: percento prežitia

Príklad 11

Redukcia apoptózy celeberálnych granúl vyvolaných nedostatkom K⁺ pomocou pamoátu sodného (STÍ 641)

Granule izolované z cerebela 8-dňových potkanov sa biochemický i morfologicky odlišujú približne počas jedného týždňa, morfologicky dozrievajú a majú glutamatergický interneurónový fenotyp (Gallo et al. 1982 PNAS 79:7919-7923). Odstránením kultivačného média séra a znížením medzibunkovej koncentrácie iónov uhličitanu draselného (25μ M) až na množstvo nedepolarizujúcich podmienok (5 mM), bunky apoptózou zahynú približne o 24 hodín.

Programovaná smrť neurónov je jav pozorovaný nielen pri mnohých fyziologických procesoch, ale aj pri početných neurodegeneratívnych chorobách, napr. ACH. Parkinsonova choroba, Huntingtonova c.horea a amyotropická laterálna skleróza. V prípade ACH sa zistil blízky vzťah medzi apoptózou a prítomnosťou mutácie βΑ predsenilného génu 2 (PS2), ktorý reguluje produkciu samotného amyloidu. V prípadoch ACH, kde je prítomná mutácia PS2, je možné zistiť aj klasické zvýšenie cerebrálnej a plazmovej βΑι.42 (Scheuer D.,Eckman C., Jensen M., Son X., Citrón M., Suzuki N., Bird T.D., Hardy J., Hutton M., Kukull W., Laeson E., Levy-Lahad E., Viitanen M., Peskind E., Selkoe D., Yunkin S., (1996) Nat. Med. 2, 864-870.); navyše mutované formy génu PS2, ktoré sa prejavujú v prípadoch apoptózy PC 12 (Wolozin B., hvasaki K.j D'Adamio L., (1966) Science 274, 1710-1713).

Tento experimentálny model umožnil získať „samozásobovací“ produkčný systém βΑ, kde neurónová apoptóza cereberálnych granúl spôsobuje zmeny v pôsobení amyloidných prekurzorov APP takej povahy, že podporujú amyloidogénny metabolizmus. Potom vzostup hladín βΑ podporuje programové hynutie buniek. V tejto experimentálnej časti sa potenciálna účinnosť skúmaných látok merala prežitím buniek v daných časoch (24, 48 a 72 hodín) po redukcii K.CI v médiu.

E x p c r i m c n lá 1 n y po s t u p

V primárnych kultúrach cereberálnych granúl 8-dňových potkanov, udržiavaných v médiu s 25 mM obsahom KC1, po 6 dňoch v kultúre boli bunky . i S označené S- mctionmom.

Apoptóza bola vyvolaná nedostatkom séra a znížením koncentrácie KCI z 25 mM na 5 m M.

Táto situácia predstavovala podmienky neurónovej deaferenlácie in vitro alebo vyrezanie dendritických a anoxálnych vetiev vstupujúcich a vystupujúcich z buniek nervových tkanív.

Výsledkom apoptózy bola nadprodukcia βΑ.

Kultúry boli inkubované s pamoátom sodným v koncentráciách od 1 μΜ do 100 μΜ.

Ochrana proti toxicite bola hodnotená podľa životaschopnosti pri 24, 48 a 72 hodinách.

Výsledky

Výsledky získané v tomto experimente ukazujú, že pamoát sodný v koncetrácii 10 μΜ má ochranný účinok ( 89 %-ná ochrana) proti poškodeniu vyvolanému amyloidom tvoriacom sa pri procese apoptózy.

Príklad 12

Schopnosť STÍ 859 prekročiť krvnú mozgovú bariéru „in vivo“

Vyšetrenia častí mozgu ACH post-mortem ukazujú prítomnosť veľkého mimobunkového senilného postihnutia pozostávajúceho z fibrilových amyloidných zhlukov. Vzťah medzi prítomnosťou beta amyioidpeptidu a vážnosťou tejto choroby naznačuje, že utlmenie tvorenia fibrilových peptidov môže byť potenciálnym nástrojom liečenia tejto choroby. ST1859 utlmil zhlukovanie beta amyloidu „in vitro“ a na otestovanie jeho priestupnosti cez intaktnú krvnú bariéru mozgu bol STÍ 859, označený ^l4C (SA 50pCi/ mM), naočkovaný i.v. normálnym potkanom v dávke 18 pCi/potkan. Mozog i krv boli 30 min. po injekcii vybrané a vložené do centrifúgy ( 3000 otáčok za min. x 15 min.) a získané sérum bolo zriedené s vodou 1:20, mozgové tkanivá sa homogenizovali 1:20 w/v vo vode. Do každej vzorky boli pridané 4 ml scinlilačnej kvapaliny pre vodné vzorky. Množstvo rádioaktivity sa počítalo na automatickom βpulte (Packard 4600). Údaje zaznamenané v DPM (tabuľka 1) boli upravené voči váhe alebo objemu každej vzorky. Výsledky získané v tomto experimente ukazujú, že

STI859 je schopnv prekročiť krvnú bariéru mozgu s množstvom séra /mozog <1 (tabuľka 3).

Claims

Zlúčenina všeobecného vzorca (I) (D v ktorej:

R¹ a R⁵, ktoré môžu byť rovnaké alebo rozdielne, sú COOR⁶, CONHR⁶, SO2NHR⁶, SO₂R⁶, SO2HHR⁶, SO3R⁶, OR⁶,COR⁶, NHR⁶, R⁶; v ktorých R⁶ je H alebo priamy alebo rozvetvený, nasýtený alebo nenasýtený alkylový reťazec s I až 5 atómami uhlíka, alebo fenyl substituovaný R⁷;

kde

R⁷ je OH, COOH, SO₃H, NR^SR⁹, v ktorom

R⁸ a R⁹, ktoré môžu byť rovnaké alebo rozdielne, sú H, alkyl s 1 až 5 atómami uhlíka;

R² a R⁴, ktoré môžu byť rovnaké alebo rozdielne, sú H, OH, NHR⁶, OCO-R¹⁰nr⁸r⁹, —O

O

CO kde R¹⁰ je priam}' alebo rozvetvený, nasýtený alebo nenasýtený alkylový reťazec s 1 až 5 atómami uhlíka;

R³ je -[CH₂]n-. -CH₂-O-. -CH(R)-, v ktorom n je celé číslo I až 4, R¹¹ je priam}· alebo rozvetvený alkyl s I až 5 atómami uhlíka, substituovaný jednou aminoskupinou. alkvlamino C|-Cs, dialkylamino C|-C₃, OH. alkyloxy C|-C?; a jeho farmaceutický prijateľné soli;

za predpokladu, že substituenty R¹, R², Rý R⁴ a R^? nie sú:

1 R' = R⁵ = -COOCH₂C₆H₅

R²=R⁴ = -OH

R³ = -CH₂-
2 R¹ -= R⁵ = -COOCH(CH₃)₂

R² = R⁴ = -OH

R³ = -CH₂R¹ = R⁵ = -COOC2H;

R² = R⁴ = -OH

R³ = -CH₂-
4 R¹ =R⁵ = -C00C₆Hh

R² = R⁴ = -OH

R³ = -CH₂-
5 ’ R¹ = R⁵ = -COOCHj

R² = R⁴ = -OH

R³ = -CH₂-
6 R¹ = R⁵ =-COOC(CH₃)₃

R² = R⁴ = -OH

R³ = -CH₂-
7 R¹ = R⁵ = - CONHC₆Hs

R² = R⁴ = -OH

R³ = -CH₂-

11 r' = r⁵ = -h

R² = R⁴ = -OCOCgIIj

R³ = -CH₂-

12 r' = R⁵ = -H

R³ = -Cl-h-

13 r‘ = R⁵ = -H

R² = R⁴ = -OCOCH=CH,

R’ = -C 112-:

14 R¹ = R⁵ = -H

R² = R⁴ - -OH

R³ = -Cl-12-

15 R¹ = R⁵ =-COOH

R² = R⁴ = -OH

R³=-CH₂-.

CU

2. (2/?)-2-(acetyloxy)-4-((3-karboxy-l-[3-karboxy-2-hydiOxy-l-naftyl)metyl]-2naftyl}oxy)-N,N,N-trimetyl-4-oxo-l-butanamínchlorid.

(2/?)-2-(acetyloxy)-4-({ l-[(2-hydroxy-l-naftyl)metyl]-2naftyl}oxy)-N,N,Ntrimetyľ-4-oxo-butanamínchlorid.

4. 2-({4-[(2-hydroxy-l-naftyl)metyl]-2-naftyl)oxy)-2-oxoetanamínchlorid.

5. 2-({4-[(3-{[2-dietylamónium)etoxy]karbonyl}-2-hydroxy-l-naftyl)metyl]-3hydroxy-2-naftoyl}oxy)-N,N-dietyletánamínchlorid.

6. Zlúčenina podľa nárokov 1 až 5 na použitie ako liečivo.

7. Spôsob prípravy zlúčenín všeobecného vzorca (I) kde

R¹ a 1U sú -COOR⁶, a kde R“, R³, R⁴ a R^? majú význam definovaný v nároku 1, vyznačujúci sa tým, že na zlúčeninu všeobecného vzorca, v ktorej R⁶ je H, sa pôsobí halogenizujúcim činidlom na získanie odpovedajúceho acylchloridu, ktorý potom reaguje počas miešania s alkoholom R⁶- OH v molárnom pomere

1: 6. alebo v inertnom bezvodom rozpúšťadle so stechiomelrickým množstvom R⁶-OH.

S. Spôsob prípravy zlúčenín vzorca (I)

R1

R2

R4

R5 (I) v ktorých R¹ a R²¹ sú CONHR⁶ a v ktorých R², R’, R⁴ a R^ô majú význam definovaný v nároku 1, vyznačujúci sa tým. že na zlúčeninu všeobecného vzorca I, v ktorej R⁶ je H, sa pôsobí halogenizujúcim činidlom na získanie odpovedajúceho acylchloridu, alebo párového činidla, a ktorá reaguje počas miešania s R⁶-NH2 amínom v molárnom pomere 6:1, alebo v inertnom bezvodom rozpúšťadle so stechiomelrickým množstvom R⁶-NH2.

9. Spôsob-prípravy zlúčenín vzorca (I) v ktorých R² a R⁴ sú OH a v ktorých R¹ a R²¹ sú SO3R⁶, SO?NHR⁶; R^J je CH(R)-, kde R⁶ a R¹¹ majú význam uvedený v nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňuje podľa doleuvedenej reakčnej schémy 1, kde zlúčenina vzorca ,,a” reaguje s aldehydom Rⁿ-CHO v glaciálnej kyseline octovej pri teplotách od 90 do 150 °C'. aby sa získali zlúčeniny všeobecného vzorca ,,b‘‘, následne sa na zlúčeninu všeobecného vzorcam „b pôsobí halogenujúcim činidlom, aby sa získal odpovedajúci sulfonylchlorid, ktorý reaguje s alkoholom R⁶-OH, aby sa získali zlúčeniny všeobecného vzorca „d, alebo s R^ft-NH₂ amínom, aby sa získali zlúčeniny všeobecného vzorca „e’.

Schéma 1 e
8.

Spôsob prípravy zlúčenín vzorca (I) (1) v ktorom R¹, R², R⁴ a R⁵ sú OR⁶ a /alebo NHR⁶;

R³ je -CH(R)-, kde R⁶ a R¹¹ majú významy definované v nároku 1, vyznačujúci sa tým. že sa uskutočňuje podľa icakčnej schémy 2 dole, kde zlúčenina vzorca A reaguje s aldehydom R'^CTIO v kyslom prostredí, aby sa získala zmes zlúčenín zodpovedajúca štruktúram B, C a D, ktoré sa oddelia a čistia; tieto zlúčeniny reagujú s R⁶-X alkylhalidom v prítomnosti zásady a potom sa odchránia v kyslom prostredí, aby sa získali odpovedajúce naftylétery E, F, G; na posledne menované sa pôsobí s NaNO? v kyseline sírovej, a lak sa získajú zlúčeniny H, I a L.

Schéma 2

PG = protective group (ochranná skupina)
9. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým. že obsahuje ako aktívnu zložku zlúčeninu podľa nárokov 1 až 5 a aspoň jeden farmaceutický prijateľný nosič a/alebo riedidlo.
10. Použitie kyseliny pamoovej alebo jedného z jej derivátov, alebo jednej z jej farmaceutický prijateľných solí všeobecného vzorca I (í) v ktorom:

R¹ a R’\ ktoré môžu byť rovnaké alebo rozdielne, sú COOR⁶, CONHR⁶, SO2R⁶, SO3R⁶, OR⁶, COR⁶, NHR⁶, R⁶;

kde R⁶ je H alebo priamy alebo rozvetvený, nasýtený alebo nenasýtený alkylový' reťazec' s 1 až 5 atómami uhlíka, alebo fenyl substituovaný R⁷;

kde R⁷ je OH, COOH, SO₃H, NR⁸R⁹,

OH

NH₂ v ktorom:

R^s a R⁹, ktoré môžu byť rovnaké alebo rozdielne, sú H, alkyl s 1 až 5 atómami uhlíka;

R² a R⁴, ktoré môžu byť rovnaké alebo rozdielne, sú H, OH, NHR⁶, OCO-R¹¹’NR⁸R⁹,

CH,

O

O

R1O v ktorom R¹⁰ je priamy alebo rozvetvený, nasýtený alebo nenasýtený alkylový reťazec s 1 až 5 atómami uhlíka;

R’ je -[CH₂]n-, -C'ID-O-, -CI1(R)-.

kde n je celé číslo 1 až 4,

R¹¹ je priamy alebo rozvetvený alkyl s 1 až 5 atómami uhlíka, nahradenými aminoskupinou, alkylamínom C|-C?, OH, alkyloxy C|-C>;

na prípravu liečiva na liečenie chorôb vyznačujúcich sa ukladaním amyloidných zhlukov.
11. Použitie podľa nároku 12, v ktorom chorobami sú choroby vyznačujúce sa ukladaním amyloidných zhlukov a sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej z Alzheimerovej choroby, Downovho syndrómu, dedičnej cerebrálnej hemorágie spojenej s holandským typom amyloidózy, amyloidózy spojenej s chronickým zápalom, amyloidózy spojenej s viacnásobným myelómom a z iných dyskrézií hematických B lymfoidných buniek, z amyloidózy spojenej s diabetom typu 11, a amyloidózy spojenej s chorobou prión, kuru alebo ovčou skarpiou.
12. Použitie podľa nároku 13, v ktorom amyloidóza spojená s chorobou prión je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z Creutzfeldt-Jakobovej choroby a Gerstmann-Strausslerovho syndrómu.
13. Použitie podľa nárokov 12 až 14, v ktorých zlúčenina je sodná soľ kyseliny pamooyej.
14. Diagnostická súprava, vyznačujúca s tým, že obsahuje najmenej jednu zlúčeninu podľa nároku 12, na diagnózu chorôb vyznačujúcich sa ukladaním amyloidných zhlukov.
15. Súprava podľa nároku 14, vyznačujúca sa tým, že v zlúčenine je najmenej jeden z prvkov uhlík, vodík, dusík alebo kyslík, substituovaný odpovedajúcim rádioaktívnym izotopom.
16. Súprava podľa nároku 15, vyznačujúca sa tým, že zlúčenina nesie najmenej jeden atóm rádioaktívneho jódu.
17. Súprava podľa nároku 16, vyznačujúca sa tým, že zlúčenina, či nesie alebo nenesie izotop, je vo forme zlúčeniny s jedným rádioaktívnym izotopom kovu.
18. Súprava podľa nároku 17, vyznačujúca sa tým, že kov je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z india, gadolínia a technécia.
19. Použitie súpravy podľa nárokov 14 až 18 na diagnózu pomocou diagnostickej techikv modelu.
20. Použitie podľa nároku 19, kde diagnostická technika modelu je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z PET, SPECT, NMR a scintigrafických techník. Použitie podľa nároku 20, v ktorom je scinligrafickou technikou planárna scintigrafia.

Zlúčenina podľa nároku 12, v ktorej najmenej jeden z prvkov uhlík, vodík, dusík alebo kyslík, je substituovaný zodpovedajúcim rádioaktívnym izotopom.

Zlúčenina podľa nároku 12, ktorá nesie najmenej jeden atóm rádioaktívneho jódu.
24. Zlúčenina podľa nároku 12, ktorá či nesie alebo nenesie rádioaktívny izotop je podľa nárokov 24 až 25 doplnená prvkami používanými pri modelovej diagnostike.
25. Zlúčenina podľa nároku 25, v ktorej je doplnený prvok vybraný zo skupiny pozostávajúcej z india, gadolínia a technécia.