SK126595A3

SK126595A3 - Compositions, for inhibition, control and regression of angiogenesis, containing hyaluronic acid and nsaid

Info

Publication number: SK126595A3
Application number: SK1265-95A
Authority: SK
Inventors: Derek A Willoughby; Chandan Alam; Samuel S Asculai; Rudolf E Falk; David W Harper
Original assignee: Hyal Pharma Corp
Priority date: 1993-04-16
Filing date: 1994-04-15
Publication date: 1997-03-05
Also published as: EP0695187A1; AU6561694A; WO1994023725A1; EP0695187B1; BR9405781A; HU9500113D0; NO954073D0; AU694113B2; NO954073L; CN1123005A; ATE226827T1; FI954914A; HU211954A9; DE69431623D1; ZA942597B; CA2094203A1; CZ267995A3; HUT74462A; IL109293A; IL109293A0

Description

Zmesi kyseliny hyalurónovej a nesteroidného protizápalového liečiva pre inhibíciu, znižovanie a regresiu angiogenézy

Oblasť techniky

Vynález sa týka inhibície, znižovania a regresie angiogenézy a nachádza použitie najmä pri inhibícii angiogenézy pri liečbe rakoviny, napríklad pri adjuvantnej liečbe sprevádzajúcej známe postupy liečby rakoviny a pri prevencii vzniku metastáz.

Doterajší stav techniky

V článku s názvom Solid cores of tumors keeping out best drugs Sandry Blakeslee, ktorý bol publikovaný v čísle Globe and Mail z 8. júli 1989 v Toronte (Ontario, Kanada) uvádza pani Blakeslee, že rastúci počet vedcov sa domnieva, že základné nedorozumenie vo veci štruktúry tuhých nádorov, vedie vedcov k navrhovaniu protirakovinových liečiv, ktoré pri mnohých pacientoch musia zlyhať.

Uvádza tu, že už po desaťročia vravie Dr. Herberman, riaditeľ Pittsburghského strediska pre rakovinu (Pittsburgh Cancer Center), že vedcovia zaujímajúce sa liečbou rakoviny jednoducho vyvíjajú liečivá, umiestňujú ich do krvného prúdu a predpokladajú, že tieto liečivá budú zanesené do nádoru, bez toho, aby v podstate brali príliš do úvahy, ako rovnomerne sa liečivo rozdelí, ked dôjde do nádoru.

Ďalej sa v tomto článku uvádza, že podľa Dr. Judaha Folkmana, ktorý je predným vedcom v odboru krvných rastových faktorov na lekárskej fakulte Harvardskej univerzity (Harvard Medical School), sú lekári dlhý čas vyučovaní, že nádory vy2 zadujú zvýšenú dodávku krvi. Toto tvrdenie podľa hore uvedeného článku nie je pravdivé. Nádory naopak vyžadujú zníženú dodávku krvi, a toto zníženie sťažuje podávanie liečiv.

V článku sa ďalej uvádza, že väčšina ľudí sa domnieva, že nádor nie je nič iné, ako súbor rakovinových buniek. Podľa Dr. Jaina, ďalšieho vedca v tomto odboru, je v skutočnosti nádor tvorený rakovinovými bunkami len z 50 %. Zvyšnú polovinu tvoria cievy a intersticiálny (medzitkanivový, priestor. Intersticiálny priestor v nádore je možné podľa Dr. Jaina prirovnať k priestoru medzi kamienkami umiestnenými v škatuli.

Ďalej sa v článku uvádza, že bez ohľadu na to, akým spôsobom sú biologické činidlá zmiešané a podávané, musia tieto činidlá prekročiť stenu cievy a potom prejsť medzery, aby sa dostali k svojmu cieľu, tj. rakovinovým bunkám.

V článku sa pokračuje, že každý nádor je iný a každý nádor obsahuje rôzne oblasti. Okrem toho, nádory sa zo dňa na deň menia behom svojho rastu a preskupovania častí. Väčšina ciev vnútri nádorov je vo vysoko dezorganizovanom stave vďaka početným zákrutám a podivným pripojením k susedným cievam.

Ako Dr. Jain hovorí, pri rastu nádorov všeobecne dochádza k tomu, že vonkajšia oblasť nádoru získava nové cievy obklopené normálnym tkanivom. (Nádor potrebuje pre svoj rast dodávku krvi; tiež metastázy potrebujú pre svoj vývoj dodávku krvi.) V nádoru sa rovnako vytvára niekoľko vlastných abnormálnych ciev. Pri rastu nádoru v obmedzenom priestore dôjde k rozdrveniu mnohých skrútených ciev v blízkosti jeho stredu. V dôsledku toho sa zdá, že nádorové bunky blízko stredu zomierajú, napriek tomu, že po transplantácii do iného zvieraťa sa z nich vyvinie aktívna rakovina. Ako cievy, tak kvapalná plazma v intersticiálnych priestoroch, sú stlačené. Tento tlak zabraňuje tomu, aby molekuly nese3 né krvou vrátane kyslíky vstúpili do centrálnej oblasti nádoru.

Podlá Dr. Jaina nie je tlak v normálnom tkanivu rovnomerný, takže veíká molekula, ako je molekula protilátky, môže dôjsť k svojmu cielu konvekciou, ktorá je indukovaná tlakovými rozdielmi. Uprostred nádoru je však tlak rovnomerne vysoký, čo takú konvekciu znemožňuje.

Ako hovorí Dr. Jain, molekuly migrujú tiež difúziou. Tento pochod sa podobá spôsobu, ktorým dochádza k rozdeleniu kvapky atramentu vo vode.

Dr. Jain údajne meral difúziu protilátky v nádoroch a zistil, že pri väčších molekulách sa môže dosiahnuť v nádoroch difúziou rovnomerná koncentrácia až po niekolkých dňoch, týždňoch alebo i mesiacoch. V tom čase už môže byt príliš neskoro na to, aby bola liečba prospešná.

V európskej patentovej prihláške č. 0 295 092 je opísaný nosič spolu s fragmentmi kyseliny hyalurónovej pre dopravu týchto fragmentov do kože tak, aby sa tieto fragmenty dostali do dermálnej vrstvy kože, za účelom zvýšenia vývoja ciev pre stimuláciu alebo obnovu rastu vlasov. Prednostnými fragmentmi kyseliny hyalurónovej sú polysacharidy obsahujúce 7 až 25 monosacharidových jednotiek. V citovanom patente sa uvádza, že je zrejmé, že čím sú fragmenty kyseliny hyalurónovej väčšie, tým obťažnejšie sú dopravované do dermálnej vrstvy kože, pokiai nie je v prípravku prítomný dajaký prostriedok zvyšujúci aktivitu týchto fragmentov.

Kombinácia môže teda zahŕňať prostriedok pre zvyšovanie aktivity fragmentov kyseliny hyalurónovej, predovšetkým pre zlepšovanie ich penetrácie kožou po topickej aplikácii. Ako sa tu uvádza, niektoré činidlá zvyšujúce túto aktivitu pôsobia tiež ako nosiče pre fragmenty kyseliny hyalurónovej .

Niektoré činidlá zvyšujúce aktivitu údajne vykazujú tiež schopnosť stimulovať alebo zvyšovať rast vlasov. Ako činidlo zvyšujúce túto aktivitu bol mi. vytypovaný minoxidil. Stimuláciu rastu vlasov teda údajne vyvolávajú ako fragmenty kyseliny hyalurónovej, tak minoxidil, pričom obidva sú dopravované prostredníctvom nosiča.

Byli uskutočnené rozsiahle štúdie, za účelom zistenia defektu v imunitnej funkcii, ktorý umožňuje vývoj nádorovej bunky. Jerne a neskôr Burnett uviedli, že hlavnou úlohou imunitného systému je imunologická pohotovosť pre ničenie abnormálnych buniek. Koncept pohotovosti, i keď je trocha zjednodušený, je stále považovaný za základ pre vysvetlenie dômyselného mechanizmu imunologického rozpoznania a funkcií, ktoré sú prítomné u vyšších druhov zvierat - cicavcov .

Neskôr bolo postulované, že k nádorovému bujneniu dochádza v dôsledku miestneho alebo všeobecného potlačenia imunity. Ako však zdôraznil Moller, pokial dôjde k všeobecnému potlačeniu imunity, vyvinú sa len určité typy neoplastických porúch, najmä poruchy lymfo-retikulárneho systému. Toto pozorovanie je všeobecne správne a predstavuje velkú výzvu pre platnosť teórie imunitnej pohotovosti, pokial by nebolo možné preukázať, prečo sa môžu jednotlivé rakovinové bunky vyvinúť a jednotlivo uniknúť imunitnému systému.

V roku 1974 bolo experimentálne preukázané, že pri neoplastickej chorobe môžu existovať defekty vo funkcii makrofágov.

Pri počiatočných experimentoch bolo zistené, že súčasťou imunitného systému sú supresorové bunky, ktoré sú typu T systému makrofágových buniek. Ich prítomnosť bola demonštrovaná v prípade neoplázie, chronických bakteriálnych infekcií, uzdravovania z velkých úrazov a chronických fungálnych infekcií.

Opakovane sa preukázalo na experimentálnych zvieratách, že pri neoplastickej chorobe sa mení funkcia makrofágových buniek. Makrofágy v zvieracom systéme sa zdajú byť zablokované, pokial sa týka ich funkcie. Po odstránení zo situácie in vivo, premytí fyziologickým roztokom a kultivácii, sa chovajú normálne. Zistilo sa, že toto zablokovanie má vzťah k nadmernej tvorbe prostaglandínu v neoplastickom tkanivu alebo samotnom makrofágu.

V základnom výskume, vykonávanom v druhej polovine 70. rokov a na počiatku 80. rokov tohto storočia, existovali značné nejasnosti, pokial sa týka úlohy imunoterapie pri liečbe rakoviny. Predpokladalo sa, že je dôležité aktivovať makrofágy (operácia hyping). Z výsledkov skúmania, ktoré získali Romans a Falk u peritoneálnych makrofágov, získaných od pacientov s neoplastickou chorobou, jednoznačne vyplýva, že tieto makrofágy už sú aktivované a napriek tomu koexistujú s rakovinovými bunkami, bez toho, aby spôsobili ich deštrukciu.

V nedávnom čase niekolko nezávislých výskumníkov ukázalo, že špatná funkcia makrofágov alebo uvažovaného bloku je zapríčinená nadmernou tvorbou prostaglandínu a že v tkanivovej kultúre je možné túto situáciu zmeniť pomocou kortikosteroidov, ASA a nesteroidných protizápalových liečiv, napríklad indometacínu a naproxénu (Naprosyn^^R^). I tu sa opakovane preukázalo, že v zvieracích nádoroch môžu tieto látky meniť odpoveď neoplastických buniek a že rôzne kombi6 nácie týchto látok s činidlami povzbudzujúcimi imunitu môžu poskytnúť veľmi dôveryhodný úspech pri eliminácii experimen tálnych nádorov. Lala a jeho spolupracovníci kombinovali liečbu indometacínom s liečbou interleukínom 2 a ukázali, že pomocou tejto kombinácie je možné vyliečiť experimentálny neoplastický nádor.

Používanie všetkých týchto látok v klinickej praxi humánnej terapie prináša však stále problémy. Všetky nesteroidné protizápalové činidlá (NSAID) sú značne toxické v gastrointestinálnej oblasti, neurologickej oblasti i inde. Základom súčasného prístupu teda je, že sa všeobecne používajú tieto látky pre liečbu humánnych chorôb v takom množstve, aby tieto liečivá prenikla do akéhokoľvek patologického tkaniva a terapeuticky tu zmenila miestnu produkciu prostaglandínov. Existujú síce intravenózne prípravky na báze indo metacínu (a teraz tiež iných činidiel), ale používanie týchto liečiv samotných spôsobuje, ako je zrejmé z rozsiahleho súboru údajov, ktorý sme nazhromaždili, veľmi nepriaznivé vedľajšie účinky u humánnych pacientov. Do tela pacienta je preto možné systemicky zavádzať len nedostatočné množstvá týchto látok, na to aby bolo možné dosiahnuť väčšiu ako príležitostnú odpoveď neoplastického nádoru.

Tvorba nových ciev je podstatná pre vývoj nádorov a chronické inflamatorné granulomatické tkanivá, ako je pannus pri reumatoidnej artritis. Obmedzenie angiogenézy pri takých chorobných stavoch je cenným terapeutickým cieľom pre redukciu rastu takého tkaniva.

Subretinálna neovaskularizácia je v západnom svete v súčasnosti hlavným oftalmologickým problémom. Keď dôjde k subretinálnomu rastu nových ciev zo strednej choroidnej vrstvy oka pod retinou a v dôsledku toho k zničeniu makuly

Ί (žltej škvrny na sietnici) alebo k strate ostrosti videnia, je malá čast pacientov liečená laserovou fotokoaguláciou.

Väčšina ciev však raste príliš blízko stredu a pri vypálení laserom by došlo k zničeniu celého potenciálneho centrálneho videnia.

Pre liečbu subretinálnej neovaskularizácie bolo tiež navrhnuté podávať injekcie α-interferónu trikrát týždne. Tento postup je však bohužiaľ komplikovaný škodlivými vedľajšími účinkami, ktoré také injekcie vyvolávajú najmä u starších ľudí. Naviac, splniť požiadavku na podávanie injekcií čerstvo vyrobeného prípravku je prinajmenšom velmi obťažné.

Pri artritis sa vyvíja pannus. Aby sa mohol pannus vyvinúť, musí byť prítomná vaskularizácia, pretože pannus sa vyvíja vaskularizáciou, ktorá je sprevádzaná depozíciou korektívneho tkaniva v korneálnom epitelu. Jedným z následkov je nadmerný rast spojivového tkaniva na artikulárnom povrchu diartroidálneho kĺbu.

V súvislosti s vynálezom boli teraz vyvinuté spôsoby a prostriedky, ktoré sa hodia pre použitie pri inhibícii angiogenézy (tvorby a diferenciácie ciev). Tieto spôsoby a prostriedky sa dajú mi. použiť pre dve aplikácie, ktorými sú liečba nádorov a použitie ako adjuvantu pri akejkolvek liečbe rakoviny, ktorou sa sladuje inhibícia metastáz. Tiež boli vyvinuté nové spôsoby a nové prostriedky vhodné pre použitie pri regresii angiogenézy (regresii rastu ciev).

Vynález je tiež možné použiť pri liečbe iných chorôb a chorobných stavov, pri ktorých je možné dosiahnuť úžitok v prípade inhibicie, regulácie a/alebo regresie rastu ciev, napríklad pri liečbe subretinálnej neovaskularizácie a pri znižovaní účinkov artritis. Pokiaľ má človek sklon k artritis, môže sa podávaním farmaceutických prostriedkov podlá vynálezu (napríklad systemickým, ako intravenóznym podávaním) dokonca zabrániť: vzniku artritis. Prinajmenšom sa môže dosiahnuť zníženie následkov artritis.

Úlohou vynálezu je teda vyvinúť spôsob inhibície, znižovania a regresie angiogenézy, farmaceutické prostriedky vhodné pre tento účel a spôsoby použitia takých farmaceutických prostriedkov.

Ďalšie úlohy, ktoré vynález rieši sú zrejmé z nasledujúcej podstaty vynálezu a podrobného opisu rôznych rozpracovaní vynálezu.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je spôsob inhibície, znižovania a/alebo regresie angiogenézy, napríklad inhibície rastu ciev v malígnom nádore prostredníctvom prerušenia rastu alebo vývoja ciev v malígnom nádore, u cicavca, napríklad človeka, ktorého podstata spočíva v tom, že sa pacientovi pravidelne podáva obyčajne počas niekolkých týždňov alebo mesiacov účinné dávkové množstvo farmaceutického prostriedku pre inhibíciu, znižovanie a/alebo regresiu angiogenézy na miesto na povrchu alebo vnútri cicavca, ktorý takú inhibíciu, znižovanie a/alebo regresiu angiogenézy potrebuje, pričom každé účinné dávkové množstvo farmaceutického prostriedku obsahuje vo forme homogénnej zmesi účinné netoxické dávkové množstvo nesteroidného protizápalového liečiva, napríklad diclofenacu, ktorý je napríklad v prostriedku rozpustený a účinné netoxické dávkové množstvo kyseliny hyalurónovej a/alebo jej soli, napríklad hyaluronátu sodného, a/alebo homológu, analógu, derivátu, komplexu, esteru, fragmentu a/alebo podjednotky kyseliny hyalurónovej, prednostne hyaluronátu sodného.

Farmaceutický prostriedok podlá vynálezu sa môže podávať systemicky (napríklad intravenózne, intraarteriálne, intraperitoneálne alebo intrapleurálne, priamou injekciou, napríklad do nádoru apod.) a môže sa použit ako adjuvans pre akúkolvek liečbu rakoviny.

Keď sa nesteroidné protizápalové liečivo, napríklad indometacín (rozpustený v N-metylglukamíne) alebo iné nesteroidné protizápalové liečivo, ako je naproxén, (+/-)trometamínová sol ketorolacu, ibuproxén, piroxicam, derivát kyseliny propiónovej, kyselina acetylsalicylová, flunixín, diclofenac, sodná sol diclofenacu a pod. podá s viac ako 200 mg hore uvedenej formy kyseliny hyalurónovej (napríklad 200 až 1 000 mg hyaluronátu sodného) pacientovi s hmotnosťou 70 kg, spolu s účinným množstvom nesteroidného protizápalového liečiva, v jednom konkrétnom prípade diclofenacu, nedochádza k vzniku väčších toxických vedlajších účinkov, ako sú poruchy gastrointestinálneho systému, neurologické poruchy, depresie, atď., i keď sa v prípade potreby použijú zvýšené dávky nesteroidných protizápalových liečiv. Pokial sa množstvo kyseliny hyalurónovej zníži pod hore uvedenú úroveň, vediajšie účinky sa môžu opäť objaviť.

Farmaceutický prostriedok podlá vynálezu je tiež možné podávať intradermálne, topicky pre dopravu do kože, alebo rektálne, alebo vo forme transdermálnej náplasti. Nech už sa použije akýkoľvek spôsob podávania, je použitá forma tvorená homogénnym prostriedkom, ako je napríklad roztok v sterilnej vode (pre systemické podávanie) alebo krém, lotión alebo gél (pre topické podávanie). Farmaceutický prostriedok môže byt zabalený do vhodného zásobníka (napríklad vrecko pre intravenóznu infúziu, fľaštička pre injekčný roztok, tuba alebo nádoba pre krém).

Predmetom vynálezu je ďalej použitie kombinácie formy kyseliny hyalurónovej, napríklad kyseliny hyalurónovej a/alebo jej soli a/alebo homológu, analógu, derivátu, komplexu, esteru, fragmentu a/alebo podjednotky kyseliny hyalurónovej , napríklad hyaluronátu sodného a nesteroidného protizápalového liečiva, napríklad sodnej soli diclofenacu pre inhibíciu, znižovanie a/alebo regresiu angiogenézy.

Pri takom použití sa používa účinné netoxické množstvo kombinácie formy kyseliny hyalurónovej, napríklad hyaluronátu sodného a nesteroidného protizápalového liečiva, napríklad sodnej soli diclofenacu, pre inhibíciu, znižovanie a regresiu angiogenézy.

Pre inhibíciu angiogenézy sa teda môže používať účinné netoxické dávkové množstvo farmaceutického prostriedku obsahujúceho účinné netoxické dávkové množstvo hyaluronátu sodného a terapeuticky účinné netoxické dávkové množstvo nesteroidného protizápalového liečiva, napríklad sodnej soli diclofenacu. Množstvo nesteroidného protizápalového liečiva (napríklad diclofenacu), ktoré sa podáva systemicky, môže ležať v rozmedzí od asi 15 do asi 100 mg, počítané na osobu s hmotnosťou 70 kg. Ako ilustratívne dávkové množstvo je možné uviesť napríklad 35 mg/70 kg (0,5 mg/kg). Nesteroidné protizápalové liečivo sa môže podávať vo väčšom množstve, za predpokladu, že je toto množstvo netoxické, napríklad v množstve 420 mg/70 kg telesnej hmotnosti (6 mg/kg). Pokiaľ sa nesteroidné protizápalové liečivo podáva systemicky (napríklad injekčné atd.), je možné ako vodidlo pre množstvo formy kyseliny hyalurónovej uviesť, že sa na každých asi 15 mg nesteroidného protizápalového liečiva používa asi 50 mg formy kyseliny hyalurónovej (napríklad hyaluronátu sodného).

Pri topickom podávaní môže byt množstvo sodnej soli diclofenacu vyššie ako asi 5 až 10 mg/cm² kože alebo expono11 vaného tkaniva. Tiež forma kyseliny hyalurónovej, napríklad hyaluronát sodný, môže byť prítomná v množstve približne v rozmedzí od 5 do 10 mg/cm². Bližšie uvedené množstvá sodnej soli diclofenacu a formy kyseliny hyalurónovej by mali byt obsiahnuté v každom dávkovom množstve prostriedku.

Predmetom vynálezu je dalej tiež farmaceutický prostriedok vhodný pre systemické a/alebo topické podávanie, ako je podávanie na kožu, rektálne podávanie, podávanie na sliznicu atd., ako je napríklad multigramový farmaceutický prostriedok pre topické použitie, pričom hore uvedený farmaceutický prostriedok je účinný pre inhibíciu, znižovanie a regresiu angiogenézy a obsahuje väčší počet dávkových množstiev pre inhibíciu, znižovanie a regresiu angiogenézy, pričom každé dávkové množstvo obsahuje terapeuticky účinné, vzhíadom na pacienta netoxické, dávkové množstvo nesteroidného protizápalového liečiva, napríklad diclofenacu a účinné netoxické dávkové množstvo kyseliny hyalurónovej a/alebo jej soli a/alebo homológu, analógu, derivátu, komplexu, esteru, fragmentu a/alebo podjednotky kyseliny hyalurónovej, pre inhibíciu, znižovanie a regresiu angiogenézy.

Tieto farmaceutické prostriedky môžu obsahovať vhodné excipienty, ktoré sú zvolené v závislosti od cesty podávania. Tak napríklad pre systemické podávanie je vhodným excipientom sterilná voda a pre topické podávanie sa ako excipienty môžu použiť látky poskytujúce gél, lotión alebo krém. Nech už je prostriedok určený pre akýkoívek spôsob podávania, môže ako excipient obsahovať solubilizátor, napríklad metoxypolyetylénglykol 350 a konzervačné činidlo, ako je benzylalkohol.

Ešte dalším predmetom vynálezu je dávkové množstvo farmaceutického prostriedku pre inhibíciu, znižovanie a regresiu angiogenézy, pričom tento prostriedok obsahuje

1) nesteroidné protizápalové činidlo, napríklad sodnú soľ diclofenacu a

2) kyselinu hyalurónovú a/alebo jej soľ, napríklad hyaluronát sodný a/alebo homológ, analóg, derivát, komplex, ester, fragment a/alebo podjednotku kyseliny hyalurónovej, ktorého podstata spočíva v tom, že tento prostriedok je

a) v dávkovacej forme, napríklad vo forme krému, lotiónu, gélu, intravenózneho roztoku, injekčného prostriedku atd., ktorý sa hodí pre podávanie, napríklad systemické alebo topické podávanie a

b) a má takú podobu a formu, že zložka 1) je prítomná v účinnom dávkovom množstve spolu so zložkou 2) pre inhibíciu, znižovanie a regresiu angiogenézy, napríklad pre inhibíciu metastáz. Taký farmaceutický prostriedok môže obsahoval väčší počet dávkových množstiev.

Predmetom vynálezu je ďalej použitie

1) nesteroidného protizápalového liečiva, napríklad sodnej soli diclofenacu a

2) kyseliny hyalurónovej a/alebo jej soli a/alebo homológu, analógu, derivátu, komplexu, esteru, fragmentu a/alebo podjednotky kyseliny hyalurónovej, pri výrobe farmaceutického prostriedku pre použitie na inhibíciu, znižovanie a regresiu angiogenézy u cicavcov, napríklad ľudí, pričom z takto vyrobeného prostriedku je možné odoberať jednotlivé dávkové množstvá prostriedku a každé odobrané dávkové množstvo obsahuje terapeuticky účinné ne13 toxické dávkové množstvo zložky 1) a 2) pre inhibíciu, znižovanie a regresiu angiogenézy.

Pri použití farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje formu kyseliny hyalurónovej a nesteroidné protizápalové liečivo, je možné dosiahnuť vyššiu inhibíciu, zníženie a regresiu (podstatne vyššiu inhibíciu, zníženie a regresiu) angiogenézy, ako pri použití farmaceutického prostriedku obsahujúceho formu kyseliny hyalurónovej (napríklad hyaluronát sodný) samotného (bez nesteroidného protizápalového liečiva). Predmetom vynálezu sú preto i podobné spôsoby liečby, farmaceutické prostriedky, dávkové množstvá a použitie zahŕňajúce formy kyseliny hyalurónovej (napríklad hyaluronát sodný s molekulovou hmotnosťou nižšou ako 750 000 dalton) bez nesteroidného protizápalového liečiva, ktoré boli uvedené v prípade foriem kyseliny hyalurónovej s nesteroidnými protizápalovými liečivami.

Množstvo formy kyseliny hyalurónovej (napríklad hyaluronátu sodného) v dávkovom množstve sa môže pohybovať v rozmedzí od asi 5 mg, v prípade podávania človeku, ako napríklad topického podávania (5 mg/cm² kože alebo exponovaného tkaniva) v závislosti od cesty podávania, až do 1 000 mg/70 kg telesnej hmotnosti, v závislosti od cesty podávania. Pretože formy kyseliny hyalurónovej nie sú toxické, je prirodzene možné je podávať v množstve vyššom (napríklad 3 000 mg/70 kg telesnej hmotnosti, v prípade systemického podávania), bez toho aby to malo dajaké nepriaznivé následky. Množstvo formy kyseliny hyalurónovej (napríklad hyaluronátu sodného) podávané systemicky môže byt asi 50 mg na každých 15 mg nesteroidného protizápalového liečiva. Prednostne podávaná forma kyseliny hyalurónovej (napríklad hyaluronátu sodného) má molekulovú hmotnosť nižšiu ako asi 750 000 dalton (napríklad asi 150 000 až asi 225 000 dalton). Pre inhibíciu angiogenéze sa síce môže použiť kyselina hyalurónová a jej formy s vyššou molekulovou hmotnosťou, ale pokiaľ je molekulová hmotnosť zvolenej kyseliny hyalurónovej pre použitie príliš vysoká, prednostne sa taká forma kyseliny hyalurónovej vopred spracuje v autokláve, aby sa kyselina hyalurónová rozštiepila na fragmenty s nižšou molekulovou hmotnosťou, alebo, pokiaľ je to možné, vopred zriedi, aby sa dala podávať a aby sa zaistilo, že nebude koagulovať (nech už sa použije akákoľvek cesta podávania). Pokiaľ sa používa forma kyseliny hyalurónovej s vyššou molekulovou hmotnosťou, môže sa koncentrácia takej formy kyseliny hyalurónovej v prostriedku upraviť, napríklad znížiť (napríklad na menej ako asi 1 %), v závislosti od molekulovej hmotnosti.

Jedna forma hyalurónovej kyseliny a/alebo jej solí (napríklad sodnej soli), homológu, analógu, derivátu, komplexu, esteru, fragmentu a podjednotiek kyseliny hyalurónovej, prednostne hyalurónovej kyseliny samotnej a jej soli, ktorá sa hodí pre použitie podľa vynálezu, je tvorená frakciou dodávanou firmou Hyal Pharmaceutical Corporation. Jedna taká frakcia je obsiahnutá v 15 ml fľaštičke obsahujúcej hyaluronát sodný 20 mg/ml (300 mg/fľaštička - várka 2F3). Frakcia hyaluronátu sodného je tvorená 2 % roztokom látky so strednou molekulovou hmotnosťou približne 225 000. Táto frakcia tiež obsahuje vodu q.s., ktorá je trojnásobne predestilovaná a sterilná, v súlade s požiadavkami lekárskeho predpisu US.P. pre injekčné prípravky. Fľaštičky s hyalurónovou kyselinou a/alebo jej solí môžu byt zhotovené z borosilikátového skla typu 1 a uzatvorené butylkaučukovou zátkou, ktorá nereaguje s obsahom fľaštičky.

Frakcia hyalurónovej kyseliny a/alebo jej soli (napríklad sodnej soli), homológu, analógu, derivátu, komple xu, esteru, fragmentu a/alebo podjednotiek kyseliny hyalurónovej, prednostne hyalurónovej kyseliny samotnej a jej soli, môže obsahovať hyalurónovú kyselinu a/alebo jej soľ s nasledujúcimi vlastnosťami:

Prečistená, v podstate apyrogénna frakcia hyalurónovej kyseliny, získanej z prírodného zdroja, ktorá má aspoň jednu z vlastností (prednostne všetky z vlastností) zvolených z dalej uvedeného súboru:

(i) molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 150 000 do 225 000;

(ii) obsah sulfátovaných mukopolysacharidov nižší ako asi

1,25 % hmotnostných, vztiahnuté na celkovú hmotnosť;

(iii) obsah proteínu nižší ako asi 0,6 % hmotnostných, vztiahnuté na celkovú hmotnost;

(iv) obsah železa nižší ako asi 150 ppm, vztiahnuté na celkovú hmotnosť;

(v) obsah olova nižší ako asi 15 ppm, vztiahnuté na celkovú hmotnosť;

(vi) obsah glukosamínu nižší ako 0,0025 %;

(vii) obsah glukurónovej kyseliny nižší ako 0,025 %;

(viii) obsah N-acetylglukosamínu nižší ako 0,025 %;

(ix) obsah aminokyselín nižší ako 0,0025 %;

(x) UV-extinkčný koeficient pri 257 nm nižší ako asi 0,275;

(xi) UV-extinkčný koeficient pri 280 nm nižší ako asi 0,25; a (xii) hodnotu pH v rozmedzí od 7,3 do 7,9.

Hyalurónová kyselina je prednostne zmiešaná s vodou a použitá frakcia hyalurónovej kyseliny má strednú molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 150 000 do 225 000. Frakcia hyalurónovej kyseliny má s výhodou aspoň jednu vlastnosť (prednostne všetky vlastnosti) zvolenú z nasledujúceho súboru:

(i) obsah sulfátovaných mukopolysacharidov nižší ako asi 1 % hmotnostné, vztiahnuté na celkovú hmotnosť;

(ii) obsah proteínu nižší ako asi 0,4 % hmotnostných, vztiahnuté na celkovú hmotnosť;

(iii) obsah železa nižší ako asi 100 ppm, vztiahnuté na celkovú hmotnosť;

(iv) obsah olova nižší ako asi 10 ppm, vztiahnuté na celkovú hmotnosť;

(v) obsah glukosamínu nižší ako 0,00166 %;

(vi) obsah glukurónovej kyseliny nižší ako 0,0166 %;

(vii) obsah N-acetylglukosamínu nižší ako 0,0166 %;

(viii) obsah aminokyselín nižší ako 0,00166 %;

(ix) UV-extinkčný koeficient pri 257 nm nižší ako asi 0,23;

(x) UV-extinkčný koeficient pri 280 nm nižší ako asi 0,19; a (xi) hodnotu pH v rozmedzí od 7,5 do 7,7.

Môže sa tiež používat hyaluronát sodný, ktorý vyrába a dodáva firma LifeCore^ Biomedical, Inc., nasledujúcich vlastností:

Vlastnosť	Opis
vzhlad	biele až krémovo zafarbené častice
zápach	žiadny zápach nie je zistený
viskozitná stredná molekulová hmotnosť	< 750 000 dalton
UV/Vis 190-820nm	zhodný s referenčnou vzorkou

optická hustota (OD), 260 nm <0,25 jednotky OD

citlivosť na hyaluronidázu «	pozitívna odpoveď
IČ •	zhodný s referenčnou vzorkou
pH, 10 mg/g roztok	6,2 až 7,8
voda	maximálne 8 %
proteín	< 0,3 μg/mg NaHy
acetát	< 10,0 ug/mg NaHy

ťažké kovy, maximálny obsah

As Cd Cr Co Cu 2,0 5,0 5,0 10,0 10,i mikrobiálne biologické znečistenie endotoxín skúšanie biologickej bezpečnosti (ppm)

Fe Pb Hg Ni 25,0 10,0 10,0 5,0 nie je pozorované <0,07 EU/mg NaHy úspešne prejde skúškou toxicity v oku králika

Ďalšia forma hyaluronátu sodného sa na trhu predáva pod označením Hyaluronan HA-M5070 (Skymart Enterprises, Inc.) Táto forma má nasledujúce vlastnosti:

Výsledky skúšania

Várka č.

PH sulfát kondroitínu obsah proteínu obsah ťažkých kovov obsah arzénu hmotnosťná strata sušením zvyšok po spálení (popol) limitné viskózitné číslo obsah dusíka esej počet mikroorganizmov E. coli plesne a kvasinky

HG1004

6,12 nezistený

0,05 % ne viacej ako 20 ppm ne viacej ako 2 ppm 2,07 %

16,69 %

12,75 dl/g (XW: 679 000)

3,14 %

104,1 % g¹negatívny ne viacej ako 50 g“¹

Tiež sa môžu použiť rôzne formy kyseliny hyalurónovej a/alebo jej soli homológu, analógu, derivátu, komplexu, esteru, fragmentu a/alebo podjednotiek kyseliny hyalurónovej od iných výrobcov, napríklad formy, ktoré sú opísané v doterajšom stave techniky, za predpokladu, že ide o formy kyseliny hyalurónovej vhodnej pre transport v medicíne.

Odkazy na potenciálne vhodnú hyalurónovú kyselinu, jej zdroje, spôsoby jej výroby a jej izoláciu sú uvedené v nasledujúcich literárnych citáciách:

V US patente č. 4 141 973 sú opísané frakcie hyalurónovej kyseliny vrátane jej sodných solí, ktoré majú

a) priemernú molekulovú hmotnosť vyššiu ako asi 750 000, prednostne vyššiu ako asi 1 200 000, t.j. limitné viskozitné číslo vyššie ako asi 1400 cm³/g a prednostne vyššie ako asi 2 000 cm³/g;

b) obsah proteínu nižší ako 0,5 % hmotnostných;

c) absorbanciu ultrafialového svetla 1 % roztoku hyaluronátu sodného nižšiu ako 3,0 pri vlnovej dĺžke 257 nm a nižšiu ako 2,0 pri vlnovej dĺžke 280 nm;

d) kinematickú viskozitu 1% roztoku hyaluronátu sodného vo fyziologickom tlmivom roztoku vyššiu ako asi 10 “³ m²/s prednostne vyššiu ako 10 ”² m²/s;

e) molárnu optickú otáčavosť 0,1 až 0,2% roztoku hyaluronátu sodného vo fyziologickom tlmivom roztoku nižšiu ako -11 x 10³ deg-cm²/mol (disacharid), merané pri 220 nm;

f) ked sa 1 ml 1 % roztoku tohto hyaluronátu sodného rozpusteného vo fyziologickom roztoku implantuje do sklovca oka opice (Owl monkey), pričom sa ním nahradí približne 1/2 prítomného kvapalného sklovca, nedôjde k žiadnej podstatnej celulárnej infiltrácii Camera vitrea bulbi a Camera oculi ante rior, žiadnym zábleskom v Humor aquosus, žiadnemu zákalu ale bo zábleskom v sklovci a žiadnym patologickým zmenám rohovky, šošovky, dúhovky, sietnice a choroidea;

pričom táto hyalurónová kyselina je dalej

g) sterilná, neobsahuje pyrogény a

h) neantigénna.

Kanadský patent č. 1 205 031 (ktorý cituje US patent č. 4 141 973, ako doterajší stav techniky) sa týka frakcií hyalurónovej kyseliny so strednou molekulovou hmotnosťou Od 50 000 do 100 000; od 250 000 do 350 000 a od 500 000 do 730 000, pričom sú tu diskutované spôsoby ich výroby.

Prehľad obr. na výkrese

Obr. 1 zahŕňa dve okienka (obr. IA a 1B), na ktorých sú znázornené stĺpcové grafy ilustrujúce účinok prostriedkov na vaskulaturu v murinnom chronickom granulomatickom vzduchovom váčku.

Na obr. 2 sú graficky ilustrované výsledky skúšok anti-angiogenézy, tj. závislosť pomeru VI od času.

Na obr. 3 sú graficky ilustrované výsledky skúšok anti-angiogenézy, tj. závislosť obsahu karmínovej červeni od času.

Na obr. 4 sú graficky ilustrované výsledky skúšok anti-angiogenézy, tj. závislosť suchej hmotnosti granulómu od času.

Nasleduje podrobný opis jednotlivých rozpracovaní vynálezu, v ktorom je vynález ilustrovaný pri použití experimentálnych údajov nameraných pri ďalej opísaných skúškach.

Pre skúšanie bol zvolený jednoduchý model murinnej angiogenézy indukovanej chronickou granulomatickou reakciou na Freundov úplný adjuvans v krotónovom oleji. Pri práci na vynáleze bola použitá modifikácia tejto metódy spočívajúca vo vytvorení intravaskulárneho vyfarbenia zahŕňajúceho karmínovú červeň. Chronické granulomatické vzduchové váčky sa indukujú subkutánnou injekciou 3 ml vzduchu anestetizovaným myšiam s hmotnosťou 25 až 30 g (Tuck Originál) a 0,5 ml Freundovho kompletného adjuvans s 0,1 % krotónového oleja po 24 hodinách. Dávkovanie myšiam sa vykonáva počas 6 dní a vaskulárny obsah sa určuje na základe vzniku vaskulárneho vyfarbenia. Vaskulárne vyfarbenie sa vyvolá intravenóznou injekciou 1 ml 25% roztoku karmínovej červeni v 10% roztoku želatíny o 40’C zahriatym myšiam. Tým sa prekonajú akékoľvek zmeny periférneho vazomotorického tónu spojené s teplotou alebo vyvolané farmakologicky, ktoré by mohli znehodnotiť výsledky. Mŕtve telíčka sa zmrazia a vyreže sa granulomatická výstelka vzduchového váčku. Ta sa vysuší pri 56’C, zváži a digeruje papaínom. Farbivo sa rozpustí prídavkom 1 ml 0,5M roztoku hydroxidu sodného a vzorky sa 20 minút odstreďujú pri zrýchleniu 2 500 g. Potom sa vzorky prefiltrujú a zmerí sa absorbancia pri 490 nm pri použití čítacieho zariadenia pre dosky s väčším počtom jamiek (Biotek). Výsledky sa potom vyjadria v hodnotách ug farbiva/gg suchej hmotnosti tkaniva.

Skúša sa, či topické podávanie kombinácie Diclofenac/hyaluronan (HA) - napríklad hyaluronát sodný s molekulovou hmotnosťou nižšou ako 750 000 dalton, bude vykazovať angiostatickú účinnosť a tiež či bude takú angiostatickú účinnosť vykazovať samotný hyaluronan, napríklad hyaluronát sodný.

Na povrch depilovaného vzduchového váčku sa topicky aplikuje každý deň 0,1 ml hyaluronanu a diclofenacu (6 mg/kg). Pokiaľ sa diclofenac podáva samotný, podáva sa v kombinácii s karboxymetylcelulózou. Intralezionálna aplikácia sa vykonáva injekčným podaním do vzduchového váčku, pričom samotný diclofenac sa podáva v sterilnom roztoku chloridu sodného. Meranie sa uskutočňuje siedmy deň po indukcii vaskularity tkaniva. Z obr. 1A a 1B je zrejmé, že ani topické, ani intralezionálne podanie samotného hyaluronanu (HA) a samotného diclofenacu (Dielo) nemá významný účinok na vaskularitu tkaniva. Kombinácia hyaluronanu (HA) a diclofenacu (Dielo) sa však prejaví podstatným znížením vaskularity. (Obr. 1A a 1B ilustrujú účinok hyaluronanu a diclofenacu vždy samotného alebo v kombinácii na vývoj vaskularity v murinnom chronickom granulomatickom vzduchovom váčku. Na povrch depilovaného vzduchového váčku sa topicky aplikuje 0,1 ml hyaluronanu a diclofenac (6 mg/kg) denne, pričom sa tieto látky použijú buď jednotlivo alebo v kombinácii (obr. 1A).) Samotný diclofenac sa podáva v karboxymetylcelulóze, ako nosiči. Intralezionálna aplikácia sa uskutočňuje injekčným podaním do vzduchového váčku (obr. 1B). V tomto prípade sa diclofenac podáva v roztoku chloridu sodného. Vaskularita tkaniva sa merí 7. deň.

Protokol podávania kombinácie kyseliny hyalurónovej a diclofenacu (topického podávania a podávania do vzduchového váčku)

Úvod:

Vytvorenie subkutánneho vzduchového váčku na chrbáte myši umožňuje vytvoriť výstelku zodpovedajúcu vzniku chronickej inflamatornej lézie v odpovedi na rôzne antigény, dráždidlá a cudzie telesa. Tiež sa môže použiť pre zavádzanie liečiv a rôzne iné ošetrenia na mieste zápalu a pre odber inflamatorného exudátu.

Bola vyvinutá jedinečná a jednoduchá metóda, ktorá umožňuje kvantitatívne vyhodnotiť angiogenézu vo vyvíjajúcom sa inflamatornom vzduchovom váčku. Táto metóda zahŕňa vaskulárne vyfarbenie obsahujúce karmínovú červeň a nasledujúce spektrofotometrické stanovenie.

Metóda:

Pre tento pokus sa použijú myšie samice (TO, 25 až 30 g, 10 zvierat v skupine), ktoré sa ľahko anestetizujú hypnormom/hypnovalom. Vzduchové váčky sa vytvoria subkutánnou injekciou 3 ml filtráciou sterilizovaného vzduchu do chrbátu každej myši. Po 24 hodinách sa na výstelke vzduchového váčku indukuje chronický zápal vstreknutím 0,5 ml Freundovho úplného adjuvans (FCA), ktoré je doplnené 0,1 % krotónového oleja.

Dávkovací režim:

Dávkovanie sa vykonáva každý deň od vstreknutia FCA/krotonový olej počas 6 dní. Potom sa uskutoční analýza.

1. Topické podávanie: (vicf tabuľka 1: topické podávanie) štyri skupiny - 0,1 ml obchodne dostupného krému na vodnej báze Aqueous Cream (Thornton & Ross Ltd.)

- 0,1 ml Aqueous Cream + 6 mg/kg diclofenacu (HPC várka č. 9113003)

- 0,1 ml kyseliny hyalurónovej (hyaluronátu sodného) (Hyal Pharmaceutical Corporation /HPC/) várka č. OG019

- 0,1 ml kyseliny hyalurónovej (1% roztoku hyaluronátu sodného s molekulovou hmotnosťou nižšou ako 750 000 dalton, napríklad 225 000 dalton) + 6 mg/kg diclofenacu

Pred topickým podávaním sa chlpy na chrbáte odstránia strihacím strojom a depilačným krémom (Louis Marcel).

Pri použití elektrického strihacieho stroja dôjde k poraneniu povrchu kože u jednej alebo dvoch myší z každej skupiny. Tieto zvieratá sa z výsledku vylúčia.

2. Podávanie do vzduchového váčku (injekcie) štyri skupiny - 0,1 ml sterilného roztoku chloridu sodného (0,9%)

- 0,1 ml sterilného roztoku chloridu sodného + 6 mg/kg diclofenacu (HPC várka číslo 9113003)

- 0,1 ml kyseliny hyalurónovej (hyaluronátu sodného) várka č. OG019

- 0,1 ml kyseliny hyalurónovej (1% roztoku s molekulovou hmotnosťou nižšou ako 750 000 dalton, napríklad 225 000 dalton) + 6 mg/kg diclofenacu

Vaskulárne vyfarbenie:

Myši sa anestetizujú hypnormom/hypnovalom a umiestnia na 20 minút na zahrievanú operačnú dosku udržiavanú pri teplote 37C. Potom sa každá mýš prenesie do inkubačnej komory, ktorá je pomocou duplikátorového vodného plášťa zahrievaná na 37“C a intravenózne sa im injekčnou striekačkou podá 1 ml 15% roztoku karmínového farbiva v 10 % roztoku želatíny (v Hanksovom vyváženom soľnom roztoku), ktorý je predhriaty na teplotu 40C. Usmrtené zvieratá sa 4 hodiny chladia pri teplote 4’C.

Analýza:

Granulomatické tkanivo sa vyreže a vysuší 48 hodinovým sušením pri teplote 56*C. Vysušené granulomatické tkanivo sa zváži a potom digeruje v 9 ml roztoku papaínu (12 j/ml v 0,05M fosfátovom tlmivom roztoku s pH 7,0, ktorý je doplnený 0,33 g/liter N-acetylcysteínu, 48 hodín pri 56’C. Extrakty sa potom doplnia 5,0M roztokom hydroxidu sodného nä 10 ml a vírivým miešaním vzniknutej zmesi sa prevedie farbivo do roztoku. Potom sa vzorka odstredí a extrakt sa prefiltruje cez membránu z dusičnanu celulózy s pórmi s velikosťou 0,2 μπι. Vzorka s objemom 200 ml sa rozdelí na alikvotné časti do dosky s 96 jamkami a spektrofotometrickou analýzou pri 490 nm sa pri použití čítacieho zariadenia pre mikrotitrové dosky analyzuje obsah farbiva. Vaskulárny objem sa vypočíta ako obsah karmínového farbiva v mg suchej hmotnosti tkaniva.

Tabulka 1

Topické podávanie

Aqueous Cream (0,1 ml)

Zviera	Suchá hmotnosť (mg)	Absorbancia	Karmín (mg)	μg farbiva/mg suchej hmotnosti
1	174	0,0183	65,5	0,376
2	303	0,848	319	1,053
3	133	0,613	229	1,722
4	163	0,769	289	1,773
O 6	221	1,014	382	1,728
7	130	0,689	258	1,985
8	122	0,606	227	1,661
y 10	191	0,413	156	0,817
stred	179,6		240,7	1,389
SEM	21,26		346	0,201

Kyselina hyalurónová (0,1 ml) [1% roztok (10 mg/ml), molekulová hmotnosť nižšia ako 750 000 dalton]
Zviera	Suchá hmôt-	Absorbancia	Karmín	μg farbiva/mg
	nosť (mg)		(mg)	suchej hmotnosti
1	187	0,0657	246	1,316
2	178	0,528	179	1,107
3	146	0,148	52,2	0,358
4	190	0,433	161	0,847
D 6	181	0,505	188	1,039
7	179	0,494	184	1,028
8	160	0,567	212	1,325
9	192	0,631	263	1,229
10 stred	176,62		184,5	1,031
SEM	561		31,3	0,111
P=	NS		NS	NS

Kyselina hyalurónová (1% roztok) + diclofenac (6 mg/kg)

Zviera	Suchá hmotnost (mg)	Absorbancia Karmín (mg)	μg farbiva/mg suchej hmotnosti
1	152	0,185	66,2	0,436
2	176	0,125	43,4	0,242
3	201	0,441	164	0,816
4	149	0,461	171	1,148
5	196	0,578	216	1,102
D 7	88	0,176	62,8	0,714
8	131	0,195	70,1	0,535
9	135	0,109	37,3	0,276
10
stred	154,6		103,6	0,658
SEM	13,79		24,3	* °'¹²³ *
P=	NS		0,0104	0,0209

Agueous Cream + diclofenac (6 mg/kg)
Zviera	Suchá hmôt- Absorbancia Karmín	μg farbiva/mg suchej hmotnosti
nost (mg)	(mg)
1	126	0,528	218	1,730
2	176	0,420	156	0,886
3 Λ	140	0,401	148	1,057
4 5	124	0,510	190	1,532
6 •7	167	0,464	173	1,035
Z 8	197	0,808	304	1,534
9	207	0,854	231	1,551
10	193	0,217	78,2	0,405
stred	166,3		187,3	1,216
SEM	11,58		23,6	0,158
P=	NS		NS	NS

n = 10, SEM = smerodajná odchýlka NS = nesignifikantné rozdiely

Tabuľka 2

Podávanie do vzduchového váčku

Kyselina hyalurónová (1% roztok) + diclofenac (6 mg/kg)

Zviera	Suchá hmotnosť (mg)	Absorbancia Karmín (mg)	μg farbiva/mg suchej hmotnosti
1	104	0,323	68	0,654
2	106	0,293	61,5	0,580
3	140	0,215	44,6	0,319
4	133	0,305	64,1	0,482
5	115	0,460	97,7	0,846
6	90	0,258	53,9	0,602
7	262	0,271	56,8	0,217
8	72	0,178	36,6	0,509
9	64	0,171	35,1	0,545
10	85	0,210	43,5	0,512
stred	117,1		56,2	0,5266
SEM	I⁷,⁸ *		⁵'⁸⁵ **	0,0546
P=	0,0454		0,0029	0,0260*

Kyselina hyalurónová (1% roztok)

Zviera	Suchá hmotnosť (mg)	Absorbancia Karmín (mg)	gg farbiva/mg suchej hmotnosti
1	126	0,607	130	1,032
2	128	0,209	43,3	0,337
3	142	0,710	152	1,069
4	108	0,603	129	1,194
5	118	0,414	87,8	0,747
6	97	0,293	61,8	0,637
7	134	0,190	39,2	0,294
8	160	0,494	105	0,716
9	147	0,495	105	0,716
10	130	0,318	66,9	0,517
stred	129		91,97	0,7197
SEM	5,85		12,24	0,0957
P=	NS		NS	NS

Roztok chloridu sodného

Zviera	Suchá hmotnosť (mg)	Absorbancia Karmín (mg)	μg farbiva/mg suchej hmotnosti
1	211	0,919	197	0,932
2	98	0,590	126	1,282
3	135	0,390	82,6	0,614
4	161	0,880	101	1,184
5	117	0,482	103	0,880
6	134	0,587	125	0,932
7	138	0,447	94,9	0,686
8	233	0,398	84,3	0,361
9	109	0,438	93	0,854
10	168	0,220	45,7	0,272
stred	150,4		114,3	0,7988
SEM	13,8		15,1	0,1022

P=

Roztok chloridu sodného + diclofenac (6 mg/kg)

Zviera	Suchá hmotnosť (mg)	Absorbancia Karmín (mg)	gg farbiva/mg suchej hmotnosti
1	139	0,773	166	1,194
2	158	0,242	50,5	0,320
3	99	0,730	156	1,577
4	99	0,400	104	1,050
5	129	0,409	86,7	0,674
6	124	0,262	54,8	0,442
7	162	0,402	85,2	0,526
8	135	0,303	63,7	0,471
9	170	0,468	99,5	0,586
10	122	0,292	61,3	0,520
stred	133,7		92,75	0,7363
SEM	7,75		12,77	0,1275
P=	NS		NS	NS

n = 10

T a b u Ϊ k a 3

Výsledky

Karmín ^g)

Tonické podanie	Stred	SEM	P =
Agueous Cream	240,7	34,6
Agueous Cream + diclofenac	187,3	23,6	NS
Hyaluronan	184,3	21,3	NS
Hyaluronan + diclofenac	103,6	24,3	0,0104*
Podanie do váčku
Roztok NaCl	114,3	15,1
Kontrolný + diclofenac	92,6	12,8	NS
Hyaluronan	91,9	12,5	NS
Hyaluronan + diclofenac	56,2	5,85	•t 0,0029

Suchá hmotnosť granulomatického tkaniva	(mg)
Tonické podanie	Stred	SEM	P =
Agueous Cream	179,6	21,3
Agueous Cream + diclofenac	166,3	11,6	NS
Hyaluronan	176,6	5,6	NS
Hyaluronan + diclofenac	154,6	13,8	NS

Suchá hmotnosť granulomatického tkaniva (mg)

Podanie do váčku	Stred	SEM	P =
Roztok NaCl	150,4	13,8
Kontrolný + diclofenac	133,7	7,8	NS
Hyaluronan	129	5,9	NS
Hyaluronan + diclofenac	117,1	17,8	0,0454*

Obsah karmínového	farbiva v mg suchej hmotnosti tkaniva
Tonické Dodanie	Stred	SEM	P =
Agueous Cream	1,389	0,201
Agueous Cream + diclofenac	1,216	0,158	NS
Hyaluronan	1,031	0,111	NS
Hyaluronan + diclofenac	0,658	0,123	0,0209*
Podanie do váčku
Roztok NaCl	0,7988	0,1022
Kontrolný + diclofenac	0,7363	0,1229	NS
Hyaluronan	0,07197	0,0957	NS
Hyaluronan + diclofenac	0,5266	0,0546	0,0260*

n = 8 v prípade topického podania n = 10 v prípade podania do váčku

Hore uvedené údaje podporujú záver, že kombinácia kyseliny hyalurónovej a diclofenacu pôsobí synergicky ako angiostatické činidlo. Tiež je dôležité si všimnúť (napriek tomu, že sa nejedná o štatisticky významný trend), že kombinácia kyseliny hyalurónovej s diclofenacom má vyšší angiostatický účinok ako samotná kyselina hyalurónová, pričom samotná kyselina hyalurónová je v tomto smere účinnejšia ako diclofenac.

Všetky údaje boli podrobené štatistickej analýze, keď sa však z výsledku vylúčia zrejme chybné hodnoty, napríklad zviera č. 7 z tabulky 2 (kombinácia kyseliny hyalurónovej s diclofenacom), sú výsledky podstatne štatisticky významnejšie.

Výsledky týchto skúšok a pokusov jasne dokladajú, že formy kyseliny hyalurónovej (napríklad hyaluronátu sodného s molekulovou hmotnosťou nižšou ako 750 000 dalton, napríklad 225 000 dalton) v kombinácii s nesteroidnými protizápalovými liečivami (napríklad diclofenacom) inhibujú angio genézu, napríklad v granulomatickom tkanivu, čo sa prejavuje znížením suchej hmotnosti granulomatického tkaniva.

Inhibícia angiogenézy sa môže použiť pre liečbu a deštrukciu rakovinových nádorov. Prostriedky podlá vynálezu, dávkové množstvá odoberané z týchto prostriedkov a spôsob liečby podlá vynálezu sa môžu použit ako prídavné prostriedky a spôsoby pri akejkolvek protirakovinovej liečbe (napríklad pri ožiarovaní, chemoterapii pri použití protirakovinových liečiv atď.). Vynález sa dá tiež použiť pre liečbu metastáz u pacientov trpiacich rakovinou, aby sa pri odstránení jedného nádoru nevyvinul ďalší malígny nádor. Vývoj nádorov je inhibovaný inhibíciou rastu ciev v nádore (zabránením dodávky krvi do nádoru). V tomto ohladu sa pri použití vynálezu môže dosiahnuť interferencia s účinností faktoru nádoro vej angiogenézy (TAF) (inhibícia tejto účinnosti, ku ktorej dochádza v rakovinovom nádore za účelom povzbudenia rastu ciev). Prostriedok, ktorý napríklad obsahuje hyaluronát sodný a diclofenac a ktorý sa podáva systemicky humánnemu pacientovi, inhibuje angiogenézu, čím dochádza k odstráneniu nádoru. Prostriedky podlá vynálezu je možné podávať krátkodobo alebo dlhodobo, podlá potreby (napríklad počas niekolkých týždňov až mesiacov). Z hore uvedených počiatočných výskumov je zrejmé, že kombinácia hyaluronanu a diclofenacu, podávaná buď topicky alebo priamo do lézie, má za následok zníženie vaskulárneho vývoja pri granulomatickom zápalu.

Ďalší protokol

Podlá tohto ďalšieho protokolu sa opäť používa vzduchový váčok na myši, ako skúšobnom zvierati. Rozdiel je, že v tomto prípade ša po vytvorení vzduchového váčku a vstreknutí 0,5 ml Freundovho úplného adjuvans (FCA) doplneného 0,1 % krotónového oleja granuloma v myši nechá 7 dní rast (tzn. myši nie sú počas 1 týždňa liečené). Táto skutočnosť sa prejaví rastom nových ciev.

Niektoré z myší sa na konci tohto sedemdenného obdobia usmrtia (spôsobom opísaným hore), zatial čo iné sa topicky ošetrujú pri dennom dávkovaní

- 0,1 ml Agueous Cream (Thornton & Ross Ltd.)

- 0,1 ml Agueous Cream + 6 mg/kg diclofenacu (HPC várka č. 9113003)

- 0,1 ml kyseliny hyalurónovej (HPC várka č. OG019)

- 0,1 ml kyseliny hyalurónovej (1% roztoku hyaluronátu sodného s molekulovou hmotnosťou nižšou ako 750 000 dalton, napríklad 225 000 dalton) + 6 mg/kg diclofenacu.

Niektoré z myší sa usmrtia (spôsobom uvedeným hore) po 2 týždňoch (1 týždeň po zahájení topickej liečby) a zvyšok sa usmrtí (spôsobom uvedeným hore) po 3 týždňoch (2 týždne po zahájení topickej liečby).

Karmínová červeň vytesní krv z granulomatického tkaniva. Granulomatické tkanivo sa vyreže a spracuje hore uvedeným spôsobom. V každom štádiu (po 7 , 14 a 21 dňoch) sa pri každej myši stanoví hmotnosť gramuloma (vrátane karmínovej červene) a hmotnosť karmínovej červene (ktorá vytesnila krv). Vypočíta sa index vaskularity (VI) a pre každú skupinu sa nasledujúcim spôsobom vypočíta stredný index vaskularity:

hmotnosť karmínovej červene v granúloma

Index vaskularity (VI) = hmotnosť granuloma (vrátane karmínovej červene)

Z nasledujúcej tabuľky je zrejmé, že ako pri použití kyseliny hyalurónovej (HA), tak pri použití kombinácie kyseliny hyalurónovej s diclofenacom, klesá s časom stredná hodnota suchej hmotnosti granuloma. Pri použití kombinácie kyseliny hyalurónovej a diclofenacu sa s časom znižuje index vaskularity (VI). K tomuto javu nedochádza pri použití žiadneho iného prostriedku. Je preto zrejmé, že tento pokles je meradlom zníženia vaskularity (dodávky krvi).

Výsledky pre všetky myši usmrtené v rovnaký čas sa spracovávaj ú dohromady.

Tabuľka 4

		Karmín Suchá VI (mg) hmôt. (pg/mg) granúl. (mg)
Po 1. týždni - vzduchový váček	stred SEM P =	173,55 116,71 1,505 6,86 4,56 0,062
Po 2. týždni Agueous Cream	stred SEM P =	127,87 102,65 1,228 17,98 7,33 0,066 0,0451 NS NS
Po 3. týždni Agueous Cream	stred SEM P =	212,72 116,57 1,822 10,66 3,49 0,062 0,0141 NS 0,0046*
Po 2. týždni hyaluronan	stred SEM P =	115,70 101,23 1,136 17,12 6,56 0,141 0,0153 0,0328 0,0436
Po 3. týždni hyaluronan	stred SEM P =	118,68 80,13 1,402 14,97 5,44 0,138 0,0075 0,0001 NS
Po 2. týždni Agueous Cream/ diclofenac	stred SEM P =	108,63 84,41 1,300 ⁸'⁹⁸* ⁵'⁵⁸* °'⁰⁸⁹0,0084 0,0006 NS
Po 3. týždni Agueous Cream/ diclofenac	stred SEM P =	150,07 112,19 1,353 12,07 7,79 0,115 NS NS NS
Po 2. týždni hyaluronan/ diclofenac	stred SEM P =	69,63 60,23 1,196 8,61 ⁷'⁷²^a. 0,141 . 0,0002 * 0,0003 0,0376
Po 3. týždni hyaluronan/ diclofenac	stred SEM P =	66,63 55,31 1,125 ¹⁵'⁰⁰* ⁸'⁴⁷* °'²¹² * 0,0002 0,0002 0,0224

IV = index vaskularity SEM = smerodajná odchýlka

Pre lepšiu ilustráciu sú výsledky spracované grafickou formou na obr. 2, 3 a 4. Na týchto obrázkoch je znázornená časová závislosť nasledujúcich premenných pri angio genézi: indexu vaskularity (obr. 2), množstva karmínovej červeni (obr. 3) a množstva granulomatického tkaniva (obr.

4).

Ďalšie spracovanie výsledkov je uvedené v tabuľke 5, V tejto tabuľke sú uvedené stredné hodnoty nameraných údajov popri seba tak, aby bolo možné ich ľahké porovnanie. Na základe týchto údajov boli skonštruované grafy na obr.

2, 3 a 4.

Tabuľka 5

	Po 1.týždni (kontrolnom)	Po 2.týždni	Po 3.týždni
	Karmín	(μσ)
Agueous Cream samotný	173,55	127,87	212,72
Hyaluronan samotný	173,55	115,7	118,68
Agueous Cream/ diclofenac	173,55	108,63	150,07
Hyaluronan/ diclofenac	173,55	69,63	66,63

Suchá	hmotnosť granulomatického tkaniva	(mg)
Aqueous Cream samotný	116,71	102,65	116,57
Hyaluronan samotný	116,71	101,23	80,1
Diclofenac samotný	116,71	84,41	112,19
Hyaluronan/ diclofenac	116,71	60,23	55,31
	Index vaskularity	VI ^g/mg)
Aqueous Cream samotný	1,505	1,228	1,822
Hyaluronan samotný	1,505	1,136	1,402
Diclofenac samotný	1,505	1,3	1,353
Hyaluronan/ diclofenac	1,505	1,196	1,125

Údaje získané pri podávaní prostriedku na báze hyaluronátu sodného myšiam boli extrapolované na humánnu aplikáciu. Výpočty uvedené dalej neznamenajú, že by s nižším množstvom nebolo možné očakávať podstatnú regresiu. V tomto ohľade zodpovedá podanie 0,1 ml 1% roztoku spolu s 6 mg/kg diclofenacu myši s hmotnosťou 25 až 30 g dávke 33,3 mg HA/kg a 6 mg sodnej soli diclofenacu/kg. Osobe s hmotnosťou 70 kg je teda potrebné podať viac ako 2 200 mg HA a 420 mg diclofenacu.

Odborníkom v tomto odboru je zrejmé, že jednotlivé aspekty tohto vynálezu je možné použiť za účelom inhibície angiogenézy i v iných prípadoch, kedy je taká inhibícia potrebná, napríklad pri subretinálnej neovaskularizácii a pri liečbe artritis alebo pri prevencii ďalších škôd, ktorá zahŕňa prevenciu ďalšieho vývoja pannu. Je teda zrejmé, že jednotlivé predvedenia a jednotlivé aspekty tohto vynálezu je možné rôznym spôsobom využívať a všetky také využitia, pokiaľ sú v duchu vynálezu, tiež spadajú do rozsahu jeho ochrany. Príklady uvedené v tomto opise majú teda výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie a) nesteroidného protizápalového činidla a b) kyseliny hyalurovej a/alebo jej farmaceutický vhodnej soli a/alebo homologu, analogu, derivátu, komplexu, esteru, fragmentu a/alebo podjednotky kyseliny hyalurónovej, pri výrobe farmaceutického prostriedku pre liečbu chorôb a chorobných stavov, pri ktorej sa dosiahne úžitku inhibícií, znižovaním a/alebo regresiou angiogenézie, t. j. rastu ciev u človeka, pričom hmotnostný pomer zložky b) k zložke a) leží v rozmedzí od 1:2 do 200:1, množstvo zložky b) je aspoň 50 mg a množstvo zložky a) robí aspoň 15 mg na každých 50 mg zložky b) v prostriedku.
2. Použitie podľa nároku 1, kde zložkou 2) je hyaluronát sodný.
3. Použitie podľa nároku 1, kde chorobou alebo chorobným stavom je subretinálna neovaskularizácia.
4. Použitie podľa nároku 1, kde chorobou alebo chorobným stavom je arthritis alebo pannus.
5. Použitie podľa nároku 1, kde chorobou alebo chorobným stavom je rakovinový nádor.
6. Použitie podľa nároku 1, kde chorobou alebo chorobným stavom je rakovina a farmaceutický prostriedok slúži pre prídavnú liečbu rakoviny za účelom zabránenia vzniku metastáz.

. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde liečba choroby alebo chorobného stavu slúži pre inhibíciu angiogenézie.
8. Použitie podľa nároku 1, 2, 3, 4 choroby alebo chorobného stavu angiogenézie.

5 alebo 6, slúži pre kde liečba znižovanie
9. Použitie podľa choroby alebo angiogenézie.

nároku 1, 2, chorobného

3, 4, 5 alebo 6, kde liečba stavu slúži pre regresiu
10. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde zložkou 2) je hyaluronát sodný s molekulovou hmotnosúou nižšou 750 000 dalton.
11. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde farmaceutický prostriedok slúži pre topickú aplikáciu na koži a/alebo exponované tkanivo.
12. Použitie podľa nároku 10, kde farmaceutický prostriedok slúži pre systematické podávanie.
13. Použitie podľa nároku 12, kde množstvo zložky b) je vyššie než 200 mg a množstvo zložky a) leží v rozmedzí od 15 mg do 100 mg na každých 200 mg zložky b) v prostriedku.
14. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde zložka a) je zvolená zo súboru zahŕňajúceho diclofenac, sodnú soľ diclofenacu, indomethacin, naproxen, (+/-)-tromethaminovú soľ ketorolacu, ibuprofén, pyroxicam, deriváty kyseliny propionovej, kyselinu acetylsalicylovú a flunixin.

:sí.«í f t ,»» '(.f
15. Použitie vyššie než podľa nároku 12, kde množstvo zložky b) je 2200 mg.
16. Použitie a) nesteroidného protizápalového činidla a b) kyseliny hyaluronovej a/alebo jej farmaceutický vhodnej soli pri výrobe farmaceutického prostriedku pre liečbu chorôb a chorobných stavov, pri ktorej sa dosiahne úžitku inhibíciou, znižovaním a/alebo regresiou angiogenézie u človeka, pričom zložka b) má molekulovú hmotnosú od 150000 do 750000 dalton, hmotnostný pomer zložky b) k zložke a) leží v rozmedzí od 1:2 do 200:1 a množstva zložky b) je aspoň 50 mg.
17. Použitie podľa nároku 16, kde prostriedok slúži pre topickú aplikáciu na kožu a/alebo exponované tkanivo.
18. Použitie podľa nároku 16, kde prostriedok slúži pre systematické podávanie.
19. Použitie podľa nároku 18, kde množstvo zložky b) je vyššie než 200 mg a množstvo zložky a) leží v rozmedzí od

15 do 100 mg.
20. Použitie podľa niektorého z nárokov 16, 17, 18 alebo

19, kde liečba choroby alebo chorobného stavu slúži pre inhibíciu angiogenézie.
21. Použitie podľa niektorého z nárokov 16, 17, 18 alebo

19, kde liečba choroby alebo chorobného stavu slúži pre znižovanie angiogenézie.
22. Použitie podľa niektorého z nárokov 16, 17, 18 alebo

19, kde liečba choroby alebo chorobného stavu slúži pre regresiu angiogenézie.
23. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde prostriedok obsahuje naviac farmaceutický kompaktibilné excipienty za účelom uľahčenia podávania formy v závislosti na zvolenej ceste podávania.
24. Použitie podľa nároku 16 alebo 17, kde prostriedok slúži k topickému alebo rektálnemu podávaniu, alebo k podávaniu na sliznicu.
25. Použitie podľa nároku 16, 20, 21 alebo 22, kde chorobou alebo chorobným stavom je subretinálna neovaskularizácia.
26. Použitie podľa nároku 16, 20,'21 alebo 22, kde chorobou alebo chorobným stavom je arthritis alebo pannus.
27. Použitie podľa nároku 16, 20, 21 alebo 22, kde chorobou alebo chorobným stavom je rakovinový nádor.
28. Použitie podľa nároku 16, 20, 21 alebo 22, kde chorobou alebo chorobným stavom je rakovina a farmaceutický prostriedok slúži pre prídavnú liečbu rakoviny za účelom zabránenia vzniku metastáz.
29. Použitie a) nesteroidného protizápalového činidla a b) kyseliny hyaluronovej a/alebo jej farmaceutický vhodné soli s molekulovou hmotnosťou od 150 000 do 750 000 dalton pri výrobe farmaceutického prostriedku pre liečbu chorôb a chorobných stavov, pri ktorej sa dosiahne úžitok z inhibície, znižovanie a/alebo regresia angiogenézie, pričom hmotnostný pomer nesteroidného protizápalového činidla a zložky kyseliny hyaluronovej leží v rozmedzí od 2:1 do 1:200 a minimálne množstvo zložky kyseliny hyaluronovej je 50 mg, za účelom inhibície, znižovanie a/alebo regresia angiogenézie u savcov, ktorí môžu mať '•'Ä vCÍBÄ prospech z inhibície, znižovania a/alebo regresie angiogenézie.
30. Použitie podľa nároku 29, kde farmaceutický prostriedok slúži pre systematické podávanie.
31. Použitie podľa nároku 30, kde množstvo formy kyseliny hyaluronovej je vyššie než 200 mg/70kg telesnej hmotnosti a množstvo nesteroidného protizápalového liečiva leží v rozmedzí od asi 15 do 100 mg.
32. Použitie podľa nároku 29, 30 alebo 31, kde chorobou alebo chorobným stavom je subretinálna neovaskularizácia.
33. Použitie podľa nároku 29, 30 alebo 31, kde chorobou alebo chorobným stavom je arthritis alebo pannus.
34. Použitie podľa nároku 29, 30 alebo 31, kde chorobou alebo chorobným stavom je rakovina.
35. Použitie podľa nároku 29, 30 alebo 31, kde chorobou alebo chorobným stavom je rakovina a farmaceutický prostriedok slúži pre prídavnú liečbu rakoviny za účelom zabránenia vzniku matestáz.
36. Použitie kyseliny hyaluronovej a/alebo jej farmaceutický vhodnej soli s molekulovou hmotnosťou od 150 000 do 750 000 dalton pri výrobe farmaceutického prostriedku pre inhibíciu, znižovanie a/alebo regresiu angiogenézie u človeka trpiaceho chorobou alebo chorobným stavom, pri ktorých liečbe je možné dosiahnuť úžitok z inhibície, znižovanie alebo regresiu angiogenézie, pričom množstvo zložky kyseliny hyaluronovej leží v rozmedzí od 5 do 3 000 mg.
37. Použitie podľa nároku 36, kde farmaceutický prostriedok je určený pre systematické podávanie.
38. Použitie nesteroidného protizápalového činidla a kyseliny hyalurónovej a/alebo jej farmaceutický vhodné soli s molekulovou hmotnosťou od 150 000 do 750 000 dalton vo forme vhodnej pre podávanie človeku pri výrobe farmaceutického prostriedku pre liečbu chorôb a • chorobných stavov, pri ktorej sa dosiahne úžitok z inhibície, znižovanie a/alebo regresia angiogenézie, pričom hmotnostný pomer kyseliny hyalurónovej a/alebo jej farmaceutický vhodnej soli a nesteroidného protizápalového činidla je vyšší než 2:1 a zložka kyseliny hyalurónovej je prítomná v množstve 50 mg na každých 15 mg nesteroidného protizápalového činidla.
39. Použitie podľa nároku 38, kde množstvo kyseliny hyalurónovej a/alebo jej farmaceutický vhodnej soli leží v rozmedzí od 2 200 do 2 800 mg.
40. Použitie podľa nároku 38, kde zložkou kyseliny hyalurónovej je hyaluronát sodný s molekulovou hmotnosťou nižšou než 750 000 a vyššou než 150 000 dalton, • nesteroidným protizápalovým činidlom je diclofenac, ktorý je prítomný v prostriedku v množstve 420 mg na každých 2200 mg prítomného hyaluronátu sodného.