SK12372001A3 - Použitie pde4 špecifického inhibítora a spôsob profylaxie a liečby copd - Google Patents

Použitie pde4 špecifického inhibítora a spôsob profylaxie a liečby copd Download PDF

Info

Publication number
SK12372001A3
SK12372001A3 SK1237-2001A SK12372001A SK12372001A3 SK 12372001 A3 SK12372001 A3 SK 12372001A3 SK 12372001 A SK12372001 A SK 12372001A SK 12372001 A3 SK12372001 A3 SK 12372001A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
pde
rolipram
ratio
compounds
binding
Prior art date
Application number
SK1237-2001A
Other languages
English (en)
Inventor
Siegfried B. Christensen
Mary S. Barnette
Theodore J. Torphy
Original Assignee
Smithkline Beecham Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Smithkline Beecham Corporation filed Critical Smithkline Beecham Corporation
Publication of SK12372001A3 publication Critical patent/SK12372001A3/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A61K31/522—Purines, e.g. adenine having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. hypoxanthine, guanine, acyclovir
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/216—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acids having aromatic rings, e.g. benactizyne, clofibrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/275—Nitriles; Isonitriles
    • A61K31/277—Nitriles; Isonitriles having a ring, e.g. verapamil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/30—Copper compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4015—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. piracetam, ethosuximide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4174—Arylalkylimidazoles, e.g. oxymetazolin, naphazoline, miconazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/472—Non-condensed isoquinolines, e.g. papaverine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález opisuje zlúčeniny, ktoré preferenčne inhibujú alebo viažu jednu formu fosfodiesterázového izozýmu označenú 4 (tu ďalej PDE 4), zatiaľ čo vykazujú rovnaké, alebo výhodne slabšie, viazanie alebo inhibíciu druhej formy enzýmu, a tak sú užitočné na liečbu chronického obštrukčného pľúcneho ochorenia (COPD). Tieto izoenzýmové formy, a verí sa, že sú to navzájom nekonvertovateľné konformácie rovnakého enzýmu, hoci to nebolo dokázané, sú rozlíšiteľné prostredníctvom ich väzobnej afinity voči rolipramu, čo je archetypický PDE 4 inhibítor. Rolipram sa viaže s vysokou afinitou na miesto jednej formy, ale s nízkou afinitou na katalytické miesto druhej formy. Tu je jedna forma označovaná ako vysoko afinitné rolipramové väzobné miesto a druhá forma je označovaná ako nízko afinitné rolipramové väzobné miesto. Opísaný je aj spôsob selektívnej liečby chronického obštrukčného pľúcneho ochorenia prostredníctvom preferenčnej inhibície nízko afinitnej formy katalytického miesta v PDE 4 izozýme. Opísaný je aj spôsob liečby COPD zahŕňajúci podávanie zlúčeniny, ktorá sa preferenčne viaže na nízko afinitné väzobné miesto. Opísaný je aj spôsob selektívnej liečby cvičením indukovanej astmy (EIA) prostredníctvom preferenčnej inhibície nízko afinitnej formy katalytického miesta v PDE 4 izozýme.
Doterajší stav techniky
Cyklické nukleotidové fosfodiesterázy (PDEs) predstavujú rodinu enzýmov, ktoré hydrolyzujú všadeprítomných sekundárnych poslov, adenozín 3’,5’monofosfát (cAMP) a guanozín 3’,5’-monofosfát (cGMP), na ich zodpovedajúce neaktívne 5’-monofosfátové metabolity. Verí sa, že existuje najmenej deväť rozličných tried PDE izozýmov, z ktorých každá má unikátne fyzikálne a kinetické vlastnosti a každá predstavuje produkt odlišnej génovej rodiny. Tieto triedy boli rozlíšené použitím čísel 1 až 9.
-2Cieľovým enzýmom je v tomto vynáleze PDE 4 izozým vo všetkých jeho rôznych formách a vo všetkých bunkách, v ktorých je distribuovaný. Je to cAMPselektívny enzým s nízkou Km (cAMP Km = 1 až 5 μΜ), ktorý má nízku aktivitu voči cGMP (Km > 100 μΜ). Členovia tejto izozýmovej triedy majú zaujímavé vlastnosti tým, že existujú v dvoch alebo viacerých navzájom nekonvertovateľných alebo málo konvertovateľných formách, ktoré viažu rolipram a iné PDE 4 inhibítory s rádovo odlišnými potenciami. Takže rovnaký génový produkt môže existovať vo viac ako jednom katalytický aktívnom konformačnom stave. Dôležité je, že relatívne podiely rôznych väzobných foriem sa môžu meniť v závislosti na tkanivovom bunkovom type. Napríklad zápalové bunky môžu obsahovať relatívne vysoký podiel formy, ktorá viaže rolipram s nízkou afinitou, zatiaľ čo mozgové a parietálne bunky môžu obsahovať relatívne vysoký podiel formy, ktorá viaže rolipram s vysokou afinitou
V tomto vynáleze je zaujímavá najmä úloha tejto triedy izozýmov, ktorú hrajú pri zápale a v hladkom svalstve dýchacích ciest. Zo štúdií vyplýva, že hrá prominentnú úlohu v regulácii cAMP v najrôznejších zápalových bunkách (tzn. mastocytoch, bazofiloch, eozinofiloch, neutrofiloch a monocytoch) a v hladkom svalstve dýchacích ciest. Práca tohto vynálezu je aplikovateľná najmä na zápalové bunky a hladké svalstvo dýchacích ciest; najzaujímavejší je typ izozýmu exprimovaný v ľudských monocytoch. To preto, že cyklické AMP slúži ako druhý posol na inhibíciu chemotaxie a aktivácie zápalových buniek. Okrem toho, cAMP sprostredkúva relaxáciu hladkých svalov dýchacích ciest. To, spolu s hlavnou úlohou PDE 4 v metabolizovaní cAMP, poskytlo oporu na skúmanie PDE 4 inhibítorov: prostredníctvom ich schopnosti zvýšiť obsah cAMP v leukocytoch a v hladkých svaloch dýchacích ciest môžu mať PDE 4 inhibítory protizápalovú a bronchodilatačnú aktivitu.
Súčasné PDE inhibítory používané na liečbu zápalu a ako bronchodilatátory, liečivá ako teofylín a pentoxyfylín, inhibujú PDE izozýmy bez rozlišovania vo všetkých tkanivách. Tieto zlúčeniny majú vedľajšie účinky, nepochybne preto, že neselektívne inhibujú všetky alebo väčšinu PDE izozýmových tried vo všetkých tkanivách. To sa zvažuje pri zhodnocovaní terapeutického profilu týchto zlúčenín.
-3Takýmito zlúčeninami je možné účinne liečiť cieľové ochorenie, ale môžu nastať nechcené sekundárne účinky, pričom, ak by sa bolo možné im vyhnúť alebo ich minimalizovať, zvýšil by sa celkový terapeutický účinok tohto prístupu na liečbu určitých chorobných stavov. Keď sa to zhrnie, vyplýva z tejto informácie, že vedľajšie účinky spojené s použitím neselektívnych PDE inhibítorov by mohli byť redukované nasmerovaním nových izozým-selektívnych inhibítorov predominantného PDE do cieľového tkaniva alebo bunky Hoci teoreticky by izozým-selektívne PDE inhibítory mali predstavovať zlepšenie oproti neselektívnym inhibítorom, doteraz testované selektívne inhibítory nie sú zbavené vedľajších účinkov, ktoré sú vytvárané ako rozšírenie inhibície cieľového izozýmu v nevhodnom alebo nie cieľovom tkanive. Napríklad klinické štúdie so selektívnym PDE 4 inhibítorom rolipramom, ktorý bol vyvinutý ako antidepresívum, indikujú, že má psychotropnú aktivitu a produkuje gastrointestinálne účinky, napr. pyrózu, nauzeu a zvracanie. Existujú indikácie, že vedľajšie účinky denbufylínu, iného PDE 4 inhibítora zameraného na liečbu demencie po viacnásobných infarktoch, môžu zahŕňať pyrózu, nauzeu, ako aj zvracanie. Myslí sa, že tieto vedľajšie účinky nastávajú ako výsledok inhibície PDE 4 v špecifických oblastiach CNS a gastointestinálneho systému.
V roku 1986 Schneider a kolegovia opísali prítomnosť a vlastnosti vysoko afinitných, stereoselektívnych [3H]-rolipram viažucich miest v homogenátoch potkanieho mozgu. Hoci sa predpokladalo, že tieto väzobné miesta predstavujú katalytické miesto potkanej mozgovej cAMP fosfodiesterázy nezávislej na kalmodulíne (tzn. PDE 4), v údajoch bola zjavná zarážajúca anomália. V podobných, hoci nie identických experimentálnych podmienkach, ukazovali údaje, že rolipram má Kd = 1 nM, zatiaľ čo inhibuje aktivitu potkanej mozgovej PDE 4 s K, = 1 μΜ. Takže tu bol 1000-násobný rozdiel medzi afinitou rolipramu voči väzobnému miestu a jeho účinkom na katalytickú aktivitu. Hoci neboli stanovené komplexné vzťahy medzi štruktúrou a aktivitou (SARs) pre PDE inhibíciu a kompetíciu viazania [3H]-rolipramu, zdá sa, že podstatný rozdiel medzi potenciálom rolipramu ako PDE 4 inhibítora a jeho účinkom vo väzobnom mieste spochybňuje platnosť predpokladu, že obe aktivity sú obsiahnuté v rovnakom molekulovom lokuse.
• · · · · · ·
Vďaka tejto hádanke bolo iniciovaných niekoľko štúdií. Cieľom jednej bolo stanoviť či rolipramové vysoko afinitné viažuce miesto existuje v rovnakom proteíne ako cAMP katalytické miesto. Cieľom inej štúdie bolo stanoviť, či SAR pre inhibíciu PDE 4 je alebo nie je rovnaké ako SAR pre kompetíciu s vysoko afinitným rolipramovým väzobným miestom. Tretia štúdia sa podujala pokúsiť sa objasniť aký biologický význam, ak vôbec nejaký, môžu mať tieto zistenia, najmä vo vzťahu k možnému vývoju nových liekových terapií.
Po zhromaždení údajov z niekoľkých testov sa stalo očividným, že existujú najmenej dve väzobné formy na ľudskom monocytovom rekombinantnom PDE 4 (hPDE 4), na ktoré sa viažu inhibítory. Jedným vysvetlením týchto pozorovaní je, že hPDE 4 existuje v dvoch odlišných formách. Jedna viaže napodobeniny rolipramu a denbufylínu s vysokou afinitou, zatiaľ čo druhá viaže tieto zlúčeniny s nízkou afinitou. Tu sú tieto formy rozlíšené tak, že sa označujú ako vysoko afinitná rolipram viažuca forma (HPDE 4) a nízko afinitná rolipram viažuca forma (LPDE 4).
Dôležitosť tohto zistenia spočíva v objave, že zlúčeniny, ktoré účinne konkurujú vysoko afinitnej rolipram viažucej forme (HPDE 4), majú viac vedľajších účinkov alebo intenzívnejšie vedľajšie účinky ako zlúčeniny, ktoré účinnejšie konkurujú LPDE 4 (nízko afinitnej rolipram viažucej forme). Z ďalších údajov vyplýva, že zlúčeniny je možné nasmerovať do nízko afinitnej rolipram viažucej formy PDE 4, a že táto forma sa líši od formy, na ktorú sa rolipram viaže s vysokou afinitou. Zistilo sa, že existujú odlišné SARs pre inhibítory účinkujúce ako vysoko afinitné rolipram viažuce formy a inhibítory účinkujúce ako nízko afinitné rolipram viažuce formy. Okrem toho sa ukázalo, že tieto formy majú odlišné funkčné úlohy Takže sa ukázalo, že zlúčeniny, ktoré interagujú s nízko afinitnou rolipram viažucou formou majú protizápalový účinok, zatiaľ čo zlúčeniny, ktoré interagujú s vysoko afinitnou rolipram viažucou formou produkujú vedľajšie účinky alebo tieto vedľajšie účinky vykazujú intenzívnejšie.
Neexistuje jasné vysvetlenie týchto zistení. Avšak bolo navrhnuté, že PDE 4 môže existovať v dvoch odlišných terciárnych alebo kvartérnych stavoch. Verí sa, že obe formy sú katalytický aktívne. Rolipram sa viaže na jedno katalytické miesto
jednej formy s vysokou afinitou, tu definovaná ako afinita s K, nižšou ako 10 nM, a na inú formu s nízkou afinitou, tu definovaná ako afinita s K, vyššou ako 100 nM.
Užitočným dôsledkom týchto zistení je, že teraz je možné identifikovať zlúčeniny, ktoré preferenčne inhibujú cAMP katalytickú aktivitu tam, kde je enzým vo forme, ktorá viaže rolipram s nízkou afinitou, a tým redukujú vedľajšie účinky, ktoré sú zjavne spojené s inhibovaním formy, ktorá viaže rolipram s vysokou afinitou.
Chronické obštrukčné pľúcne ochorenie (COPD) je zastrešujúci termín, ktorý sa často používa na opísanie dvoch stavov ochorenia fixovaných dýchacích ciest, bronchitídy a emfyzému. Chronická bronchitída a emfyzém sú najbežnejšie spôsobené fajčením: približne 90 % pacientov s COPD je alebo bolo fajčiarmi Hoci u približne 50 % fajčiarov sa vyvinie chronická bronchitída, len u 15 % fajčiarov sa vyvinie obštrukcia brániaca priechodu vzduchu. Aj niektoré iné cicavce, najmä kone, trpia na COPD.
Obštrukcia priechodu vzduchu spojená s COPD je progresívna, môže byť sprevádzaná hyperaktivitou dýchacích ciest a môže byť čiastočne reverzibilné. Pri vývoji COPD hrá úlohu aj nešpecifická hyper-responzívnosť dýchacích ciest a môže predpovedať zvýšenú rýchlosť poklesu pľúcnej funkcie u fajčiarov.
COPD je významnou príčinou smrti a invalidity. V súčasnosti je štvrtou vedúcou príčinou smrti v Spojených štátoch amerických a Európe. Návod na liečbu odporúča skorú detekciu a implementáciu programov na ukončenie fajčenia, aby sa pomohlo znížiť morbiditu a mortalitu spôsobenú týmto ochorením. Avšak z mnohých dôvodov bola skorá detekcia a diagnostika obtiažne.
Vývoj COPD trvá roky a fajčiari často popierajú akékoľvek chorobné dôsledky fajčenia, pričom pripisujú skoré varovné signály zvýšenej dýchavičnosti starnutiu. Podobne, akútne prípady bronchitídy praktickí lekári často nerozoznávajú ako skoré príznaky COPD. Mnohí pacienti majú príznaky viac ako jednej choroby (napr. chronickej bronchitídy alebo astmatickej bronchitídy), čo spôsobuje, že presná diagnostika je problémom najmä v skorých štádiách ochorenia. Mnohí pacienti aj nevyhľadávajú lekársku pomoc, až kým nemajú skúsenosť s ťažšími symptómami spojenými s redukovaním pľúcnej funkcie, ako napríklad
-6·· · · dýchavičnosť, pretrvávajúci kašeľ a produkcia hlienov. Dôsledkom je, že veľká väčšina pacientov nie je diagnostikovaná alebo liečená, pokiaľ nie je v pokročilejšom štádiu ochorenia.
Tento vynález tak poskytuje vynikajúci terapeutický index vis-á-vis COPD verzus vedľajšie účinky.
Podstata vynálezu
Tento vynález sa týka použitia PDE 4 špecifického inhibítora na výrobu lieku na profylaxiu alebo liečbu COPD a spôsobu profýlaxie alebo liečby COPD, pričom sú minimalizované gastrointestinálne a psychotropné účinky, ktorý zahŕňa podávanie účinného množstva zlúčeniny, ktorá má IC50 pomer približne 0,1 alebo vyšší, pričom uvedeným IC50 pomerom je podiel IC50 pre PDE 4 katalytickú formu, ktorá viaže rolipram s vysokou afinitou a IC50 pre formu, ktorá viaže rolipram s nízkou afinitou, subjektu, ktorý to potrebuje.
Podrobný opis vynálezu
COPD je charakteristické chronickým zápalovým procesom v pľúcach, ktorý sa vyznačuje zvýšením aktivácie a/alebo počtu alveolárnych makrofágov, CD8+ Tbuniek a neutrofilov. Najdôležitejšia je v terapii COPD schopnosť meniť premiestňovanie a aktiváciu neutrofilov. Verí sa, že neutrofily hrajú centrálnu úlohu v patofyziológii COPD. Výsledkom aktivácie neutrofilov je vylučovanie množstva zápalových mediátorov a proteináz, pričom najdôležitejšou je neutrofil elastáza, ktorá sa podieľa na progresívnej fibróze, stenóze dýchacích ciest a deštrukcii pľúcneho parenchýmu, čo vedie k urýchleniu zhoršenia funkcie pľúc. Neutrofilová elastáza je aj silným mucus secretagogue a tak sa môže podieľať aj na nadmernom vylučovaní hlienu, ktoré je charakteristické pre COPD Zlúčeniny podľa tohto vynálezu významne vplývajú na neutrofilovú aktivitu, inhibujú neutrofilovú chemotaxiu a degranuláciu in vitro. M živočíšnych modeloch zlúčeniny podľa predloženého vynálezu redukujú vypúšťanie neutrofilov z krvného obehu, pľúcnu sekvestráciu a edematózne odpovede na množstvo zápalových napadnutí in vivo
-7• ·
Ďalšie aktivity, ktoré sa môžu podieľať na terapeutickom účinku PDE 4 inhibítorov pri COPD, zahŕňajú bronchodilatáciu a moduláciu pľúcnej nervovej aktivity. Hoci je stupeň reverzibility zníženého prúdenia v dýchacích cestách pri COPD nízky, malé zvýšenie môže mať akútny pozitívny účinok, ako aj môže viesť k postupnej redukcii zhoršovania stavu, čoho výsledkom môže byť podstatný vplyv na kvalitu života COPD pacientov. Schopnosť inhalovaných antagonistov muscarínu produkovať klinicky významné zlepšenia pľúcnej funkcie pri COPD, aspoň akútne, naznačuje, že veľká zložka reverzibilnej obštrukcie dýchacích ciest pri tomto ochorení je spojená s dysreguláciou pľúcnych nervov. Hoci ešte PDE 4 inhibítory neboli doteraz podrobne študované, môžu modulovať aj aktivitu epiteliálnych buniek dýchacích ciest, ktoré sú bohatým zdrojom prozápalových mediátorov, ktoré sa vylučujú pri zásahu z okolitého prostredia (napr. pri fajčení), a ktoré inhibujú hyperpláziu hladkých svalov ciev, štrukturálnu zmenu v koncovom štádiu COPD, ktorá je spojená so zlyhaním pravej strany srdca.
Pre účely tohto vynálezu sa cAMP katalytické miesto, ktoré viaže rolipram s nízkou afinitou, označuje nízko afinitné väzobné miesto (LPDE 4) a druhá forma tohto katalytického miesta, ktorá viaže rolipram s vysokou afinitou, sa označuje vysoko afinitné väzobné miesto (HPDE 4).
Uskutočnili sa iniciačné experimenty, aby sa ustanovil a zhodnotil [3Hjrolipram viažuci test. Podrobnosti tejto práce sú uvedené v príklade 1 nižšie.
Aby sa stanovilo či tak vysoko afinitné väzobná aktivita, ako aj nízko afinitná väzobná aktivita sú výsledkom rovnakého génového produktu, transformovali sa známymi metódami kvasinky a nasledovala expresia rekombinantného PDE 4 počas 6 hodín fermentácie. Z Western blot analýzy použitím protilátky nasmerovanej proti PDE 4 vyplynulo, že množstvo exprimovaného PDE 4 sa s časom zvyšovalo, pričom maximum sa dosiahlo po 3 hodinách rastu. Okrem toho vo vysoko rýchlostnom (100 000 x g) supernatante kvasinkových lyzátov bolo viac ako 90 % imunoreaktívneho produktu. Spolu s proteínovou expresiou sa monitorovali [3H]ŕ?-(-)-rolipram viažuca aktivita a PDE aktivita. PDE 4 aktivita sa exprimovala spolu s rolipram väzobnou aktivitou, z čoho vyplýva, že obe funkcie existujú v rovnakom génovom produkte. Podobne ako pri výsledkoch s Western blot
-8• · · · • · · · • · · · • · · ··· • · · analýzou, v kvasinkovej supernatantovej frakcii sa zistila prítomnosť viac ako 85 % rolipramom inhibovateľnej PDE 4 aktivity a [3H]-rolipram väzobnej aktivity.
Celkovo väčšina rekombinantnej PDE 4 exprimovanej v tomto systéme existuje ako LPDE 4 a len malá frakcia ako HPDE 4. Následkom toho inhibícia katalytickej aktivity rekombinantnej PDE 4 primárne odráža pôsobenie zlúčenín na LPDE 4. Inhibícia PDE 4 katalytickej aktivity tak môže byť použitá ako index účinku zlúčenín na LPDE 4. Účinok zlúčenín na HPDE 4 sa môže stanoviť skúmaním ich schopnosti konkurovať [3H]R-(-)-rolipramu. Aby sa vyvinuli vzťahy medzi štruktúrou a aktivitou (SARs) tak pre nízko afinitné rolipram viažuce miesto, ako aj pre vysoko afinitné rolipram viažuce miesto, stanovili sa účinnosti vybraných zlúčenín v dvoch testovacích systémoch. Výsledky z experimentov používajúcich štandardné zlúčeniny boli spracované formou tabuľky Ako sa očakávalo, niektoré zlúčeniny boli jasne účinnejšie pri kompetícii s [3H]-rolipramom v mieste, kde rolipram vykazoval vysoko afinitné viazanie, v porovnaní s druhým miestom, na ktoré sa rolipram viaže s nízkou afinitou. SAR korelácia medzi vysoko afinitným viazaním a nízko afinitným viazaním bola slabá a z toho sa vyvodilo, že SAR pre inhibíciu vysoko afimtného [3H]-rolipram viazania sa líši od SAR pre viazanie na nízko afinitné rolipram viažuce miesto. Tabuľka 1 poskytuje výsledky tejto SAR práce.
Tabuľka 1
Zlúčenina Nízko afinitné IC50 Vysoko afinitné IC50 Pomer nízke/vysoké
1-(5-tetrazol)-3-(3- cyklopentyloxy-4- metoxyfenyl)cyklopentán 1,1 0,002 0,0018
c/s-[3-(3-cyklopentyloxy-4metoxyfenyl)cyklopentán-1 karboxylát] 2,7 0,021 0,0078
/\/-[2-(3-cyklopentyloxy-4- metoxyfenyl)etyl]oxamid 0,89 0,012 0,013
R-rolipram 0,31 0,004 0,013
A/-[2-(3,4-bisdifluórmetoxy- fenyl)etyl]oxamid 1,6 0,4 0,25
Ro 20-1724 2,6 0,19 0,07
-9·· ·· • · · · • · · · • · · · ··· • · · · • · ···
S-rolipram 1.1 0,095 0,086
(f?)-(+)-1 -(4-brómbenzyl)-4-[(3- cyklopentyloxy)-4-metoxyfenyl]- 2-pyrolidón 4,0 0,45 0,11
1 -(4-aminobenzyl)-4-(3- cyklopentyloxy-4-metoxyfenyl)- 3-imidazolidinón 1,4 0,1 0,07
denbufylín 0,29 0,05 0,17
3-(cyklopentyloxy-4metoxyfenyl)-1 -(4-Λ/-[Λ/2-kyanoS-metyl-izotioureido]benzyl)-2pyrolidón 0,1 0,03 0,30
(f?)-(+)-1 -(4-brómbenzyl)-4-[(3- cyklopentyloxy)-4-metoxyfenyl]- 2-pyrolidón 0,06 0,02 0,33
IBMX 29,1 20,3 0,698
(S)-(-)-etyl [4-(3-cyklopentyloxy- 4-metoxyfenyl)pyrolidín-2- ylidénj-acetát 0,46 0,45 0,98
Papaverín 10 10 10
c/s-[4-kyano-4-(3cyklopentyloxy-4metoxyfenyl)cyklohexán-1 karboxylát] 0,095 0,110 1,1
c/s-[4-kyano-4-(3- cyklopropylme-toxy-4- difluórmetoxyfenyl)cyklo-hexán- 1-ol] 0,021 0,04 2,0
(R)-(+)-etyl [4-(3- cyklopentyloxy-4metoxyfenyl)pyrolidín-2-ylidén]acetát 0,14 0,3 2,143
2-karbometoxy-4-kyano-4-(3cyklopropylmetoxy-4-difluórmetoxyfenyl)cyklohexán-1 -ón 0,140 0,5 3,571
trequizín 1,6 5,0 3,125
dipyridamol 5,2 32,5 6,25
Denbufylín je 7-acetonyl-1,3-dibutylxantín vyrábaný firmou SmithKline Beecham. Papaverín je 1-[(3,4-dimetoxyfenyl)metyl]-6,7-dimetoxyizochinolín. T requizín je 2,3,6,7-tetrahydro-2-(mesitylimino)-9,10-dimetoxy-3-metyl-4A7-10primidol[6,1 -a]izochinolín-4-ón. Dipyrimadol je všeobecný názov pre 2,2’,2”,2”’[(4,8-dipiperidinopyrimido[5,4-cQpyrimidín-2,6-diyl)dinitrilo]tetraetanol.
Tieto výsledky ilustrujú, že niektoré zlúčeniny môžu selektívne inhibovať takzvanú nízko afinitnú formu v porovnaní s vysoko afinitnou formou, a naopak. Význam tohto zistenia je v tom, že je jednoduché minimalizovať vedľajšie účinky navrhnutím alebo výberom zlúčenín, ktoré selektívne (preferenčne) inhibujú jedno miesto, a tým vyvolať požadovanú odpoveď s vylúčením druhej, nežiadúcej, odpovede, alebo aspoň s minimalizovaním necieľovej odpovede do takej miery, ktorá neinterferuje so zamýšľanou terapiou v neprijateľnom stupni.
Na rozdiel od tejto práce sme nedefinovali základ pre rôznorodé SARs pre vysoko afinitné viazanie rolipramu a nízko afinitne viazanie rolipramu v PDE 4 izozýme. Zistilo sa však, že ak má zlúčenina IC50 pomer približne 0,1 alebo vyššie, počítané ako pomer IC50 vysoko afinitnej rolipram viažucej formy delené IC50 formy, ktorá viaže rolipram s nízkou afinitou, bude mať prijateľný terapeutický index. Takže je teraz možné úspešne liečiť rôzne imunitné a zápalové ochorenia bez ovplyvňovania iných fyziologických fenoménov alebo s ich ovplyvňovaním v prijateľnej miere. Najvýhodnejším uskutočnením je tu inhibovanie nízko afinitného rolipram viažuceho miesta, ako prostriedok na liečbu zápalových a alergických ochorení.
Zlúčeniny
Tento vynález zahŕňa tie zlúčeniny, ktoré majú IC50 pomer (vysoké afinitné/nízko afinitné viazanie) približne 0,1 alebo vyšší. To zahŕňa akúkoľvek a všetky zlúčeniny, ktoré sú PDE 4 inhibítormi označené tak použitím tu uvedenej testovacej sady, a ktoré v týchto alebo podobných testoch majú pomer v definovanom rozsahu; zaujímavé sú najmä tie zlúčeniny, ktoré nie sú v publikovanej doméne a/alebo neboli testované alebo známe ako PDE 4 inhibítory pred dátumom podania tejto prihlášky vynálezu.
Výhodnou technikou na výber užitočných zlúčenín je determinácia zlúčeniny, ktorá má IC50 pomer približne 0,1 alebo vyšší pomer IC50 hodnoty kompetície s viazaním 1nM [3H]/?-rolipramu na formu PDE 4, ktorá viaže rolipram s vysokou
afinitou, ku IC50 hodnote inhibície PDE 4 katalytickej aktivity formy, ktorá viaže rolipram s nízkou afinitou, použitím 1μΜ [3H]-cAMP ako substrátu.
Príklady zlúčenín, ktoré spĺňajú IC50 pomerový štandard, sú uvedené v tabuľke 1 vyššie, ako aj v US patente č. 5448686; US patente 5605923 a US patente 5552438. Každá z týchto prihlášok je tu kompletne zahrnutá jej citáciou.
Výhodnými zlúčeninami podľa tohto vynálezu sú tie, ktoré majú IC50 pomer vyšší ako 0,5, a najmä tie zlúčeniny, ktoré majú pomer vyšší ako 1,0. Zlúčeniny ako c/'s-[4-kyano-4-(3-cyklopentyloxy-4-metoxyfenyl)cyklohexán-1-karboxylát], 2karbometoxy-4-kyano-4-(3-cyklopropylmetoxy-4-difluórmetoxy-fenyl)cyklohexán-1ón a c/'s-[4-kyano-4-(3-cyklopropylmetoxy-4-difluór-metoxyfenyl)cyklohexán-1-ol] sú príklady štruktúr, ktoré sa preferenčne viažu na nízko afinitné väzobné miesto, a ktoré majú IC50 pomer 0,1 alebo vyšší.
Predložené zlúčeniny a farmaceutický prijateľné soli môžu byť podávané štandardným spôsobom na liečbu indikovaných ochorení napríklad parenterálne, pod jazyk, kožou, transdermálne, rektálne, prostredníctvom inhalácie alebo bukálnym podaním. Využitý môže byť aj prípravok s riadeným uvoľňovaním.
Predložené zlúčeniny a farmaceutický prijateľné soli, ktoré sú aktívne, keď sa podávajú orálne, môžu byť formulované ako sirupy, tablety, kapsuly, prípravky s riadeným vylučovaním alebo zdravotnícke pastilky. Sirupová formulácia bude vo všeobecnosti pozostávať so suspenzie alebo roztoku zlúčeniny alebo soli v kvapalnom nosiči, napríklad etanole, arašidovom oleji, olivovom oleji, glyceríne alebo vode, s ochucovacím alebo farbiacim činidlom Keď je prostriedok vo forme tablety, môže byť použitý akýkoľvek farmaceutický nosič, ktorý sa rutinne používa na prípravu tuhých formulácií. Príklady takýchto nosičov zahŕňajú stearan horečnatý, sádrovec, mastenec, želatín, akáciu, kyselinu stearovú, škrob, laktózu a sacharózu. Keď je prostriedok vo forme kapsuly, vhodná je akákoľvek rutinná enkapsulácia, napríklad použitím vyššie uvedených nosičov v tvrdom želatínovom kapsulovom obale. Keď je prostriedok vo forme mäkkej želatínovej obalovej kapsuly, do úvahy prichádza akýkoľvek farmaceutický nosič rutinne používaný na prípravu disperzií alebo suspenzií, napríklad vodné gumy, celulózy, silikáty alebo oleje, a je zložkou mäkkého želatínového kapsulového obalu.
-12Typické parenterálne prostriedky obsahujú roztok alebo suspenziu zlúčeniny alebo soli v sterilnom vodnom alebo nevodnom nosiči voliteľne obsahujúcom parenterálne prijateľný olej, napríklad polyetylénglykol, polyvinylpyrolidón, lecitín, arašidový olej alebo sezamový olej.
Typické prostriedky na inhaláciu sú vo forme roztoku, suspenzie alebo emulzie, ktoré môžu byť podávané ako suchý prášok alebo vo forme aerosólu použitím bežného hnacieho plynu, ako napríklad dichlórdifluórmetánu alebo trichlórfluórmetánu.
Typické dermálne a transdermálne formulácie obsahujú bežné vodné alebo nevodné vehikulum, ako napríklad krém, masť, pleťové mlieko alebo pastu alebo sú vo forme medikovanej náplasti, obväzu alebo membrány.
Výhodne je prostriedok v jednotkovej dávkovej forme, napríklad vo forme tablety, kapsuly alebo ako odmeriavaná aerosólová dávka, takže pacient si môže podávať jednu dávku.
Každá dávková jednotka na orálne podanie obsahuje vhodne od 0,3 mg do 60 mg/kg a výhodne od 1 mg do 30 mg/kg zlúčeniny alebo jej farmaceutický prijateľnej soli. Výhodné dávky na liečbu COPD zahŕňajú 10 mg a 15 mg/kg. Každá dávková jednotka na parenterálne podanie obsahuje vhodne od 0,1 mg do 100 mg/kg zlúčeniny alebo jej farmaceutický prijateľnej soli. Každá dávková jednotka na intranazálne podanie obsahuje vhodne 1 až 400 mg a výhodne 10 až 200 mg na osobu. Topické formulácie obsahujú vhodne 0,01 až 5,0 % predloženej zlúčeniny.
Účinná zložka môže byť podávaná jedenkrát až šesťkrát denne, tak aby to stačilo na vykázanie požadovanej aktivity. Výhodne sa aktívna zložka podáva približne jedenkrát alebo dvakrát denne, výhodnejšie dvakrát denne.
Keď sa podávajú zlúčeniny podľa predloženého vynálezu v súlade s predloženým vynálezom, neočakávajú sa žiadne neprijateľné toxikologické účinky.
Nasledujúce príklady sú poskytnuté na ilustráciu ako vytvoriť a používať vynález. V žiadnom prípade nie sú žiadnym spôsobom am v žiadnej miere zamýšľané ako obmedzenie rozsahu vynálezu. To čo si pôvodcovia nárokujú odvodzujte prosím z nižšie uvedených nárokov.
-13Príkladv uskutočnenia vynálezu
Nasledujúcich deväť testov uskutočňovaných na piatich druhoch sa používalo na získanie údajov podporujúcich selekciu IC50 pomeru s hodnotou približne 0,1 alebo vyššou. Testami boli: stimulácia produkcie kyseliny izolovanou králičou parietálnou žľazou; inhibícia FMLP-indukovanej degranulácie (vylučovania myleoperoxidázy) v ľudských neutrofiloch; inhibícia FMLP-indukovaného vytvárania O2 v eozinofiloch morského prasaťa; inhibícia LPS-indukovanej produkcie TNFa v ľudských monocytoch; vyvolanie zvracania u psov; inhibícia antigénom indukovaného stiahnutia priedušiek u morských prasiat; reverzia rezerpínom indukovanej hypotermie u myší; a inhibícia LPS-indukovanej produkcie TNFa adoptívne prenesenými ľudskými monocytmi v myšiach. Tieto testy a údaje sú prezentované nižšie.
Štatistická analýza
Na skúmanie hypotézy, že inhibícia nízko afinitného miesta PDE 4 je spojená s protizápalovými účinkami tejto triedy zlúčenín, zatiaľ čo inhibícia vysoko afinitného miesta je spojená s vytváraním určitých vedľajších účinkov, sa stanovovala schopnosť rôznych PDE 4 inhibítorov blokovať zápalovú bunkovú funkcie tak in vitro, ako aj in vivo, a schopnosť týchto zlúčenín vytvárať vedľajšie účinky tak in vitro, ako aj v in vivo modeloch. Na porovnanie schopnosti PDE 4 inhibítorov vyvolať daný terapeutický účinok alebo vedľajší účinok s ich schopnosťou inhibovať nízko afinitné väzobné miesto verzus ich schopnosťou inhibovať vysoko afinitné miesto PDE 4, sa porovnával potenciál týchto zlúčenín v in vitro alebo v in vivo testoch s ich účinkom proti katalytickej aktivite izolovaného enzýmu alebo vysoko afinitnému miestu prostredníctvom lineárnej korelácie (r2) alebo rádovej korelácie (Spearman’s Rho). Lineárnou koreláciou sa zisťovalo či potenciál zlúčeniny inhibovať buď nízko afinitné miesto, alebo vysoko afinitné miesto sa môže použiť na predpovedanie schopnosti vyvolať daný protizápalový alebo vedľajší účinok. Rádovou koreláciou sa testovalo či rádový účinok pri produkovaní daného ·· ··
- 14protizápalového alebo vedľajšieho účinku je podobný ako rádový účinok pri inhibícii nízko afinitného alebo vysoko afinitného miesta. Tak r2, ako aj Spearman’s Rho sa počítali použitím STAT View II počítačového programu pre Macintosh.
PDE 4 verzus rolipram vysoko afinitné viazanie
Príklad 1
Fosfodiesterázový a rolipramový väzobný test
Príklad 1A
Determinovalo sa, že izolovaný ľudský monocytový PDE 4 a hrPDE (ľudský rekombinantný PDE 4) existujú primárne v nízko afinitnej forme. Takže aktivita testovaných zlúčenín proti nízko afinitnej forme PDE 4 sa mohla stanovovať použitím štandardných testov pre PDE 4 katalytickú aktivitu s využitím 1μΜ [3H]cAMP ako substrátu (Torphy a ďalší, J. of Biol. Chem., zv. 267, č 3, str. 17981804, 1992).
Vysoko rýchlostné supernatanty potkanieho mozgu sa používali ako zdroj proteínu. Pripravili sa enantioméry [3H]-rolipramu so špecifickou aktivitou 25,6 Ci/mmol. Štandardné testovacie podmienky publikovaného postupu boli modifikované, aby boli identické s PDE testovacími podmienkami, s výnimkou cAMP: 50mM TrisHCI (pH 7,5), 5 mM MgCI2 a 1nM [3H]-rolipramu (Torphy a ďalší, J. of Biol. Chem., zv. 267, č. 3, str. 1798-1804, 1992). Test sa uskutočňoval hodinu pri 30 °C. Ukončila sa reakcia a naviazaný ligand sa oddelil od voľného ligandu použitím Brandel zberača buniek. Kompetícia pre vysoko afinitné väzobné miesto sa stanovovala v podmienkach, ktoré boli identické s podmienkami používanými na meranie nízko afinitnej PDE aktivity, s tým rozdielom, že [3H]-cAMP a [3H]5’-AMP neboli prítomné. Údaje uvedené v tabuľke 1, na stranách 8 a 9, boli generované použitím protokolu opísaného v príklade 1A.
Príklad 1B
- 15• · · • ···
Meranie fosfodiesterázovej aktivity
PDE aktivita sa stanovovala použitím [3H]-cAMP scintilačného proximálneho testu (SPA) alebo [3H]-cGMP SPA enzymatického testu podľa návodu dodávateľa (Amersham Life Sciences). Reakcie sa uskutočňovali v 96-jamkových platniach pri laboratórnej teplote v 0,1 ml reakčného tlmivého roztoku obsahujúceho (konečné koncentrácie)· 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8,3 mM MgCI2, 1,7 mM EDTA, [3H]cAMP alebo [3H]cGMP (približne 2000 dpm/pmol), enzým a rôzne koncentrácie inhibítorov. Test sa nechal prebiehať hodinu a ukončil sa pridaním 50 μΙ SPA ytrium silikátových guličiek v prítomnosti síranu zinočnatého. Platne sa miešali a nechali sa stáť pri laboratórnej teplote 20 minút. Scintilačnou spektrometriou sa stanovovalo vytváranie rádioaktívne značeného produktu. Aktivity PDE 3 a PDE 8 sa stanovovali použitím 0,05 μΜ [3H]cAMP, zatiaľ čo aktivita PDE 4 sa stanovovala použitím 1 μΜ [3H]cAMP ako substrátu. Aktivity PDE 1B, PDE 1C, PDE 2 a PDE 5 sa stanovovali použitím 1 μΜ [3H]cGMP ako substrátu.
[3H]ŕ?-rolipram väzbový test [3H]ft-rolipram väzbový test sa uskutočňoval modifikáciou spôsobu podľa Schneidera a ďalších, pozri Nicholson a ďalší, Trends Pharmacol. Sci., zv. 12, str. 19 až 27 (1991) a McHale a ďalší, Mol. Pharmacol, zv. 39, 109-113 (1991). Rrolipram sa viaže na katalytické miesto PDE4, pozri Torphy a ďalší, Mol. Pharmacol, zv. 39, str. 376-384 (1991). Z toho vyplýva, že kompetícia [3H]/?-rolipram viazania poskytuje nezávislé potvrdenie PDE 4 inhibítorových účinkov neznačených kompetítorov. Test sa uskutočňoval pri 30 °C jednu hodinu v 0,5 μΙ tlmivého roztoku obsahujúceho (konečné koncentrácie): 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCI2, 0,05 % hovädzí sérový albumín, 2 nM [3H]/?-rolipramu (5,7 x 104 dpm/pmol) a rôzne koncentrácie rádioaktívne neznačených inhibítorov. Reakcia sa ukončila pridaním
2,5 ml ľadom chladeného reakčného tlmivého roztoku (bez [3H]R-rolipramu) a rýchlou vákuovou filtráciou (Brandel bunkový zberač) cez Whatman GF/B filtre, ktoré boli nasiaknuté 0,3% polyetylénimínom. Filtre sa premyli ďalšími 7,5 ml
-16studeného tlmivého roztoku, vysušili sa a odčítali sa prostredníctvom kvapalnej scintilačnej spektrometrie.
Príklad 2
Akumulácia aminopyrínu
Určité metylxantíny a iné neselektívne PDE inhibítory zvyšujú vylučovanie kyseliny v rôznych druhoch. Určité selektívne PDE 4 inhibítory, napr. rolipram a Ro 20-1724, zosilňujú vylučovanie kyseliny v potkanoch, najmä ak sa podávajú v kombinácii s aktivátorom adenylát cyklázy, ako napríklad histamínom. Toto zvyšovanie vylučovania kyseliny je sprevádzané zvýšením akumulácie histamín indukovaného cAMP. Táto publikovaná informácia bola testovaná, aby sa stanovilo, či fenomén existuje. Schopnosť zlúčenín indukovať vylučovanie kyseliny sa korelovala s ich účinkom voči nízko afinitnému miestu alebo vysoko afinitnému miestu. Testom používaným v tejto práci bola akumulácie slabej bázy, rádioaktívne značeného aminopyrínu, o ktorom bolo publikované, že slúži ako biochemický marker zvýšenia vylučovania kyseliny. Test nasleduje.
Príprava žalúdočnej žľazy
Králiky oboch pohlaví sa humánne usmrtili cervikálnou dislokáciou a vybral sa žalúdok. Od korpusu sa oddelila sliznica; kraniálne a antrálne časti žalúdka sa odstránili. Žalúdočné žľazy sa izolovali modifikáciou spôsobov opísaných v publikáciách Berglindh a Obrink (1976) a Sack a Spenney (1982). Sliznica sa potom nakrájala a poštiepila kolagenázou, aby sa izolovali žalúdočné žľazy. Poštiepené žľazy sa prefiltrovali, premyli a resuspendovali v pomere 1:15 (obj.:obj.) v inkubačnom médiu nasledujúceho zloženia' NaCI, 132,4 mM, KCI, 5,4 mM, Na2HPO4, 5,0 mM, NaH2PO4, 1,0 mM; MgSO4, 1,2 mM; CaCI2, 1,0 mM; NaHCO3, 12,0 mM; králičí sérový albumín, 2 mg/ml; dextróza, 2 mg/ml; a pH 7,4.
Akumulácia aminopyrínu
Na stanovenie vylučovania kyseliny sa žalúdočné žľazy v kombinácii s [14Cjaminopyrínom, rôznymi koncentráciami selektívnych PDE 4 inhibítorov a prahovou
- 17koncentráciou histamínu (0,3 až 1,0 μΜ) inkubovali pri 37 °C v horizontálnej miešačke (110 cyklov/min.) 20 minút podľa postupov v súlade s publikáciou Sack a Spinney (1982). Vzorky sa potom centrifúgovali a stanovovala sa rádioaktivita v alikvotách supernatantovej frakcie a peletu. Aminopyrínové pomery sa vypočítali ako je opísané v Sack a Spenney (1982). Údaje boli vyjadrené ako percento odpovede vyprodukovanej maximálnou koncentráciou histamínu (100 μΜ). EC50 hodnoty sa stanovili lineárnou interpoláciou použitím maximálnej odpovede získanej pre každú zlúčeninu.
Príklad 3
Zhodnotenie emetického potenciálu selektívnych PDE inhibítorov u psov
Mongrel psi (n=5 pre každú štúdiu) oboch pohlaví sa získali zo zvieracej kolónie. Po hladovaní cez noc sa psy nakŕmili 1/2 plechovky psej potravy (Big Bet) najmenej 30 minút pred štúdiou. Na podávanie liečiv sa do cefalických žíl na oboch predných nohách umiestnila kanyla. Kanyla sa prepláchla 1 ml izotonického fyziologického roztoku (0,9 %) pred tým, ako sa podávala experimentálna zlúčenina. Zlúčeniny sa rozpustili buď v zmesi polyetylénglykolu a fyziologického roztoku, alebo v 100% polyetylénglykole a podávali sa v objeme 1,0 až 2,0 ml/10 kg Aby sa zaistilo, že celá dávka vstúpi do obehu, prepláchla sa kanyla ďalším 0,5 až 1,0 ml fyziologického roztoku. Zvieratá sa vrátili do klietky na hodinové pozorovanie. Pri každom psovi sa pozorovali známky napínania na zvracanie a zvracania a zaznamenával sa čas výskytu tohto správania po podaní zlúčeniny. Na konci pozorovania sa zvieratá vrátili do domácej klietky. Každá štúdia bola oddelená siedmymi dňami. Každá zlúčenina sa podávala každému psovi vo vzostupných dávkach počas za sebou nasledujúcich dní štúdie, až kým sa nepozoroval emetický účinok. V tom časovom bode sa u daného psa ukončila štúdia a vyššie dávky sa zhodnocovali len u tých psov, u ktorých ešte nebola odpoveď.
Údaje sa vyjadrili ako kumulatívne percento psov odpovedajúcich na každú dávku ako je opísané v literatúre pre kvantitatívne dávkové krivky. ED50 hodnota sa vypočítala použitím probit analýzy.
·· ·· • · · · * · · • · · · · ·
-18·· • e ····
Príklad 4
Eozinofilový test s morským prasaťom
Izolácia a purifikácia eozinofilov
Samčekom (Hartley, Hazelton Labs) morských prasiat sa 4 až 6 týždňov pred použitím týždenne injekčné podával 1 ml koňského séra. Zvieratá sa anestetikovali so zmesou ketamínu a xylazínu (88 mg; 12 mg/ml; 0,4 ml/kg) najmenej 24 hodín po injekcii koňského séra. Po indukcii anestézie sa peritoneálna dutina naplnila 50 ml horúceho sterilného fyziologického roztoku (0,9 %). Tekutina, ktorou sa vymývala dutina, sa zhromaždila použitím 14G katétra do 50ml plastických kužeľovitých centrifugačných skúmaviek. Morské prasatá sa nechali zotaviť z anestézie a mohli byť znova použité po dvojtýždňovej oddychovej perióde.
Bunky sa izolovali z tekutiny, ktorou sa vyplachovala dutina, centrifugáciou (400 ot./min., 10 min.) a resuspendovali sa v 35 ml fosfátom tlmeného fyziologického roztoku (PBS) a podliali sa 10 ml izotonického Percollu (1,075 g/ml). Táto suspenzia sa centrifúgovali 30 minút pri 300 ot./min. Pelet obsahujúci najmä eozinofily a erytrocyty sa premyl v PBS a erytrocyty sa lyžovali. Tieto bunky sa resuspendovali v RPMI 1640 médiu s 20% FBS a inkubovali sa pri 37 °C vo vlhkostnom 5% CO2 inkubátore. Na ďalší deň sa bunky premyli a resuspendovali v PBS, aby sa stanovila životaschopnosť buniek (farbenie trypánovou modrou) a čistota buniek.
Produkcia peroxidázového aniónu (O2)
Purifikované eozinofily (životaschopnosť >95 %) sa resuspendovali v PBS s 20 mM HEPES tlmivého roztoku (pH 7,4) a 0,1% želatínou v koncentrácii 1 až 2 x 106 buniek/ml. Eozinofily (1x105) sa pridali do 96-jamkovej platne a inkubovali sa približne 1 hodinu pri 37 °C. 10 minút pred štartom reakcie sa pridali PDE 4 inhibítory. Reakcia sa iniciovala pridaním cytochrómu C (160 μΜ) a formylMet-LeuPhe (fMLP) (30 nM) bez alebo v prítomnosti 60 jednotiek peroxid dismutázy (SOD).
-19V rôznych časových bodoch sa monitorovala redukcia cytochrómu C na Dynatech MR 7000 platňovom snímači pri 550 nm s referenciou pri 630 nm. Rýchlosť O2' produkcie sa stanovovala lineárnou regresnou analýzou použitím sieťovej absorbancie jamiek bez alebo v prítomnosti SOD v niekoľkých časových bodoch Výsledky boli vyjadrené ako percento kontrolovanej produkcie O2' korigované vo vzťahu ku základnému vylučovaniu. Kedže maximálna pozorovaná inhibícia bola 60 %, vypočítalo sa loglC30 použitím lineárnej interpolácie koncentrácie a porovnávaním 30 %.
Príklad 5
Stiahnutie priedušiek u morských prasiat
Samčekovia Hartley morských prasiat (200 až 250 g/4 týždne, Hazelton Research, Denver, PA) sa senzitizovali I.M. injekciami 0,35 ml 5% (w/v) zmesi ovoalbumínu a fyziologického roztoku do každého stehna (0,7 ml celkovo) v 1. a 4. dni. Na použitie boli morské prasatá vhodné p 25. dni.
Experimentálna procedúra
Samčekovia Hartley morských prasiat (600 až 800 g, Hazelton), aktívne senzitizovaní voči ovalbumínu, sa anestetikovali pentobarbitalom sodným (40 mg/kg I.P.) približne 10 až 15 minút pred chirurgickým zákrokom. Do jugulárnej cievy, karotídy a trachei sa zaviedli kanyly (Deseret Intracath® Vialon® polymérne živicové rádiopak katetre (Deseret Medical, Inc., Sandy, UT), v poradí 22 GA, 19 GA a PE rúrka 260) na podávanie liečiva, monitorovanie tlaku krvi a na prevzdušňovanie. Na minimalizáciu cholinergickej interferencie sa uskutočnila bilaterálna vagotómia. Zvieratá sa paralyzovali (pankuronium bromidom, 0,1 mg/kg i.v.) a ventilovali sa (45 vdychov/min.) prostredníctvom Harvard hlodavčieho respirátora (model 683, Harvard Apparatus, South Natick, MA). Zmeny tlaku v dýchacích cestách sa merali prostredníctvom bočného ramena tracheálnej kanyly s Elcomatickým transduktorom (Buxco Electronics, Sharon, CT). Ventilačný nárazový objem sa nastavil tak, aby produkoval tlak v bočnom ramene 8 cm H2O (približne 5cc laboratórneho vzduchu) Tlak krvi sa meral so Statham P23XL Fyzikálnym Tlakovým Transduktorom (Viggo-20Spectramed, Oxnard, Quincy, MA). Zvieratá sa udržiavali počas experimentu teplé na zahrievanom stole, aby sa udržala telesná teplota.
Testovacie zlúčeniny alebo vehikulum sa podávali i.v. spôsobom 10 minút pred výzvou antigénom. V čase 0 sa podávalo i.v., spôsobom 0,1 mg/kg ovalbumínu. Pri vrchole antigénovej odpovede sa i.v. podala ďalšia dávka antigénu a 0,2 mg/kg ovalbumínu. Potom ako sa dosiahol vrchol antigénovej odpovede na kumulatívnych 0,3 mg/kg ovalbumínu podával sa i.v. nasýtený roztok KCI, 1cc/kg, ktorý produkoval maximálne stiahnutie priedušiek.
Príklad 6
Inhibícia LPS-indukovaného TNFa v ľudských monocytoch
In vitro štúdie
Na testovanie toho, či má inhibícia TNFa vzťah k inhibícii LPDE 4 alebo HPDE 4, sa skrínovali série PDE 4 inhibítorov s rôznymi potenciálmi pre LPDE4 a HPDE 4 z hľadiska ich schopnosti inhibovať produkciu TNFa v ľudských monocytoch stimulovaných s lipopolysacharidmi (LPS) in vitro. Použitie primárnych ľudských buniek na tento skríning sa považovalo za extrémne dôležité, keďže sa ukázalo, že odlišné druhy sa dramaticky líšia v relatívnom podiele LPDE 4 a HPDE 4 na hydrolýze cAMP v zápalových bunkách.
Metódy
TNFa inhibícia sa stanovovala v ľudských periférnych krvných monocytoch, ktoré boli purifikované (Collata) z čerstvo získaných zrazených krvných buniek alebo plazma-foretických zvyškov krvi od normálnych ľudských darcov. Monocyty sa nanášali do 24-jamkových multi-platní s hustotou 1x106 buniek/ml média/jamku. Bunky sa nechali hodinu adherovať a potom sa odsal supernatant a pridal sa 1 ml čerstvého média (RPMI-1640 obsahujúce 1% fetálne teľacie sérum a penicilín/streptomycín s koncentráciou 10 U/ml). Bunky sa inkubovali 45 minút bez alebo v prítomnosti testovacích zlúčenín s koncentráciami v rozsahu od 1 nM do 1
-21 mM pred pridaním LPS (E. coli 055:B5, Sigma Chemicals), aby sa získala konečná koncentrácia 100 ng/ml. Testované zlúčeniny sa rozpustili a nariedili v 50:50 koncentrácii zmesi dimetylsulfoxidu a etanolu tak, aby konečná koncentrácia rozpúšťadiel v monocytovom kultivačnom médiu bola 0,5 % dimetylsulfoxidu a 0,5 % etanolu. Z monocytov sa odobrali kultivačné supernatanty po 14 až 16 hodinách inkubovania pri 37 °C/5% CO2 a centrifugovali sa pri 100 ot./min., aby sa odstránili zvyšky buniek. Buď sa okamžite uskutočňovali cytokínové testy, alebo sa kultivačné supernatanty uskladňovali pri -70 °C až do ich testovania.
Hladiny TNFa sa merali použitím ELISA (Winston) s využitím hlodavčej monoklonálnej anti-ľudskej TNFa protilátky (pozri nižšie) ako zachytávacej protilátky a polyklonálnej králičej anti-ľudskej TNFa protilátky ako sekundárnej protilátky Na detekciu sa pridávala kozia anti-králičia protilátka konjugovaná s peroxidázou (Boehringer Mannheim, č. kat. 605222) a nasledoval substrát pre peroxidázu (1 mg/ml orfofenyléndiamínu s 0,1 % peroxidom močoviny). TNFa hladiny vo vzorkách sa vypočítali zo štandardnej krivky generovanej s rekombinantným ľudským TNFa produkovaným v E. coli. Monoklonálne protilátky proti ľudskému TNFa sa pripravili zo slezín BALB/c myší imunizovaných rekombinantným ľudským TNFa modifikáciou metódy podľa Kohlera a Millsteina (Náture, zv. 256, str. 495-497, 1975). Polyklonálne králičie proti-ľudské TNFa protilátky sa pripravili opakovanou imunizáciou New Zealand bielych králikov s rekombinantným ľudským TNFa emulzifikovaným v kompletnom Freundovom adjuvans.
In vivo supresia produkcie ľudského TNFa v adaptívnom modeli zápalu pobrušnice Metódy
Dobrovoľníkom, ktorí nebrali žiaden druh liečiva sa odobralo pol jednotky heparinizovanej cievnej celkovej krvi. Polymorfonukleárne leukocyty sa separovali nanesením krvi na Histopaque-1077 s centrifugáciou pri 800 ot./min. 30 minút pri 25 °C. Izoloval sa lymfocytový/monocytový podiel a dvakrát sa premyl s DPBS (Dulbeccov fosfátom tlmený fyziologický roztok) bez Ca2+ a Mg2+ pri 1000 ot./min počas 10 minút pri 25 °C. Pelet sa resuspendoval v 5 ml DPBS bez Ca2+ a Mg2+,
-22navrstvil sa na 5 ml Percoll roztoku pripraveného v RPMI 1640 médiu, ktoré bolo zbavené séra pri 25 °C, a centrifugoval sa pri 550 ot./min. 30 minút pri 25 °C. Odobrala sa plávajúca vrstva monocytov a dvakrát sa premyla v DPBS bez Ca2+ a Mg2+ pri 1000 ot./min. počas 10 minút pri 25 °C. Finálny premytý monocytový izolát sa suspendoval v koncentrácii 6 až 10 x 106 buniek/ml v DPBS bez Ca2+ a Mg2+ pri 25 °C. Monocyty sa rovnakým postupom izolovali aj zo Source Leukocytes balíčkov. Monocytové prípravky obsahovali monocyty v rozsahu 65 až 90 % a životaschopnosť buniek bola > 97 % (určovanie pomocou trypánovej modrej).
BALB/c myši (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), v skupinách po 4 alebo 5, sa chovali v príslušenstve so stálymi bariérami. Myšiam s hmotnosťou 18 až 25 g a rovnakého veku sa injekčné podalo 0,5 ml monocytov s koncentráciou 6 až 10 x 10® monocytov/ml do peritonea miernym tlakom na striekačku s 23 ga ihlou tak, aby boli monocyty vystavené minimálnym trhacím silám a tlaku. Do dvoch minút po obdržaní monocytov sa myši ošetrili vehikulom alebo zlúčeninou orálnym dávkovaním v priebehu 15 minút. Zvieratám sa potom intraperitoneálne (i.p.) injekčné podalo 0,2 ml 125 mg/ml endotoxínu (E coli, typ W. Difco) rozpusteného v DPBS bez Ca2+ a Mg2+. O dve hodiny neskôr sa zvieratá usmrtili zadusením s CO2 a i.p. sa injekčné podalo 1,5 ml DPBS bez Ca2+ a Mg2+ (4 °C) Peritoneum sa jemne masírovalo a odobral sa vymytý obsah a umiestnil sa do polypropylénových skúmaviek v ľadovom kúpeli. Vzorky sa vyjasnili centrifugáciou (12500 ot./min, 5 min. pri 4 °C). Supernatanty sa dekantovali do nových skúmaviek (mohli byť uskladnené pri -20 °C) a testovali sa na prítomnosť ľudského a myšacieho TNFa prostredníctvom ELISAs. ED50 hodnoty sa vypočítali štandardnými postupmi.
Príklad 7
Ľudské neutrofilové metódy
Izolácia a purifikácia
Neutrofily (PMNs) sa izolovali z heparinizovanej krvi gradientovou centrifugáciou použitím Ficollu (Histopaque 1077), po ktorej nasledovala dextránová • · • · · ·
-23• · · • ··· sedimentácia, aby sa odstránili erytrocyty. Akékoľvek zvyšné erytrocyty sa zlyzovali s vodou v priebehu 30 sekúnd a izotonicita sa obnovila použitím 10 x DB-PBS (w/o Ca2+ alebo Mg2+). PMNs sa izolovali centrifugáciou a znova sa raz premyli s 1x DBPBS pred stanovovaním počtu buniek a životaschopnosti (farbenie trypánovou modrou). Počet buniek sa nastavil na 0,75 až 1,5 x 106 buniek/ml v závislosti na jednotlivom darcovi.
Degranulácia (vylučovanie myeloperoxidázy)
Alikvota (0,1 ml) vyššie uvedenej bunkovej suspenzie sa inkubovala v Earles vyváženom slanom roztoku obsahujúcom 20 mM HEPES tlmivého roztoku (pH = 7,4) a 0,1 % želatíny v prítomnosti 5 pg/ml cytochalazínu B, 5 minút pri 37 °C v pretrepávanom vodnom kúpeli. Bunky sa predošetrovali ďalších 5 minút s rôznymi koncentráciami selektívnych PDE 4 inhibítorov a PGE2 (3 až 10 nM) pred pridaním fMLP (30 nM). Pridal sa fMLP a inkubovanie pokračovalo ďalších 30 minút. Reakcia sa ukončila umiestnením vzoriek na ľad a nasledovala centrifugácia Supernatantová frakcia sa odobrala a uskladňovala zmrazená (-30 °C), až kým sa netestovala myeloperoxidázová aktivita.
Stanovenie myeloperoxidázovej aktivity
Myeloperoxidázová aktivita sa stanovovala použitím o-dianizidínu ako substrátu a chrenovej peroxidázy ako štandardu. Alikvota (50 μΙ) supernatantu sa inkubovala so 100 μΙ substrátu (o-diamzidín, 0,53 mM; H2O2, 0,147 mM; konečná koncentrácia) v 50 mM fosfátového sodného tlmivého roztoku (pH 6,0). Reakcia sa ukončila pridaním 50 μΙ 4M H2SO4. Vytváranie produktu sa stanovovalo meraním absorbancie pri 410 nm a stanovovaním aktivity prostredníctvom porovnávania so štandardnou krivkou použitím chrenovej peroxidázy. Údaje boli vyjadrené ako percento kontroly (množstvo myeloperoxidázy vylučované len v prítomnosti PGE2). Keďže maximálnou pozorovanou inhibíciou bolo pri väčšine zlúčenín 30 %, vypočítali sa log(IC15) hodnoty použitím lineárnej interpolácie porovnávania 15 % koncentrácií.
• · • · * ·
-24Príklad 8
Reverzia rezerpínom indukovanej hypotermie u myší
Samčekovia CF-1 alebo BALB/c myší sa jednotlivo izolovali do drôtených klietok. Pred predošetrením s rezerpínom (10 mg/kg, i.p.) sa zaznamenala rektálna teplota každej myši. Štyri hodiny po podaní rezerpínu sa zaznamenali rektálne teploty a jednotlivým zvieratám sa podali buď rôzne dávky (orálne) testovaných zlúčenín, alebo vehikulum, alebo rolipram (10 mg/kg). Rektálne teploty sa potom zaznamenávali každých 30 minút 2 hodiny. Údaje boli vyjadrené ako zmeny teploty oproti teplote pozorovanej štyri hodiny po podaní rezerpínu (teplota poklesla približne o 10 až 15 °C pod základné úrovne). Použitím teplotných zmien zaznamenaných 90 alebo120 minút po ošetrení sa skonštruovali na dávke závislé odpoveďové krivky ED50 hodnoty sa stanovili probit analýzou alebo lineárnou regresiou priemerov 6 až 9 zvierat. Na porovnanie schopnosti zlúčenín zvrátiť rezerpínom-indukovanú hypotermiu s ich schopnosťou inhibovať nízko afinitné viazanie alebo vysoko afinitné viazanie sa ED50 a IC50 hodnoty vyjadrili ako - log (hodnota).
Príklad 9
Vzťah medzi biologickou funkciou a inhibíciou PDE 4
Na stanovenie toho, či sú určité biologické účinky PDE 4 inhibície spojené s inhibíciou buď LPDE 4, alebo HPDE 4, porovnávala sa schopnosť zlúčenín produkovať účinok a schopnosť zlúčenín inhibovať LPDE 4 alebo HPDE 4, použitím lineárnej alebo rádovej korelácie. Tieto korelácie môžu byť ovplyvnené niekoľkými faktormi: 1) stabilitou zlúčenín; 2) schopnosťou zlúčenín vstupovať do buniek; 3) pri in vivo štúdiách biologickou dostupnosťou zlúčenín; 4) korelácia hodnôt, najmä pri lineárnej korelácii, je citlivá na rozdiely v účinnostiach, čím je väčší rozsah hodnôt účinností, tým je jednoduchšie merať významnú lineárnu koreláciu. Tieto nástrahy boli brané do úvahy, keď sa analyzovala a sumarizovala korelácia medzi inhibíciou LPDE 4 alebo HPDE 4 a biologickou funkciou v rôznych testovacích systémoch.
·· ··
-25Použitím izolovaných zápalových buniek, bola supresia produkcie TNFa monocytmi a inhibícia produkcie peroxidu eozinofilmi morského prasaťa lepšie korelovaná s inhibíciou LPDE 4, a nie HPDE 4. Okrem toho, prevencia antigénom indukovaného stiahnutia priedušiek in vivo bola lepšie korelovaná s inhibíciou LPDE 4, ako s inhibíciou HPDE 4. V tomto in vivo modeli sa ukázalo, že PDE 4 inhibítory fungujú prostredníctvom bránenia degranulácii mastocytov (Underwood a ďalší, v tlači). Avšak inhibícia funkcie zápalových buniek nebola vždy spojená s inhibíciou LPDE 4, pretože sa zistilo, že inhibícia neutrofilovej degranulácie je vždy lepšie korelovaná s inhibíciou HPDE 4, ako inhibíciou LPDE 4. Takže sa ukázalo, že niektoré, ale nie všetky supresie aktivity zápalových buniek sú spojené s inhibíciou LPDE 4. Na rozdiel od toho, zosilnenie vylučovania kyseliny, produkcia emetického účinku a reverzia rezerpínom-indukovanej hypotermie (miera psychotropického potenciálu PDE 4 inhibítorov) boli lepšie korelované s inhibíciou HPDE 4, a nie inhibíciou LPDE 4. Takže väčšina potenciálnych vedľajších účinkov tejto triedy zlúčenín bola spojená s inhibíciou HPDE 4.
Takže tieto zistenia naznačujú, že zlúčeniny, ktoré preferenčne inhibujú LPDE 4, budú produkovať užitočné protizápalové účinky so zníženou schopnosťou vyvolať nežiadúce vedľajšie účinky. Takže vybrané zlúčeniny s IC50 pomerom približne 0,1 alebo vyšším, pričom uvedený IC50 pomer je podiel IC50 pre PDE 4 katalytickú formu, ktorá viaže rolipram s vysokou afinitou a IC50 pre PDE 4 katalytickú formu, ktorá viaže rolipram s nízkou afinitou (HPDE 4/LPDE 4), by mali mať zvýšený svoj terapeutický index, tzn. vítaný účinok je maximalizovaný a škodlivý účinok je minimalizovaný.
Aby sa stanovilo, či by tento selekčný návod skutočne identifikoval zlúčeniny so zlepšeným terapeutickým indexom, hodnotili sa tri modely porovnávajúce terapeutický účinok a vedľajší účinok. Tieto modely zahŕňali in vitro porovnanie schopnosti zlúčenín suprimovať produkciu TNFa izolovanými ľudskými monocytmi a ich schopnosti stimulovať vylučovanie kyseliny v izolovaných králičích žľazách, a dve in vivo porovnávania skúmajúce schopnosť zlúčenín zabrániť antigénom indukovanému stiahnutiu priedušiek u morských prasiat a schopnosť vyvolať • · ·· ··
dávenie u psov, a schopnosť zlúčenín suprimovať produkciu TNFa v adoptívnom transferovom modeli v myšiach a ich schopnosť zvrátiť rezerpínom indukovanú hypotermiu u myší.
PDE 4 inhibítory so selektívnym pomerom (HPDE 4/LPDE 4) rovným alebo väčším ako 0,1 vykazovali značné zlepšenie ich terapeutického indexu. Napríklad c/s-[4-kyano-4-(3-cyklopentyloxy-4-metoxyfenyl)cyklohexán-1-karboxylát], 2karbometoxy-4-kyano-4-(3-cyklopropylmetoxy-4-difluórmetoxy-fenyl)cyklohexán-1ón a c/'s-[4-kyano-4-(3-cyklopropylmetoxy-4-difluórmeto-xyfenyl)cyklohexán-1-ol], všetky so selektívnym pomerom väčším alebo rovným 0,1, demonštrujú 100násobné zlepšenie ich terapeutického indexu v porovnaní s archetypickým PDE 4 inhibítorom, ft-rolipramom. Takže to demonštruje, že použitie selekčného návodu HPDE4 IC50/LPDE 4 IC50 > 0,1 identifikuje zlúčeniny so zvýšeným terapeutickým indexom pri in vitro porovnaní.
Čo sa týka liečby COPD, zlúčenina c/s-[4-kyano-4-(3-cyklopentyloxy-4metoxyfenyl)cyklohexán-1-karboxylát] bola podávaná ľuďom trpiacim na COPD. U týchto ľudí sa redukoval zápal, nastala bronchodilatácia a pľúcna neuromodulácia.

Claims (8)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použitie PDE 4 špecifického inhibítora na výrobu lieku na profylaxiu alebo liečbu COPD, pričom IC50 pomer inhibítora je približne 0,1 alebo vyšší, pričom uvedeným IC50 pomerom je podiel IC50 pre PDE 4 formu, ktorá viaže R-rolipram s * vysokou afinitou a IC50 pre katalytickú formu, ktorá viaže R-rolipram s nízkou , afinitou, s výnimkou použitia c/s-[4-kyano-4-(3-cyklopentyloxy-4metoxyfenyl)cyklohexán-1-karboxylátu].
  2. 2. Použitie podľa nároku 1, pričom inhibítor má IC50 pomer približne 0,1 alebo vyšší, pričom uvedený IC50 pomer predstavuje IC50 hodnotu konkurencie viazania 1 nM [3H]R-rolipramu na formu PDE 4, ktorá viaže rolipram s vysokou afinitou, delené IC50 hodnotou inhibície PDE 4 katalytickej aktivity formy, ktorá viaže rolipram s nízkou afinitou, použitím 1μΜ [3H]-cAMP ako substrátu.
  3. 3. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, pričom IC50 pomer je 0,5 alebo vyšší.
  4. 4. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, pričom IC50 pomer je 1,0 alebo vyšší.
  5. 5. Spôsob profylaxie alebo liečby COPD u ľudí podávaním PDE 4 špecifického inhibítora, ktorý preferenčne inhibuje PDE 4 katalytickú formu viažucu * R-rolipram s nízkou afinitou, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podávanie účinného množstva zlúčeniny, ktorá má IC50 pomer približne 0,1 alebo vyšší, pričom uvedeným IC50 pomerom je podiel IC50 pre PDE 4 formu, ktorá viaže R-rolipram s vysokou afinitou a IC50 pre katalytickú formu, ktorá viaže R-rolipram s nízkou afinitou, s výnimkou c/s-[4-kyano-4-(3-cyklopentyloxy-4-metoxyfenyl)cyklohexán-1karboxylátu], subjektu, ktorý to potrebuje.
  6. 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že inhibítor má IC50 pomer približne 0,1 alebo vyšší, pričom uvedený IC50 pomer predstavuje IC50 • · ο
    -28hodnotu konkurencie viazania 1 nM [3H]ŕ?-rolipramu na formu PDE 4, ktorá viaže rolipram s vysokou afinitou, delené IC50 hodnotou inhibície PDE 4 katalytickej aktivity formy, ktorá viaže rolipram s nízkou afinitou, použitím 1μΜ [3H]-cAMP ako substrátu.
  7. 7. Spôsob podľa nároku 5 alebo 6, vyznačujúci sa tým, že IC50 pomer je 0,5 alebo vyšší.
  8. 8. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 7, vyznačujúci sa t ý m , že IC50 pomer je 1,0 alebo vyšší.
SK1237-2001A 1999-03-01 2000-03-01 Použitie pde4 špecifického inhibítora a spôsob profylaxie a liečby copd SK12372001A3 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12231599P 1999-03-01 1999-03-01
PCT/US2000/005227 WO2000051598A1 (en) 1999-03-01 2000-03-01 Method for treating copd

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK12372001A3 true SK12372001A3 (sk) 2001-12-03

Family

ID=22401990

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1237-2001A SK12372001A3 (sk) 1999-03-01 2000-03-01 Použitie pde4 špecifického inhibítora a spôsob profylaxie a liečby copd

Country Status (30)

Country Link
US (1) US6670394B1 (sk)
EP (1) EP1156799A4 (sk)
JP (1) JP2002538114A (sk)
KR (1) KR20010102459A (sk)
CN (1) CN1349403A (sk)
AP (1) AP2001002248A0 (sk)
AR (1) AR042369A1 (sk)
AU (1) AU772583B2 (sk)
BG (1) BG105953A (sk)
BR (1) BR0008603A (sk)
CA (1) CA2366036A1 (sk)
CO (1) CO5160248A1 (sk)
CZ (1) CZ20013149A3 (sk)
DZ (1) DZ3019A1 (sk)
EA (1) EA200100930A1 (sk)
HK (1) HK1043935A1 (sk)
HU (1) HUP0200288A3 (sk)
ID (1) ID29888A (sk)
IL (1) IL144992A0 (sk)
MA (1) MA25522A1 (sk)
NO (1) NO20014222L (sk)
NZ (1) NZ513695A (sk)
OA (1) OA11842A (sk)
PE (1) PE20001505A1 (sk)
PL (1) PL352816A1 (sk)
SK (1) SK12372001A3 (sk)
TR (1) TR200102514T2 (sk)
UY (1) UY26040A1 (sk)
WO (1) WO2000051598A1 (sk)
ZA (1) ZA200107186B (sk)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2362101A (en) * 2000-05-12 2001-11-14 Astrazeneca Ab Treatment of chronic obstructive pulmonary disease
US20040005995A1 (en) * 2001-07-26 2004-01-08 Edelson Jeffrey D Method for reducing exacerbations associated with copd
AR029984A1 (es) * 2000-07-27 2003-07-23 Smithkline Beecham Corp Metodo para reducir las exacerbaciones asociadas copd ambito
WO2002088079A2 (en) * 2001-05-01 2002-11-07 Bristol-Myers Squibb Company Dual inhibitors of pde 7 and pde 4
MY140561A (en) * 2002-02-20 2009-12-31 Nycomed Gmbh Dosage form containing pde 4 inhibitor as active ingredient
AR039385A1 (es) 2002-04-19 2005-02-16 Astrazeneca Ab Derivados de tioxantina como inhibidores de la mieloperoxidasa
ME00524B (me) 2003-03-10 2011-10-10 Astrazeneca Ab Novi postupak za dobijanje roflumilasta
CN1767827A (zh) * 2003-03-31 2006-05-03 协和发酵工业株式会社 肺部疾病的治疗及/或预防剂
WO2005056009A1 (ja) * 2003-12-12 2005-06-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 肺疾患治療剤
MY140748A (en) 2004-12-06 2010-01-15 Astrazeneca Ab Novel pyrrolo [3,2-d] pyrimidin-4-one derivatives and their use in therapy
WO2006097456A1 (en) 2005-03-16 2006-09-21 Nycomed Gmbh Taste masked dosage form containing roflumilast
TW200804383A (en) 2006-06-05 2008-01-16 Astrazeneca Ab New compounds

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5605923A (en) * 1992-04-02 1997-02-25 Smithkline Beecham Corporation Compounds useful for treating inflammatory diseases and inhibiting production of tumor necrosis factor
US5552438A (en) * 1992-04-02 1996-09-03 Smithkline Beecham Corporation Compounds useful for treating allergic and inflammatory diseases
PT710109E (pt) 1993-06-18 2005-01-31 Smithkline Beecham Corp Metodo para identificar um inibidor de pde iv
US5728705A (en) * 1993-10-04 1998-03-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method of inducing vasorelaxation to treat pulmonary hypertension
US5716967A (en) * 1993-11-26 1998-02-10 Pfizer Inc. Isoxazoline compounds as antiinflammatory agents
UY25338A1 (es) 1998-01-07 2001-08-27 Smithkline Beecham Corp Método para tratar copd

Also Published As

Publication number Publication date
EA200100930A1 (ru) 2002-02-28
KR20010102459A (ko) 2001-11-15
DZ3019A1 (fr) 2005-05-20
BR0008603A (pt) 2001-12-26
ZA200107186B (en) 2002-08-30
AP2001002248A0 (en) 2001-09-30
HUP0200288A2 (hu) 2002-05-29
CZ20013149A3 (cs) 2002-04-17
MA25522A1 (fr) 2002-10-01
PL352816A1 (en) 2003-09-08
EP1156799A1 (en) 2001-11-28
ID29888A (id) 2001-10-18
WO2000051598A1 (en) 2000-09-08
CN1349403A (zh) 2002-05-15
HK1043935A1 (zh) 2002-10-04
JP2002538114A (ja) 2002-11-12
IL144992A0 (en) 2002-06-30
CO5160248A1 (es) 2002-05-30
AR042369A1 (es) 2005-06-22
TR200102514T2 (tr) 2002-04-22
EP1156799A4 (en) 2004-11-10
OA11842A (en) 2005-08-22
NO20014222D0 (no) 2001-08-31
HUP0200288A3 (en) 2003-08-28
US6670394B1 (en) 2003-12-30
AU3386900A (en) 2000-09-21
BG105953A (en) 2002-05-31
NO20014222L (no) 2001-10-29
NZ513695A (en) 2001-09-28
CA2366036A1 (en) 2000-09-08
UY26040A1 (es) 2000-09-29
PE20001505A1 (es) 2001-02-08
AU772583B2 (en) 2004-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6555576B1 (en) Method for treating exercise induced asthma
US5998428A (en) Compounds and methods for treating PDE IV-related diseases
Rafferty et al. Terfenadine (Seldane®) is a potent and selective histamine H1 receptor antagonist in asthmatic airways
EP1908461B9 (fr) Utilisation de l'énantiomère (1S, 2R) du milnacipran pour la préparation d'un médicament
Rogers et al. E2020—the pharmacology of a piperidine cholinesterase inhibitor
Sastre et al. Post mortem redistribution of drugs: current state of knowledge
PT1928438E (pt) Método para tratamento de dependências de drogas e comportamentos
SK12372001A3 (sk) Použitie pde4 špecifického inhibítora a spôsob profylaxie a liečby copd
Giacobini Cholinesterase inhibitors do more than inhibit cholinesterase
Lee et al. Selective muscarinic receptor antagonists for airway diseases
KR20010050225A (ko) 포유동물에서의 니코틴 탐닉의 예방 및 치료를 위한 약학조성물
EP0710109B1 (en) Method for identifying a PDE IV inhibitor
Nutt et al. Treatment of Huntington disease with a cholinergic agonist
JP2002543133A (ja) ロフルミラストおよびｐｄｅ−３インヒビターを含有する共力薬の組合せ物
EP2528595A1 (de) Verbindungen zur verwendung bei der behandlung von erkrankungen
Dean et al. Effects of ethanol on cocaine metabolism and disposition in the rat
Mokrý et al. Effects of Selective Inhibition of PDE4 by YM976 on airway reactivity and cough in ovalbumin-sensitized guinea pigs
NZ243577A (en) Synergistic anti-hypertensive composition containing tetrahydronaphthalene and pyridodiazepine derivatives
MXPA01008853A (en) Method for treating copd
Brown et al. Interactions of pyrazole and ethanol on norepinephrine metabolism in rat brain.
RU2607946C2 (ru) Композиции, включающие ингибитор холинэстеразы, для лечения когнитивных расстройств
US20020115111A1 (en) Compounds
ZA200107187B (en) Method for treating exercise induced asthma.
MXPA01008858A (en) Method for treating exercise induced asthma
JP2002517446A (ja) 精神障害の治療のためのｎｋ−１受容体アンタゴニストの使用