SI9400085A - Vaccine compositions comprising antigenic polypeptide and 3d-mpl, useful in preventing infection with influenza - Google Patents

Description

(57) Predloženi izum zagotavlja vakcinske sestavke, ki so sposobni povečanja protektivnega odziva na izbran influenčni antigen, pri čemer sestavek vsebuje vsaj antigenski polipeptid in 3D-MPL, in postopke za povečevanje imunskega odziva na influenco z uporabo teh sestavkov.

1. SmithKline Beecham Corporation

2. SmithKline Beecham Biologicals (s.a.)

Vakcinski sestavki, ki vsebujejo antigenski polipeptid in 3D-MPL, uporabni pri preprečevanju infekcije z influenco

To je delna nadaljevalna prijava US patentne prijave, serijska številka 021,535, vložene 19. februarja 1993, ki je istočasno v postopku.

Ta izum se nanaša na vakcine, uporabne pri preprečevanju infekcije z influenco pri ljudeh.

Infekcija z virusom influence povzroči akutne respiratorne bolezni pri ljudeh, konjih in perutnini, ki so včasih pandemičnih razsežnosti. Virusi influence spadajo v ortomiksovirusno družino RNA virusov in imajo ovite virione s premerom 80 do 120 nanometrov z dvema zunanjima glikoproteinskima konicama, hemaglutininom (HA) in nevraminidazo (NA) in pet notranjih proteinov, nukleoprotein, matrični protein in tri polimeraze. Influenčna virusna RNA kodira tudi za dva nestrukturna proteina (NS1 in NS2), ki se producirata v inficiranih celicah, vendar nista vgrajena v infektivne virione.

Trije tipi influenčnih virusov, tip A, tip B in tip C inficirajo ljudi. Virusi tipa A so odgovorni za večino humanih epidemij v sodobnem času, čeprav obstajajo tudi sporadični izbruhi infekcij tipa B. Znani prašičji, konjski in perutninski virusi so večinoma tipa A, čeprav so viruse tipa C izolirali tudi iz prašičev.

V virusu ima genetična variacija v površinskih proteinih HA in NA za posledico tri pomembne podtipe, označene s H1N1, H2N2 in H3N2. Pri tipu A, so podtipi HI (prašičja influenca), H2 (azijska influenca) in H3 (hongkonška influenca) prevladujoči v humanih infekcijah.

površinskih glikoproteinov, ki povzročajo antigensko variacijo. Taje najbolj izražena v virusu tipa A, kjer so glavne genetične spremembe v HA ali NA proteinih že potekle(antigenski premiki). Nastanek teh novih virusnih podtipov povzroči infekcijo pandemične razsežnosti, kar ima za posledico precejšnjo smrtnost in bolehnost. Npr. H1N1 viruse, prevladujoče pred 1957, nadomestili virusi podtipa H2N2, ki so prevladovali do 1968, nakar jih je nadomestil podtip H3N2. Splošno H3N2 sevi še vedno krožijo, vendar so se od 1977 ponovno pojavili H1N1 virusi. HA-ji v danem podtipu so tudi izpostavljeni manjšim genetičnim spremembam (točkovne mutacije), vsako leto ali dve (antigenski naplav). Predvsem so omejeni na antigenske determinante, zbrane okoli vezavnih mest sialinske kisline v HA1 in rezultirajo v nastanku novih virusnih sevov. Čeprav ta antigenski naplav ne povzroči resne smrtnosti in bolehnosti takega obsega kot antigenski premik, pa je odgovoren za letne epidemije influence.

Influenčne vakcine so klasificirane v tri tipe, popolen virion, razcep in podenoto. Vakcine popolni virioni, bazirajo na intaktnih virusnih delcih in čeprav so na splošno bolj imunogenske, težijo k večji reaktogenosti in so zaradi tega nadomeščene z vakcinami, ki so razcepljene ali podenote, pripravljene iz očiščenih virusnih komponent, dobljenih po razbitju virusa z obdelavo z raznimi kemijskimi sredstvi. Razlika med vakcinami, ki so razcepljene in tistimi, ki so podenote, je v tem, da vakcina podenota vsebuje skoraj izključno hemaglutinin in nevraminidazo, povrhnje antigene virusa, medtem ko razcepljene vakcine dodatno vsebujejo spremenljive količine internih komponent virusa, kot npr. ribonukleoprotein in matrični protein.

Splošno dosegljive tržne influenčne vakcine temeljijo na načelu, da protitelo za HA ali NA daje zaščito. Sestojijo iz neadjuvantiranih, inaktiviranih, popolnih ali razcepljenih virusnih produktov, ki izkoriščajo virus, zrasel v oplojenih kurjih jajcih. Vse influenčne vakcine na splošno vsebujejo pripravke iz H1N1, H3N2, in tipa B virusnih sevov . Zaradi vsakoletne antigenske variacije so specifični virusni sevi usklajeni na letni osnovi po WHO priporočilih, ki temelje na epidemiološkem nadzoru prevladujočih krožečih virusnih sevov.

Ne obstoja nobena univerzalna vakcina za virus influence, t.j. vakcina, specifična za ne-sev. Pred kratkim so poskušali pripraviti takšne univerzalne ali poluniverzalne vakcine iz reasortantnih virusov, pripravljenih s križanjem različnih sevov. Še bolj pred kratkim so takšni poskusi vključevali tehnike rekombinatne DNA, osredotočene primarno na HA protein.

Influenčne vakcine manj uporabljajo zaradi razlogov, ki vključujejo dvome o učinkovitosti, strah pred stranskimi učinki, potrebo po vsakoletni revakcinaciji in pomanjkanje zanimanja med pripravljalci. Za obstoječe vakcine je dokazano, da imajo približno 60-80% učinkovitost proti infekciji z virusi influence, ki so antigensko zelo sorodni virusnim sevom, uporabljenim v vakcini. Ta stopnja protektivne učinkovitosti ima tendenco padanja, kadar HA antigen epidemičnega seva HA odplava iz vakcinskega seva in bi padla na nič, če ne bi prišlo do premika v podtipu. Poleg tega se zaščita zmanjša v nekaterih imunsko ogroženih skupinah, kot so npr. starejši, ki žive v sanatorijih.

Torej glavne pomanjkljivosti splošno dosegljivih vakcin izhajajo iz dejstva, da je zaradi pogostega antigenskega naplava komponento virusnih sevov potrebno menjati letno in je posameznike potrebno revakcinirati.

Torej obstaja v tehniki potreba po vakcinskih formulacijah in sestavkih, zmožnih induciranja protektivnih odzivov pri bitjih za širok izbor patogenov.

Iz enega vidika predloženi izum zagotavlja vakcinski sestavek, ki je zmožen stimuliranja povečanega imunskega in protektivnega odziva v vakcioniranem bitju proti influenci, pri čemer sestavek obsega izbran influenčni antigen ali antigenski polipeptid in učinkovito količino 3-o-deaciliranega monofosforilnega lipida A (3DMPL).

Z drugega vidika predloženi izum zagotavlja vakcinski sestavek, ki obsega izbran influenčni antigen ali antigenski polipeptid, učinkovito količino 3D-MPL in liposomski pripravek. Liposomski pripravek je definiran tukaj tako, da poleg tega, da deluje kot nosilec deluje tudi kot adjuvant in nudi precejšnje prednosti izdelovanja in formuliranja.

V nadaljnjem vidiku predloženi izum zagotavlja postopek za povečevanje vakcinskega imunskega odziva za izbran influenčni antigen. Ta postopek vključuje dajanje sesalcu, prednostno človeku, vakcinski sestavek, opisan zgoraj.

Drugi vidiki in prednosti predloženega izuma so nadalje opisani v naslednjem podrobnem opisu njegovih prednostnih izvedb.

Slika 1 je stolpčen diagram, ki prikazuje navzkrižno zaščito za H1N1 in H2N2 podtip virusov influence v miših, imuniziranih s Flu D proteinom (SK&F 106160) v aluminiju in 3D-MPL, kot je prikazano v primeru 18.

Slika 2 je stolpčen diagram, ki prikazuje vranične proliferativne odzive pred izzivom v miših, vakciniranih s Flu D formulacijami in kontrolami. Glej primer 20.

Slika 2B je stolpčen diagram, ki prikazuje vranične proliferativne odzive po izzivu v miših, vakciniranih s Flu D formulacijami in kontrolami. Glej primer 20.

Slika 3A je stolpčen diagram, ki prikazuje proliferativne odzive bezgavk, ki jih dobimo na dan 4 v miših, vakciniranih z 20 /zg flu D v aluminiju (prazni stolpci) ali aluminiju in 3D-MPL (šrafirani stolpci). Glej primer 21.

Slika 3B je stolpčen diagram, ki prikazuje proliferativne odzive bezgavk, ki jih dobimo na dan 4 v miših, vakciniranih s 5 /zg Flu D v aluminiju (prazni stolpci) ali aluminiju in 3D-MPL (šrafirani stolpci). Glej primer 21.

Slika 3C je stolpčen diagram, ki prikazuje proliferativne odzive bezgavk, ki jih dobimo na dan 4 v miših, vakciniranih z 1 /zg Flu D v aluminiju (prazni stolpci) ali aluminiju in 3D-MPL (šrafirani stolpci). Glej primer 21.

Slika 4A je stolpčen diagram, ki prikazuje proliferacijo, na dan 2, bezgavk, v miših, imuniziranih z 1 /zg vakcinske formulacije proteina D. Glej primer 21.

Slika 4B je stolpčen diagram, ki prikazuje proliferacijo, na dan 3, bezgavk, v miših, imuniziranih z 1 /zg vakcinske formulacije proteina D. Glej primer 21.

Slika 4C je stolpčen diagram, ki prikazuje proliferacijo, na dan 4, bezgavk, v miših, imuniziranih z 1 /zg vakcinske formulacije proteina D. Glej primer 21.

Slika 4D je stolpčen diagram, ki prikazuje IL-2 produkcijo, na dan 2, bezgavk, v miših, imuniziranih z 1 /zg vakcinske formulacije proteina D. Glej primer 21.

Slika 4E je stolpčen diagram, ki prikazuje IL-2 produkcijo, na dan 3, bezgavk, v miših, imuniziranih z 1 /zg vakcinske formulacije proteina D. Glej primer 21.

Slika 4F je stolpčen diagram, ki prikazuje IL-2 produkcijo, na dan 4, bezgavk, v miših, imuniziranih z 1 μ-g vakcinske formulacije proteina D. Glej primer 21.

Slika 5A je diagram, ki prikazuje nivoje interferona v kulturah, stimuliranih z antigenom, pri miših, imuniziranih kot je opisano pri primeru 24 spodaj.

Slika 5B je diagram, ki prikazuje IL-2 nivoje v kulturah, stimuliranih z antigenom, dobljenih iz miši, imuniziranih, kot je opisano pri primeru 24 spodaj.

Slika 6A je diagram, ki prikazuje virusne titre, določene v nosu z MDCK mikrotestom na dan 1, 3, 5, 7 in 9 po izzivu (5 miši na skupino) za kontrolo, ki vsebuje aluminij in 3D-MPL (--kvadrat-), influenčno monovalentno razcepljeno vakcino, ki vsebuje A/PR/8 sev brez adjuvanta (-trikotnik-), in sev A/PR/8 adjuvantiran s 3D-MPL (nepretrgana črta in krog). Glej primer 28.

Slika 6B je diagram, ki prikazuje virusne titre, določene v nosu z MDCK mikrotestom na dan 1, 3, 5, 7 in 9 po izzivu (5 miši na skupino) za kontrolo, ki vsebuje aluminij in 3D-MPL (-kvadrat-), influenčno monovalentno razcepljeno vakcino, ki vsebuje Singapurni sev brez adjuvanta (-trikotnik-), in singapurni sev, adjuvantiran s 3DMPL (nepretrgana črta in krog). Glej primer 28.

Slika 6C je diagram, ki prikazuje virusne titre, določene v traheji z MDCK mikrotestom na dan 1, 3,5, 7 in 9 po izzivu (5 miši na skupino) za enake tri vakcinske formulacije kot na sliki 6A.

Slika 6D je diagram, ki prikazuje virusne titre, določene v traheji z MDCK mikrotestom na dan 1,3, 5, 7 in 9 po izzivu (5 miši na skupino) za enake tri vakcinske formulacije kot na sliki 6B.

Slika 6E je diagram, ki prikazuje virusne titre, določene v pljučih z MDCK mikrotestom na dan 1, 3, 5, 7 in 9 po izzivu (5 miši na skupino) za enake tri vakcinske formulacije kot na sliki 6A.

Slika 6F je diagram, ki prikazuje virusne titre, določene v pljučih z MDCK mikrotestom na dan 1, 3, 5, 7 in 9 po izzivu (5 miši na skupino) za enake tri vakcinske formulacije kot na sliki 6B.

Predloženi izum zagotalja vakcinske sestavke, ki so zmožni izzvanja povečanega imunskega odziva v vakciniranih gostiteljih, vključno ljudeh, kot tudi postopke za pripravo in uporabo takih vakcinskih sestavkov. Vakcinski sestavek v smislu izuma je označen s tem, da vsebuje učinkovito količino izbranega influenčnega antigena ali antigenskega polipeptida in 3-o-deaciliranega monofosforilnega lipida A (3D-MPL). V danem primeru je liposomski pripravek tudi lahko komponenta vakcinskih sestavkov v smislu izuma.

Izumitelji smo ugotovili, da so kombinacije 3D-MPL in določenih influenčnih antigenov učinkovite pri doseganju protektivnih odzivov proti influenci, katere ne dosežemo s samim influenčnim antigenom. Npr. z antigenskim polipeptidom, znanim kot Flu D, opisanim spodaj, je ta odziv takšen, da je potrebna nižja količina antigena, da dobimo enake rezultate, kot z očiščenim Flu D in popolnim Freundovim adjuvantom (CFA), znanim močnim adjuvantom, kije toksičen za živali.

Nadalje, kadar sta izbrani influenčni antigen in 3D-MPL vključena v liposom, kot je opisano tukaj, dobimo protektivni odziv, ki presega tistega, dobljenega z antigenom in katerokoli drugo kombinacijo adjuvanta.

Z izrazom povečan imunski odziv, kot ga uporabljamo tukaj, je mišljeno, da vakciniran gostitelj proizvede močnejši celični imunski odziv (produkcija protektivnih limfocitov T) za vakcinski sestavek v smislu izuma, kot je ali bi ga proizvedel gostitelj v odzivu na izbran antigen, ki ni adjuvantiran ali je adjuvantiran z drugimi običajnimi adjuvanti, prikladnimi za interno dajanje. Povečan protitelesni (celica B) odziv tudi pričakujemo s tem povečanim odzivom.

Z izrazom imunološko učinkovita količina ali učinkovita količina, kot ga uporabljamo tukaj, je mišljena tista količina antigena, ki inducira protektivni imunski odziv.

Z izrazi izbran antigen, antigenski polipeptid ali protein ali imunogen, kot jih uporabljamo tukaj, je mišljen popoln ali inaktiviran patogen, imunogenski protein, peptid ali fragment iz patogena, ki je v danem primeru spojen z drugim peptidom ali proteinom, ki je homolognega ali heterolognega izvora. Ti izrazi tudi vključujejo razcepljen virus, opisan spodaj. Ti izrazi lahko vključujejo tudi neproteinske biološke snovi iz patogena. Patogeni so prednostno organizmi, ki povzročajo bolezni, ki inficirajo ljudi, čeprav lahko uporabimo tudi živalske patogene v teh vakcinah, kjer je želeno za veterinarske namene. Ti izrazi se nanašajo na zmožnost popolnega patogena, razcepljenega virusa, peptidnega ali fuzijskega proteina, da izzove protektivni imunski odziv v vakciniranem gostitelju.

Z izrazom monovalentna vakcina je mišljena vakcina, ki vsebuje antigene iz enojnega tipa ali podtipa influenčnega virusa, npr. H1N1, H2N2, H3N2 tipa A, tipa B in tipa C.

Z izrazom multivalentna vakcina je mišljena vakcina, ki vsebuje antigene iz več kot enojnega tipa ali podtipa influenčnega virusa, t.j. trivalentna vakcina lahko vsebuje antigene iz katerihkoli treh influenčnih tipov ali podtipov, npr. H1N1, H2N2, H3N2 tipa A, tipa B in tipa C.

Z izrazom razcepljen virus je mišljena suspenzija virusa influence, ki jo dobimo iz oplojenih kurjih jajc, inokuliranih z zasevnim materialom, ki je delno očiščen in koncentriran. Koncentrirano virusno suspenzijo obdelamo z detergentom, kot npr. natrijevim dezoksiholatom, da razbijemo virusne delce. Odstranitev virusnih fosfolipidov med tem razcepitvenim postopkom proizvede inaktiviran influenčni antigen, za katerega je potencial reaktogenosti močno znižan. Suspenzijo razcepljenega virusa popolnoma inaktiviramo s kombiniranim učinkom detergenta in formaldehida.

Naslednji opis sestavkov in postopkov v smislu izuma podrobno opisuje vakcinske sestavke za profilaktično uporabo proti virusu influence.

V eni prednostni izvedbi v smislu izuma, vakcinski sestavek, sposoben izvajanja povečanega imunskega odziva, protektivnega, proti infekciji z influenčnim virusom, vsebuje vsaj izbran influenčni antigenski polipeptid, kot npr. NS1₁^₁HA2_{65 222} (na katerega se tukaj sklicujemo kot na Flu D, D protein ali Flu D protein), adjuvantiran s 3D-MPL.

Na splošno je flu D protein prednosten influenčni antigenski polipeptid za uporabo v vakcinskih sestavkih v smislu izuma, ker ga najlažje očistimo influenčnih fuzijskih proteinov, ki vsebujejo celotno karboksi-terminalo poročje HA2 dela hemaglutininskega področja. D protein vsebuje prvih 81 amino kislin NS1, spojenih na amino kislino 65 skrajšane HA2 podenote (amino kisline 65-222). V danem primeru, kar zadeva druge NS1-HA2 fuzijske proteine, prikazane tukaj, linkersko sekvenco lahko vključimo med dve spojeni sekvenci.

V sedanji prednostni izvedbi, DNA kodirno sekvenco za flu D protein pripravimo kot je opisano v EP 0366238 z restringiranjem HA2 kodirne sekvence s PvuII in ligiranjem C-terminalne regije Ncol mesta med amino kislinama 81 in 82 v NS1 kodirni sekvenci s sintetičnim oligonukleotidnim linkerjem. Ta linkerska selvenca kodira za glutamin-izolevcin-prolin. D protein, za katerega smo dobili 90-95%-no čistoto, zahteva uporabo čistilnih postopkov, opisanih tukaj, da v bistvu odstranimo proteine gostiteljske celice (E. coli) in druge kontaminante.

Flu D protein in rekombinantna ekspresija in čiščenje le-tega so podrobno prikazani v US patentni prijavi ser.št. 07/751,899, ki je istočasno v postopku in njeni ustrezni evropski patentni prijavi št. 366,238, objavljeni 2. maja 1990 in US patentni prijavi ser. št. 07/387,558 in evropski patentni prijavi št. 366,239, objavljeni 2. maja 1990. Te prijave so vključene z referenco za namene opisovanja tega proteina, njegove ekspresije in čiščenja.

Poleg Flu D lahko v vakcinskih sestavkih v smislu izuma uporabimo tudi druge prikladne influenčne antigenske polipeptide, vključno tiste, opisane v evropski patentnih prijavah št. 366,238 in EP 366,239, obe objavljeni 2. maja 1990 in US patentnih prijavah ser.št. 07/751,898 07/751,896 in 07/837,773, ki so istočasno v postopku. Taki proteini vključujejo Δ M, Δ M+, A, C, C13,03 kratek in Δ D. Drugi, ki so primerni, vključujejo konstrukte D brez Cys, HAZ^ ₂₂₂, in NS1H3HA2, kot npr. tiste, opisane v US patentnih prijavah ser. št. 07/751,898, 07/751,896, 07/751,896 in 07/837,773 in WO 93/15763, ki so istočasno v postopku in so vključene tukaj z referenco. Posebno zaželeni so H3HA2 konstrukti, navedeni zgoraj. Iz novejših študij izumiteljev je razvidno, da so miši, imunizirane s koktajlom, ki vsebuje tako NS1-H1HA2, kot tudi NS1-H3HA2 fuzijske proteine, zaščitene pred letalnim izzivom tako s HI kot tudi s H3 virusnimi podtipi.

Kodirne sekvence za HA2, NS1 in druge virusne proteine influenčnega virusa lahko pripravimo sintetično ali jih lahko izpeljemo iz virusne RNA z znanimi tehnikami, ali iz dosegljivih plazmidov, ki vsebujejo cDNA, kot je opisano v objavljenih evropskih prijavah, ki so navedene zgoraj. Npr. dodatno k zgoraj navedenim referencam, DNA kodirno sekvenco za HA iz A/Japonska/305/57 seva kloniramo in sekvenciramo kot navajajo Gething et al, Nature, 287:301-306 (1980); HA kodirno sekvenco za sev A/NT/60/68 kloniramo kot navajajo Sleigh et al, in Both et al, oboje v Developments in Celi Biology, Elsevier Science Publishing Co., str. 69-79 in 81-89, (1980); HA kodirno sekvenco za sev A/WSN/33 kloniramo, kot navajajo Davis et al, Gene, 10:205-218 (1980); in Hiti et al, Virology, 111:113-124 (1981). HA kodirno sekvenco za perutninski plakni virus kloniramo kot navajajo Porter et al in Emtage et al, oboje v Developments in Celi Biology, (citirano zgoraj), str. 39-49 in 157-168.

Sistemi za kloniranje in ekspresijo vakcinskih polipeptidov v raznih mikroorganizmih in celicah, ki vključujejo npr. E. coli, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, celice sesalcev in insektov, so znani in dosegljivi iz privatnih in javnih laboratorijev in skladišč in od komercialnih prodajalcev.

D protein lahko očistimo s postopkom, opisanim v primeru 13. Razne običajne postopke lahko uporabimo pri čiščenju proteinov sestavkov v smislu izuma, čeprav ti postopki niso nujni, da dobimo visoko očiščen produkt farmacevtske kvalitete. Take postopke lahko uporabimo med, pred ali po zgoraj opisanih stopnjah postopka. Ena taka opcijska stopnja je diafiltracija, oblika kontinuirne dialize, ki je ekstremno učinkovita pri doseganju mnogih pufrnih sprememb. Diafiltracijo prednostno izvedemo mimo celulozne membrane ali ultrafiltra. Prikladne membrane/filtri so tisti z molekulsko maso približno 1000, odrezano za tiste z velikostjo por premera do 2,4 jim. Številni različni sistemi, prilagodljivi za diafiltracijo so tržno dosegljivi, kot npr. 10 K Amicon dualni spiralni patronski sistem. V postopku v smislu izuma lahko diafiltracijo z uporabo 20 mM tris pufra pri približno pH 8 učinkovito uporabimo pri čiščenju in kasnejšem koncentriranju polipeptida, ki ga uporabimo v vakcinskem sestavku v smislu izuma. V drugi prednostni izvedbi je antigen, uporabljen v vakcinskem sestavku v smislu izuma popolnoma inaktiviran patogen, kot npr. razcepljen virus, podrobno opisan v primeru 25. Monovalentna razcepljena influenčna vakcinja, ki vsebuje razcepljen virus ali multivalentna (npr. trivalentna) razcepljena influenčna vakcina, ki vsebuje več kot en razcepljen virus, je lahko adjuvantirana s 3D-MPL. V eni formulaciji vakcina vsebuje razcepljen virus, ki je pripravljen iz H1N1 seva, kot npr. Singapur/6/86 [Sachsisches Serumwerkl GmbH (SSW), Dresden, Nemčija in National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC, London, Anglija)], ki se navadno uporablja v običajnih influenčnih vakcinah. Alternativno lahko druge H1N1 razcepljene viruse pripravimo iz A/PR/8/34 (imenovano tudi A/PR/8), opisano v T. Francis, Proč. soc. Exp. Biol. Med., 32:1172 (1935) in dosegljivo od American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, ZDA pod ATCC št. VR-95. Monovalentna vakcina vsebuje antigene iz enega seva virusa influenčnega tipa. Alternativno je vakcina lahko multivalentna, pri čemer vsebuje več kot en influenčni antigen, npr. dva ali tri razcepljenene viruse, da se ji poveča reaktivnost proti več kot enemu virusu influenčnega tipa. Primer trivalentne vakcine vključuje npr. H1N1 Singapur/6/86 sev, s H3N2 sevom Beijing/32/92 (SSW), Dresden, Nemčija] in sev tipa B, Panama/45/90 [SSW, Dresden, Nemčija].

Viruse influence, ki jih lahko pripravimo kot razcepljene viruse na znan način, kot je opisan v primeru 25, vključujejo katerekoli seve, podtipe in tipe, zlasti tiste, ki jih priporoča WH0, pri čemer so mnogi dosegljivi iz kliničnih primerkov in iz javnih shramb, kot npr. American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, ZDA (ATCC) in NIBSC. Npr. drugi prikladni H3N2 virusni sevi vključujejo, brez omejitev, A/Victoria/H3/75, opisano v Fiers et al, Celi, 19: 683696 (1980); A/Udorn, opisano v C. J. Lai et al, Proč. Natl. Acad. Sci., ZDA, 77:210214 (1980); Palese and Schulman, virol., 57:227-237 (1974); in A/HK/8/68, opisano v WHO Weekly Epid. Record, Vol, 43:401 (1968) in dosegljivo iz ATCC kot št. VR544 kot tudi Beijing/32/92. Drugi prikladni sevi tipa B vključujejo, brez omejitve, tiste, znane kot B/Lee/40, ki jih opisujejo Krystal et al, Proč. Natl. Acad. Sci., ZDA 79:4804-4900 (1982) in B/Taiwan, dosegljive iz ATCC kot št. VR-295, Panama/45/90 in B/Yamaghta sevi. H2N2 viruse tudi lahko uporabimo v teh vakcinah.

Razumljivo je, da so poleg drugih influenčnih virusov ali inaktiviranih virusnih pripravkov, predvideni tudi drugi antigenski materiali iz drugih patogenov za uporabo poleg ponazorjenih antigenov, po napotkih, navedenih tukaj.

Druga komponenta vakcinskega sestavka v smislu izuma je adjuvant 3D-MPL. 3DMPL je podrobno opisan v US patentu št. 4,912,094, ki je vključen tukaj z referenco in je tržno dosegljiv od RIBI Immunochem Research Inc., Hamilton, Montana. Na kratko, 3D-MPL je derivat endotoksina, monofosforilni lipid A (MPL), lipidni A analog, izoliran iz brezheptozne RE mutante gramnegativne bakterije, kot je npr. Salmonella minnesota. MPL nima fosfatne skupine v C-l legi glukozamina. Z obdelavo MPL molekule, da odstranimo acilno verigo v legi 3 glukozamina, dobimo 3D-MPL. 3D-MPL je netoksičen v nasprotju z drugimi enterobakterijskimi lipopolisaharidi, vendar ohrani antigensko aktivnost izvirnega endotoksina. Ta molekula je uporabna pri preprečevanju gramnegativne sepse in endotoksemije.

3D-MPL lahko raztopimo v vodi, da dobimo raztopine vezikularnih agregatov, ki so verjetno sestavljeni iz lipidnih dvoplastnih membran. Torej ni mogoče, da bi 3D-MPL zaznali kot individualno molekulo pri imunskem sistemu, ker raje pride do vzajemnega delovanja pri kontaktih membrana-membrana, ki vključuje celične površine in površine veziklov.

V prednostni izvedbi so delci MPL majhni in na splošno ne presegajo 120 nm.

deaciliran monofosforilni lipid A z majhnimi delci, ki na splošno ne presegajo 120 nm lahko naredimo po postopku, opisanem v GB 2 220 211 (ali pa lahko tržen MPL z večjimi delci nabavimo od Ribi Immunochem.) in produkt lahko nato sonificiramo, dokler ni suspenzija bistra. Velikost delcev lahko določimo z uporabo dinamičnega svetlobnega sipanja, kotje opisano za tem.

Prednostno je velikost delcev v območju 60-120 nm.

Najbolj prednostno je velikost delcev pod 100 nm.

V skladu s predloženim izumom, smo izumitelji določili, da influenčni antigenski polipeptid, npr. flu D protein, Če je visoko očiščen, ni niti imunogenski niti protektiven v odsotnosti adjuvanta. Vendar, če je adjuvantiran s 3D-MPL, kot je opisano tukaj in prikazano v primerih 14-24 spodaj, je protein sposoben induciranja zaščite proti influenčni infekciji. Če je izbran antigen razcepljen virus v monvalentnem ali trivalentnem sestavku, ima sestavek v smislu izuma povečano imunogenost in navzkrižno reaktivnost.

Nadalje smo izumitelji ugotovili, da če influenčni antigenski polipeptid, npr. flu D protein, adjuvantiramo s 3D-MPL, potem je potrebna nižja doza flu D proteina, da dosežemo enak nivo imunskega odziva, kot ga dobimo, če protein adjuvantiramo samo z aluminijevim adjuvantom. Če je izbran antigen razcepljen influenčni virus v monovalentnem ali trivalentnem sestavku, predvidevamo, da bo reaktogenost sestavka manjša, če uporabimo manj antigena v tej izvedbi v smislu izuma.

Dodatni adjuvanti so tudi lahko vključeni v vakcinske sestavke v smislu izuma. Eden od ustreznih dodatnih adjuvantov je aluminij ali aluminijev hidroksid ali aluminijev fosfat. Če flu D protein adjuvantiramo s kombinacijo aluminija in 3D-MPL, dosežemo stopnjo učinkovitosti ekvivalentno tisti, ki jo zaznamo s popolnim Freundovim adjuvantom (CFA), klasičnim adjuvantom za vzpodbujanje odzivov celic T, ki pa ni primeren za interno dajanje pri ljudeh.

Za pripravo prednostnega vakcinskega sestavka v smislu izuma, ki vsebuje antigenski polipeptid, npr. flu D protein in 3D-MPL, potrebno količino flu D proteina pomešamo s primerno količino 3D-MPL, kot je bolj podrobno opisano spodaj. V danem primeru liofiliziran lipid A pomešamo s predliposomskim gelom, podrobno opisanim spodaj pred antigenom. Najbolj prednostno molsko razmerje fosfatidov proti lipidu A je 66:1. Vendar gostoto sredstva lahko spreminjamo do želenega nivoja.

Druga primerna sredstva za dodajanje k vakcinskemu sestavku vključujejo, npr. IL-2, QS21 [C. R. Kensil et al, J. Immunol., 146(2):431-437 (1991)] in muramil dipeptide (MDP). Poleg tega lahko vključimo v vakcinske sestavke v smislu izuma tudi druge v vodi topne ali netopne kemikalije ali zdravila in/ali adjuvante, opisane zgoraj. Npr., muramil dipeptide lahko tudi uporabimo v podobnih razmerjih, kot je opisano zgoraj oz. potrebno. Druga zdravila, ki so lahko del take vakcine, lahko vključujejo katerokoli substanco, ki kadar je v vakcini, modificira eno ali več njenih funkcij, npr. kot je navedeno v uradni farmakopeji ali substanco, uporabljeno pri zdravljenju ali preprečevanju infekcij.

Vakcinski sestavki v smislu izuma lahko nadalje vsebujejo primerne nosilce, ki so dobro znani strokovnjakom na področju vakcin in jih z lahkoto izberejo. Primeri za nosilce vključujejo sterilno fiziološko raztopino, laktozo, saharozo, kalcijev fosfat, želatino, dekstrin, agar, pektin, arašidno olje, olivno olje, sezamovo olje, skvalen in vodo. V danem primeru nosilec ali razredčilo lahko vključuje snovi za časovno zadrževanje, kot npr. gliceril monostearat ali gliceril distearat sam ali z voskom. V danem primeru lahko uporabimo primerne kemijske stabilizatorje,da izboljšamo stabilnost farmacevtskega pripravka. Primerni kemijski stabilizatorji so dobro znani strokovnjakom in vključujejo npr. citronsko kislino in druga sredstva za naravnanje pH, kelirna ali sekvestirna sredstva in antioksidante. Alternativno, če je liposomski sistem dajanja del vakcinskega sestavka, potem niso potrebni nobeni nosilci.

Drug prednosten vakcinski sestavek v smislu izuma obsega izbran antigen, npr. flu D protein, kot je opisan zgoraj in 3D-MPL, pri čemer so komponente ujete ali vrinjene v liposomski pripravek. V danem primeru, liposom, flu D protein in 3D-MPL, vsebujoč vakcinski sestavek, lahko vsebuje tudi enega ali več dodatnih influenčnih antigenov ali drugih antigenov ali ustreznih adjuvantov in sredstev, kot je opisano zgoraj. V prednostni formulaciji, vakcina vsebuje antigenski polipeptidni flu D protein in 3D-MPL, nameščen v nosilni liposom. V drugi formulaciji vakcina vsebuje mono- ali multivalenten influenčni antigen, ki je podobno vsebovan v nosilnem liposomu.

Izumitelji smo ugotovili, da so liposomski pripravki, opisani tukaj, sposobni delovanja ne samo kot nosilci, ampak tudi kot adjuvanti in so posebno prednostni, ker za njihovo izdelavo ne potrebujemo organskih topil ali področij z visokim strigom, kar je precejšnja prednost proteinskega zdravila in za vse sestavine za liposome smatramo, da so varne za interno dajanje. Zaradi enostavnosti in fleksibilnosti preparativnega postopka, so ti liposomski pripravki primerni za izdelovanje v velikem obsegu.

Izumitelji smo tudi ugotovili, da 3D-MPL lahko enostavno vgradimo v liposomske strukture, opisane tukaj, v kombinaciji z influenčnimi antigeni, da dobimo rezultate, superiorne glede na tiste, ki smo jih ugotovili, če influenčne antigene kombiniramo z znanimi običajnimi adjuvanti. Značilno ima vakcinski sestavek, ki vsebuje D protein v 3D-MPL in liposomski formulaciji, celo večjo učinkovitost kot D protein v CFA. Glej npr. primer 20 in 22 spodaj.

Liposomski pripravki, uporabni v vakcinskih sestavkih in postopki v smislu izuma so opisani v US patentni prijavi ser. št. 07/714,984 (US 5230899), ki je istočasno v postopku in je vključena tukaj z referenco. Na splošno je beseda liposom predlagana in sprejeta kot izraz za uporabo v znanstveni literaturi, ki opisuje sintetične, oligolamelne lipidne vezikle. Taki vezikli so običajno sestavljeni iz ene ali več koncentričnih naravnih ali sintetičnih lipidnih dvoplasti, ki obdajajo notranjo vodno fazo.

Specifično, kot je definirano tukaj in v skladu z vključeno referenco, liposomske pripravke, uporabne v vakcinskem sestavku v smislu izuma, pripravimo z dispergiranjem v vodnem mediju na način, ki ustreza tvorbi liposomov, pri čemer sestavek vsebuje snov za tvorbo liposoma, ki vsebuje dolgoverižno alifatsko ali aromatsko kislino ali amin; hidratacijsko sredstvo, ki ima naboj nasproten tistemu od kisline ali amina, ki je prisotno v molskem razmerju med 1:20 in 1:0,05 glede na kislino ali amin; in vodo v količini do 300 mol glede na trdne snovi.

Priprava liposomskih adjuvantnih nosilcev, uporabnih v smislu izuma, sledi. Primeri snovi, ki tvorijo liposome, vključujejo lipide, ki se dajo in takšne, ki se ne dajo umiliti, npr. acilne glicerole, fosfogliceride, sfingolipide, glikolipide, itd. Maščobne kisline vključujejo nasičene ali nenasičene alkil (Cg-C^) karboksilne kisline, monoalkil (C_gC₂₇) estre (C₄-C₁₀) dikarboksilnih kislin, (npr. holesterol hemijantarno kislino in maščobno kislinske derivate amino kislin v katerih so vključene tudi katerekoli N-acil karboksilne kisline (npr. N-oleoil treonin, Ndinoleoil serin, itd). Mono- ali dialkil (Cg-C^) sulfonatni estre in mono- ali dialkil (Cg-C^) sulfonatne estre in mono- ali dialkil (Cg-C^) fosfatne estre lahko substituiramo za maščobne kisline. Nadalje lahko uporabimo mono- ali diacil (Cg-C^) glicerolne derivate fosforjevih kislin in mono- ali diacil (Cg-C^) glicerolne derivate žveplovih kislin namesto maščobnih kislin.

Poleg tega maščobne kisline lahko nadomestimo tudi z amini (npr. Cg-C^ NHJ, Cg-C^ maščobnimi kislinskimi derivati aminov (npr. Cg-C^ CONH-NH₂), C_g-C₂₄ maščobnimi alkoholnimi derivati amino kislin (npr. Cg-C^ OOC-NH₂), in Cg-C^ maščobnimi kislinskimi estri aminov (npr. Cg-C^ COO-NH₂).

Fotopolimerizibilni lipidi in/ali maščobne kisline (ali amini) (npr. diacetilenske maščobne kisline) so tudi lahko vključeni, ki lahko zagotovijo zaprt liposom s premreženimi membranskimi dvoplastmi po fotoiniciaciji polimerizacije.

Dolgoverižne alifatske in/ali aromatske kisline ali amini vključujejo kislino ali amin, ki ima strukturo z odprto verigo in sestoji iz parafina, olefina in acetilenskih ogljikovodikov in njihovih derivatov, npr. nasičenih in nenasičenih ogljikovodikov ali ogrodje take verige vsebuje aromatski substituent. Take kisline in amini imajo lahko več kot eno takšno funkcijo. Izraz dolga veriga pomeni, da ogrodje alifatske verige kisline ali amina vsebuje 10 ali več atomov ogljika. Če veriga vsebuje aromatsko skupino, kot npr. fenil, veriga obsega ogrodje iz vsaj petih atomov ogljika, spojeno z aromatsko skupino. Veriga atomov ogljika v ogrodju je lahko različno substituirana z nasičenimi ali nenasičenimi alifatskimi ali aromatskimi funkcijami.

Izraza kislina ali amin pomenita običajno definirane kemijske funkcionalosti. Npr. kislinska funkcija je lahko karboksilatna ali izpeljana iz fosforja ali žvepla, kot npr. fosfat, fosfit ali pirofosfat ali sulfat, sulfit, tiosulfat ali podobno sestavljena kislina na osnovi fosforja ali žvepla. Amini morajo biti dovolj bazični, tako da imajo vodik, ki se da ionizirati oz. sposobni tvorbe kvaternih soli, ki imajo takšno ionizacijsko konstanto, da lahko tvorijo potrebni hidratni kompleks.

Kot uporabljamo v vakcinskem sestavku in glede na uporabljeno količino vode v liposomskem sestavku, se izraz trdne snovi nanaša na snovi, ki tvorijo liposom in kislinsko ali aminsko komponento, hidratacijska sredstva, 3D-MPL, aluminij in izbrano antigensko snov, ki jo je treba zakapsulirati.

Za namene v smislu izuma hidratacijsko sredstvo pomeni spojino z vsaj dvema skupinama, ki se dasta ionizirati, prednostno nasprotnega naboja, pri čemer je ena zmožna tvorbe ionske soli, ki lahko disociira, pri čemer sol lahko tvori kompleks z ionsko funkcionalnostjo kisline ali amina v snovi, ki tvori liposom. Hidratacijsko sredstvo samo po sebi ne tvori liposomov. Tako sredstvo je tudi fiziološko sprejemljivo, t.j. nima nobenih neugodnih ali škodljivih fizioloških učinkov na gostitelja, kateremu ga damo v zvezi z njegovo uporabo v smislu izuma.

Prednostna hidratacijska sredstva so alfa amino kisline z omega substitucijo, ki se da ionizirati, kot so npr. karboksilatna, amino in gvanidino funkcija in spojine predstavljene s formulo:

x-(CH₂)„-Y i kjer je

X H₂N-C(NH)-NH-, H₂N-, ZO₃S-, Z₂O₃P-, ali ZO₂Ckjer je Z H ali anorganski ali organski kation;

Y je -CHCNH^-CC^H, -NH₂-NH-C(NH)-NH₂-COOH, CH(NH₂)SO₃Z ali ZH(NH₂)PO₃Z₂, kjer je Z definiran zgoraj; in je n celo število 1-10; ali njihove farmacevtsko sprejemljive soli.

Na seznamu prednostnih spojin so tudi Ν,Ν’-dialkil substituirane argininske spojine in podobne spojine, kjer dolžina alkilne verige variira. Bolj prednostna hidratacijska sredstva so omega substituirane alfa amino kisline, kot npr. arginin, njegovi N-acilni derivati, homoarginin, gama-aminomaslena kislina, asparagin, lizin, ornitin, glutaminska kislina, asparaginska kislina ali spojine, predstavljene z naslednjimi formulami:

H₂NC(NH)-NH-(CH₂)_n-CH-(NH₂)COOH II

H₂N-(CH₂)_n-CH(NH₂)COOH III

HzN-tCH^-CNHz) IV

H₂NC(NH)-NH-(CH₂)_n-NH-CH(NH)-(NH₂) V

HOOC-(CH₂)_n-CH(NH₂)COOH VI

HOOC-(CH₂)_n-COOH VII

HO₃SC-(CH₂)_n-CH(NH₂)COOH VIII

H₂o₃s-(CH₂)_n-CH(NH₂)cooH IX

HO₃S-(CH₂)_n-CH(NH₂)SO₃H X

H₂O₃S-(CH₂)_n-CH(NH₂)PO₃H₂ XI kjer je n 2-4.

Najbolj prednostne spojine so arginin, homoarginin, gamaaminomaslena kislina, lizin, ornitin, glutaminska kislina ali asparginska kislina. Hidratacijska sredstva v smislu izuma lahko uporabimo sama ali kot zmes. Pri uporabi zmesi teh hidratacijskih snovi niso vključene ali mišljene nobene omejitve.

Hidratacijska sredstva v smislu izuma so navedena v katalogu mnogih kemijskih proizvajalcev, ki jih tudi običajno izdelujejo ali jih lahko naredimo po postopkih, znanih v tehniki. Arginin, homoarginin, lizin, glutaminsko kislino, asparaginsko kislino in druge naravne amino kisline lahko dobimo s hidrolizo proteina in ločenjem individualnih amino kislin, ali iz bakterijskih virov.

Spojine s formulo II lahko naredimo po postopku Eisele, K. et al, Justusliebigs, Ann. Chem., str. 2033 (1975). Nadaljnje informacije raznih reprezentativnih primerov teh spojin so na voljo v Chemical Abstracts Service pod štev. kot sledi: nonarginin, CAS #14191-90-3; arginin, CAS #74-79-3; in homoarginin CAS #151-86-5. Za reprezentativne primere s formulo III glej za 2,4-diaminobutanojsko kislino CAS #305-62-4 in za lizin CAS #56-87-1. Postopki za izdelavo reprezentativnih spojin s formulo IV so na voljo iz Chemical Abstracts, kot sledi.: etandiamin, CAS #305-62-4; propan diamin-54618-94-9; in 1,4-diaminobutan, CAS #52165-57-8. Glej posebno Johnson, T.B., J. am. Chem. Soc., 38:1854 (1916).

Od spojin s formulo VI je glutaminska kislina dobro znana v tehniki in je na voljo iz mnogih komercialnih virov. Opisi za izdelavo drugih reprezentativnih spojin so vsebovani v literaturi, npr.: 2-aminoheksanojska kislina - CAS #62787-49-9 in

2- aminoheptandiojska kislina - CAS #32224-51-0. Glutaminska kislina, spojina s formulo VII, kjer je n 2, je dobro znana v tehniki in jo lahko naredimo po postopku Maryel and Tuley, Org. Syn., 5:69 (1925). Druge reprezentativne spojine v tej skupini lahko naredimo po postopkih, na katere se sklicujemo z naslednjimi CAS številkami: heksadiojska kislina, CAS #123-04-9 in heptadiojska kislina, CAS #111-16-0. Homocisteinska kislina je znana v tehniki z referenco CAS #56892-03-6. Spojina

3- sulfovalin je opisana v literaturi z referenco CAS #23405-34-2.

Zmesi hidratacijskega sredstva, snovi, ki tvori liposom in diskretnih količin vode tvorijo maso, podobno gelu. Kadar so v tej obliki gela, se hidratacijsko sredstvo in kis17 lina ali amin skupaj s snovmi, ki tvorijo liposom, razporedijo v hidratni kompleks, ki je visoko urejen tekoči kristal. Hidratni kompeks pomeni kompleks, ki nastane med hidratacijskim sredstvom, kislino ali aminom, v snovi, ki tvori liposom. Kompleksiranje v tej zvezi pomeni tvorbo disociativnih ionskih soli, kjer ena funkcionalnost asociira z ionsko fukcionalnostjo snovi ki tvori liposom in ima druga funkcionalnost hidrofilne lastnosti, ki dajo vodotopnost nastalemu kompleksu. Medtem ko struktura tekočega kristala hidratnega kompleksa vaiira s pH in količino hidratacijskega sredstva, se struktura tekočega kristala ohrani. NMR spektroskopija potrjuje, da ta kristalna struktura sestoji iz več lamelnih lipidnih dvoplasti in hidrofilnih plasti, ki so izmenično zložene skupaj. Iz ³¹P-NMR spektra je razviden anizotropičen vrh, ki potrjuje eksistenco večlamelnih dvoplasti.

Čeprav so primarne komponente teh liposomov lipidi, fosfolipidi in druge maščobne kisline, pa lahko dodamo tudi razne drugi komponente, da modificiramo liposomsko permeabilnost. Dodamo lahko npr. neionske lipidne komponente, kot npr. polioksi alkoholne spojine, poligiceridne spojine ali estre poliolov, polioksialkolinolirane alkohole; estre poliolov in sintetične lipolipide, kot so cerebrozidi. Druge snovi, kot npr. dolgoverižne alkohole in diole, dolgoverižne amine in njihove kvaterne amonijeve derivate; polioksietilenirane maščobne amine, estre dolgoverižnih amino alkoholov in njihove soli in kvaterne amonijeve derivate; fosforjeve estre maščobnih alkoholov, polipeptide in proteine.

Sestavek liposoma lahko naredimo iz več kot ene komponente raznih vrst lipidov, maščobnih kislin, alkil aminov ipd., in hidratacijskih sredstev.

Če ima lipidna komponenta sama ali antigenski material ali katerikoli drugi material, ki ga je treba dodati vakcinskemu sestavku za zakapsuliranje, pred tem omenjene lastnosti, potem v lipidni sestavek ni potrebno vključiti maščobnih kislin (ali aminov) ali hidratacijskih sredstev, da nastane predliposomski gel ali liposomi. Npr. zmes dipalmitoilfosfatidilholina (DPPC) in disteroil fosfatidiletanolamina tvori predliposomski gel oz. liposome z vodno raztopino lutaminske kisline, zmes DPPC ter oljne kisline, pa tvori predliposomski gel in liposome z vodno raztopino epinefrina.

Kot adjuvantimo snov za uporabo v vakcinskem sestavku, liposomski pripravek prednostno vključuje fosfolipide, oljno kislino (ali fosfatidil-etanolamin) in arginin ali lizin (ali glutaminsko kislino in/ali asparaginsko kislino).

Približno 1:20 molsko razmerje hidratacijskega sredstva glede na snov, ki tvori liposom, zagotovi ugodne učinke v smislu izuma, z omejitvijo navzgor približno 1:0,05. Prednostno koncentracijsko območje za hidratacijsko sredstvo je molsko razmerje hidratacijskega sredstva glede na snov, ki tvori liposom med 1:2 do 1:0,5.

Smotrno, torej preferenčno, če liposome pripravimo z dolgoverižno alifatsko ali aromatsko kislino, prednostno uporabimo hidratacijska sredstva, ki vsebujejo vsaj en dušik, ki se da ionizirati, kot npr. arginin, homoarginin, lizin, ornitin ipd. Obratno, če uporabimo amfifatične snovi za tvorbo liposomov, ki vsebujejo dolgo verižne alifatske ali aromatske amine, je prednostno,da uporabimo dikislino, kot npr. glutaminsko kislino, asparaginsko kislino; katerokoli od alkilnih dikislin, kot npr. enostavne dikisline, kot npr. valeriansko kislino, kaprilno, kapronsko, kaprinsko ipd.; ali tiste dikisline, ki imajo dve fosfatni ali sulfatni funkcionalnosti; ali tiste dikisline z mešanimi -COOH/-SO₃H ali -COOH/-PO₃H₂ funkcijami.

Določene alifatske in aromatske kisline in amini so prednostni pri uporabi v smislu izuma. Take spojine imajo lahko mnogoterne funkcije, pri čemer imajo dve ali več kislinski ali aminski skupini ali njihove kombinacije. Npr. uporabimo lahko dikislino, diamin ali spojino s kislinsko in aminsko funkcijo. Prednostne spojine so tiste z eno ali dvema kislinskima ali aminskima funkcijama. Bolj prednostne so maščobne mono kisline z 10 do 20 ogljiki, nasičene in nenasičene. Najbolj prednostne so alkilne in alkenilne kisline z 10 do 20 atomi ogljika, posebno oljna kislina.

Zmesi snovi, ki tvorijo liposom, dolgoverižna alifatska ali aromatska kislina ali amin, eden ali več hidratacijskih sredstev z do 300 mol vode glede na celotno količino trdne snovi, z izbrano količino antigenske snovi ali brez, proizvedejo gel iz katerega nastanejo liposomi direktno po dodatku vodne raztopine. Ta gel lahko označimo kot predliposomski gel, ker so njegove strukturne lastnosti v bistvu takšne, kot jih imajo liposomi in je sposoben, da ga pretvorimo v liposome po razredčitvi z vodno raztopino. Vodna raztopina v prebitku približno 300 mol ekvivalentov povzroči začetek tvorbe liposoma.

Struktura tega gela je visoko urejen tekoči kristal, ki tvori optično bistro raztopino. X,

Y in Z dimenzije tekočega kristala variirajo s koncentracijami hidratacijskega sredstva pri konstantni pH kot tudi s pH raztopine. Z variiranjem koncentracije hidratacijskega sredstva pri konstantnem pH ali spreminjanjem pH, medtem ko vzdržujemo konstanten odstotek hidratacijskega sredstva, lahko kontroliramo velikost in število lamelnih struktur lipidne dvoplasti kasnejših liposomskih veziklov.

Sama gelna struktura je prilagojena za približno 300 mol vode na mol trdne snovi, ne da bi to motilo njeno stabilnost. Struktura gela, kot jo določimo s protonsko jedrsko magnetno resonančno spektroskopijo (NMR), obsega večlamelne lipidne dvoplasti in hidrofilne plasti, izmenično zložene skupaj. Iz ³¹P-NMR spektra tega gela je razviden anizotropičen vrh, kar nadalje potrjuje, da gel sestoji iz več lamelnih dvoplasti. Ta gel lahko avtoklaviramo, kar je prikladen način sterilizacije. Poleg tega pri gelu ne opazimo nobene spremembe barve in ostane bister pri sobni temperaturi vsaj eno leto po avtoklaviranju. Če je želeno in izvedljivo, gel lahko v danem primeru nadalje steriliziramo s filtracijo skozi ustrezne sterilizacijske filtre. Po dispergiranju gela v vodni raztopini so liposomi učinkoviti in spontano proizvedeni.

Predliposomski gel s 3D-MPL ali brez in antigensko snov za zakapsuliranje lahko tudi dehidratiziramo (npr. liofiliziramo) in prašek ponovno hidratiziramo, da nastanejo liposomi, spontano, celo po daljši periodi shranjevanja. Ta sposobnost zagotavlja vakcinske sestavke posebno uporabne za dajanje vodno občutljivih antigenskih snovi, kjer je potrebno dolgotrajno predhodno shranjevanje.

Predliposomski gel pripravimo kot sledi. Poltrden tekoč kristalni gel, na katerega se sklicujemo tukaj kot na predlipsomski gel, pripravimo s kombiniranjem treh osnovnih sestavin: fosfolipida, maščobne kisline in hidratacijskega sredstva v vodi. Odvisno od potrebne lipidne sestave lahko uporabimo fosfolipide ali njihove zmesi, ki spadajo v isto vrsto glede temperature prehoda (Tm) gel-tekočina. Maščobno kislino lahko izberemo glede na stopnjo nasičenja ali dolžino verige in jo navadno zmešamo s fosfolipidom v gosto pasto. Holesterol lahko dodamo k lipidni zmesi za kontrolo dvoplastnega značaja. (Holesterol v nekaterih primerih povečuje Tm membrane in s tem vpliva na njeno permeabilnost za vključena sredstva).

Hidratacijsko sredstvo, prednostno alfa amino kislina, kot npr. arginin, dodamo lipidni zmesi kot raztopino v vodi, počasi, da dobimo homogeno pasto. Za eno od želenih formulacij uporabimo jajčni fosfatidilni holimoljno kislino v molskem razmerju 1:1,2. Arginin dodamo v vodi pri približno 1:1,2 molskem razmerju fosfolipida proti argininu.

Koncentracija L-arginina v komponenti vodne faze gela vpliva na premer stabilnih liposomskih delcev, ki eventualno nastanejo. Velikost delcev je odvisna od načina dajanja in od tega, če je željeno ciljanje makrofagnih celic. Npr. za oralno dajanje je želena velikost liposomskih delcev med približno 1 in približno 5 μτη. Za ciljanje limfocitov je prednostna velikost delcev med približno 200 do 500 nm. Za depojski učinek je želena velikost liposomskih delcev med približno 5 do približno 10 μτη. Razne velikosti delcev strokovnjak z lahkoto testira in izbere.

Končni predliposomski gel lahko vsebuje od približno 65 do približno 70 mas.% vode, ima gostoto mazila in izgleda kot značilen tekoči kristal, če ga opazujemo pod polarizirajočim svetlobnim mikroskopom. Predliposomski gel lahko shranimo ob inertni atmosferi ali ga liofiliziramo do suhega praška za shranjevanje daljše časovno obdobje.

Pri tvorbi vakcinskih sestavkov v smislu izuma sledimo enakim stopnjam liposomske priprave z dodatkom imunološko učinkovite količine izbranega antigena, npr. antigenskega polipeptida, zlasti flu D proteina in 3D-MPL in v danem primeru enega ali več dodatnih imunogenskih proteinov, peptidov ali fragmentov iz izbranega patogena zmešanih z liposomskim pripravkom.

Da pripravimo take vakcinske sestavke izbrani antigen zakapsuliramo ali interkaliramo v liposomski pripravek tako da ga z njim zmešamo.

Obstajata dva postopka, s katerim lahko 3D-MPL in izbrani antigen vgradimo v liposomski sestavek, da pripravimo vakcinski sestavek v skladu s predloženim izumom. En postopek vključuje vgradnjo antigena v liposome s hidratacijo predliposomskega gela ali hidratacijo liofiliziranega praška z raztopino antigena v ustreznem pufru. Drug postopek vključuje fizično zmešanje predliposomskega gela z liofiliziranim pripravkom antigena. To zmes nato hidratiziramo, kar povzroči spontano tvorbo liposomov.

Izbran postopek je tisti, ki ima za posledico največjo stopnjo asociacije antigenliposom z najmanjšo izgubo antigena kot neasociirane frakcije in je odvisen od fizikalno kemijskih lastnosti antigena v prisotnosti lipida. Na splošno je razmerje komponent v taki vakcinski zmesi 20 mg antigenskega proteina: 2 mg 3D-MPL: 300 mg liposomskega gela. Npr. če je antigen flu D, potem uporabimo drugi postopek, ker ima antigen precej hidroben značaj in nizko topnost v vodi in kot je opisano spodaj, da tvorimo flu D sestavek v smislu izuma 300 mg predliposomskega gela zmešamo z 20 do 30 mg flu D proteina in 0,5 do 2 mg 3D-MPL.

Smatramo, da strokovnjak glede na tukajšnje napotke z lahkoto določi izbrano količino antigenske snovi za uporabo v tega izuma v praksi.

V danem primeru lahko dodamo druga sredstva sovključena v izbran antigen, npr. flu D protein in 3D-MPL v liposomskem sestavku. Prikladna druga sredstva so opisana zgoraj.

Potem, ko se tvorijo liposomi v prisotnosti 3D-MPL, izbranega antigena in katerekoli v danem primeru, dodatne komponente, katerikoli neasociiran antigen lahko odstranimo na razne načine. Značilno liposome centrifugiramo serijsko pri približno 100 000 g in supernatante zavržemo. Končni liposomski pelet rekonstituiramo v sprejemljivi tekočini, 5% dekstrozi, normalni fiziološki raztopini ali pufmi raztopini, za injekcijo pri želeni koncentraciji lipida ali antigena. Za odstranitev neasociiranega antigena lahko uporabimo tudi druge postopke, znane strokovnjakom, kot npr. gelno filtracijo ali dializo.

Opis izbranega antigena, 3D-MPL in liposomske formulacije obsega tudi uporabo razcepljenih virusov opisanih tukaj namesto ali poleg flu D.

Predloženi izum zagotavlja tudi postopek za povečevanje imunskega odziva, posebno odziva, posredovanega s celicami T pri ljudeh ali drugih sesalcih, za izbrani antigen v vakcinskem sestavku. Ta postopek vključuje dajanje človeku ali drugemu sesalcu vakcinski sestavek v smislu izuma, ki vsebuje 3D-MPL in izbran antigen. V danem primeru je liposomski pripravek lahko del sestavka, kot je opisano zgoraj. Ta postopek ni omejen na noben poseben antigen ponazorjen tukaj. V prednostni izvedbi je postopek uporaben za izzvanje povečane zaščite učinkovite proti influenčni infekciji. V tej izvedbi vakcinski sestavek obsega učinkovito količino flu D in 3DMPL, kot je opisano zgoraj. V drugi izvedbi vakcinski sestavek obsega učinkovito količino enega ali več razcepljenih virusov influence in 3D-MPL, kot je opisano zgoraj. Druge vakcine lahko pripravimo in damo v učinkovitih količinah na podoben način.

Kot je prikazano s primeri, posebno primeri 25-30 ima vakcinski sestavek, v katerem so uporabljeni razcepljeni virusi, adjuvantirani s 3D-MPL za posledico superiorno virusno čiščenje posebno v pljučih, stimulacijo višjih nevtralizirajočih protitelesnih titrov; pojav heterosubtipične (HjN₂) navzkržne reaktivnosti v odsotnosti nevtralizajoče aktivnosti; in spremenjeno progresijo bolezni od zgodnjega do spodnjega respiratornega traka (čez trahejo).

Predpisi za doziranje in dajanje so lahko optimizirani v skladu s standardno prakso vakciniranja za te vakcinske sestavke. Značilno vakcine dajemo intramuskularno, čeprav so drugi načini dajanja tudi uporabni kot npr. subkutano, v črevo, oralno, pulmunalno, intradermalno, intraperitonealno ali intravenozno. Način, ki ga izberemo, je lahko določen s tipom želenega imunskega odziva. Npr. subkutani način lahko zagotovi klasičen depojski učinek ali bolj podaljšano stimulacijo kot drugi. Možno je tudi, da izbran način dajanja lahko generira močnejše protitelesne odzive kot celične odzive ali obratno. Npr. oralen način dajanja lahko dopušča generiranje povečanega IgA odziva, kije koristen za lokalno imunost.

Glede na to, kar je znano o drugih polipeptidnih vakcinah, pričakujemo koristno posamezno doziranje za ljudi povprečne starosti influenčne antigenske polipeptidne vakcine, kot npr. vakcine v smislu izuma, ki vsebuje flu D protein, v območju med približno 1 do približno 1000 gg D proteina, prednostno približno 50 do približno 500 gg in najbolj prednostno približno 100 gg, pomešano s prikladnimi količinami 3DMPL adjuvanta. Če uporabimo te doze flu D proteina so količine 3D-MPL v vakcinskem sestavku med približno 1 do približno 500 gg 3D-MPL/gg virusnega proteina, bolj prednostno približno 10 do približno 50 gg 3D-MPL/gg virusnega proteina in najbolj prednostno približno 50 gg 3D-MPL.

Če flu D in 3D-MPL damo z liposomskih nosilcem, kot je opisano tukaj, je prednostna količina D proteina v vakcinskem sestavku med približno 50 do približno 500 gg in količina 3D-MPL med približno 10 in približno 50 gg. Tak 3D-MPL adjuvantiran flu D vakcinski sestavek vsebuje približno 1 do približno 10 mg in prednostno približno 3 mg liposomske snovi na približno 0,2 mg antigenskega proteina.

Če flu D in 3D-MPL vakcinska formulacija v danem primeru vsebuje drug adjuvant, kot npr. aluminij ali aluminijev hidroksid, je prednostno doziranje D proteina med približno 10 do približno 500 gg proteina; prednostna količina aluminija ali aluminijevega hidroksida je med približno 10 do približno 500 gg.

Podobno glede na to, kar je znano o drugih vakcinah razcepljenega virusa, pričakujemo, da je koristno posamezno doziranje, za ljudi povprečne starosti, influenčnih monovalentnih ali multivalentnih vakcin razcepljenega virusa, kot npr. tistih, opisanih tukaj, približno 15 μ% hemaglutinina (HA) na sev, s celotnim proteinom, ki je v območju od približno 80-300 μ-g/ml, v zmesi s prikladnimi količinami 3D-MPL adjuvanta. Če uporabimo te doze razcepljenega virusa je količina 3D-MPL v vakcinskem sestavku prednostno 50 μ§ 3D-MPL na dozo. Seveda lahko strokovnjaki te količine virusnega proteina in 3D-MPL spreminjajo.

Če enega ali več razcepljenih virusov in 3D-MPL damo z liposomskim nosilcem kot je opisano tukaj, je prednostna količina vsakega razcepljenega virusa v vakcinskem sestavku možno manjša kot približno 15 /xg Ha/sev in količina 3D-MPL je med približno 10 in približno 50 μ%. Tak vakcinski sestavek influenČnega razcepljenega virusa adjuvantiranega s 3D-MPL vsebuje približno 1 do približno 10 mg in prednostno približno 3 mg liposomske snovi na približno 0,2 mg virusnega proteina.

Kadar vakcinska formulacija razcepljenega virusa in 3D-MPL v danem primeru vsebuje drug adjuvant, kot npr. aluminij ali aluminijev hidroksid, je prednostno doziranje vsakega razcepljenega virusa v vakcinskem sestavku naravnano navzdol. Prednostna količina aluminija ali aluminijevega hidroksida je podobna tisti, opisani zgoraj za antigenski polipeptid.

Katerokoli vakcino, opisano s tem izumom, lahko damo (prednostno v 0,5 ml dozirnih enotah) na začetku poznega poletja ali zgodnje jeseni in jo lahko ponovno damo 2 do 6 tednov kasneje, če je potrebno, ali periodično, ko imunost upade, npr. vsaki dve do pet let.

Naslednji primeri ponazorjujejo prednostne postopke za pripravo vakcinskih sestavkov v smislu izuma. Ti primeri so samo za ponazoritev in ne omejujejo obsega izuma.

Primer ί - priprava gela

3,0 g dipalmitoilfosfatidilholina zatehtamo v 50 ml čašo. Dodamo 1,2 g oljne kisline in mešamo skupaj, da nastane enakomerna pasta.

K pasti dipalmitoilfosfatidil-holinoljne kisline dodamo 0,72 g arginina v 30 ml destilirane deionizirane vode in segrejemo na 45°C. Z ročnim mešanjem zmes tvori bister stabilen gel. Gel shranimo in kasneje tvorimo liposome z razredčenjem gela s fosfatno puferno fiziološko raztopino.

Primer 2 - priprava liposomov

120 mg dipalmitoilfosfatidilholina in 24 mg oljne kisline damo skupaj in temeljito mešamo, da nastane bela homogena pasta.

Nato 20 mg arginina raztopimo v 60 ml fosfatne pufme fiziološke raztopine (ionska jakost = 0,15, pH = 7,4). Raztopino arginina - fiziološke raztopine dodamo k pasti in segrevamo pri 40°C pol ure ali dokler ne opazimo rahlo motne raztopine.

Primer 3 - priprava gela in liposoma v velikem obsegu

i) Izdelava gela: k 50 g jajčnega fosfatidnega praška tipa 20 (Asahi Chemicals) dodamo 20 g oljne kisline N.F. Z mešanjem dobimo belo pasto, ki jo ohladimo na 4°C in zmeljemo v fin prašek. Ta prašek dodamo k vodni raztopini, ki vsebuje 20 g arginina in 500 g destilirane deionizirane vode. Zmes mešamo z lopatico da se raztopina segreje na približno 35°C, da pripomoremo hidrataciji fosfolipidov. Nastane homogen, rahlo rumen gel. Ta gel nato avtoklaviramo in shranimo pri 4°C ali pa ga lahko zamrznemo in kasneje rekonstituiramo.

ii) Izdelava liposomov: gel pripravljen po postopku, opisanem v prejšnjem odstavku, v hladnem odvzamemo in segrejemo na sobno temperaturo. Le-to nato zmešamo z 2 1 fosfatne pufrne fiziološke raztopine, pH 7,4. Nastane bela motna liposomska raztopina.

Primer 4 - tvorba liposoma iz gela

Tvorimo homogeno pasto iz 1,0 g dipalmitoilfosfatidilholina (DPPC) in 400 mg oljne kisline. Nato 300 mg arginna zmešamo v 10 ml fosfatne pufrne fiziološke raztopine, segrejemo na 45°C in dodamo k pasti DPPC/oljne kisline, da nastanejo liposomi.

Primer 5 - predliposomski gel g dipalmitoilfosfatidilholina (DPPL) zmešamo s 400 mg oljne kisline, da nastane homogena pasta. 300 mg arginina zmešamo z 2 ml vode pri 45°C, dokler se ne raztopi. Argininsko raztopino zmešamo s pasto DPPC/oljne kisline pri približno 45°C, da dobimo gosti gel. Liposomi nastanejo, ko ta gel razredčimo s fosfatno pufrno fiziološko raztopino.

Primer 6 - različne liposomske formulacije

A. Liposomi, ki vsebujejo holesterol mg holesterola zmešamo s 100 mg dipalmitoilfosfatidilholina (DPPC), da nastane homogen prašek. Nato k prašku dodamo 23 mg oljne kisline in temeljito mešamo, da nastane homogena pasta. Da naredimo liposome, dodamo 30 mg arginina k 10 ml fosfatne pufrne fiziološke raztopine, segrejemo na 40°C in dodamo k pasti DPPC/holesterola/oljne kisline. Kombinacijo mešamo pri 40°C, da dobimo liposome.

B. Liposomi, ki vsebujejo palmitinsko kislino

250 mg dipalmitoilfosfatidilholina (DPPC) zmešamo s 25 mg palmi tinske kisline, da nastane enakomeren prašek. Nato 80 mg oljne kisline zmešamo s tem praškom in segrevamo pri 45°C med konstantnim mešanjem, dokler ne nastane enakomerna pasta. 100 mg arginina raztopimo v 25 ml destilirane deionizirane vode in segrejemo na 45°C. Raztopino arginina dodamo k pasti pri 45°C in mešamo dokler ne nastane enakomeren homogen gel. Gel razredčimo z 10-kratno količino fosfatne pufrne fiziološke raztopine, da nastanejo liposomi.

C. Liposomi, ki vsebujejo izostearinsko kislino

100 mg dipalmitoilfosfatidilholina zmešamo s 50 mg izostearinske kisline, da nastane enakomerno homogena pasta. Naredimo argininsko raztopino 50 mg arginina v 2,0 mg destilirane deionizirane vode in dodamo k pasti izostearinske kisline in segrevamo pri 45°C. To zmes mešamo dokler ne nastane bister gel. Liposomi nas26 tanejo po razredčitvi s fosfatno pufrno fiziološko raztopino.

D. Liposomi, ki vsebujejo oleoil treonin

125 mg dipalmitoilfosfatidilholina in 75 mg oleoil treonina damo skupaj in segrevamo pri 40°C, da nastane pasta. Nato dodamo med konstantnim mešanjem pri 40°C 2 ml destilirane deionizirane vode. Nastane bister gel, ki ga lahko razredčimo s fosfatno pufrno fiziološko raztopino pri pH 5, da nastanejo liposomi.

E. Liposomi, ki vsebujejo miristil amin

192 mg dipalmitoilfosfatidilholina dodamo k 72 mg miristil amina in segrevamo med konstantnim mešanjem, da nastane enakomerna pasta. Pasti dodamo 65 mg glutaminske kisline v 5 ml destilirane deionizirane vode in segrevamo, dokler ne nastane gel. K gelu dodamo fosfatno pufrno fiziološko raztopino, da nastanejo liposomi.

F. Liposomi, ki vsebujejo DLPC mg dilavrilfosfatidilholina (DLPC) zmešamo z 20 mg oljne kisline, da nastane homogena pasta. 20 mg arginina dodamo k 10 ml fosfatne pufme fiziološke raztopine, dodamo k pasti in ročno mešamo dokler ne nastane motna liposomska raztopina.

G. Liposomi fosfatidiletanolamin-glutaminske kisline mg L-glutaminske kisline raztopimo v 2,0 ml destilirane deionizirane vode in pH naravnamo na 5,2 z 1,0 N natrijevim hidroksidom. To raztopino segrejemo na 60°C in dodamo 100 mg fosfatidiletanolamina. Raztopino vzdržujemo pri 60°C med konstantnim mešanjem, dokler ne opazimo enakomerno viskoznega gela.

Gel fosfatidiletanolamin-glutaminske kisline razredčimo z 1/10 fosfatne pufme fiziološke raztopine. Strukture, podobne veziklom opazimo pod fazno kontrastnim svetlobnim mikroskopom.

Primer 7 - Učinek koncentracije arginina na velikost liposoma

K 502 mg dipalmitoilfosfatidilholina (DPPC) dodamo 10 μ.1 (2-palmitoil-l-C₁₄) (0,1 mCi/ml) dipalmitoilfosfatidilholina. Dodamo kloroform, da povzročimo popolno mešanje radioaktivnosti in nato uparimo. 195 mg oljne kisline (OA) nato zmešamo v lipid, da nastane pasta. Dodamo 5 ml destilirane vode, ki vsebuje 119 mg arginina in mešamo pri 45°C, da nastane bister gel.

g gela zatehtamo v štiri različne fiole in dodamo arginin, kot je prikazano v naslednji tabeli 1.

Tabela 1

Sestava vzorca

Vzorec ID DPPC:OA:Arg fiola 1 + 1 ml vode (1^;1:1) fiola 2 + 1 ml mg/ml Arg v H₂O (1:1:3) fiola 3 + 1 ml mg/ml Arg v H₂O (1:1:5) fiola 4 + 1 ml

192 mg/ml Arg v H₂O (1:1:10)

Pol grama vsake raztopine razredčimo v 50 ml fosfatne pufme fiziološke raztopine s pH 7,8.

Ocenjene povprečne premere dobimo s kromatografsko analizo na Sephracyl S-1000 koloni, pri čemer uporabimo DPPC zaznamovan s ₁₄C-izotopom (t.j. premere določimo na osnovi intenzitete sipanja z uporabo fotonske korelacijske spektroskopije (PCS)). Učinki so navedeni v nasledji tabeli 2.

Tabela 2

Učinki koncentracije arginina na velikost vezikla

Sistem	Razmerje	PH	Ocenjeni premer (nm)
DPPC:OA:Arg	1:1:1	7,8	-220
DPPC:OA:Arg	1:1:3	7,8	-140
ΔΠΠΧ:ΟΑ:Αργ	1:1:3	7,8	-90
DPPC:OA:Arg	1:1:10	7,8	-20

Primer 8 - učinek pH na velikost vezikla

Dodatno tega lahko velikost vezikla variiramo s spreminjamem pH vodne pufrne raztopine.

K 100 mg dipalmitoilfosfatidilholina (DPPC) dodamo 25 μΐ (2-palmitoil-l-C₁₄) (0,1 mCi/ml) dipalmitoilfosfatidilholina. Dodamo kloroform, da povzročimo popolno mešanje radioaktivnosti in nato uparimo. 40,1 mg oljne kisline (OA) nato zmešamo v lipid, da nastane pasta. 1 ml raztopine, ki vsebuje 24 mg/ml arginina v vodi, dodamo k lipidni zmesi in mešamo pri 45°C, da nastane bister gel.

Dva 100 mg alikvota tega gela razredčimo v 10 ml fosfatnega pufra pri pH 9,0 oz. 7,4.

Ocenjene povprečne premere dobimo s kromatografsko analizo na Sephracyl S-1000 koloni, pri čemer uporabimo dipalmitoilfosfatidilholin, zanamovan s ₁₄C-izotopom. Rezultati so navedeni v nasledji tabeli 3.

Tabela 3

Učinki pH na velikost vezikla

Sistem	Razmerje	PH	Ocenjen premer (nm)
DPPC:OA:Arg	1:1:1	7,4	— <300
DPPC:OA:Arg	1:1:1	7,8	-220
DPPC:OA:Arg	1:1:1	9,0	-25,4

Torej želene velikosti liposomskih veziklov lahko pripravimo z variiranjem argininske koncentracije ali pH vodne pufrne raztopine.

Primer 9 - liposomska stabilnost

Sterilne liposome lahko pripravimo iz toplotno steriliziranih predliposomskih gelov. Alternativno liposomski gel ali liposome lahko sterilno filtriramo skozi ustrezen sterilizacijski filter.

Liposome, pripravljene iz DPPC:OA:Arg (1:1:2) pri pH 8,0 toplotno steriliziramo in shranimo pri sobni temperaturi približno 1 leto brez dodatka antimikrobnih sredstev in antioksidantov. Ne opazimo nobene bakterijske rasti, spremembe barve in obar29 janja. Negativna barvna elektronska mikroskopska raziskava eno leto starih liposomov razkriva, da so liposomski vezikli stabilni.

Primer 10 - saharozna latenca

Latenco zakapsulirane saharoze izmerimo z uporabo C₁₄-saharoze, zakapsulirane z DPPC:OA:Arg (1:1:1) liposomskim sistemom v vodni fosfatni pufrni raztopini pri pH 7,8. Rezultati so predstavljeni v naslednji tabeli 4.

Tabela 4

Dnevi % saharozne latence 100

97.4

93.4

91.4

Predloženi liposomski sistem ima odlično latenco za dajanje zdravila.

Primer 11 - liofilizirani liposomi

30,0 g oljne kisline in 7,5 g holesterola U.S.P. zmešamo. Nato 75,0 g fosfatidnega praška tipa 20 (Asahi Chemical Co.) mešamo z zmesjo oljne kisline/holesterola, dokler ne dobimo homogene paste.

Nato 15,0 arginina (prosta baza) raztopimo v 183 g destilirane, deionizirane vode. To raztopino arginina počasi mešamo z lipidno pasto, da dobimo homogeni gel. Gelu naravnamo pH na 7,4 z uporabo 5,0 N HCl.

10,0 g alikvot tega predliposomskega gela prenesemo v 10 ml fiolo in jo liofiliziramo. Nastali prašek tvori liposome, če ga razredčimo s 5 ml fosfatne pufrne fiziološke raztopine.

Primer 12 - konstrukcija flu D ekspresijskih plazmidov

Plazmid PaPR701 je iz pBR322-izpeljan klonirni vektor, ki nosi kodirna področja za

Ml in M2 virusne proteine influence (A/PR/8/34). To opisujejo Young et al, v The

Origin of Pandemic Influenza Viruses, 1983, izdaj. W. G. Laver, Elsevier Science Publishing Co.

Plazmid pAPR801 je iz pBR322 izpeljan klonimi vektor, ki nosi NS1 kodirno področje (A/PR/8/34). To opisujejo Young et al, citirano zgoraj.

Plazmid pASl je iz pBR322 izpeljan ekspresijski vektor, ki vsebuje P_L promotor, N uporabljivo mesto (za sproščanje transkripcijskih polaritetnih učinkov v prisotnosti N proteina) in cll ribosomsko vezavno mesto, vključno cll translacijski iniciacijski kodon, čemur takoj sledi BamHI mesto. To opisujejo Rosenberg et al, Methods Enzymol., 101:123-138(1983).

Plazmid pASldeltaEH pripravimo z delecijo nebistvenega EcoRI-Hindlll področja pBR322 začetka iz pASl. 1236 bazni par BamHI fragmenta pAPR801, ki vsebuje NS1 kodirno področje v 861 baznih parih virusnega začetka in 375 baznih parih pBR322 začetka vključimo v BamHI mesto pASldeltaEH. Nastali plazmid pASldeltaEH/801 izraža avtentičen NS1 (230 amino kislin). Ta plazmid ima Ncol mesto med kodoni za amino kisline 81 in 82 in Nrul mesto 3’ za NS sekvence. BamHI mesto med amino kislinama 1 in 2 je ohranjeno.

Plazmid pASlAEH/801 odrežemo z Bglll, končno dopolnimo z DNA polimerazo I (DNApolI; Klenow) in ligiramo zaprto in s tem eliminiramo Bglll mesto. Nastali plazmid pBgl' razgradimo z Ncol, končno dopolnimo z DNA poli (Klenow) in ligiramo na Bglll linker. Nastali plazmid pB4 vsebuje Bglll mesto v NS1 kodirnem področju. Plazmid pB4 razgradimo z Bglll in ligiramo na sinetični DNA linker kot je opisano v primeru 4 EP 0366238.

Nastali plazmid pB4+ dopušča insercijo DNA fragmentov v linker po kodirnem področju za prvih 81 amino kislin NS1, čemur sledijo terminacijski kodoni v vseh treh bralnih okvirih. Plazmid pB4+ razgradimo z Xmal (odrezano v linkerju), končno dopolnimo (Klenow) in ligiramo na 520 bazni par PvuII/Hindlll, končno dopolnjen fragment izpeljan iz HA2 kodirnega področja. Nastali plazmid pD kodira za protein, ki obsega prvih 81 amino kislin NS1, tri amino kisline, izpeljane iz sintetičnega DNA linkerja (Gln-Ile-Pro), čemur sledijo amino kisline 65-222 HA2, kot je prikazano na sl. 2 objavljene evropske patentne prijave št. 366,238.

Da olajšamo plazmidno selekcijo v produkciji fermentacij, BamHI fragment, izpeljan iz pD ekspresijskega plazmida, ki kodira rekombinantni flu D protein, ligiramo v BamHI mesto pASl plazmidnega derivata, ki vsebuje kanamicinski rezistenten gen iz Tn903 za selekcijo [Berg et al, Microbiology, izd. D. Schlessinger, str. 13-15, American Society for Microbiology (Washington, DC 1978); Nomura et al, The Single-Stranded DNA Phages, izd. D. Denhardt et al, str. 467-472, Cold Spring Harbor Laboratory (New York 1978); Castellazzi et al, Molecul. Gen. Genet., 117:211218 (1982)]. To rezultira v vektorju pC₁₃(H₆₅_₂₂₂)Kn.

Kot opisujejo Shatzman and Rosenberg, Meth. Enzymol., 152:661-673 (1987), pOTS207 je iz pAS izpeljan klonimi vektor, ki nosi kanamicinski rezistenten gen iz Tn903 [Berg, citirano zgoraj; Nomura, citirano zgoraj; Castellazzi, citirano zgoraj]. Tega konstruiramo z razgradnjo plazmida pUC8 [Yanisch-Perron et al, Gene, 33:103-119 (1985)], z BamHI in ligiranjem na Bell fragment, ki vsebuje kanamicinski gen iz Tn903. Nastali plazmid pUC8-Kan razgradimo z Ecorl in Pstl in fragment, ki vsebuje kanamicinski gen vključimo med EcoRI in Pstl mesti pOTSV [Shatzman and Rosenberg, citirano zgoraj]. Nastali plazmid je pOTS207.

520 bp fragment, ki kodira HA2 kodimo-sekvenco izoliramo iz pJZ102 [iz pBR322 izpeljan klonirni vektor, ki nosi kodirno področje za celoten HA protein (A/PR/8/34) (opisujejo Young et al, The Origin of Pandemic Influenza Viruses, izd. W.G. Laver, Elsevier Science Publishing Co. (1983)] in vključimo v pB4+, ki je bil odrezan z Xmal in končno dopolnjen. Nastali plazmid pC₁₃(H₆₅_₂₂₂)Kn razgradimo z BamHI in fragment, ki kodira flu D protein izoliran iz tega fragmenta nato ligiramo v BamHI mesto pOTS207, da proizvedemo plazmid pC₁₃(H₆₅_₂₂₂)Kn [SmithKline Beecham].

Sekvenco kanamicinskega rezistentnega C₁₃(H_{65 222})Knplazmida izpeljemo naslednje: nukleotidne lege 1-31, 3136-3964, 4021-4343, 4533-7166 izpeljemo iz pBR322 [Young et al, citirano zgoraj]; nukleotidne lege 32-1879, 4344-4532 izpeljemo iz λ faga, nukleotidne lege 1880-2122, 2682-3135 izpeljemo iz NS1 gena, nukleotidne lege 2123-2132, 2660-2681 izpeljemo iz sintetičnega linkerja, nukleotidne lege 2133-2659 izpeljemo iz HA2 gena, nukleotidne lege 3965-4020 izpeljemo iz pCV_] polilinkerja, in nukleotidne lege 7167-8601 izpeljemo iz pUCKanl2 (Tn903:KN_r). DNA sekvenco kodirnega področja za flu D proteinski derivat potrdimo z dideoksi verižnim terminacijskim postopkom sekvenciranja DNA [Sanger et al, Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 74:5463-5467 (1977)].

Ta C₁₃(H_{65 222})Kn plazmid je v bistvu enak kot plazmidi, ki so opisani v U. S. patentni prijavi ser.št. 07/387,200, ki je istočasno v postopku, njeni ustrezni objavljeni EPA št. 366,238 in U. S. patentni prijavi ser.št. 07/387,558, ki je istočasno v postopku, njeni ustrezni objavljeni EPA št. 366,239 razen da /3-laktamski marker odstranimo in nadomestimo s kanamicinskim markerjem. Zgornje prijave so vključene za referenco za njihov opis drugih ustreznih vektorjev.

pC₁₃(H_{65 222})Kn plazmid transformiramo v E. coli ekspresijski sev AR58 [SmithKline Beecham]; in produkcijo flu D proteina potrdimo z imunoprepivno analizo [Towbin et al, Proč. Natl. Acad. Sci. ZDA, 76:4350 (1979)], ki razkriva glavne imunoreaktivne vrste z napovedanimi molskimi masami 27,7 kD.

Primer 13 - čiščenje D proteina

NSi₁^₁-HA2_{65 222} ali D protein (m.m. 27,7 kD) očistimo kot je podrobno opisano v objavljeni evropski patentni prijavi št. 366,239, ki ustreza U.S. patentni prijavi ser.št. 07/387,558.

Po indukciji sinteze D proteina s katerimkoli E. coli gostiteljskim sevom AR58 [SmithKline Beecham] z uporabo pC₁₃(H₆₅_₂₂₂)Kn sistema, opisanega v primeru 12, bakterijske celice zberemo s centrifugiranjem in zamrznemo pri -70°C do uporabe. Ta pelet odtajamo in resuspendiramo v 50 mM Trisu, 2 mM EDTA, 0,1 mM ditiotreitola (DTT), 5% glicerolu pri pH 8. Nastalo suspenzijo obdelujemo z lizozimom (končna koncentracija vsaj približno 0,2 mg/ml) približno 1 uro pri sobnih pogojih.

Suspenzijo nato liziramo na Manton Gaulinovem homogenizatorju [APV Gaulin, Inc., Everet, Massachusetts pri 5,4xlO¹⁰ Pa v dveh prehodih. Nastalo suspenzijo obdelamo s Tritonom Χ-100 (1% končna koncentracija) in deoksiholatom (DOC; 0,1% končna koncentracija). Pelet, ki vsebuje D protein, suspendiramo v 50 mM GlyNaOH pufru, ki vsebuje 2 mM EDTA in 5% glicerol pri pH 10,5 z uporabo Turkovega homogenizatorja. Dobljeno suspenzijo po dodatku Tritona Χ-100 (1% končna koncentracija) mešamo približno 1 uro v hladni sobi pri 4°C in nato centrifugiramo. Pelet, ki vsebuje D protein, raztapljamo v 8 M sečnini, 50 mM Trisu pri pH 8,0 preko noči pri 4°C. Supernatant vsebuje D protein.

Ta supernatant po dodatku DTT (do 50 mM končna koncentracija) mešamo pri sobnih pogojih približno 1 uro in nato napolnimo na dolono DEAE hitro pretočno

Sepharose [Pharmacia] kolono, uravnoteženo z 8M sečnino in 50 mM Tris pufra pri pH 8. D protein eluiramo z 0 do 0,3 M NaCl gradientom (preko pet kolonskih volumnov ali več) v uravnoteženem pufru.

Frakcije, ki vsebujejo D protein, koncentriramo na Minisette tangencialnem pretočnem aparatu [Pharmacia], obdelamo z 10 mg SDS na mg proteina, DTT [Sigma] (do končne koncentracije 50 mM) in mešamo pri sobni temperaturi približno 1,5 ure.

Nastalo raztopino napolnimo v kolono Superose-12 [Pharmacia], uravnoteženo s 25 mM Tris-Glycin pufrom pri pH 8,6, ki vsebuje 1% SDS. D protein eluiramo pri njegovi napovedani monomerni molekulski masi v izokratičnem gradientu uravnoteženega pufra. Frakcije, ki vsebujejo D protein ustrezne čistote zberemo, koncentriramo, obdelamo z 10 mg SDS na mg proteina in DTT (do 50 mM končna koncentracija), nato kromatografiramo na koloni Superozni-12 pri enakih pogojih, kot so bili opisani tik pred tem.

Frakcije, ki vsebujejo D protein najvišje čistote zberemo, koncentriramo in damo v prečiščevalno kolono G25 Sephadex [Pharmacia], uravnoteženo s 50 mM Tris pufrom pri 8,0, ki vsebujejo 8 M sečnino. D protein eluiramo izokratično z uravnoteževalnim pufrom in frakcije, ki vsebujejo D protein brez SDS zberemo in koncentriramo. Ta visoko očiščen vzorec D proteina nato koncentriramo, dializiramo proti 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 in sterilno filtriramo.

Primer 14 - vrednotenje Flu D vakcinskih sestavkov

Podrobni opisi D proteina in postopkov, uporabljenih za in vitro poskuse celic T in študiji zaščite, so opisani v S. B. Dillon et al, Vaccine, 10:309 (1992), vključeni tukaj z referenco.

CTL in proliferacijske teste izvedemo kot je opisano pred tem [S. B. Dillon et al, citirano zgoraj]. IL-2 izmerimo na IL-2 odvisni CTL liniji (CTLL) in IFN-γ izmerimo s komercialnim ELISA kompletom.

Vakcinske sestavke v smislu izuma, ki vsebujejo s Superoso očiščen D protein (primer 13) v adjuvantu aluminijevem hidroksidu, z ali bez 3D-MPL, pripravimo naslednje: 3D-MPL (RIBI Immunochemical, Hamilton, MT) rekonstituiramo v sterilni vodi za injekcijo na delujočo koncentracijo 1 mg/ml. To izhodno osnovno raztopino sonificiramo 30 minut in kasnejše razredčenine, narejene v 5% dekstrozi, sonificiramo dodatnih 10 minut pred dodatkom zmesi D proteina v aluminijevem hidroksidu, pripravljeni kot je opisano pred tem [Dillon et al, Vaccine, 10(5):309-318 (1992)].

Antigenske doze titriramo iz 0,01, 0,1,1,0,10, 20 in 100 jug doze injekcije; in 3D-MPL doze titriramo iz 0,025, 0,25, 2,5, 25 in 50 /tg doze injekcije. Razmerje 3DMPL:antigenu vzdržujemo pri 2,5:1 (mas/mas) za vse antigenske doze razen za 100 /tg dozo, kot je prikazano v tabeli 5 spodaj. Aluminijevega hidroksida je 100 /tg na dozo v vseh primerih. Kontrolni vakcinski sestavek vsebuje 20 /tg antigena mešanega s CFA, kot je opisnao v Dillon et al, Vaccine, 10(5):309-318 (1992). Končni injekcijski volumni so 0,2 ml na miš.

Za te študije zaščite miši (CB6Fp 11-2^) injiciramo subkutano z izbrano vakcinsko dozo na teden 0 in 3 in izzovemo intranazalno (pod anestezijo z metofanom) na teden 7 z 2 do 5 LD_S0 dozama A/Puerto Rico/8/34 [A/PR/8/34 (influenca tipa A, H1N1)] virusa.

Podrobni opisi postopkov, uporabljenih za študije zaščite, so opisani v S. Dillon et al, Vaccine, 10(5): 309-318 (1992), ki so vključeni tukaj z referenco. Odstotek preživetja na dan 21 po izzivu primerjamo med skupinami z Fischerjevim ekzaktnim verjetnostnim testom.

Tabela 5

Antigenska	3D-MPL	% preživetja
doza (Mg)	doza (Mg)	(dan 21)
100	50	27
100	0	53+
20	50	86+,++
20	0	40**
10	25	67+
10	0	4θ**
1,0	2,5	80+-++
1,0	0	7
0,1	0,25	20
0,1	0	20
0,01	0,025	20
0,01	0	13
0,0	50	13
0,0	0	0

⁺ p < 0,003 proti adjuvantni kontroli **p < 0,01 proti adjuvantni kontroli **p < 0,01 proti aluminijevi formulaciji pri enaki antigenski dozi

Iz rezultatov tabele 5 je razvidno, da se minimalna doza flu D antigena potrebna za znatno zaščito pred letalnim izzvom zniža iz 10 jug (samo z aluminijem) na 1 Mg, & j^e 3D-MPL vključen v vakcinski sestavek. Prav tako odstotek miši, ki preživijo iziv naraste, če 20 Mg (p - 0,01), 10 Mg (p 0,05; NS) in 1 Mg (p - 0,01) antigenske doze damo s 3D-MPL kot tudi aluminij proti aluminiju samem v vakcinskem sestavku. Preživetje v CFA kontrolni skupini pri 20 Mg antigena je 73% v tem poskusu.

Primer 15 - vrednotenje flu D vakcinskih sestavkov

Ta poskus izvedemo v bistvu tako, kot je opisano v primeru 14 zgoraj, razen da doze 3D-MPL titriramo in damo bodisi same z minimalno učinkovito dozo flu D antigena (1 μ%) in aluminijevega adjuvanta (100 μ-g) ali s flu D antigenom (10 μ%) in aluminijevim adjuvantom (100 /xg). Iz rezultatov, navedenih v tabeli 6, je razvidno, da je mininalna učinkovita doza 3D-MPL 2 μ-g.

Tabela 6

Antigenska doza (μ-g) 3D-MPL doza (p,g) % preživetja (dan 21)

10	10	80+
10	2,0	73+
10	0,4	53+
10	0,0	53*
1	10	80+,++
1	2,0	87+-++
1	0,4	33*
1	0,0	33
0	10	0
0	2,0	0
0	0,4	0
0	0,0	7

⁺ p < 0,001 proti adjuvantni kontroli *p < 0,02 proti adjuvantni kontroli ⁺⁺p < 0,01 proti aluminijevi formulaciji pri enaki antigenski dozi.

Primer 16 - Vrednotenje flu D vakcinskih sestavkov

V tem poskusu učinkovitost liposomov in 3D-MPL primerjamo z liposomi (lipo) brez

3D-MPL (Ribi Immunochem] in z A1(OH)₃ ali CFA z določevanjem nivoja zaščite, kije viden po izzivu z 2,10 ali 50 LD₅₀ dozami virusa. Vakcine, ki so uporabljene, so enake kot v tabeli 9 spodaj.

Miši injiciramo na teden 0 in 3 in izzovemo z A/PR/8/34 na teden 7. Preživetje je prikazano v tabeli 7 spodaj na dan 21.

Tabela 7 % preživetja

Antigen	Doza (Mg)	Adjuvant	izzivna doza (LD50)
2	10	50
D protein	50	Lipo	53	53b	7
	0	Lipo	27	0	0
D protein	50	Lipo/3D-MPLa	100b	73b-c	47b-c
	0	Lipo/3D-MPL	13	0	0
D protein	50	Al3+	86b	20	13
	0	Al3+	7	13	0
D protein	50	CFA	86b	80b,c	13
	0	CFA	33	0	0

^a Količina 3D-MPL na liposom ni določena.

^b p < 0,003 proti adjuvantni kontroli ^c p < 0,003 proti formulaciji aluminijevega hidroksida pri enaki antigenski dozi.

Iz rezultatov je razvidno, da znatno zaščito proti 50 LD₅₀ izzivu dosežemo le z liposomsko /3D-MPL formulacijo in z nobeno drugo testirano adjuvantno formulacijo (tabela 7). Znatno zaščito dosežemo proti 2 LD₅₀ izzivu z vsemi formulacijami in vse formulacije razen aluminija so protektivne proti 10 LD₅₀ izzivni dozi. Zato D protein v 3D-MPL/liposomski formulaciji sestavlja vakcino s celo večjo učinkovitostjo kot D protein v CFA, ki je klasičen adjuvant za vzpodbujanje odziva celic T, vendar ni primeren za uporabo pri ljudeh.

Primer 17 - vrednotenje flu D vakcinskih sestavkov

V tem poskusu vrednotimo vakcinski sestavek v smislu izuma, ki vsebuje flu D protein, 3D-MPL in liposome v primerjavi z vakcinskim sestavkom, ki vsebuje flu D,

3D-MPL in aluminijev adjuvant. Izmerimo dejansko količino 3D-MPL, vgrajenega v liposome.

Flu D protein (očiščen na koloni s Superoso) v 25 mM Trisu/1 mM EDTA, pH 8, pri celotni proteinski koncentraciji 2,49 mg/ml dializiramo proti 20 mM amonijevemu bikarbonatu s pH 8 in liofiliziramo v prašek v 20 mg alikvotih.

Jajčne fosfatide (Asahi tip 5) in oljno kislino (Sigma) zmešamo v molskem razmerju približno 1:1,2. L-arginin (prosta baza), 0,38 M v vodi dodamo (1:1) molsko razmerje fosfatid: arginin) k fosfatidni/maščobni kislinski zmesi in mešamo, da nastane gladek in homogen gel. Ta gel je predliposomski gel.

Liofiliziran protein združimo s predliposomskim gelom (0,06-0,08 protein/gel (mas/mas) razmerje) in mešamo pri sobni temperaturi, da nastane homogena pasta. Monofosforilni lipid A (Ribi/Immunochem) dodamo pri razmerju 1 μ,πιοί lipida A proti 66 μηιοί fosfatidov. To je transparenten brezbarven sistem, ki je sestavljen iz struktur nanodelcev (po premeru submikroni) agregiranih 3D-MPL monomerov. Nastalo liposomsko suspenzijo nadalje razredčimo s 25 mM Tris/1 mM EDTA, pH 8,0 pufrom in homogeniziramo. Liposomski pripravek nato serijsko centrifugiramo (3x), da odstranimo nevgrajen protein in 3D-MPL. Vsakič pelet resuspendiramo s tris/EDTA pufrom. Končno liposomsko suspenzijo analiziramo in hranimo pod duškom pri 5°C do uporabe.

Liposome nato testiramo, da določimo vsebnost proteina z modificiranim Loweryjevim kolorimetričnim testom, fosfolipidno koncentracijo z Bartlettovim testom [Bartlett, G. R., J. Biol.m Chem., 234:466-468 (1959)] in velikost liposoma s fotonsko korelacijsko spektroskopijo [Malvem model 4700]. Vse teste izvedemo s standardnimi tehnikami. Liposomov nismo analizirali za vsebnost lipida A, vendar se zdi, da ves od lipid A ostane v končni liposomski frakciji.

V naslednji tabeli 8, D protein LA in kontrolo LA-I pripravimo z vgradnjo trdnega lipida A v lipidno fazo. Kontrolo LA-II pripravimo s hidratacijo z raztopino lipida A za vgradnjo.

Tabela 8

Liposomski vzorec	Fosfolipid (μιηοΐ/ml)	Protein (mg/ml)	3D-MPL (/ig/ml)	premer ZAvg povprečni (nm)
kontrola	4,37	ni določeno	ni določeno	200,8
kontrola+ 3D-MPL	7,87	0,02	ni določeno	201,3
Flu D	21,8	4,89	ni detektirano	487,0
FluD+ 3D-MPL	14,8	4,06	270	502,4

Miši imuniziramo subkutano z 0,2 ml formulacije antigena/nosilec/3D-MPL na teden 0 in 3 in izzovemo intranazalno na teden 7 s 5 LD₅₀ A/PR/8/34 virusom. Nosilec je bodisi aluminijev hidroksid (Al) ali liposomi (Upo). Preživetje zasledujemo 21 dni. Ti rezultati so prikazani v tabeli 9 spodaj. Če ni drugače navedeno je vrednost p merilo proti 3D-MPL kontroli.

Tabela 9

Antigenska doza	Nosilec	Doza 3D-MPL	% preživetja	p vrednost
1,0 M-g	Al	-	33	0,084
1,0 Mg		2,5 gg	80	0,000/0,0013
1,0 gg	Al	-	33	0,084
0,1 gg		2,5 gg	93	0,000/0,0013
Ogg	Al	2,5 gg	7	-
0,1 gg	Lipo	-	73	0,001
1,0 gg		0,05 gg	80	0,000
0,1 gg	Lipo	-	46	0,054
0,1 gg		0,005 gg	87	0,000/0,0203
Ogg	Lipo	0,05 gg	13	-

³ p vrednost proti homologni dozi brez 3D-MPL.

Iz teh podatkov je razvidno, da z uporabo liposomov kot nosilcev, potrebno dozo 3D-MPL (0,005 - 0,05 gg) lahko dramatično znižamo proti količini, potrebni z aluminijem (približno 2 gg). (Glej tudi tabelo 6 zgoraj).

Primer 18 - Vrednotenje vakcinskega sestavka

CB6F₁ (12 na skupino) injiciramo subkutano na teden 0 in 3 z vakcinskim sestavkom, ki vsebuje 100 gg flu D v aluminiju (100 gg) in 3D-MPL (10 gg). Na teden 7 miši izzovemo s 3-5 LD₅₀ dozami virusov, prikazanih na sl. 1. Preživetje zasledujemo 21 dni po izzivu.

Iz rezultatov na sl. 1 je razvidno, da je antigenska specifičnost vakcine ekvivalentna tisti, prikazani preje z Al⁺³ adjuvantom [S. B. Dillon et al, citirano zgoraj] (t.j.

navkrižno protektiven tako za HI kot tudi za H2 podtipe, vendar pomanjkanje učinkovitosti za H3 ali tip B). Preživetje je tudi večje v vakcinirani skupini, izzvani s heterolognim H1N1 virusom, A/Tai/86, čeprav rezultati niso signifikantni, p < 0,09. (glej sl. 1).

Primer 19 - Vrednotenje Flu D vakcinskega sestavka

CB6F_X miši injiciramo subkutano (sc) z vakcinskim sestavkom, ki vsebuje 1 ptg D proteina v aluminiju (100 μ-g) in 3D-MPL (2,5 μ-g) ali samo z aluminijem na teden 0 in 3.18 miši izzovemo na teden 7 s 5 LD₅₀ dozami A/PR/8/34 virusa. 5 miši usmrtimo na dan 7 po izzivu za pljučne titre. (Smrt v kontrolnih skupinah na dan 7 je 60% za A1/3D-MPL in 40% za CFA). Vranice odstranimo dvem mišim v skupini pred izzivom in trem mišim v skupini na dan 6 po izzivu za proliferacijo in citokinske teste (tabela 15 spodaj). Iz tabele 10 je razvidno preživetje (n = 10 /skupino) in čiščenje pljučnega virusa (n=5/skupino) po 5 LD₅₀ izzivu. Pljučni virusni titer, zabeležen na dan 7, je naveden v četrti koloni tabele 10.

Iz rezultatov v tabeli 10 je razvidno, da je znižanje pljučnih virusnih titrov v miših zaradi 5 LD₅₀ izziva večjega obsega z 3D-MPL proti CFA (2,4 log_w proti 0,9 log₁₀), čeprav je preživetje ekvivalentno v teh skupinah.

Tabela 10

Antigen (μ-g) Adjuvant	Preživetje	log10 TCIDS0/pljuča
1,0	A1/3D-MPL	86% *	4,41 ± 0,83+
0	A1/3D-MPL	0%	6,80 ± 0,45
ι,θ	Al	33%	6,39 ± 0,41+
0	Al	0%	7,39 ± 0,41
1,0	CFA	86%**	6,00 ± 0,50++
0	CFA	26%	6,90 ± 0,72

* p < 0,001 proti adjuvantni kontrolni skupini **p < 0,01 proti adjuvantni kontrolni skupini ⁺ p < 0,003 proti adjuvantni kontrolni skupini ⁺⁺ p < 0,03 proti adjuvantni kontrolni skupini,

Primer 20 - vrednotenje flu D vakcinskega sestavka

Da določimo, če je proliferacija vraničnih celic T, yIFN produkcija soodnosna z zaščito, te odzive zasledujemo v vranicah miši, imuniziranih z 1 ju,g D proteina v Al proti A1/3D-MPL (2,5 ng 3D-MPL) adjuvanti (iz študija, prikazanega v tabeli 10) pred in po izzivu. Na teden 7 dve miši usmrtimo 6 dni po virusnem izzivu. Vranico sokultiviramo z D proteinom in pulziramo s ³H-timidinom na dan 3. Kulture supernatantov požanjemo 8 ur kasneje.

Celotni proliferativni vranični odzivi so podobni pred in po izzivu za skupine, vakcinirane bodisi z D proteinom v Al ali A1/3D-MPL formulaciji (maksimalni cpm v nestimuliranih kulturah je 2750 cpm) (sl. 3). Obseg proliferativnih odzivov je tudi podoben tako za adjuvantno skupino z maksimalnim stimulacijskim indeksom, ki je enak 3,0 ali nižjim (sl. 2). Nivoje gama interferona pred izzivom v kulturah supernatantov, stimuliranih z antigenom, so samo skromno (približno 2-krat) povečani in dve adjuvantni skupini sta ekvivalentni, kot je razvidno iz tabele 11.

Vendar je nasprotno produkcija gama interferona povečana več kot 7-krat v kulturah, stimuliranih z antigenom pri A1/3D-MPL skupino po izzivu; medtem ko nivoji po izzivu niso narasli v skupini, vakcinirani samo z Al⁺³ (tabela 11). Iz teh rezultatov je torej evidentno, da je produkcija gama interferona soodnosna z znižanimi pljučnimi titri in preživetjem po izzivu in nadalje je iz teh rezultatov razvidno, da proliferacija celic T sama po sebi ne reflektira razlike med dvema adjuvantnima skupinama.

Tabela 11 ng/ml IFN-gama

antigen	injekcija doza	adjuvant	pg/ml in vitro	pred izzivom	PO izzivu
D	1 P9	Al+3/3D-MPL	0	<0,9	<0,9
			1	1,0	>7,0
			10	1,8	>7,0
-	-	Al+3/3D-MPL	0	<0,9	<0,9
			1	<0,9	1,0
			10	0,94	<0,9
D	i pg	Al	0	<0,9	<0,9
			1	1,9	1,0
			10	1,9	1,0
-	-	Al	0	<0,9	1,2
			1	<0,9	1,7
			10	1,1	1,0

Primer 21 - vrednotenje flu D vakcinskega sestavka

Za nadaljnjo raziskavo vloge CD4⁺ celic primerjamo proliferacijo, specifično za antigen in produkcijo citokina v miših, vakciniranih z vakcinskimi sestavki, ki vsebujejo flu D in aluminijev adjuvant (Al) proti vakcinskim sestavkom, ki vsebujejo flu D in A1/3D-MPL formulacije.

Bezgavke miši, katerim smo dali enojno injekcijo 1,5 ali 20 /xg D proteina v A1/3DMPL (razmerje 3D-MPL:antigenu je 2,5:1 mas/mas) ali Al⁺ adjuvantu (100 μ-g) 7 dni preje kultuviramo z 0-30 mg/ml očiščenega D proteina.

Rezultati so prikazani na sl. 3 in 4. Proliferacija je jasno povečana v skupinah, ki so prejele A1/3D-MPL adjuvant in razlika je največja pri najnižji in vivo antigenski dozi (1 μ-g). Na sl. 3 je prikazana maksimalna cpm v nestimuliranih kulturah, ki je enaka

1368 cpm. Na sl. 4 je razvidna maksimalna cpm v nestimuliranih kulturah, kije enaka

1600 cpm; in maksimalna cpm CTLL (IL-2 odvisna CTL linija) celic, kultiviranih s supernatanti iz nestimuliranih kultur enakih 195 cpm). Vrh (48 ur) IL-2 aktivnosti je večji v skupinah, vakciniranih z A1/3D-MPL formulacijami, čeprav so nivoji na splošno nižji v vseh kulturah (sl. 4).

Iz tabele 12 so razvidni rezultati analize interferona gama v supernatantih iz enakih kultur, stimuliranih z antigenom. Nivoji interferona v supernatantih iz adjuvantnih kontrolnih kultur so vsi < 1 ng/ml. Interferon gama izmerimo z Gibco-BRL ELISA kompletom. Ta citokin, kije najvišji na dan 4 kulture, je do 5-krat večji v A1/3D-MPL skupini.

Tabela 12 μ% antigena antigen IFN-gama (ng/ml)

(in vivo)	adjuvant (Aig/ml)	in vitro	dan 2	dan 3	dan 4
1,0	Al+	0	<1	<1	<1
		1	<1	<1	<1
		10	<1	<1	<1,1
1,0	A1/3D-MPL	0	<1	<1	<1
		1	<1	<1	1,9
		10	1,1	2,9	4,9

Rezultati iz tabel 11 in 12 v celoti podpirajo vlogo interferona gama v mehanizmu delovanja MPL adjuvanta.

Primer 22 - vrednotenje flu D vakcinskega sestavka

Ker je iz gornjih primerov razvidno, da 3D-MPL izboljša učinkovitost vakcine, smo naredili študijo, da bi določili, če je vzpodbujevalna (booster) injekcija potrebna za zaščito. Miši vakciniramo s posamezno sc injekcijo 50 μ-g D in izzovemo 7 tednov kasneje z 2 LD₅₀ A/PR/8/34. Alternativno drugi skupini damo booster injekcijo z enako antigensko dozo pri 3 tednih. 3D-MPL doza je 125 μ%. Flu D je adjuvantiran bodisi z aluminijevim hidroksidom, aluminijem in 3D-MPL ali CFA. Izvedemo kontrole za vsak adjuvant.

Iz rezultatov v tabeli 13 spodaj (prikazano v primeru 23) je razvidno, da vgradnja 3D-MPL (125 Mg) v vakcinsko formulacijo s 50 Mg antigena znatno poveča preživetje v miših, katerim smo dali bodisi eno ali dve injekciji, če primerjamo z enako dozo vakcinskega proteina, adsorbiranega na aluminiju. Ponovno je preživetje v Al/MPL skupini primerljivo s tistim, vidnim v CFA.

Primer 23 - testi citotoksičnih limfocitov T

Podrobni opisi postopkov, uporabljenih za in vitro teste celic T so opisani v S. Dillon et al, citirano zgoraj. Testi za detektiranje spominskih celic CTL izvedemo po drugi in vitro stimulaciji z virusom, kot je opisano pred tem [glej F. Ennis et al, Lancet, 11:887-891 (1981); A. Yamada et al, J. Exp. Med., 162:663-674 (1985); in K. Kuwono et al, J. Exp. Med., 169:1361-1371 (1989)]. Na kratko, vranične celice ali celice bezgavk od imunih ali kontrolnih miši kultiviramo v razmerju 6:1 s singenskimi vraničnimi celicami, inficiranimi z virusom influence 5 dni. Medij kulture je RPMI 1640, dopolnjen z 10% fetalnim telečjim serumom [Hyclone Laboratories, Logan, UT], 2 mM glutamin, 5 χ 10'⁵ M 2-ME, 10 mM HEPES, penicilin in streptomicin.

Vranice miši, ki smo jim dali eno ali dve sc injekciji 50 Mg deproteina (teden 0 in 3) odstranimo sedmi teden in restimuliramo in vitro, kot je opisano zgoraj. Ena litična enota (LU₃₅) je definirana kot število efektorskih celic v testu sproščanja kroma, potrebnih za 35% lizo (določeno z regresijsko analizo). V tabeli 13 so navedeni rezultati CTL aktivnosti, specifičnih za H1N1 v teh vranicah miši, imuniziranih s SK&F 106160 (D protein) v aluminijevem hidroksidu in 3D-MPL.

Tabela 13

LU₃₅ na kulturo

	kontrolni	A/PR/8/34	A/Taiwan/86	% preživetja
# injekcije:	cilji 1	2	1	cilji 2	1	cilji 2	1	2
Formulacija
D/A1+3*	<1	19	53	56	51	69	7	33
D/A1+3	<1	<1	41	43	64	53	40+-++	73+,++
/3D-MPL* D/CFA*	<1	<1	129	88	98	131	53+,++	93+>++
Al+3	<1	<1	<1	<1	35	35	N.D.	7
Al+3/3D-MPL	18	18	<1	<1	29	29	N.D.	0
CFA	<1	<1	<1	<1	<1	<1	N.D.	0

* = antigenska doza je 50 gg flu D proteina.

⁺ = p < 0,05 proti adjuvantni kontrolni skupini *+ = p < 0,05 proti ΑΓ³ adjuvantni skupini.

V poskusih tega primera 3D-MPL ne vpliva na spominske CD8+ CTL restringirane na razred I glede na odziv, generiran z aluminijevim hidroksidom (prikazano kot Al⁺³), kot je navedeno v tabeli 13. Poleg tega je iz rezultatov v tabeli 13 razvidno, da so vranični CTL primerljivi pri miših, ki smo jim dah 1 proti 2 sc injekciji, medtem ko je zaščita jasno izboljšana v miših, ki smo jim dali drugo injekcijo.

Zaradi tega smatramo, da mora biti mehanizem, drugačen kot CD8+ CTL odgovoren za izboljšano imunost, ki jo dobimo, če je 3D-MPL vključen v vakcinski sestavek, ki vsebuje antigenski peptid in aluminijev adjuvant ah če mišim damo booster injekcijo.

Primer 24 - študije deplecije

Za nadaljnje določevanje kateri podset cehe T je najbolje v soodnosu z aktivnostjo s

3D-MPL adjuvanta, smo naredili študije deplecije z anti-CD-4 ali anti-CD-8 monoklonskimi protitelesi (Mabs). Začetni študij smo izvedli z uporabo predpisa povakciniranja za deplecijo podseta celic T kot sledi. Miši (15/skupino) smo imunizirali z dvema subkutanima injekcijama 50 /tg flu D (SK&F 106160) v A1/3D-MPL na dan 0 in 21 in izzvali s 5 LD₅₀ dozami A/R/8/34 na dan 42. Protitelesa (300 /tg/miš) smo dali ip po vakcinaciji na dan 32, 33, 34, 39, 40 in 41 pred izzivom in na dan 43, 48 in 53 po izzivu. V drugi študiji smo miši obdelali z Mabs za deplecijo podseta T celic pred prvo injekcijo vakcine (predpis predvakcinacije) na dan -3, -2, -1. Po vakcinaciji na dan 0 smo miši nadalje obdelali z Mabs na dan 7, 14, 18, 19 in 20 in jim nato dali booster injekcijo z vakcino na dan 21. Miši smo nadalje obdelali z Mabs na dan 28, 35, 39, 40 in 41 pred virusnim izzivom na dan 42. Miši smo nadalje obdelali z Mabs po izzivu na dan 43, 49 in 54. Rezultati eksperimentov deplecije podsetov celic T so prikazani v tabeli 14 spodaj. Iz rezultatov je razvidno, da je učinkovitost vakcinacije znižana, če smo miši depletirali bodisi CD4⁺ ali CD8⁺ podsetov celic T, učinek je bolj izražen, če smo Mab obdelavo začeli pred vakcinacijo. Zato je iz teh rezultatov definitivno razvidno, da je mehanizem delovanja flu D vakcine v Al/MPL formulaciji posredovan s celicami T in sta oba podseta celic T potrebna za učinkovitost.

Ker je produkcija gama interferona soodnosna z zaščito (tabela 11), smo izvedli študijo za določitev fenotipa celice T, odgovorne za produciranje tega citokina v vakciniranih miših. Miši smo depletirali CD4⁺ ali CD8⁺ podsetov celic T z injiciranjem anti-CD4 ali anti-CD8 Mab ip dnevno 3 dni (300 gg/injekcijo). Štiri dni po zadnji Mab injekciji, smo miši imunizirali z 20 gg flu D proteina v aluminijeveim hidroksidu (100 gg) in 3D-MPL (20 gg) formulacijo in bezgavke odstranili 7 dni kasneje. Celice bezgavk smo restimulirali in vitro z 0,1 ali 10 gg/ml D proteina in supernatante zbrali na dan 1-4 za teste interferona in IL-2. Iz rezultatov na sl. 5 je razvidno, da je IL-2 produkcija popolnoma eliminirana z anti-CD4 obdelavo in je tudi delno znižana v anti-CD-8 obdelanih miših (sl. 5B). Vrh IFNy produkcije (dan 4 supernatanti) je znižan za približno 50% v anti-CD4 ali anti-CD8 obdelanih miših (sl. 5C). Torej tako CD4⁺ kot tudi CD8⁺ podseta celic T proizvajata IL-2 in IFNy.

Tabela 14

Antigen (Mg)	3D-MPL (Mg)	Mab obdelava	% preživetja (Mabs po vakcinaciji)	% preživetja (Mabs pred vakcinacijo)
50	10	nobena	70*	80*
50	10	anti-CD4	30	20+
50	10	anti-CD8	50**	0+
50	10	anti-CD4+ anti-CD8	30	10+
0	10	nobena	0	0

* p < 0,002 proti adjuvantni kontroli (skupina 5) so < 0,02 proti adjuvantni kontroli (skupina 5) ⁺ p < 0,01 proti neobdelani kontroli (skupina 1).

Primeri, predstavljeni zgoraj, prikazujejo, da rekombinantna influenčna H1N1 vakcina formulirana z aluminijem in 3D-MPL olajšuje virusno čiščenje in preživetje in zniža antigensko dozo, potrebno za znatno zaščito proti letalnemu izzivu, pri čemer doseže nivo učinkovitosti, ki je ekvivalenten tistemu, ki ga dobimo s CFA. Iz podatkov, zbranih do danes, je evidentno, da mehanizem, s katerim 3D-MPL deluje na povečanje aktivnosti te rekombinantne influenčne vakcine, nastane s selektivno zmožnostjo CD4⁺ T celičnih odzivov in je lahko restringiran na celice tipa TH1, ki proizvajajo IL-2 in IFNy.

Primer 25 - priprava razcepljenega virusa

Razcepljene viruse, kot npr. tiste, ki jih proizvaja Sachsisches Serumwerkl GmbH (SSW) (Dresden, Nemčija), lahko pripravimo z znanimi postopki, kot so tisti, navedeni v European Pharmacopoeia PA/PH/Exp 3 (1992); DAB 10 Vaccines Influenzae ex virorum fragmentis preaparatum in zahtevah za influenčne vakcine (invaktivirane), revidiranih z osnutkom Svetovne zdravstvene organizacije (1990).

Take razcepljene viruse pripravimo z uporabo enega ali več sevov influenčnih virusov, ki jih priporoča WHO in EEC, kot npr. A/Singapur/6/86, A/Beijing/32/92 in B/Panama/45/90. Te seve lahko menjamo, odvisno od tega, kateri so popularni v določenem letu.

Kot je podrobno opisano drugod, influenčne viruse dobimo iz oplojenih kurjih jajc, inokuliranih z zasevnim materialom. Te virusne suspenzije so delno očiščene in koncentrirane. Koncentrirano virusno suspenzijo obdelamo z detergentom, natrijevim dezoksilholatom, da razbijemo (ali razcepimo) virusne delce. Po odstranitvi virusnih fosfolipidov med cepitvenim postopkom se potencial reaktogenosti močno zniža. Suspenzijo razcepljenega virusa popolnoma inaktiviramo s kombiniranim učinkom detergenta in formaldehida.

Bolj podrobno je postopek za izdelavo razcepljenega virusa v smislu izuma naslednji:

A. Priprava monovalentnega popolnega virusnega inokuluma

Na dan inokulacije oplojenih jajc pripravimo svež inokulum z mešanjem influenčno delujočega zasevka s fosfatnim pufrom, ki vsebuje gentamicin sulfat 0,5 mg/ml in hidrokortizon 25 ml/ml. Virusni inokulum vzdržujemo pri 2-8°C.

do 11 dni stara oplojena jajca uporabimo za virusno replikacijo. Jajca inkubiramo na farmah predno prispejo v obrat za izdelavo in pridejo v produkcijske prostore po dekontaminaciji lupin. Jajca inokuliramo z 0,2 ml virusnega inokuluma na napravi za avtomatsko inokulacijo jajc. Inokulum injiciramo pri tlaku ±0,3 MPa. Inokulirana jajca inkubiramo pri ustrezni temperaturi (odvisno od virusnega seva) 50 do 96 ur. Na koncu inkubacijske periode embrije ubijemo z ohlajevanjem jajc in shranjevanjem 12-60 ur pri 2-8°C.

Alantoično tekočino iz ohlajenih oplojenih jajc zberemo z ustrezno napravo za žetje jajc. Navadno lahko zberemo 8 do 10 ml surove alantoične tekočine na jajce. K surovi monovalentni virusni masi dodamo 0,100 mg/ml tiomersala.

Zbrano alantoično tekočino očistimo s pretokom skozi centrifugo z volumnom 100200 1/uro in centrifugalno silo 1-17000 g. To predhodno očiščeno tekočino lahko nadalje očistimo na 6-8 μτη membranskem filtru.

Da dobimo CaHPO₄ gel v očiščenem virusnem poolu dodamo 0,5 M Na₂HPO₄ in 0,5 M CaCl₂ raztopini, da dosežemo končno koncentracijo CaHPO₄ 1,5 g do 3,5 g CaHPO₄/l, odvisno od virusnega seva. Po sedimentiranju vsaj 10 ur supematant odstranimo in sediment, ki vsebuje influenčni virus, resolubiliziramo z dodatkom 0,26 M EDTA raztopine. Koncentracija EDTA variira med 4,5 in 10 g/1 originalnega zbranega volumna.

Resuspendiran sediment filtriramo na 6 do 8 μπι membranskem filtru.

Influenčni virus koncentriramo z izopikničnim centrifugiranjem v linearnem saharoznem gradientu (0-55%) pri 90000 g. Volumski pretok je od 8-12 1/h. Na koncu centrifugiranja vsebnost rotorja rekuperiramo s štirimi različnimi frakcijami (saharozo izmerimo v refraktometru):

- frakcija 1 55-52% saharoze

- frakcija 2 52-38% saharoze

- frakcija 3 38-20% saharoze

- frakcija 4 20-0% saharoze

Za nadaljnjo pripravo vakcine uporabimo samo frakcijo 2 in 3. Frakcijo 3 razredčimo zato, da znižamo vsebnost saharoze na približno 6%. Influenčni virus, prisoten v tej razredčeni frakciji, peletiramo pri 53000 g, da odstranimo topne kontaminante. Pelet resuspendiramo in temeljito zmešamo, da dobimo homogeno suspenzijo. Frakcijo 2 in resuspendiran pelet frakcije 3 združimo v poole in dodamo fosfatni pufer, da dobimo volumen 30 1. V tej stopnji produkt imenujemo monovalententni popolni virusni koncentrat.

B. Monovalentna masa razcepljenega virusa

Izbran influenčni virus prednostno monovalentni popolni virusni koncentrat iz prejšnjega dela A razbijemo s centrifugiranjem pri 70000 g skozi Nadoc linearni saharozni gradient 0-55%, ki vsebuje linearno porazdelitev natrijevega dezoksiholata od 1,2-1,5%. Tweena 80 je 0,1% v gradientu. Virusni koncentrat črpamo s hitrostjo 5 1/h. Na koncu centrifugiranja vsebnost rotorja zberemo v treh različnih frakcijah:

- frakcija: 1 55-40% saharoze

- frakcija: 2 40-13% saharoze

- frakcija: 3 13-0% saharoze

Hemaglutinin je koncentriran v frakciji 2. Fosfatni pufer, ki vsebuje tiomersal 0,01% in Tween 80 0,01% dodamo k razredčini frakciji 4-krat (±51).

Razredčeno frakcijo 2 filtriramo na filtrnih membranah, pri čemer končamo z 0,2 gm membrano. Na koncu filtracije filtre izperemo s fosfatnim pufrom, ki vsebuje 0,01% tiomersala in 0,01% Tweena 80. Rezultat je končni volumen filtrirane frakcije 2, kije 5-kratni volumen originalne frakcije. Odvisno od virusnega seva lahko uvedemo kratko sonifikacijo snovi razcepljenega virusa, da olajšamo sterilno filtracijo.

Filtriran monovalenten razcepljen material inkubiramo pri 22 ± 2°C vsaj 84 ur, da pride do inaktivacije virusov in mikoplazme z učinkom natrijevega dezoksiholata. Po tem inkubacijskem času dodamo fosfatni pufer, ki vsebuje 0,01% tiomersala in 0,01% Tween 80 zato, da privedemo celotno vsebnost proteina pod maksimum 250 gg/ml. Formaldehid dodamo v količini 50 gg/ml in inaktiviranje poteka pri 4°C ± 2°C vsaj 72 ur.

Inaktiviran material razcepljenega virusa ultrafiltriramo na membranah, katerih povprečna velikost por je 20000 daltonov. Med ultrafiltracijo se vsebnost formaldehida, NaDOC in saharoze precej zniža. Volumen ohranimo konstanten med ultrafiltracijo (diafiltracijo) z dodajanjem fosfatnega pufra, ki vsebuje 0,01% tiomersala in 0,01% Tween 80.

Ultrafiltriran razcepljen material filtriramo na membranah, pri čemer končamo z 0,2 gm membrano, odvisno od virusnega seva pa je zadnja filtracijska membrana lahko 0,8 gm. V tej stopnji se produkt imenuje: monovalentna končna masa. Monovalentno končno maso shranimo pri 2-8°C maksimalno 18 mesecev.

Primer 26 - Vakcinski sestavek razcepljenega virusa (a) Priprava MPL z delci velikosti 60 -120 nm.

Vodo za injekcijo injiciramo v fiole, ki vsebujejo liofiliziran 3 deaciliran monofosforilni lipid A (MPL) od Ribi Immunochem, Montana, z uporabo injekcij, da dosežemo koncentracijo 1 do 2 mg na ml. Preliminarno suspenzijo dobimo z vrtinčastim mešanjem. Vsebnost fiol nato prenesemo v 25 ml Corexove cevi z okroglim dnom (10 ml suspenzije na cev) in suspenzijo sonificiramo z uporabo sonifikatorja z vodno kopeljo. Ko suspenzija postane bistra, ocenimo velikost delcev z uporabo dinamičnega svetlobnega sipanja (Malvem Zetasizer 3). Obdelavo nadaljujemo dokler ni velikost MPL delcev v območju 60 - 120 nm in prednostno pod 100 nm.

Suspenzije lahko v nekaterih primerih shranimo pri 4 °C brez znatne agregacije do 5 mesecev. Izotoničen NaCl (0,15M) ali izotoničen NaCl in 10 mM fosfata inducira hitro agregacijo (velikost >3-5/xm).

(b) Vakcinski sestavek razcepljenega virusa v smislu izuma pripravimo naslednje.

Končno pufrno maso pripravimo z dodajanjem vodi za injekcijo koncentriranih raztopin soli: NaCl 4 mg; Na₂HPO₄ 0,52 mg; KH₂PO₄ 0,19 mg; KC1 0,1 mg; in MgCl₂ 0,05 mg in tiomersal 50 /xg. Nastalo raztopino mešamo 15 minut pred nadaljnjo uporabo.

Monovalentno maso razcepljenega virusa (15 /ig HA) nato zmešamo s 3D-MPL 50 /xg in nastalo zmes mešamo približno uro pri sobni temperaturi.

Pufrno zmes in zmes virusne mase nato zmešamo skupaj. Po 30 minutah mešanja pri sobni temperaturi naravnamo pH na 7,15 ± 0,1. Nastalo končno vakcino shranimo pri +2- +8°C.

Da pripravimo multivalentno vakcino razcepljenega virusa, kot npr. trivalentno vakcino, monovalentne razcepljene virusne poole izbranih sevov, pripravljene, kot je opisano zgoraj, zmešamo, da sestavimo končno multivalentno vakcino. Nastali material, združen v poole, mešamo 30 minut pri sobni temperaturi (pH 7,15 ± 0,1). Nastalo končno vakcino lahko shranimo pri temperaturah med približno 2°C do približno 8°C. Vakcina je brezbarvna rahlo opalescenčna vodna suspenzija očiščenega razcepljenega influenČnega virusa.

Za namene primerjave v testih naslednjih primerov, vakcinski pripravek pripravimo brez adjuvanta. Za kontrolno vakcino končno monovalentno pufrno maso pripravimo tako, da vodi za injekcijo dodamo koncentrirane raztopine soh: NaCl 4 mg; Na₂HPO₄ 0,52 mg; KH₂PO₄ 0,19 mg; KC10,1 mg; MgCl₂ 0,05 mg in tiomersal 50 μ-g. Nastalo raztopino mešamo 15 minut pred nadaljnjo uporabo. Zmes mešamo 15 minut pri sobni temperaturi. Dodamo monovalentno maso (15 /ig HA), čemur sledi 30-minutno mešanje pri sobni temperaturi (pH 7,15 ± 0,1). Nastalo končno vakcino shranimo pri temperaturah med +2°C do +8°C.

Dva monovalentna vakcinska sestavka v smislu izuma in monovalentne kontrolne vakcine pripravimo za naslednje primere z uporabo H1N1 sevov, A/PR/8 in Singapura, zmešanega z 3D-MPL 50 gg (velikost delcev <100 nm, kot jih dobimo iz primera 26 (a).

Primer 27 - Letalni izziv v miših

Imunogenost monovalentne vakcinske formulacije v smislu izuma ovrednotimo in primerjamo z imunogenostjo monovalentne neadjuvantirane formule in z adjuvantom 3D-MPL brez antigena v letalnem influenčnem izzivu v miših.

Za vsako vakcino, CB6F₁ miši (30 na skupino) imuniziramo subkutano z 2 injekcijama, ki ju damo v razmaku 3 tednov s pripravkom, ki vsebuje 5 gg naznačenega seva ± 5 gg 3D-MPL. Sedem tednov po prvi injekciji miši intranazalno izzovemo pod anestezijo z metofanom s 5 LD₅₀ A/PR/8. Preživetje in klinične znake bolezni zasledujemo za 15 miši do 3 tednov po izzivu. Pljučne virusne titre določimo z MDCK mikrotestom [A. L. Frank et al, J. Ciin. Microbiol., 12:426-432 (1980)] na ostalih živalih (5 miši na skupino).

Rezultati so navedeni v tabeli 15 spodaj.

Tabela 15

Letalni izziv miši: Stopnja preživetja in pljučni virusni titri

Virusni titer*

Vakcinska skupina	Preživetje (%)	dan 3	dan 5	dan 7
Aluminij -1- 3D-MPL13	8,90±0,10	8,44±0,55	8,69±0,32
Singapur	80	8,10±0,17	7,15 ±0,23	3,09±0,10
Singapur + 3D-MPL	100#	<1	<1	<1
A/Pr/8	100#	8,01±0,029	3,93 ±0,70	<1
A/PR/8 + 3D-MPL	100#	<1	<1	<1

* log TCID/pljuča (geometrično povprečje ± S.E.) # nobenih vidnih kliničnih simptomov

Dva seva (A/PR/8 in Singapur) inducirata določen nivo zaščite. Stopnja preživetja za obe skupini je znatno višja kot tista za kontrolni pripravek brez antigena (Alum + 3D-MPL), čiščenje pljučnega virusa je hitrejše. Ne presenetljivo se z A/PR/8 vakcinirana skupina (homologna glede na izziv) obnaša boljše kot skupina,vakcinirana s Singapurom (heterologna glede na izziv). Nadalje oba seva, dopolnjena s 3D-MPL, inducirata 100% preživetje, praktično brez pljučnega virusnega titra in brez kliničnih simptomov. Očitno, s 3D-MPL adjuvantirana vakcina v smislu izuma inducira superiorno zaščito pred infekcijo nižjega respiratornega trakta in zaradi tega pred resnimi kliničnimi pojavi kot npr. virusno pljučnico. Iz tega poskusa je zato razvidno, da 3DMPL adjuvantiranje izboljša homosubtipično in heterosubtipično aktivnost razcepljene vakcine in zato pričakujemo, da zagotavlja širšo zaščito pred antigenskimi premiki in naplavi kot neadjuvantirana vakcina.

Primer 28 - Neletalni izziv v miših

Predpis je enak kot v primeru 25 zgoraj, razen da miši anestetiziramo pred intranazalnim izzivom. Izvedemo virusno titracijo v respiratornem traktu, virusne nevtralizacijske teste in vrstično elektronsko mikroskopijo traheje.

Virusne nevtralizacijske titracije proti A/PR/8 virusu izvedemo na dan 1, 5 in 9 po izzivu (tabela 16).

Tabela 16

Virusni nevtralizacijski test

Nevtralizirajoči titer*

Vakcinska skupina	dan 1	dan 5	dan 9
Aluminij+3D-MPL	<1	<1	<1
Singapur	<1	<1	<1
Singapur	<1	<1	<1
+ 3D-MPL
A/PR/8	1,6	2,3	2,2
A/PR/8 + 3D-MPL	3,5	3,6	3,3

* povprečje log₁₀ (5 miši)

Obe A/PR/8 skupini proizvedeta nevtralizirajoča protitelesa s titrom, ki vsebuje več 3D-MPL. Nasprotno vakcinacija s Singapurom ne inducira nevtralizacij skih protiteles niti z dodatkom 3D-MPL. Iz tega je razvidno, da heterosubtipična aktivnost, ki smo jo znanali pred tem s Singapurom in 3D-MPL, ni zaradi protitelesa, ampak je strogo evidentno, daje za to odgovorna celično posredovana imunost.

Vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM) traheje izvedemo na vzorcih, zbranih na dan 3 in 5. Tkiva ovrednotimo za histopatološke spremembe v glavnih in ciliiranih epitelijskih celicah, s katerimi je obložen sapnik, posebno za deskvamacijo. Te spremembe so pokazatelj za resnost nadaljevanja influenčne infekcije ali okrevanja od infekcije (glej tabelo 17 spodaj).

Tabela 17

Neletalni izziv v miših: SEM traheje povprečni rezultat resnosti*

Vakcinska skupina	dan 1	dan 5	celoten rezultat
Aluminij + 3D-MPL 1,7	1,0	0
Singapur	2,0	1,7	2+
Singapur+MPL	2,4	2,4	3 +
A/PR/8	2,0	2,0	2+
A/PR/8+3D-MPL	2,0	2,4	3+

* polkvantitativno, narejeno slepo.

Regeneracija: 1: resna lezija

2: delna lezija 3: normalno tkivo ** celoten rezultat, od 0 (ni zaščite) do 4+ (popolna zaščita)

Iz rezultatov SEM je razvidno, da vakcinacija bodisi z A/PR/8 ali Singapumim sevom samim daje zaščito; v obeh primerih je ta pozitiven učinek povečan z dodatkom 3DMPL, pri čemer je razvidno, da adjuvantirana razcepljena vakcina lahko spremeni progresijo influenčne bolezni.

Virusne titre določimo v nosu, traheji in pljučih z MDCK mikrotestom na dan 1, 3, 5, 7 in 9 po izzivu (5 miši na skupino). Rezultati so prikazani na sl. 6A do 6F spodaj. Nazalni titri so višji kot trahejski ali pulmonalni, kar ni presenetljivo. Vendar vse testirane obdelave ne rezultirajo v jasnih razlikah nazalnih ali trahejskih titrov. Nasprotno, se pljučni titri razlikujejo: A/PR/8 + 3D-MPL in Singapur + 3D-MPL titri so vedno nižji ali enaki vrednostim samega antigena ali samega 3D-MPL (sl. 6A do 6F). Iz tega je razvidno, da 3D-MPL adjuvantiranje nudi boljšo pljučno zaščito pri miših.

Oba seta poskusov miši (letalni in neletalni izziv) prikazujeta, da influenčna vakcinacija z dvema podtipoma H1N1 seva (Singapur ali A/PR/8) in kasnejši homotipični izziv izboljša vgradjo 3D-MPL kot adjuvanta v skladu s predloženim izumom.

Primer 29 - Imunogenost vakcine

Za vsako vakcino CB6F₁ miši (15 na skupino) imuniziramo subkutano z 2 injekcijama, danima v razmiku 3 tednov, pripravka, ki vsebuje desetino čoveške doze običajne neadjuvantirane Singapurne monovalentne razcepljene vakcine ali vakcinskega sestavka v smislu izuma, ki vsebuje Singapumi sev s 3D-MPL. Človeška doza je definirana kot 0,5 ml injekcija, ki vsebuje 15 /ig HA vsakega virusnega seva. Formulacija, ki smo jo uporabili, vsebuje hemaglutinin (HA) proti 3D-MPL v razmerju 1,5 /ig HA na 5 /ig 3D-MPL do 5 /tg HA na 5/tg 3D-MPL. Kontrolna skupina prejme samo 3D-MPL (5 /ig). 3 tedne po drugi injekciji mišim izpustimo kri in serumska protitelesa individualno testiramo z inhibiranjem hemaglutinacije. Titre izračunamo proti kalibrirani referenci. Miši smatramo za odzivne, če imajo protitelesne titre večje, kot odrezana vrednost.

Rezultati so navedeni v tabeli 18. Oba tipa formulacij inducirata antihemaglutinacijska protitelesa v vseh živalih, torej je seroodzivna stopnja maksimalna. Vendar je imunski odziv znatno povečan z vakcinsko formulacijo v smislu izuma, ki vsebuje 3D-MPL in kot je prikazano z geometričnih srednjim titrom več kot 5-krat višji kot tisti od vakcine, ki vsebuje samo Singapumi sev.

Tabela 18

Vakcinska	Individualni titri*	Geometrični	Sero
skupina	povprečni	povprečni titer	odziv
3D-MPL	<25; <25; <25; <25; <25;
(5 Mg)	<25; <25; <25; <25; <25; <25; <25; <25; <25; <25;	<25;	0/15
Singapur	100; 200; 200; 75; 200;
(1,5 pg	100 25 800 300 50	150	15/15
HA)	200 200 600 200 50
Singapur	1200 600 400 400 1600
(1,5 pg	800 200 1600 1600 400	828	15/15
HA) + 3DMPL 5 pg	400 3200 400 3200 1200

* odrezana vrednost je nižja kot 25.

Iz tega poskusa je razvidno, daje protitelesni odziv v miših izboljšan z uporabo vakcine adjuvantirane s 3D-MPL v smislu izuma.

Primer 30 - Študija hipersenzitivnosti v morskem prašičku

Študijo hipersenzitivnosti izvedemo v morskih prašičkih, da določimo, če je dodatek 3D-MPL (delci velikosti < 100 mm;primer 26) k trivalentni razcepljeni vakcini modificira hipersenzitivnost. Trivalentno vakcino, označeno trivalentni Influsplit, pripravimo, kot je opisano v primeru 25 in vsebuje H1N1 sev Singapur/6/86, H3N2 sev Beijing/353/84 in sev tipa B, Β/Υamaghta/16/88.

Senzibilizirno sredstvo [alantoična tekočina 0,5 ali 2,5 mg ± 3D-MPL 50 μ-g; ena človeška doza (0,5 ml injekcija, ki vsebuje 15 μξ HA za vsakega od teh sevov influenčnega virusa) trivalentnega Influsplita ± 3D-MPL 50 μ-g] damo intraperitonealno s šestimi injekcijami na dan 0, 3, 5, 7, 10 in 12. Morske prašičke pustimo, da počivajo 4 tedne in jih nato izzovemo intravenozno, pod anestezijo, z izzivnim sredstevom (alantoična tekočina 0,45 mg; ena človeška doza trivalentnega Influsplita ± 3D-MPL 50 μ%). Živali opazujemo 30 minut po izzivu in ponovno po 2 ali 3 urah. Opažene simptome (praskanje, težave z dihanjem, krči, smrt) zabeležimo. Če po prvem izzivu ne pride do simptomov, živali ponovno izzovemo z alantoično tekočino (1,3 mg) 24 ur kasneje.

Rezultati tega testa so prikazani v tabelah 19A in 19B spodaj.

Tabela 19A - Hipersenzitivnostne študije Influsplita ± 3D-MPL

Izziv

Skupina	Senzibi- lizacijsko sredstvo	Sredstvo	Smrt- nost	Druge ugoto- vitve
1 (negativna kontrola)	nobeno	alantoična tekočina	0/5	nobene
2 (negativna kontrola)	nobeno	Influsplit	0/5	nobene
3 (negativna kontrola)	nobeno	Influsplit 3D-MPL	0/5	nobene
4 (pozitivna kontrola) alantoična tekočina	alantoična tekočina	alantoična tekočina	4/5	srbenje, omotica, krci
5 (test. razcep.vakc.)	Influsplit	alantoična tekočina	0/5	nobene
6 (test. razcep.vakc.)	alantoična tekočina	Influspl it	0/5	nobene
7 (pozitivna kontrola alant.tek./3D-MPL	alantoična tekočina 3D-MPL	alantoična tekočina	4/5	srbenje, omotica, krci
8 (test razcep.vakc./ 3D-MPL)	-Influsplit - 3D-MPL	alantoična tekočina	0/5	nobene
9 (test razcep.vakc./ 3D-MPL)	alantoična tekočina	Influsplit/ 3D-MPL	0/5	nobene

Tabela 19B - Hipersenzitivnostne študije Influsplita ± 3D-MPL

;upina	Senzi ΜΙ izaci jsko sredstvo	Ponovni izziv
Sredstvo	Smrt- nost	Druge ugoto- vitve
(negativna kontrola)	nobeno
(negativna kontrola)	nobeno
(negativna kontrola)	nobeno
(pozitivna kontrola)	alantoična	alantoična	1/5	srbenje,
alantoiCna tekočina	tekočina	tekočina		omotica, krči
(test. razcep.vakc.)	Influsplit	alantoična	0/5	nobene
		tekočina
(test. razcep.vakc.)	alantoična	alantoična	5/5	srbenje,
	tekočina	tekočina		omotica, krči
(pozitivna kontrola	alantoična	alantoična	1/1	srbenje,
alant.tek./3D-MPL	tekočina	tekočina		omotica,
	3D-MPL			krči
(test razcep.vakc./	-Influsplit	alantoična	0/5	nobene
3D-MPL)	- 3D-MPL	tekočina
(test razcep.vakc./	alantoična	alantoična		srbenje,
3D-MPL)	tekočina	tekočina	5/5	omotica,

krči

Iz odsotnosti učinka za skupine 1 do 3 (negativne kontrole) je razvidno, da je hipersenzitivnost potrebna pred intraperitonealnim senzibiliziranjem. Odsotnost hipersenzitivnosti v skupini 5 prikazuje, da Influsplit ne more senzibilizirati za alantoično tekočino. Podobne zaključke lahko dobimo iz skupine 6 (senzibilizacija za alantoično tekočino in izziv z Influsplitom). Dejansko je iz rezultatov skupin 5 in 6 tudi razvidno, da vakcina ne vsebuje preostankov proteinov alantoične tekočine. Dodatek 3D-MPL bodisi k senzibilimem sredstvu (skupini 7 in 8) ali k izzivnemu sredstvu (skupina 9) ne spremeni odziva (primerjava skupine 7 proti 4; skupine 8 proti 5; skupine 9 proti 6).

Iz poskusa je razvidno, da trivalentna Influsplit vakcina, ki jo damo kot senzibilizirno sredstvo z ali brez 3D-MPL, ni sposobna inducirati hipersenzitivnosti. Trivalentno vakcino Influsplita, ki jo damo kot izzivno sredstvo z ali brez 3D-MPL, ni sposobna sprožiti nobene hipersenzitivnostne reakcije v živalih, predhodno hipersenzibiliziranih z alantoično tekočino; in v poskusnih pogojih 3D-MPL nima nobenega zaznavnega učinka na hipersenzibilnostne reakcije. Torej so vakcinski sestavki v smislu izuma varni za dajanje sesalcem.

Številne modifikacije in variante predloženega izuma so vključene v zgoraj identificiran opis in pričakujemo, da so strokovnjakom očitne. Za te modifikacije in spremembe sestavkov in postopkov v smislu predloženega izuma smatramo, da so zajeti v obsegu priloženih zahtevkov.

Za

1. SmithKline Beecham Corporation

2. SmithKline Beecham Biologicals (s.a.):

*»« - - t . ·

A' ' 'Z

PATENTNI ZAHTEVKI

Claims (24)

1. Vakcinski sestavek, označen s tem, da je sposoben izzvanja povečanega imunskega odziva na influenčni antigen, ki vsebuje učinkovito količino influenčnega antigena in 3D-MPL.

2. Vakcinski sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da influenčni antigen antigenski polipeptid.

3. Vakcinski sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da je antigenski polipeptid izberemo iz skupine, ki jo sestavljajo D protein NS1₁₈₁HA2₆₅ _₂₂₂, NS1_{X 81}HA2_{X 222}, HA2_{66 222}, ΔΜ, ΔΜ+, A, C, 03, 03 kratek, Δϋ, cis-brez D, HA2_{66 222} in NS1H3HA2 konstrukti.

4. Vakcinski sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da sestavek vsebuje vsaj en razcepljen influenčni virus.

5. Vakcinski sestavek po zahtevku 4, označen s tem, da vsebuje tri razcepljene viruse z reaktivnostjo proti vsaj trem sevom influenčnega virusa.

6. Vakcinski sestavek po zahtevku 4, označen s tem, da seve izberemo izmed H1N1, H3N2, H2N2 in B tipa influenčnih sevov.

7. Vakcinski sestavek po zahtevku 6, označen s tem, da razcepljen virus izpeljemo iz skupine influenčnih sevov, ki jo sestavljajo A/PR/8, A/Singapur, A/Udorn, A/Victoria, A/Texas, A/Beijing, A/Puerto Rico, B/Panama, B/Yamaghta, B/Lee/40 in B/Taiwan.

8. Vakcinski sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da nadalje vsebuje adjuvant, ki vsebuje aluminij.

9. Vakcinski sestavek po zahtevku 8, označen s tem, da je adjuvant aluminijev hidroksid ali aluminijev fosfat.

10. Vakcinski sestavek po zahtevku 9, označen s tem, da je influenčni antigen NSl_lglHA2₆₅_₂₂₂, D protein.

11. Vakcinski sestavek po zahtevku 10, označen s tem, da sestoji iz približno 1 gg do približno 1000 gg D proteina in med približno 1 gg do približno 50 gg 3D-MPL.

12. Vakcinski sestavek po zahtevku 11, označen s tem, da je količina D proteina približno 2 gg in količina 3D-MPL približno 20 gg.

13. Vakcinski sestavek po zahtevku 3, označen s tem, da je antigen D protein, pri čemer omenjeni sestavek vsebuje med približno 50 gg do približno 500 gg D proteina, med približno 10 gg do približno 50 gg 3D-MPL in med približno 100 gg do približno 500 gg aluminijevega adjuvanta.

14. Vakcinski sestavek po kateremkoli od zahtevkov 1 do 13, označen s tem, da dodatno vsebuje liposomski pripravek, pri čemer liposomski pripravek vsebuje snov, ki tvori liposom, ki vsebuje dolgoverižno alifatsko ali aromatsko kislino ali amin; hidratacijsko sredstvo, ki ima naboj, nasproten tistemu od kisline ali amina, pri čemer je sredstvo prisotno v molskem razmerju med 1:20 in 1:0,05 glede na kislino ali amin; in vodo, v količini do 300 mol glede na trdne snovi, prisotne v sestavku.

15. Vakcinski sestavek po zahtevku 14, označen s tem, da sestoji iz med približno 50 gg do približno 500 gg D proteina, med približno 10 gg do približno 50 gg 3D-MPL in med približno 1 mg do približno 10 mg lipomskega pripravka.

16. Vakcinski sestavek po zahtevku 14, označen s tem, da je antigen flu D, ki sestoji iz med približno 50 gg do približno 500 gg D proteina, med približno 10 gg do približno 50 gg 3D-MPL, od približno 1 mg do približno 10 mg liposomskega pripravka in med približno 100 gg do približno 500 gg aluminijevega adjuvanta.

17. Vakcinski sestavek po kateremkoli od zahtevkov 14 do 16, označen s tem, da je hidratacijsko sredstvo alfa amino kislina z omega substitucijo, ki je karboksilatna, amino ah gvanidino funkcija ali njena farmacevtsko sprejemljiva sol ali spojina predstavljena s formulo:

K-CCH.VV I kjer je

X H^-^NHj-NH-, H^-, ZO₃S-, Z₂O₃P-, ali ZO₂Ckjer je Z H ali anorganski ali organski kation;

Y je -CHCNH^-CC^H, -NH₂, -NH-qNH)-NH₂-COOH, CH(NH₂)SO₃Z ali

ZH(NH₂)PO₃Z₂, kjer je Z definiran zgoraj; in je n celo število 1-10; ali njena farmacevtsko sprejemljive soli in sta kislina ali amin alkilna ali alkenilna kislina ali amin z 10 do 20 atomi ogljika.

18. Vakcinski sestavek po zahtevku 17, označen s tem, da je hidratacijsko sredstvo arginin, homoarginin, njuni N-acilni derivati, gama-aminomaslena kislina, asparagin, lizin, ornitin, glutaminska kislina, asparaginska kislina ali spojina, z naslednjo formulo:

H₂NC(NH)-NH-(CH₂)_n-CH-(NH₂)COOH II

H.N-(CH.) -CH(NH_o)COOH III ^H2^N<^CH2V^NH2) ^IV

H₂NC(NH)-NH-(CH₂)_n-NH-CH(NH)-(NH₂) V HOOC-(CH₂)_n-CH(NH₂)COOH VI

HOOC-(CH₂)_n-COOH VII

HO₃SC-(CH₂)_n-CH(NH₂)COOH VIII

H₂O₃S-(CH₂)_n-CH(NH₂)COOH IX

HO₃S-(CH₂)_n-CH(NH₂)SO₃H X

H₂O₃S-(CH₂)_n-CH(NH₂)PO₃H₂ XI ali kjer je n 2-4, ali njena farmacevtsko sprejemljive soli.

19. Vakcinski sestavek po kateremkoli od prejšnjih zahtevkov, označen s tem, da velikost delcev 3D-MPL ne presega 120 nm.

20. Vakcinski sestavek po zahtevku 19, označen s tem, da je velikost delcev v območju 60-120 nm.

21. Vakcinski sestavek po zahtevku 19 ali 20, označen s tem, da je velikost delcev pod 100 nm.

22. Vakcinski sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da povečuje imunski odziv na influenčni antigen.

23. Uporaba vakcinskega sestavka po zahtevku 1 pri izdelavi zdravila za povečevanje imunskega odziva na influenčni antigen.

24. Postopek za pripravo vakcinskega sestavka po zahtevku 1, označen s tem, da ob sega pomešanje omenjenega antigena in 3D-MPL.

Za

1. SmithKline Beecham Corporation

2. SmithKline Beecham Biologicals (s.a.):

1/9

Navzkrižna zaščita v miših, imuniziranih s SK&F106 160 v A1+3D-MPL (H1N1) (H1N1) (H2N2) (H3N2)

Predpis-SKF106160 10jjg/AI+3D-MPL 10>ig SC(0) > SC(3)> izziv (7)

-p <0.05

I I SK & F105160/AI + 3D-MPL

Sl. 1

PATI iUaJ L·* ki,. 1 'j

2/9

CD ο ο ο Ο ο σ ο σ σ σ ο σ ο σ σ σ ο ο ιη σ m ο LT) η CM Csl r^-

Wd3

3/9

20/jg

4/9