SI9300586A - Compositions for the regulation of cytokine activity - Google Patents

Description

(54) SESTAVKI ίΆ KtGULACiJO AKTIVNOSTI CiTOKiNOV (57) Odkrili smo substance, ki vsebujejo karboksiiirane in/aii suifatirane oiigosahariae v visoko čisti obliki, koi tudi sestavke, ki vsebujejo ie te, in metode njihove uporabe, za regulacijo aktivnosti citokina pri gostitelju. Na primer, izločanje tumorskega nekroznega faktorja alfa (Tumor Necrosis Factor Alpha TNF-alfa) lahko bodisi inhibiramo, bodisi selektivno povečamo z dajanjem gostitelju učinkovitih količin substanc ali njenih sestavkov, ki vsebujejo specifične oligosaharide v visoko čisti obliki. Tako se predstavljeni izum prav tako nanaša na farmacevtske sestavke in njihove uporabo za preprečevanje in/a!i zdravljenje patoioškin procesov, ki vključujejo indukcijo iziočanja aktivnega citokina, kot je tumorski nekrozni faktor alfa (TNF-alfa). Izum se nanaša tudi na vzbujanje žeijenega, z imunskim sistemom povezanega, odgovora gostitelja na prisotnost aktivatoriev. vključno s patogeni. Substance in farmacevtske sestavke predstavljenega izuma lahko uporabljamo dnevno pri zelo nizkih učinkovitih količinah, za ljudi tipično pod 0.1 mg/kg, ali v intervalih do 5-8 dni, najbolje enkrat tedensko.

SESTAVKI ZA REGULACIJO AKTIVNOSTI CITOKINOV

Napotki k sorodnim vlogam

Pričujoča vloga je nadaljevanje U.S. Application No. 08/096,739, ki je bila vložena 23. Julija 1993, ta je nadaljevanje U.S. Application No. 07/974,750, ki je bila vložena 10. Novembra 1992, ta pa je nadaljevanje U.S. Application No. 07/878,188, ki je bila vložena 1. Maja 1992. Vsa odkritja iz teh vlog so vključena v pričujočo vlogo.

1. PODROČJE IZUMA

Pričujoč izum se nanaša na substance, njihove sestavke in metode za regulacijo aktivnosti citokinov, na primer, vzpodbujanje ali zaviranje aktivnosti TNF-u. (iumor Necrosis Factor alpha. Tumorski nekrozni taktor alta).

Podrobno, razkrite so substance in njihovi farmacevtsko sprejemljivi sestavki, ki ob dajanju gostitelju v učinkovitih količinah, povzročijo zmanjšanje ali povečanje sekrecije aktivnega TNF-α iz gostiteljskih celic. Verjamemo, da lahko z metodami pričujočega izuma reguliramo sekrecijo aktivnih citokinov, na primer TNF-α, iz gostiteljevih imunskih elektorskih celic (npr.gostiteljevi aktivirani makrofagi).

Pričujoči izum se nanaša tudi na metode za preprečevanje in/ali zdravljenje patoloških procesov ali, nasprotno, na inicijacijo koristnega odgovora imunskega sistema, vključujoč tudi indukcijo produkcije, sekrecije in/ali aktivnosti citokinov. Izbrani sestavki pričujočega izuma vsebujejo nizko, učinkovito količino heparina z nizko molsko maso (LMVVH) za dajanje v intervalih med pet do osem dni. Naslednji sestavki vsebujejo karboksilirane in/ali sulfatirane oligosaharide v visoko prečiščeni obliki, ki jih dobimo iz različnih primarnih virov, ki obsegajo kromatografsko ločbo in prečiščevanje LMVVH, encimsko degradiranega heparina in encimsko degradiranega ekstracelularnega matriksa (DECM).

Substance, sestavki, ki jih vsebujejo, in farmacevtski sestavki, ki so posebej pripravljeni za parenteralno, oralno ali usmerjeno dajanje, posamezno zmanjšujejo ali povečujejo izločanje TNF-α iz počivajočih T-celic ali/in makrofagov in vitro kot odgovor na aktivacijo z aktivatorji imunskih efektorskih celic, ki obsegajo antigene specifične za T celice, mitogene T celic, aktivatorje makrofagov, rezidualni ekstracelulami matriks (RECM), fibronektin, laminin in podobne, vendar pa aktivatorji niso omejeni le na te primere. Podatki in vivo, ki kažejo inhibicijo eksperimentalnega tipa zakasnele hipersenzitivnosti (DTH), so prav tako predstavljeni in podpirajo rezultate dobljene in vitro.

2. OZADJE IZUMA

2.1. Tumorski nekrozni faktor alfa

TNF-α je citokin, ki ga proizvajajo monociti (makrofagi) in T limfociti. Je ključni element v kaskadi faktorjev, ki povzročijo inflamatomi odgovor, kot glavni pokazatelj stanja bolezni ima mnogo pleiotropnih učinkov (Beutler, B. in Cerami, A., Ann. Rev. Immunol. (1989) 7:625 655).

Biološki učinki TNF-α so odvisni od njegove koncentracije in mesta nastanka: pri nizkih koncentracijah lahko TNF-α opravlja zaželjene homeostatske in obrambne funkcije, vendar pri visokih koncentracijah (sistematično ali v določenem tkivu) TNF-α lahko deluje skupaj z drugimi citokini in poostri mnoge inflamatorne odgovore, znan je interleukin-1 (IL-1).

Pokazano je bilo, da TNF-α inducira sledeče (skupaj z IL-1): vročico, spanje s kratkimi valovi, hemodinamični šok, povečano produkcijo proteinov akutne faze, zmanjšano produkcijo albumina, aktivacijo vaskularnih endotelialnih celic, povečano ekspresijo glavnih molekul histokompatibilnostnega kompleksa (MHC), znižanje lipoprotein lipaze, znižanje citohroma P450, znižanje plazemskega cinka in železa, proliferacijo fibroblastov, povečanje kolagenaze sinovialnih celic, povečanje aktivnosti ciklooksigenaze, aktivacijo T in B celic ter indukcijo izločanja citokinov IL-1, IL-6, IL-7 in tudi samega sebe (TNF-α). Študije so pokazale, da so fiziološki učinki teh citokinov medsebojno povezani (Philip, R. in Epstein, L. B., Nature (1986) 323(6083):86-89: VVallch, D. in ostali., J. Immunol. (1988) 140(9):2994-2999).

Ni še poplnoma jasno, na kakšen način TNF-α povzroča svoje učinke, vendar verjamemo, da so mnogi izmed njih povezani s sposobnostjo TNF-α, da vzpodbudi celice k proizvajanju prostaglandinov in leukotrienov iz arahidonske kisline iz celične membrane. S svojimi pleiotropnimi učinki je TNFα zapleten v mnoga patološka stanja v različnih organih v telesu. V krvnih žilah TNF-α pospešuje hemoragični šok. zavira endoteiialni celični trombomodulin in stopnjuje prokoagulantno aktivnost. Povzroča sprijemanje belih krvničk in verjetno tudi plateietov na stene krvnih žil in na ta način lahko pospešuje procese, ki vodijo do ateroskleroze '.n prav tako do vaskulitisa.

TNF-α aktivira krvne celice in povzroča sprijemanje nevtrofilcev, eozinofilcev, monocitov/makrofagov ter T in B limfocitov. Z indukcijo IL-6 in IL-8 TNF-α povečuje kemotaksijo inflamatornih celic in njihovo prodiranje v tkiva. Tako ima TNF-α vlogo pri poškodbah tkiva pri avtoimunskih boleznih, alergijah in zavrnitvah transplantatov.

TNF-α tudi poimenujemo kahektin (cachectin), ker modulira metabolne aktivnosti adipocitov in pomaga pri uničevanju in hiranju, ki spremljata rakasta obolenja, pri kroničnih infekcijah, kroničnih srčnih kapeh in pri kroničnih vnetjih. TNF-α ima verjetno tudi vlogo pri nevrotični neješčnosti, z zmanjšanjem apetita in s stopnjevanjem izgube maščobnega tkiva.

TNF-α ima metabolne učinke na skeletne in kardialne mišice. Prav tako ima vidne učinke na jetra: znižuje metabolizem albumina in citohroma P450 ter povišuje proizvodnjo fibrinogena, 4-kislinskih glikoproteinov in drugih proteinov akutne faze. TNF-α lahko povzroča tudi odmiranje črevesja.

V centralnem živčnem sistemu TNF-α preide možgansko krvno bariero in povzroča vročico, podaljšano spanje in anoreksijo. Povečana koncentracija TNF-α je tudi v povezavi z multiplo sklerozo. Nadalje povzroča adrenalno hemoragijo in proizvodnjo steroidnih hormonov, povišuje kolagenaze in PGE-2 v koži in z aktiviranjem poškodb kostnega tkiva povzroča lomljenje kosti in hrustancev.

Na kratko, TNF-α je vključen v patogenezo mnogih nezaželjenih vnetnih stanj pri avtoimunskih boleznih, zavrnitvah transplantatov. vaskulitisu in aterosklerozi. Vlogo ima lahko tudi pri srčnih kapeh in pri odgovoru na rakasta obolenja. Zaradi teh razlogov iščemo poti za regulacijo proizvodnje, sekrecije in dosegljivosti aktivne oblike TNF-α z namenom nadzorovanja različnih bolezni.

Osnovna naloga imunskega sistema je varovanje osebka pred infekcijami, ki jih povzročijo vdori tujkov kot so mikroorganizmi. Imunski sistem pa lahko prav tako napade lastno tkivo osebka, kar pripelje do patološkega stanja, znanega kot avtoimunsko obolenje. Agresivne reakcije osebkovega imunskega sistema proti tujim tkivom so tudi razlog za nezaželjene zavrnitve transplantiranih organov. Hiper-reaktivnost sistema proti tujim substancam povzroča alergije, ki dajejo simptome kot so: astma, ekcem in vnetje nosne sluznice.

Celice, ki nadzorujejo te reakcije so limfociti, primarno aktivirani T limfociti, patološki inflamatorni odgovor, ki ga uravnavajo, je odvisen od njihove sposobnosti potovanja skozi skozi stene krvnih žil do in od ciljnih tkiv. Torej, z zmanjšanjem sposobnosti limfocitov za prilepljanje na stene žil in za prehajanje sten krvnih žil bi lahko preprečili avtoimunske reakcije, zavrnitve transplantatov in alergije. To bi ponudilo nov terapevtski princip, ki obeta rezultate pri boljši učinkovitosti in zmanjšuje adverzne reakcije, v primerjavi s terapijami, ki se uporabljajo danes.

Ateroskleroza in vaskulitis sta kronična in akutna primera patološke inflamacije žil. Ateroskleroza obsega oženje in povečevanje rigidnosti notranjosti arterij, kar vodi h koronarnim boleznim, miokardialni infarkciji, cerebralni infarkciji in perifernim vaskulamim obolenjem, to predstavlja glavni vzrok bolehanja in smrtnosti na Zahodu. Patološko se ateroskleroza razvija počasi in kronično kot poškodba, ki jo povzroči nalaganje maščob in apnenca. Razraščanje vlaknastih tkiv vodi k končnemu akutnemu stanju, ki pripelje do nepredvidene zamašitve krvne žile.

Pokazano je bilo, da TNF-α pospešuje in povečuje replikacijo virusa človeške imunodeficience (HIV) in vitro (Matsuyama, T. in ostali, J.Virol. (1989)

63(6):2504-2509: Michihiko, S. in ostali, Lancet (1989)1(8648):1206-1207) in, da stimulira ekspresijo HIV-1 gena, tako verjetno sproži razvoj kliničnega AIDS pri posameznikih, ki so latentno okuženi s HIV-1 (Okamoto.T. in ostali, AIDS

Res. Hum. Retroviruses (1989) 5(2):131-138).

Zato ima TNF-α tako kot inflamatorni odgovor, katerega del tudi je, dobre in slabe strani. Morda bi z razumavanjem njegove fiziološke funkcije lahko bolje razumeli namen inflamacije kot celote in razsvetlili okoliščine, pri katerih nastaneta pomanjkanje ali prebitek TNF-α. S tem bi se približali oblikovanju razumnega In specifičnega terapevtskega pristopa k boleznim, ki obsegajo proizvodnjo tega hormona.

2.2 Heparin

Heparin je glikozaminoglikan, polianionski suffatirani polisaharid, ki ga uporabljajo klinično (za preprečevanje strjevanja krvi) kot antitrombotični dejavnik. Na živalskih modelih je bilo pokazano, da heparin zmanjša možnosti avtoimunskih T limfocitov za dosego ciljnega organa (Lider, O. in ostali, Eur. J. Immunol. (1990) 20:493-499). Pokazano je bilo tudi. da heparin zavira eksperimentalne avtoimunske bolezni pri podganah in. pri uporabi v majhnih količinah (5pg za miši in 20pg za podgane), podaljšuje preživetje vsadkov pri transplantacijah kože na mišjem modelu (injiciranje enkrat na dan) (Lider, O. in ostali, J. Ciin. Invest. (1989) 83:752-756).

Misli se. da mehanizmi v ozadju opaženih učinkov obsegajo inhibicijo sproščanja encimov iz T limfocitov, encimski so nujni za penetracijo skozi krvno žilo, primarno encim heparanaza. ki specifično napade glikozaminoglikanski del subendotelialnega ekstracelularnega matriksa (ECM), ki je obloga krvne žile (Naparstek, Y. in ostali, Nature (1984) 310:241-243). Ekspresija encima heparanaza je v povezavi z zmožnostjo avtoimunskih T limfocitov za penetracijo skozi stene krvnih žil in s sposobnostjo za napad na možgane pri modelni bolezni eksperimentalnega avtoimunskega encefalomielitisa (EAE).

European Patent Application EP 0114589 (Folkman in ostali) opisuje sestavek za inhibicijo angiogeneze pri sesalcih, kjer aktivni dejavniki esencialno sestojijo iz: (1) heparina ali beparinovega fragmenta, ki je heksasaharid ali pa je še večji, (2) kortizona ali hidrokortizona ali 11-a hidrokortizonovega izomera. Z ozirom na razkritje: sta kortizon ali heparin sama po sebi neučinkovita, le kombinacija obeh daje željene učinke. Čeprav v literaturi ni dokaza, da obstaja povezava med angiogenezo in avtoimunskimi obolenji, povezuje opis patenta na strani 5 angiogenezo s psoriazo in artritisom in indicira uporabo visokih količin 25.000 do 47.000 enot heparina na dan (to je okrog 160 do okrog 310 mg na dan).

Horvath, J. E. in ostali, opisuje v Aust. N.ZJ. Med. (1975) 5(6):537539 učinke subantikoagulantnih količin podkožnega heparina na zgodnjo funkcijo renalnega alotransplantata. Dnevni odmerek je visok (5000 U ali okrog 33 mg), zaključek študije je, da heparin v subantikoagulantnih količinah nima učinka na zgodnjo funkcijo transplantacije ali preživetja vcepka in, da je lahko povezan s povečanimi hemoragičnimi komplikacijami.

Toivanen, M. L. in ostali. Meth. and Fmd. Exp. Ciin. Pharmacol. (1982) 4(6):359-363 je preizkusil učinek heparina v visokih odmerkih (1000 U/podgano ali okrog 7 mg/podgano) pri inhibiciji z adjuvansom povzročenega artritisa (adjuvansni artritis) pri podganah, ugotovil je, da heparin pri podganah povečuje resnost z adjuvansom povzročenega artritisa.

PCT Patent: Application PCT/Au88/00017, objavljen pod številko No. W088/05301 (Parish in ostali) opisuje sulfatirane polisaharide, ki blokirajo ali inhibirajo endoglikozilazno aktivnost, kot je heparanazna aktivnost, za uporabo kot antimetastatik in kot antiinflamatorni agens. Pokazalo se je, da imajo heparin in heparinovi derivati, kot so periodično oksidirani ali reducirani heparini, antimetastatično in antiinflamatorno aktivnost (ob uporabi v odmerkih v okviru od 1.6 do 6.6 mg na dan/podgano, dajanje z neprekinjeno infuzijo; odgovarjajoče količine za odraslega človeškega pacienta so od 75 do 308 mg/dan), njihova antikoagulantna aktivnost je zanemarljiva.

Heparin in heparan sulfat sta tesno sorodni glikozaminoglikanski makromolekuli. Njuni degradacijski produkti, ki jih imenujemo heparini z nizko molekulsko maso (LMWH), imajo lahko podobne ali celo boljše farmakološke učinke na sistem strjevanja krvi kot njihove starševske makromolekule. Še več, post-sintetsko predelovanje bazične disaharidne podenote polimera je obširno a nepopoino (glukoronska kislina in N-acetil glukozamin), LMWH pa bo heterogena mešanica po velikosti in tudi po kemijski sestavi (glejte: Goodman in Gilman‘s The Pharmacological Basis ot Therapeutics, 8th Ed.. Pergamon Press, new York, 1990, 1313-1315). Metode za pridobivanje produktov z nizko molekulsko maso, ki so uporabni kot antikoagulanti, iz heparina so opisane. Te metode težijo k produktom, ki optimizirajo trajanje učinka in vivo ali optimizirajo obseg stranskih hemoragičnih efektov (glejte: npr. Alpino, R. R. in ostali, US Patent No. 5.010.063; Choay, J. in ostali, US Patent No. 4.990.502 ; Lopez, L. L. in ostali, US Patent No. 4.981.955). Ostali svetujejo pri pridobivanju produktov z nizko molekulsko maso uporabo afinitetnih kromatografskih metod (glejte: npr. Rosenberg, R. D. in ostali. US Patent No. 4.539.398 in Jordan. R.E. in ostali US Patent No. 4.446.314).

Psuja, P., kakor je poročano v Folio. Haematoi (Leipz), 1987, 114:429-436, je proučeval učinke heterogenosti heparinov na njihove interakcije s celičnimi površinami. Psuja je poročal, da je pri kulturah endotelialnih celic našel receptorje z zmerno afiniteto za LMVVH (D<j=5.6 μΜ), toda, določil je, da je zgornji nivo količine frakcije LMVVH, ki je vezana na te receptorje, manj kot 1% celotne količine LMVVH.

Drugi raziskovalci so razkrili učinke LMVVH na metabolizem širokega spektra tipov celičnih kultur. Asselot-Chapel, C. in ostali, V Biochem. Pharmacol., 1989, 38:895-899; in Bioche. Biophys. Acta, 1989, 993:240-244 poročajo, da LMVVH povzroči pri celičnih kulturah gladkih mišic znižanje obsega sinteze kolagena (tipov 1-3) in fibronektina. Rappaport, R. v US patent No. 4.889.808 trdi, da človeški diploidni pulmonami fibroblasti, ki so bili gojeni brez seruma, odgovorijo na LMVVH s povečano sekrecijo tkivnih plazminogenskih aktivatorjev in sorodnih proteinov.

Poročali so tudi o učinkih LMVVH na kompleksne multicelulame sisteme. Delo Folkmana in sodelavcev ter Liderja in sodelavcev v EPO Application 0114589 in J. Ciin. Invest., 1989 83:752-756 je bilo omenjeno zgoraj. Kot dodatek trdi Diferrante, N. v objavljeni International Application WO 90/03791, da uporaba LMVVH inhibira reprodukcijo HIV pri kulturah C8116 transformiranih človeških limfocitov (ALL).

Kakorkoli, noben izmed dosedanjih znanstvenih poskusov, ki je proučeval vplive LMVVH na celični metabolizem, ni zaključil, da heterogenost LMVVH lahko povzroči antagonistične efekte. Še več, nihče ni pokazal ali vsaj nakazal možnosti regulatomih učinkov na citokinsko aktivnost, ki temelji na uporabi visoko čistih oligosaharidnih substanc.

3. POVZETEK IZUMA

V predstavljenem izumu so razkrite substance, ki so sposobne regulirati aktivnost citokinov pri sesalcih in vsebujejo karboksiliran in/ali sulfatiran oligosaharid v visoko očiščeni obliki. Natančno, substance kažejo doslednost: (a) inhibitorne R vrednosti približno 200,000 % x (gg/gm)'¹ ali več, kot je določeno z in vivo biotesti, ki merijo relativno inhibicijo eksperimentalnih DTH reakcij pri miših, ki smo jih obdelali z različnimi količinami omenjene substance v okviru od 0 do okrog 2 gg/gm miši; (b) ali povečane R vrednosti približno 0.03% x (pg/ml)'¹ ali več, kot je določeno z in vitro biotesti, ki merijo relativno aktivnost TNF-α, ki se izloča iz aktivnih človeških CD4+ T-celic v prisotnosti različnih koncentracij omenjene substance od 0 do okrog 1x10*⁷ pg/ml. Bolj zaželjena substanca kaže in vivo inhibitorne R vrednosti, ki so bile izbrane iz skupine, ki vsebuje 300000,400000,500000 in 600000% x (gg/gm)’¹ ali več.

Vrh tega, substance iz pričujočega izuma, ki imajo imajo inhibitomi učinek na izločanje aktivnega TNF-α, lahko dodatno kažejo dosledno inhibitorno ’R' vrednost vsaj okrog 0.4% x (pg/ml)'¹, kot je bilo določeno z in vitro biološkimi testi, ki merijo relativno aktivnost TNF-α, ki se izloča iz aktiviranih človeških CD4⁺ T-celic v prisotnosti različnih koncentracij omenjene substance od 0 do okrog 1x10⁷ pg/ml.

V eni izvedbi pričujočega izuma, imaj ogljikov hidrat ali oligosaharid molekulsko maso ne večjo kot okoli 3000 daltonov, po možnosti leži v območju od okrog 400 do okrog 2000 daltonov, še bolje med okrog 400 in 1100 daltoni. Navadno substance omenjene iznajdbe, ki inhibirajo aktivnost TNF-α, kot je bilo določeno z biološkimi testi (podrobneje so razloženi v nadaljevanju), vključujejo molekule različnih sladkornih enot, katerih osnovna enota aktivnosti je povezana z drsaharidi. Kakorkoli, daljše oligosaharidne verige, do okrog 10 sladkornih enot, ki vsebujejo osnovno disaharidno enoto aktivnosti, tudi lahko delujejo tako, da inhibirajo aktivnost TNF-α. Na drugi strani, so substance pričujočega izuma, ki povečajo opaženo aktivnost TNF-α, v glavnem dveh tipov: (i) agregati z relativno višjo molekulsko maso iz molekul z nizko molekulsko maso, ki v ne-agregiranem stanju kažejo inhibitorno aktivnost; in (ii) disaharidne ali monosaharidne podenote, ki so izgubile sulfatne skupine (to je, prestale so vsaj nekaj desulfatacij).

Ko te substance ali sestavke, ki jih vsebujejo, prečistimo, so le te visoko očiščene substanc, ki povzročajo nasproten ali antagonističen učinek.

Tako bi substanca, ki kaže inhibitorno aktivnost (zniževalna regulacija) v visoko očiščeni obliki, bila visoko očiščena, ne le drugih substanc na splošno, temveč tudi substanc, ki kažejo povečevanje ali zmanjševanje inhibitorne aktivnosti zniževalnega regulatorja. Situacija bi se seveda obrnila pri primeru, povečevalne substance (to je ‘‘zviševalni regulator) v kateri bi bila substanca visoko očiščena drugih substanc, predvsem tistih, ki znižujejo ali nasprotujejo porastu.

Fraza regulatorni efekt vklučuje obe, “zviševalno in zniževalno regulacijo, kateregakoli procesa, ki vpliva na razpoložljivost aii rezultirajočo aktivnost citokinov in vivo ali in vitro, ki na splošno vključujejo IL-1, IL-6, IL-8 in še posebno TNF-α. Tako lahko sestavki pričujočega izuma kažejo regulatorni efekt na gostiteljevo produkcijo TNF-α, na gostiteljevo izločanje TNF-α, na ekstracelularno razpoložljivost TNF-α ali na aktivne oblike TNF-α v gostitelju. Na primer, toda ne z željo da bi se s teorijo omejili, lahko omenjeni izum izvabi izločanje substance kot je protein, ki lahko veže TNF-α, spremeni njegovo konformacijo in posledično prizadene njegovo biološko aktivnost. Prav tako je mogoče, da se lahko sestavki omenjenega izuma v penetracijsko aktiviranih Tcelicah ali makrofagih vežejo na določene oligonukleotidne sekvence in tako prizadenejo transkripcijske in translacijske procese, ki dokončno spremenijo proteinsko sintezo. Sestavki lahko prav tako delujejo z vezavo na receptorje na površini celic.

Da bi poenostavili nadaljno diskusijo, se bomo med drugimi dotaknili izločanja aktivnega TNF-α ali regulacije aktivnosti TNF-α, s tem razumemo, da moramo tem frazam dati dosti širši pomen, le te vsebujejo dejanski mehanizem, ki je odgovoren, ali dejanski način po katerem je opaženo povečanje ali inhibicija aktivnosti TNF-α prizadeta s spojinami in sestavki predstavljenega izuma.

Substance omenjenega izuma vključujejo karboksiliran in /ali sulfatiran oligosaharidni del, ki ga lahko pridobimo iz naravnih virov, vključno z živimi organizmi. Na primer, aktivne substance smo izolirali in prečistili iz frakcij heparina z nizko molekulsko maso (LMWH), prav tako kot ekstracelularni matriksi, ki smo jih degradirali z delovanjem encima, t.j., heparanaze, pridobljene iz živali (sesalcev) ali mikroorganizmov (bakterij). Še en vir aktivnih substanc je encimsko obdelan heparin (t.j., endoglikozilazno degradiran heparin).

Zato termin visoko očiščena oblika pomeni, da smo uporabili specifične stopnje za odstranjevanje neaktivnih komponent ali komponent, ki imajo nasprotni učinek, iz oligosaharidnih substanc in za izolacijo aktivnega dela ali delov iz takih mešanic ali supematantov, kot so tisti, ki jih dobimo po degradaciji z encimi. Natančno, substance, zahtevane v omenjenem izumu, smo pridobili z rigoroznim kromatografskim procesom, v katerem je nizkotlačna, po velikosti izločitvena, gelska kromatografija začetna stopnja v očiščevalni shemi. Po nizkotlačni separaciji uporabimo za izolacijo individualnih komponent oligosaharidov visokotlačne tekočinske kromatografske tehnike (HPLC). Zaželjeno so te stopnje pri čiščenju individualnih aktivnih substanc dale visoko homogenost.

Taka zaželjena prečiščevalna stopnja lahko obsega, na primer, prehajanje mešanic, ki vsebujejo aktivne komponente (t.j. frakcije, ki jih dobimo pri nizkotlačni gelski kromatografiji), skozi gelske permeabilne kolone HPLC ali kolone z močnimi anionskini izmenjevalci za (SAX)HPLC. Tako smo opazili in izolirali substance, ki vključujejo oligosaharide iz skupine, ki je sestavljena iz di-, tri-, tetra-, penta-, ali heksasaharidov, po možnosti iz disaharidov. Okgosahatidi omenjenega izuma so karboksiliran/ in/ali sutfatirani in so zato negativno nabiti. Določene izvedbe izuma prioritetno vsebujejo disaharide, ki imajo tri negativno nabite skupine. Molekulska masa tistih, ki kažejo specifično inhibitomo aktivnost, se giblje od okrog 400 do okrog 2000, najraje okrog 400 do okrog 1100.

Izum prav tako predpisuje biotest (biološki test) za določanje učinkov testne substance na izločanje aktivnega TNF-α. Biotest vključuje stopnje predinkubacije človeških CD4+ celic v mediju z različnimi koncentracijami testne substance, dodajanja konstantne količine aktivatorja, učinkovitega pri izvabljanju izločanja TNF-α iz T-celic v odsotnosti omenjene testne substance, zbiranja medija po ustrezni časovni periodi in naknadnega testiranja aktivnost TNF-α v mediju. Najraje smo človeške CD4+ T celice pridobili iz mononukleamih levkocitov (PBL) periferne krvi. Primerni aktivatorji imunskih efektorskih celic vključujejo, vendar le s temi niso omejeni, specifične antigene T-celic. mitogene, aktivatorje makrofagov. rezidualni ekstracelulami matriks (RECM, definiran v poglavju 4, v nadaljevanju), laminin, fibronektin in podobne.

Predstavljeni izum se nanaša na specifično regulatorno aktivnost določenih substanc, kot je določena z in vitro in in vivo biološkimi testi, ki so podrobneje opisane v nadaljevanju. Na kratko, substance uporabne v predstavljenem izumu kažejo regulatorno (oboje, inhibitorno ali povečevalno) aktivnost, ki je odvisna od količine in je povezana z indukcijo izločanja aktivnega TNF-α. To je, graf odstotka inhibicije ali povečanja v odvisnosti od količine (npr. pg/ml substance) daje dvig do zvončaste krivulje, iz katere je maksimalni odstotek inhibicije (lnh_max ) ali povečanja (Pov_max ) takoj viden. Tako lahko za vsako točko takega grafa izračunamo razmerje med odstotkom inhibicije ali povečanja in koncentracijo ali količino. V predstavljenem primeru lahko dobimo vrednost R ali specifično regulatorno aktivnost iz razmerja maksimalnega odstotka inhibicije ali povečanja (to je, lnh_max ali Pov_max ) in koncentracije ali količine testne substance, ki daje dvig k taki maksimalni odstotni regulatomi vrednosti. Razen tega lahko R vrednost določimo iz vsakega biološkega testa. Zato lahko združimo R vrednosti iz in vitro testov mišjih vraničnih celic, ex vivo testov mišjih vraničnih celic, in vitro humanega testa PBL in in vivo testa, ki temelji na eksperimentalni DTH reakciji. Če ne opažimo učinka, pripišemo R vrednosti vrednost nič.

Še en objekt predstavljenega izuma je metoda za regulacijo aktivnosti crtokinov pri sesalcih, ki vključuje dajanje omenjenim subjektom količin substance, ki povzroči zmanjšanje ali povečanje aktivnosti citokina pri omenjenih subjektih, omenjena substanca vključuje karboksiliran in/ali sulfatiran oligosaharid v visoko očiščeni obliki in omenjena substanca kaže doslednost: (a) ne-nična inhibitoma R vrednost, določena iz (i) in vitro biološkega testa, ki meri relativno aktivnost TNF-α, ki se izloča iz aktiviranih človeških CD4+ T -celic v prisotnosti različnih koncentracij omenjene substance od 0 do okrog 1x10 ⁷ pg/mi, in/ali (ii) in vivo biološki test, ki meri relativno inhibicijo esperimentalne DTH reakcije pri miših, ki smo jih obdelali z različnimi količinami omenjene substance od 0 do okrog 2 pg/gm miši; ali (b) ne-nična povečevalna R vrednost, kot je določena iz in vitro biološkega testa, ki meri relativno aktivnost TNF-α, ki se izloča iz aktiviranih človeških CD4+ celic v prisotnosti različnih koncentracij omenjene substance od 0 do okrog 1x10⁷ pg/ml.

Še en objekt predstavljenega izuma je metoda za uporabo aktivne substance za pripravo farmacevtskega preparata, ki je uporaben za zdravljenje gostitelja, metoda vsebuje kombiniranje substance s farmacevtsko sprejemljivim nosilcem za zagotovitev enote količine, po možnosti nizkega odmerka, ki ima učinkovito količino substance. Farmacevtski preparat lahko tudi vključuje agens za stabilizacijo, na primer, protamin, v zadostni količini, da ohrani zantno, če ne visoko razmerje začetne aktivnosti substance čez podaljšano obdobje, t.j. okrog 100% čez približno 3 dni. Pri temperaturah hranjenja, ki so nižje od sobne temperature, npr. okrog -10°C, najbolje 4°C, se ohrani več začetne aktivnosti do okrog 4 mesece.

Ker so farmacevtski sestavki predstavljenega izuma namenjeni za dajanje človeku, je zaželjeno, da so farmacevtski sestavi sterilni. Sterilizacijo opravimo s katerimkoli sredstvom, ki so dobro znana strokovnjakom, vključujoč uporabo sterilnih sestavin, toplotne sterilizacije ali prehod sestavka skozi sterilni filter.

Prav tako je lahko očitno, da je primarni cilj predstavljenega izuma preskrbeti metodo zdravljenja gostitelja (kot je sesalski subjekt, ki trpi bolezensko stanje z resnostjo, ki je lahko povzročena z aktivnostjo citokina v gostitelju), ki vključuje dajanje aktivne substance gostitelju, substanca vsebuje oligosaharide tega izuma v visoko očiščeni obliki ali farmacevtske sestavke, ki so lahko pripravljeni iz njih. Odvisno od zdravstvenega stanja določenega gostitelja, iahko dajemo substance ali sestavke, ki zmanjšajo razpoložljivost ali aktivnost TNF-α ali pa nasprotno, povečajo indukcijo TNF-α ali pojačajo njegovo aktivnost. Take sestavke ali farmacevtske preparate lahko dajemo pri nizkih ravneh odmerkov in pri intervalih do okrog 5-8 dni, najbolje enkrat na teden. Farmacevtski sestavki, ki vsebujejo oligosaharidne (npr., mono-, di-, triali tetrasaharide, najbolje, če vklučujejo disaharide) substance za parenteralno, oralno ati lokalno dajanje, lahko dajemo dnevno glede na ugodnost in učinkovitost in v količinah, ki jih strokovnjak lahko takoj določi z rutinskim preizkušanjem.

Predstavljeni izum se prav tako nanaša na farmacevtske preparate za preventivo in/ali zdravljenje patoloških procesov, ki vključujejo indukcijo izločanja aktivnega TNF-α; preparati vsebujejo farmacevtsko sprejemljiv nosilec in heparin z nizko molekulsko maso (LMWH), ki je prisoten v nizki učinkoviti količini, za dajanje v intervalih do okrog 5-8 dni, ta LMWH je sposoben inhibirati in vitro izločanje aktivnega TNF-α iz mirujočih T-celic in/ali makrofagov v odgovor na za T-celice specifične antigene, mitogene, aktivatorje makrofagov, rezidualni ekstracelularni matriks (RECM), laminin, fibronektin in podobne.

V določeni izvedbi predstavljenega izuma ima LMWH farmacevtskega preparata povprečno molekulsko maso od okrog 3000 do okrog 6000, še več, dajemo ga lahko vsak peti ali sedmi dan.

Prav tako je predmet predstavljenega izuma priskrbeti farmacevtski preparat za dajanje v intervalih do okrog 5-8 dni za preventivo in/ali zdravljenje patoloških procesov, ki vključujejo indukcijo izločanja aktivnega TNF-a; vključujoč farmacevtsko sprejemljiv nosilec in heparin z nizko molekulsko maso (LMWH), prisoten v nizki učinkoviti količini.

Aktivne substance ali sestavki predstavljenega izuma so sposobni inhibirati eksperimentalno podaljšani tipa hipersenzitivne (DTH) reakcije na uporabljen antigen, kot je dokazano z zmanjšanjem strjenja, ki je bilo opaženo po apliciranju antigena na kožo do okrog pet do sedem dni po dajanju substanc ali njihovih farmacevtskih sestavkov, relativno glede na strjenje, ki je bilo opaženo po aplikaciji antigena na kožo v odsotnosti dajanja ali pa po okrevanju po dajanju substanc ali njihovih farmacevtskih sestavkov. Primeri apliciranih antigenov obsegajo, niso pa s tem omejeni, tetanus, mieiinski bazični protein, prečiščeni proteinski derivat, oksazolon in podobne.

Nadalje je cilj predstavljenega izuma preskrbeti sestavke ali farmacevtske preparate, katere bi lahko dajali na kateri koli način, kot ga narekuje določena aplikacija, ki je na voljo, vključno z, ni pa s tem omejeno, enteralnim dajanjem (vključno z oralnim ali rektalnim) ali parenteralnim dajanjem (vključno z lokalnim dajanjem ali z inhalacijo s pomočjo aerosolov). V željeni izvedbi farmacevtske sestavke predstavljenega izuma dajemo oralno, podkožno, intramuskularno, intraperitonalno in intravenozno.

Tako je predstavljeni izum uporaben, na primer, pri zadrževanju ali preprečevanju zavrnitve alotransplantatov in pri zdravljenju ali preprečevanju različnih patoloških procesov, kot so bolezni povezane z avtoimunskimi boleznimi, alergijami, vnetnimi boleznimi (zlasti pri vnetju prebavil) ali pri sindromu pridobljene imunske deficience (AJDS). Predstavljeni izum je prav tako uporaben pri zdravljenju diabetesa tipa (1), obzobnih bolezni, kožnih bolezni, bolezni jeter, uveitisa, revmatičnih bolezni (zlasti revmatoidnega artritisa), ateroskleroze, vnetja žil ali multiple skleroze.

še več. predstavljeni izum je uporaben pri zdravljenju tumorjev, virusnih in bakterijskih infekcij tako, da z dajanjem izumljene substance povečamo izločanje aktivnega TNF-α. Primeri zdravljenja tumorjev, seveda nismo omejeni le na te, vključujejo zdravljenje raka na dojki, raka na debelem črevesju, raka na prostati, kot tudi zdravljenje limfomonasa in drugih karcinomov bazalnih celic. Zdravljenje bakterijskih infekcij vključuje, ni pa omejeno le na te, zdravljenje davice, streptokokov, pljučnice, gonoreje, gobavosti in tuberkuloze. Podobno lahko po izumu zdravimo nekatere primere virusnih infekcij, nismo pa z njimi omejeni, kot je zdravljenje influence, hepatitisa, vnetja želodca in črevesne sluznice, mononukleoze, vnetja malih dihalnih potov in meningitisa.

V določenih farmacevtskih sestavkih predstavljenega izuma so prisotne nizke učinkovite količine predpisane aktivne substance LMWH. Značilno, farmacevtski sestavki vsebujejo enojno nizko odmemo enoto, z manj kot 5 mg aktivne substance LMWH, po možnosti od približno 0.3 do približno 3 mg in, kar je najboljše, enojno nizko odmemo enoto med 1 in 1.5 mg.

Predstavljeni izum se tudi na široko ukvarja z metodo uporabe heparina z nizko molekulsko maso (LMWH), ki je in vitro sposoben inhibirati izločanje aktivnega TNF-α iz počivajočih T celic in/aii mikrofagov, v odgovor na aktivatorje imunskih elektorskih celic, za pripravo farmacevtskega preparata za dajanje v intervalih do približno 5-8 dni za preventivo in/ali zdravljenje patoloških procesov, ki vključujejo indukcijo izločanja TNF-α; metoda vključuje kombiniranje nizke učinkovite količine LMWH s farmacevtsko sprejemljivim nosilcem.

Še en cilj predstavljenega izuma je v zvezi z metodami zagotavljanja virov aktivne substance po predstavljenem izumu, metode vključujejo frakcioniranje heparinov z nizko molekulsko maso, encimsko degradiranje intaktenega heparina (DH) ali encimsko degradiranje ekstracelularenega matriksa (DECM).

Nadalje je cilj predstavljenega izuma zagotovitev metode za zdravljenje pacienta ali gostitelja, ki trpi zaradi patološkega procesa, ki vklučuje indukcijo izločanja aktivnega TNF-α, metoda obsega dajanje farmacevtskega sestavka takemu osebku, kot je opisano zgoraj, v intervalih do približno 5-8 dni, najbolje enkrat tedensko. Kot bo omenjeno, lahko farmacevtske sestavke, ki vključujejo aktivni oligosaharid, dajemo dnevno ali v do tedenskih intervalih.

Predstavljeni izum prav tako zagotavlja farmacevtske sestavke za inhibicijo produkcije aktivnega TNF-α, ki vključujejo oligosaharid s formulo (1) ali njegovo farmacevtsko sprejemljivo sol,

Slika (1) pri kateri je X-| vodik ali sulfat; Χ2 vodik ali sulfat in Χ3 sulfat ali acetil; s tem da če je Χ3 sulfat, je vsaj en od Χ-j in Χ2 sulfat in če je Χ3 acetil, sta oba Xj in Χ2 sulfata, ter farmacevtsko sprejemljiv nosilec. Natančno lahko farmacevtski sestavki vsebujejo disaharid, ki je 2-O-sulfat-4-deoksi-4-en-iduronska kislina(a-1,4)-2-deoksi-2-N-sulfatglukozamin. 4-deoksi-4-en-iduronska kislina-(a-1,4)2-deoksi-2-N-sulfat-6-0-sulfatglukozamin, 2-O-sulfat-4-deoksi-4-en-iduronska kislina-(a-1,4)-2-deoksi-2-N-sulfat-6-0-sulfatglukozamin ali 2-O-sulfat-4-deoksi4-en-iduronska kislina-(a-1,4)-2-deoksi'2-N-acetil-6-0-sulfatglukozamin.

Predstavljeni izum se prav tako ukvarja s farmacevtskim sestavkom za povečanje produkcije aktivnega TNF-α, ki vsebuje 4-deoksi-4-en-iduronsko kislino-(a-1,4)-2-deoksi-2-N-acetilglukozamin ali njegovo farmacevtsko sprejemljivo sol in farmacevtsko sprejemljiv nosilec. Take farmacevtske sestavke seveda lahko prilagodimo različnim načinom dajanja kar vključuje, ni pa s tem omejeno, parenteralno dajanje, oralno dajanje ali usmerjeno dajanje.

Razen tega je preskrbljen farmacevtski sestavek za inhibicijo produkcije aktivnega TNF-α in vsebujejo spojino, ki je N-sulfatiran ali N-acetiliran 4deoksi-4-en-glukuronoglukozamin ali njegova farmacevtsko spejemljiva sol. Če je ta spojina N-sulfatirana, ima vsaj eno drugo sulfatno skupino, če pa je Nacetilirana, ima vsaj dve drugi sulfatni skupini. Omeniti je potrebno, da zaradi nenasičenja (na primer; dvojna vez med C-4 in C-5) na uranskem kislinskem delu določenenega disaharida, izmed disaharidov, ki nas zanimajo, ni nobene stereokemije povezane s C-6 karboksilno skupino, ki je esencialna v ravnini šestčlenskega obroča. Tako je, ob prisotnosti dvojne vezi med C-4 in C-5, iduronska kislina enaka glukuronski kislini. Iz tega sledi, da izraz “uranska kislina obsega tako glukuronsko kot iduronsko kislino. Prav tako lahko uranska skupina pomeni oboje, iduronsko ali gkukuronsko skupino.

Še drug aspekt tega izuma se navezuje na farmacevtski sestavek za povečanje produkcije aktivnega TNF-α, vsebuje ne-sulfatiran N-acetiiiran 4deoksi-4-en-glukuronoglukozamin ali njegovo farmacevtsko sprejemljivo sol in farmacevtsko sprejemljiv nosilec.

V tem izumu se prav tako ukvarjamo z metodo za inhibicijo produkcije aktivnega citokina pri subjektu, ki obsega dajanje subjektu, na primer sesalcu, kot je človeški pacient, učinkovite količine disaharida s formulo (1) ali njegove farmacevtsko sprejemljive soli,

Slika 1 pri katerem je X-| vodik ali sulfat; Χ2 vodik ali sulfat in Χ3 sulfat ali acetil, s tem da, če je Χ3 sulfat, je vsaj en od Χ1 in Χ2 sulfat, če pa je Χ3 acetil, sta oba X-| in X2 sulfata. Druga metoda, ki se nanaša na povečanje produkcije aktivnega citokina pri subjektu, obsega dajanje subjektu učinkovite količine disaharida, ki je 4-deoksi-4-en-iduronska-kislina-(a-1,4)-2-deoksi-2-N-acetilglukozamin ali njegova farmacevtsko sprejemljiva sol. V skladu s cilji predstavljenega izuma vključujejo te metode dnevno, raje pa tedensko dajanje tozadevnih spojin ali njihovih farmacevtsko sprejemljivih soli.

Zgoraj omenjene metode se lahko tudi uporabljajo za inhibicijo ali povečanje produkcije aktivnega citokina pri subjektu in vsebujejo dajanje subjektu učinkovite količine farmacevtskega sestavka iz predstavljenega izuma.

Predstavljeni izum se prav tako ukvarja z metodo uporabe spojine, ki je N-sulfatiran ali N-acetiliran 4-deoksi-4-en-glukuronoglukozamin ali njegova farmacevtsko sprejemljiva sol, s tem da, če je spojina N-su!fatirana, ima vsaj eno drugo sulfatno skupino, če pa je spojina N-acetilirana, ima vsaj dve sulfatni skupini, za preparacijo farmacevtskega sestavka za preprečevanje ali zdravljenje bolezenskega stanja, ki ga povzroči ali pa je povezano z nepravilno produkcijo TNF-a.

Prav tako se ukvarjamo z metodo uporabe spojina, ki je ne-sulfatiran Nacetiliran 4-deoksi-4-en-glukuronoglukozamin ali njegova farmacevtsko sprejemljiva sol, za pripravo farmacevtskega sestavka za zdravljenje bolezenskega stanja, ki nastane kot odgovor na povečano produkcijo TNF-a.

Enako smo zagotovili metode za preprečevanje ali zdravljenje bolezenskega stanja, ki nastane zaradi ali je povezano z nepravilno produkcijo aktivnega citokina pri subjektu, metode obsegajo dajanje subjektu učinkovite količine spojine, ki je N-sulfatiran ali N-acetiliran 4-deoksi-4-englukuronoglukozamin ali njegova farmacevtsko sprejemljiva sol, če je spojina N-sulfatirana. ima vsaj eno drugo sulfatno skupino in če je N-acetilirana, ima vsaj dve drugi sulfatni skupini.

Prav tako smo zagotovili metode za zdravljenje zdravstvenega stanja, ki nastane kot odgovor na povečano produkcijo aktivnega citokina pri subjektu, metode obsegajo dajanje učinkovite količine spojine subjektu, ki je ne-sulfatiran N-acetiliran 4-deoksi 4-en-glukuronoglukozamin ali njegova farmacevtsko sprejemljiva sol. Taka zdravljenja so posebno uporabna v primerih, ki vključujejo avtoimunsko bolezen, neoplastične pogoje ali nekatere oblike infekcij, vključujoč infekcije inducirane z virusnimi, bakterijskimi ali gljivičnimi agensi.

Drugi cilji predstavljenega izuma obsegajo metode za zaščito subjekta pred škodljivimi vplivi izpostavljanja radiaciji, vključujejo dajanje subjektu učinkovite količine spojine, ki je N-suffatiran ali N-acetiliran 4-deoksi4-en-glukuronoglukozamin ali njegova farmacevtsko sprejemljiva sol, če je spojina N-sulfatirana, ima vsaj eno drugo suffatno skupino in če je N-acilirana, ima vsaj dve sulfatni skupini. Značilno, dajemo spojine iz predstavljenega izuma subjeku pred izpostavitvijo radiaciji. Najugodnejše pa je to, da radiozaščitne lastnosti odkritih sestavkov lahko izkoriščamo med radiacijsko terapijo.

Nadalje, metode za supresijo zavrnitve alotransplantata pri subjektu, vključujejo dajanje subjektu učinkovite količine spojine, ki je Nsulfatiran ali N-acetiliran 4-deoksi-4-en-glukuronoglukozamin ali njegova farmacevtsko sprejemljiva sol, pri tem velja, da če je spojina N-sulfatirana, ima vsaj še eno drugo sulfatno skupino in, če je spojina N-acetilirana, ima vsaj dve sulfatni skupini. Alotransplantat lahko seveda vključuje organski transplantat vključno s srčnimi, jeternimi, ledvičnimi ali transplantati kostnega mozga, niso pa omejeni le s temi. Odkrite metode se lahko prilagodijo tudi na transplantate kože.

Še en cilj se navezuje na metodo za supresijo ekspresije adhezijske molekule pri subjektu, ki vsebuje dajanje subjektu učinkovite količine spojine, ki je N-sulfatiran ali N-acetilira: ί 4-deoksi-4-englukuronoglukozamin ali njegova farmacevtsko sprejemljiva sol, če je spojina N-sulfatirana, ima vsaj še eno drugo suffatno skupino in če je N-acetilirana. ima vsaj dve sulfatni skupini. Primera takih adhezijskih molekul sta. nismo pa omejeni z njima, ICAM-1 ali ELAM-1.

Prav tako smo odkrili biološki test in vitro za določanje učinka testne substance na izločanje aktivnega TNF-α, test vključuje predinkubacijo humanih CD4⁺ T celic v mediju z različnimi koncentracijami testne substance: dodajanje konstantne količine aktivatorja, ki učinkuje tako, da izsili izločanje TNF-α iz T celic ob odsotnosti testne substance; zbiranje medija po ustreznem času in nazadnje testiranje aktivnosti TNF-α v mediju.

Naslednji cilji predstavljenega izuma bodo jasni strokovnjakom po nadaljnjem pregledu sledečih odkritij, vključno z natančnimi opisi določenih izvedb izuma.

Kratek opis slik

Slika 1 prikazuje rezultate adjuvansnega artritisa (AA), dobljene pri skupinah podgan, ki smo jim tedensko dajali Fragmin v različnih odmerkih (količinah), relativno glede na kontrolno skupino podgan, ki je dobivala le fosfatno pufrsko slanico (PBS)

Slika 2 prikazuje rezultate AA, dobljene pri skupini podgan, ki so dobivale konstantni odmerek (20 pg) Fragmina z različnimi režimi dajanja: en sam odmerek, dnevni odmerek, petdnevni intervali in tedensko dajanje

Slika 3 primerja učinkovitost tedenskega dajanja Fragmina proti Heparinu in kontroli (PBS)

Slika 4 prikazuje rezultate dnevnega dajanja Fragmina, Heparina ali

PBS

Slika 5 prikazuje rezultate AA, dobljene iz skupin miši, ki so dnevno ali tedensko dobivale odmerke različnih heparinov z nizko molekulsko maso, vključeni so bili Fraxiparin, Fraxiparine in Lovenox.

Slika 6 orisuje odstotek stopnje preživetja podgan, ki so bile podvržene alogenetičnim transplantacijam srca in so tudi dobivale tedensko Fragmin ali PBS

Slika 7 predstavlja nivo glukoze v krvi pri dveh skupinah NOD miši, ena skupina je dobivala Fragmin, druga pa le PBS

Slika 8 prikazuje rezultate DTH eksperimenta, ki je vključil človeškega prostovoljca

Slika 9 prikazuje krivuljo odziva v obliki zvona glede na količino aktivnega Fragmina

Slika 10 prikazuje izgubo inhibitorne aktivnosti izkazane z inaktiviranim Fragminom

Slika 11 kaže absorpcijo različnih frakcij dobljenih pri gelski filtraciji inaktiviranega Fragmina, vključujoč frakcije F2, F8. F10 in F15, pri 206 nm

Slike 12.12A in 12B prikazujejo učinke aktivnega Fragmina (frakcije F15 in frakcije F10 pri različnih odmerkih pri miših) na občutljivost za DTH reakcijo

Sliki 13 in 15 primerjata elucijske profile frakcij Fragmina in s heparanazo degradiranega ECM, ki so bile dobljene s separacijo s kolono s Sepharoso 4B

Slika 14 prikazuje absorpcijo pri 206 nm frakcij Fragmina in s heparanazo degradiranega ECM, ki so bile dobljene s separacijo s kolono s Sepharoso 4B

Slika 16 kaže, da oligosaharidni produkt (frakcija 5 s Slike 13) daje, pri testih sposobnosti inhibicije sekrecije aktivnega TNF-oc, podobno zvonasto krivuljo odziv/količina

Slika 17 kaže, da ležijo področja z največjim anti-TNF-α učinkom v podfrakcijah med okrog 5.65 in okrog 5.8

Sliki 18A in 18B prikazujeta kromatogram dobljen pri separaciji Fragmina oziroma s heparanazo degradiranega ECM s HPLC

Slika 19 prikazuje absorpcije dveh frakcij (F5 in F8), ki sta bili dobljeni pri kolonski separaciji s heparanazo degradiranega ECM na Sepharosi 4B pri 206 nm

Sliki 20A in 20B prikazujeta absorpcijo pika dobljenega pri separaciji frakcije F5 s HPLC pri 206 nm oz. 232 nm

Sliki 21A in 21B prikazujeta absorpcijo dodatnih frakcij dobljenih pri separaciji frakcije F5 s HPLC v UV območju

Slika 22 pikazuje absorpcijo frakcij F7 in F8, ki sta bili dobljeni pri kolonski separaciji s heparanazo degradiranega ECM na Sepharosi 4B, v UV območju

Slika 23 prikazuje visoko prečiščen pik, dobljen pri separaciji kombiniranih frakcij F7 in F8 s SAX-HPLC kromatografijo

Slika 24 prikazuje še en pik, ki je označen kot ‘A23/4, ki je bil dobljen pri razsolitvenih preparacijah iz pika Γ s Slike 23

Slike 25A, 25B in 25C prikazujejo kromatograme, ki so bili dobljeni s SAX-HPLC kolonsko separacijo disaharidnih standardov, dobljenih pri SIGMI z oznakami H-1020, H-0895 oz. H-9267

Slika 26 prikazuje separacijo mešanice dobljene pri obdelavi Heparina s heparanazo (MM5) na koloni s Sepharoso 4B, kar da frakciji F7 in F8

Slika 27 prikazuje absorpcijo pri 206 nm različnih frakcij, dobljenih s kromatografijo PC3 heparanaze same in še Heparina in PC3 skupaj, na Sepharosi 4B

Sliki 28A in 28B prikazujeta dodatne frakcije, dobljene pri HPLC separaciji frakcije F7 s Slike 26

Slika 29 prikazuje frakcijo F90 dobljeno pri HPLC separaciji Fragmina

Slika 30 prikazuje kromatogram dobljen pri SAX-HPLC separaciji postaranega vzorca A23/4

Slika 31 prikazuje protonski NMR spekter vzorca (20 mikrogramov) disaharida, izpeljanega iz ECM ter dobljenega pri HPLC kromatografiji, kakor je pokazano na Sliki 23

Slika 32 prikazuje dvodimenzionalni COSY spekter vzorca s Slike 31

Slika 33 prikazuje povečani del NMR spektra s Slike 31. ki kaže signal za anomerni proton

Sliki 34 in 35 prikazujeta FTIR spektera, dobljena iz dveh ločenih vzorcev, en nakazuje prisotnost sulfatirane spojine Slika 34, drugi pa nakazuje prisotnost delno suffatiranega analoga Slika 35

Slika 36A prikazuje masni spekter metiliranega derivata vzorca s Slike 23 v topilni podlagi, ki vsebuje DTTrtioglicerol (1 ;1)

Slika 36B prikazuje masni spekter topilne podlage brez vzorca

Sliki 37A in 37B prikazujeta masni spekter enakega vzorca v drugačni topilni podlagi, ki vsebuje metilnitrobenzil alkohol. Slika 37A kaže topilno podlago z vzorcem, Slika 37B kaže spekter topilne podlage same

Slika 38 prikazuje rezultate eksperimentov, kjer smo primerjali učinkovitost disaharidov 9392 in 1020 pri izboljšanju AA rezultatov samic Lewis podgan, ki so trpele zaradi eksperimentalno induciranega adjuvansnega artritisa

Slika 38A prikazuje učinke disaharida 0895 na rezultate AA pri podganah, ki so trpele zaradi eksperimentalno povzročenega AA, relativno glede na kontrolo s PBS

Slika 38B prikazuje učinke zdravljenja z glukozaminom pri izboljšanju rezultatov AA pri Lewis podganah, ob dajanju različnih odmerkov glikozamina

Slika 38C podobno kaže učinke galaktozamina, pri različnih odmerkih, na rezultate AA pri Lewis podganah

Sliki 38D in 38E prikazujeta rezultate nadaljnih eksperimentov, ki so potekali z disaharidom 9392, kjer smo disaharid dajali oboje, tedensko ali dnevno z začetkom na dan 0 (t.j. začetek indukcije AA) ali z začetkom na 12 dan. ko je podgana že trpela zaradi AA

Sliki 38F in 38G prikazujeta rezultate ločenih primerjalnih setov eksperimentov, ki smo jih izvajali na skupinah Lewis podgan, da bi ugotovili učinkovitost disaharida 9392, ki smo ga dajali tedensko, v primerjavi z učinkovitostjo znanega antiinflamatomega dejavnika (deksametazon fosfat) pri supresiji eksperimentalno induciranega adjuvansnega artritisa

Slika 39 prikazuje učinkovitost podkožno injiciranega disaharida 1020 proti z Iiposaharidom (LPS) induciranem vnetju podganje roženice

Slika 39A predstavlja rezultate eksperimentov v zvezi z radiozaščitnimi učinki glukozamina pri različnih odmerkih, glede na kontrolo (PBS)

Slika 39B predstavlja rezultate podobnih iradiacijskih eksperimentov, ki so vključevali dajanje disaharida 9392 v različnih odmerkih, glede na kontrolo (PBS)

Sliki 40A in 40B prikazujeta rezultate eksperimentov, ki kažejo zmožnost izbranih substanc pričujočega izuma za supresijo zavrnitev transplantatov. Ti rezultati, predstavljeni na sliki 40, kažejo, da je 3 ng odmerek disaharida 9392, s podkožnim injiciranj&m dan pred presaditvijo in tedensko po presaditvi, zmanjšal zavrnitve kožnih transplantatov za 50% v 5 dneh. Vendar pa 300 ng odmerek istega disaharida ni pokazal nič večje učinkovitosti od 50% zmanjšanja relativno glede na kontrolno skupino

Slika 41 prikazuje pogostost pojava IDDM pri skupinah samic NOD miši, ki smo jih ločeno zdravili z disaharidom 9392, glukozaminom ali le s slanico

Slika 41A predstavlja stopnjo umrljivosti samic NOD miši, ki smo jih ločeno zdravili z disaharidom 9392, glukozaminom ali ie s slanico. Potrebno je povdariti, da so bile miši z obeh slik stare od 3 do 3.5 mesece, kar pomeni, da so kot skupina že imele 20% pojavnost IDDM

Slika 42 predstavlja rezultate respiratorne stiske (RD) šestih imuniziranih podgan, ki so bile izzvane z aerosoliziranim antigenom; A1. A2 in A3 niso bile zdravljene, Β1, B2 in B3 pa so bile zdravljene s substanco H-9392. Podrobnosti so opisane v tekstu.

Slika 43 prikazuje strukturo 4-O-(2-deoksi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-Dglukopiranozil)-(2-O-suffo-p-D-glukopiranozid) uronske kisline, ki smo jo pripravili po shemi sinteze, poglavje 6.23.

4. NATANČEN OPIS IZUMA

V enem pogledu predstavljenega izuma smo odkrili, da obdelava s heparini z nizko molekulsko maso (LMWH) inhibira sposobnost T-celic in makrofagov za izločanje aktivnega TNF-α. V drugem pogledu predstavljenega izuma so opisane druge substance, ki vključujejo karboksilirane in/ali sulfatirane oligosaharide v visoko očiščeni obliki, ter v celoti predstavljajo sredstva za regulacijo biološke aktivnosti citokinov, kot je TNF-α, v gostitelju. Zaradi enostavnosti, bomo termin 'substanca* ali 'aktivna substanca uporabljali za označevanje LMWH, kot je uporabljeno v metodi obdelovanja, ki je razkrita tukaj, pravtako pa tudi substance, ki vključujejo karboksilirane in/ali sulfatirane oligosaharide, ki smo jih izolirali tukaj, v visoko očiščeni obliki, razen, če je drugače zapisano.

Eno funkcionalno ekspresijo tega učinka lahko vidimo v inhibiciji zakasnelega tipa hipersenzitivne (DTH) reakcije pri miših in ljudeh, od T-celi odvisne vnetne reakcije, ki jo tudi lahko sprožijo celicami, vključujoč makrofage in druge vnetne celice. Obdelovanje z aktivnimi substancami v količinah, ki vplivajo na produkcijo aktivnega TNF-α, je tudi lahko inhibiralo model avtoimunskega artritisa, ki se imenuje adjuvansni artritis (z adjuvansom povzročeni artritis (AA)). Zdravljenje z aktivnimi substancami podaljša tudi preživetje alogenetičnih srčnih transplantatov pri podganah in prekine od insulina odvisni diabetes mellitus (IDDM) pri NOD miših. Razen tega, podobno zdravljenje prepreči indukcijo produkcije aktivnega TNF-α v T-celicah in makrofagih, kot odgovor na stimulus poškodovanega ali rezidualnega subendotelialnega ekstracelularnega matriksa. Ta rezidualni ekstracelulamegi matriks (RECM), ki je odgovoren za signalizacijo pojava indukcije TNF-α (in rezultirajočega vnetja), moramo razlikovati od encimsko degradiranega ekstracelularnega matriksa (DECM), katerega izbrane komponente, ki smo jih tukaj izolirali in pokazali, da oboje, ustavijo ali povečajo aktivnost TNF-a.

Ker ima TNF-α na mestu vaskulame poškodbe verjetno vlogo v procesu ateroskleroze, bo inhibicija aktivnosti TNF-α na mestu poškodovanega subendotelialnega ECM izboljšala patogene procese ateroskleroze. Najbolj presenetljiv vidik zdravljenja z LMWH aktivnimi substancami je, da je tako zdravljenje najbolj učinkovito, kadar dajemo nizke odmerke v tedenskih intervalih. Visoke količine LMWH aktivnih substanc ali dnevnih količin LMWH aktivnih substanc niso učinkovite pri inhibiciji izločanja TNF-α ali imunskih reakcij.

Heparini z nizko molekulsko maso, ki jih dobimo s frakcionacijo ali kontrolirano depolimerizacijo heparinov, kažejo izboljšan antitrombotični učinek, toda tudi drugačne farmakokinetične lastnosti v primerjavi s haparinom: polovična življenjska doba je podvojena in biouporabnost je višja z upoštevanjem njihovega antikoagulantnega učinka po podkožnem injiciranju (Bratt, G. in ostali. IhrombO5i§.and HaemQSt.a§is.(1985) 53:208; Bone, B. in ostali., Thrombosis Research (1987) 46:845).

Glede na predstavljeni izum smo ugotovili, da so LMWH aktivne substance, ki jih dajemo v subantikoagulantnih količinah, pri posameznih dnevnih intervalih učinkovite pri preventivi in/ali zravljenju patoloških procesov, ki vključujejo indukcijo aktivnega TNF-α. Razen tega smo do zdaj odkrili, da ločene substance, ki vključujejo oligosaharid iz 1-10 sladkornih enot, po možnosti 2-4 sladkorne enote, lahko identificiramo in lahko inhibirajo ali povečajo aktivnost TNF-α. Te ločene substance lahko pridobimo, na primer, iz tkiv živečih organizmov, na primer, iz topnih razkrojnih produktov substrata, ki je ekstracelularni matriks.

4.1. Viri aktivnih substanc

LMWHs za uporabo glede na inovacijo izhajajo iz LMVVHs s povprečno molekulsko maso 3000-6000, tako kot, na primer. LMVVHs. odkriti v European Patent EP 0014184. Nekateri LMVVHs so komercialno na razpolago pod različnimi tržnimi imeni, na primer. Fragmin®, Fraxiparin®, Fraxiparine®', Lovenox®yciexane®.

LMVVHs lahko pridobimo na več različnih načinov: obogatitev s frakcionacijo z etanolom in/ali molekularnim sitom, to je gelska filtracija ali membranska filtracija LMWH, ki so prisotnih v standardnem heparinu in kontrolirana kemična (s solitmo kislino, p-eliminacijo ali periodično oksidacijo) ali encimska (s heparinazami) depolimerizacija. Pogoj za depolimerizacijo lahko previdno kontroliramo, kar da produkte željenih molekulskih tež. Navadno se uporablja depolimerizacija z dušikovo kislino. Prav tako se uporablja depolimerizacija benzilnega estra heparina z p-eliminacijo, ki prinese enak tip fragmentov kot encimska depolimerizacija z uporabo heparinaz. LMVVH z nizko antikoagulantno aktivnostjo in ohranjeno bazično kemijske strukturo lahko pripravimo z depolimerizacijo z uporabo periodatne oksidacije ali z odstranitvijo antitrombin-veznih frakcij LMWH, pripravljenih z drugimi metodami, z uporabo imobiliziranega antitrombina za adsorpcijo.

Fragmi' ^ je heparin z nizko molekulsko maso s povprečno molekulsko maso » obsegu intervala 4000-6000 daltonov, pripravljen s kontrolirano depolimerizacijo natrijevega heparina iz svinjske črevesne sluzi z dušikovo kislino. Proizvaja ga Kabi Pharmacia, Švedska, pod imenom Fragmin®, za uporabo kot antitrombotični dejavnik v obliki raztopine soli za iniciranje v posameznih količinah za injiciranje 2500 IU/0.2ml in 5000 IU/0.2ml, kar usreza okrog 16mg oziroma 32mg.

Fraxiparin® in Fraxiparine® sta LMVVHs s povprečno molekulsko maso približno 4500 daltonov, pripravljena s frakcionacijo ali s kontrolirano depolimerizacijo s solitrno kislino iz kalcijevega heparina iz svinjske črevesne sluzi. Proizvaja ju Sanofi (Choay Laboratories) za uporabo kot antitrombotični dejavnik, v posameznih količinah za injiciranje, ki vsebujejo približno 36 mg, kar ustreza 3075 IU/0.3 ml vode.

Lovenox® (Enoxaparin/e), je LMWH fragment, ki ga dobijo z depolimerizacijo natrijevega heparina iz svinjske črevesne sluzi z uporabo βeliminacije, proizvaja ga Pharmuka SF, Francija in distribuira Rhone-Poulenc pod imenom Clexane® in Lovenox®· za uporabo kot antitrombotični dejavnik, v posameznihv posameznih količinah za injiciranje, ki vsebujejo 20 mg/0.2 ml in 40 mg/0.4 mi vode.

Kot je prikazano v predstavljeni aplikaciji, so nove lastnosti LMVVHs, ki smo jih odkrili in predstavili tukaj, skupne vsem LMVVHs, brez ozira na proizvodne procese, strukturne razlike (ki nastanejo z depolimerizacijo ali so odvissne od variacij v heparinu, ki se uporablja kot surovina) ali antikoagulantno aktivnost, zagotavljajo, da je uporabljeni LMVVH sposoben inhibirati izločanje aktivnega TNF-α in vitro iz počivajočih T celic in/ali makrofagov v odgovor na aktivacijo s kontaktom s za T-celice specifičnimi antigeni, mitogeni, aktivatorji makrofagov, rezidualnim ECM ali njegovimi proteinskimi komponentami, kot so fibronektin, laminin ali podobne.

Drugi test, uporaben za identifikacijo LMVVHs, ki so učinkoviti za cilj predstavljenega izuma, je inhibicija eksperimentalnega poznega tipa hipersenzitivne (DTH) kožne reakcije, od T-limfocitov odvisno reakcijo na različne antigene (na primer, tetanus antigen, mielinski bazični protein (MBP), očiščeni proteinski derivati (PPD) in oksazolon). LMWHs prav tako inhibirajo adhezijo T-celic na ECM in njegove proteinske komponente.

LMVVHs, ki so učinkoviti, glede na izum, smo vključili v farmacevtske sestavke, na primer, kot vodne raztopine, možno je, da vključujejo natrijev klorid, stabilizatorje in ostale primerne neaktivne sestavine. Boljša pot dajanja je z injiciranjem, podkožno ali intravenozno, toda izum obsega tudi vsak drug primeren način dajanja, vključujoč oralno dajanje.

Glede na izum, LMVVH dajemo v intervalih do okrog pet do osem dni, najbolje enkrat na teden. Druge substance predstavljenega izuma, posebno oiigosaharidi z nizko molekulsko maso (pod 2000), lahko dajemo na katerikoli primeren, učinkovit način (na primer, z injiciranjem, oralno ali lokalno), pri predpisanih količinskih režimih, ki lahko vključujejo dnevno ali tedensko dajanje.

4.2. Izguba aktivnosti LMWH preparatov s časom.

Vpliv dodanih stabilizatorjev

Potek časovni študij, ki smo jih opravili, kaže, da vzorci LMVVH, kot je Fragmin, izgubijo sposobnost inhibicije aktivnosti TNF-α v 72 urah pri sobni temperaturi in v nekaj mesecih pri nižji temperaturi (na primer, 4° C).

Tabela 11, poglavje 6.1, v nadaljevanju, prikazuje, da se okrog 53% aktivnosti Fragmina® izgubi po enem dnevu pri sobni temperaturi. Po okrog dveh dnevih izgubi okrog 87% aktivnosti in po okrog treh dnevih, kaže ne-aktivnost. Kot je prikazano v tabeli 12, poglavje 6.2, v nadaljevanju, so eksperimenti pokazali, da Fragmin® izgubi svojo anti-DTH reaktivnost celo pri hladnejših temperaturah (4°C); proces zahteva le več časa. Običajno nefrakcionirani heparini, v nasprotju, ne izgubijo svojih klasičnih anti-koagulantnih aktivnosti pri 4°C.

Z namenom, da bi odkrili agens, sposoben stabilizirati ali ohraniti citokinsko inhibitomo aktivnost odkritih LMVVH preparatov, so se izumitelji obrnili k dobro znanim aditivom za heparin. Protamin sulfat je znan kot nevtralizator anti-koagulantnih učinkov heparinoidnih molekul in se uporablja klinično za te namene (glej, Goodman and Gilman's The Pharmacoiogical Basis of Therapeutics . Eight Edition, Pergamon Press, New York, 1990, p.1317). Vendar smo odkrili , glede na izum, da dodani protamin sulfat ne nevtralizira inhibicije aktivnosti TNF-α z LMVVH; v bistvu protamin sulfat pravzaprav stabilizira to aktivnost (glej, podatke v tabeli 12, v nadaljevanju, ki obsegajo dodan protamin sulfat).

V povzetku, lahko zaključimo, da (i) razredčene raztopine LMVVH izgubijo aktivnost hitreje pri 20°C in počasneje pri 4°C (omeniti moramo, da izguba aktivnosti pri 4°C ni značilna za standardni antikoagulant ali za antitrombotično aktivnost heparina ali LMVVH); (ii) dodan protamin sulfat, klasični nevtralizator stanardnih aktivnosti heparinov, ne interferira z novo aktivnostjo LMVVHs proti TNF-α, ki je opisana v predstavljenem izumu. Resnično, izumitelji smo pokazali, da protamin sulfat v bistvu ohrani to novo aktivnost.

4.3. Frakcioniranje LMVVH in prprava degradiranega ECM ali degradiranega heparina. Odkritje izrazitih povečevalnih in inhibitornih aktivnosti za in proti TNF-α aktivnosti.

Kot smo že razpravljali, heparin z nizko molekulsko maso (Fragmin) inhibira izločanje aktivnega TNF-α . Maksimalno inhibicijo ali lnh_max (90%) smo opazili pri koncentraciji 1pg/ml (glej, slika 9). Nasprotno, inaktiviran Fragmin nima učinka na produkcijo TNF-α (glej sliko 10). Kakorkoli, frakcionacija inaktiviranega materiala z nizkotlačno, po velikosti izključitveno, gelsko kromatografsko separacijo z uporabo Sepharoze 4B kompaktne podpore (glej sliko 11, graf absorbance pri 206 nm proti številom frakcij) pokaže aktivne frakcije z inhibitomimi (F-15) in povečevalnimi (F8, F2) učinki (glej sliko 11 in tabelo 13). Inhibitoma frakcija inaktiviranega Fragmina (F-15) tudi inhibira DTH reakcijo (glej sliko 12; ki se nanaša na aktivni Fragmin'^, 12A; nanaša se na frakcijo F-15 in 12B; nanaša se na frakcijo F10). Frakcija F10 ni imela učinka na produkcijo TNF-α ali na DTT reaktivnost.

S sepharozo 4B, po velikosti izključitveno, gelsko kromatografsko separacijo smo izpeljali tudi na degradacijskih produktih, pridobljenih iz s heparanazo obdelanega ECM, ki so bili označeni s ³⁵S-vsebujočimi sulfatnimi skupinami. V predstavljeni preizkavi smo bili uporabili posamezne tipe encima heparanaze. Ti encimi vsebujejo MM5 (sesalska heparanaza iz človeških placent, pridobljena komercialno pri Rad-Chemicals, Weizman Industrial Park, Ness Ziona, Israel), PC3 (bakterijska endoglikozidaza, kot je opisana v Shoseiov, O. in ostali, Biochem, Bioohy. Res, Commun, (1990) 169:667-672), in encim iz bakterijskega vira, pridobljen pri ΙΒΕΧ Technologies, Ouebec, Kanada. Graf radioaktivnosti (CPM) proti frakcijskim številom je predstavljen na sliki 13. Drugi graf položen na ©lucijski profil frakcioniranega Fragmina in frakcioniranega ECM-heparanaze, je prikazan na sliki. 14. Pogoji za s Sepharozo 4B nizkotlačno separacijo so našteti v tabeli 1, v nadaljevanju :

Tabela 1: Pogoji Sepharoza 4B kromatografije_ kolona: sepharoza 4B (35cm x 0.7cm ID) nanos: 1-1.5ml pretok: 5ml/h topilo: PBS (pH=7.4) frakcija: 0.2 - 0.5 ml / epruveto detektor absorbcije:206 nm, 280nm

Testirali smo učinke različnih frakcij na produkcijo TNF-α in ti rezultati so predstavljeni v tabeli 15, v nadaljevanju. Zanimivo je, da smo ugotovili, da imajo frakcije s podobnimi elucijskimi lastnostmi iz dveh virov (to je, F-39 in F42 iz Fragmina in s heparanazo razgrajenega ECM), ki imajo podobne kvalitativne biološke učinke na produkcijo in/ali aktivnost TNF-a.

Sliki 15 in 13 ilustrirata en način predstavljanja elucijskega profila, pridobljenega na Sepharoza 4B kolonah iz LMWH (Fragmin) in s ^S-sulfatom označenih oligosaharidov iz ECM, oziroma pridobljenih s prečiščeno MM5 heparanazo. Na sliki 13 lahko vidimo, da heparan sulfat iz ECM (substrat heparanaze) razgradimo z encimom, da bi pridobili fragmente heparan sulfata z elucijskimi lastnostmi, primerljivimi frakcioniranemu LMWH.

Slika 16 kaže. da ima oligosaharidni produkt (Sepharoza 4B frakcija F5. slika 13). pridobljen iz ECM + heparanazne 'juhe (to je zmes.

pridobljena iz heparanazne degradacije ECM) visoko podobno karakteristiko količina/odgovor pri svojih učinkih na izločanje aktivnega TNF-α kot LMWH v svojih učinkih na izločanje aktivnega TNF-α, to je, oba kažeta zvončasto obliko krivulje količina/odgovor in oba kažeta maksimalno inhibicijo okrog 90%, pri koncentraciji okrog 1 pg/ml, z manjšo aktivnostjo pri nižjih ali višjih koncentracijah. Ugodno je, da tako dajanje teh aktivnih substanc vključuje količine, ki spadajo v lahko določljivo okno fiziološkega učinka.

Slika 17 kaže, da je anti TNF-α učinek degradacijskih produktov ECM najvišjih v področju podfrakcij (med okrog 5.65 in okrog 5.80) fragmentov pod pikom št. 5 na sliki 13.

Tako lahko na heparan sulfat delujemo s heparanazo, da generiramo degradacijske produkte, ki tako kot LMWH, povratno delujejo na Tcelice in makrofage in izključijo produkcijo aktivnega TNF-α in kot posledico vnetje, ki ga posreduje TNF-α .

Prav tako smo odkrili, da oligosaharidni fragmenti z nizko molekulsko maso, pridobljeni iz intaktnega heparina z obdelavo z endoglikolazo, kažejo željeni regulatorni efekt na aktivnost TNF-a.

4.4. HPLC separacija LMWH frakcij in fragmentov, pridobljenih iz DECM in DH

Tehnike visokoločljivostne tekočinske kromatografije (HPLC) smo koristno uporabili za pridobitev boljše ločljivosti frakcij iz LMWH (na primer. Fragmina), vzorcev degradacije ECM in degradacije heparina. Na začetku smo uporabili dva tipa pogojev za HPLC. Pod prvim setom HPLC pogojev, smo ločili in izolirali številne posamezne frakcije; pregledali smo njihovo sposobnost regulirati izločanje aktivnega TNF-a.

CITOKINSKA REGULATORNA SHEMA

Aktivator

Mirujoče T celice & makrofagi

Regulatorna povratna zanka

(+)Poviševanje 0 Inhibicija

Specifični ECM degradacijski produkti

Na veliko presenečenje smo odkrili, da lahko izbrane frakcije povečajo aktivnost TNF-α v gostitelju, medtem ko ostale inhibirajo aktivnost TNF-α. Drugi set HPLC pogojev smo uporabili za boljšo separacijo različnih komponent glede na njihovo molekulsko maso.

V prvem setu HPLC pogojev smo uporabili TSK-GEL® GOligo-PVV kolono (30 cm x 7.8 mm f.D.) opremljeno z Guard kolono Oligo (4 cm x 6 mm I.D.). Pogoji (HPLC Γ) so našteti v tabeli 2, v nadaljevanju. Značilen kromatogram za HPLC 1 separacijo Fragmina oziroma ECM + MM5 heparanazo je predstavljen na slikah. 18A ali 18B.

Tabela 2.HPLC 1 kromatografski pogoji

kolona:	TSK-GEL G-Oligo PW 30 cm x 7.8 mm ID
zaščitna kolona:	guard kolona Oligo 4 cm x 6.0 ID
lup*:	200 pl
pretok:	0.5 ml/min
topilo:	0.2 M fosfatni pufer (pH=7,0)
frakcija:	0.5 ml/epruveto
absorbcijski detektor:	190 nm - 400 nm

‘Lup: zanka za nanos vzorca.

Drugi set HPLC pogojev (HPLC 2) je opisan v tabeli 3. v nadaljevanju, in uporabljeni pogoji so podobni tistim, ki jih je opisal Rice, K.G. in ostali v Analvtical Biochemistrv (1985) 150: 325-331. Tako smo uporabili dve koloni, povezani v serijo; Toyo Soda TSK - Gel G3000SVV (7.5 mm x 50 cm) kolona, povezana z G2000SW (7.5 mm x 50 cm) kolono. Ti koloni, skupaj s 7.5 min x 10 cm guard kolono, dodano na vstopni konec G2000 kolone, ki smo ju dobili pri Phenomenex. Nadaljnje eksperimentalne podrobnosti so razložene v poglavjih 6.11,6.14 in 6.15, v nadaljevanju.

Tabela 3. HPLC 2 kromatografski pogoji kolona: Toyo Soda TSK-GEL G3000SVV (50 cm x 7.5 mm ID) in G2000SVV (50 cm x 7.5 mm ID) v serijah Guard kolona: guard kolona (10 cm x 7.5 mm ID) lup: 20 ali 100 pJ pretok: 1 ml/min topilo: deaeriran 0.5M NaCI frakcija: 0.5 ml / epruveto detektor absorbcije: 205 nm, 232 nm

Pod temi pogoji se manjše substance obdržijo dalj časa kot večje molekule.

V še enem setu HPLC pogojev (HPLC 3), je bila čistost izbranih razsoljenih HPLC frakcij preizkušena z dodatkom močnega unionskega izmenjevalca (SAX) HPLC kolone. Vemo, da take SAX HPLC kolone lahko ločijo molekule podobnih velikosti glede na število negativno nabitih skupin, ki so prisotne v molekuli. Večje je število negativnih skupin v substanci, dalj časa se substanca obdrži v koloni. HPLC 3 pogoji so opisani v tabeli 4, v nadaljevanju.

Tabela 4. HPLC 3 kromatografski pogoji

kolona:	SAX-HPLC kolona (25 cm x 4.6 mm ID. polnjena s Spherisorb, 5 pm velikost delcev)
lup: pretok: topilo: frakcija: detektor absorbcije: linearni gradient:	1 ml 1.5 ml/min linearni gradient, v nadaljevanju 1 ml / epruveto 205 nm, 232 nm (glej poglavje 6.15, v nadaljevanju)

Strokovnjakom bo jasno, po upoštevanju odkritij, ki so tukaj prisotna, da lahko ostale HPLC pogoje priredimo in uporabimo za separacijo in čiščenje aktivnih substanc omenjenega izuma. Podrobneje, pogoji reverzne faze se prav tako lahko s prednostjo uporabijo. Glej, na primer. Rice, K. G. in ostali, zgoraj.

Ponovno, brez želje, da bi se s teorijo omejili, pričakujemo, da je aktivnost TNF-α povečana z obojim, s povečanjem intracelulame produkcije aktivnega TNF-oc. ki se izloča iz gostiteljevih imunskih elektorskih celic, ali s povečanjem aktivnosti citokina preko delovanja agonista.

Prav tako sledi, da je lahko biološka aktivnost TNF-α inhibirana z nasprotnimi procesi, vključujoč ne samo kompeticijo, ki jo nudi aktivna inhibitoma substanca za receptorje za TNF-α (t.j., inhibitoma subtanca, ki deluje kot inhibitor ali inducira produkcijo druge substance, ki deluje kot antagonist TNF-oc) ampak tudi tvorbo kompleksa med TNF-α in inhibitoreno substanco, ki je manj aktivna kot prosti TNF-α. Alternativno sledi, da je lahko souped - up“ kompleks med TNF-α in povečevalno substanco odgovoren za opaženo povečanje v aktivnosti TNF-oc.

4.5. Določanje aktivnosti

Aktivne substance predstavljenega izuma, tiste, ki so sposobne inhibirati TNF-α aktivnost in tiste, ki so sposobne povečati TNF-α aktivnost, smo izolirali in očistili iz zmesi, ki jih vsebujejo. V nekaterih primerih smo te aktivne substance očistili do visoke homogenosti z zmogljivimi HPLC tehnikami, ki so tukaj opisane.

Kot nadaljno indikacijo čistosti teh aktivnih substanc, smo določili specifične regulatorne učinke posameznih substanc.

Vendar smo na začetku naredili karbazolne teste, na način, podoben tistemu, ki ga je opisal Carney, S.L. v Proteogivcan Anaivsis, A Practical Aproach. Chaplin, M. F. in Kennedy, J. F. (Eds.) IRL Press, Oxford, VVashington D. C. (1986) p. 129, in jih uporabili za določitev količine oligosaharidnega materiala, ki je bil prisoten (na primer, količina prisotnega sladkorja) v danih testnih primerih. Pikogramske (pg) količine sladkorja lahko določimo na ta način. Test izvedemo kot je opisano v poglavju 5, v nadaljevanju.

Pravo aktivnost, ki je povezana s količino substance, določimo z enim od bioloških testov, ki so natančno opisani v poglavju 5, v nadaljevanju; tako dobimo krivuljo količina/odgovor; te biološke teste lahko izpeljemo pod in vitro ali in vivo pogoji.

Na ta način smo ugotovili, da sta opažena inhibicija ali povečanje aktivnosti TNF-α, izraženi v odstotkih aktivnosti TNF-α, ki ga opazimo v odsotnosti substance iz predstavljenega izuma, odvisna od koncentracije ali količine take substance, prisotne v testnem primeru. Krivulja prave aktivnostni, ki jo dobimo, je približno zvončaste oblike, kot je prikazano na slikah 9 in 16. Maksimalna vrednost odstotka inhibicije ali povečanja, ki je bila opažena za posamezno substanco, je označena kot lnh_max oziroma Pov_max

Kot je opisano v nadaljevanju, lahko biološki testi, ki smo jih uporabili za ugotavljanje idealne* enote količine (odmerka) (to je, taka, ki da lnh_max ali Pov_max )· bazirajo na in vitro ali in vivo inhibiciji ali povečanju aktivnosti TNF-a ali DTH testa pri miših.

Alternativno lahko prav tako uporabimo in vitro test, ki bazira na človeških celicah (opisan je v nadaljevanju). Specifična regulatoma aktivnost ah' R vrednost je, kot je tukaj definirano, razmerje med lnh_max ali Pov_max in idealno količino, ki da dvig do maksimalnega procenta inhibicije ali povečanja. Za in vitro teste je R vrednost tipično izražena v enotah % x (pg/ml)-¹.

Kot je določeno zgoraj, lahko specifično regulatomo aktivnost prav tako ugotavljamo pod in vivo pogoji z opazovanjem inhibicije eksperimentalne DTH reakcije pri n iški ali človeku. Ugotovili smo, da je sposobnost določene količine inhibitornega sestavka za inhibicijo izločanja aktivnega TNF-α pozitivno korelirana z njegovo sposobnostjo inhibicije poznega tipa hipersenzitivne reakcije (DTH), čeprav je lahko isti sestavek v enem testu bolj učinkovit kot v drugem testu (to je, med in vitro in in vivo biološkimi testi). Inhibitorna ali povečevalna aktivnost v teh in vivo s celicami - posredovanimi inflamatornimi reakcijah je velikega pomena, ker je DTH reakcija ekspresija procesov, ki so vključeni v avtoimune bolezni, zavrnitve transplantatov, nekatere tipe vnetij krvnih žil in alergij. Tako aktivnost pri teh testih nakazuje koristno uporabo spojin pri teh tipih bolezni in možno tudi pri ostalih, kot je opisano v nadaljevanju.

Razen tega lahko nova količina, specifična regulatoma aktivnost, ki je definirana kot razmerje med lnh_max ali Pov_max vrednostjo in količino aii koncentracijo substance (idealne’ količine), ki daje dvig do maksimalne procentne vrednosti, služi za razlikovanje novih aktivnih substanc omenjenega izuma od tistih substanc, ki so lahko že znane, toda nespoznane, da bi imele sposobnost regulacije aktivnosti citokinov, kot je tukaj odkrito. To specifično razmerje je tukaj označeno na kratko kot R vrednost. Tako lahko nove substance ali sestavke predstavljenega izuma opišemo s terminom minimalne R vrednosti, ki jo lahko izračunamo iz krivulje prave aktivnosti proti odmerku in katera R‘ vrednost bo presegla ’R’ vrednost, ki jo lahko, sklicujoč se na predstavljeni izumu, povežemo z znanimi sestavki.

4.6. Tipi motenj, ki jim predstavljeni izum koristi

Motnje, ki jih lahko preprečimo ali zdravimo glede na izum, so vse motnje, povezane s patološkimi procesi, ki vključujejo indukcijo izločanja aktivnega TNF-α, vključujoč aterosklerozo in vaskulitis in patološke procese, ki so jim sorodni; avtoimune bolezni, na primer revmatoidni artritis, diabetes tipa I (od insulina odvisna sladkorna bolzen, IDDM), multipla skleroza, lupus erythematotus, Gravesova bolezen; alergija; zavrnitev transplantatov, akutne in kronične vnetne bolezni, na primer vnetje veznice, vnetje črevesja. anorexia nervosa; hemoragični šok, povzročen s septikemijo in HIV infekcija pri AIDS. Pri AIDS bodo aktivne substance zatrle replikacijo HIV, s tem pa preprečile razvoj AIDS - sorodnih kompleksov (ARC). Druge motnje, ki ijm lahko koristi zdravljenje, ki jepripravljeno za regulacijo aktivnosti citokinov, toda nismo z njimi omejeni, so luskavica, pemphigus, astma, ledvične bolezni, jetrne bolezni, propadanje kostnega mozga, vitiligo, lokalno izpadanje las in vnetje mišic.

Nadalje, povečanje aktivnega TNF-α je koristno pri zdravljenju tumorjev, bakterijskih infekcij in virusnih infekcij. Parenteralno, oralno in lokalno dajanje substanc predstavljenega izuma, ki povečujejo produkcijo aktivnega TNF-α, v farmacevtsko sprejemljivih nosilcih, lahko prav tako pomaga pri borbi proti kožnemu raku, kot je rak bazalnih celic, rak skvamoznih celic ali melanoma.

V kliničnih aplikacijah aktivnih substanc predstavljenega izuma si moramo zapomniti, da uspešno zdravljenje določenih tipov bolezni obsega v velikem merilu obnovitev homeostaze. To endokrinologu indicira razumno dajanje ali nasprotovanje specifičnih hormonov. Na primer, diabetike, odvisne od insulina, lahko učinkovito zdravimo s terapijo, ki vrača insulin; pacientu z Gravesovo boleznijo lahko pomamo s farmakološkimi prijemi, ki inhibirajo sproščanje tiroksina. Le redko lahko začnemo bolezen lajšati z dajanjem hormonov, ki niso bili nikoli nezadostni.

Uporaba citokinov, kot je TNF-α, kot antineoplastične agense, poda tak primer. Osnovni princip za dajanje imunomodulatomih agensov pacientom z rakom je lahko prrecej nezadosten. Veliko citokinov, kot TNF-α. kaže toksičnost, ki kaže k omejevanju količine, precej preden je dosežen terapevtski namen. V takem primeru lahko povečanje aktivnosti endogeno produciranega TNF-α preskrbi nov pristop, ki je oboje, nov in se v danem primeru kaže bolj učinkovit kot katerikoli prejšnji pregledan terapevtski način.

Jasno je, da se naše razumevanje vloge TNF-α še vedno razvija in da bomo brez dvoma odkrili nove in koristne uporabe hormona in substanc, ki so sposobne regulirati njegovo aktivnost. Gre tudi brez posebnega povdarka, da so vse uporabe zahtevanih sestavkov in farmacevtskih preparatov predstavljenega izuma znotraj okvira predstavljenega izuma, vendar so vse uporabe, ki blažijo simptome bolezni, preprečujejo nastop bolezni ali omogočajo zdravljenje bolezni, posebej pregledane.

4.7. Lokalne uporabe oligosaharidnih substanc predstavljenega izuma

Substance omenjenega izuma so prav tako uporabne pri lokalnem dajanju sestavkov, kot so preparati za zdravljenje oteklin ali vnetij. Vsekakor so vrh tega (čiste terapevtske aplikacije) substance omenjega izuma prav tako uporabne več kot le za čiste terapevtske namene, prav tako lahko dopolnijo zaščitno delovanje kozmetičnih sestavkov, kot so losioni za zaščito pred soncem in za porjavenje kože. Preparatov, ki so popolnoma učinkoviti pri blokiranju vseh škodljivih valovnih dolžin (na primer, 290 - 320 nm ) prisotnih v ultravijoličnem delu elektromagnetnega spektra, je malo oziroma, če sploh so. Zato, prevelika izpostavljenost soncu pogosto pripelje do akutnega stanja, znanega kot sončne opekline in podaljšano, ponavljajoče se izpostavljanje seveda lahko vodi do usnjenega videza kože ali še huje, do kožnega raka.

Na ta način je vključevanje aktivnih substanc omenjenega izuma v kozmetične preparate specifično namenjeno tako za varovanje in zaščito kože, kot za lajšanje zdravstvenega stanja, kot so sončne opekline. V preparate za zaščito in porjavenje kože bo ugodno vključevati učinkovite količine oligosaharidov predstavljenega izuma skupaj s konvencionalnimi agensi za zaščito pred soncem. Običajno bo prisotna količina aktivne substance, ki bo omogočila količino od okrog 1 gg do okrog 100 mg na kilogram subjekta, bolje od okrog 0.01 mg do okrog 10 mg na kilogram subjekta in najbolje okrog 0.1 mg do okrog 1 mg na kilogram subjekta.

Kozmetični sestavki lahko vsebujejo običajne sestavine, ki so znane strokovnjakom, tako kot tiste, ki so opisane v Kirk - Othmer,

176, V preparatih za zaščito pred soncem dodatki aktivnih substanc omenjenega izuma povečajo minimum opeklinske doze (minimum erythemal dose (MED)) in zato povečajo zaščitni faktor pred soncem (sun protection factor (SPF)). Specifične sestavine, vključno s tipičnimi zaščitnimi snovmi pred soncem, so naštete v Kirk - Othmer.(supra). na straneh 153 - 154. Kot dodatek lahko lokalne preparate in kozmetične formulacije pripravimo kot je razloženo v U. S. Patent Nos. 4,199,576, 4,136,165 in 4,248,861, katerih popolna odkritja, so vključena v tukajšnje reference. Seveda bo strokovnjakom v kozmetologiji očitno, da so lahko dobljeni sestavki v različnih oblikah, ki vključujejo, niso pa z njimi omejeni, raztopine, losione. kreme, paste, emulzije, spreje in aerosole.

4.8.Primeri režimov odmerjanja (doziranja)

Glede na izum smo vpeljali, da za najnižjo količino LMWH na kg, ki povzroči inhibicijo TNF-α, produkcijo ali inhibicijo DTH reaktivnosti za najmanj 50%; smatramo, da predstavlja za miši 12 inhibitornih enot na kg (12 E/kg). (Najnižjo inhibitorno enoto smo definirali kot količino LMWH, ki povzroči 50% inhibicijo TNF-α.) Zaradi razlik v zunanjosti in metabolizmu med mišmi in ljudmi, moramo ljudi zdraviti z nižjimi količinami LMWH in 12 E/kg pri miših dokazano ustreza 1 E/kg pri ljudeh. Na primer, količina Fragmina® serije 38609, ki je učinkovita pri inhibidji izločanja TNF-α in DTH reaktivnosti, je 5pg na miško pri tedenskem dajanju. Če vsaka miš tehta približno 25 g, je količina Fragmina® 38609, ki je ekvivalentna 12 E/kg, 200 pg/kg miši. Količina 1 E/kg. primerna za človeka, je zato 200 pg/kg-? 12 = 16.67 pg/kg. Človeka, ki tehta okrog 70 kg. bomo zdravili s količino okrog 12 mg, ki jo dajemo v posameznih odmerkih podkožno, enkrat vsakih 7 dni. Ker se ljudje med seboj biološko razlikujejo, lahko optimalna količina odstopa od okrog 1.2 mg in leži splošno pod 5 mg. natančneje v območju od 0.3 do 3 mg.

Zato je grob vodnik za pretvorbo mišjega režima za odmerjanje v človeški rezin naslednji:

človeška količina t kg = mišja količina / kg + 10 ali 12

Količino LMWH, ki naj bi bila učinkovita pri podganah, lahko dobimo s pomočjo dejstva, da je količina LMWH na kg podgan, polovična količina na kg miši, to je 6 E/kg. Na primer, če je 12 u Fragmina® serije 38609, 200 pg/kg, potem bi bila 6E količina primerna za podgano 100 pg/kg ali 20pg na 200 g podgane, dajana enkrat na teden.

Za večino oligosaharidnih substanc omenjenega izuma, ki so bile izolirane iz LMVVH, razgrajenega heparina in razgrajenega ECM, sledi pot za napovedovanje učinkovite količine teh oligosaharidnih substanc, za zdravljenje ljudi, iz in vivo DTH bioloških testov.

Slika 12A prikazuje, da izolirana frakcija (F15) in vivo inhibira DTH v miši v območju 0.1 - 5.0 pg / miš / teden. Če naše miši tehtajo 25 gm, je in vivo količina približno (0.1:0.025 kg) 4 - 200 pg t kg miši / teden (ekvivalentno 0.01 -10 pg / ml in vitro).

Za korekcijo zunanjih površinskih razlik med mišmi in ljudmi, moramo deliti mišjo količino / kg z 12:

- 200 pg / kg miši —-> 0.33 - 16.67 pg / kg človeka Tako naj bi 70 kg človek prejel do okrog 1.2 mg (okrog 1.200pg). Da bi bili prepričani, da lahko pokrijemo razliko med ljudmi, lahko povečamo to količino do okrog 5 mg, količina, ki je daleč pod katerokoli količini heparinoidov, ki se uporabljajo zaradi njihovih učinkov na koagulacijo ali trombozo. Zato bo količina za 70 kg človeka 5 mg ali manj. bolje okrog 3 mg ali manj. še bolje okrog 1.5 mg ali manj in najbolje okrog 1 mg ali manj.

Pravzaprav so za visoko očiščene materiale predstavljenega izuma, vključujoč tiste, ki so bili pridobljeni s HPLC kromatografijo, prednostne količine lahko celo nižje. Na primer: za disaharide, ki so opisani podrobneje v nadaljevanju, smo odkrili, da kažejo inhibitomo aktivnost, če jih injiciramo v količinah okrog 0.1 pg do okrog 0.5 pg na kilogram miši. Tako so količine za ljudi ocenjene na okrog 0.01 pg do okrog 0.05 ug na kilogram človeka ali okrog 0.7 pg do okrog 3.5 pg za 70 kg človeka za očiščene disaharide. Splošno območje količin za 70 kg človeka je tako lahko okrog 0.1 do okrog 100 pg, bolje okrog 1 pg do okrog 10 pg za disaharide. Količine so lahko nekoliko višje za znane disaharidne markerje*. ki so razloženi v nadaljevanju.

Zgoraj navedene količine lahko dajemo večkrat na dan ali v dnevnih, tedenskih ali celo daljših intervalih, glede na dovzetnost posameznika. Za LMVVHs, vendar, je zaželjeni interval odmerjanja tedenski, kot je navedeno pred tem.

Izum bo sedaj ilustriran z nadaljnjimi neomejujočimi primeri.

5. Eksperimenti z izključno uporabo LMWH (Fragmln)

5.1. Biloški test inhibicije izločanja aktivnega TNF-α z uporabo mišjih vraničnih celic

Supematante vraničnih celic, ki smo jih kultivirali v prisotnosti ali odsotnosti LMWH, ali vranične celice, pridobljene iz miši, ki smo jih aii pa tudi ne obdelali z LMWH in vivo, smo analizirali na njihovo sposobnost izločanja aktivnega TNF-α. TNF-a biološki test bazira na citotoksičnem učinku TNF-α na za cikloheksimid (CHI) senzibilizirane celice in določanju njihove kvantitete s testom jemanja nevtralnega rdečega (neutral red uptake assay) kot je opisano v Wallach D., J, Immunol. (1984) 132:2464 - 2469. Na kratko, merimo uničenje CHI senzibiliziranih HeLa celic s prisotnim TNF-α v supematantih celic, koncentracijo TNF-α v supematantih določimo s primerjavo s titracijskimi krivuljami za eksogeno dodani TNF-α. Sposobnost celic za življenje določimo z

2-umo inkubacijo z nevtralnim rdečim (neutral red), po tem času odplaknemo odvečno barvilo, nevtralno rdeče, ki se je absorbiralo na celice, eksrahiramo s Sorensonovo zmesjo (citratni pufer - etanol) in ga določimo kolorimetrično pri 570 nm z Microelisa Autoreader.

Mišje celice, ki smo jih obdelali z LMWH, pridobimo na nasljednji način: miši ženskega spola BALB/c linije (25 gramov, stare 2 meseca), najmanj 5 mišk na skupino, podkožno iniciramo z različnimi količinami LMWH, ponavadi v območju od 0.5 do 20 gg na miško. Pet dni kasneje smo miši ubili z zlomom vratne hrbtenice, odstranili vranice in analizirali suspenzije vraničnih celic, ki smo jim izčrpali eritrocite, na produkcijo TNF-α v odgovor na indukcijo z rezidualnim ekstracelularnim matriksom (RECM), s Concanavalinom A (Con A) ali z lipopolisaharidom (LPS).

5.2. h vivo biološki test inhibicije eksperimentalne DTH reaktivnosti

Skupine BALB/c miši sorodnih prednikov (Jackson Laboratories. Bar Harbor ME) ali CD1 miši. križane v daljnjem sorodstvu. (VVeizmann Institute Animal Breeding Center, Rehovot, Israel) smo senzibilizirali na obriti koži na trebuhu z 100 μΐ 2% oksazolona (OX) v aceton/olivno olje (4/1, v/v).aplicirano lokalno. DTH občutljivost se pojavi 5 dni kasneje na naslednji način: miši smo izzvali z 20 μΙ 0.5% ΟΧ (10μ1 smo injicirali lokalno na vsako stran ušesa) v aceton / olivnem olju. Konstantno območje ušesa smo merili tik pred izzivom in 24 in 48 ur kasneje z Mitutoyo Engineeris mikrometrom. Z individualnim merjenjem ušesne otekline ni mogoče identificirati skupin miši. Povečanje (A) ušesne otekline je izraženo v enotah 10‘² mm ali 10'⁴ inče (+SE), odvisno kateri mikrometer uporabljamo. Procent inhibicije izračunamo na naslednji način:

obdelava - negativna kontrola % inhibicije = 1 --------pozitivna kontrola - negativna kontrola

Miši smo obdelali z LMWH, kot v primeru 5.1, dan pred primarno senzibilizacijo za OX smo jim injicirali LMVVH. Peti dan po senzibilizaciji za OX, smo pri miših izzvali indukcijo DTH reakcije, kot je razloženo spodaj.

Pozitivna kontrola je DTH reakcija, izzvana pri imuniziranih miših, v odsotnosti obdelave z LMVVH. Negativna kontrola je osnovna oteklina, ki jo pri neimuniziranih miših povzroči antigen.

5.3. Indukcija Izločanja TNF-α Iz T-celic in makrofagov in vitro

Mikrotitrske ploščice smo pripravili na naslednji način: fibronektin (FN) ali laminin (LN) (Sigma) smo dodali v 96-luknjične ploščice z ravnim dnom (Costar) pri koncentraciji 1pg / 50 μΐ PBS na luknjico in ga odstranili po 16 urah.

Preostala vezavna mesta smo blokirali z BSA/PBS (10 mg/ml), ki smo ga dali v luknjice za 2 uri in potem izprali.

Luknjice, pokrite z ECM smo pripravili na naslednji način: goveje endotelialne kornealne celice smo gojili v 96-luknjičnih ploščicah z ravnim dnom. Konfluentne plasti endotelialnih celic smo razdrli, ECM je ostal brez celičnih ostankov (Gospodarowicz, D. in ostali, J. Biol, Chem. (1987) 253:3736). Razbiti ali rezidualni ECM (RECM) smo pripravili z nežnim praskanjem ECM trikrat, s 27G injekcijsko iglo in izpostavljene strani smo nato pokrili z BSA/PBS. Počivajoče klonirane podganje CD4⁺ T celice, označene kot KI, ki spoznajo mielinski bazični protein (MDP), smo razmnožili in vzdrževali v kulturah in jih dodali v luknjice, 10⁵ celic na luknjico z ali brez 3x10⁵ singenskih vraničnih makrofagov v 100 μΙ na luknjico RPMI 1640 (Gibco), dopolnjen z 1% BSA in antibiotiki.

Vranične makrofage smo prečistili z odstranitvijo T in B celic z uporabo specifičnih monoklonskih protiteles (mAb). Anti-murin TNF-α mAb smo pridobili pri Genzyme (Cambridge, MA) razredčene 300-krat. 10 pl alikvot te razredčene raztopine smo dodali vsaki luknjici. MBP (100 pg/ml), Con A (2.5 pg/ml), LPS (1 pg/ml), FN (5 pg/ml) in LN (5 pg/ml) smo dodali luknjicam, ki so bile označene.

Ploščice smo inkubirali 3 ure pri 37° C v vlažilnem inkubatorju. V nadaljevanju smo vsebine luknjic (4 luknjice na eksperimentalno skupino) zbrali, centrifugirali in medij testirali na izločanje aktivnega TNF-α, kot je opisano v poglavju 5.1: to je: supernatante gojenih makrofagov in limfocitov smo dodali kulturam HeLa celic, ki so občutljive na ubijanje s TNF-α, in smrt teh celic v prisotnosti testnega medija je bila kalibrirana v primerjavi s titracijskimi krivuljami eksogeno dodanega TNF-α. Celično smrt ugotovimo s sproščanjem nevtralnega rdečega (neutral red) iz preinkubiranih HeLa celic. Rezultati prikazani tukaj predstavljajo podatke dobljene iz vsote šestih eksperimentov, ki so dali bistveno podobne rezultate.

Tabela 5 kaže, da T celice in makrofage, ki so gojeni skupaj, lahko induciramo, da izločajo TNF-α, s kontaktom s specifičnim antigenom MBP (skupina 4), mitogenom Con A (skupina 6) ali LPS (skupina 8). Kakorkoli, v odsotnosti antigenskih ali mitogenskih stimulusov, lahko izločanje TNF-α prav tako induciramo z rezidualnim ekstracelulamim matriksom (RECM; skupina 10) ali z ECM komponentami, fibronektinom (FN; skupina 12) ali lamininom (LN; skupina 14). Intaktni ECM je šibek induktor za TNF-α (skupina 16).

Tabela 5. Izločanje TNF-α iz T celic in makrofagov je inducirano s specifičnim antigenom MBP, Con A, LPS, RECM, ali ECM komponentami.

skupina	K1 celice, gojene skupaj
TNF-a induktor	z (da) ali brez (ne) makrofagov	izločen TNF-a (pg/ml)
1	nič	ne	50
2		da	65
3	MBP antigen	ne	30
4		da	950
5	Con A	ne	120
6		da	1300
7	LPS	ne	50
S		da	1500
9	RECM	ne	30
10		da	900
11	FN	ne	20
12		da	650
13	LN	ne	50
14		da	500
15	ECM	ne	30
16		da	120

5.4. Regulacija izločanja TNF-α z LMWH$

Kulture T celic in celic pomagalk smo pripravili kot je opisano v poglavju 5.3. LMWH smo dodali v luknjice na začetku kultiviranja celic. Ravni TNF-a smo pregiedaali po 3 urah inkubacije.

Tabela 6 prikazuje, da je prisotnost LMWH (Fragmin® serija 38609) in vitro inhibirala izločanje aktivnega TNF-α, inducirano s specifičnim antigenom (MBP; skupina 4), mitogeni (Con A in LPS; skupini 6 in 8), RECM ali ECM komponentami (skupine 10, 12 in 14). Ker je izločanje TNF-α, inducirano z RECM, verjetno vključeno v aterosklerozo, bo inhibicija TNF-α z LMWH koristna v aterosklerozi.

Tabela 6. Indukcija izločanja TNF-α, inducirana in vitro, je inhibirana z LMWH (Fragmin® serija 38609).

Skupina	TNF-a Induktor	LMWH (1 pg/ml)	Izločanje TNF-α iz kultur T celic in makrofagov (pg/ml)
1	nič	ne	65
2		da	30
3 MPB antigen	ne	950
4		da	60
5	Con A	ne	1300
6		da	80
7	LPS	ne	1500
8		da	80
9	RECM	ne	900
10		da	90
11	FN	ne	650
12		da	90
13	LN	ne	500
14		ne	70

5.5. Ex Vivo eksperimenti z LMWH-obdelanimi BALB/c mišmi

Da bi preizkusili učinek LMWH, ki smo ga dajali mišim in vivo, na izločanje TNF-α iz vraničnih celic in vitro, smo opravili naslednji eksperiment. BALB/c miši. 5 na skupino, smo obdelali z različnimi količinami LMWH (Fragmin® serija 38609), raztopljenimi v slanici, podkožno injiciranimi. Po tednu dni smo živali ubili in njihove vranične celice, brez rdečih krvnih celic, preizkusili na njihovo sposobnost izločanja TNF-α v odgovor na kontrolne luknjice brez RECM (A) ali na luknjice oblečene z RECM (B). Merjenje stopnje izločanja TNF-α smo naredili, kot je razloženo v poglavju 5.1. Tabela 7 prikazuje rezultate, ki indicirajo, da je enkratno injiciranje 5pg LMWH, opravljeno 7 dni prej, inhibiralo izločanje TNF-α, inducirano z REMC. Višje ali nižje količine LMWH so bile manj učinkovite. Tako je bila optimalna količina LMWH, dana in vivo teden dni prej. visoko učinkovita.

Tabela 7. Ex vivo inhibicija s T celicami posredovanega izločanjaTNF-a kot odgovor na rezidualni ECM

	In vitro izločanje TNF-α (pg/ml) iz
LMWH	vraničnih celic gojenih na;
obdelava
BALB/c miši	A. nič B. rezidualni ECM
(tedensko gg)	(% Inhibicije)

1	nič	30	400	-
2	0.5	50	380	(5)
3	1.0	25	90	(78)
4	5.0	25	60	(85)
5	10	30	140	(65)
6	20	40	320	(20)

Tabela 8 kaže. da je bila količina 5gg LMWH Fragmin® serije 38609 in vivo prav tako učinkovita pri inhibiciji izločanja TNF-α, induciranega z LPS. BALB/c (4 miši na eksperimentalno skupino) miši smo obdelali z določeno količino LMWH, raztopljenega v slanici, podkožno injiciranje. Po tednu dni smo mišim intraperitonalno injicirali 10 mg LPS, nato smo jih po 4 urah ubili in njihove vranične celice, brez rdečih krvnih celic, nato kultivirali v z RECM oblečenih luknjicah za 3 ure v vlažilnem inkubatorju. Stopnje izločanja TNF-a, kot odgovor na RECM. smo izmerili v supematantih kultur. Rezultati so podani v tabeli 8.

Tabela 8. Obdelava miši z LMVVH inhibira z LPS posredovano izločanje aktivnega TNF-α iz makrofagov

LMVVH obdelava miši (pg)	In vitro sekrecija TNF-a iz makrofagov (pg/ml) kot odgovor na LPS	% inhibicije
0	690	-
0.1	500	28
1.0	350	50
5.0	120	82
20	550	20

5.6. Eksperiment z uporabo različnih virov LMVVH

Da bi pregledali učinek različnih LMVVH na inhibicijo izločanja aktivnega TNF-α in na DHT odgovore, smo miši obdelali z določenim LMVVH, dajanim podkožno v različnih koncentracijah. Po tednu dni smo ubili nekaj miši in izmerili idukcijo izločanja aktivnega TNF-α kot odgovor na aktivacijo s Con A in vitro (tabela 9). Ostale miši smo pregledali glede na njihovo sposobnost odgovora na antigen oksazolon (tabela 10). Rezultati so v tabelah izraženi kot procent inhibicije v primerjavi z odgovorom z LMVVH neobdelanih miši.

Ob pregledu rezultatov, prikazanih v tabelah 9 in 10, lahko naredimo dva zaključka:

1. Različne serije LMVVH, vsaka kalibrirana za podoben antitrombotični učinek (Faktor X test), imajo različne optimalne količine za inhibicijo izločanja aktivnega TNF-α. Še več, obstajajo preparati LMVVH, kot je na primer Clexane® serija 4096, ki pri katerikoli preizkušeni količini nima nobenega inhibitornega učinka na izločanje aktivnega TNF-α. Iz tega lahko zaključimo, da antitrombični učinek LMVVH preparatov ni povezan z možnostjo LMVVH preparatov za inhibicijo izločanja aktivnega TNF-α. Dva različna biološka testa sta v zvezi z različnimi faktorji, prisotnimi v preparatih.

Tabela 9. Tedenska obdelava miši z različnimi LMWH inhibira DTH občutljivost miši

Serija LMVVH	Količina (Dg/gm miši)	DTH Odgovor (10‘2 mm)	Inhibicija DTH R“vrednost (%) % x (ng/gm)-1
Fragmin
serija 38609	nič	25 2	(+) kontrola (-) kontrola
	0.02	21	12	-
	0.04	23	10	-
	0.2	6	73 (maks.)	365
	0.4	6	20	-
	2	0	0	-
serija 45389	nič	28 2	(+) kontrola (-) kontrola	-
	0.004	26	6	-
	0.04	4	89 (maks.)	2225
	0.2	24	13	-
	0.4	26	6	-
	2	29	0	-
ciexsane
serija 2088	nič	22 2	(+) kontrola (-) kontrola	-
	0.004	17	23	-
	0.04	3	87 (maks.)	2175
	0.2	13	41	-
	0.4	23	0	-
serija 2066	nič	23 2	(+) kontrola (-) kontrola
	0.004	20	13	-
	0.04	8	65	-
	0.2	7	70 (maks.)	350
	0.4	7	70	-
serija 4096	nič	24 2	(+) kontrola (-) kontrola	-
	0.04	27	ni učinka	0
	0.2	26	ni učinka	0
	0.4	24	ni učinka	0

2. Zmožnost posamezne količine LMVVH, da inhibira izločanje aktivnega TNF-α, je pozitivno korelirana z njeno zmožnostjo inhibicije DTH reakcije in količina LMVVH preparata, optimalno učinkovita pri inbibiciji izločanja aktivnega TNF-α, je enako optimalno učinkovita pri inhibiciji DTH reakcije.

Tabela 10. Tedenska obdelava miši z različnimi LMWH, inhibira ex vivo izločanje aktivnega TNF, z uporabo mišjega biotesta vraničnih celic

Serija LMVVH	Količina (qg/gm mi<	S ConA inducirano izločanje TNF ji) (pg/ml)	Inhibicija (%)	R vrednost % x (pg/gm)‘1
Fragmin
serija 38609	nič	450	kontrola	-
	0.02	425	5	-
	0.04	400	12	-
	0.2	68	85 (maks.)	425
	0.4	350	22	-
	2	435	8	-
serija 48389	nič	330	kontrola	-
	0.004	280	13	-
	0.04	70	78 (maks.)	1950
	0.2	260	18	-
	0.4	290	10	-
	2	310	4	-
Clexane
serija 2088	nič	400	kontrola	-
	0.004	360	10	-
	0.04	64	84(max)	2100
	0.2	152	38	-
	0.4	380	4	-
serija 2066	nič	350	kontrola	-
	0.004	338	6	-
	0.04	185	54	-
	0.2	192	57 (maks.)	285
	0.4	186	55	-
serija 4096	nič	320	kontrola	-
	0.04	335	ni učinka	0
	0.2	325	ni učinka	0
	0.4	330	ni učinka	0

5.7. Zdravljenje z adjuvansom povzročenega artritisa (adjuvansni artritis (AA)) pri podganah z nizkimi količinami LMWH

Z adjuvansom povzročeni (adjuvansni) artritis je eksperimentalna bolezen, ki jo lahko induciramo nekaterim rodovom podgan z imunizacijo le teh z antigeni za Mycobacterium tuberculosis (Pearson, C. M.. Proč. Soc, Exp, Biol, Med, (1956) 91:91). Ta eksperimentalna bolezen velja kot model za humani revmatoidni artritis (Pearson, C. M., Arthritis Rheum, (1964) 7:80). Zdi se, da artritis povzročijo T limfociti, ki prepoznajo antigen za M. tubereculosis, ki je navzkrižno reaktiven s strukturami v sklepnih tkivih (Cohen, I. R., in ostali, Arthritis Rheum, (1985) 28:841).

Lewis podgane smo imunizirali z M. tuberculosis (1 mg) v olju, da bi inducirali adjuvansni artritis (Peason, C. M., Proč, Soc, Exp, Biol. Med, (1956) 91:91). Čez pet dni smo podgane podkožno cepili, kot je omenjeno, s količinami LMWH in/ali heparina in jih sortirali glede na razvoj artritisa na skalo med 0-16, kot je opisano (Holoshitz, J. in drugi, Science (1983) 219:56). Vse eksperimente smo izvedli s Fragminom® serija 38609

Z namenom preučevanja odgovora na količino za Fragmin® (slikal), smo podgane imunizirane za indukcijo AA. tedensko podkožno injiciraii, začenši peti dan po injiciranju, 0.5 pg (o), 1 pg (♦), 2 pg (·). 10 pg (<3), 15 pg (Δ), 20 pg (), 30 pg (a), 40 pg (x) in PBS kontrola (o). Odmerek 20 pg je bil maksimalno učinkovit pri inhibiciji artritisa.

Učinek 20 pg odmerka Fragmina® na potek AA je prikazan na sliki 2: PBS kontrola (□); eno zdravljenje petega dne (-*·): dnevno (·); vsak peti dan (o); tedensko (). Izkazalo se je, da obe dajanji Fragmina, v petdnevnih in sedem dnevnih intervalih, inhibirata artritis.

Slika 3 prikazuje učinek tedenskega dajanja Fragmina® (serija 38609) v primerjavi s standardnim heparinom na AA. Lewisove podgane smo imunizirali, da bi inducirali AA. S pričetkom na dan 5 smo podgane podkožno cepili v tedenskih intervalih z 20 pg odmerki Fragmina® (·), heparina (o) ali fosfatno pufrsko slanico (□). Rezultati kažejo na veliko razliko med močjo učinkovanja Fragmina® in heparina: Fragmin® je v celoti inhibiral artritis, medtem ko heparin ni imel nikakršnega inhibitomega učinka.

Nobenega inhibitornega učineka na AA nismo zasledili pri dnevnem dajanju 20 μρ odmerkov LMVVH, čeprav je bil inhibitoren učinek heparina presenetljivo močnejši kot učinek Fragmina® pri vsakodnevni uporabi, kot je prikazano na sliki 4: Fragmin® (serija 38609) (·), heparin (o), PBS kontrola(o)).

Podoben inhibitorni učinek smo opazili pri mnogih drugih LMVVH, ki smo jih dajali Levvisovim podganam, imuniziranim za indukcijo AA. Slika 5 prikazuje rezultate injiciranja 20 μρ količin Faxiparin® (dnevno (Λ); tedensko (a ); Faxiparine® (dnevno (D), tedensko (▲)), Lovenox®/Clexan® (dnevno (·); tedensko (o)) in PBS kontrola (x). Vsi trije LMVVH različnih tipov in virov so pokazali močno inibicijo artritisa, ko smo jih dajali tedensko in ne dnevno.

5.8. Obdelava z LMVVH preprečuje zavrnitev alotransplantatov

Wistar podgane smo podvrgli alogenetičnemu BN srčnemu transplantatu (Ono, K. in Linsay, E. S., J, Thorac, Cardiovasc, Sura. (1969) 45:225-229). Od dneva pred transplatacijo naprej smo podganam podkožno injicirali v 7 dnevnih intervalih po 20 pg Fragmina® ali PBS kontrole (slika 6, · in o, posamezno) in zasledovali rezultate preživetja. Dan zavrnitve smo določili kot dan, ko je transplantirano srce prenehalo biti, kar smo preizkusili z otipavanjem abdomna. Slika 6 kaže, da so podgane, obdelane s tedensko količino LMVVH, imele izrazito povečano preživetje srčnih alotransplantatov.

5.9. Biološki efekt LMVVH na od Insulina odvisni Diabetes Mellitus (IDDM) pri NOD miših

Miši NOD rodu spontano razvijejo obliko tipa 1 od insulina odvisnega diabetesa mellitusa (IDDM), ki je sprejet model za humani IDDM (Castano, L. in Eisenbarth, G. S. , Annu, Rev. ImmunoL (1990) 8:647-679). Bolezen se prične pri starosti 4-5 tednov, s pojavom vnetja pankreatičnih otočkov (insulitisa). Insulitis progresivno poškoduje beta celice, ki proizvajajo insulin in so občutljive na poškodbe s TNF-α, Pri približno 4-5 mesecih starosti je uničenih zadostno število beta celic in tako postane diabetes očiten.

Da bi testirali, če zdravljenje z LMWH lahko vpliva na IDDM proces, smo skupino 10 NOD miši ženskega spola obdelali tedensko s podkožnimi injiciranji 5 μ9 Fragmin® (serija 38609) na miš. Količina je določena tako, da predstavlja 12 mišjih enot na kilogram. SkupinolO kontrolnih miši smo obdelali z injiciranji slanice. Pri starosti 5 mesecev smo vsem mišim puščali kri, da bi določili razvoj IDDM z uporabo standardnega postopka (Elias, D. in ostali, Proč, Natl, Acad, Sci.U.S.A, (1990) 87:1576-1580). Slika 7 kaže, da so imele kontrolne miši (“nič) nenormalno krvno glukozo (400 mg/dl). Nasprotno pa so imele miši, obdelane z LMWH, normalno krvno glukozo (100 mg/dl). Torej lahko zdravljenje z LMWH zares zdravi IDDM proces.

5.10. Zdravljenje alergij z LMWH

Pri mnogih pacientih z alergijo intradermalni izziv s specifičnim antigenom ali anti-lgE inducira takojšnje izpuščaje in širjenje reakcije, kateri sledi, 4-8 ur kasneje, perioda nenehnega otekanja in infiltracije levkocitov, kar označuje pozno fazo kožne rekcije. Reakcije pozne faze (LPR) so bile prvotno opisane v koži (Solley, G. O. in ostali. J. Ciin, Invest. (1976) 58:408420). Kakorkoli že, sedaj je jasno, da se pozne posledice od IgE odvisnih reakcij, ki opazno vključujejo infiltracijo reakcijskih mest z levkociti, ki nastanejo v krvi, pojavljajo tudi v respiratornem traktu in na drugih anatomskih lokacijah (Lemanski, R. F. and Kaliner, M., v Allergv: Principles andpractice. Vol. 1 (1988), Middeton, Jr., E. in ostali (Eds.), pp. 224-246). Seveda je bilo neizpodbitno dokazano, da mnoge klinično signifikante posledice od IgE odvisnih reakcij v obeh, kožnem in respiratornem sistemu, odražajo delovanje levkocitov okrepljenih na teh mestih za časa LPR, raje kot direktne učinke posrednikov izpuščenih v zgodnjih intervalih po draženju z antigenom (Kay, A. B.J^IecgvIžljn^imniunpl. (1991) 87:893-910).

Pred kratkim je bilo splošno priznano, da so kronične alergijske bolezni, kot sta astma in atopični dermatitis, rezultat osnovnega vnetnega procesa, ki vklučuje infiltracijo in aktivacijo v glavnem eozinofilcev in T celic (Kay, A. B. J. Allergv Ciin, Immunol. (1991) 87:893-910). Več linij dokazov podpira hipotezo, da se infiltracija levkocitov povezana z LPR, pojavlja kot rezultat degranulacije mastocitov. Pri obeh. človeku in poskusnih živalih, lahko povročitelj, ki inducira degranulacijo kožnih mastocitov z od IgE odvisnim ali s katerim drugim mehanizmom, prav tako podpira infiltracijo reakcijskih mest z levkociti (Soliey, G. O. in ostali. J. Ciin, Invest. (1976) 58:408-420; Lemansky, R. F. and Kaliner, M., v Allerav; Principles and practice. Vol. 1 (1988), Middeton, Jr., E. in ostali (Eds.), pp. 224-246; Kay, A. B. J. Allerav Ciin. Immunol. (1991) 87:893-910). Pregled posredovalcev , ki jih lahko izdelajo z aktivirani mastociti, odkriva številne, ki bi lahko prispevali k levkocitni infiltraciji v LPR, vključujoč lipidne posredovalce, kot so LTB4, LTC4, LTD4, PGD2 in PAF (platelet activating factor), kot tudi posamezne peptidne ali proteinske kemotaktične faktorje (Holgate, S. T. in ostali, v Allergv: Principles and Practice. Vol. 1 (1988), Middleton, Jr. E. in drugi (Eds.), pp. 135-178). Omenjeni povročitelji so v intervalu velikosti od tetrapeptidnih ‘eozinofilnih kemotaktičnih faktorjev anafilaksije do nevtrofilnih kemotaktičnih fatorjev, ki imajo veliko molsko maso. Nedavno so identificirali še več potencialnih mediatorjev infiltracije levkocitov povezanih z mastociti, ki vključujoč citokine podobne ali identične TNF-α, IL-1a in štirim članom MIP-1 genske družine malih sekretomih peptidov (Gordon, J. R. in ostali,_(mtTUJfiPJ^TQ5i.8y„(1990) 11:458464). Izkazako se je, da imajo štirje od teh citokinov (TNF-α, IL-1a, MIP-1 a in MIP-1 B), sposobnost podpiranja infiltracije levkocitov.

Še novejše, (Wershil, B. K. in ostali, v J. Ciin. Invest, (1991) 87:446-453) z uporabo miši s pomankanjem mastocitov so pokazali, da je okrepitev levkocitov med od IgE odvisno LPR, mastocitno odvisna in da je bila ta inhibicija delno blokirana z lokalnim dajanjem anti TNF-α antiseruma. Danes je splošno sprejeto, da je inhibicija celične infiltracije/aktivacije, ki je povezana z od IgE odvisno LPR, odločilen terapevtski pristop pri lajšanju različnih alergijskih bolezni (Bames, P. J. N, Ena, J, Med. (1989) 321:1517-1527).

V presenečenje smo odkrili, da je LMVVH občutno inhibiral infiltracijo levkocitov med od IgE odvisno kožno LPR pri miših, podvrženih pasivni kožni anafilaksi (PCA).

Miši so prejele isto injekcijo (v ušesa) monoklonskega IgE anti DNP Ab (pribl. 20 ng). Dan kasneje smo mišim intavenozno injicirali DNP3q^q-HSA v slanici. Ušesno oteklino smo določili z merjenjem ušesne debeline z mikrometrom pred in v različnih intervalih po izivu z DNP-HSA. Pri vseh poskusih smo tkiva z mest PCA reakcij pridobili po usmrtitvi z zlomom vratu in jih raztelesili za barvanje z Giemsa. LMWH smo dali enkrat s podkožnim injiciranjem (5 μο/ιτιίδ) na dan 2.

Rezultati

Oteklina se je rapidno razvila na mestih PCA reakcij (Δ 35 χ 10*⁴ inče po 15 min) ne pa na kontrolnih mestih (ušesa, injicirana s samim topilom). Oteklina PCA mest se je občutno zmanjšala med 2 in 4 urami po intravenoznem antigenskem izzivanju.

PCA in kontrolna mesta smo histološko ocenili 6-8 ur po intravenoznem antigenskem izzivanju. Večina mastocitov na PCA mestih je kazala znatno ali zmerno degranulacijo. Nasprotno pa je < 5% mastocitov na kontrolnih mestih kazalo občutno degranulacijo. Samo na PCA mestih je bila nevtrofilna infiltracija signifikantna 6 uro po antigenskem izzivanju. Ta infiltracija je bila opazno reducirana (za 60%) pri miših, ki smo jih obdelali z LMWH dva dni prej. To zdravilo ni imelo nobenega učinka na obseg degranuiacije mastocitov. Zdravilo ni imelo nobenega učinka na totalno in diferencialno število levkocitov v periferni krvi teh živali. Zaključimo lahko, da je LMWH heparin inhibiral celulamo infiltracijo povezano z od IgE odvisno pozno kožno reakcijo. Dodatno, enako napovedujemo, da bo dajanje LMWH pokazalo ugoden učinek na kožno LPR pri živalih z aktivno kožno anafilaksijo (specifična IgE produkcija bo inducirana z DNP-HSA Alum). Prav tako so predvideni podobni terapevtski učinki na pljučno alergično vnetje (Tarayre, J. P. in ostali. Int, J. immUQQPhatma.C.oL (1992) 14(5) :847-855).

5.11. Zdravljenje človeške DTH z LMWH

Slika 8 predstavlja eksperiment, pri katerem smo 40 let starega moškega prostovoljca, težakega 85 kg. testirali na DTH reaktivnost na tetanusni antigen (aplikator za Merieux-ov kožni test). Po 24 in 48 urah smo izmerili okoli 18 mm strditve. Prostovoljca smo nato obdelali s podkožnim injiciranjem Fragmina® (serije 38609) 3 mg. Pet dni kasneje smo prostovoljca ponovno testirali na njegov DTH odgovor na tetanus in strditev je bila inhibirana na okoli 5mm. Prostovoljec je bil ponovno testiran na DTH 3 tedne kasneje (Recovery) in test je pokazal pozitivno reaktivnost s Fragminom®. Prostovoljca smo spet zdravili, kot prej, in merili DTH reaktivnost 7 dni kasneje. Zopet je bila DTH inhibirana na okoli 5mm strditve. Ponovno obnovao DTH smo znova opazili 3 tedne kasneje. Tako lahko LMWH pri količinah manjših od 5 mg inhibira DTH pri ljudeh z zdravljenjem v intervalih 5 in 7 dni.

6. Eksperimenti, kjer smo uporabili LMWH (Fragmin) in druge aktivne substance

6.1. Stabiinostne Študije inhibitorne aktivnosti LMWH (Fragmina) za TNF-a

Fragmin serije 38609 smo razredčili v normalni slanici na koncentracijo 5 pg/0.1 ml. V nekaj stekleničk smo zamešali še enako količino protamin sulfata (5 pg) in stekleničke spravili pri sobni temperaturi (21 °C) za 0 do 72 ur (tabela 11) ali pa pri temperaturi 4 θθ za 1 do 4 mesece (tabela 12). Fragmin z ali pa brez protamin sulfata smo uporabili in vivo za inhibicijo DTH reakcije T celic pri BALB/c miših, kot je zgoraj opisano. Za predstavljene eksperimente je bila pozitivna kontrola DTH 17.5 ± 1.2 χ 10'² mm (0 % inhibicija) in popolna inhibicija DTH je bila 2.6 ± 0.5 x 102 mm (100 % inhibicija).

Rezultati inkubiranja LMWH pri 20 θθ so navedeni v tabeli 11. Iz tabele 11 je očitno, da LMWH izgubi svojo inhibitorno aktivnost napram od TNF-a odvisni s T celicami posredovani DTH reakciji, čez 72 ur. med inkubacijo pri sobni temperaturi. Nasprotno pa heparin in LMWH izgubljata svojo antikoagulativno aktivnost pri sobni temperaturi le počasi.

Tabela 11. Stabilnost inhibitorne aktivnosti Fragmina (serija 38609, 5 pg/0.1 ml), brez protamin sulfata, pri 20 °C , napram DTH reakciji.

Število ur	DTH reakcija	% anti-DTH reaktivnosti
nič	17.5	±1.2	kontrola*
0	2.6	±0.5	100**
24	9.6	± 1.0	47
48	15.7	± 1.6	13
72	17	±0.8	0

nobene inhibicije popolna inhibicija

6.2. Izguba anti-DTH reaktivnost pri nizki temperaturi in stabilizacijski učinek dodanega protamina

A

Tabela 12 kaže, da Fragmin izgubi svojo sposobnost inhibicije DTH reaktivnosti mišjih T celic v razredčeni raztopini v 4 mesecih pri 4°C. Dodatek enake koncentracije protamin sulfata ne ovira inhibicije DTH reakcije, ampak dejansko ohrani to aktivnost intaktno po 4 mesecih pri 4°C. Zopet je rezultat nasproten normalni funkciji protamin sulfata, ko ga dodamo heparinu ali Fragminu, kjer protamin sulfat nevtralizira anti-koagulativne učinke heparinoidnih substanc.

Tabela 12. Izguba anti-DTH aktivnosti s Časom pri nizkih temperaturah. Stabilizacijski učinek dodanega protamina.

Fragmin	Meseci	Protamin	DTH	% Anti-DTH
(38609)	pri 4 °C	sulfat	(10'2 mm)	aktivnost
ne	nič	ne	15+ 1	kontrola*
da	1	ne	2.8+ 0.5	100”
da	1	da	3± 0.4	100
da-	2	ne	4+ 0.8	82
da	2	da	2.4± 1	100
da	3	ne	9.6+ 0.8	55
da	3	da	3+0.5	100
da	4	ne	14.8+ 1.4	0
da	4	da	3± 0.4	100
da	0	da	3± 0.5	100

nobene inhibicije popolna inhibicija

6.3. Priprava plošč oblečenih z ECM

Z ECM oblečene luknjice smo pripravili kot sledi. Sveže secirane volovske oči smo dobili iz klavnice v nekaj urah po klanju. Oči smo secirali na vrhu. da bi odstranili roženico. Roženice smo nato izbrskati ali izpraskali s skalpelom, da bi dobili roženične endotelialne celice. Te celice smo kultivirali na ploščah za tkivne kulture s približno 5 ml medija, vsebujočega DMEM, dopolnjenega z 10% seruma telečjih zarodkov, 5% telečjega seruma in antibiotiki, kot sta 1% streptomicin alil% neostatin, skupaj z 1% glutaminom kot stabilizatorjem. Celice, ki so se usedle na dno plošč po približno 2 dneh po setvi, smo vsake štiri dni hranili s svežim medijem in inkubirali pri 37 v vlažilnih inkubatorjih s 5% CO2. če želimo, lahko mediju dodamo nekaj fibroblastnega rastnega faktorja, čeprav dodatek FGF ni odločilen. Konfluentnim celicam smo (po približno dveh tednih) supematant odsesali stran in celice nato tripsinirali z 1-2 ml tripsina.

Osemdeset procentov teh primarnih celic (usoda preostalih 20% primarnih celic je razložena takoj spodaj) smo vzeli in razdelili na 5 96luknjičnih plošč z ravnim dnom. Celice smo kultivirali v DMEM, dopolnjenim s 4% dekstranom T-40, 10% seruma telečjih zarodkov in 5% telečjega seruma. Po okoli 7 dnevni inkubaciji pri 37 °C v vlažilnih inkubatorjih s 5% CO2. smo nastale konfluentne plasti endotelialnih celic lizirali. Razkrojni pufer, ki je vključeval 0.025 M NH4OH, vsebujoč 0.25% Tritona X in PBS, smo pustili stati nad celicami 10 minut in ga nato oddekantirali. Vsebino plošč smo nato trikrat sprali s PBS, ohlajenim na 4°C. Ta postopek je pustil ECM intakten, trdno pritrjen na celotno območje luknjice. Nastali ECM je bil prav tako brez jeder in celičnih ostankov. Z ECM-oblečene plošče lahko hranimo pri 4°C vsaj tri mesece.

Preostalih 20% primarnih celic smo pustili na enojni plošči in jih gojili v približno 5 ml medija, vsebujočega DMEM, dopolnjenega z 10% seruma telečjih zarodkov, 5% telečjega seruma in antibiotiki, kot je bilo prej opisano. Sekundami pridelek celic smo pustili, da je dosegel zadostno konfluentnost in ga nato obdelali s tripsinom, kot je bilo prej opisano. Zopet smo celice tripsinirali in jih razdelili, 80% smo jih kultivirali na 5 ploščicah v rastnem mediju, vsebujočem 4% Dextran T-40, 20% celic smo kultivirali na enojni ploščici kot prej. Iz te enojne plošče je možno še enkrat izvesti 80/20 delitev.

6.4. Degradacija sulfatiranih proteoglikanov

S ³⁵(S)C>4 označen ECM smo 48 ur inkubirali s 5 μΙ MM5 heperanaze (4 U/ml) v 1 ml PBS in 100 gl 8.2 M fosfatno-citratnega pufra (pH 6.2) pri 37 °C. Medij smo nato zbrali, centrifugirali pri 10.000xg 5 min, (neobvezno) in analizirali po želji z gelsko filtracijo na Sepharoznih 4B kolonah. Dvo ml frakcije smo eluirali s PBS s pretočno hitrostjo 5 ml/uro in prešteli radioaktivnost z uporabo Bio-Fluor scintilacijske tekočine.

Ta s ³⁵(S)O4-označen eksperiment je pokazal, da je bil ECM dejansko degradiran, da smo nastale degradacijske produkte uspešno izvlekli in nadalje primemo filtrirali skozi Sepharozne 4B kolone. Sledeče eksperimente povezane z degradacijo sulfatiranih proteoglikanov, smo izvršili na neoznačenem ECM, namesto tega smo opazovali degradacijske produkte z merjenjem njihove absorpcije pri 206 ali 232 nm.

Kot prej, smo izvedli encimske degradacijske eksperimente, kot dodatek, smo degradacijske produkte (D ECM) nadalje očistili z nanašanjem degradiranih proteoglikanov, ki so se eluirali s Sepharozne kolone, na HPLC kolone. HPLC analize frakcij s kolon s Sepharozo smo izvršili na način, ki je opisan v poglavju 6.11 in kot sledi. Detekcija degradacijskih produktov je bila dosežena zopazovanjem njihove absorpcije pri 206 nm.

Dodatni encimski dehradacijski eksperimenti so bili izvršeni s podobnimi rezultati ob uporabi PC3 encima in heparanaze. pridobljene pri ΙΒΕΧ.

6.5. Čiščenje humanih CD4+ T celic

CD4⁺ T celice smo pridobili iz perifernih krvnih mononukteamih levkocitov, pridobljenih iz zdravih človeških darovalcev, kot sledi. Mononukleame celice smo izolirali na Ficoll gradientu, sprali v RPMI, dopolnjenim z 10% FCS in antibiotiki, v petrijevkah in inkubirali pri 37 ³C v vlažilnih inkubatorjih s 10% CO2. Po 1 uri smo neadherirane celice odstranili in jih 45-60 min inkubirali na kolonah najlon-volna(Fenwall, IL) pri 37 °C v vlažilnih inkubatorjih s 10% CO2. Neadherirane celice smo eluirali in sprali. CD4⁺ T celice smo negativno selekcionirali z izpostavljanjem eluiranih celic mešanici naslednjih monoklonskih antiteles (mAb): anti-CD8, CD19 in CD14, konjugiranih na magnetne kapljice (Advanced Magnetics, Cambridge, MA). Nevezane celice smo oživli in pregledali njihove fenotipe. Dobljene prečiščene celice so bile v večini (>90%) CD3+CD4+, kot smo določili s FACScan analizo.

6.6. Biotest aktivnosti TNF-α z uporabo humanih CD4⁺ T celic, pridobljenih Iz PBLs

250.000 humanih CD4+ T celic smo 1.5 uro predinkubirali s 150 μΙ degradacijskih produktov ECM, pri različnih koncentracijah pri 37 °C, pod 7% COg atmosfero. Nato smo dodali 100 μΙ PHA (Wellcome Co., England, ^ig/ml) za 3 urno inkubacijo v 96-luknjičastih ploščicah z ravnim dnom (Costar). Nadalje smo vsebine luknjic (3-6 luknjic na eksperimentalno skupino) zbrali, centrifugiraii in medij testirali na TNF-α izločanje, kot je bilo opisano v poglavju 5.1. Na kratko, supernatante kultiviranih limfocitov smo dodali kulturam mišjih fibrosarkomnih celičnih klonov (BALB/c.CL.7). BALB/c.CL.7 celice so občutljive na ubijanje z TNF-α v prisotnosti aktinomicina D (0.75 pg/ml). Nophar, Y. in ostali. J. Immunol. (1988) 140(10):3456-3460. Smrt teh celic, v prisotnosti testnega medija, smo kalibrirali v primerjavi s titracijsko krivuljo za eksogeno dodani TNF. Celično sposobnost za življenje določimo z dveumim inkubiranjem z MTT tetrazolom (Sigma, Cat. No. M2128), z ekstrahiranjem barve, ki so jo celice vzele, z mešanico izopropanol-HCf in s kolorimetričnim merjenjem (pri 570 nm) z Microelisa Autoreader. TNF-α določanje smo naredili s testiranjem nevtralizacijskega učinka anti-murin TNF-α mAb (razredčen 1/400; Genzyme, MA).

6.7. Degradacija heparina

En miligram heparina (Sigma) v 1 ml PBS in 100 μΙ 25 M fosfatnocitratnega pufra (pH 62) smo 48 ur inkubirali z 20 μΐ MM5 (5 u/ml) pri 37 °C.

Produkte reakcije smo nato analizirali z gelsko filtracijo na Sepharoznih 4B kolonah. Dvo ml frakcije smo eluirali s PBS pri pretočni hitrosti 5ml/uro. Za nadaljnjo karakterizacijo degradacijskih produktov smo pike eluirane iz Sepharozne kolone, podvrgli HPLC separaciji z uporabo Toyo Soda-Gel G3000SVV in G2000SW HPLC kolon, kot je opisano v poglavju 6.11 in kot sledi.

Nadaljne eksperimente smo izvedli z uporabo 20 μΙ PC3. PC3 encimsko reakcijo smo izpeljali z 1 mg heparina pod enakimi pogoji kot je bilo opisano prej za MM5 razen, da smo reakcijo inkubirali 24 ur namesto 48 ur. Produkte smo nato analizirali z gelsko filtracijo na Sepharoznih 4B kolonah (slika 29).

Rezultati in vitro biotesta so predstavljeni v tabeli 19 spodaj.

6.8. Izvabljanje DTH odgovora pri miših In preverjanje Inhibitornih učinkov

BALB/c miši (vsaj 5 miši na skupino) smo senzibilizirali na obritem abdomnu s 3% 4-etoksimetilen-2-fenil oksazolonom (OX; BDH Chemicals, GB) v aceton/olivnem olju uporabljenem lokalno. DTH občutljivost smo izvabili 5 dni kasneje kot sledi. Miši smo izzvali s 0.5% OX v aceton/olivnem olju. Uho smo izmerili tik pred izzivanjem in 24 ur kasneje z Mitutoyo inženirskim mikrometrom (Japan). individualno merjenje otekline ušesa nepokaže identitete skupin miši. Za interferiranje z DTH odgovorom smo nizko molekularne imuno-regulatome frakcije, razredčene v PBS, podkožno dajali v hrbte obdelanih miši po določenem časovnem programu in koncentracijah. Obdelane miši smo pregledali med in po (> 2 mesečnem) obdelovanju in klinično nismo opazili nobenega večjega stranskega učinka.

6.9. Separiranje LMVVH (Fragmin) na gelski kromatografskl (po velikosti) izkiučitveni koloni (Sepharoza 4B)

Fragmin (serija 38609) in neaktivni Fragmin smo frakcionirali z gelsko filtracijo na Sepharoznih 4B (Pharmacia) kolonah. 0.5 ml frakcije smo eluirali s PBS pri pretočni hitrosti 5 ml/uro in opazovali absorbanco pri 206 nm.(Pri 280 nm ni bilo detektirane nič absorbance). Graf števil frakcij proti absorbciji pri 206 nm je predstavljen na sliki 11. Rezultati biotestov za izbrane frakcije so predstavljeni v tabelah 13 in 14, spodaj.

Tabela 13. Učinek poplnega Fragmina, frakcij Fragmina s Sepharoze 4B in HPLC frakcij, ki so dobljene iz frakcij s Sepharoze 4B, na izločanje aktivnega TNF z uporabo humanega PBL biotesta.

Testni material	konc. (pg/mi)	Biotest aktivnosti TNF(%)	R vrednost % x (pg/ml)'1
aktiven frag/popoln	1	'flhmaks (®0%)	90
inaktiniran trag/popoln	a	ni učinka	0
inaktiviran frag/Seph. 4B-F15	5	'nhmaks (50%)	50
inaktiviran frag/Seph. 4B-F10	a	ni učinka	0
inaKiiviran frag/Seph. 4B-F8	1000	POVmaks (θθ%)	0.06
inaktiviran frag/Seph. 4B-F2	1000	P°vmaks (00%)	0.03
frag/HPLC-F-90	b	ni učinka	0

a koncentracijski interval med 1 pg/ml - 0.001 pg/ml b koncentracijski interval med 1 pg/ml - 0.01 pg/ml

Tabela 14. Učinek popolnega Fragmina in Sepharoznih 4B frakcij Fragmina na DTH občutljivost miši

Testni material	Količina (μρ/gm miš)	Inhibicija DTH (>50%)	R vrednost % x (qg/gm)'1
aktiven frag/popoln	0.2	50	250
inaktiviran frag/popoln	0.2 - 0.004	ni učinka	0
inaktiviran frag/Seph. 4B-F15	0.004	50	12,500
inaktiviran frag/Seph. 4B-F10	0.2 - 0.004	ni učinka	0

6.10. Dodatni eksperimenti, ki vključujejo frakcionacijo Fragmina in s heparanazo degradiranega ECM

Fragmin in s heparanazo degradiran ECM smo trakcionirali z gelsko filtracijo na Sepharoznih 4B kolonah. Frakcije po 0.3 ml smo eluirali s PBS pri pretočni hitrosti 5 ml/uro in opazovali absorbanco pri 206 nm. ( Pri 280 nm absorbanca ni bila detektirana). Graf števil frakcij proti absorbciji pri 206 nm je predstavljen na sliki 14. Rezultati biotestov za izbrane frakcije so predstavljeni v tabeli 15 spodaj.

Tabela 15. Učinek frakcij Fragmina s Sepharoze 4B in DECM na izločanje aktivnega TNF-α, z uporabo humanega PBL biotesta

Testne	konc.	Biotest aktivnostiTNF	R vrednost
frakcije	(pg/ml)	(%)	% x (pg/ml)'1

frag/Seph. 4B-F39	100	'nhmaks (θθ%)	0.6
DEMC/Seph. 4B-F39	10,000	'nhmaks (θ5%)	0.0085
frag/Seph. 4B-F42	a	ni učinka	0
DECM/Seph. 4B-F42	a	ni učinka	0
frag/Seph. 4B-F32	10	P°vmaks (55%)	5.5
DECM/Seph. 4B-F46	10	P°vmaks (20%)	2

a koncentracijski interval med 1 pg/ml - 0.001 pg/ml

6.11. Separacija aktivnih substanc iz Fragmina z uporabo tekočinske kromatografije z visoko ločljivostjo

Izvedli smo dva eksperimenta z uporabo dveh setov pogojev za tekočinsko kromatografij z visoko ločljivostjo. Začetni tip uporabljene kolone je bil 30 cm x 7.8 mm I.D. TSK-Gel® G-Oligo-PW kolona s 4 cm x 6 mm I.D. zaščitno kolono. Kolono smo eluirali z 0.2 M fosfatnim pufrom, pH 7.0, pri pretoku 0.5 mi/min. Vsaka od zbranih frakcij je imela 0.5 ml volumna.

Drugi uporabljeni tip HPLC je bil Toyo Soda TSK-Gel G3000SVV (7.5 mm x 50 cm) in G2000SVV (7.5mm x 50 cm) koloni (zaporedno) s 7.5 mm x 10 cm zaščitno kolono iz Phenomenexa. Kolona smo eluirali pri 1 ml/min s skrbno deaeriranim 0.5 M NaCl. Vsaka od zbranih frakcij je imela 0.5 ml volumna. Detektor je bil nastavljen na 232 nm z 0.02 AUFS in z retenzijskim časom merjenim na ± 0.1 sekunde. Prazne in totalne volumne smo izmerili z modrim dekstranom in natrijevim azidom. Zbrane vzorce smo izpostavili tudi detekciji pri 206 nm pod istimi pogoji kot pri 232 nm.

Graf števil frakcij Fragmina s HPLC proti absorbciji pri 206 nm je predstavljen na sliki 18A. Rezultati biotestov za izbrane frakcije so predstavljeni v tabeli 16, spodaj. Iz predstavljenih rezultatov je razvidno, da so določene substance sposobne inhibirati aktivnost TNF-α, medtem ko so druge sposobne povečati njegovo aktivnost.

Tabela 16. Učinek popolnega Fragmina in njegovih HPLC frakcij na izločanje aktžvnegaTNF-a, uporaba humanega PBL biotesta

Fragminska frakcija	konc. (pg/ml)	Biotesl
TNF aktivnost (%)	R’ vrednost % x (pg/ml)'1
popoln	10	•nhmaks (40%)	4
HPLC-F1	100	Povmaks (θθ%)	0.6
HPLC-F3	10	•nhmaks (70%)	7
HPLC-F16	10	•nhmaks (100%)	10
HPLC-F22	10	•nhmaks (100%)	10
HPLC-F26	100	•nhmaks (50%)	0.5
HPLC-F30	100	•nhmaks (70%)	0.7
HPLC-F47	100	•nhmaks (55%)	0.55

a Popoln Fragminski vzorec je bil 90 dni staran pri 4 0c.

6.12. Separacija aktivnih substanc Iz ECM z uporabo tekočinske kromatografije z visoko ločljivostjo

Separacijo aktivnih substanc iz ECM z uporabo tekočinske kromatografije z visoko ločljivostjo smo izpeljali kot je razloženo v poglavju 6.11.

Graf števil frakcij Fragmina s HPLC proti absorbciji pri 206 nm je predstavljen na sliki 18B. Rezultati biotestov za izbrane frakcije so predstavljeni v tabeli 17, spodaj. Iz predstavljenega izuma je razvidno, da so določene substance, izolirane iz heparanao posredovane degradacije ECM, sposobne inbibirati aktivnost TNF-α, medtem ko so druge sposobne povečati njegovo aktivnost. Rezultati prav tako kažejo, da določene frakcije pridobljene iz HPLC separacije, ne kažejo nobenega učinka na aktivnost TNF.

Tabela 17. Učinek DECM HPLC frakcij na izločanje aktivnega TNF, uporaba humanega PBL biotesta.

Biotest
DECM frakcija	konc. (pg/ml)	aktivnosti TNF (%)	R vrednost % x (pg/ml)’1
HPLC-F1	a	ni učinka	0
HPLC-F5	a	ni učinka	0
HPLC-F10	10	•H^maks (θθ%)	6
HPLC-F14	10	'H^maks (70%)	7
HPLC-F17	a	ni učinka	0
HPLC-F25	1000	Povmaks (40%)	0.04
HPLC-F33	100	Povmaks (40%)	0.4
HPLC-F37	10	Povmaks (1θ0%)	10
HPLC-F39	100,000	'H^maks (θθ%)	0.0006
HPLC-F42	a	ni učinka	0
HPLC-F46	1000	P°vmaks (30%)	0.03
HPLC-F49	1000	P°vmaks (30%)	0.03
HPLC-F61	a	ni učinka	0

a

Pri konc. intervalu med 1 pig/ml - 0.001 pg/ml.

6.13. Karbazolni kvantitativni sladkorni test

Na kratko, 1500 pJ reagenta, to je borat žveplene kisline, ohladimo na ledeni kopeli. Testno raztopino (250 μ|, vsebujočo 20 μρ uronske kisline/ml) nato previdno naložimo na površino regenta borove kisline in pustimo 10 minut, da difundira. Nato smo raztopine temeljito premešali, dali za 10 minut na vrelno kopel in nato ohladili na ledeni kopeli. Ohlajeni karbazol (50 μΙ) smo nato dodali mešanici, premešali na vorteksu in nato za 15 minut položili v vrelno kopel. Raztopino smo nato ohladili in merili absorbanco pri 525 nm. Rezultati so primerljivi s kalibriranimi raztopinami.

6.14. Izolacija disaharida iz produktov degradacije ECM

Disaharidno substanco smo izolirali s HPLC iz volovskega roženičnega endotelialnega ECM. ki smo ga izpostavili sesalski heparanazi (MM5).

Podrobneje: z ECM-oblečeno ploščico smo inkubirali z 20 μΐ sesalske heparanaze (0.5 mg/ml) v 1 ml PBS pufra (ki je bil prej naravnan na pH 6.2 s citronsko kislino) za 48 ur pri 37°C. Medij smo nato zbrali in nanesli na Sepharozno 4B kolono (35 cm x 0.7 cm notranjega premera ID). Mobilna faza je bil PBS pufer pri pretočni hitrosti 5 ml/uro. Frakcije po 2.2 ml smo zbrali in jih opazovali pri 206 nm (slika 19). Vzorec (100 μΐ) iz Sepharozne 4B frakcije št. 5 (8.8-11 ml elucijskega volumna) smo injicirali v HPLC kolono (Toyo Soda TSK-Gel G3000SVV (7.5 mm x 50 cm) in G2000SW (7.5 mm x 50 cm), v serijah s 7.5 mm x 10 cm zaščite od Phenomenex). Mobilna faza je bil 0.5 M NaCl pri pretočni hitrosti 1 ml/min. Eno ml frakcije smo zbrali in jih opazovali pri 206 in 232 nm (sliki 20A in 20B). Pik št. 1 (P1) je bil suho zamrznjen v 25 ml kalupu. Vzorec vsebuje pripližno 20 μρ oligosaharida (določenega s karbazolnim testom) v 60 mg NaCl.

Vzorec ima ©lucijski profil, ki je podoben disaharidnemu standardu ali “markerju molekulske teže, ki ga komercialno pridobimo z depolimerizacijo heparina (Sigma).

Inhmaks vrednost substabce . osnovane na podobno pridobljenih vzorcih (poglej, na primer, maksimum F73 na sliki 21A (elucijski čas približno minut) in podatek F5/HPLC-F73 v tabeli 18 spodaj), je bila ugotovljena pri 87% pri in vitro TNF-α inhibicijskem testu, z uporabo humanih PBL, s koncentracijami okoli 10 pg/ml. Biotesti smo vodili, kot je že bilo zgoraj razloženo. Ta vzorec lahko očistimo še naprej z uporabo SAX-HPLC kolone, kot je spodaj opisano.

6.15. Izolacija disaharida iz degradacijskih produktov ECM z vključevanjem SAX-HPLC kromatografije

Z ECM oblečeno ploščico smo inkubirali z 20 μΙ sesalske heparanaze (0.5 mg/ml) v 1 ml PBS putra (ki je bil prej naravnan na pH 6.2 s citronsko kislino) za 48 ur pri 37 °C. Medij smo nato zbrali in nanesli na Sepharozno 4B kolono (0.7 x 35 cm). Mobilna faza je bil PBS pufer pri pretočni hitrosti 5 ml/uro. Frakcije po 1.6 ml smo zbrali in opazovali pri 206 nm (slika 22). Frakciji številka 7-8 smo združili in suho zamrznili, prah smo resuspendiraii v 1/10 začetnega volumna. Vzorce (100 μΐ) smo injicirali v HPLC kolono (Toyo Soda TSWK-Gel G3000SVV 7.5 mm x 50 cm in G2000SVV 7.5 mm x 50 cm, v serijah s 7.5 mm x10 cm zaščite iz Phenomenex), kot prej. Mobilna faza je bil 0.5 M NaCl pri pretočni hitrosti 1 ml/min. Eno ml frakcije smo zbrali in opazovali pri 206 in 232 nm (slika 23). Maksimum (pik), označen z 1, smo zbrali iz desetih različnih ponovitev. Visoko homogene frakcije smo združili in suho zamrznili.

Material smo resuspendiraii v 2 ml dvakrat deionizirane vode in razsolili na Sephadex G-10 koloni (26 x 150 mm), eluirali pri 1.6 ml/min z dvakrat deionizirano (DD) vodo. Eno ml frakcije smo zbrali in opazovali pri 232 nm in izmerili prevodnost (za določevanje vsebnosti NaCl). Razsoljene frakcije smo združili, suho zamrznili in jih resuspendiraii v 1 ml DD H2O. 1 ml vzorec, pripravljen z združevanjem 100 μΐ resuspendirane raztopine in 900 μ! 0.2 M_NaCI pri pH 3.5, smo injicirali v analitično SAX-HPLC kolono (4.6 x 250 mm, polnjeno z Spherisorb, velikost delcev 5 mm). Pretočna hitrost je bila 1.5 ml/min in program linearnega gradienta NaCl je bil nastavljen kot sledi:

Čas/pufer	A(%)	B (%)	C (%)(min)
0	100	0	0
2	100	0	0
35	38	62	0
40	38	62	0
45	0	100	0
47	0	100	0
50	0	0	100
55	0	0	100
58	100	0	0
60	100	0	0

A = 0.2 M NaCl, pH 3.5 B = 1.5 M NaCl, pH 3.5 C = H₂O

Kolonski eluat smo opazovali pri 232 nm (slika 24) in pik A23/4 smo zbrali in ga testirali za inhibicijo TNF. Inh_mak_s za to SAX-HPLC frakcijo je bila 60% pri koncentraciji 0.1 pg/ml, dala je R vrednost 600 % x (pg/ml)‘¹.

Heparinske disaharidne standarde z različnimi nivoji sulfatiranja smo injiciraii v SAX-HPI_C kolono pod identičnimi pogoji. Elucijski profili teh standardov so predstavljeni na slikah 25A-C. S teh slik je razvidno, da so dali disaharidni standardi različne retenzijske čase, nesulfatirani disaharid (Sigma Product No. H-0895) se je eluiral najhitreje (slika 25A), disulfatirani disaharid (Sigma Product No. H-1020), se je eluiral vsaj 20 minut (slika 25B) in trisulfatirani disaharid (Sigma Product No. 9267) se je eluiral kot zadnji (slika 25C). Trisulfatirani disaharidni standard H-9267 je imel retenzijski čas zelo podoben času. ki smo ga dobili za pik A23/4 (to je 23.07 min. napram 23.10 min).

6.16. Rezultati In vitro humanih PBL biotestov za različne substance

Rezultati in vitro biotestov z uporabo humanih PBL za različne aktivne substance in začete ‘mešanice* so predstavljeni v tabeli 18 za produkte, pridobljene z degradacijo ECM, vklučujoč pik ’ΡΓ s slike 20. Medtem, ko P1 daje R vrednost 10 % x (pg/ml)'¹, daje začetna D ECM “juha “R vrednost 0.000053 %x (pg/ml)'¹.

Tabela 18. Učinek ECM+MM5 heparanaze (DECM juhe), Sepharoznih 4B frakcij juhe in HPLC frakcij Sepharoznih 4B frakcij na izločanje aktivnega TNF-α, uporaba humanega PBL biotesta.

Testni material	konc. (pg/ml)	Biotest TNF aktivnost R* vrednosti
(%)	% x (pg/ml)’1
DECM juha 5	1 x106	’n^maks	(53%)	5.3 x 10'
Seph.4B-F5	100	•hhmaks	(50%)	0.5
Seph.4B-F6	100	•rt^maks	(60%)	0.6
Seph.4B-F7,8	100	Hhmaks	(81%)	0.8
F5/HPLC-F73	10	iH^maks	(87%)	8.7
F5/HPLC-F65	10	•n^maks	(78%)	7.8
F5/HPLC-F22	10	'H^maks	(33%)	3.3
F6/HPLC-F86	10	inhmaks	(43%)	4.3
P1	10	inhmaks	(100%)	10.0

6.17. Izolacija oligosaharidov iz degradacijskih produktov heparina

Na način za degradacijo ECM, ki je podoben tistim, že zgoraj razloženim, smo intaktni heparin obdelali s heparanaznimi encimi, pridobljenimi iz različnih virov, tu označenimi kot MM5 in PC3 (glej. Shoseyov, O. in ostali. Biochem, Biophvs, RES, COMM, (1990) 169:667672, za preparacijo PC3 encima). Nekatere začetne degradacijske mešanice smo separirali na Sepharozi 4B (glej sliko 26 za Heparin+MM5 Sepharozne 4B frakcije F7 in F8 ter sliko 27 za Sepharozno 4B kromatografijo heparina + PC3 in PC3 samega). Ob tem smo druge frakcije nadalje separirali s HPLC 2 metodami, opisanimi spodaj (glej sliki 28A in 28B za frakcije F7/HPLC-F86, -F84 in -F90). Intaktni heparin in Fragmin smo prav tako izpostavili direktnim HPLC 2 pogojem in izbrane frakcije smo tako izolirali (HPLC-F90 iz Fragmina je predstavjena na sliki 29). Rezultati in vitro biotestov, uporaba humanih PBL, za različne aktivne substance in začetne mešanice, so predstavljeni v tabeli 19, vključno s produkti pridobljenimi z degradacijo heparina.

Tabela 19 Učinek intaktnega Heparina, Heparina + MM5 ali PC3 juh in izbranih Sepharoznih 4B in njihovih HPLC frakcij na izločanje aktivnega TNF-α, uporaba humanega PBL biotesta

Testni material	konc. (pg/ml)	Biotest
aktivnosti TNF (%)	R vrednost % x (pg/ml)1
intaktni Heparin	a	ni učinka	0
hep/HPLC-F90	a	ni učinka	0
dodatne Heparinske
frakcije
F7/HPLC-F86	0.1	*n^maks(26%)	260
F8/HPLC-F84	a	ni učinka	0
F8/HPLC-F90	a	ni učinka	0
hep/PC3 juha	0.1-	10 χ 10θ ni učinka	0
Seph.4B-F9	100	inhmaks(50%)	0.5
Seph.4B-F8	100	inhmaks(4°o/°)	0.4
samo PC3	a	ni učinka	0
Seph.4B-F8	a	ni učinka	0
Seph.4B-F9	a	ni učinka	0

a V koncetracijskem intervalu med 1 pg/ml - 0.01 pg/ml.

6.18. Rezultati in vivo DTH reaktivnosti miši, obdelanih z različnimi substancami

Različne substance smo testirali pod in vivo biotestnimi pogoji in ugotovili, da inhibirajo eksperimentalno DTH občutljivost miši do različnih obsegov, odvisno od njihove stopnje očiščenosti. Miši smo obdelali z aktivno substanco, kot je razloženo v poglavjih 5.1 in 5.2, zgoraj. V splošnem smo substance, ki smo bile očiščene do visoke homogenosti z visokotlačno tekočinsko kromatografijo, izkazovale R vrednosti v deset tisočih. Rezultati za eno skupino eksperimentov so predstavljeni v tabeli 20.

Kot je zapisano v tabeli 20, intaktni heparin in začetna ECM+MM5 juha ne izražata nobenega in vivo učinka. Pri kasnejšem primeru ni doseženega nobenega učinka, najverjetneje zaradi izničevanja učinka inhibitornih in povečevalnih komponent. Svež vzorec Fragmina (serija 38609) je izražal zmerno R vrednost, primerljivo vrednosti dobljeni v prejšnjih eksperimentih (glej, prvi vpis, tabela 9). Sepharozne 4B frakcije so manifestirale rahlo nižjo R vrednost kot ustrezne frakcije, pridobljene pod HPLC 2 pogoji.

Rezultati drugega seta eksperimentov, navedeni v tabeli 21, potrjujejo odsotnost kakršnega koli učinka začetne ECM + MM5 juhe. Kot je zapisano, HPLC 2 frakcija št. F5/HPLC-L22, kaže zelo visoko specifično regulatorno aktivnost, ko jo podkožno injiciramo v miši (R vrednost = 454,545 % χ (gg/gm)‘¹), prav tako kaže oralno aktivnost, čeprav pri višji količini, (R vrednost + 5,000 % x (ug/gm)¹). Prav tako je iz tabele 21 vidno, da imajo aktivne substance izolirane iz ECM, večjo in vivo specilično regulatorno aktivnost, kot tiste pridobljene iz Fragmina. Zato desulfatacija očitno zmanjša specifično inhibitomo aktivnost aktivne substance predstavljenega izuma. Dejansko pod in vitro biotestnimi pogoji dobimo povečevalne R vrednosti takih desulfatiranih disaharidov.

Nadaljnji eksperimenti prav tako kažejo, da so galaktozamin, monosaharid ali enostavni sladkor, ki nimajo sullatnih skupin, sposobni delovanja kot antagonisti inhibitome aktivnosti sullatiranih oligosaharidov predstavljenega izuma. Tako je mogoče, da desulfatirani oligosaharidi delujejo kot neposredne povečevalne komponente ali kot antagonisti specifične inhibitome aktivnosti karboksiliranih in/ali sullatiranih oligosaharidov. Opažanja predstavljenih raziskav so prav tako skladna z mehanizmom, po katerem se določene substance (na primer, trisutfatirani disaharid), vedejo kot agonisti do sedaj neidentificiranega naravnega inhibitorja izločanja aktivnega TNF-a.

Tabela 20. Tedenska obdelava miši z različnimi substancami in njihov učinek na DTH občutljivost miši

Testni Količina material (^tg/gm miši)	DTH odgovor (10'2 mm)	Inhibicija
DTH (%)	R vrednost % x (gg/gm)'1
nič	-	17.2±2		0	-
(-) kontrola		2		-	-
0.5 M NaCl	-	16.5± 1.5		5	-
intaktni Heparin	a	-		ni učinka	0
Fragmin
serija 38609	0.2	3± 1		85	425
DECM
MM5 juha	a	-		ni učinka	-
Seph.4B-F6	0.032	16.5±5		5	-
	0.016	16±2		10	-
	0.0032	14±2		20	-
	0.0006	7.1+ 1		65 (maks)	110,000
F6/HPLC-F9	0.032	11± 2		40	-
	0.01	17±2		0	-
	0.002	6± 0.5		70	-
	0.0006	6+1.2		70 (maks)	120,000
F6/HPLC-F11	0.02	17+3		0	-
	0.01	13±1		25	-
	0.001	9.5+ 2.5		55	-
	0.0006	2.8± 0.5		90 (maks)	150,000
F6/HPLC-F12	0.02	18±2		0	-
	0.01	150±2		15	-
	0.001	8.2±1.5		60	-
	0.0006	4± 1		80 (maks)	130.000

a Pri količinskem intervalu med 0.04-0.0004 gg/gm miši.

Tabela 21. In vivo DTH reaktivnostni podatki za miši, obdelanimi podkožno z različnimi substancami

Testni material	Količina (pg/gm miši)	DTH odgovor (10'2 mm)	'n^maks (%)	R vrednost % x (pg/gm)'1
ECM + MM5	a	20.4+ 0.7	ni učinka	0
juha F5/HPLC-L22	ο.οοβΡ	13.2+1.3	40 ± 12%	5,000
F5/HPLC-L22	0.000132	9.7± 1.3	60 ± 17%	454,545
FRAGMIN
FR/HPLC-2	0.00048	8.5± 1.3	70 ±20%	145,833

Pri količinskem intervalu med 0.04 - 0.0004 pg/gm miši. Oralno dajanje.

Pozitivna kontrolna skupina je imela DTH odgovor med 20.0 ±1.1 in negativna kontrolna skupina je imela DTH odgovor med 2.0 ± 1.0.

6.19. Primerjava in vivo aktivnosti SAX-HPLC frakcij proti znanim dlsaharidnim markerjem

Dva disaharidna markerja smo testirali pod in vivo pogoji, z namenom določitve njune sposobnosti inhibiranja relativne DTH reaktivnosti pri miših. Kot je prikazano na tabeli 22, sta dva markerja (H-1020 in H-9267) izrazila zmerno aktivnost, imela sta R' vrednosti med 140.000 - 160.000 % x (pg/gm)'¹. ko smo ju podkožno injicirali v miši. Marker H-1020 smo testirali tudi oralno in je imel skromno aktivnost (“R vrednost = 531 % x (pg/gm)'¹). Marker H-1020 je O.N-di-suliat, medtem ko je H-9267 marker O,O',N-trisuffat. Njuni strukturi sta narisani spodaj.

Η - 1020

Kot je predstavljeno v tabeli 22, je SAX-HPLC frakcija L22/SAX-A23/4 (Slika 24) prinesla nadaljnje izboljšanje že tako visoke specifične regulatome aktivnosti F5/HPLC-L22, dala je R vrednost 630,303 % x (gg/gm)’¹, v primerjavi z *R vrednostjo 454,545 % x (gg/gm)’¹ za F5/HPLCL22 (tabela 21). Odkrili smo vendar, da ta disaharidna substanca, z retenzijskim časom skozi SAX-HPLC kolono, ki je skoraj identičen retenzijskemu času H-9267, izgubi svojo sultatno skupino pri pH 3.5 v nekaj dneh pri sobni temperaturi. Tako je ponovna analiza starega vzorca skozi SAX-HPLC kolono odkrila, da je prvotni pik pri 23.10 min. omogočil pot trem glavnim pikom, označenim kot 2039/1,2039/2 in 2039/3 na sliki 30, vsi trije imajo retenzijske čase krajše od A23/4. Pik 2039/3, ki ima retenzijski čas podoben H-1020 markerju, je zelo verjetno izgubil N-sulfatno skupino. Pika 2039/1 in 2039/2 verjetno ustrezata monosulfatiranim ali popolnoma desulfatiranim disaharidom. (Njuna retenzijska časa sta primerljiva disaharidnemu markegu H-0895, ki je N-acetilglikozaminoglikan brez sulfatne skupine.)

Vsako od teh desulfatiranih substanc smo zbrali in jih testirali pod in vivo DTH biotestnimi pogoji in presenetljivo ugotovili, da imajo samo zmerno inhibicijsko aktivnost ali pa je sploh nimajo. (Glej tabelo 22). Zares so pri in vitro humanem PBL biotestu vsi trije piki manifestirali povečanje izločanja aktivnega TNF-α. Ti in vitro rezultati so podani takoj spodaj:_

SAX-HPLC konc. P°^vmaks *R vrednosti pik (pg/ml) (%) %x (pg/ml)·¹

2039/1

2039/2

2039/3

Tabela 22. Dodatni in vivo rezultati z uporabo različnih podkožno dajanih disaharidov

‘Rvrednost	Količina	DTH
Testni	(pg/gm	odgovor	Inhmaks	%x
material	miši)	(10'2 mm)	(%)	(pg/gm)

PBS (poz. kontrola)		18.6+0.7
Naravno (neg. kontrola)	-	1.4+ 0.2	-	-
SAX-HPLC frakcije
A23/4	0.000132	3± 1	83	630,303
2039/3	0.0005	3.1± 1.1	83	166,000
2039/1	0.000132	18.5± 1.1	ni učinka	0
markerji
H-1020	0.0005	4.7± 0.7	73	146,000
H-1020	0.128a	5.9± 0.9	68	531
H-9267	0.0005	3.5+ 1	80	160,000

Oralno dajanje.

6.19.1. Nadaljnji rezultati sposobnosti izbranih disaharidov za regulacijo produkcije aktivnega TNF-α in vivo

Izvedli smo dodatne eksperimente, v katerih smo izbrane disaharidne molekule, komercialno dosegljive pri Sigma Chemical Co. in identificirane tu z njihovo kataloško številko Sigma Catalog Nos., testirali na glede njihovo sposobnost inhibicije ali povečevanja eksperimentalne DTH reakcije pri miših in tako je omogočena indikacija njihove sposobnosti reguliranja produkcije aktivnega TNF-α pri teh sesalcih.

Podrobneje, CD1 miši (dosegljive na VVeizmann Institute Animal

Breeding Center, Rehovot, Israel), 4-12 miši na skupino, smo obdelali kot je opisano v poglavju 5.2 ali 6.8.

Rezultati različnih eksperimentov so zbrani v tabeli 23A spodaj. Kot je razvidno, so štirje od enajstih testiranih disaharidov izkazali inhibitorni učinek na oteklino na ušesih miši, ki nastane kot odgovor na dajanje oksazolona. Inhibicija s T celcami posredovanega inflamatornega odgovora je tako vidna kot indikacija, da lahko disaharidi, ki kažejo ne-ničelno R vrednost, inhibitorno regulirajo produkcijo aktivnega TNF-α. Iz rezultatov, navedenih v tabeli, so R vrednosti v okviru od relativno skromne 65,000 % x (gg/gm) ¹do čez okoli 1,500,000 % x (pg/gm)*1. Poudariti je treba, da visoka R vrednost ni nujno najbolj željena karakteristika aktivnih snovi, ki nas zanimajo. Podrobneje, količinsko okno, v katerem določena spojina kaže fiziološke učinke, naj bi bilo široko kot je le mogoče , tako da je manjša verjetnost, da dajana količina ne bi bila iz učinkovitega količinskega intervala. Kot je nakazano v opombah pod tabelo 23A, kaže da ima molekula H-9392, med vsemi testiranimi spojinami najširše količinsko okno, 0.000132 - 0.004 pg/gm.

Enako evidentna iz rezultatov je presenetljiva sposobnost enega od enajstih testiranih disaharidov, da povečuje oteklino, povzročeno z eksperimentalno DTH T celično reakcijo. Spojina H-0895, ki nima sulfatnih skupin, kaže izreden učinek na stopnjo otekanja pri zelo nizki količini okoli

1.2 pikograma disaharida na gram miši. Rezultirajoča R vrednost okoli 76,700,000 % x (pg/gm)-1 je do sedaj nepresežena.

Tabela 23A Dodatni zn vivo rezultati. Uporaba različnih disaharidnih markerjev, podkožno dajanje.

Testni	količina	DTH	'nbmax	R vrednost
material	(pg/gm)	(10'2 mm)	(%)	% x(pg/gm)‘1
H-9392a	0.0012	4.2 ± 0.7	78	6.5 x 104
		(17.8 + 0.9}
H-1020b	0.0004	6.7 ± 1.1	66	1.65 x 105
		(19.6 ± 1.2)
H-9267C	0.0004	7.2 ± 1	64	1.60106
		(19.6 ± 1.2)
H-9517b	0.00004	7.6 ± 1	62	1.55 x106
		(20.4 ± 0.7)
Η-0895θ	0.0000012	37.3 ± 0.7	+92	7.67 x 108
		(18.9 ±0.7)
H-9017f	N.E.			0
H-86429	N.E.			0
H-9142h	N.E.			0
H-8767'	N.E.			0
H-8892J	N.E.			0
H-1145k	N.E.			0
a. H-9392 je 2-0-sulfat-4-deoksi-4-en-iduronska kislina-(a-1,4)-2-deoksi-2-

N-sulfatglukozamin. PBS (pozitivna kontrola) vrednost za ta set podatkov je prisotna v oklepaju. Oteklina neimuniziranib miši je bila 2.0±0.5 mm. To vrednost smo uporabili za vse izračune. Učinkovito količinsko območje za inhibicijo > 50% kontrole je bilo 0.000132 - 0.004 pg/gm.

b. H-1020 je 4-deoksi-4-en-iduronska kislina (a-1.4)-2-deoksi-2-N-sulfat-6O-sulfatglukozamin. Učinkovito količinsko območje za inhibicijo s50% kontrole je bilo 0.00004 - 0.0004 pg/gm. 'R' vrednost, predstavljena v tej tabeli, je dobro primerljiva s prejšnjo R vrednostjo, podano v tabeli 23, zgoraj. Ti rezultati indicirajo izredno ponovljivost in vivo testnih metod pri različnih skupinah CD1 linije miši.

c. H- 9267 je 2-O-sulfat-4-deoksi-4-en-iduronska kislina-(a-1,4)-2-deoksi2-N-sulfat-6-O-sulfatglukozamin. Učinkovito količinsko območje za inhibicijo >50% kontrole je bilo ozko.

d. H-9517 je 2-O-sulfat-4-deoksi-4-en-iduronska kislina-(a-1,4)-2-deoksi-2N-acetil-6-O-sulfatglukozamin.Učinkovito količinsko območje za inhibicijo ž 50% kontrole ja bilo 0.00004 - 0.00012 pg/gm.

e. H-0895 je 4-deoksi-4-en-iduronska kislinama-1,4)-2-deoksi-2-Nacetilglukozamin. Ti rezultati kažejo povečanje DTH reakcije. Učinkovito količinsko območje za povečanje >50% kontrole je bilo 0.000001 - 0.00004 Mg/gm.

f. H-9017 je 4-deoksi-4-en-iduronska kislina-(a-1,4)-2-deoksi-6-0sulfatglukozamin. N.E. pomeni, da ni bilo opaženih učinkov pri testiranem količinskem območju 0.000004 - 4 pg/gm miši.

g. H-8642 je 4-deoksi-4-en-iduronska kislina-(a-1,4)-2-deoksi-2-N-acetil-6O-sulfatglukozamin.

h. H-9142 je 2-O-sultat-4-deoksi-4-en-iduronska kislina-(a-1.4)-2deoksiglukozamin.

i. H-8767 je 2-O-sulfat-4-deoksi-4-en-iduronska kislina -(a-1,4)-2-deoksi-2N-acetilglukozamin.

j. H-8892 je 2-0-sulfat-4-deoksi-4-en-iduronska kislina-(a-1,4)-2-deoksi-6O-sulfatglukozamin.

k. H-1145 je 4-deoksi-4-en-iduronska kislina-(a-1,4)-2-deoksi-2-Nglukozamin.

Strukture štirih inhibitornih disaharidnih spojin, H-9329, H-9517, H-1020 in H-9267, so predstavljene spodaj.

INHIBITORJI

H - 9392

H-9517

H - 1020

H - 9267

Od enajstih testiranih disaharidov jih šest ne kaže nikakršnih stalnih učinkov in jih zato lahko klasificiramo kot ‘nevtralne. Strukture teh nevtralnih spojin so predstavljene v nadaljevanju.

NEVTRALNI

H - 8892

H - 8767

H - 1145

H -8642

Od enajstih je en disaharid povečal učinke eksperimentalne DTH reakcije. Struktura te spojine H-0895 je predstavljena spodaj.

POVIŠEVALEC

H - 0895

Tako je možno predpostaviti generično formulo, ki izraža strukturne karakteristike inhibitomih spojin iz te izvedbe izuma.Ta generična formula (H-GENUS) je prikazana spodaj:

H-GENUS v kateri je X-| H ali SO³; Χ2 je H ali SO³; in Χ3 je SO³ ali COCH3 predvidoma, če je Χ3 SO³', potem je vsaj eden. X-| ali Χ2, SO³' in če je Χ3 COCH3, potem sta oba, Xj in Χ2, SO³· V mejah spojin, ki imajo precej široko okno učinkovitih količin, je Xj najraje SO³· Χ2 je najraje H in Χ3 najraje SO³ (to je, H-9392 ima najširše okno učinkovitega inhibitomih količin).

Iz rezultatov, predstavljenih zgoraj, lahko prav tako opazimo, v mejah inhibicije, da je najbolj zaželjen substituent glukozaminovega dušika, sulfat. S sulfatom na 2-N položaju glukozamina (Χ3), je opažena inhibitoma aktivnost v prisotnosti le enega drugega sulfata oboje, na 2-poiožaju ostanka iduronske kisline ali 6-položaju glukozamina. Prisotnost dveh dodatnih sulfatov na obeh hidroksilnih položajih bo prav tako delovala, toda v odsotnosti kateregakoli dodatnega sulfata (kot v H-1145) nam da nevtralno spojino.

Nasprotno, uvedba acetilne skupine na 2-N položaj glukozamina zahteva prisotnost dveh dodatnih sulfatov, na vsakem 2-položaju iduronske kisline (X-,) in na 6-položaju glukozamina (Χ2). Odsotnost katerekoli substituente na 2-N položaju glukozamina vodi do pozitivno nabite amonijeve skupine, učinkovito nevtralizira vsah inhibitorni učinek, kot je dokazano z dejstvom, da so bile vse testne spojine H-9017, H-8892 in H9142 ‘nevtralne. Prisotnost ene ali dveh sulfatnih skupin na 2-položaju iduronske kisline ali na 6-položaju glukozamina nima očitnih učinkov.

Končno, prisotnost acetilne skupine na Χ3 kombinirana z odsotnostjo sulfatnih skupin na Χ-j in X2_t vodi do povečanja regulatome aktivnosti (H0895).

Opaziti je treba močno korelacijo med negativnimi naboji, prisotnimi v disaharidu, in njegovo sposobnostjo inhibiranja produkcije TNF-a. Prisotnost pozitivno nabite amonijeve substituente vodi do nevtralnosti, medtem pa po naboju nevtralna spojina H-0895 poveča produkcijo aktivnega TNF-a.

Tabela 23B. Empirična pravila, zbrana iz rezultatov in vivo DTH študij, ki vključujoč komercialno dostopne disaharide.

identiteta Xn *3	v H-GENUSU	opažena aktivnost
	Χ1
SO3’	SO3’	SO3'	inhibicija
SO3’	SO3-	H	inhibicija
SO3’	H	SO3’	inhibicija
SO3’	H	H	nevtralno
COCH3	SO3-	SO3’	inhibicija
COCH3	SO3’	H	nevtralno
COCH3	H	SO3’	nevtralno
COCH3	H	H	povečanje
H2+	SO3’	SO3’	nevtralno
H3+	SO3’	H	nevtralno
H2+	H	SO3'	nevtralno

6.19.2. Rezultati sposobnosti posameznih monosaharidov za regulacijo produkcije aktivnega TNF-α in vivo

Izvršili smo dodatne eksperimente, v katerih smo posamezne monosaharide, ki so komercialno na voljo pri Sigma, testirani na njihovo sposobnost za regulacijo produkcije aktivnega TNF-α in vivo. Z uporabo popolnoma enakih postopkov, opisanih v prejšnjih poglavjih, smo CD1 miši, 6 na skupino, cepili in obdelali z različnimi kontrolnimi in testnimi substancami, da bi določili učinke, če jih je kaj, odkožno iniciranih substanc na eksperimentalne DTH reakcije testnih živali. Rezultati teh eksperimentov so prdstavljeni v tabeli spodaj.

Tabela 23C. Dodatni in vivo rezulatati, uporabljeni smo bili različni Monosaharidi, injicirani podkožno

testni material	količina DTH (gg/gm) (1CT2	mm)	Inh. xx (%)	R vrednost %x(gg/gm)'1
GlcNa	0.000012	5 i 0.7	75	6.25 χ 106
		(19.7± 1.2)
	0.4	2.3 + 0.9	88	2.2 10
GlcN-2Sb	N.E.	(19.7 + 1.2)		0
GlcN - 3SC	N.E..			0
GlcN - 6Sd	N.E.			0
GlcN- 2,3Se	0.0012	6.3 i 1	68	5.67 χ 104
		(19.7+ 1.2)
GlcN - 2,6Sf	1.2	7.7 ± 1	61	5.08 x 106
NAc - GlcN9 GalNh	N. E. O. 00004	(19.7 ±1.2) 8.9 ± 0.6 (18.0 + 0.7)	50	θ6 1.25x10°
	0.12	6.5 + 0.7 (18.9 +0.7)	67	5.58 x10^

^a GlcN je glukozamin ali 2-amino-2-deoksi-D-glukoza. Dve učinkoviti količinski območji smo opazili za inhibicijo >50% kontrole, pri: 0.0000040.00004 μg/gm in 0.004 - 4 μg/gm.

b GlcN - 2S je D-glukozamin-2-N-sulfat,N.E. označuje, da pri teh testnih količinskih območjih za substanco nismo opazili nobeni učinkov, 0.000004 4 pg/gm miši.

^c GlcN - 3S je D-glukozamin-3-sulfat.

^d GlcN - 6S je D-glukozamin-6-sulfat.

^θ GlcN - 2.3S je D-glukozamin-2,3-disullat. Učinkovito količinsko območje za inhibicijo >50% kontrole je bilo ozko.

* GlcN - 2,6S je D-glukozamin-2.6-disulfat. Učinkovito količinsko območje za inhibicijo £50% kontrole je bilo ozko.

NAc-GIcN je N-acetilglukozamin.

h GalN D-galaktozamin. Dve učinkoviti količinski območji smo opazili za inhibicijo >50% kontrole, pri: 0.00004 - 0.00012 pg/gm in 0.04 - 0.4 pg/gm.

Stereokemija hidroksila na 4-poižaju monosaharida, določa ali je sladkor glukozamin (a - položaj) ali galaktozamin (p - položaj), kot je prikazano spodaj.

D-Glukozamin

Tako je očitno, da N-acetilacija ali prisotnost enega sulfata v monosaharidu sovpada s sposobnostjo glukozamina, da inhibira DTH reakcijo pri miših.

6.19.3 Zdravljenje adjuvansnega artritisa (AA) pri podganah z izbranimi monosaharidi in disaharidi

AA smo inducirali pri samicah Lewis podgan, starih 6-8 tednov, kakor je opisano v poglavju 5.7, zgoraj. Skupine podgan, 5-10 podgan na skupino, smo zdravili s testno substanco s podkožnim injiciranjem 1 dan pred indukcijo eksperimentalnega artritisa, zdravljenje smo potem ponavljali tedensko. Učinki, če so bili. so bili zbrani kakor je opisano v poglavju 5.7.

Izmed treh testiranih disaharidov je H-9392 pokazal najbolj izražen učinek pri zniževanju AA rezultatov v primerjavi s kontrolnimi skupinami podgan, ki so dobivale le slanico (0.1 ml). Kakor je prikazano na Sliki 38, H9392 je skoraj popolnoma zavrl destruktivno inflamacijo AA (do okrog 90%) 24 dni po indukciji AA, pri dajanju 120 ng/podgano ali 0.6 ng/gm podgane, in H-1020 je inhibira! razvoj AA za približno 30% (relativno glede na kontrolne skupine) 24 dni po indukciji. Ravno nasprotno pa je pospeševalec H-0895 pokazal povečan tempo AA razvoja v okrog dveh tednih po indukciji pri dveh količinskih ravneh 0.1 in 0.4 ng/podgano. Ta učinek je potem začel rapidno slabeti, tako rezultat AA ni bi, na dan 24 znatno večji kakor pri kontrolnih skupinah (Glejte Sliko 38A).

Po drugi strani smo našli tudi nekaj monosaharidov, ki prav tako kažejo inhibitorne učinke in vivo na tem podganjem modelu. Na Sliki 38B je prikazano, da zdravljenje z glukozaminom pri treh različnih odmerkih inhibira razvoj AA za okrog 60-80% v primerjavi s kontrolami. Galaktozamin prav tako kaže inhibitorne učinke, vendar pa je stopnja inhibicije znatno nižja kakor pri glukozaminu (Slika 38C).

Najbolj zanimiv, nadaljni eksperimenti s H-9392, kjer smo disaharid dajali tako tedensko kakor dnevno z začetkom na dan 0 (začetek pri indukciji AA) ali pa z začetkom na dan 12 (podgana že trpi zaradi AA), so pokazali pozitivno supresijo rezultatov AA vseh primerih. Rezultati so prikazani na Sliki 38D (tedensko) in 38E (dnevno). Kakor je nakazano na Sliki 38D, je tedensko dajanje H-9392 z začetkom na dan 12. tudi če je podgana že prizadeta z AA, v končni fazi prav tako koristno kot tedensko dajanje H-9392 z začetkom na dan O v primerjavi s kontrolami. Slika 38E kaže, da čeprav dnevno zdravljenje že bila prizadetih podgan kaže manjše učinke kakor dnevno zdravljenje z začetkom na dan 0, je dnevno zdravljenje podgan z razvitim artritisom še zmeraj visoko učinkovito pri zniževanju rezultatov AA v primerjavi s kontrolno skupino.

Ti rezultat trdno kažejo na to, da so spojine iz pričujočega izuma učinkovite ne le pri preprečevanju razvoja hudega artritisa temveč, da so prav tako učinkovite tudi pri zdravljenju že razvitega artritisa. Še več, predstavljeno delo prav tako kaže, da so disaharidi iz pričujočega izuma sposobni izražati uporabno inhibitorno aktivnost ob dnevnem ali ob tedenskem dajanju, medtem ko že prej opisani LMWH kažejo inhibitorne aktivnosti le ob tedenskem dajanju.

Kot nadaljno demonstracijo superiornosti spojin iz pričujočega izuma pri zdravljenju eksperimentalno induciranega artritisa, smo naredili primerjalni, ločeni set eksperimentov, kjer smo skupine Lewis podgan (5 podgan v skupini) zdravili s podkožnim injiciranjem z obema, z deksametazon fosfatom (kupljen pri SIGMI, znan antiinflamatorni dejavnik) ali pa z disaharidom 9392.

Zdravljenja smo začeli 12 dni po indukciji adjuvansnega artritisa (AA) na dva različna načina: pri način je obsegal dnevno injiciranje znanega antiinflamatornega dejavnika, drugi pa je obsegal tedensko injiciranje znanega antiinflamatornega dejavnika ali disaharida. V vseh primerih so podgane dobivale po 100gg znanega antiinflamatornega dejavnika v 0.1 ml fosfatne pufrske raztopine ali po 120 ng disaharida prav tako v 0.1 ml fosfatne pufrske raztopine. Za kontrolo smo skupini podgan injicirali le 0.1 ml fosfatne pufrske raztopine. Pri načinu z dnevnim dajanjem znanega antiinflamatornega dejavnika smo zdravljenje zaključili 17 dan po indukciji, pri tedenskem načinu dajanja znanega antiinflamatornega dejavnika ali disaharida smo zdravljenje zaključili 26 dni po indukciji.

Rezultati zgornjih eksperimentov so predstavljeni na Slikah 38F in 38G. Če preučimo Sliko 38F, vidimo, da je tedensko dajanje disaharida 9392 dobro primerljivo z dnevnim dajanjem deksametazom fosfata v približno prvem tednu zdravljenja. Vsekakor moramo opaziti, da se je po koncu zdravljenja (po dnevu 26) skupini podgan, ki je dnevno dobivala deksametazon fosfat, bolezen povrnila, skupini, ki je dobivala disaharid, pa se je stanje še naprej izboljševalo. 30 dni po indukciji AA je bilo stanje skupine z disaharidom boljše kot stanje skupine z deksametazon fosfatom.

Še več, če primerjamo učinkovitost tedenskega dajanja deksametazon fosfata in tedenskega dajanja disaharida 9392, kakor je ilustrirano na Sliki 38G, lahko vidimo, da 30 dni po indukciji AA tedensko dajanje deksametazon fosfata le zmerno zmanjša resnost rezultatov AA. Ravno nasprotno pa tedensko dajanje disaharida 9392 30 dni po indukciji AA skoraj popolnoma zatre eksperimentalno inducirani adjuvansni artritis. Še enkrat, posebnega pomena je dejstvo, da se je po koncu tedenskega dajanja deksametazona podganam adjuvansni artritis spet povrnil. Kakor je bilo povdarjeno že prej, se je stanje podgan, ki so bile zdravljene z disaharidom 9392, po koncu dajanja zdravila vendar še naprej izboljševalo.

Tako se je tedensko dajanje disaharida 9392 izkazalo kot superiorno nad dnevnim ali tedenskim dajanjem deksametazon fosfata tudi v daljših časovnih obdobjih. Medtem, ko se je podganam, ki smo jih zdravili z deksametazon fosfatom tedensko ali dnevno, bolezen po prenehanju zdravljenja spet povrnila, se je stanje podgan, ki smo jih zdravili z disaharidom, še naprej popravljalo tudi po prenehanju dajanja zdravila, kar nakazuje neprekinjeno inhibicijo bolezni še naprej po zdravljenju.

6.19.4 Rezultati eksperimentov povezanih z inducirano inflamacijo podganje roženice z lipopolisaharidom (LPS)

Z LPS inducirana inflamacija roženice je odvisna od TNF, kakor je v svojem delu, predloženem za publikacijo, pokazal Vanderhagen, C. s sodelavci na Nizozemski, Kinetics of Intraocuiar TNF and IL-6 in EndotoxinInduced Uveitis in the Rat. Z uporabo 30-merskih igel smo injicirali LPS (5ng) v roženico Lewis podgan. Čez en dan smo ločenim skupinam podgan (dve podgani na skupino ali štiri očesa na skupino) podkožno injicirali fosfatno pufrsko slanico (0.05ml) ali H-1020 (v odmerkih 50 ng/podgano ali 200 ng/podgano). Učinke, če so bili, smo ovrednotili kakor sledi;

oteklina neovaskularizacija rdečina oteklina hemoragija zoženje zenice zarastline

0-3 točk

0-3 točk

1/0 točk

1/0 točk

1/0 točk

1/0 točk

1/0 točk (šarenični prirastek na lečo ali roženico) krvavitve sprednjih očesnih prekatov 1/0 točk (kri ali gnoj v notranji komori) zamegljena roženica 1/0 točk in vsoto točk uporabili kot končni rezultat.

Kakor lahko razberemo iz grafične predstavitve rezultatov (Slika 39) je bil 50 ng odmerek/podgano učinkovit pri supresiji učinkov lokalne, z LPS inducirane inflamacije glede na kontrolo. Zanimivo je to, da 200 ng količina/podgano ne povzroči znatnih učinkov.

6.19.5 Rezultati eksperimentov povezanih s podganjim uveitisom induciranim z lipopoiisaharidom (LPS)

Uveitis je vnetje prednje komore očesa kot odgovor na sistematično dajanje LPS. Prav tako kot inflamacija, opisana v prejšnjem poglavju, povzročena z lokalnim dajanjem LPS, je tudi uveitis odvisen od TNF. V pričujočem eksperimentu smo dali skupinam Lewis podgan, 8 očes na skupino (starost podgan 8-10 tednov), na dan nič disaharid H-9392 (v odmerkih 32 ng/podgano ali pa 500 ng/podgano) ali le slanico (0.1 ml). Na dan 2 smo v eno blazinico vsake šapice injicirali 50 μ| raztopine LPS (koncentracije 2 mg/ml), vsaka podgana je prejela skupno količino 200 pg LPS. Tretji dan smo vsako oko punktirali in izmerili koncentracijo celotnih proteinov, ki je kot kvantitativni test, ki kaže stopnjo inflamacije. Rezultati teh testov so opisani spodaj.

Podgane	Zdravljenje	Srednja vrednost proteinov mg/ml
brez LPS		0.36
LPS	slanica	18.4
LPS	32 ng H-9392	5.2
LPS	500 ng H-9392	4.8

Tako je bilo eno samo dajanje H-9392 v kateremkoli odmerku učinkovito pri supresiji inflamacije, povzročene s sistematičnim dajanjem LPS, pri podganah čez približno 70% glede na kontrolno skupino.

6.19.6 Rezultati eksperimentov povezanih z radiozaščitnimi učinki izbranih substanc

Skupinam (5-10 miši na skupino) samic BALB/c miši (starost 8 tednov), smo podkožno injicirali slanico (0.1 ml za kontrolo) ali H-9392 (30 ng/miš) ali glukozamin (10.000 ng/miš) en dan pred obsevanjem in tedensko po obsevanju, do zaključka eksperimenta na dan 30. Vse miši smo obsevali tako. da so prejele količino 700 radov, uporabljali smo gama radijacijski izvor s ^Co.

Umrljivost miši v različnih skupinah smo zasledovali v obdobju 30 dni. Rezultati kažejo, da so skupine miši, ki so prejele le odmerek slanice, pokazale 100% umrljivost do 30 dne, medtem pa so miši, ki smo jim predhodno dali H-9392, izkazale le 40% umrljivost v enakem obdobju.

Skupina miši, ki smo ji predhodno dali glukozamin, je pokazala 20% umrljivost v enakem obdobju.

Tako predhodno dajanje testne substance iz pričujočega izuma je omogočilo obravnavanim miškam, da so preživele obsevanje take intenzitete, ki bi navadno povzročilo 100% smrtnost skupine v 30 dnevih.

Pri drugem ločenem poskusu smo skupine BALB/c miši (5 miši v skupini) podobno izpostavili 750 radom gama žarkov, razen da smo tem skupinam miši dajali testne substance (slanica 0.1 ml na miš: H-9392 v odmerkih 0.3, 3,30 in 300 ng/miš; glukozamin v odmerkih 1,10 in 100 Mg/miš) en dan pred obsevanjem, šesti dan po obsevanju in še enkrat trinajsti dan po obsevanju. Po tretjem, zadnjem dajanju smo prenehali s kakršnimkoli zdravljenjem. Rezultati teh eksperimentov so predstavljeni na Slikah 39Υ (slanica in H-9392) in 39Χ (slanica in glukozamin) in kažejo, da je medtem, ko so poginile vse miši iz kontrolne skupine v 22 dnevih po obsevanju, poginila le ena miš iz skupine z odmerkom 30 ng trideseti dan po obsevanju. Način dajanja s 300 ng H-9392 in način dajanja z 1 μg glukozamina sta pokazala zmerno aktivnost pri supresiji smrtnosti po obsevanju.

Ti rezultati tako kažejo na možnost uporabe substanc, ki nas zanimajo, pri terapijah proti raku, kjer bi lahko s predhodnim dajanjem teh substanc drastično zmanjšali toksičnost, ki je povezana z zdravljenjem z obsevanjem. Tak pristop bi morda lahko omogočil povišanje odmerkov sevanja do višjih, bolj učinkovitih nivojev, ne da bi opazili toksične stranske učinke. Kot je prikazano v eksperimentih, ki so opisani zgoraj, so spojine iz pričujočega izuma visoko učinkovite v gotovih, zelo nizkih odmerkih, četudi je zdravljenje omejeno ie na trikratno dajanje disaharida.

6.19.7 Sposobnost izbranih substanc za supresijo zavrnitev alotranspiantatov

Učinek H-9392 smo testirali tudi pri poskusih zavrnitve kožnih transplantatov pri miših. Natančneje, kožne transplantate od C57BL/6 donorske miši (H-2^) smo dali BALB/c miškam (H-2^d) v skladu z metodo po

Baharav, E. in ostali J. Immunol. Methods 1986, 90:143-144. Število dni do zavrnitve smo ugotavljali glede na nastajanje kraste na transplantatu. Število dni do zavrnitve smo določili za kontrolno skupino (le injiciranje slanice, 0.1 ml) in za testne skupine, ki so dobivale 3 ng ali 300 ng H-9392 s podkožnim injiciranjem dan pred presaditvijo in tedensko po njej. Rezultati , ki so grafično prikazani na slikah 40 in 40A, odkrivajo, da je 3 ng odmerek/miš odložil stopnjo zavrnitve kožnega transplantata za 50% v 5 dneh. Vendar ista spojina, v večjem odmerku 300 ng/miš, ni povzročila znatnega odmika od 50% zavrnitve glede na kontrolo. Ti rezultati so zelo pomembni, ker je zavrnitev transplantatov tkiva popolnoma alogenetične kože znana kot en izmed najmočnejših znanih imunskih odgovorov.

6.19.8 Sposobnost izbranih substanc za supresijo razvoja IDDM pri NOD miših

Znano je, da NOD miši služijo kot zvesti model za človeški diabetes tipa 1. Pri vseh samicah NOD miši v naši koloniji se v približno četrtem do petem mesecu starosti diabetes spontano razvije. Ker je diabetes tipa 1 ali od insulina odvisni diabetes mellitus (IDDM) znan kot avtoimunska bolezen, ki jo verjetno povzročijo avtoreaktivne T celice, smo testirali sposobnosti izbranih spojin iz pričujočega izuma za regulacijo s T celicami posredovane avtoimunske reakcije.

Tako smo skupine samic NOD miši (6-12 v skupini) obdelovali s podkožnim injiciranjem slanice (0.1 ml), H-9392 (30 ng/miš) ali glukozamina (10,000 ng/miš). Vse miši so bile stare okrog 3.5 mesece, kar je prikazano na Sliki 41, pomeni, da so miši kot skupina pretrpele že 20% pojavov IDDM. Pojavnost IDDM lahko opazujemo s spemljanjem nivoja glukoze v krvi miši. Miš, ki nima diabetesa kaže srednjo vrednost glukoze v krvi okrog 140 ± 10 mg/ml. Miš spoznamo za diabetika, če je njen nivo glukoze v krvi enak ali večji od 200 mg/ml (t.j. večji kot je trikratna standardna deviacija čez normalno vrednost). Za večjo zanesljivost smo merili še količino glukoze v urinu, uporabljali smo ClinsticxTM paličice (Ames). Ta test da rezultate od 0 do +3, rezultat +2 ali več, pri dveh ločenih priložnostih, lahko vzamemo kot pozitivno indikacijo za diabetes.

Zelo presenetljivo je bilo odkritje, da oba, H-93S2 in glukozamin, inhibirata pojav diabetesa pri NOD miših tako, da so miši (pri 4.5 mesecih) pri obdelavi z glukozaminom postale diabetiki le v 65%, pri obdelavi s H-9392 pa je bolezen izkazalo manj kot 50% miši, medtem ko so vse kontrolne miši postale diabetiki.

Še drugače, slika 11A kaže, da so vse kontrolne miši v starosti 5 mesecev poginile zaradi diabetesa. Nasprotno pa je v enakem časovnem okviru poginila le približno polovica miši, ki so bile obdelane z 10,000 ng glukozamina. Precej šokantno je dejstvo, da ni v enakem časovnem obdobju poginila niti ena sama miš, ki je bila obdelana s 30 ng H-9392; risba za H9392 rezultate tako sovpada z X-osjo.

6.19.9.Učinki izbranih disaharidov na s TNF-α inducirano iztiskanje adhezijskih molekul, ICAM-1 in ELAM-1, iz endoteiiainih celic (EC)

Adhezijske molekule, kot sta ICAM-1 in ELAM-1, so kritične pri prepoznavanju in pri kasnejši vlogi leukocitov (t.j. adherenca na endotelij in migracija skozi endotelij), ki so vpleteni v inflamatomi odgovor. Kot odgovor na aktivni TNF-α endotelialne celice iztiskajo ICAM-1 in ELAM-1. Tako lahko TNF-α poveča vnetje z regulacijo signalov za migracijo in adherenco levkocitov v pozitivni smeri. Da bi določili učinke disaharidov iz pričujočega izuma na s TNF-α inducirano iztiskanje ICAM-1 in ELAM-1 iz EC, smo opravili naslednje eksperimente.

Sveže izolirane humane EC popkovnih ven smo gojili v M-199 (Gibco Laboratories) z dodatkom 10%FCS, 8% humanega seruma, antibiotikov in rastnega faktorja za endotelialne celice (50 gg/ml. EC-GM; SIGMA, St. Louis,

MO). EC celice smo posejali ob dodatku 0.1 ml medija EC-GM (3.5 X 10θ celic/ml) na ravno dno ploščic s 96 luknjami (Nunk Roskilde, Denmark).

Konfluentne enoplastne kulture smo sprali in inkubirali z izbranimi disaharidnimi spojinami pri različnih koncentracijah v 50 μ! M-199 pri 37°C eno uro. Nato smo spojine sprali stran in kulture inkubirali čez noč s prej pripravljenim TNF-α , 200 lU/ml, v EC-GM. Celice smo sprali trikrat pri 37°C s Hank raztopino, ki vsebuje 1% FCS (Hank's 1%) in fiksirali z 2% glutaraldehidom v PBS. Celice smo potem trikrat sprali s Hank's 1%, blokirali z 2.5% BSA v PBS in še dvakrat sprali s Hank‘s 1%. Anti-ICAM-1 in antiELAM-1 mAb (Genzyme, Cambridge MA; razredčena 1/1000 v PBS) smo inkubirali s celicami eno uro pri 22°C in nato trikrat sprali s Hank's 1%. S peroksidazo konjugirana kozja proti-mišja Ab (SIGMA; razredčitev 1/1000) smo inkubirali s celicami eno uro ter jih pozneje sprali stran. Po dodatku ofenilendiamina (OPD), pripravljenega z raztapljanjem OPD hidrokloridnih tablet v vodi (OPD je substrat za peroksidazo, dobimo ga lahko pri SIGMI, št. Kataloga No.p9187), smo merili absorpcijo v ELIZA merilniku pri 492 nm. Vsorce smo testirali v triplikatu in izračunali povprečje vsaj treh različnih testov.

Tabela 230 Učinek disaharidov na iztiskanje adhezijskih molekui iz endotelialnih celic kot odgovor na prej pripravljeni TNF-a

TNF-α obdelava EC	Inhibitoma spojina (pg/ml)	Rekombinantne humane s TNF-a inducirane adhezijske molekule (O.D 492)*
ne	ne	0.12±0.01	0.18+0.01
da	ne	0.1+0.1	2.2+0.2
da	9392 (50)	0.6+0.1	1.0±0.04
da	9392 (100)	0.9+0.07	1.4+0.03
da	1020 (50)	0.7+0.05	1.2+0.1
da	1020(100)	0.9+0.03	1,5±0.07

‘iztiskanje ELAM-1 in ICAM-1 detektirano z ELIZA vezavo specifičnih monoklonskih protiteles

Eksperimenti, opisani zgoraj, kažejo, da predobdelava EC z disaharidnima spojinama 1020 in 9392 daje EC znatno odpornost na prej pripravljeni TNF-α. Tako, regulacija iztiskanja adhezijskih molekul iz EC v pozitivni smeri (up regulation), inducirana s TNF-α, je bila do 50% inhibirana. Ti rezultati pomenijo, da spojine iz izuma lahko vplivajo na ciljne celice za TNF-α (t.j. EC) in prav tako na celice, ki TNF-α proizvajajo (t.j. T celice, makrofagi), poleg inhibicije nastajanja aktivnega TNF-α inhibirajo tudi nagnjenost ciljnih celic k odgovoru na TNF-α (t.j. regulacija periferalne recepcije citokina).

Pri določenih bolezenskih stanjih tako lahko pomaga dajanje substanc iz pričujočega izuma, ciljne celice za TNF-α dobijo rezistence proti celično induciranemu inflamatomemu odgovoru, ki je sprožen z aktiviranimi T celicami in makrofagi.

6.19.10 Zmožnosti substance H-9392 pri supresiji signala za eksperimentalno alergično astmo pri podganah

Eksperimentalna alergična bronhialna astma je neposreden tip hipersenzitivne reakcije pri podganah, ki so bile imunizirane in nato izzvane z inhalacijo dražilnega antigena v aerosolu. (Edelman, in ostali, Am. Rev. Resp. Dis., 1988, 137:1033-37). Etioiogija in patofiziologija te eksperimentalne bolezni sta zeio podobni naravno nastali človeški inačici.

Za ocenitev sposobnosti substance H-9392 za preprečitev napada bronhialne astme smo 6 samcev Brown Norway podgan vzdražili na ovalbumin (OVA) s podkožnim injiciranjem 1 mg OVA v suspenziji z 200 mg AI0H/ml 0.9% raztopine soli in vzporedno z intraperrtonalnim injiciranjem 1 ml raztopine, ki vsebuje 6x10⁶ z vročino uničenih bakterij Bordetela pertussis (Pasteur Merieux, S.V.) na dan 0.

Kasnejši izziv je obsegal 5 minutno inhalacijo OVA (1 mg/ml raztopina), ki je bila aerosolizirana v Devilbiss Nebulizer (deluje pri pretoku zraka 6 l/min). Respiratorne stiske (RD) kot odgovore smo okarakterizirali kot: stopnja 0, če ni bilo znakov stiske; stopnja 1 je tahipnea; stopnja 2 je zmerno oteženo dihanje; stopnja 3 je zelo oteženo dihanje z odprtimi usti; stopnja 4 je izguba zavesti in mišični tonus. Šestnajst dni po primarni imunizaciji smo izpostavili vse živali začetnemu aerosoliziranemu izzivu, da bi določili pozitivno kontrolo. Živalim smo določili kode, tako smo preprečili opazovalcu, da bi upošteval preteklost živali. Vse podgane so bite občutljive na OVA in astma je bila uniformno inducirana pri vseh živalih.

dan smo živali razdelili na dve skupini in eni dali slanico (kontrolna skupina A), dugi pa 30 ng substance H-9392 (skupina B) in jih izzvali na dan 35 kot je opisano zgoraj. Rezultati so predstavljeni na Sliki 42. Kot je pokazano na sliki 42, so živali, ki so na dan 30 dobile le slanico, doživele respiratorne stiske stopnje 3 ali 4. Živali, ki so dobile substanco H-9392 so izkazale več tahipnee. Predstavljeni rezultati kažejo, da dajanje substance H-9392 (5 dni pred sekundarnim izzivom) živalim z vspostavijeno hipersenzitivnostjo blokira astmatični napad.

6.20 Rezultati humanega PBL biotesta in vitro za komercialno dostopne, iz H parina izpeljane disaharide

Komercialnim vzorcem disaharidov, izpeljanih iz Heparina, in polisaharidov v okviru molekulske mase od 1.800 do 18.000 smo testirali biološko aktivnost. Rezultati so predstavljeni v tabeli 23. Kot je razvidno iz dobljenih podatkov, testirani vzorci, razen ene izjeme, niso pokazali nobene biološke aktivnosti ali pa je bila ta nestalna. V opombah k tabeli je razloženo, da smo testni rezultat za posamezni vpis karakterizirali za nestalen, če nismo dobili enakega kvantitativnega rezultata za tri bioteste, ki smo jih naredili. Vsak vpis, v vseh tabelah v predstavljenem izumu, ki opisujejo bioteste, je rezultat vsaj treh testiranj. Pri humanem PBL biotestu smo za vsak poskus uporabili kri različnega donorja.

Tabela 23 Učinki komercialno dostopnih Heparin disaharidov na Izločanje aktivnega TNF-α. Uporaba humanega PBL biotesta

Testni materijal3	koncentracija (pg/ml)	Biotest TNF aktivnosti (%)	R’vrednost % x (pg/ml)1
H 9517	b	nestalen0	-
H 8642	b	nestalen	-
H 8767	b	nestalen	-
H 0895	b	nestalen	-
H 8892	b	ni učinka	0
H 9017	b	ni učinka	0
H 9142	b	nestalen	-
H 9267	b	nestalen	-
H 1020	1	25% do 35%	25 do 35
H 9392	b	nestalen	-
MW 1.8000	e	nestalen	-
MW 2.400	e	nestalen	-
MW 3.000	e	nestalen	-
MW 3.600	e	nestalen	-
MW 4.200	e	nestalen	-
MW 4.800	e	nestalen	-
MW 5.400	e	ni učinka	0
MW 6.000	e	ni učinka	0
MW 9.000	e	ni učinka	0
MW 16.000	e	nestalen	-
MW 18.000	e	nestalen	-

^a Številka produkta, ki jo najdemo v katalogu Sigma Chemical Co. Catalog (1992) ^b V koncentracijskem okviru od 1 pg/ml do 0.01 pg/ml ^c Tri bioteste, z uporabo PBL treh različnih donorjev, smo naredili na vsakem testnem materialu. Testni rezultat za katerikoli testni material smo označili za nestalen, če nismo dobili enakega rezultata za vse tri (t.j. inhibicija ali povečevanje ali brez efekta) ^d Molekulske mase za različne heparinove oligosaharidne fragmente, kot so opisane v Serbio Product Catalog (December 26,1991) ^e V koncentracijskem okviru od 1 pg/ml do 0.01 pg/ml

6.21 Rezultati In Vitro humanega PBL biotesta v primerjavi s testom, ki temelji na mAb

Primerjava podatkov o aktivnosti, ki so bili dobljeni pri in vitro biotestu (test temelji na humanem PBL, opisan je tukaj) in rezultatov konvencionalnega testa, ki temelji na monoklonskih protitelesih kaže, da je v testiranem mediju prisotnih veliko več proteinov, kot jih pokaže humani PBL biotest, ki poda količino aktivnega TNF. Rezultati so predstavljeni v Tabeli 24. Kot primer, razlika med količinami proteinov, ki jih producirajo T celice na kontrolnem nivoju (približno 274 pg/ml) in ob prisotnosti Fragmina HPLC-F16 (200 pg/ml) ni niti približno tako velika kot je razlika v aktivnosti (100% sprememba v aktivnosti), ki jo poda humani PBL biotest za iste vzorce. Torej iz teh rezultatov lahko sklepamo, da lahko aktivirane imunske celice izločijo velike količine TNF proteina tudi ob prisotnosti aktivne substance iz pričujočega izuma, vendar je le majhen delež izločenega proteina dovolj aktiven za uničenje na TNF občutljivih celic. Tak sklep podpira tudi stališče, da celice proizvajajo TNF v obeh oblikah, aktivni in neaktivni.

100

Tabela 24 Primerjava aktivnosti TNF, detektirane s humanim PBL biotestom in količine proteinov, detektirane z mAb komercijalnim testom

Testni Materijal	Biotest TNF aktivnosti (% uničenih)	mAb komercijalni test za TNF (pg/ml)
nič	45	kontrola	273.9	kontrola
Fragmin HPLC-F1 HPLC-F3 HPLC-F16	72 13.5 0	P°vmax (60%) ’n^max (70%) Inhmfl* (100%)	284.5 224 199	P°vmax (3.8%) lnhmax (17.9%)
DECM HPLC-F10 HPLC-F14 HPLC-F25 HPLC-F37	18 13.5 63 90	'n^max (60%) 'nhfpax (70%) P°vmax (40%) Povmax(10Q%)	225 232 292 301	*n^max (17.5%) 'n^max (16%) P°vmax (6.5%)

6.22 Rezultati preliminarnih raziskav strukturnih lastnosti iz ECM izpeljanih disaharidov gg vzorca (iz ECM izpeljanega disaharida) smo dobili po HPLC 2 kromatografiji (Slika 23) in razsoljevanju, kakor je že prej opisano. Poznejše čiščenje, pod SAX-HPLC pogoji, je pokazalo, da je vzorec več kot 90% čist (Slika 24, pik A23/4 pri 23.10 min). Vendar protonski NMR spekter tega vzorca (Slika 31) kaže, da je prisoten kontaminant. ki vsebuje ponavljajoči se alifatski CH2- del. Nenazadnje je pomembno povdariti, da je testirano SAX-HPLC prečiščevanje pozitivno za inhibicijo pod in vitro in in vivo biotestnimi pogoji.

Protonski NMR spekter je bil posnet v D2O pri 500 MHz pri 23°C.

Posneli smo tudi dvodimenzionalni COSY spekter. Velikost končne podlage je

101 bila 512 χ 512, N-COSY s prenasičenjem, (1536 seans, slika 32). Tipični signali za sladkor so evidentni pri 3-5.5 ppm, pri obeh spektrih (eno in dvodimenzionalnem). Dubletni signal za anomerni proton se pojavi pri 5.39 ppm, ki ima sklopitveno konstanto 3 Hz (Slika 33), ujema se s prisotnostjo glukozaminske sladkorne enote v a konfiguraciji.

Kemijski premik anomernega protona skupaj z verjetno betaglukoronidno specifičnostjo placentalne heparanaze vodi k poskusnemu zaključku, da ima disaharid na nereducirajočem koncu glukozamin v alfa konfiguraciji, ki je 1-»4 pritrjen je na preostanek glukoronske kisline. Še več, odsotnost signala pri 6 ppm kaže, da je disaharid nasičen (t.j. ni dvojne vezi pri C4-C5 glukozaminskega preostanka). Torej, heparanaza ni eliminaza temveč očitno hidrolaza.

FTIR spekter smo posneli na Mattson Galaxy 6020, ki je opremljen s transmisijskim filmskim detektorjem: DTGS pri resoluciji 2 cm¹·, 128 scanov z uporabo ZnSe okna. Sliki 34 in 35 indicirata prisotnost sulfatirane spojine oziroma parcialno desulfatiranega analoga. Slika 34, natančneje, kaže absorpcije pri 3500-3000 (karakteristike karboksilne in hidroksilne skupine), 1594 (karbonil), 1394, 1121, 1107, 1074, 1005, 993, 936 in 825 cm'¹, izmed katerih jih je nekaj, posebej pa zadnja, povezanih s sulfatom.

Masni spekter merilnega derivata, za katerega je verjetno, da je izgubil nekaj sulfata, smo posneli na Jeol JMS ΗΧ/110A FAB. Xe žarek smo uporabili pri E=6 kV, emisijski tok 10 mA, pospeševalna napetost 10 kV. Najprej smo pripravili merilni derivat z obdelavo vzorca oligosaharida z diazometanom v kislem mediju. Metilirani produkt smo nato ekstrahirali z etil acetatom. Karakteristični ion smo opazili pri M/Z (M+H⁺) =531 nad ozadjem. Tako je verjetno, da se podatek ujema z molekulsko maso za metiliran derivat okrog 530. Da bi potrdili rezultate, smo uporabili dve različni podlagi: DTTdioglicerol (1:1) in metilnitrobenzil alkohol (Slike 36 A-B oziroma 37 A-B). Spektra 'A' prikazujeta vzorec in podlago, spektra 'B' pa le podlago.

Na osnovi podatkov masne spektroskopije lahko predlagamo poskusno formulo za metiliran derivat (parcialno desulfatiran): C-j3H23NO^7S2·

MW = 529.47.

4-0-(2-deoksi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozil)-(2-0-sulfo-pD-glukopiranozid) uronsko kislino sintetiziramo po protokolu, ki sledi.

102

6.23. Sinteza 4-0-(2-deoksi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-«-D-glukopiranozil)-(2O-sulfo-p-D-glukopiranozid) uronske kisline

6.23.1 Priprava6-0-acetil-2-azido-3,5-di-0-benzil-2-deoksi-p-D glukopiranozll klorida

2-O-tozil-1,6:3,4-dianhidro-p-D-galaktopiranozo (2) pripravimo iz 1,6anhidro-g-D-glukopiranoze (1) glede na Cerny in ostali (1961) Coli. Chech. Chem. Soc. 26:2547. 2-0-tozil-1,6-anhidro-p-D-glukopiranozo (3) pripravimo iz

2-O-fozii-1,6:3,4-dianhidro-p-D~gaiaktopiranoze (2) po Cerny in ostali (1965) Coli. Chech. Chem. Soc. 30:1151.

1,6:2,3-dianhidro-p-D-manopiranozo (4) pripravimo iz 2-O-tozil-1,6anhidro-p-D-glukopiranoze (3) glede na Stanek in Cemy (1972) Synthesis p. 698.

6-0-acetil-2-azido-3,5-di-0-benzil-2-deoksi-p-D-glukopiranozil klorid (A) pripravimo iz 1,6:2,3-dianhidro-p-D-manopiranoze (4) glede na Paulsen in Slenzel (1978) Chem. Ber. 111:2334.

6.23.2 Priprava metil-(benzil-2-O-acetil-3-O-benzil-P in a-Lglukopiranozid}-uronata

1,2:5,6-di-O-izopropiliden-a-D-glukofuranozo (6) pripravimo iz D-glukoze (S) po Stevens (1978), Methods Carbohydr. Chem. 6:124. 3-0-benzil-1,2-0izopropiliden-a-D-glukofuranozo (7) pripravimo iz 1,2:5,6-di-O-izopropiliden-aD-glukofuranoze (6) po VVhistler in Lake (1972), Methods Carbohydr. Chem. 6:286.

Metil-(benzil-2-O-acetil-3-O-benzil-p in a-L-glukopiranozid)-uronat pripravimo iz 3-0-benzil-1.2-0-izopropiliden-D-glukoiuranoze (7) po Jacquinet in ostali (1984) Carbohydr. Res. 130:221.

103

6.23.3 Kondenzacija produktov iz poglavij 6.23.1 in 6.23.2

Spajanje produkta iz poglavja 6.23.1 in produkta iz poglavja 6.23.2 poteka po Jacquinet in ostali (1988) Carbohydr. Res. 174:253.

O-deacetilacija, hidroliza, O-sulfatacija, redukcija in debenzilacija potekajo po Jacquinet in ostali (1984) (zgoraj) in dajo 4-O-(2-deoksi-6-O-suffo2-sulfoamino-a-D-glukopiranozil)-(2-0-sulfo-p-D-glukopiranozid) uronsko kislino, ki jo naprej prečistimo s SAX-HPLC po Rice in ostali (1985), Anal. Biochem. 150:325. Struktura tega produkta je podana na Sliki 43 in verjamemo, da ima podobno biološko aktivnost kot druge spojine, ki so opisane tukaj.

Strokovnjakom bo jasno, da so drugi sestavki in metode, ki tukaj niso posebej razložene, vendarle preizkušene in pretehtane. Taki drugi sestavki in metode sodijo v okvir in smisel predstavljenega izuma. Torej, izum naj bo omejen le s sledečimi zahtevki, ne pa z opisom specifičnih izvedb, ki so razkrite tukaj.

Razkritja Iz vseh referenc, ki so citirane, so celovito (v obsegu reference) vključena v pričujoči izum.

YECA RESEARCH & DEVELOFMENT CO. LTD. Rehovot, Izrael

Za:

104

Claims (39)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Farmacevtski sestavek za inhibicijo produkcije aktivnega tumorskega nekroznega faktorja alfa (TNF-α), ki je označen s tem, da vsebuje disaharid s formulo (1) kjer je Χ-j vodik ali sulfat; X₂ je vodik ali sulfat; Χ3 je sulfat ali acetil, če je Χ3 sulfat, potem je vsaj en izmed X-| in X₂ sulfat, če pa je Χ3 acetil, sta Χ-j in X₂ sulfata, ali njegovo farmacevtsko sprejemljivo sol, ter še farmacevtsko sprejemljiv nosilec.
2. 2. Farmacevtski sestavek po prvem zahtevku, ki je označen s tem, da je omenjeni disaharid 2-0-sulfat-4-deoksi-4-en-uronska kislina-(a-1,4)-2deoksi-2-N-sulfatglukozamin.
3. 3. Farmacevtski sestavek po prvem zahtevku, ki je označen s tem, da je omenjeni disaharid 4-deoksi-4-en-uronska kislina-(a-1,4)-2-deoksi-2-Nsulfat-6-O-sulfatglukozamin.
4. 4. Farmacevtski sestavek po prvem zahtevku, ki je označen s tem, da je omenjeni disaharid 2-O-sutfat-4-deoksi-4-en-uronska kisiina-(a-1.4)-2deoksi-2-N-sutfat-6-O-sulfatglukozamin.

   105
5. 5. Farmacevtski sestavek po prvem zahtevku, ki je označen s tem, da je omenjeni disaharid 2-O-sulfat-4-deoksi-4-en-uronska kislina-(a-1,4)-2deoksi-2-N-acetil-6-O-sulfatglukozamin.
6. 6. Farmacevtski sestavek za poviševanje produkcije aktivnega TNF-α, ki je označen s tem, da vsebuje 4-deoksi-4-en-uronska kislina-(a-1,4)-2deoksi-2-N-acetilglukozamin ali njegovo farmacevtsko sprejemljivo sol, ter še farmacevtsko sprejemljiv nosilec.
7. 7. Farmacevtski sestavek po prvem ali šestem zahtevku, ki je označen s tem, da je prirejen za parenteralno dajanje.
8. 8. Farmacevtski sestavek po prvem ali šestem zahtevku, ki je označen s tem, da je prirejen za oralno dajanje.
9. 9. Farmacevtski sestavek po prvem ali šestem zahtevku, ki je označen s tem, da je prirejen za lokalno dajanje.
10. 10. Farmacevtski sestavek za inhibicijo produkcije aktivnega tumorskega nekroznega faktorja alfa (TNF-α), ki je označen s tem. da vsebuje spojino, ki je N-sulfatiran ali N-acetiliran 4-deoksi-4-en-uronoglukozamin ali njegovo farmacevtsko sprejemljivo sol, če je omenjena spojina N-sutfatirana ima vsaj še eno drugo sulfatno skupino, če je omenjena spojina N-acetilirana pa ima vsaj še dve drugi sulfatni skupini, ter še farmacevtsko sprejemljiv nosilec.
11. 11. Farmacevtski sestavek za povišanje produkcije TNF-α, ki je označen s tem, da vsebuje nesulfatiran N-acetiliran 4-deoksi-4-en-uronoglukozamin ali njegovo farmacevtsko sprejemljivo sol ter še farmacevtsko sprejemljiv nosilec.

    106
12. 12. Metoda uporabe spojine, ki je N-sulfatiran ali N-acetiliran 4-deoksi-4en-uronoglukozamin ali njegova farmacevtsko sprejemljiva sol, če je omenjena spojina N-sulfatirana, ima vsaj eno drugo sulfatno skupino in, če je omenjena spojina N-acetilirana, ima vsaj dve sulfatni skupini, za pripravo farmacevtskih sestavkov, ki so namenjeni za preprečevanje ali zdravljenje bolezenskih stanj, ki jih povzroči ali pa so povezana z nepravilno produkcijo TNF-a.
13. 13. Metoda uporabe spojine, ki je nesulfatiran N-acetiliran 4-deoksi-4-enuronoglukozamin ali njegova farmacevtsko sprejemljiva sol, za pripravo farmacevtskih sestavkov, ki so namenjeni za zdravljenje bolezenskih stanj, ki so odzivna na zmanjšano produkcijo TNF-a.
14. 14. Metoda po dvanajstem zahtevku, ki je označena s tem, da je omenjena spojina 2-O-sulfat-4-deoksi-4-en-uronska kislina-(a-1,4)-2-deoksi2-N-sulfatglukozamin.
15. 15. Metoda po dvanajstem zahtevku, ki je označena s tem, da je omenjena spojina 4-deoksi-4-en-uronska kislinama-1,4)-2-deoksi-2-N-sulfat6-O-sulfatglukozamin.
16. 16. Metoda po dvanajstem zahtevku, ki je označena s tem, da je omenjena spojina 2-O-sulfat-4-deoksi-4-en-uronska kislina-(a-1,4)-2-deoksi2-N-sulfat-6-O-sulfatglukozamin.
17. 17. Metoda po dvanajstem zahtevku, ki je označena s tem, da je omenjena spojina 2-O-sulfat-4-deoksi-4-en-uronska kislina-(a-1,4)-2-deoksi2-N-acetil-6-O-sulfatglukozamin.
18. 18. Metoda po trinajstem zahtevku, ki je označena s tem, da je omenjena spojina 4-deoksi-4-en-uronska kislina-(a-1,4)-2-deoksi-2-Nacetilglukozamin.

    107
19. 19. Metoda po dvanajstem zahtevku, ki je označena s tem, da je | omenjeno bolezensko stanje avtoimunska bolezen.
20. 20. Metoda po dvanajstem zahtevku, ki je označena s tem, da je omenjeno bolezensko stanje izbrano iz skupine, ki vsebuje: od insulina odvisni diabetes mellitus, periodontalne bolezni, vnetja črevesja, kožne bolezni, uveitis, reumatična obolenja, kronična vnetja, multiplo sklerozo, lupus erythematosus, aterosklerozo, artritis, vaskulitis in alergije.
21. 21. Metoda po trinajstem zahtevku, ki je označena s tem, da je omenjeno bolezensko stanje neoplazia, virusna infekcija, bakterijska infekcija ali gljivična infekcija.
22. 22. Metoda po trinajstem zahtevku, ki je označena s tem, da je omenjeno bolezensko stanje bazalni kožni rak, luskinast celični rak ali melanoma.
23. 23. Farmacevtski sestavek za uporabo pri zdravljenju bolezenskih stanj, ki so izbrana iz skupine, ki vsebuje: od insulina odvisni diabetes mellitus. periodontalne bolezni, vnetja črevesja, kožne bolezni, uveitis, reumatična obolenja, kronična vnetja, multiplo sklerozo, lupus erythematosus, aterosklerozo, artritis, vaskulitis in alergije, je označen s tem, da vsebuje spojino, ki je N-sulfatiran ali N-acetiliran 4-deoksi-4-en-uronoglukozamin ali njegovo farmacevtsko sprejemljivo sol (če je omenjena spojina N-sulfatirana, ima vsaj eno drugo sulfatno skupino in, če je omenjena spojina Nacefilirana. ima vsaj dve sulfatni skupini) in še farmacevtsko sprejemljiv nosilec.
24. 24. Farmacevtski sestavek po 23.zahtevku, ki je označen s tem, da je v obliki enote za odmerjanje.
25. 25. Biotest in vitro za merjenje velikosti učinka testne substance na izločanje aktivnega TNF-α, ki je označen s tem, da obsega prediokubačijo humanih CD4+ T celic v mediju s spremenljivo koncentracijo testne substance, dodajanje stalne količine aktivatorja učinkovitega pri izsiljevanju

    108 sekrecije TNF-α iz omenjenih T celic v odsotnosti omenjene testne substance, zbiranje omenjenega medija po določenem času in kasnejše testiranje aktivnosti omenjenega TNF-α v tem mediju.
26. 26. Farmacevtski sestavek za regulacijo citokinske aktivnosti pri subjektu, ki je označen s tem, da vsebuje zadostno količino substance za inhibicijo ali povečevanje aktivnosti citokina v omenjenem subjektu, kjer omenjena substanca vsebuje karboksiliran in/ali sulfatiran oligosaharid ali njegovo farmacevtsko sprejemljivo sol in farmacevtsko sprejemljiv nosilec, omenjena substanca kaže od nič različno vrednost 'R\ kakor je določeno iz in vivo hiotesta, ki meri relativno eksperimentalno DTH reakcijo pri miših, ki so jih obdelali z različnimi odmerki omenjene substance (v okviru od 0 do približno 2pg/gm miši).
27. 27. Farmacevtski sestavek po 26. zahtevku, ki je označen s tem, da je omenjena substanca učinkovita pri inhibiciji aktivnosti citokina pri omenjenem subjektu, omenjena substanca kaže od nič različno inhibitorno R vrednost.
28. 28. Farmacevtski sestavek po 26. zahtevku, ki je označen s tem. da je omenjena substanca učinkovita pri poviševanju aktivnosti citokina pri omenjenem subjektu, omenjena substanca kaže od nič različno poviševalno “R vrednost.
29. 29. Farmacevtski sestavek po 26.. 27. ali 28. zahtevku, ki je označen s tem, da je omenjeni oligosaharid disaharid.
30. 30. Farmacevtski sestavek po 26.. 27. ali 28. zahtevku, ki je označen s tem, da je omenjeni oligosaharid disaharid. ki je karboksiliran.
31. 31. Farmacevtski sestavek po 26., 27. ali 28. zahtevku, ki je označen s tem, da je omenjeni oligosaharid disaharid. ki je karboksiliran in sulfatiran.

    109
32. 32. Farmacevtski sestavek po 26, 27. ali 28. zahtevku, ki je označen s tem, da je omenjeni oligosaharid disaharid, ki je karboksiiiran vendar ne tudi sulfatiran.
33. 33. Farmacevtski sestavek po 26, 27 ali 28. zahtevku, ki je označen s tem, da je omenjeni citokin izbran iz skupine, ki vsebuje IL-1, IL-6, IL-8 in TNF-α .
34. 34. Farmacevtski sestavek po 29. zahtevku, ki je označen s tem, da je omenjeni citokin TNF-a.
35. 35. Farmacevtski sestavek po 27 zahtevku, ki je označen s tem, da je omenjena substanca H-1020 ali njena farmacevtsko sprejemljiva sol.
36. 36. Farmacevtski sestavek po 27. zahtevku, ki je označen s tem, da je omenjena substanca H-9517 ali njena farmacevtsko sprejemljiva sol.
37. 37. Farmacevtski sestavek po 27. zahtevku, ki je označen s tem, da je omenjena substanca H-9392 ali njena farmacevtsko sprejemljiva sol.
38. 38. Farmacevtski sestavek po 27 zahtevku, ki je označen s tem, da je omenjena substanca H-9267 ali njena farmacevtsko sprejemljiva sol.
39. 39. Farmacevtski sestavek po 28. zahtevku, ki je označen s tem, da je omenjena substanca H-0895 ali njena farmacevtsko sprejemljiva sol.

    YEDA RESEARCH & DEVELOPMENT CO. LTD. Rehovot, Izrael

    Za:

    110

    IZVLEČEK

    SESTAVKI ZA REGULACIJO AKTIVNOSTI CITOKINOV

    Odkrili smo substance, ki vsebujejo karboksilirane in/ali sulfatirane oligosaharide v visoko čisti obliki, kot tudi sestavke, ki vsebujejo le te, in metode njihove uporabe, za regulacijo aktivnosti citokina pri gostitelju. Na primer, izločanje tumorskega nekroznega faktorja alfa (Tumor Necrosis Factor Alpha TNF-α) lahko bodisi inhibiramo, bodisi selektivno povečamo z dajanjem gostitelju učinkovitih količin substanc ali njenih sestavkov, ki vsebujejo specifične oligosaharide v visoko čisti obliki. Tako se predstavljeni izum prav tako nanaša na farmacevtske sestavke in njihovo uporabo za preprečevanje in/ali zdravljenje patoloških procesov, ki vključujejo indukcijo izločanja aktivnega citokina, kot je tumorski nekrozni faktor alfa (TNF-α). Izum se nanaša tudi na vzbujanje žeijenega, z imunskim sistemom povezanega, odgovora gostitelja na prisotnost aktivatorjev, vključno s patogeni. Substance in farmacevtske sestavke predstavljenega izuma lahko uporabljamo dnevno pri zelo nizkih učinkovitih količinah, za ljudi tipično pod 0.1 mg/kg, ali v intervalih do 5-8 dni, najbolje enkrat tedensko.

    1/54