HUT70945A - Compositions for the regulation of cytokine activity contg. oligosaccharides and process to prepare them - Google Patents

Description

1. A találmány tárgya

A találmány citokinin aktivitást szabályozó anyagokra, ezeket tartalmazó készítményekre, valamint e szabályozáson alapuló eljárásokra, így az α-tumor nekrózis faktor (TNF-α) aktivitását fokozó- vagy gátló-eljárásokra vonatkozik. Közelebbről megjelölve a találmány olyan anyagokra illetve ezeket tartalmazó gyógyászatilag elfogadható készítményekre vonatkozik, melyek hatásos mennyiségben a gazdaszervezet aktív TNF-α elválasztását gátolják vagy fokozzák. Az a feltevésünk, hogy a találmány szerinti eljárással a gazdaszervezet immuneffektor sejtjeinek (pl. a gazdaszervezet aktivált makrofágjának) aktív citokinin (pl. TNF-α) elválasztása szabályozható.

Patológiás folyamatok megelőzésére és/vagy kezelésére, vagy éppenséggel az egészséges immunrendszeri válaszok, így a citokinintermelés, elválasztás és/vagy aktiválás indukcióján alapuló válaszok iniciálására alkalmas eljárások szintén a találmány tárgyához tartoznak. A találmány szerinti készítmények bizonyos reprezentánsai kis molekulatömegű heparint (LMWH) tartalmaznak és kis dózisban, 5-8 naponként beadva is hatásosak. Más készítmény reprezentánsok karboxilés/vagy szulfátcsoportot tartalmazó oligoszacharidokat tartalmaznak hatóanyagként; ezeket különféle primer forrásokból nyerik ki és tisztítják, pl. LMWH tisztításával és kromatográfiás elválasztásával, heparin enzimatikus lebontásával vagy enzimatikusan lebontott extracelluláris mátrixból (DECM) nyerik.

Az egyes találmány szerinti anyagok, ezeket tartalmazó készítmények, főként az orális, parenterális vagy helyi kezelésre alkalmas gyógyszerkészítmények, in vitro gátolják vagy fokozzák a nyugvó T-sejtek és/vagy makrofágok TNF-α elválasztását; ez az immunválasz akkor következik be, ha az immuneffektor sejteket valamely aktivátorral, így pl. T-sejt specifikus antigénnel, T-sejt mitogénnel, makrofág aktivá

60.704/SM

- 3 torral, reziduális extracelluláris mátrix-szal (RECM), fibronektinnel, lamininnel vagy hasonlóval aktiváljuk. Kísérleti úton kiváltott késleltetett típusú hiperszenzitivitás (DTH) gátlását in vivő mutattuk ki, mintegy az in vitro eredmények alátámasztására.

2. A technika állása

2.1 Tumornekrózis faktor-a

ATNF -a egy citokinin-féleség, melyet monociták (makrofágok) és T-limfociták termelnek, s kulcsszerepet tölt be a fertőzések leküzdését elősegítő kaszkódrendszerben, pleiotrópiás hatásával segíti a kóros állapotok levezénylését [Beutler, B. és Cerami A.: Ann. Rév. Immunoi. (1989) 7:625-655]. A TNF-α biológiai hatása koncentrációjától és termelődési helyétől függően változik: Kis koncentrációban a TNF-a jótékony védő funkciót lát el és szerepe van a homeosztázisban, nagy koncentrációban azonban szisztémikusan, ill. bizonyos szövetekben más citokininekkel, nevezetesen az interleukin-1-gyel (IL-1) szinergetikus hatást mutatva több gyulladásos válaszreakciót is súlyosbít.

ATNF -a IL-1 -gyei együtt a következő hatásokat válthatja ki: láz, aluszékonyság, hemodinamikus sokk, az akut-fázisra jellemző fehérjék fokozott termelése, az albumintermelés csökkenése, az erek endoteliális sejtjeinek aktiválódása, a fő hiszto-kompatibilitási komplex (MHC) fokozott kifejeződése, csökkent lipoprotein lipáz és citokrom P450, csökkent cink- és vasszint a plazmában, fibroblaszt proliferáció, megnövekedett szinoviális sejt-kollagenáz és ciklooxigenáz aktivitás, a T- és B-sejtek aktiválódása, a citokininek (TNF-α, IL-1, IL-6 és IL-8) elválasztásának indukálása. Az idevonatkozó tanulmányok szerint ezeknek a citokinineknek az élettani hatása összefügg egymással [Philip, R. és Epstein, L. B., Natúré 323(6083):86-89 (1986) valamint Wallach D. és munkatársai: J. Immunoi, 140(9):2994-2999 (1988)].

60.704/SM ι

- 4 ATNF -α hatásmechanizmusa nem ismert, valószínűsíthető azonban, hogy e hatások a TNF-α azon képességével függnek össze, mely a sejteket arra készteti, hogy a sejtmembránban lévő arachidonsavból prosztaglandinokat és leukotriéneket állítsanak elő.

ATNF -α-pleiotropikus hatásából következően - számos patológiás állapotban és különböző szervekben kimutatható. Az erekben a TNF-α hemodinamikus sokkot idéz elő csökkentve az endoteliális sejtekben a thrombomodulin és fokozva a vérolvadási aktivitást. Hatására a fehérvérsejtek és valószínűleg a vérlemezkék is megtapadnak az érfalon, elősegítve ezzel az atheroszklerózishoz és érgyulladáshoz vezető folyamatokat.

A TNF-α aktiválja a vérsejteket, ennek következtében a neutrofil- és eozinofilsejtek, a monociták/makrofágok, továbbá a T- és B-limfociták megtapadnak. IL-6 és IL-8 indukálásával a TNF-α fokozza a gyulladáskeltő sejtek kemotaxisát és ezek behatolását a szövetekbe. Azaz a TNF-α szerepet játszik az autoimmun betegségeket kísérő szöveti károsodásban, az allergiában és az átültetett szövetek kilökésében.

A TNF-α más néven kachectin, mely modulálja az adipociták metabolitikus aktivitását, s ezáltal hozzájárul a rákbetegséget, a krónikus fertőzéseket, a krónikus szívbénulást, valamint a krónikus gyulladásos betegségeket kísérő legyengüléshez és kachexiához. A TNF-α az anorexia nervosa kialakuásában is szerepet játszik azzal, hogy miközben csökkenti az étvágyat, fokozza a zsírszövetek lepusztulását.

A TNF-α szerepet játszik a vázizmok és a szívizom anyagcsere folyamatában. A májra kifejtett hatása is markáns: csökkenti az albumin és citokróm P450 metabolizmust és fokozza a fibrinogén, az 1-karboxil-glukoprotein és más, az akut fázisban jelentkező proteinek termelését, ezenkívül bélnekrózist is okozhat.

60.704/SM

- 5 A TNF-α a vér-agy barriert átlépve lázat, aluszékonyságot és étvágytalanságot okoz. A megnövekedett TNF-α koncentráció a sclerosis multiplex kialakulásában is szerepet játszhat. Ezenkívül mellékvese vérzést okozhat, kihat a szteroid hormonok képződésére, növeli a kollagenáz és a PGE-2 szintet a bőrben, továbbá osteoclast-aktiváló hatása következtében tönkremegy a csont- és porcrendszer.

A TNF-α az autoimmun betegségekben (átültetett szövetek kilökődése, érgyulladás, atheroscelrosis) gyulladásos állapotok kifejlődéséért is felelős szerepe lehet továbbá a szívbénulás és a rábetegség kialakulásában. Mindezek miatt kutatás folyik, hogy a TNF-α aktív formáinak képződését, elválasztását és hozzáférhetőségét szabályozni lehessen, s ezáltal számos betegség kezelése lehetővé váljon.

Az immunrendszer elsődleges funkciója az, hogy a szervezetet megvédje a külső támadásokkal, így pl. a mikroorganizmusokkal szemben; saját testszövetei ellen is fordulhat azonban autoimmun betegségekként ismert patológiás állapotok előidézésével. Ilyen pl. ha más szervezetből átültetett szervek ellen lép fel nem kívánt aggresszív reakcióval a saját immunrendszer. Az immunrendszer hiper-reaktivitása idegen anyagokkal szemben okozza az allergiát pl. asztma, rhinitis vagy ekcéma formájában.

Ezeket a reakciókat a limfociták, elsősorban a T-limfociták irányítják, és a patológiás gyulladásos válasz, amelyet kiváltanak, attól függ, mennyire tudnak közlekedni az érfalon át a kívánt szövetekhez és vissza. Ha tehát sikerül a limfociták azon képességét korlátozni, hogy megtapadjanak és áthatoljanak az érfalon, elejét lehet venni az autoimmun folyamatoknak (átültetett szövet kilökése, allergia). Ez egy új terápiás alapelv lehetne, mely a jelenlegi terápiáknál hatékonyabban gátolhatná ezeket a káros reakciókat.

60.704/SM

A f

Az atherosclerosis az ér gyulladásos megbetegedésének krónikus, a vasculitus pedig akut formája. Az atherosclerosis folyamán az artériák belső fala megvastagodik és rugalmatlanná válik, s következményeként koszorúér megbetegedések, szív- vagy agyinfarktus, továbbá perifériás, érbetegségek jelentkezhetnek, melyek a nyugati világban a morbiditás és mortalitás fő okozói. Az atherosclerosis lassan alakul ki és lényegében zsír- és mészlerakódás következtében fellépő betegség. Végső soron a kötőszövetek elszaporodása akut problémaként hirtelen érelzáródás formájában jelentkezik.

A TNF-a-ról kimutatták egyrészt, hogy a HÍV vírus replikációját is elősegi in vitro [Matsuyama, T. és munkatársai: J. Virol. 63(6):2504-2509 (1989) és Michihiko, S. és munkatársai: Láncét, 1(8648):1206-1207 (1989)], másrészt, hogy stimulálja a HIV-1 gén megnyilvánulását, azaz valószínűleg szerepe van abban, hogy a HIV-1 fertőzött betegeknél az AIDS a látens szakaszból a klinikai fázisba megy át [Okamoto, T. és munkatársai: AIDS Rés. Hűm. Retroviruses, 5(2):131-138 (1989)].

A TNF-α, akárcsak a gyulladásos válaszreakció, melyben részt vesz, áldás és átok egyszerre. Ha élettani szerepét megértjük, közelebbről kerülünk a gyulladásos folyamatok egészének megértéséhez is, és betekintést nyerhetünk abba, hogy mely körülmények között jön létre TNF-α -„hiány és -fölösleg”. S ezártal az e hormon termelődésével összefüggő betegségek leküzdésére egy racionális és specifikus terápiás megközelítés jobban tervezhetővé válik.

2.2 Heparin

A heparin egy glukóz-amino-glukán, vagyis egy polianionos, szulfátcsoportokkal helyettesített poliszacharid, mely véralvadásgátló hatású és antithrombatikus szerként használatos. Állatkísérletek azt bizonyítják, hogy a heparin csökkenti az autoimmun T-limfociták esélyét arra, hogy elérjék a célszervet [Lider, O. és munkatársai: Eur. J. Immunoi., 20: 493-499 (1990)]. Patkányokon azt is kimutatták, hogy a

60.704/SM

A t

heparin kis dózisban gátolja a kísérletesen előidézett autoimmun betegségeket, ill. bőr-transzplantáción átesett egeregen a más fajtól származó szövet kilökődése időben késletehető és nő a túlélési idő (egereken 5 pig, patkányokon 20 Mg a heparin dózis napi egyszeri injekcióban) [Lider, O. és munkatársai: J. Clin. Invest. 83:752-756 (1989)].

A fenti hatások mechanizmusa vélhetőleg az, hogy a heparin gátolja annak az enzimnek a felszabadulását, mely ahhoz szükséges, hogy a T-limfociták áthatolhassanak az érfalon; főleg a heparináz enzim az, amely megbontja az érfalat bevonó szub-endoteliális extracelluláris mátrix (ECM) glikóz-amino-glukán részét [Naparstek, Y. és munkatársai: Natúré, 310:241-243 (1984)]. A heparináz enzim expressziója következtében az autoimmun T-limfociták átlépnek az érfalon és exprementális autoimmun encephalomyelitises (EAE) modellen észlelhető, hogy az agyat megtámadják.

Az EP 0114589 sz. európai szabadalmi bejelentés (Folkman és munkatársai) olyan, az emlősök angiogenezisét gátló készítményt ismertet, melynek hatóanyagjai (1) heparin vagy egy hexaszacharid vagy egy ennél hosszabb heparinfragmens, és (2) kortizon, hidrokortizon vagy ennek 11 α-izomerje. A leírás szerint a komponensek külön-külön hatástalanok, ugyanakkor a kombináció a kívánt hatást produkálja. Noha nincs rá bizonyíték, hogy az angiogenezis és az autoimmun betegségek között összefüggés volna, a szabadalmi leírás 5. oldalán összefüggésbe hozzák az angiogenezist a psoriasissal és az arthritis-szel, megadva egyúttal, hogy a heparint nagy dózisban (25.000-47.000 egység/nap, ami kb. 160-310 mg/nap-nak felel meg) kell adni.

Horváth, J. E. és munkatársai [Aust. Ν. Z. J. Med. 5(6):537-539 (1975)] szubkután szubantikoaguláns dózisban adott heparin hatását vizsgálták átültetett idegen veseszöveten a kilökődési folyamat korai szakaszában. A napi adag magas (5000

60.704/SM < , .::.;?

- 8 egység, ami kb. 33 mg), és a kísérletből azt a következtetést vonták le, hogy a szubantikoaguláns dózis nem befolyásolja sem a korai kilökődési folyamatot, sem a transzplantáció túlélési idejét; ugyanakkor az adagolás során megnőtt a vérzéses szövődmények száma.

Toivanen, M.L. és munkatársai [Meth, and Find. Exp. Clin. Pharmacol., 4(6):359-363 (1982)] nagy dózisban adott hearin hatását vizsgálták adjuváns arthritises patkányokon (1000 egység/patkány, ami kb. 7 mg/patkány dózisnak felel meg) és azt találták, hogy a heparin súlyosbította az adjuváns arthritist.

A PCT/AU88/00017 bejelentési számú és WO 88/05301 publikációs számú nemzetközi bejelentés az endoglikozilázok, így pl. a heparináz aktivitását gátló vagy blokkoló, szulfátcsoportokat tartalmazó poliszaccharidokat ismertet, melyek metasztázist gátló vagy gyulladásgátló szerként alkalmazhatók. A heparin, valamint a heparin redukált vagy perjodáttal oxidált származékai, mely származékok véralvadásgátló hatása elenyésző, napi 1,6-6,6 mg/patkány dózisban infúzióban beadva (ez felnőtt emberre extrapolálva napi 75-308 mg-ot jelent) hatásosnak bizonyultak a metasztázis és a gyulladás gátlására.

A heparin és a heparin-szulfát szerkezetileg hasonló glukózamino-glukánok.

Ezeknek a polimer makromolekuláknak a degradációs termékeit kis molekulatömegű heparinoknak (LMWH) nevezzük, melyek a kiindulási markomolekulákéval azonos vagy nagyobb mértékben hatnak a véralvadásra. A polimer alapvető diszacharid (glukuronsav és N-acetil-glukózamin) alegységei a szintézist követően többféle átalakuláson mehetnek át, s emiatt az LMWH nemcsak nagyságát, hanem kémiai öszszetételét tekintve is heterogénnek tekinthető [Goodman és Gilman: The Pharmacoloqical Basis of Therapeutics, 8th Ed, 1313-1315, Pergamon Press, New York (1990)]. A szakirodalom heparinból nyerhető kis molekulatömegű termékek antikoaguláns hatását és előállítási eljárásaikat ismerteti. így pl. az 5,010,063, a 4,990,502

60.704/SM

- 9 és a 4,981,955 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások azt taglalják, hogyan tartható meg az optimális sajátság in vivő, illetve hogy termékeik esetében a vérzéses mellékhatás milyen mértékű. A 4,539,398 és a 4,446,314 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírások affinitás kromatográfiás eljárásokat ismertetnek kis molekulatömegű termékek előállítására.

Psuja, P. [Folio Haematol, (Leipz), 114:429-436 (1987)] azt tanulmányozta, hogy a heparin heterogenitása hogyan befolyásolja a sejtfelülettel való kölcsönhatást. Psuja szerint endoteliális sejttenyészetben LMWH-ra nézve mérsékelt affinitási receptorok vannak (D_d = 5,6 μΜ) és az az LMWH frakció, mely ezekhez a receptorokhoz kötődött kevesebb, mint az ossz. LMWH 1%-a.

Más kutatók többféle sejttenyészet típus metabolizmusa vonatkozásában vizsgálták az LMWH hatását. Asselot-Chapel, C. és munkatársai fBiochem. Pharmacol, 38:895-899 (1989) és Biochem. Biophys. Acta, 993:240-244 (1989)] szerint LMWH hatására simaizom sejttenyészetben csökken a III. típusú kollagén és az I. típusú kollagén aránya és a fibronektin szintézise. A 4,889,808 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint humán diploid fibroblasztok szérum nélküli tenyészetében LMWH hatására fokozódik a szöveti plazminogén aktivátor, valamint az azzal rokonságot mutató proteinek elválasztása.

Az LMWH komplex soksejtes rendszerekre kifejtett hatására vonatkozó közlemények közül a 0114589 számú európai szabadalmi leírást, valamint Lider és munkatársai cikkét [J. Clin. Invest, 83:752-756 (1989)] már ismertettük. Ismert továbbá a W090/03791 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés, mely szerint C8166 transzformált humán limfocita tenyészetben (ALL) az LMWH gátolja a HÍV reprodukcióját. Az eddigi, az LMWH celluláris metabolizmusával kapcsolatos vizsgálatoknál azonban nem vették figyelembe, hogy az LMWH heterogenitása miatt antagoniszti60.704/SM

- 10 kus hatások léphetnek fel. Ezen kívül egyikük sem mutatott ki citokinin aktivitást gyakorlatilag tiszta oligoszacharidok alkalmazása esetén.

3. A találmány összefoglaló ismertetése

A találmány olyan anyagokra vonatkozik, melyek emlősökben a citokinin aktivitását szabályozzák, s mely anyagok karboxil- és/vagy szulfátcsoportokkal szubsztituált oligoszacharidokat tartalmaznak lényegében tiszta formában. Közelebbről megjelölve, ezen anyagok szabályzása lehet (a) gátló jellegű, az esetben in vivő kísérletesen DTH-t idéztünk elő egerekben és ennek relatív gátlását határoztuk meg a találmány szerinti anyagok változó (O és kb. 2 qg/gm egér közötti) dózisai esetében. A gátlást kifejező „R” értéke 200,000 % X (μ/mg)'¹, vagy ezt meghaladó érték; (b) fokozó jelegű; ez esetben in vitro aktivált humán CD4⁺ T-sejtek által kiválasztott TNF-oc relatív aktivitását határoztuk meg a találmány szerinti anyagok jelenlétében, melyek koncentrációja O és 1 χ 10⁷ pg/ml között változott. Az aktivitás fokozódást kifejező „R” értéke 0,03% x (pg/ml)'¹ vagy ezt meghaladó érték volt. Az in vivő meghatározott gátló jellegű R érték a találmány szerinti előnyös anyagok esetében 300,000; 400,000; 500,000 és 600,000 % X ^g/gm)'¹, vagy ennél nagyobb.

Az aktív TNF -a elválasztására gátlólag ható találmány szerinti vegyületek esetében in vitro vizsgálatot is végeztünk; aktivált humán CD4⁺ T-sejtek által kiválasztott TNF -a relatív aktivitását határoztuk meg, ilyen vegyületek O és kb. 1 χ 10⁷ pg/ml között változó koncentrációi jelenlétében. A gátlás mértékét kifejező „R” értéke legalább 0,4 % X (pg/ml)'¹.

A találmány szerinti szénhidrát vagy oligoszaccharid molekulatömege kisebb mint 3000 dalion, előnyösen 400-2000 dalion, legelőnyösebben 400 és kb. 1100 dalton között van. A találmány szerinti anyagok azon képviselői, melyek - a későbbiekben részletes ismertetésre kerülő - biológiai tesztekben gátolták a TNF-α aktivitá60.704/SM ··· · · · sát, különböző cukoregységekből álló molekulák,melyekben az aktivitást hordozó alapegység egy diszacharid. Hosszabb, max. kb. 10 cukoregységből álló oligoszaccharid láncok is gátolják a TNF-α aktivitását, ha az aktív disszacharid egységet tartalmazzák. A találmány szerinti anyagok azon képviselői, melyek a TNF-α aktivitását fokozzák, két típusba sorolhatók: (i) olyan kis molekulatömegű molekulákból képződött viszonylag nagy molekulatömegü aggregátumok, melyek nem aggregált állapotban gátló hatásúak, és (ii) olyan diszacharid és monoszacharid alegységek, melyek szulfátcsoportot vesztettek (azaz legalább részleges deszulfatáláson mentek át).

Tisztítás után ezek az anyagok, illetve ezek a készítmények praktikusan mentesek minden más anyagtól, mely ellenkező vagy antagonista hatású. Tehát, azok az anyagok, melyek az aktivitást gátolják (negatív szabályzók), alapvetően megtisztított formában nemcsak általánosságban mentesek egyéb anyagoktól, hanem az olyan anyagoktól mentesek, melyek az aktivitást fokozzák vagy késleltetik a negatív szabályzó gátló hatását. Aktivitást fokozó anyagok (pozitív szabályzók) esetében a helyzet fordított: az ilyen, találmány szerinti anyagok, más anyagtól, s különösen a negatív szabályozóktól, illetve az aktivitást fokozó hatást antagonizáló anyagoktól mentesek.

A szabályzó hatás fogalmába minden olyan folyamat negatív vagy pozitív szabályzását beleértjük, mely a citokininek in vivő vagy in vitro aktivitására vagy hozzáférhetőségére befolyást gyakorol; a citokininek fogalmába az IL-1, IL-6, IL-8 és főként a TNF-oc értendő bele.A találmány szerinti vegyületek hatása tehát kiterjedhet a gazdaszervezet TNF-α termelésére/kiválasztására, a TNF-oc extracelluláris hozzáférhetőségére vagy a gazdaszervezetben fellehető TNF-α aktív formáira. Anélkül, hogy teoretikus oldalról be kívánnánk határolni a jelen találmányt, példaképpen

60.704/SM ·♦ 9 • 9 • 9

- 12 ·· · · 9 « • «·· megemlítjük, hogy a találmány szerinti vegyületek elősegíthetik valamely anyag, pl. egy protein kiválasztását, mely a TNF-a-hoz kötődve megváltoztatja annak konformációját, s következésképp biológiai aktivitását is. Egy további lehetőség, hogy a találmány szerinti készítmények miközben behatolnak az aktivált T-sejtekbe vagy makrofágokba, bizonyos oligonukleotid szekvenciákhoz kötődnek, s ezáltal befolyásolják a transzkripciós vagy transzlációs folyamatokat, mely végső soron megváltoztatja a protein szintézist. A találmány szerinti készítmények úgy is kifejthetik hatásukat, hogy sejtfelületi receptorokhoz kötődnek.

Egyszerűség kedvéért a továbbiakban csak „aktív TNF-a-elválasztást” vagy a „TNF-α aktivitás” szabályozást fogunk terminológiaként megadni, de ezekhez mindig a lehető legtágabb értelmezést rendeljük a találmány szerinti anyagok és készítmények TNF-α aktivitására gyakorolt hatását illetően, akár a tényleges hatásmechanizmust, akár az észlelt gátlást vagy aktivitásfokozást illetően.

A találmány szerinti anyagok karboxilezett és/vagy szulfátéit oligoszacharidokat tartalmaznak, melyeket természetes forrásokból, így élő szervezetkböl is nyerhetünk. így pl. aktív anyagok nyerhetők és tisztíthatók kis molekulatömegű heparin (LMWH) frakciókból, enzimmel degradált extracelluláris mátrixokból; az alkalmazott enzim pl. heparináz lehet, mely származhat állatokból (emlősökből) vagy mikroorganizusokból (baktériumokból). Az aktív anyagok további forrásaként enzimmel kezelt heparin (pl. endoglikozilázzal emésztett heparin) jöhet számításba.

Az „alapvetően megtisztított forma”, illetve „lényegében tiszta forma” kifejezések azt jelentik, hogy az oligoszacharidoktól specifikus lépésekkel el kell választani a nem aktív, vagy ellenkező hatású kísérőanyagokat, illetve az aktív rész(eke)t keverékből, felülúszókból (pl. az enzimes degradációval nyert anyagok esetében) megfelelő lépésekkel kell izolálni. A találmány szerinti anyagokat szigorú kromatográfiás

60.704/SM

-13 előírások szerint nyerik ki, melyek közül a kisnyomású méretkizárásos gélkromatográfia (azaz Sephadex oszlopon végzett kromatografálás) csak az első lépés a tisztítási folyamatban. Ezt követően nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (HPLC) izoláljuk az egyes oligoszacharid komponenseket. Előnyösen ezekkel a lépésekkel lehet megfelelően tiszta és homogén formában megkapni az egyes aktív anyagokat.

Az előnyös tisztítási lépések példái lehetnek még a következők: az aktív anyagot tartalmazó keverékek (azaz a kisnyomású gélkromatográfiával nyert frakciók) átbocsátása gél-permeációs HPLC oszlopon vagy erős anioncserélő gyantával töltött HPLC oszlopon. Oligoszaccharidként di-, tri-, tetra-, penta- vagy hexaszacharidokat, előnyösen diszacharidokat azonosítottunk és izoláltunk. A találmány szerinti oligoszacharidok karboxil- és/vagy szulfátcsoportot tartalmaznak, tehát negatív töltésüek. A találmány szerinti diszacharidok előnyösen három negatív töltésű csoportot tartalmaznak. Azok, amelyek hatása gátló jellegű, kb. 400 - kb. 2000, előnyösen kb. 400 - kb. 1100 dalion molekulatömegűek.

Azok a biológiai mérőeljárások, melyeknél a teszt-vegyületek hatása az aktív TNF -oc elválasztására kvantitálható, szintén a találmány tárgyához tartoznak. Ennek a biológiai mérőeljárásnak a lépései a következők: humán CD4⁺ T-sejteket a tesztanyagok válgozó koncentrációi jelenlétében, alkalmas médiumban előinkubálunk; a mintához egy aktivátort adunk olyan konstans mennyiségben, hogy a T-sejtek TNF-oc elválasztása teszt anyagok jelenléte nélkül is meginduljon; megfelelő idő elteltével a médiumban lévő TNF-α aktivitását meghatározzuk. A humán CD4⁺ T-sejteket perifériás vér egymagvú leukocitáiból (PBL) nyerjük előnyös esetben. Alkalmas immun effektor sejt aktivátorként pl. T-sejtspecifikus antigéneket, mitogéneket, makrofág aktvátorokat, reziduális extra-celluláris mátrixot (RECM, lásd 4. rész), laminint, fibronektint vagy hasonlót használhatunk.

60.704/SM ' · · i ’ ·· «» .·*>’

- 14 A jelen találmány alapja bizonyos anyagok specifikus szabályozó hatása, melyet a későbbiekben részletezésre kerülő in vitro és in vivő biológiai módszerekkel határoztunk meg. Röviden: a találmány szerinti anyagok az aktív TNF-oc elválasztását indukáló szabályzó (akár gátló akár fokozó jellegű) aktivitást mutatnak; a hatás dózis-függő. Nevezetesen, ha a %-os gátlást/fokozást a dózis (pl. pg/ml) függvényében ábrázoljuk, haranggörbét kapunk, melynek maximuma (gátlás esetén lnh_max; aktivitást fokozás esetén Aug_max) könnyen leolvasható. Azaz a görbe minden egyes pontján a %-os gátlás (fokozás) és a koncentráció (dózis) viszonya kiszámolható. „Specifikus aktivitási szabályzási értéknek” vagy „R”-értéknek a maximális gátlási (lnhm_ax) vagy a maximális aktivitásfokozó érték (Aug_max) és a teszt-anyag ennek megfelelő koncentrációja (vagy dózisa) hányadosát tekintjük. Ez az „R”-érték bármely biológiai módszer esetében, tehát in vitro egérlép-sejtes, ex vivő egérlép-sejtes, in vitro humán PBL-sejtes vagy a kísérletesen előidézett DTH-modellen in vivő meghatározható. Ha nincs hatás, akkor „R” értéke zéró.

A találmány tárgya továbbá eljárás citokininek aktivitásának szabályozására emlősökben, oly módon, hogy az emlősnek a citilinin aktivitás gátlásához vagy fokozásához szükséges mennyiségben karboxilezett és/vagy szulfátéit oligoszacharidot tartalmazó anyagot adunk be lényegében tiszta formában, mely anyag egy zérótól eltérő értékű „R”-értékkel rendelkezik, melynek meghatározását (a) gátló jellegű szabályzás esetén végezhetjük (i) in vitro, amikoris aktivált humán CD4⁺ T-sejtek által kiválasztott TNF-oc relatív aktivitását mérjük a fenti anyag 0 és kb. 1 χ 10⁷ pg/ml között változó koncentrációi jelenlétében, és/vagy (ii) in vivő, amikoris kísérletesen előidézett DTH relatív gátlását mérjük a fenti anyag 0 és kb. 2 μg/ml között változó dózisaival kezelt egereken, vagy (b) aktivitást fokozó jellegű szabályzás esetén in vitro végezhetjük, amikoris aktivált humán CD4⁺ T-sejtek által kiválasztott TNF-oc re60.704/SM • · · ·· .» ··. ... ,· ’ .

.............

latív aktivitását mérjük a fenti anyag 0 és kb. 1 x 10⁷ pg/ml között változó koncentrációi jelenlétében.

A találmány tárgya továbbá eljárás az aktív anyag alkalmazására gazdaszervezetek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására oly módon, hogy a fenti anyag hatásos mennyiségét valamely gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal összekeverve dozírozott egységekké, előnyösen kis dózist tartalmazó egységekké alakítjuk. A gyógyszerkészítmény stabilizálószert, így pl. protamint is tartalmazhat olyan mennyiségben, hogy a készítmény a kezdeti aktivitásnak a minél teljesebb, de legalább szignifikáns részét hosszabb időn át, így pl. a kb. 100%-os aktivitást kb. 3 napon át megőrizze. Szobahőmérséklet alatti tárolási hőmérsékleten, így kb. -10 és 10°C közötti, előnyösen 4°C hőmérsékleten a kezdeti aktivitás döntő része közel 4 hónapig megmarad. Minthogy a találmány szerinti gyógyászati készítmények humán célra készülnek, a készítmények előnyösen sterilek. A sterilizálás önmagában ismert módon, pl. steril alkotóelemekkel, hősterilizálással vagy steril szűrön való átbocsáj-tással biztosítható.

Az eddigiekből következik, hogy legfőképpen olyan gyógyászati eljárás a találmány tárgya, mellyel a beteg gazdaszervezet, pl. emlős, állapotának súlyosságát a citokininaktivitás változtatásával befolyásolni lehet, oly módon, hogy a találmány szerinti oligoszaccharidokat tartalmazó anyagot lényegében tiszta formában vagy az ezekből készített gyógyszerkészítményeket a gazdaszervezetbe juttatjuk. Az adott gazdaszervezet állaptotától függően a találmány szerinti anyagok vagy kompozíciók közül vagy olyat adunk be, amelyik a TNF-α hozzáférhetőségét vagy aktivitását gátolja vagy olyat, amelyik a TNF-α képződését elősegíti vagy fölerősíti az aktivitását. A készítményeket vagy gyógyszer preparátumokat kis dózisban és 5-8 naponként, előnyösen hetente egyszeri adagban adjuk. Oligoszaccharid típusú anyagot (pl. mono-, di-, tri- vagy tetraszacharidot, előnyösen diszaccharidot) tartalmazó, párén60.704/SM • · ···· ···· · « · φ ··· · ···· » ··· ··· · · • · · · ·

- 16 - ..................

terális, orális vagy topikális beadásra szánt kompozíciókat a helyzetnek és hatásosságnak megfelelőn napi egyszeri adagban is adhatunk, olyan dózisban, melyet a szakember rutin kísérlettel tud megállapítani.

Aktív TNF -a elválasztását indukáló patológiás folyamatok megelőzésére és/vagy kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények is a találmány tárgyához tartoznak; ezekre az jellemző, hogy gyógyászatilag elfogadható vivőanyagot és 5-8 naponkénti beadásra alkalmas, kis effektív dózisban tartalmazzák a kis molekulatömegű heparint (LMWH), mely in vitro gátolja a nyugvó T-sejtek és/vagy makrofágok aktív TNF-α elválasztását T-sejt specifikus antigének, mitogének, makrofágok, reziduális extracelluláris mátrix (RECM), laminin, fibronektin és hasonlók hatására.

A találmány egyik kiviteli alakja olyan gyógyszerkészítmény, melyben az LMWH molkeulatömege kb. 3000 és kb. 6000 között van és 5-7 naponként adagolható.

Az 5-8 naponkénti beadásra alkalmas gyógyszerkészítmények, melyek az aktív TNF-α elválasztást indukáló patológiás folyamatok megelőzésére és/vagy kezelésére alkalmasak, szintén a találmány tárgyához tartoznak, s ezekre jellemző, hogy gyógyászatilag elfogadható vivőanyagot, valamint kis effektív dózisban kis molekulatömegű heparint (LMWH) tartalmaznak.

A találmány szerinti aktív anyagok és készítmények egy adott antigénnel szemben a kísérletes késői túlérzékenységi reakciókat (DTH) is gátolják; ezt oly módon bizonyítottuk, hogy 5-7 nappal a találmány szerinti anyag vagy gyógyászati készítmény beadása után, a bőrbe juttatott antigén hatására létrejött szöveti keményedés (induration) mértéke csökkent azokhoz az esetekhez képest, melyek vagy nem kaptak találmány szerinti anyagot/készítményt, vagy amelyeknél a találmány szerinti anyag/ké-szítmény hatásának elmúltával juttattuk a bőrbe a kérdéses antigént. Anti60.704/SM

- 17 génként pl. tetanuszt, myelin fehérjét, tisztított proteinszármazékot, oxazolont vagy hasonlót alkalmazhatunk.

A találmány szerinti készítmények vagy gyógyászati preparátumok a választott beadási módnak megfelelően lehetnek enterálisan (orálisan vagy rektálisan) vagy parenterálisan (topikálisan vagy inhalálás útján aeroszol alkalmazásával) beadhatók. A találmány szerinti gyógyászati készítmények előnyös kiviteli alakjai orális, szubkután, intramuszkuláris, intraperitoneális vagy intravénás beadásra alkalmasak.

A találmány széles körben hasznosítható; így pl. alkalmazható szövetátültetést követő kilökődési folyamat késleltetésére vagy megelőzésére, számos patológiás folyamat kezelésére vagy megelőzésére, így autoimmun betegségek, allergia, gyulladások (különösen a bél gyulladásos megbetegedései) vagy a szerzett immunhiányos szindróma (AIDS) esetében. A találmány hasznosítható továbbá a diabetes

I. típusa, a foggyökérhárnya megbetegedései, bőr- és májbetegségek, uveitis, reumás megbetegedések (különösen rheumatiod arthritis), atherosclerosis, vasculitis vagy sclerosis multiplex kezelésére.

Olyan találmány szerinti anyagokat, melyek az aktív TNF-α elválasztást fokozzák, tumorok, vírus- és baktériumfertözések kezelésére használhatunk. A tumorok közül kezelhetők pl. az emlő, a végbél és a prosztata rákos daganatai, a limfómás megbetegedések és más bazális karcinómák. A bakteriális fertőzések közül kezelhetők pl. a diftéria, a streptococcus-fertözések, a tüdőgyulladás, a gonorrhea, a lepra, a tuberculózis, stb. A vírusfertőzések közül kezelhetők pl. az influenza, a hepatitis, a gyomor- és bélhurut, a mononucleosis, a bronchiolitis és az agyhártyagyulladás.

A találmány szerinti gyógyászati készítményekben az LMWH hatóanyag jellemzően kis hatásos dózisban van jelen. Nevezetesen a gyógyászati készítmények a LMWH hatóanyagot 5 mg-nál kisebb, előnyösen kb. 0,3-3 mg, legelőnyösebben 1-1,5 mg egyszeri dózisegységben tartalmazzák.

60.704/SM • · • · · ·

- 18 - .......

A találmány tárgya továbbá eljárás 5-8 naponkénti beadásra szánt, a TNF-a elválasztást előidéző patológiás folyamatok megelőzésére és/vagy kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, hatóanyagként az immuneffektor sejt aktivátorok hatására nyugvó T-sejtek és/vagy makrofágok által kiválasztott TNF-a aktivitását in vitro gátló LMWH alkalmazásával, oly módon, hogy az LMWH hatásos kis dózisát gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal összekeverjük.

A hatóanyag előállítási eljárásai, így a kismolekulatömegű heparinok frakcionálása, az intakt heparin enzimes degradálása (DH) vagy az extracelluláris mátrix enzimes lebontása (DECM), szintén a találmány tárgyához tartoznak.

A gyógyászati eljárás aktív TNF-α elválasztást előidéző patológiás folyamatok szenvedő alanyai/gazdaszervezetei kezelésére szintén a találmány tárgyához tartozik, s erre jellemző, hogy a kérdéses betegalanyt vagy gazdaszervezetet a fenti gyógyászati készítménnyel 5-8 naponként, előnyösen heti egy alkalommal kezeljük. Mint már említettük, aktív oligoszaccharidot tartalmazó gyógyászati készítmények beadása is lehetséges 1-7 naponként.

A találmány értelmében az aktív TNF-α termelését gátló gyógyászati készítményekre jellemző, hogy egy (I) általános képletű vegyületet vagy gyógyászatilag elviselhető sóját tartalmazzák - ebben a képletben X! hidrogénatom vagy szulfátcsoport; X₂ hidrogénatom vagy szulfátcsoport, és X₃ szulfát- vagy acetilcsoport, azzal a megszorítással, hogy ha X₃ szulfátcsoportot jelent, akkor X-, és X₂ közül legalább az egyik jelentése szulfátcsoport, és ha X₃ acetilcsoportot jelent, akkor X₁ és X₂ jelentése is szulfátcsoport - valamely gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal együtt. A gyógyászati készítmény jellemzően egy diszacharidot tartalmaz, mely 2-(O-szulfo)-4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-szulfo)-glukózamin, 4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-szulfo)-6-(O-szulfo)-glukózamin, 2-(O-szulfo)-4-dez

60.704/SM • · · • · · ·

- 19 - .....

oxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-szulfo)-6-(O-szulfo)-glukózamin vagy -2-(0-szulfo)-4-dezoxi-iduronsav-4--én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-acetil)-6-(O-szulfo)-glukózamin lehet.

A találmány szerinti, az aktív TNF-α termelését fokozó gyógyászati készítmény egyik kiviteli alakja 4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-acetil)-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját és valamely gyógyászatilag elfogadható vivőanyagot tartalmaz. Az ilyen készítmény beadásmódja változó lehet, így pl. parenterális, orális vagy topikális beadásmód jöhet elsősorban számításba.

A találmány szerinti, az aktív TNF-α termelését gátló gyógyászati készítmény egyik kiviteli alakja valamely N-szulfatált vagy N-acilezett 4-dezoxi-4-én-glukorono-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza. Az N-szulfatált hatóanyag legalább egy további szulfátcsoportot, az N-acilezett hatóanyag legalább két szulfitcsoportot tartalmaz. Megjegyezni kívánjuk, hogy a diszacharidok egyes képviselőinek „uronsav’-részén lévő telítetlenség miatt (azaz a C-4 és C-5 közötti kettős kötés miatt) a C-6 helyzetű karboxilcsoport teljesen a 6-tagú gyűrű síkjában helyezkedik el, azaz szteroizomeriát nem mutat. Ha tehát a C-4 és C-5 szénatomok között kettős kötés van, az iduronsav-rész a glukuronsavval azonos. Ilyenkor az ,,-uronsav” kifejezés akár iduronsavat, akár glukuronsavat jelenthet; hasonlóképpen az ,,-uroncsoport” jelentése akár iduron-, akár glukuroncsoport lehet.

A találmány szerinti, az aktív TNF-α termelését fokozó gyógyászati készítmény egy másik kiviteli alakja az N-acilezett 4-dezoxi-4-én-glukurono-glukózamin nem szulfátéit formáját, vagy ennek gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza valamely gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal együtt.

A gyógyászati eljárás aktív citokinin termelésének gyátlására beteg alanyokban, így emlősökben, pl. humán betegekben, melynek során a kérdéses alanyoknak

60.704/SM

-20 - ' ' (I) általános képletű diszacharidot vagy ezek gyógyászatilag elfogadható sóját adjuk be hatásos dózisban, szintén a találmány tárgyázoz tartozik. Az (I) általános képletben X-j hidrogénatom vagy szulfátcsoport; X₂ hidrogénatom vagy szulfátcsoport, és X₃ szulfát- vagy acetilcsoport, azzal a megszorítással, hogy ha X₃ szulfátcsoportot jelent, akkor X! és X₂ közül legalább az egyik jelentése szulfátcsoport, és ha X₃ acetilcsoportot jelent, akkor Χτ és X₂ jelentése is szulfátcsoport.

Egy másik gyógyászati eljárás értelmében az aktív citokinin termelésének fokozása a cél a beteg alanyokban; ilyenkor gyógyászatilag hatásos mennyiségű diszacharidként 4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-acetil)-glukózamint vagy valamely gyógyászatilag elfogadható sóját adjuk be a betegnek. A találmány tárgyával összhangban naponta vagy előnyösen hetente egyszer adjuk be a kérdéses vegyületet vagy gyógyászatilag elfogadható sóját.

Ezekben a gyógyászati eljárásokban a beteg aktív citokinin termelésének fokozására vagy gátlására a találmány szerinti gyógyszerkészítmények is alkalmazhatók, oly módon, hogy a készítményből hatásos mennyiséget adunk be a betegnek.

A találmány tárgya továbbá eljárás a nem megfelelő TNF-α termeléssel öszszefüggő betegségek megelőzésére vagy kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, oly módon, hogy hatóanyagként valamely N-szulfatált- vagy N-acilezett-4-dezoxi-4-én-glukorono-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját alkalmazzuk. Ha a hatóanyag N-szulfatált, akkor legalább még egy további szulfátcsoportot, ha a hatóanyag N-acetilezett, akkor legalább két szulfátcsoportot tartalmaz.

Ha a TNF -a fokozott termelésével összefüggő betegségek megelőzése vagy kezelése a cél, akkor a gyógyszerkészítmény előállításához hatóanyagként nem szulfátéit, N-acetilezett-4-dezoxi-4-én-glukorono-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját alkalmazzuk.

60.704/SM ·· ···· «··· ·· ·· ··· · ···· • ··· ··· · · • · · · ·

..................

Az aktív citokinin nem megfelelő termelése miatt vagy azzal összefüggésben fellépő betegségek megelőzésére vagy kezelésére alkalmas gyógyászati eljárások is a találmány tárgyához tartoznak; ezekre az eljárásokra jellemző, hogy a betegnek hatásos mennyiségben N-szulfatált- vagy N-acetilezett-4-dezoxi-4-én-glukorono-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját adjuk be, mely vegyület ha N-szulfatált, akkor legalább még egy szulfátcsoportot, ha N-acetilezett, akkor legalább két szulfátcsoportot tartalmaz.

Ha a citokinin fokozott termelése miatt lépett fel a betegség, akkor a gyógyászati eljárásban a betegnek nem-szulfatált, N-acetilezett-4-dezoxi-4-én-glukoronoglukóz-amint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját adjuk be hatásos mennyiségben. Ezek a kezelések különösen olyan esetekben hasznosak, amikor autoimmun betegségekről, neoplaziás esetekről vagy a fertőzés egyes formáiról, így vírusos, bakterális vagy gombás fertőzésekről van szó.

A találmány tárgya továbbá gyógyászati eljárás sugárzás káros hatásának kivédésére oly módon, hogy a kezelési alanynak N-szulfatált- vagy N-acetilezett-4-dezoxi-4-én-glukurono-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját adjuk be hatásos mennyiségben, mely vegyület ha N-szulfatált, akkor legalább még egy további szulfátcsoportot, ha N-acetilezett, akkor legalább két szulfátcsoportot tartalmaz. A találmány szerinti vegyületet célszerűen a surgárzás bekövetkezése előtt adjuk be a kezelési alanynak. A vegyületek sugárvédő hatását főként sugárterápiás kezelés esetén használhatjuk ki.

A találmány szerinti gyógyászati eljárás átültetett szövetek kilökődésének gátlására is alkalmas, s ilyenkor a kezelési alanynak N-szulfatált- vagy N-acetilezett4-dezoxi-4-én-glukorono-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját adjuk be hatásos mennyiségben, mely vegyület ha N-szulfatált, akkor legalább még egy további szulfátcsoportot, ha N-acetilezett, akor legalább két szulfátcsoportot tartal

60.704/SM • · · · ····

- 22 máz. Az átültetett szövet lehet átültetett szerv, mint pl. szív, máj, vese vagy csontvelő transzplantátum, de lehet átültetett bőrszövet is.

A találmány szerinti gyógyászati eljárás adhéziós molekulák kifejeződését is gátolhatja a kezelt szervezetben, s ilyenkora betegnek N-szulfatált- vagy N-acetilezett-4-dezoxi-4-én-glukorono-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját adjuk be hatásos mennyiségben, mely vegyület ha N-szulfatált, akkor legalább még egy további szulfátcsoportot, ha N-acetilezett, akkor legalább két szulfátcsoportot tartalmaz. Adhéziós molekula lehet pl. az ICAM-1 vagy ELAM-1.

A teszt vegyületeknek az aktív TNF-α elválasztására gyakorolt hatását egy, szintén a találmány tárgyát képező in vitro biológiai mérőeljárással kvantitálhatjuk, oly módon, hogy humán CD4⁺ T-sejteket a teszt-vegyületek változó koncentrációi jelenlétében valamely táptalajon preinkubálunk, teszt-vegyülettől mentes mintához a T-sejtek TNF-α elválasztásának megindításához szükséges aktivátort adunk, megfelelő idő elteltével a táptalajban a TNF-α aktivitását meghatározzuk.

A jelen találmány további módozatai az alábbi részletes leírásból és példákból a szakember számára nyilvánvalóan megismerhetők.

Az 1. ábra adjuváns arthritises (AA) patkányok csoportjainak pontszámait mutatja. Az egyes csoportok különböző dózisban kaptak Fragmint heti egyszeri adagban, a kontrollcsoport foszfáttal pufferolt sóoldatot kapott (PBS).

A 2. ábra adjuváns arthritises (AA) patkányok csoportjainak pontszámait mutatja. Minden csoport 20 pg dózisban kapta a Fragmint, de az egyes csoportok különböző részadagokra (naponta, 5 naponként, hetenként) osztva vagy egyszeri adagban kapták az anyagot.

A 3. ábrán összehasonlításban látható a heti egyszeri adagban beadott Fragmin és Heparin hatása a kontrolihoz (PBS) képest.

60.704/SM • ·

-23 A 4. ábrán összehasonlításban látható a naponkénti adagokban beadott Fragmin és Heparin hatása a kontrolihoz képest.

Az 5. ábra hetenként vagy naponta különböző kis molekulatömegü heparinokkal, pl. Fraxiparinnal, Fraxiparine-nal vagy Lovenox-szal kezelt AA egerek pontszámait mutatja.

A 6. ábrán allogén szívtranszplantáción átesett patkányok %-os túlélési arányát szemléltetjük, melyek hetenként vagy Fragmint vagy PBS-t kaptak.

A 7. ábrán NŐD egerek két csoportjának vércukorszintjét szemléltetjük blokkdiagrammal; az egyik csoport Fragmint, a másik PBS-t kapott.

A 8. ábrán DTH tesztek eredménye látható humán önkéntes adataival.

A 9. ábrán a Fragmin dózis-hatás összefüggését bemutató haranggörbe látható.

A 10. ábra azt szemlélteti, hogy az inaktivált Fragmin elveszti gátló hatását.

A 11. ábrán az inaktivált Fragmin gélszűrésével kapott különböző frakciók, így az F2, F8, F10 és F15 frakció abszorbciója (206 nm) látható.

A 12, 12A és 12B ábrák azt szemléltetik, hogy az aktív Fragmin, az F15 és F10 frakciók hogyan befolyásolják különböző dózisokban az egerek érzékenységét DTH vonatkozásában.

A 14. ábra azt szemlélteti, hogy a Fragmin és a heparinázzal degradált ECM Sepharose 4B oszlopon szétválasztott különböző számú frakciói 206 nm-nél milyen abszorbciót mutatnak.

A 13. és 15. ábrák a Fragmin és a heparinázzal degradált ECM Sepharose 4B oszlopon elválasztott frakcióinak elúciós profiljait mutatják be összehasonlításban.

A 16. ábrán látható, hogy egy oligoszacharid termék (a 13. ábra 5. frakciója) ugyancsak haranggörbét ad ki az aktív TNF-α elválasztást gátló hatás vonatkozásában dózis-hatás görbeként.

60.704/SM

-24 • · ·♦······ ·· ·· ··· · ···· • · · · ··· · · * · · · ·

A 17. ábra értelmében a legerősebb anti-TNF-α hatástartomány az 5.65 és

5.8 közötti szubfrakciókban mérhető.

A 18A illetve a 18B ábrákon a Fragmin illetve a heparinázzal degradált ECM kromatogramjai (HPLC) láthatók.

A 19. ábra a heparinázzal degradált ECM Sepharose 4B oszlopon történő elválasztásakor kapott F5 és F8 frakcióinak 206 nm-nél mért abszorbcióját mutatja.

A 20A és 20B ábrákon egy, az F5 frakció HPLC elválasztásakor csúcsot adó anyag abszorbciója látható 206 illetve 232 nm-nél.

A 21A és 21B ábrákon az F5 frakció HPLC elválasztásánál kapott további frakciók UV abszorbciója látható.

A 22. ábra a heparinázzal degradált ECM Sepharose 4B oszlopon történő elválasztásakor kapott F7 és F8 frakciók UV abszorbcióját mutatja.

A 23. ábrán az F7 és F8 fraklciók keverékének SAX-HPLC kromatografálásakor kapott teljesen tiszta csúcs látható.

A 24. ábrán egy „A23/4” jelzésű csúcs látható; ezt a 23. ábrán „Τ’-jelű csúcsot adó anyag sómentesítésével nyert preparátumból mértük.

A 25A, 25B és 25C ábrákon standard diszacharidot (H-0895, H-1020 és H9267; Sigma) SAX-HPLC elválasztásakor kapott kromatogramok láthatók.

A 26. ábra a heparin heparinázzal (MM5) történő kezelésekor kapott keverékből Sepharose 4B oszlopon elválasztott F7 és F8 frakciókat mutatja.

A 27. ábrán a PC3 heparináz, valamint heparin+PC3 Sepharose 4B oszlopon való kromatografálásakor kapott különböző frakciók 206 nm-nél mért abszorbciós görbéi láthatók.

A 28A és 28B ábrákon a 26. ábra szerinti F7 frakció HPLC elválasztásakor kapott további frakciók láthatók.

A 29. ábrán a Fragmin HPLC elválasztásakor kinyert F90 frakció látható.

60.704/SM • · · • · »

-25 A 30. ábrán az A23/4 csúcsnak megfelelő elöregedett minta SAX-HPLC kromatogramja látható.

A 31. ábra a 23. ábrán bemutatott, HPLC kromatográfiával nyert ECM-eredetű diszacharid 20 pg-os mintájából felvett ¹H-NMR spektrumot szemlélteti.

A 32. ábrán a 31. ábra szerinti minta kétdimenziós COSY színképe látható.

A 33. ábrán a 31. ábra szerinti NMR színkép kinagyított részletét mutatja az anomer proton szignáljával.

A 34. és 35. ábrán két különböző minta FT-IR színképe látható; az egyik (34. ábra) egy szulfatált vegyület, a másik (35. ábra) egy részlegesen deszulfatált analógon jelenlétére utal.

A 36A ábra a 23. ábra szerinti minta metilezett származékának tömegspektrumát mutatja ditio-treitol (DTT) és tioglicerin 1:1 arányú elegyében.

A 36B ábra a DTT-tioglicerin 1:1 elegy tömegspektrumát mutatja.

A 37A és 37B ábrákon ugyanennek a mintának a tömegspektruma látható: a 37A ábrán metil-nitro-benzilalkoholban, a 37B ábrán pedig magának az oldószernek a színképe (MS) szerepel.

A 38. ábra a 9392 és 1020 sz. diszacharidokkal kezelt, kísérletesen előidézett adjuváns arthritiszben szenvedő nőstény Lewis patkányok AA pontszámainak javulását mutatja be.

A 38A ábra a 0895 sz. diszachariddal kezelt, kísérletesen előidézett adjuváns arthritiszben szenvedő patkányok AA pontszámait mutatja a kontrolihoz (PBS) képest.

A 38B ábra Lewis patkányok AA pontszámainak javulását mutatja be különböző dózisokban alkalmazott glukózamin hatására.

A 38C ábra Lewis patkányok AA pontszámainak javulását mutatja be galaktózamin különböző dózisai hatására.

60.704/SM

-26 A 38D és 38E ábrák a 9392 sz. diszachariddal végzett további kísérletek eredményeit illusztrálják; a kérdéses diszacharidot naponta vagy hetenként adagolták a nulladik naptól (az AA-indukció kezdőnapja) vagy a 12. naptól (a patkány már AA-ban szenvedett) kezdődően.

A 38F és 38G ábrák Lewis patkányokon végzett összehasonlító kísérletsorozat eredményét mutatja; ebben azt vizsgálták, hogy a kísérletesen előidézett adjuváns arthritiszre milyen hatást fejt ki a hetenként beadott 9392 sz. diszacharid és az ismert gyulladásgátló, a dexamethasone phosphate.

A 39. ábra a patkányok szaruhártyáján liposzachariddal (Lps) előidézett gyulladással szemben mutatja be a szubkután beadott 1020 sz. diszacharid hatását.

A 39A ábrán különböző dózisokban beadott glukózamin sugárvédő hatására vonatkozó eredményeket mutatunk be a kontrollal (PBS) összehasonlításban.

A 39B ábrán különböző dózisokban beadott 9392 sz. diszacharid hasonló sugárzási kísérletekre vonatkozó eredményeit mutatjuk be a kontrollal összehasonlításban.

A 40. és 40A ábrán a találmány szerinti anyagok néhány reprezentánsának idegen szövettel szembeni reakciók gátlására való alkalmasságát szemléltetjük. A 40. ábra azt mutatja, hogy a 9392 sz. diszacharid 3 ng dózisa szubkután 1 nappal a szövetátültetés előtt és 1 héttel azután beadva (injekció) az átültetett bőrszövettel szembeni 50%-os reakciót 5 nappal késleltette. Ugyanakkor a 300 ng-os dózis (ugyanebből a diszacharid-ból) az 50%-os kilökődési reakció tekintetében nem mutatott szignifikáns különbséget a kontrolihoz (PBS) képest.

A 41. ábrán az IDDM előfordulási gyakorisága látható nőstény NŐD egereken, melyek vagy 9392 sz. diszacharidot vagy glukózamint vagy sóoldatot kaptak.

A 41A ábra a 9392 sz. diszachariddal vagy glukózaminnal vagy sóoldattal kezelt nőstény NŐD egerek halálozási arányát mutatja. Mind a 41., mind a 41A ábrával

60.704/SM ·♦ ··«·««·· · · · * • · · · ···· » >*····«·· • · · « · -27 - ..................

kapcsolatban megjegyezzük, hogy az egerek 3-1/2 hónaposak voltak, ami azt jelenti, hogy az egerekből alakult csoportban 20%-os volt az IDDM (insulin dependent diabetes mellitus) előfordulási gyakorisága.

A 42. ábrán 6 immunizált patkány nehézlégzési (RD) pontszámait mutatja be; az állatok tüneteit aeoroszolban eloszlatott antigénnel provokáltuk, 3 közülük (B1, B2 és B3) kapott H-9392 kezelést, A1, A2 és A3 pedig nem. A részleteket a leíró részben ismertetjük.

A 43. ábra a 4-O-(2-dezoxi-6-O-szulfo-2-szulfoamino-a-D-glukopiranozil)-(2-0-szulfo^-D-glukopíranozid)-uronsav szerkezetét mutatja be; a vegyületet a 6.23 példa szerinti szintézisvázlatnak megfelelően állítottuk elő.

4. A találmány részletes ismertetése

A találmány kidolgozásakor egyrészt azt találtuk, hogy a kis molekulatömegű heparinokkal (LMWH) történő kezelés gátolja a T-sejtek és makrofágok aktív TNF-a elválasztó képességét. Másrészt olyan egyéb, a találmány szerinti anyagokat ismertetünk, melyek karboxilezett és/vagy szulfátéit oligoszacharidokat tartalmaznak lényegében tiszta formában, melyek a citokininek, így pl. a TNF-α biológiai aktivitását tudják szabályozni valamely gazdaszervezetben. A továbbiakban egyszerűség kedvéért mind az itt ismertetésre kerülő gyógyászati eljárásokban használt LMWH-t, mind azokat az anyagokat, melyek a karoboxilezett és/vagy szulfátéit oligoszacharidokat tartalmazzák, s amelyeknek az izolálása lényegében tiszta formában történik, „anyag(ok)”-ként vagy „aktív anyag(ok)”-ként említjük.

A fenti hatás pl. úgy jut kifejezésre, hogy a késői típusú túlérzékenységi reakció (DTH) egereken és embereken is gátolható. Ez a túlérzékenységi reakció T-sejt dependens, melyet más sejtek, így pl. makrofágok is kiválthatnak. Ha az aktív TNF -a termelésre hatásos dózisban végezzük a kezelést, akkor az aktív anyagokkal

60.704/SM ·· ···· ·««· ·· ·· • · ♦ · · · · · t ······«·· • · · · «

-28 - .................

az autoimmun arthritis egy fajtáját, az adjuváns arthritist (AA) is gátolni lehet. Az aktív anyagokkal végzett kezelés hatására a szívátültetésen átesett patkányok túlélése meghosszabbodott, inzulin-függő diabetes mellitusos (IDDM) NŐD egereken pedig javulás volt tapasztalható. Hasonló kezeléssel megelőzhető, hogy a szétzúzott vagy más néven reziduális - extracelluláris mátrix (RECM) stimuláló hatására válaszként a T-sejtek és makrofágok aktív TNF-α termelést indukáljanak. A reziduális extracelluláris mátrix - mely a TNF-α. indukció megindulásáért (és az ennek következtében fellépő gyulladásért) felelős - nem tévesztendő össze az enzimesen degradált extracelluláris mátrix-szal (DECM), melynek néhány komponensét a találmány szerint izoláltuk, s melyek vagy a TNF-α aktivitását szüntetik meg, vagy felerősítik azt.

Minthogy az érsérülések környezetében kialakuló atherosclerosisos folyamatban a TNF-α. valószínűleg szerepet játszik, a TNF-α aktivitásának gátlása a károsodott szubendoteliális ECM környezetében enyhítheti a kóros atherosclerosisos folyamatot. Az LMWH-típusú anyagok alkalmazásakor talán az a legmeglepőbb, hogy ezek kis dózisban, hetenként beadva a leghatásosabbak. Nagy dózisban vagy napi adagolásban az LMWH-típusú anyagok nem gátolják a TNF-α elválasztást és az immunreakciókat.

A heparinokból frakcionálással vagy szabályzott depolimerizációval előállított kis molekulatömegü heparinok a heparinhoz képest jobbak az antitrombotikus hatást illetően és farmakokinetikai sajátságaik is mások, mint a hepariné: szubkután beadva felezési idejük megduplázódik és biológiai hozzáférhetőségük jobb antikoaguláns hatás vonatkozásában. [Bratt, G. és munkatársai: Thrombosis and Haemostatis, 53:208 (1985) és Boné, B. és munkatársai: Thrombosis Research, 46:845 (1987)].

A találmány értelmében tehát azt találtuk, hogy az LMWH-típusú aktív anyagok szubantikoaguláns dózisban több napos szünetekkel beadva hatásosan alkal60.704/SM • · · · » • · ··· ··« ·

-29 mázhatok az aktív TNF-oc indukciójával járó patológiás folyamatok megelőzésére és/vagy kezelésére. Azt találtuk továbbá, hogy bizonyos, 1-10 cukoregységből, előnyösen 2-4 cukoregységből álló oligoszacharidokat tartalmazó anyagok azonosíthatók, melyek a TNF-oc aktivitását gátolják vagy fokozzák. Ezek az anyagok pl. élő szervezetek szöveteiből, így pl. a szubsztrát extracelluláris mátrix oldható degradációs termékeiből állíthatók elő.

4.1. Az aktív anyagok forrásai

A találmány szerint alkalmazott LMWH-típusú anyagok 3000-6000 átlagos molekulatömegü LMWH-ból származnak; ilyeneket ismertet pl. a 0014184 sz. európai szabadalmi leírás. Más LMWH-típusú anyagok, így pl. a Fragmin®, a Fraxiparin®, a Fraxiparine® és a Lovenox®/Clexane® a kereskedelmi forgalomban is kaphatók.

LMWH-típusú anyagokat többféle eljárással is előállíthatunk: így a standard heparinban jelenlévő LMWH dúsításával (frakcionálás etanollal és/vagy molekulaszita alkalmazásával, pl. gélszűréssel vagy membrán szűréssel) és szabályzott kémiai (salétromossavas, β-eliminációs vagy perjodátos oxidációs) vagy enzimatikus (heparinázos) depolimerizációval. A depolimerizáció körülményeit gondosan kell megválasztani ahhoz, hogy a kívánt molekulatömegű termékeket kapjuk. A salétromossavas depolimerizációs technika közismert. A heparin-benzilészter β-eliminációs depolimerizációját szintén alkalmazzák olyan fragmens-típusok előállítására, mint amilyenek a heparinázok alkalmazásán alapuló enzimes depolarizációnál is képződnek. Kis antikoaguláns aktivitással rendelkező és az alap kémiai struktúrát megtartó LMWH-típusú anyagokat perjodátos oxidáción alapuló depolimerizációs technikával állíthatunk elő, vagy úgy, hogy immobilizált antitrombinon történő ad60.704/SM • · *««4 , .

* · · ··»· _#· ··» «·< , ,

9··· ··<> »·α« «·»«

-30 szorpcióval távol ltjuk el az antitrombin-kötö frakciót az egyéb módszerekkel előállított LMWH-ból.

A Fragmin® egy 4000-6000 dalton átlagos molekulatömegü LMWH, melyet sertés intestino musocából származó nátrium-heparinát szabályzott salétromossavas depolimerizációval állítanak elő. A Fragmin® gyártója, a svéd Kabi Pharmacia a terméket antitrombotikus készítményként fiziológiás sóoldatban hozza forgalomba 2500 IE/0,2 ml és 5000IE/0,2 ml injekciós dózisokban (ez 16 mg-nak illetve 32 mg-nal felel meg injekciós ampullánként).

A Fraxiparin® és Fraxiparine® 4500 dalton körüli átlagos molekulatömegű LMWH-féleségek, melyeket sertés bélmucosából származó kalcium-heparinát frakcionálásával vagy szabályzott salétromossavas depolimerizációjával állítanak elő. A készítmény gyártója, a Sanofi (Choay Laboratories) az antitrombotikus hatású szert 3075 IE/0,3 ml víz dózisban forgalmazza (ez kb. 36 mg-os dózisnak felel meg).

A Lovenox® (Enoxaparin/e) egy olyan LMWH-fragmens, melyet a sertés bélmucosából származó nátrium-heparinát β-eliminációs depolimerizációjával állít elő a francia Pharmuka SF; az anyagot Clexane® és Lovenox® néven a Rhone-Poulenc forgalmazza antitrombotikus szerként 20 mg/0,2 ml víz és 40 mg/0,4 ml víz injekciós dózisokban.

Azok az új tulajdonságok, melyeket felismertünk és a jelen találmány vonatkozásában leírunk, mindegyik LMWH-típusú anyagban megvannak - függetlenül az előállítási eljárástól, az esetleges szerkezeti különbségektől (ezek a depolimerizációból vagy a nyersanyagként használt heparin különbözőségéből adódhatnak) és az antikoaguláns aktivitásból -, mely LMWH-anyagok a nyugvó T-sejtek és/vagy makrofágok aktív TNF-α elválasztását in vitro gátolni képesek, mely gátlás válaszreakcióként jelentkezik arra az aktiválási folyamatra, amelyet T-sejtspecifikus antigén60.704/SM nel, mitogénekkel, makrofág aktivátorokkal, reziduális ECM-mel vagy ennek protein komponenseivel (pl. fibronectin, laminin vagy hasonló) való érintkezés válthat ki.

Egy másik teszt, mellyel a jelen találmány céljának megfelelő LMWH-típusok identifikálhatok, a kísérletesen előidézett késői típusú túlérzékenység (DTH), mely bőrreakció formájában jelentkezik; ez egy T-limfocita-dependens reakció, melyet egy sor antigénnel [pl. tetanusz antigén, a myelin alapú protein (MBP), tisztított protein származék (PPD) és oxazolon]. Az LMWH-típusú anyagok gátolják a T-sejtek megtapadását az ECM-en és annak protein komponensein.

A találmány szerinti hatásos LMWH-típusú anyagokból gyógyászati készítményeket, így pl. vizes oldatokat készíthetünk, melyek nátrium-kloridot, stabilizátorokat és egyéb, a gyógyhatás szempontjából közömbös segédanyagokat is tartalmaznak. Az injekciós beadásmód, így pl. a szubkután vagy az intravénás adagolás az előnyös, de más, a találmány szerint ismertetett beadásmódok, így az orális adagolás is lehetséges.

A találmány értelmében az LMWH adagolása célszerűen 5-8 naponként, előnyösen heti egy alkalommal történik. A találmány szerinti egyéb anyagok, különösen a kis molekukatömegű (2000 dalton alatti) oligoszacharidok bármely szokásos módon (így injekcióban, orálisan vagy topikálisan), napi dózisokra bontva vagy hetenként egyszeri dózisban beadhatók.

4.2. Az LMWH készítmények aktivitás-csökkenése az idő függvényében Stabilizátorok hatása

Stabilitás vizsgálatok során azt találtuk, hogy az LMWH minták, így pl. a Fragmin szobahőmérsékleten 72 órán belül, alacsony (4°C) hőmérsékleten néhány hónapon belül elveszti azt a képességét, hogy a TNF-α aktivitását gátolja.

A 6.1. pontban közlésre kerülő XI. táblázatból látható, hogy szobahőmérsékleten a Fragmin 1 nap után aktivitásának 53%-át, kb. 2 nap után 87%-át elveszti, 3

60.704/SM

-32 nap után pedig nincs kimutatható aktivitása. A 6.2. pontban közlésre kerülő XII. táblázatban lévő kísérleti adatok szerint a Fragmin® anti-DTH hatása már alacsonyabb (4°C) hőmérsékleten is megszűnik idővel, ez azonban hosszabb folyamat. Ugyanakkor a szokványos, nem-frakcionált heparinok 4°C hőmérséleten nem vesztik el klasszikus véralvadásgátló hatásukat.

A citokinin gátló hatás stabilizálása vagy megőrzése érdekében folytatott kísérleteink során figyelmünk egy jól ismert heparin adalékanyag felé fordult. A protamin-szulfátról ismert, hogy a heparinoid molekulák véralvadásgátló hatását semlegesíti, s a klinikai gyakorlatban használják is erre a célra [Goodman és Gilman: The Pharmacoloqical Basis of Therapeutics, 8th Ed, p. 1317, Pergamon Press, New York (1990)]. Meglepő módon azt találtuk azonban, hogy a protamin-szulfát az LMWH TNF -α-dependens gátló hatását nem semlegesíti, hanem stabilizálja ezt a hatást (lásd XII. táblázat, protamin-szulfát adalékra vonatkozó rovatai).

Összefoglalva tehát a következőket állapíthatjuk meg: (i) LMWH hígított oldatai 20°C hőmérsékleten gyorsan, 4°C hőmérsékleten lassabban elvesztik aktivitásukat (megjegyezni kívánjuk, hogy a 4°C-on történő aktivitás-vesztés nem vonatkozik a Heparin illetve LMWH standard véralvadásgátló és anti-trombotikus hatására); (ii) a protamin-szulfát adalék, mely a heparinok standard aktivitásait közismerten semlegesíti, nem interferál az LMWH-típusú anyagok jelen találmány szerinti TNF-α elleni új hatásával, hanem stabilizálja az új hatást.

4.3. Az LMWH frakcionálása, valamint degradált ECM vagy degradált heparin előállítása. A TNF-α aktivitását fokozó és gátló hatás felismerése Mint fentebb már ismertettük, a kis molekulatömegü heparin (Fragmin) gátolja az aktív TNF-oc elválasztását. A maximális gátlás vagy lnh_max (90%) 1 pg/ml koncentrációnál volt észlelhető (lásd 9. ábra). Ugyanakkor az inaktivált Fragmin nem befo60.704/SM • · · • ·

-33 lyásolja a TNF-α termelést (lásd 10. ábra). Az inaktivált anyag kisnyomású méret kizárásos gélkromatografálásakor (Sepharose 4B szilárd töltetű oszlopon való frakcionálás) viszont aktív frakciókat kaptunk, melyek között gátló (F15) és aktivitást fokozó frakciók (F8 és F2) is voltak. (A 206 nm-nél mért abszorpciót a frakció-számok függvényében a 11. ábra, a hatásadatokat a XIII. táblázat mutatja). Az inaktivált Fragmin gátló hatású frakciója (F15) a DTH reakciót is gátolja. (A 12. ábra az aktív fragminra, a 12A ábra az F15 frakcióra, a 12B ábra az F10 frakcióra vonatkozik). Az F10 frakció sem a TNF-α termelést, sem a DTH reakciót nem befolyásolja.

Sepharose 4B oszlopon, méret-kizárásos gélkromatográfiával S-jelzett szulfát-csoportokat tartalmazó, heparinázzal kezelt ECM degradációs termékeit is elválasztottuk. Ebben a kísérletben a heparináz enzim több típusát is alkalmaztuk, így pl. MM5 (humán placentából származó emlős heparináz; gyártó: Rád Chemicals, Weismann Industrial Park, Ness Ziona, Izrael), PC3 [bakteriális endoglikozidáz, melyet Shoseiov, O. és munkatársai ismertettek, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 169:667-672 (1990)] és egy bakteriális eredetű enzim, mely az IBEX Technologiestől (Quebec, Kanada) származott. Az egyes frakcióknak megfelelő radiokativitást (CPM) a 13. ábra szemlélteti. A frakcionált Fragmin és a heparinázzal kezelt ECM frakciók elúciós profiljai egy ábrára (14. ábra) felvitten láthatók. A Sepharose 4B oszlopon végzett kisnyomású elválasztás paramétereit az alábbi I. táblázat mutatja.

I. Táblázat: A Sepharose 4B kromatografálás paraméterei

Oszlop:	Sepharose 4B (35 x 0,7 cm, belső átmérő)
Termelés:	1-1,5 ml
Áramlási sebesség:	5 ml/óra
Oldószer:	PBS (pH = 7,4)
Frakció:	0,2-0,5 ml/cső
Abszorpciós detektor állása:	206 nm, 280 nm

60.704/SM

Az egyes frakciókat a TNF-α termelésre kifejtett hatásuk vonatkozásában vizsgáltuk. Az eredményeket a későbbiekben közölt XV. táblázat mutatja. Érdekes, hogy a két különböző forrásból származó, de hasonló elúciós tulajdonságokkal rendelkező frakció a TNF-α termelésére és/vagy aktivitására is hasonlóan hatott kvalitativen (F39 illetve F42 Fragminból illetve heparinázzal degradált ECM-ből).

A 15. és 13. ábrákon Sepharose 4B oszlop alkalmazásával nyert elúciós profilokat láthatunk; az egyik az LMWH-tól (Fragmin), a másik ³⁵S-jelzett szulfátcsoportokat tartalmazó ECM-eredetű oligoszacharidoktól származik, melyet tisztított MM5 heparinázzal állítottunk elő. A 13. ábrán átható, hogy az enzim az ECM heparánszulfátot (a heparináz-szubsztrátját) degradálja, s az így keletkező heparán-szulfát fragmensek elúciós tulajdonságai hasonlóak a frakcionált LMWH-éhoz.

A 16. ábra egy olyan oligoszacharidra vonatkozik (a 13. ábrán látható 5. frakció Sepharose 4B oszlopról), melyet az ECM+heparináz „léből”, azaz az ECM heparinázos kezelésekor kapott keverékből nyertük ki. Ez az oligoszacharid lényegileg hasonló dózis-hatás összefüggést mutat mint az LMWH az aktív TNF-α elválasztásra kifejtett hatást illetően; nevezetesen mindkettő dózis-hatás görbéje harangalakú, a maximális gátlás (kb. 90%-os) kb. 1 pg/ml koncentrációnál jelentkezik mindkét anyagnál, tehát az aktivitás mind az ennél nagyobb, mind az ennél kisebb koncentrációknál csökken. Ez azzal az előnnyel jár, hogy a beadandó dózis ezeknél az aktív anyagoknál egybeesik a hatásgörbe egy „ránézésre” könnyen felismerhető pontjával.

A 17. ábra azt mutatja, hogy az ECM degradációs termékeinek anti-TNF-a hatása egy olyan szubfrakció környezetében a legerősebb (kb. 5,65 és 5,80 közé eső tartomány), mely a 13. ábra szerinti 5. frakcióból származik.

60.704/SM • ·

-35 A heparin-szulfátot tehát a heparináz degradációs termékek produkálására készteti, ezek - akárcsak az LMWH - visszahatnak a T-sejtekre és makrofágokra, hogy állítsák le az aktív TNF-α termelést, s következésképpen a TNF-mediálta gyulladásos folyamatot is (45. ábra).

Felismertük továbbá, hogy a kis molekulatömegű oligoszacharid fragmensek, melyek az intakt heparin endoglikozilázos kezelésekor képződnek, szintén rendelkeznek a kívánt, TNF-α aktivitást szabályzó hatással.

4.4. LMWH frakciók, valamint DECM és DH eredetű fragmensek HPLC elválasztása

Az LMWH (pl. Fragmin), az ECM- illetve a heparin-degradáció során kapott minták frakcióinak minél tökéletesebb elválasztása érdekében nagynyomású folyadékkromatográfiás technikát alkalmaztunk (HPLC). Első közelítésben két különböző típusú HPLC feltétel-együttest alkalmaztunk. Az első típus (HPLC I) körülményei között több frakció elválasztását és izolálását oldottuk meg, és ezeket megvizsgáltuk, hogy az aktív TNF-α elválasztását hogyan szabályozzák. Meglepő módon azt találtuk, hogy míg egyesek fokozzák a TNF-α aktivitását egy adott gazdaszervezetben, addig más frakciók gátolják a TNF-α aktivitást. Ezt követően a másik HPLC (HPLC II) körülményei között molekulatömeg szerint tovább finomítottuk az egyes komponensek elválasztását.

Az első típusnál Guardcolumn Oligoval (4 cm x 6 mm belső átmérő) kiegészített TSK-GEL® G-Oligo-PW oszlopot (4 cm x 6 mm belső átmérő) használtunk. A további paramétereket az alábbi II. táblázatban adjuk meg.

60.704/SM

-36 II. Táblázat: HPLC I kromatográfiás körülmények

Oszlop: TSK-GEL G-Oligo-PW 30 cm x 7,8 mm belső átmérő

Guard oszlop: Guardcolumn Oligo 4 cm x 6,0 mm belső átmérő

Huroktérfogat: 200 μΙ

Áramlási sebesség: 0,5 ml/perc

Oldószer: 0,2 M foszfát puffer (pH = 7,0)

Frakció: 0,5 ml/cső

Detektor állás az abszorpciós készüléken: 190 nm - 400 nm

A másik típusú kromatografálási feltételei hasonlóak a Rice, K.G. és munkatársai által leírtakhoz [Analytical Biochem. 150:325-331 (1985)]. Két sorbakapcsolt oszlopot alkalmaztunk, az egyik egy Toyo Soda TSK-Gel G3000SW oszlop (7,5 mm x 50 cm), mely a másikkal (G2000SW, 7,5 mm x 50 cm) össze van kapcsolva. A G2000-es oszlop bemenetéhez egy 7,5 mm x 10 cm-es guard oszlop csatlakozik. A készüléket a Phenomenextől szereztük be. A HPLC II. adatait az alábbi III. táblázat foglalja össze, a kísérlet további részleteit pedig a 6.11, 6.14, és 6.15 pontokban ismertetjük.

III. Táblázat: HPLC II kromatográfiás körülmények

Oszlop: Toyo Soda TSK-GEL G3000SW (50 cm x 7,5 mm belső átmérő) és egy

G2000SW (50 cm x 7,5 mm belső átmérő), Guarddal sorbakötve

Oszlop: Guardcolumn (10 cm x 7,5 mm belső átmérő)

Huroktérfogat: 20 vagy 100 μΙ

Áramlási sebesség: 1 ml/perc

Oldószer: gáz-mentes 0,5 M NaCI

Frakció: 0,5 ml/cső

Detektor állás az abszorpciós készüléken: 205 nm - 232 nm

60.704/SM

-37 ········ · · ·· • · * · · ........

A táblázat szerinti feltételek között a kismolekulájú anyagok hosszabb ideig maradnak az abszorbensen, mint a nagymolekulájúak.

Néhány kiválasztott és sómentesített frakciót még egy harmadik HPLC típuson is megvizsgáltunk tisztaság szempontjából, erős anioncserélő (SAX) töltetű HPLC oszlop alkalmazásával (HPLC III). Ilyen tölteten hasonló molekulaméretű anyagok is elválaszthatók, ha a molekulákban lévő negatív töltésű csoportok száma különböző. Minél több a negatív töltésű csoportok száma egy anyagban, annál hosszabb ideig marad az oszlopon megkötve. A HPLC III. körülményeit az alábbi

IV. táblázat szemlélteti.

IV. Táblázat: HPLC III kromatográfiás körülmények

Oszlop: SAX-HPLC oszlop (25 cm x 4,6 mm belső átmérő, töltet: Spherisorb, 5 Mm részecskeméret)

Huroktérfogat: 1 ml

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc

Oldószer: lineáris gradiens, lásd később

Frakció: 1 ml/cső

Abszorpció méréskor a detektor állása: 205 nm, 232 nm

Lineáris gradiens (lásd 6.15 pontot)

A szakember számára az eddigiekből nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti aktív anyagok elválasztására és tisztítására más HPLC technikák, így pl. a fordított fázisú HPLC is alkalmas (lásd Rice, K.G. és munkatársai már említett cikkét).

Anélkül, hogy elméleti oldalról be kívánnánk határolni a találmányt, megemlítjük, hogy feltevésünk szerint a TNF-α aktivitását fokozhatja pl. az ha az aktív TNF-a intra-celluláris termelése nő vagy ha a gazdaszervezet immun effektor sejtjei nagyobb mennyiségben választanak el aktív TNF-a-t, illetve ha a citokinin aktivitását egy másik anyag felerősíti.

60.704/SM •··· ·«··

-38ATNF -a biológiai aktivitásának gátlását értelemszerűen valamely ellenkező irányú folyamat válthatja ki; ez nemcsak olyan folyamat lehet, melynek során valamely aktív gátló anyag és a TNF-α ugyanazokért a receptorokért verseng (ilyen pl. ha maga a gátló anyag TNF-α antagonista vagy ha egy másik olyan anyag termelését indukálja, mely TNF-α antagonista), hanem a TNF-α és a gátló anyag között komplexképződési folyamat is lejátszódhat, mely komplex kevésbé aktív, mint a szabad TNF-α. Természetszerűleg ha a TNF-α egy, az aktivitását fokozó anyaggal képez olyan komplexet, mely az aktivitást „feldobja”, akkor megnövekedett TNF-α aktivitás észlelhető.

4.5. Az aktivitás meghatározása

A találmány szerinti aktív anyagokat, melyek a TNF-α aktivitást fokozzák/gátolják, az ezeket tartalmazó keverékekből izoláltuk és tisztítottuk. Bizonyos esetekben az aktív anyagokat alapvetően homogén formában állítottuk elő a már ismertetett hatékony HPLC módszerrel.

Az aktív anyagok tisztaságának indikálására meghatároztuk az egyes anyagok specifikus szabályzó aktivitását.

Először azonban Carney, S.L. karbazol-módszerével [Chaplin, M.F. és Kennedy, J.F. (eds.) IRL. Press. Oxford, Washington, D.C. (1986), Proteqlycan Analysis, A Practical Approach, p. 129] meghatároztuk az adott mintában jelenlévő oligoszacharid (cukor) mennyiségét. Ezzel a módszerrel pikogrammnyi (pg) cukormennyiségek mérése is lehetséges. A módszert az 5. pontban leírt módon alkalmazzuk.

Ezután az anyag mennyiségével összefüggő látszólagos aktivitást határoztuk meg az 5. pontban részletesen taglalt biológiai mérömódszerek valamelyikével, hogy

60.704/SM ♦··· ···

-39 felvehessük a dózis/hatás görbéket. Ezek a biológiai mérőmódszerek akár in vitro, akár in vivő körülmények között is alkalmazhatók.

Azt találtuk, hogy ha a találmány szerinti anyagok nélkül, majd a találmány szerinti anyagok jelenlétében felvettük a koncentráció/dózis függvényében a TNF-a aktivitás %-ban kifejezett aktivitás fokozódás/gátlás mértékét, akkor dózis-hatás öszszefüggés tapasztalható. Az így kapott látszólagos aktivitási görbe jó közelítéssel harang-alakú, mint az a 9. és 16. ábrákon látható. A %-os aktivitás fokozódási/gátlási értékek maximumát minden egyes anyagnál Aug_max illetve lnh_max értékként jelöltük, attól függően, hogy aktivitás fokozásról vagy gátlásról van szó.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük, hogy az lnh_max illetve Aug_max értéknek megfelelő „ideális” dózis ezzel a biológiai méröeljárással hogyan állapítható meg akár a TNF-α aktivitás in vitro vagy in vivő egér kísérletekben mért gátlása/fokozódása, akár egereken végzett DTH kísérletek alapján. Alternatív megoldásként a biológiai mérőeljárás in vitro humán sejteken végzett kísérleteken is alapulhat (ismertetést lásd később). Bevezettük a specifikus szabályzó aktivitás kifejezésére az „R” érték fogalmát, mely az Inh_max illetve Aug_max és a maximális gátlásnak illetve aktivitás fokozásnak megfelelő „ideális” dózis hányadosa. In vitro méréseknél az „R” értéket jellemzően % X (pg/ml)’¹ egységekben fejezzük ki.

Mint már említettük, a specifikus szabályzó aktivitást in vivő körülmények között is meghatározhatjuk egereken vagy embereken kísérletesen előidézett DTH reakció gátlásának megfigyelése alapján. Azt találtuk, hogy egy gátló hatású készítmény valamely dózisával az aktív TNF-α elválasztásának gátlására elérhető hatás és a késői típusú túlérzékenységi (DTH) reakció gátlásában mutatkozó hatás között mindenképpen pozitív korreláció van, de előfordulhat,hogy egy adott készítmény vonatkozásában in vitro és in vivő körülmények között eltérő hatáserösség mutatkozik.

60.704/SM

-40 ·*»· ···· • · · * *9 999 999

9 99 ·99* 99·*

Ezekben az in vivő sejt-mediátor hatásra fellépő gyulladásos reakciókban az aktivitás gátlására illetve fokozására való képesség igen jelentős, hiszen a DTH reakció autoimmun betegségek, szöveti kilökődési folyamatok, bizonyos típusú érgyulladások és allergia megjelenési formája is lehet. Azaz, ha abbén a tesztben aktivitást lehet kimutatni, akkor a teszt ezekben a betegség-típusokban és valószínűleg további, a későbbiekben ismertetésre kerülő egyéb betegségekben való használhatóságot is jelzi.

Az új mennyiség - az lnh_max vagy Aug_max és az ehhez tartozó anyagmennyiség vagy koncentráció (az „ideális” dózis, mely a maximális %-os értéket kiadja) hányadosként definiált specifikus szabályzó aktivitás - ezenkívül arra is alkalmas, hogy a jelen találmány szerinti aktív anyagokat vagy azokat az ismert anyagokat, melyekről eddig nem lehetett tudni, hogy citokinin szabályzó hatásuk van, megkülönböztessük az ilyen hatással nem rendelkező anyagoktól. Ezt a specifikus arányszámot a továbbiakban röviden csak „R”-értékként említjük. A jelen találmány szerinti új anyagok és kompozíciók tehát akár ennek az „R”-értéknek a minimumával is jellemezhetők (ez a látszólagos aktivitást a dózis függvényében ábrázoló görbéről kiszámolható), mely „R”-érték meghaladja az ismert kompozíciókhoz hozzárendelhető „R”értéket.

4.6. Rendellenesség típusok, melyek esetében a jelen találmány alkalmazható

A jelen találmány mindazon rendellenességek megelőzésére és kezelésére alkalmazható, melyek aktív TNF-α elválasztást előidéző patológiás folyamatokkal vannak összefüggésben; ilyenek pl. az atherosclerosis és vasculitis, valamint az ezekkel összefüggő kóros folyamatok; az autoimmun betegségek, mint pl. a rheumatoid arthritis, az I. típusú diabetes (inzulin-függő diabetes mellitus vagy

60.704/SM ·«· ^r ·· ··«· * · · * ··« ··♦· ·*-'·

IDDM), a sclerosis multiplex, a lupus erythematosus, és a Graves-betegség; az allergia; az átültetett szövet kilökődése; az akut és krónikus gyulladásos betegségek, mint pl. az uveitis és bélgyulladás; az anorexia nervosa; a szepszis-okozta hemorragiás sokk és végül a HIV-fertőzések következtében kifejlődött AIDS. AIDS esetén az aktív anyagok visszaszorítják a HÍV replikációját, s ezáltal megelőzhető az AIDS-szel összefüggő komplexum (ARC) kialakulása. Más betegségek esetében a citokinin aktivitás szabályzása a kezelés alapja; a teljesség igénye nélkül ide sorolhatók a psoriasis, penphigus, asztma, vese- és máj rendellenességek, a csontvelő elégtelen működése, a vitiligo, alopecia és a myositis.

Ezen kívül az aktív TNF-α aktivitásának fokozása is hasznos lehet, pl. daganatok, bakteriállis és vírusos fertőzések kezelésében. Azok a találmány szerinti anyagok, amelyek az aktív TNF-α termelését fokozó hatásnak, gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal összekevert formában parenterálisan, orálisan vagy topikálisan alkalmazva használhatók a bőrrák, így a bazális- vagy pikkelyes sejtek rákos megbetegedéseinek vagy a melanoma kezelésére.

A találmány klinikai alkalmazási lehetőségeinél nem szabad megfeledkezni arról sem, hogy bizonyos betegségek kezlése elsősorban a homeostasis helyreállításából áll. Endokrinológusok ezt egy adott hormon óvatos adagolásával vagy annak antagonizálásával oldják meg. így pl. egy inzulin-dependens diabeteszes kórformában szenvedő beteg eredményesen kezelhető inzulin helyettesítő terápiával; egy Graves-betegségben szenvedő páciensen általában a tiroxin elválasztást gátló szerrel lehet segíteni. A legritkább esetben lehet hormon beadásával segíteni olyanokon, akiknek elégtelen a hormonmüködésük.

A citokininek - így a TNF-α is - alkalmazhatók, mint neoplazmás folyamatot gátló szerek. Rákos betegeknek immunmodulátorokat adni nem tűnik túl racionális60.704/SM • · · • · · ·

-42 - .......

nak: sok citokinin-féleség, így a TNF-α is, annyira toxikus, hogy jóval a terápiás cél elérése előtt abba kellene hagyni az adagolásukat. Ilyen esetben nagy segítség lehet, ha az endogén úton termelt TNF-α aktivitását tudjuk fokozni, s ez nemcsak egy új terápiás megközelítés, hanem minden eddigi terápiás rendszernél hatékonyabb lehet.

ATNF -a szerepének megértése még folyamatban van és kétségtelen, hogy e hormonnak, valamint e hormon aktivitását szabályozni képes anyagoknak további új felhasználási területeire derülhet fény. Az igényelt kompozíciók és gyógyszerkészítmények összes felhasználási területét beelértjük a találmány oltalmi körébe, s különösen azokat, melyek valamely betegség tüneteit enyhítik, a betegség kialakulását megelőzik vagy a betegséget elmulasztják.

4.7. A találmány szerinti oligoszacharid típusú anyagok topikális alkalmazása

A találmány szerinti anyagok topikálisan alkalmazható készítményekben is használhatók pl. ödéma vagy gyulladás kezelésére. A tisztán terápiás alkalmazási területen túlmenően azonban kozmetikai kompozíciók védőhatásnak kiegészítésére is használhatók, pl. napozó és fényvédő folyadékokban. Ha egyáltalán van, kevés az olyan teljes hatású napvédő készítmény, mely az elektromágneses színkép ultraibolya tartományába eső veszélyes hullámhossztartományt (így a 290-320 nm közöttit) teljes egészében kizárja. így a túlzásba vitt napozás gyakran idéz elő napozás okozta akut erythemát, a hosszantartó vagy ismétlődő sugárhatás pedig kicserzi a bőrt vagy rosszabb esetben bőrrákot okozhat.

A találmány szerinti aktív anyagok kozmetikai készítményben inkorporáltan mind a bőr állagmegőrzésére, mind annak védelmére, továbbá kóros állapotának, így pl. a szoláris erythema enyhítésére alkalmasak. Napvédő és napozó preparátumokban a találmány szerinti oligoszacharidok hatásos mennyisége mellett célszerű

60.704/SM • · · · · ·

-43 más szokásos napvédő anyagokat is alkalmazni. Az aktív anyagot általában 1 pg és 100 mg közötti dózisban alkalmazzuk testsúly kb-ra számolva; előnyösen azonban 0,01-10 mg, legelőnyösebben 0,1-1 mg a testsúly kg-ra számított mennyiség.

A kozmetikai készítmények a szakember számára nyilvánvalóan egyéb ismert komponenseket is tartalmazhatnak [pl. Kirk-Othmer: Encyclopedia of Chemical Technoloqy, 3rd Ed. Vol 7, pp. 143-176 (1979)]. Napvédő készítményben a találmány szerinti aktív anyagok hatására megnő a miminális erythemás dózis (MED) és ennek következtében a fényvédő faktor (SPF) is. További komponensek - beleértve a tipikus fényvédőket - lehetnek a fenti Kirk-Othmer könyv 153-154. oldalán felsorolt anyagok. Topikálisan alkalmazható preparátumok és kozmetikumok előállítására alkalmas eljárásokat ismertetnek a 4,199,576, 4,136,165 és 4,248,861 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások, melyek teljes leíró részét ideértjük. A kozmetikumok előállításában jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy többféle készítmény formára hozhatók az adott kompozíciók (így pl. oldat, folyadék, krém, paszta, emulzió, spray, aeroszol, stb.)

4.8. Dozirozási példák

A találmány értelmében azt a legkisebb LMWH per kilogramm dózist, amely legalább 50%-ban gátolja a TNF-α termelést vagy a DTH reakciót, 12 egér gátlási egységnek tekintjük per kilogramm (12 egység/kg, azaz 12 E/kg). Mivel az ember testfelülete és metabolizmusa az egérétől eltérő, emberek kezelésénél ennél kisebb LMWH dózist kell alkalmazni; ezért úgy tekintjük, hogy az egérre alkalmas 12 E/kg dózis emberen 1 E/kg dózisnak felel meg. így pl. a 38609 mintaszámú Fragmin®, mely mind a TNF-α elválasztást, mind a DTH-reakciót hatékonyan gátolja, egéren 5 pg/egér/hét dózisban került adagolásra. Tekintve, hogy egy-egy egér kb. 25 g-os, a 38609 mintaszámú Fragmin®-ból a 12 E/kg dózisnak 200 pg/kg egér adag felel

60.704/SM

-44 meg. Következésképp az emberen alkalmazható 1 E/kg dózisnak 200 pg/kg: 12 = = 16,67 pg/kg adag felel meg. Egy 70 kg-os ember tehát 1,2 mg körüli mennyiséget kell, hogy kapjon heti egyszeri adagban szubkután. az optimális dózis természetesen emberenként változó lehet, de általában 5 mg alatti és célszerűen 0,3 és 3 mg közötti.

Tehát durván: az egér dózisból úgy kapjuk meg a humán, testsúlykg-ra vonatkoztatott dózist, hogy az egér dózis/kg értékeit 10-zel vagy 12-vel elosztjuk.

A patkányon hatásos dózist úgy valószínűsíthetjük, hogy az LMWH dózis/kg patkány hányados a fele az LMWH dózis/kg egér értéknek, azaz 6 E/kg. Pl: ha a 38609 mintaszámú Fragmin-ból 12 E 200 pg/kg-nak felel meg, akkora patkány esetében alkalmazandó 6 E dózis 100 pg/kg, illetve 20 pg per 200 g patkány, heti egyszeri adagban.

Az LMWH-ból, degradált haprinból vagy degradált ECM-ből izolált találmány szerinti oligoszacharid-típusú anagok többfségénél a humán terápiában hatásos dózis a következőképpen valószínűsíthető az in vivő DTH eredmények alapján.

Mint a 12A ábra mutatja, egy izolált frakció (F15) 0,1-5,0 pg/egér/hét dózisban in vivő gátolja egereken a DTH-t. Lévén, hogy az egerek 25 g-osak, az in vivő dózis közelítőleg 4-200 pg/kg egér/hét (ez 0,01-10 pg/ml in vitro adagnak felel meg).

Az egér és ember testfelület közti különbséget korrekcióba véve az egér dózis/kg értéket el kell osztani 12-vel:

4-200 pl/kg egér 0,33 - 16,67 pg/kg ember

Tehát egy 70 kg-os embernek kb. 1,2 mg-ot (kb. 1200 pg-ot) kell kapnia. Minthogy ember és ember közt különbség van, biztonság kedvéért kb. 5 mg-ra emelhetjük a dózist; ez egy olyan mennyiség, mely bőven alatta van annak a dózisnak, mely heparinoid anyagok esetében a véralvadás vagy thrombózis kezelésére hatásosan

60.704/SM • · • · · · · ·

-45 alkalmazható. Tehát egy 70 g-os ember 5 mg vagy ez alatti dózist, előnyösen 3 mg vagy ennél kisebb dózist, legelőnyösebben 1 mg vagy ennél kisebb dózist kap.

A találmány szerinti anyagok közül azok, amelyeket alapos tisztítással, így HPLC kromatográfiás úton állítottuk elő, ennél kisebb előnyös dózisban is adhatók, így pl. az alábbiakban részletes ismertetésre kerülő diszacharidok injekcióban beadva kb. 0,1-0,5 pg per kilogramm egér dózisban is gátló hatásnak. így a becsült humán dózis kb. 0,01 pg - 0,05 pg/kg, vagyis egy 70 kg-os ember dóisa 0,7-3,5 pg a tisztított diszacharidok esetén. Egy 70 kg-os ember adagja általában 0,1 pg -100 pg között, előnyösen 1 és 10 pg között változhat. Ez a dózis a későbbiekben ismertetésre kerülő ismert diszacharid „markelek esetében valamivel magasabb lehet.

A fenti dózisok napi többszöri részadagban vagy napi egyszeri, heti egyszeri dózisban, esetleg ennél hosszabb szünetekkel is adhatók a beteg reagálásától függően. LMWH-típusú anyagok esetében azonban előnyösen heti egyszeri adagban adagolunk, mint ezt már korábban is említettük.

A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy igényünket a példákra korlátoznánk.

5. Kísérletek LMWH (Fragmin) alkalmazásával önmagában

5.1. Aktív TNF -a elválasztás gátlása egérlép sejtekben

Egyrészt LMWH jelenlétében vagy LMWH nélkül tenyésztett lépsejtek fel ülúszóit, másrészt in vivő LMWH-val kezelt, illetve kezeletlen egerek lépsejtjeit vizsgáltuk aktív TNF -a elválasztási képességük alapján. A vizsgálat lényege az, hogy cikloheximiddel (CHI) szenzitizált sejtekre a TNF-α citotoxikus hatású, és az elölt sejtek neutrál vörös festék felvétele alapján kvantitálhatók [Wallach, D.: J. Immunoi. 132: 2464-2469 (1984)]. A módszer lényege röviden a következő: A CHI-vel szenzitizált HeLa sejtek azon mennyiségét mérjük, melyet a felülúszóban jelenlévő

60.704/SM • · · · · · · • · · · • · · · · · · · • ··· ··· · · • · · · ·

-46 ..................

TNF-α elölt. A TNF-α koncentrációját a felülúszóban ismert TNF-α tartalmú mintákkal felvett titrálási görbék segítségével határozzuk meg. A sejtek életképességét neutrál vörössel történő inkubációt (2 óra) követően úgy mérjük, hogy a festék fölöslegét a tenyészetből kimossuk, a sejtek által fölvett neutrál vöröst Sorenson-féle citrát puffer-etanol eleggyel extraháljuk és mennyiségét kolorimetrikusan 570 nm hullámhossznál automatikus leolvasású mikroelisa készülékkel mérjük.

Az LMWH-val kezelt egerek sejtjeit a következőképpen nyerjük: BALB/c nőstény egerek (25 grammosak, 2 hónaposak) legalább ötös csoportjai szubkután 0,5 és 20 pg/egér közötti különböző dózisban LMWH-t kaptak. 5 nap elteltével az egereket a nyak elcsavarásával megöltük, lépüket eltávolítottuk és a lépsejt szuszpenzióban (melyből a vörös vérsejteket eltávolítottuk) a reziduális extracelluláris mátrix (RECM), a Concanavalin A (Con A) vagy lipopoliszacharid (LPS) által indudált TNF-a termelést meghatároztuk.

5.2. Kísérletesen előidézett DTH-reakció gátlásának meghatározása in vivő

Inbred BALB/c (Jackson Laboratoires, Bar Harbor, ME) vagy outbred CD1 egerek (Weizmann Institute Animál Breeding Center, Rehovot, Izrael) hasi bőrfelületét leborotváljuk, és a borotvált bőrfelületet aceton és olívaolaj 4:1 térfogatarányú elegyében oldott 2% oxazolon (OX) 100 μΙ-ével topikálisan szenzitizáljuk. A DTH-túlérzékenységet 5 nappal később 0,5%-os OX 20 μΙ-ével (aceton-olivaolaj eleggyel készült oldatát) a következőképpen váltjuk ki: Az oldat 10 μΙ-ével az egerek fülét mindkét oldalon bekenjük és az egerek fülén egy konstans területet közvetlenül a kezelés előtt, majd 24 és 48 órával a kezelés után mérnöki mikrométerrel (Mitutoyo) megmérünk. A földuzzadás mérésekor az egyes egércsoportok azonosítási lehetősége kizárt (vak-próba). A fülduzzadás átlagának mértékét (Δ) a mikrométer fajtájától

60.704/SM

-47 függően 10'² mm vagy 10'⁴ hüvelyk (+SE) egységekben olvassuk le. A gátlás %-os mértékét a következőképpen számoljuk ki:

Kezelt - negatív kontroll %-os gátlás = 1 pozitív kontroll - negatív kontroll

Az egerek LMWH-val történő kezelése az 5.1 példa szerinti, injekciós úton történt az oxazolonos primer szenzitizálást megelőző napon. Az oxazolonos szenzitizálást követő 5. napon váltjuk ki az egerekből a DTH-reakciót a fent leírt módon.

Pozitív kontrollnak tekintjük az LMWH-val nem kezelt, immunizált egereknél jelentkező DTH reakciót. Negatív kontrollnak tekintjük az antigén hatására, nemimmunizált egereken jelentkező „háttér”-duzzadást.

5.3. T-sejtek és makrofágok által előidézett TNF-α elválasztás in vitro

Mikrotiterü lemezeket a következőképpen készítettünk elő: Laposfenekű, 96mélyedéses lemezekre (Costar) mélyedésenként 1 pg/50 μΙ koncentrációjú fibro nektint (FN) vagy Laminint (LN) (Sigma) vittünk fel PBS-oldatban, majd 16 óra elteltével ezeket eltávolítottuk. A megmaradt kötőhelyeket 10 mg/ml BSA/PBS felvitelével blokkoltuk, majd 2 óra elteltével a mélyedésekből ezeket is kimostuk.

ECM-mel beovont lemez-mélyedéseket úgy készítettünk, hogy laposfenekű,

96-mélyedéses lemezeken borjú szaruhártya endotelialis sejteket tenéysztettünk, az endotelialis sejtek egymásbafolyó rétegeit kioldottuk, és a sejttörmeléktől mentes ECM-et érintetlenül hagytuk [Gospodarawicz, D. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 253:3736 (1978)]. Tördelt vagy reziduális ECM előállítása céljából az ECM-et 27G injekcióstűvel háromszor könnyedén megkarcoltuk, majd a karcokat BSA/PBS oldattal bevontuk. K1 jelzésű, myelin alap fehérjét (MBP) felismerő, nyugvó klónozott patkány CD4⁺ T-sejteket táptalaljon szaporítottunk, majd fenntartottunk, és a tenyészet60.704/SM ·· ··· ···· ·· ·· • · · · ···· • ··· ··· · · * · · · ·

-48 bői minden lemezmélyedésre 10⁵ sejtet vittünk fel 3 χ 10⁵ szingénikus lép-makrofággal együtt vagy anélkül; a lép-makrofág sejteket tartalmazó oldatból (mely e sejteken kívül 1% BSA és antibiotikus adalék mellett Gibco RPMI 1640-et tartalmazott) minden mélyedésbe 100 μΙ-t tettünk.

A lép-makrofágokat úgy nyertük ki, hogy specifikus monoklonális antitestek segítségével (mAb) a T- és B-sejteket eltávolítottuk. A Genzymtől (Cambridge, MA) beszerzett anti-murine TNF-α mAb preparátumokat 300-szorosra hígítottuk és a hígított oldatból minden lemezmélyedésbe 10 μΙ-t tettünk. Ezen kívül, az V. táblázatban feltüntetett módon, a következő adalékok valamelyikét is használtuk: MBP (100 pg/mg), Con A (2,5 μΙ/ml), LPS (1 pg/ml), FN (5 pg/ml) vagy LN (5 pg/ml).

A lemezeket párásított inkubátorban 37°C hőmérsékleten 3 órán át inkubáltuk. Ezután a mélyedések tartalmát (kísérleti csoportonként 4 mélyedés) összegyűjtöttük, centrifugáltuk és a kapott médiumot aktív TNF-α elválasztás szempontjából, az 5.1 pontban leírtaknak megfelelően a következőképpen vizsgáltuk: a makrofág és limfocita tenyészetek felülúszóit szenzitizált (TNF-α. -val könnyen előlhetővé tett), HeLa sejttenyészethez adtuk és a teszt-médium jelenlétében a sejtpusztulás mértékét különböző, ismert TNF-α tartalmú anyagok titrálási görbéivel öszehasonlítva meghatároztuk. A sejtpusztulást preinkubált HeLa sejtek neutrál vörös színkibocsátása alapján vizsgáljuk. Az itt bemutatott eredmények 6 teljesen hasonló eredményre vezető kísérlet adataiból származnak.

Az V. táblázatból látható, hogy együtt tenyésztett T-sejtek és makrofágok TNF -a elválasztását előidézhetjük, ha ezeket specifikus antigénnel (MBP: 4. csoport) vagy mitogénnel (Con A; 6. csoport vagy LPS; 8. csoport) érintkezésbe hozzuk. Antigénnel vagy mitogénnel kiváltott stimulus nélkül is képes TNF-α elválasztást előidézni a reziduális extracelluláris mátrix (RECM; 10. csoport), az ECM komponensei:

60.704/SM

a Fibronektin (FN; 12. csoport) vagy laminin (LN; 14. csoport). Az intakt ECM TNF-a indukáló hatása gyenge (16. csoport).

V. táblázat: T-sejtek és makrofágok TNF-α elválasztása MBP specifikus antigén valamint Con A. LPS, RECM vagy ECM-komponensek hatására

Csoport száma	TNF-α indu- káló anyag	Makrofágokkal együtt (igen) vagy ezek nélkül (nem) tenyésztett K1 sejtek	TNF-α elválasztás mértéke (pg/ml)
1	nincs	nem	50
2		igen	65
3	MBP antigén	nem	30
4		igen	950
5	Con A	nem	120
6		igen	1300
7	LPS	nem	50
8		igen	1500
9	RECM	nem	30
10		igen	900
11	FN	nem	20
12		igen	650
13	LN	nem	50
14		igen	500
15	ECM	nem	30
16		igen	120

60.704/SM ·· ········ · · ♦ * • · · · « · · ······· · · * · * · ·

5.4. TNF -α elválasztás szabályzása LMWH-típusú anyagokkal

A T-sejttenyészeteket és a kiegészítő sejtkulturákat az 5.3 pontban leírt módon állítottuk elő. Az LMWH-t a sejttenyésztés kezdetekor vittük fel a lemezmélyedésekre. A TNF-α szintet 3 órás inkubációt követően vizsgáltuk.

A VI. táblázatból látható, hogy a specifikus antigénnel (MBP; 4. csoport), a mitogénnekkel (Con A és LPS; 6. és 8. csoport), a RECM-vel vagy az ECM komponensekkel (10., 12. és 14. csoport) előidézett aktív TNF-α elválasztást az LMWH (Fragmin®, mintaszám: 38609) gátolta. Minthogy a RECM által indukált TNF-oc elválasztás valószínűleg szerepet játszik az atherosclerosis kialakulásában, az LMWHval elérhető TNF-α gátlás hasznos lehet az atherosclerosis esetében.

60.704/SM

VI. táblázat: in vitro TNF-α elválasztás gátlása LMWH-val (Fragmin®, mintaszám: 38609)

Csoport száma	TNF-α indu- káló anyag	LMWH (1 pg/ml)	T-sejt- és makrofág-tenyészet által elválasztott TNF-α (pg/ml)
1	nincs	nincs	65
2		van	30
3	MBP antigén	nincs	950
4		van	60
5	Con A	nincs	1300
6		van	80
7	LPS	nincs	1500
8		van	80
9	RECM	nincs	900
10		van	90
11	FN	nincs	650
12		van	90
13	LN	nincs	500
14		nincs	70

5.5. Ex vivő kísérletek LMWH-val kezelt BALB/c egereken

Ebben a kísérletben azt vizsgáltuk, hogy egereknek in vivő beadott LMWH hogyan hat a lépsejtek TNF-α elválasztására in vitro. BALB/c egerek 5-ös csoportjait szubkután injekcióban beadott LMWH (Fragmin®, mintaszám: 38609) különböző dózisaival kezeltük. Az LMWH sóoldattal hígítva került beadásra. Egy hét elteltével az egereket megöltük, lépsejtjeikből a vörös vérsejteket eltávolítottuk és a lépsejteket TNF -a elválasztó képességre vizsgáltuk: a kontroll RECM-nélküli lemezbemélyedésbe (A) került, s ezzel hasonlítottuk össze a RECM-mel bevont lemezbemélye60.704/SM • ········ ·· ·φ ··* <* ···· *·····« · · • · · · ·

- 52 désbe helyezett sejtek (B) eredményét. A TNF-α szekréció mértékét az 5.1. pontban leírt módon mértük. Az eredményeket a VII. táblázat mutatja: Eszerint az egy héttel korábban egyszeri 5 pg-os dózisban injekcióban beadott LMWH gátolja a RECM által kiváltott TNF-α szekréciót. Az ennél nagyobb vagy kisebb dózisban beadott LMWH kevésbé hatásos. Tehát az 1 héttel korábban beadott (in vivő) LMWH optimális dózisa a hatásos.

VII. táblázat: A reziduális ECM hatására létrejött T-sejt médiáit TNF-a elválasztás ex vivő gátlása

BALB/c egerek	Lépsejtek in vitro TNF-α elválaszása
LMWH kezelése	(pg/ml); tenyésztve
(hetenként)	A. RECM nélkül B. RECM-vel (% gátlás)

1	nincs	30	400
2	0,5 pg	50	380	(5)
3	1 μ9	25	90	(78)
4	5 pg	25	60	(85)
5	10 pg	30	140	(65)
6	20 pg	40	320	(20)

A Vili, táblázat azt mutatja, hogy az in vivő 5 pg dózisban beadott LMWH Fragmin® (38609 mintaszám) az LPS által indukált TNF-α elválasztást is gátolja. BALB/c egereket (4 egérből álló kísérleti csoportok) LMWH táblázatban jelzett mennyiségével kezeltük: a sóoldattal hígított LMWH-t szubkután injekcióban adtuk. Egy hét elteltével az egereknek intraperitoneálisan 10 mg LPS-t adtunk injekcióban, 4 órával később az egereket megöltük, vörös vérsejtektől mentesített lépsejtjeiket

60.704/SM • · *··« · · ··

-53RECM-mel bevont lemez bemélyedésekben 3 órán át párásított inkubátorban tenyésztettük. A RECM hatására termelt TNF-α szinteket a tenyészetek felülőszóiban határoztuk meg. Az eredményeket a Vili, táblázat foglalja össze.

Vili, táblázat: Egerek LMWH kezelése gátolja a makrofágok LPS-mediált aktív TNF-α elválasztását

Egerek LMWH kezelése	Makrofágok LPS-vel kiváltott in vitro TNF-α elválasztása (pg/mi)	%-os gátlás
0	690	-
0.1	500	28
1	350	50
5	120	82
20	550	20

5.6 Kísérletek különböző forrásból származó LMWH-típusú anyagokkal

A IX. és X. táblázatban feltüntetett LMWH-féleségek különböző koncentrációit adtuk be szubkután egereknek és azt vizsgáltuk, hogyan gátolják az aktív TNF-a elválasztását és a DTH-reakciót. Egy hét elteltével az egerek egy részét megöltük és a ConA aktiváció hatására meginduló aktív TNF-oc elválasztást in vitro mértük (IX. táblázat). Az egerek másik részénél az oxazolon antigén hatására bekövetkező válaszreakciót vizsgáltuk (X. táblázat). A táblázatokban a gátlási értékeket az LMWHval kezelt egerekben mért adatok %-ában fejeztük ki.

60.704/SM

-54 A IX. és X. táblázat eredményeiből két következtetést vonhatunk le:

1. A különböző (de Faktor x vizsgálat alapján hasonló antitrombotikus hatással rendelkező) LMWH minták optimális dózisa az aktív TNF-α elválasztás gátlására különböző, sőt volt olyan LMWH preparátum - nevezetesen a 4096 mintaszámú Clexone® - amely a kísérletekben kipróbált egyik dózisban sem gátolta az aktív TNF-α elválasztását. Megállapíthatjuk tehát, hogy az LMWH prepartátumok antitrombotikus hatása és az aktív TNF-α elválasztásra gyakorolt gátló hatása között nincs összefüggés. A két biológiai vizsgálati eljárást a készítmény más-más faktorai befolyásolják.

2. Az LMWH egy adott dózisa az aktív TNF-α elválasztás gátlásában és a DTH-reakció gátlásban egymással pozitív korrelációban lévő eredményre vezet, azaz az LMWH azon dózisa, mely az aktív TNF-α elválasztást optimálisan gátolja, az a DTH-reakció gátlásában is optimálisan hatásos.

60.704/SM • · t-9«· *· • · ·· ♦ ··>··« *· ♦ ··«· ··»«>· • »'>· ··* ·

IX. Táblázat: Különböző LMWH-típusú anyagok hetenkénti alkalmazásával a DTH érzékenység gátlása egereken

DTH gátlása

Az LMWH faj- Dózis DTH-mértéke „R” értéke tája/mintaszáma (pg/gm/egér) (10'²mm) (%) % x (pg/gm)’¹

Fragmin

mintaszám 38609	0 0.02 0.04 0.2	25 2 21 23 6	(+) kontroll (-) kontroll 12 10 73 (max.)	365
	0.4	6	20
	2	0	0
mintaszám 45389	0	28	(+)
		0	(-) kontroll
	0.004	26	6
	0.04	4	89 (max.)	2225
	0.2	24	13
	0.4	26	6
	2	29	0
Clexane
mintaszám 2088	0	22	(+) kontroll
		2	(-) kontroll
	0.004	17	23
	0.04	3	87 (max.)	2175
	0.2	13	41
	0.4	23	0
mintaszám 2066	0	23	(+) kontroll
		2	(-) kontroll
	0.004	20	13
	0.04	8	65
	0.2	7	70 (max.)	350
	0.4	7	70
mintaszám 4096	0	24	(+) kontroll
		2	(-) kontroll
	0.04	27	nincs hatás	0
	0.2	26	nincs hatás	0
	0.4	24	nincs hatás	0

60.704/SM

X. Táblázat: Különböző LMWH-típusú anyagok hetenkénti alkalmazásával egérlépsejtes kísérletben ex vivő gátolt aktív TNF-α elválasztás

Az LMWH fajtája/mintaszáma	Dózis (pg/gm/egér)	Con A-val indukált TNF-α elválasztás (pg/ml)	Gátlás %	„R” értéke % x (pg/gm)’1
Fragmin mintaszám 38609	0	450	(+) kontroll
	0.02	425	5	-
	0.04	400	12	-
	0.2	68	85 (max.)	425
	0.4	350	22	-
	2	435	8	-
mintaszám 45389	0	220	kontroll	-
	0.004	280	13	-
	0.04	70	78 (max.)	1950
	0.2	260	18	-
	0.4	290	10	-
	2	310	4	-
Clexane mintaszám 2088	0	400	kontroll
	0.004	360	10	-
	0.04	64	84 (max.)	2100
	0.2	152	38
	0.4	380	4
mintaszám 2066	0	350	kontroll
	0.004	338	6
	0.04	185	54
	0.2	192	57 (max.)	285
	0.4	186	55	-
mintaszám 4096	0	325	kontroll	-
	0.04	335	nincs hatás	0
	0.2	325	nincs hatás	0
	0.4	330	nincs hatás	0

60.704/SM • · · · · · ·

-57 - ...........

5.7. Adjuváns arthritises (AA) patkányok kezelése LMWH-típusú anyagok kis dózisaival

Az adjuváns arthritis kíséreleti célokra előidézhető model-betegség, amely néhán patkánytörzsön akkor fejlődik ki, ha a Mycobacterium tuberculosis antigénjével szemben immunizálják ezeket [Pearson, C.M.: Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 91:91 (1956)]. Ezen a kísérleti célra létrehozott betegségen a humán rheumatoid arthritis modelezhető [Pearson, C.M.: Arthritis Rheum· 7:80 (1964)]. Az arthritist valószínűleg olyan T-limfociták okozzák, amelyek felsimerik az M. tuberculosis egy antigénjét, mely a kötőszövetek valamely szerkezeti elemével kölcsönhatásba lép [Cohen, I.R. és munkatársai: Anthritis Rheum. 28:841 (1985)].

Lewis patkányokat M. tuberculosis-szal (1 mg, olajban) immunizálva idéztük elő az adjuváns artritist [Pearson, C.M.: Proc. Soc. Exp, Bioi. Med., 91:91 (1956). 5 nap elteltével a patkányoknak szubkután LMWH és/vagy heparin változó dózisait adtuk be, és az arthritis mértékét a Holoshitz, J. és munkatársai által ismertetett [Science, 219:56 (1983)] tapasztalati skála segítségével 0 és 16 közötti pontszámmal értékeltük. Az összes kísérletben a 38609. mintaszámú Fragmin®-t használtuk.

A dózis-hatás összefüggést Fragmin® esetében AA indukálására immunizált patkányokon vizsgáltuk (1. ábra). A fragmin szubkután adagolását hetenként végeztük az immunizálást követő 5. naptól kezdődőleg; a beadott dózisok a következők voltak: 0,5 μg (o), 1 pg (♦), 2 pg (.), 10 pg (o), 15 pg (λ), 20 pg (), 30 pg (a), 40 pg (x), valamint PBS kontroll (□). Az arthritis gátlására a 20 pg-os dózis volt a leghatásosabb.

A 20 pg-os Fragmin® dózis adagolási rendjének hatása az AA folyamatra a

2. ábrán látható: PBS kontroll (q); egyszeri kezelés az 5. napon (4); naponta (·);

60.704/SM «· ········ · · · · ··· · ···· • ··· ··« <· · • · · · -58 - ..................

minden 5. napon (o); hetenként («). Látható, hogy mind az 5., mind a 7. naponkénti Fragmin kezelés gátolja az arthritist.

A 3. ábrán a Fragmin® (38609 mintaszám) és a standard heparin AA-ra kifejtett hatása látható összehasonlításban (heti egyszeri adagolás). Lewis patkányokon immunizálással AA-t idéztünk elő. Az immunizálást követő 5. nappal kezdődően 20 pg-os szubkután dózisban kezeltük a patkányokat 1 hetes szünetekkel Fragmin®-al (·), heparinal (o) vagy a kontroll foszfáttal tompított sóoldattal («). Az eredményt illetően drámai különbség van a Fragmin® és a heparin hatásában: míg a Fragmin® teljes mértékben gátolja az arthritist, addig a heparinnak nem volt gátló hatása.

Ugyanakkor a naponta beadott 20 pg LMWH nem gátolta az adjuváns arthritist, a heparin viszont - némi meglepetésre - erősebb gátló hatást mutatott mint a Fragmin®, naponkénti adagolásban. Az eredményeket a 4. ábra mutatja: 38609 mintaszámú Fragmin® (·), heparin (o), PBS kontroll (<*).

Lewis patkányokon indukált AA gátlására más LMWH-típusú anyagok is alkalmasak. Az 5. ábrán injekcióban beadott 20 pg Fraxiparin® (naponta °, hetente ), Fraxiparine® (naponta a, hetente a), Lovenox®/Clexane® (naponta», hetente o) és a PBS kontroll (x) hatása van feltüntetve. Mind a három különböző típusú és másmás forrásból származó LMWH heti adagolás esetén markánsan gátolja az arthritist, naponkénti adagolásban viszont nem.

5.8 LMWH alkalmazása idegen szövet kilökődésének megelőzésére

Wistar patkányokon allogén BN szívtranszplantációt hajtottunk végre [Ono, K. és Linsay, E.S.; J. Thorac. Cardiovasc. Surq. 45:225-229 (1969)]. A transzplantációt megelőző naptól kezdődően a patkányok 7 naponként 20 pg Fragmin®-t, illetve a kontrollok PBS-t kaptak szubkután injekcióban (6. ábrán ·, illetve o) és a túlélésüket pontoztuk. Kilökődés! napnak azt a napot tekintettük, amikor az átültetett szív meg60.704/SM • · *······· ·· ·· * ··· ··· · ·

-59 szűnt dobogni; ezt egyszerű tapintással állapítottuk meg. A 6. ábra azt mutatja, hogy azoknak a szívátültetésen átesett patkányoknak a túlélési ideje lényegesen meghoszszabbodott, amelyek heti egyszeri adagban kaptak LMWH-t.

5.9. LMWH biológiai hatása inzulin-függő diabetes mellitusos (IDDM)

NŐD egerekre

A NŐD törzshöz tartozó egereken spontán kifejlődik az I. típusú inzulin-függő diabetes mellitus (IDDM) egy formája, melyet a humán IDDM elismert modeljének tekintenek [Castano, L. és Eisenbarth, G.S.: Annu. Rév. Immunoi. 8:647-679 (1990)]. A betegség 4-5 hetes korban a hasnyálmirigy szigetein megjelenő gyulladással (inzulitis) kezdődik. Az insulitis progresszíven károsítja az inzulin-termelő béta sejteket, melyek a TNF-α károsító hatására érzékenyek. Az egerek 4-5 hónapos korára elegendő számú béta sejt roncsolódik szét ahhoz, hogy a diabetes összes tünetei jelentkezzenek.

Azt, hogy az LMWH hatással van-e az IDDM folyamatára, 10 nőstény NŐD törzsű egérből álló csoporton teszteltük. Minden egyes egér 5 pg Fragmin®-t (mintaszám 38609) kapott hetenként szubkután injekcióban (ez 12 egér egység/kg dózisnak felel meg). A kontrollcsoportban lévő 10 egér sóoldatot kapott injekcióban. 5 hónapos korban az egereket elvéreztettük, és az IDDM előrehaladottságát standard módszerrel [Éliás, D. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1576-1580 (1990)] meghatároztuk. A 7. ábrán látható, hogy a kontroll egerek vércukorszintje kóros (400 mg/dl). Ugyanakkor az LMWH-val kezelt egerek vércukorszintje normális (100 mg/dl), azaz az LMWH meggyógyítja az IDDM folyamatot.

5.10. Allergia kezelése LMWH-val

Ha allergiás beteg bőrébe specifikus antigént vagy anti-lgE-t juttattunk, általában azonnali kiütés vagy belobbanás a reakció, melyet 4-8 óra elteltével szívós duzzadással és leukocita infiltrációval járó időszak követ, melynek a késői típusú bőrre60.704/SM

- 60 - -.- ...

akciók (LPR)² periódusa vet véget. Ilyen késői típusú reakciókat először a bőrön tapasztaltak és írtak le [Solley, G.O. és munkatársai, J. Clin. Invest. 58:408-420 (1976)]. Nyilvánvaló azonban, hogy az IgE-függő reakciók késői következményei, mint pl. a vérből származó leukociták infiltrációja a reakció helyére, a légzőszervekben és anatómiailag másutt elhelyezkedő területeken is előfordulhatnak [Lemanski, R.F. és Kaliner, M.: in Allergy: Principles and Practice, Vol. 1, pp. 224-226 (1988), Middeton, Jr., E. és munkatársai (kiadók)]. Szívós viták tárgya, hogy a mind a bőrben, mid a légzőszervekben jelentkező IgE-dependens reakciók számos, klinikailag szignifikáns következménye inkább az ezeken a helyeken felszaporodó leukociták működésének köszönhető-e vagy a röviddel az antigénes provokáció után felszabaduló mediátorok közvetlen hatásának [Kay, A.B. J. Allergy Clin. Immunoi. 87:893-910 (1991)].

Az utóbbi időben kezdik széles körben elismerni, hogy a krónikus allergiás megbetegedések, mint pld. az asztma és az atópiás dermatitisz, alapvetően valamilyen gyulladásos folyamat következményei, melyben főleg az eozinofil és T-sejtek aktiválódása és infiltrációja játszik szerepet [Kay, A.B.: J. Allergy Clin. Immunoi. 87:893-910(1991)].

Többféle bizonyíték is azt a hipotézist támasztja alá, hogy a kései fázisban jelentkező reakciókat kísérő leukocita infiltráció masztocita sejtek szétesésének (degranuláció) a következménye. Azok a szerek, amelyek emberben és kísérleti állatban egyaránt - akár IgE-dependens, akár más mechanizmus útján - a bőr masztocita sejtjeinek szétesését okozzák, elősegíthetik a reakció helyén a leukocita infiltrációt is [Solley, G.O. és munkatársai: J, Clin. Invest. 58:408-420 (1976); Lemanski, R.F. és Kaliner, M., in Allergy: Principles and Practice, Vol. 1, pp. 224-246, Middeton, Jr. E. és munkatársai (kiadók); Kay, A.B.: J. Allergy Clin. Immunoi. 87:893-910 (1991)]. Áttekintve azokat a mediátorokat, amelyeket az aktivált

60.704/SM masztocita sejtek tudnak létrehozni, megállapíthatjuk, hogy ezek között számos olyan van, amelyeknek szerepe lehet a kései fázisban jelentkező leukocita infiltrációban; ilyenek a lipid mediátorok, mint pl. az LTB₄, LTC₄, LTD₄, PGD₂ és a PAF (trombocita aktiváló faktor), valamint számos peptid vagy protein kemotaktikus faktor [Holgate, S. T. és munkatársai, in Allerqy: Principles and Practice, Vol. 1, pp. 135-178, Middleton, Jr. és társai (kiadó), 1988)]. Az utóbbi ágensek méretileg a tetrapeptidtől (az anafilaxia eozinofil kemotaktikus faktorai) az igen nagy molekulatömegű anyagokig (neutrofil kemotaktikus faktorok) terjedhetnek.

Az utóbbi időben több, a leukocita infiltrációt masztocita sejtek útján befolyásoló potenciális mediátort is azonosítottak, így az INF-cc és IL-1a anyagokhoz hasonló vagy ezekkel azonos citokinineket, valamint a MIP-1 géncsalád négy tagját [Gordon, J.R. és munkatársai: Immunoi. Today, 11:458-464 (1990)]. Ezek közül a citokininek közül négy (TNF-oc, IL-1oc, MIP-1cc és MIP-1 β) képes a leukocita infiltráció elősegítésére.

Legújabban Wershil, B.K. és munkatársai [J. Clin. Invest, 87:446-453(1991)] masztocita-hiányos egereken kimutatták, hogy IgE-dependens kései fázisú reakciók során a leukociták szaporodása masztocita-függő, és ezt a gátlást anti TNF-oc antiszérum helyi beadásával részlegesen blokkolni lehet. Ma már általánosan elfogadott dolog, hogy az IgE-dependens kései fázisú reakciót kísérő celluláris infiltráció/aktivitás gátlása döntő lehet különböző allergiás betegségek gyógyításában [Barnes, P. J. N. Enq. J, Med., 321:1517-1527 (1989)].

Meglepő módon azt találtuk, hogy passzív bőr anafilaxián (PCA) átesett egereken az LMWH szignifikánsan gátolja az IgE-dependens kései fázisban jelentkező bőrreakció során a leukocita infiltrációt.

60.704/SM ···· ····

-62 Egerek fülébe i.d. injekcióban monoklonális IgE anti DNP Ab-t adtunk (« 20 ng). Egy nappal később az egerek DNP₃₀.₄₀-HSA-t kaptak sóoldatban i.v. injekcióban. A fülduzzadás mértékét mikrométerrel mértük a DNP-HSA beadás előtt, valamint azt követően különböző időpontokban. Végül az állatokat a nyak elcsavarásával megöltük, a PCA reakció helyéről szövetet vettünk és Giemsa-festésű metszeteket készítettünk. Az LMWH-t az egereknek a -2. napon adtuk be egyszeri s.c. injekcióban (5 pg/egér).

Eredmények:

Míg a PCA reakció helye gyorsan megduzzadt (a 15. percben 35 x 10'⁴ hüvelyknyi a különbség a kezelés előttihez képest), addig a kontrolioknál (csak hígítószert kaptak a fülükbe) nincs duzzadás. A PCA reakció helyén a duzzanat az antigén

i.v. beadást követő 2-4 órában jelentősen csökkent.

A kezelt és kontroll felületek szövettani kiértékelése 6-8 órával az antigén i.v. beadása után történt. A PCA felületeken a masztocita sejtek többségén nagyfokú vagy mérsékelt degranuláció volt észlelhető. Ezzel ellentétben a kontrolokban a masztocita sejtek <5%-án látszott jelentős degranuláció. A PCA felületeken csak az antigén beadás után 6 órával látszott szignifikáns neutrofil infiltráció. Azoknál az egereknél, amelyek az antigén beadás előtt két nappal LMWH kezelést kaptak, az infiltráció jelentősen (60%-ra) csökkent. A gyógyszer nem befolyásolta a masztocita sejtek degranulációjának nagyságrendjét, és nem volt hatása az állatok perifériás vérében található leukociták ossz- és frakciónként! számára sem. Megállapíthatjuk tehát, hogy az LMWH gátolja az IgE-dependens kései bőrreakciót kísérő celluláris infiltrációt. Megjegyezzük továbbá, hogy az LMWH az állatokon jelentkező aktív bőr anafilaxia kései szakaszának bőrreakcióit is jótékonyan befolyásolhatja (a specifikus IgE termelést DNP-HSA Alum segítségével idézhetjük elő). Várhatólag a tüdő aller60.704/SM • *·· ··· · · • · · · ♦

-63 giás gyulladásaiban is hasonló a terápiás hatás [Tarayre, J. P. és munkatársai: Int. J. Immunopharmacol. 14(5):847-855 (1992)].

5.11. Humán DTH kezelése LMWH-val

A 8. ábra egy 40 éves férfi önkéntes (85 kg) teszt-eredményét mutatja. A tesztben tetanusz antigén hatására (Merieux bőr-próba) bekövetkező DTH-reakciót vizsgáltunk. 24 és 48 óra elteltével kb. 18 mm-es szöveti keményedést mértünk. Ezután az önkéntest 3 mg Fragmin®-nal (38609 mintaszám) kezeltünk (szubkután injekció). 5 nappal ezután újra teszteltük a tetanusz hatására létrejövő DTH reakciót és a gátlás következtében a szöveti keményedés most csak 5 mm kiterjedésű volt. Az önkéntest 3 hét elteltével („gyógyuláskor”) újra teszteltük DTH-ra és a teszt eredménye pozitív volt (23 mm-es keményedéit felület 24 és 48 óra után). Ezután az önkéntest Fragmin®-nal kezeltük (ugyanúgy mint korábban) és a DHT-reakciót 7 nap elteltével értékeltük. Ismét kb. 5 mm-es volt a keményedés a DTH-gátlás jeléül. A tünetek ezúttal is 3 hét elteltével szűntek meg. Megállapítható tehát, hogy az LMWH 5 mg alatti dózisban gátolja a DTH-t emberen 5-7 naponkénti kezelés hatására.

6. Kísérletek LMWH (Fragmin) és más aktív anyagok együttes alkalmazásával

6.1. LMWH (Fragmin) stabilitás vizsgálata; TNF-α gátló hatása

Afragminból (38609 mintaszám) normál sóoldattal 5 pg/0,1 ml koncentrációjú hígítást készítettünk. A fiolák egy részéhez azonos mennyiségű (5 pg) protaminszulfátot kevertünk. A minták egy részét 0-72 órán át 21°C-on (XI. táblázat), más részét 1-4 hónapig 4°C hőmérsékleten tároltuk (XII. táblázat). A Fragmint (protaminszulfáttal vagy anélkül) ezután BALB/c egereken a már leírt módon DTH T-sejt reakció in vivő gátlása tekintetében vizsgáltuk. Ezekben a kísérletekben a pozitív kontroll

60.704/SM

-64·· ···· ···· *··· ··· · 4 · ·4 • ··4 ··· ··

DTH értéke 17,5±1,2x10'² mm (0% gátlás), a teljesen gátolt DTH 2,6±0,5x10'² mm (100% gátlás) volt.

Az eredményeket 20°C hőmérsékleten inkubált LMWH minták esetében a XI. táblázat mutatja. Ebből látható, hogy a 72 órán át szobahőmérsékleten inkubált LMWH elveszti gátló aktivitását a TNF-a-dependens, T-sejtek által médiáit DTH-reakcióval szemben. Ezzel ellentétben a Heparin és a LMWH szobahőmésékleten csak lassan veszti el antikoaguláns hatását.

XI. táblázat: A Fragmin (mintaszám 38609, 5 pg/0,1 ml, protamin-szulfát nélkül)

DTH-reakcióval szembeni gátló hatásának stabilitása 20°C-on

Órák száma	DTH-reakció	DTH-reakció %-os gátlása
-	17,5±1,2	kontroll*
0	2,7±0,5	100*
24	9,6±1	47
48	15,7±1,6	13
72	17±0,8	0

6.2. A DTH-reakcióval szembeni gátló hatás csökkenése alacsony hőmérsékleten és a protamin adalék stabilizáló hatása

A XII. táblázat azt mutatja, hogy a Fragmin híg oldatban, 4°C hőmérsékleten hónap alatt elveszti egér T-sejtek DTH-reakciójával szembeni gátló hatását. Ha azonos koncentrációjú protamin-szulfát adalék van jelen, az a DTH-reakció gátlást nem zavarja, az aktivitás viszont 4 hónap alatt sem változik 4°C hőmérsékleten. Ez az eredmény ellentmond a protamin-szulfát szokásos szerepének, a heparinoid anyagok (heparin, Fragmin) antikoagulás hatását ugyanis semlegesíti.

60.704/SM

XII. táblázat: DTH-reakcióval szembeni hatás csökkenése alacsony hőmérsékleten

Protamin adalék stabilizáló hatása

Fragmin (38609)	Hónapok 4°C-on	Protamin Sulfat	DTH-reakció (10‘2 mm)	DTH-reakció %-os gátlása
nincs	-	nincs	15±1	kontroll*
van	1	nincs	2,8±0,5	100**
van	1	van	3±0,4	100
van	2	nincs	4±0,8	82
van	2	van	2,4±1	100
van	3	nincs	9,6+0,8	55
van	3	van	3±0,5	100
van	4	nincs	14,8±1,4	0
van	4	van	3±0,4	100
van	0	van	3±0,5	100

* nincs gátlás ** teljes gátlás

6.3. ECM-bevonatú lemezek készítése

Az ECM-bevonatú lemezeket a következőképpen készítettük: Vágóhídról három órával a vágás után borjúszemeket szereztünk, ezekről a szaruhártyát eltávolítottuk. A szaruhártyát szikével összekarcolva, megkaparva nyertük a szaruhártya endotheliális sejteket. A sejteket szövettenyésztő lemezeken kb. 5 ml táptalajon tenyésztettük. Táptalajként 10% borjúembrió szérumot (FCS), 5% borjú szérumot és antibiotikumokat (pl. 1% sztreptomicint vagy 1% neostatint), valamint stabilizátorként 1% glutamint tartalmazó DMEM táptalajt használtunk. A beoltás után kb. 2 nappal a sejtek leülepedtek a lemez aljára és 4 naponként friss táptalaj hozzáadásával tovább folytattuk a tenyésztést nedvesített, 5% CO₂-tartalmú atmoszférájú inkubátorban.

60.704/SM ·· ···· ···· ·· ·· ··· · ···· • ··· ··· · · • · · · ·

-66 Kívánt esetben a táptalajhoz fibroblaszt növekedési faktort (FGF) is adhatunk, de ennek jelenléte nem döntő. Amikor a sejtek összefolytak (kb. 2 hét után), a felülúszót leszivatjuk és a sejteket 1-2 ml tripszinnel kezeljük.

Az így nyert primer sejtek 80%-át (a fennmaradó 20% feldolgozását ezután ismertetjük) 5 laposfenekű 96-bemélyedéses lemezre elosztjuk. A sejteket 4% dextrán T-40, 10% borjú embriószérum és 5% borjúszérum adalékot tartalmazó DMEM táptalajon tenyésztjük. A tenyészeteket kb. 7 napig 37°C-os, 10% CO₂-t tartalmazó nedvesített atmoszférájú inkubátorban tartjuk, majd a kapott összefolyt endoteliális sejtrétegeket lizáljuk. A lizáló puffért (amely 0,25% Triton X/PBS-t tartalmazó 0,025M ammónium-hidroxid) 10 percig a sejtek fölött tartjuk, majd dekantáljuk. A lemezek tartalmát 4°C-ra hűtött PBS-sel háromszor mossuk. Az eddigi műveletek az ECM-et érintetlenül hagyták, s az szilárdan megtapadt a bemélyedések teljes felületén. Az így kapott ECM mentes a sejtmagvaktól és a sejttörmeléktől egyaránt. A kapott ECM-bevonatú lemezek 4°C hőmérsékleten legalább 3 hónapig tárolhatók.

A primer sejtek megmaradt 20%-át egy lemezen 5 ml táptalajon tenyésztjük a fent leírt módon (táptalaj.’DMEM, 10% borjúembrió szérum, 5% borjúszérum és antibiotikum adalékkal). Ezt a szekunder sejttenyészetet is hagyjuk összefolyni, majd a fent leírt módon tripszinnel kezeljük. A sejtek 80%-át újra 5 lemezen elosztva tenyésztjük 4% dextrán T-40 tartalmú táptalajon, a fennmaradó 20%-ot pedig egy lemezen tenyésztjük, mint az előbbi menetben. Ezt a 80/20 arányú megosztást ebből az egy lemezes tenyészetből még egyszer megtehetjük.

6.4. Szulfatált proteoglikánok degradációja ³⁵(S)O₄-jelzett ECM-et 1 ml PBS-ben oldott 5 μΙ MM5 heparináz (4 egység/ml) és 100 μΙ 8,2 molos foszfát-citrát puffer (pH 6,2) elegyében 48 órán át 37°C hőmérsékleten inkubálunk. Ezután a tenyészetet 10000 g-vel 5 percig (adott eset) centrifu60.704/SM ·· ···· ···· ·· ♦· ··· · ···· ···«····· • « · · ♦

-67 góljuk, majd Sepharose 4B oszlopon gélszűréssel analizáljuk. PBS elúcióval 5 ml/óra áramlási sebeséggel 2 ml-es frakciókat gyűjtünk és a frakciók radioaktivitását BioFluor szcintillációs folyadék alkalmazásával meghatározzuk.

Ez a ³⁵(S)O₄-jelzéssel operáló kísérlet igazolta, hogy azECM valóban degradálódott, hogy a degradációs termékek valóban leszakadtak és a Sepharose 4B oszlopon megfelelően szűrhetők. Ezt követően jelzetlen ECM-en vizsgáltuk a szulfátéit proteglikánok degradáióját és a degradációs termékeket a 206 és 232 nm-nél mért abszorpció alapján detektáltuk.

Az enzim degradációs kísérleteket is a fentiek szerint végeztük, a degradációs termékeket (DECM) azonban tovább tisztítottuk oly módon, hogy a Sepharose oszlopról eluált degradált proteoglikánokat HPLC oszlopra vittük fel. A Sepharose oszlopról leoldott frakciókat a 6.11. és ezt követő pontokban leírt módon tisztítottuk HPLC-vel. A degradációs termékek kimutatását a 206 nm-nél mért abszorpció alapján végeztük.

További enzim degradációs kísérleteket végeztünk PC3 enzim és az IBEX-től beszerzett heparináz alkalmazásával, hasonló eredményekkel.

6.5. Humán CD4⁺ T-sejtek tisztítása

Egészséges humán donoroktól származó, perifériás vér-eredetű egymagvú leukocitákból a következőképpen nyerjük ki a CD4⁺ T-sejteket. Az egymagvú sejteket Ficoll gradiens módszerrel izoláljuk, 10% borjú embrió szérum, valamint antibiotikus adalékot tartalmazó RPMI táptalajjal petricsészébe mossuk és 37°C hőmérsékleten 10% CO₂-tartalmú nedvesített atmoszférában inkubáljuk. 1 óra elteltével a nem tapadó sejteket eltávolítjuk, nylon-, gyapjú töltetű oszlopon (Fenwall, IL) 37°C hőmérsékleten 10% CO₂ tartalmú nedvesített atmoszférában inkubáljuk. A nem tapadó sejteket eluáljuk és mossuk. A CD4⁺ T-sejteket negatív szelekció alapján a következőképpen nyerjük ki: az eluált sejteket a következő monoklonális antitestek

60.704/SM

II* ···

-68 (mAb) keverékével kezeljük: anti-CD8,, CD19 és CD14 mágnesezett szemcsékhez kötötten (Advanced Magnetics, Cambridge, MA). A nem-kötődött sejtek fenotípusát vizsgáltuk, és FACScan elemzés alapján dominánsan (> 90%) CD3⁺CD4⁺ sejteket kaptunk.

6.6. TNF -a aktivitás meghatározása PBL-eredetű humán CD4⁺ sejtek alkalmazásával

150.000 humán CD4⁺ T-sejtet, 150 μΙ ECM degradációs termék különböző koncentrációival 37°C hőmérsékleten másfél órán át 7% CO₂ tartalmú atmoszférában előinkubálunk. Ezután 100 μΙ PHA (Wellcome Co, Anglia, 1 pg/ml) hozzáadásával 96-bemélyedéses laposfenekű lemezen (Costar) 3 órán át inkubáljuk. Ezután a bemélyedések tartalmát (kísérleti csoportonként 3-6 szonda) összegyűjtjük, centrifugáljuk, és az 5.1. pontban leírt módon TNF-α elválasztásra megvizsgáljuk. Röviden: a limfocita tenyészetek felülúszóit egér fibroszarkóma sejt-klón tenyészethez (BALB/c. CL7) adjuk. A BALB/c. CL7 sejtek aktinomicin D jelenlétében (0,75 pg/ml) szenzitivvé válnak TNF-a-ra és elpusztulnak tőle [Nophar, Y. és munkatársai: J, Immunoi. 140(10):3456-3460 (1988)]. A sejtpusztulás mértékét az adott táptalaj jelenlétében, ismert TNF-α tartalmú médiumok titrálási görbéivel összehasonlításban állapítottuk meg úgy, hogy 2 órán át MTT tetrazoliummal (Sigma; katalógusszám: M2128) inkubáltuk, a sejtek által felvett festéket izopropanol-sósav eleggyel extraháltuk és mennyiségét kolorimetrikusan (570 nm-nél) Mirkoelisa automatikus leolvasású készülékkel meghatároztuk. A TNF-α típusát úgy határoztuk meg, hogy patkányellenes TNF-α mAb-vel (hígítása: 1/400; Genzyme, MA) szembeni semlegesítő hatásra vizsgáltuk.

60.704/SM ·· ··♦· *··· · ·· ··· · ···· • · · · ··· · * • · 9 · ·

6.7. A heparin degradáiója mg heparint (Sigma) 1 ml PBS és 100 μΙ 25M foszfát-citrát puffer (pH 6,2) elegyében 20 μΙ MM5 (5 egység/ml) jelenlétében 37°C hőmérsékleten 48 órán át inkubálunk. A reakcióelegyet Sepharose 4B oszlopon gélszűréssel frakcionáljuk. Az eluálást PBS-sel, 5 ml/óra áramlási sebesség végezzük és 2 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az elúciós csúcsoknak megfelelő degradációs termékeket ezután HPLC-vel Toyo Soda-Gel G3000SW és G2000SW oszlopon, a 6.11. és az ezt követőn pontokban leírt módon tisztítjuk.

Alternatív megoldásként ezt a kísérletet úgy is lefolytattuk, hogy 1 mg heparinra - MM5 enzim helyett - 20 μΙ PC3 enzimet alkalmaztunk a fenti körülmények között, azzal az eltéréssel, hogy 24 órát inkubáltuk a tenyészetet (48 óra helyett). A frakciókat Sepharose 4B oszlopon gélszűréssel választottuk el (29. ábra). Az in vitro biológiai vizsgálatok eredményét a később ismertetésre kerülő XIX. táblázat mutatja.

6.8. DTH-reakció előidézése egereken, valamint a gátló hatás vizsgálata

BALB/c egerek (csoportonként legalább 5 egér) hasi szőrzetét leborotváltuk, és a borotvált felületet topikálisan 4-(etoxi-metilén)-2-fenil-oxazolon (OX; gyártó: BDH Chemicals, GB) aceton-olivaolaj eleggyel készült 3%-os oldatával kezeltük. A DHT-érzékenységet 5 nappal később a következőképpen váltottuk ki: Az egerek fülét 0,5% OX aceton-olivaolaj eleggyel készült oldatával kezeltük. Az egerek fülét közvetlenül a kezelés előtt, majd 24 órával a kezelés után Mitutoyo mérnöki mikrométerrel megmértük. A duzzadás mérést végző személy az egyes egércsoportok azonosítási adatit nem tudta (vak). A DTH-reakció gátlást meghatározandó, az egerek hátába adtuk be szubkután a PBS-sel hígított kis molekulatömegű immunszabályzó frakciókat a jelzett időközökben és koncentrációban. A kezelt egereket mind a kezelés alatt, mind a kezelést követően (több mint 2 hónapig) megfigyelés alatt tartottuk és súlyosabb mellékhatást klinikailag nem észleltünk.

60.704/SM <« ···· ···· ·· ·· ··· « ♦ · · · • ··« ·· · · · • · « · ·

6.9. LMWH (Fragmin) elválasztása méret kizárásos gélkromatográfiás (Sepharose 4B) oszlopon

A Fragmint (mintaszám 38609) és az inaktív Fragmint Sepharose 4B (Pharmacia) oszlopon gélszüréssel frakcionáltuk. Az egyes frakciókat 5 ml/óra sebességgel PBS oldattal eluáltuk és 0,5 ml-es frakciókat gyújtöttünk, s ezeket 206 nm hullámhossznál mért abszorpció alapján azonosítottuk (280 nm-nél nem detektáltunk abszorpciót). A frakció száma függvényében ábrázoltuk a 206 nm-nél mért abszorpciót (11. ábra). A biológiai mérésre kiválasztott frakciók eredményeit a XIII. és XIV. táblázat mutatja.

60.704/SM

XIII. táblázat: A teljes fragmin, a Sepharose 4B oszlopon nyert, valamint a

Sepharose 4B oszlopon majd HPLC-vel nyert Fragmin-frakciók hatása az aktív TNF-α elválasztására Humán PBL kísérletekben

Tesztelt anyag	Koncentráció (pg/ml)	TNF aktivitás (%)	„R”-érték % x (pg/ml)’1
Aktív Fragmin (teljes) Inaktiválódott	1	lnhmax (90%)	90
Fragmin (teljes)	a	nincs hatás	0
Inaktiválódott
Frag/Seph.4B-F15	5	lnhmax (50%)	50
Inaktiválódott
Frag/Seph.4B-F10	a	nincs hatás	0
Inaktiválódott
Frag/Seph.4B-F8	1000	Augmax (60%)	0,06
Inaktiválódott
Frag/Seph.4B-F2	1000	Augmax (30%)	0,03
Fragmin/HPLC-F90	b	nincs hatás	0

a) koncentráció tartomány: 1 pg/ml - 0,001 pg/ml

b) koncentráció tartomány: 1 pg/ml - 0,01 pg/ml

60.704/SM

-72 «· *··· ··»« ·· ·· • · · · ···· • ··· *·· 9 · • · · · ·

XIV. táblázat: A teljes Fragmin és a Sepharose 4B oszlopon nyert Fragmin-frakciók hatása egér DTH-reakcióra

Tesztelt	Dózis	DTH-reakció gátlás	„R”-érték
anyag I	jig/g egér)	(>50%)	% x (pg/gm)'1
Aktív Fragmin
(teljes)	0,2	50	250
Inaktiválódott
Fragmin (teljes)	0,2-0,004	nincs hatás	0
Inaktiválódott Fragmin
Seph.4B, F15 frakció	0,004	50	12.500
Inaktiválódott Fragmin
Seph.4B.F10-frakció	0,02-0,004	nincs hatás	0

6.10. További kísérletek Fragmin-frakciókkal és heparinázzal degradált ECM-mel (DECM)

A Fragmint és a heparinázzal degradált ECM-et Sepharose 4B oszlopon gélszűréssel frakcionáltuk. A frakciókat 5 ml/óra áramlási sebességgel PBS-oldattal eluáltuk. 0,2 ml-es frakciókat gyűjtöttünk, s ezeket 206 nm-nél mért abszorpció alapján azonosítottuk (280 nm-nél nem detektáltunk abszorpciót). A frakció száma függvényében ábrázoltuk a 206 nm-nélmért abszorpciót (14. ábra). A választott frakciók biológiai eredményeit a XV. táblázat mutatja.

60.704/SM

-73·· ···· ···» ·· »« • * * » * · « · ··*·««· · · • · · · ·

XV. táblázat: Fragmin és DECM Sepharose 4B oszlopon elválasztott frakcióinak hatása az aktív TNF-α elválasztásra humán PBL kísérletekben

Vizsgált frakció	Koncentráció (pg/ml)	TNF-α aktivitás (%)	„R”-érték % x (pg/ml)'1
Frag/Seph.4B-F39	100	lnhmax (60%)	0,6
DEMC/Seph.4B-F39	10,000	lnhmax (85%)	0,0085
Frag/Seph.4B-F42	a	nincs hatás	0
DECM/Seph.4B-F42	a	nincs hatás	0
Frag/Seph.4B-F32	10	Augmax (55%)	5,5
DECM/Seph.4B-F46	10	Augmax (20%)	2

a) Koncentráció tartomány 1 pg/ml - 0,001 pg/ml

6.11. Aktív anyagok kinyerése Fragminból HPLC-vel

A kísérleteket két különböző paraméter-együttessel jellemezhető nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel végeztük. Először egy 30 cm x 7,8 mm (belső átmérő) TSK-GEL® G-Oligo-PW oszlopon kromatografáltunk, mely egy 4 cm x 6 mm (belső átmérő) guard oszloppal volt kiegészítve. Az eluálás 0,7M foszfát pufferrel (pH 7,0), 0,5 ml/perc áramlási sebességei történt. 0,5 ml térfogatú frakciókat gyűjtöttünk.

Másodszorra sorba kapcsolt Toyo Soda TSK-Gel G3000SW (7,5 mm x 50 cm) és G2000SW (7,5 mm x 50 cm) oszlopok alkalmazásával ment a HPLC, egy 7,5 mm x 10 cm guard oszlop (Phenomenex) kiegészítéssel. Az elúciót 1 ml/perc sebességgel átfolyatott, gondosan gáztalanított 0,5M nátrium-kloriddal végzetük. 0,5 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A detektort 0,02 pontossággal 232 nm-re állítottuk, a retenciós időket ±0,1 sec. pontossággal mértük. A hiányos és teljes térfogatokat kék dextrán és nátrium-azid jelenlétében mértük. A sorozat mérését 206 nm detektor-állásnál

60.704/SM

-ΊΑ·· ·«·· ···« ·· ·· ve· · e · w · »«····· · · • · · · · azonos feltételek mellett megismételtük. A HPLC-vel kapott Fragmin-frakciók száma függvényében ábrázoltuk a 206 nm-nél mért abszorpciót. A kiválasztott frakciók biológiai eredményeit az alábbi XVI. táblázat mutatja. Ebből nyilvánvaló, hogy míg egyes frakciók gátolják a TNF-α aktivitását, addig mások ennek fokozására képesek.

XVI. táblázat: A teljes Fragmin és HPLC-frakcióinak hatása az aktív TNF-a elválasztására humán PLB kísérletekben

Fragmin vagy	Koncentráció	TNF-α aktivitás	„R” érték
frakciója	(pg/ml)	(%)	% x (pg/ml)1
teljes*	10	lnhmax (40%)	4
HPLC-F1	100	Augmax (60%)	0,6
HPLC-F3	10	lnhmax (70%)	7
HPLC-F16	10	lnhmax (100%)	10
HPLC-F22	10	lnhmax(100%)	10
HPLC-F26	100	lnhmax (50%)	0,5
HPLC-F30	100	lnhmax (70%)	0,7
HPLC-F47	100	lnhmax (55%)	0,55

* A teljes Fragmin mintát 4°C-on 90 napig öregítettük

6.12. ECM aktív frakcióinak elválasztása HPLC-vel

Az ECM aktív frakcióinak HPLC elválasztását a 6.11 pontban leírt módon végeztük. A 206 nm-nél mért abszorpciót a frakció számának függvényében a 18B ábra mutatja. A választott frakciók biológiai eredményei az alábbi XVII. táblázatban láthatók. Az adatokból nyilvánvaló, hogy az ECM heparináz segítségével lefolytatott degradációja során részint olyan anyagokat izoláltunk, amelyek TNF-α aktivitását gátolják, részint olyanokat, amelyek ennek aktivitását fokozzák. Az eredményekből

60.704/SM

-75·· »«·· ···· ·· ·« • · · · 4 · · » • ··· ··· · * • · · · · az is kiderül, hogy a HPLC elválasztás során olyan frakciókat is kaptunk, melyek a TNF -a aktivitását nem befolyásolják.

XVII. táblázat: DECM HPLC-vel elválasztott frakcióinak hatása az aktív TNF-a elválasztásra humán PBL kísérletekben

DECM	Koncentráció	TNF-α aktitivitás	„R”-érték
frakció	(pg/ml)	(%)	% x (pg/ml)’1
HPLC-F1	a	nincs hatás	0
HPLC-F5	a	nincs hatás	0
HPLC-F10	10	lnhmax (60%)	6
HPLC-F14	10	lnhmax (70%)	7
HPLC-F17	a	nincs hatás	0
HPLC-F25	1000	Augmax (40%)	0,04
HPLC-F33	100	Augmax (40%)	0,4
HPLC-F37	10	Augmax (100%)	10
HPLC-F39	100,000	lnhmax (60%)	0,0006
HPLC-F42	a	nincs hatás	0
HPLC-F46	1000	Augmax (30%)	0,03
HPLC-F49	1000	Augmax (30%)	0,03
HPLC-F61	a	nincs hatás	0

*Koncentráció tartomány: 1 μg/ml - 0,001 pg/ml

60.704/SM ·· »··· ···« -· ·» • · · · · · « · • ··· ··· · 4 • · · · ·

6.13 Karbazol-próba kvantitatív cukor meghatározásra

1500 μΙ borát-kénsav reagenst jégfürdön lehűtünk és a bórsavas reagens felületére óvatosan rárétegezzük a teszt-oldatot (250 μΙ; 20 μg uronsav/ml). 10 perc diffúziós idő után az oldatokat erőteljesen összekeverjük, 10 percig forró fürdőn tartjuk, majd jégfürdőn lehűtjük. Az elegyhez 50 μΙ hűtött karbazolt adunk, erőteljesen öszszekeverjük és 15 percre forró fürdőre tesszük, majd lehűtjük és abszorpcióját - ismert koncentrációjú oldatottal összehasonlításban - 525 nm-nél leolvassuk.

6.14 Diszacharid izolálása ECM degradációs termékeiből

Borjú szaruhártya endoteliális sejtekből származó ECM-ből, emlős-eredetű heparinzzal (MM5) kaptuk azokat a degradációs termékeket, melyekből HPLC-vel izoláltuk a diszacharidot.

Részletesebben:

ECM-bevonatú lemezei 1 ml PBS-ben (melynek pH-ját citromsavval 6,2-re állítottuk be) oldott 20 μΙ emlős heparinázzal (0,5 mg/ml)48 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáltunk. A tenyészetet ezután Sepharose 4B oszlopra (35 cm x 0,7 cm belső átmérő) vittük fel. A mozgó fázis PBS puffer volt 5 ml/óra áramlási sebességgel. 2,2 ml-es frakciókat gyűjtöttünk és ezek tartalmát 206 nm-nél azonosítottuk (19. ábra). Az 5. frakcióból egy 100 μΙ-es mintát (a 8,8 és 11 ml közötti elúciós részletet) HPLC oszlopra injektáltuk (sorba kapcsolt Toya Soda TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm x 50 cm és G2000SW, 7,5 mm x 50 cm oszlopok, Phenomex 7,5 mm x 10 cm guard kiegészítővel). A mozgó fázis 0,1 M nátrium-klorid volt 1 ml/perc áramlási sebességgel. 1 mles frakciókat gyűjtöttünk és tartalmukat 206 és 232 nm-nél vizsgáltuk (20A és 20B ábra). Az 1 sz. csúcsnak megfelelő mintát (P1) 25 ml-es lombikban liofilizáltuk. A minta karbazol-próba alapján kb. 20 pg oligoszacharidot tartalmaz 60 mg nátrium-kloridban.

60.704/SM

-77 • · ···· ···· ·· · φ ··· · ····

A minta elúciós profilja hasonló a heparin depolimeráziójával nyert molekulasúly markeréhez (Sigma), mely diszacharid standardként van forgalomban.

Az anyag lnh_max értékét - hasonlóan készített minták alapján - (lásd pl. az F73-nak megfelelő csúcsot a 21A ábrán; elúciós idő kb. 4,4 perc, valamint az F5/HPLC-F73 sort a XVIII. táblázatban) 87%-ra becsültük (humán PBL modelen, in vitro TNF -a gátlási kísérlet) 10 pg/ml koncentráció szinten. A vizsgálatot a fent leírt módon végeztük. A mintát az alábbiak szerint tisztíthatjuk SAX-HPLC oszlopon.

6.15 Diszacharid izolálása ECM degradációs termékeiből SAX-HPLC alkalmazásával

ECM-bevonató lemezei 1 ml PBS pufferben (melynek pH-ját citromsavval 6,2-re állítottuk be) oldott 20 μΙ emlős heparinázzal (0,5 mg/ml) 48 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáltuk. A tenyészetet ezután Sepharose 4B oszlopra (0,7 x 35 cm) vittük fel. A mozgó fázis PBS puffer volt 5 ml/óra áramlási sebességgel. 1,6 ml-es frakciókat gyűjtöttünk és ezek tartalmát 206 nm-nél azonosítottuk (22. ábra). A 7-8 frakciókat egyesítettük és liofilizáltuk. A kapott porból az eredeti térfogat 1/10-ének megfelelő koncentrációjú szuszpenziót készítettünk. 100 μΙ-es mintákat HPLC oszlopra injektáltunk (sorba kapcsolt Toyo Soda TSG-Gel G3000SV, 7,5 mm x 50 cm és G2000SW, 7,5 mm x 50 cm oszlopok, Phenomenex 7,5 mm x 10 cm guard kiegészítővel), mint előbb. A mobil fázis 0,5ΓνΤ nátrium-klorid volt 1 ml/perc áramlási sebességgel. 1 ml-es frakciókat gyűjtöttünk és ezek tartalmát 206 és 232 nm-nél azonosítottuk (23. ábra). Tíz azonosan végzett ilyen kísérletből az 1 sz. csúcsnak megfelelő anyagokat (gyakorlatilag homogén rakciók) egyesítettük, majd a mintát liofilizáltuk.

A kapott anyagot 2 ml kétszer desztillált vízben szuszpendáltuk, Sephadex G-10 oszlopon (26 x 150 mm) sómentesítettük, és az oszlopról 1,6 ml/perc áramlási sebességű kétszer desztillált (DD) vízzel eluáltuk. 1 ml-es frakciókat gyűjtöttünk, abszorpciójukat 232 nm-nél mértük, és vezetőképességüket - nátrium-klorid tartalom

60.704/SM • ·· · ···· meghatározása céljából - is meghatároztuk. A sómentes frakciókat egyesítettük, liofilizáltuk és 1 ml DD vízben szuszpendáltuk. 100 pl szuszpenzióhoz 900 μΙ 0,2M nátrium-kloridot (pH 3,5) adtunk és a kapott 1 ml-nyi mintát analitikai SAX-HPLC oszlopra (4,6 x 250 mm, Spherisorb töltet 5 pm-es részecskeméret) vittük fel. az eluciót

1,5 ml/sebességgel, az alábbi táblázat szerinti lineáris gradiensnek megfelelő nátrium-klorid-tartalmú oldattal végeztük.

Idő/Puffer perc	A (%)	B (%)	C (%)
0	100	0	0
2	100	0	0
35	38	62	0
40	38	62	0
45	0	100	0
47	0	100	0
50	0	0	100
55	0	0	100
58	100	0	0
60	100	0	0

A = 0,2 M NaCI, pH 3,5

B = 1,5 M NaCI, pH 3,5

C = H₂O

60.704/SM

-79 Az elúció menetét 232 nm-nél végzett abszorpcióméréssel követtük (24. ábra), az A23/4 csúcsnak megfelelő frakciót TNF-gátló hatásra teszteltük. Ennek a SAX-HPLC tisztítással nyert frakciónak az lnh_max értéke 0,1 pg/ml koncentrációnál 60% volt, az „R”-értéke pedig 600% x (pg/ml)'¹-nek adódott.

Különböző mértékben szulfátéit diszacharid standard mintákat teljesen azonos körülmények között SAX-HPLC oszlopra injektáltunk. Ezek elúciós profiljait a 25A-C ábrák szemléltetik. Az ábrákról látható, hogy az egyes diszacharid standardok retenciós idői különbözők; legelőbb a szulfátcsoportot nem tartalmazó diszacharid elulálható (Sigma, H-0895; 25A ábra), ezt követi 20 percen belüli elúciós idővel a két szulfátcsoportot tartalmazó diszacharid (Sigma, H-1020; 25B ábra), s utolsónak a 3 szulfátcsoportot tartalmazó diszacharid eluálható (Sigma H-9267; 25C ábra). A triszulfát-(H-9267) típusú diszacharid retenciós ideje (23.07 perc) nagyon hasonló az A23/4 csúcsnak megfelelő minta retenciós idejéhez (23.10 perc).

6.16 Különböző anyagok biológiai eredményei in vitro humán PBL modelen

A XVIII. táblázatban kiindulási „keverékek”, valamint különböző, az ECM degradálásával nyert aktív anyagok (köztük a 20. ábrán P1-jelzésű csúcsnak megfelelő anyag) eredményei láthatók, in vitro humán PBL modelen. Míg a P1 anyagnak 10% x (pg/ml)'¹ az „R”-értéke, addig a kiindulási DECM „lé” „R”-értéke 0,000053 % x (pg/ml)'¹.

60.704/SM

-80 XVIII. táblázat: ECM + MM5 heparináz (DECM-”lé”), ennek Sepharose 4B oszlopon nyert frakciói, továbbá a frakciók HPLC tisztításával nyert újabb frakciók hatása az aktív TNF -a elválasztásra Humán PBL modelen

Vizsgált anyag	Koncentráció (pg/ml)	TNF-aktivitás (%)	„R”-érték % x (pg/ml)’1
DEDM „lé”	1 χ 106	lnhmax (53%)	5,3 χ 10'5
Seph.4B-F5	100	lnhmax (50%)	0,5
Seph.4B-F6	100	lnhmax (60%	0,6
Seph.4B-F7,8	100	lnhmax (81%)	0,8
F5/HPLC-F73	10	lnhmax (87%)	8,7
F5/HPLC-F65	10	lnhmax (78%)	7,8
F5/HPLC-F22	10	lnhmax (33%)	3,3
F6/HPLC-F86	10	lnhmax (43%)	4,3
P1	10	lnhmax (100%)	10,0

6.17. Oligoszacharidok izolálása heparin degradációs termékeiből

Az ECM degradálásához hasonló módon, az intakt heparint is különböző forrásokból származó heparináz enzimekkel, így az MM5 és PC3 enzimmel kezeljük. A PC3 enzim előállítását Shoseyov, O. és munkatársai ismertették [Biochem., Biophys. Rés. Comm, 169:667-672 (1990)]. A kiindulási keverékeket Sepharose 4B oszlopon választottuk szét (lásd 26. ábra: Heparin + MM5 frakcionálása, F7 és F8 frakciók; 27. ábra: Heparin + PC3, valamint PC3 önmagában). A kapott frakciókat HPLC II technikával - a fent leírt módon - további komponensekre választhatjuk szét (lásd 28A és 28B ábra: F7/HPLC-F86, F84 és F90). Az intakt heparint és Fragmint azonban közvetlenül is a kívánt frakciókra választhatjuk szét HPLC II technikával (lásd 29. ábra:

60.704/SM • ·

-81 - ...........

HPLC-F90 frakciók közvetlenül Fragminból). A kiindulási „keverékek”, valamint különböző aktív anyagok - köztük a heparin degradációs termékei - in vitro biológiai eredményeit humán PBL modelen a XIX. táblázat mutatja.

XIX. táblázat: Intakt heparin, Heparin + MM5 (vagy + PC3) „levek”, ezek

Sepharose 4B és HPLC frakcióinak hatása az aktív TNF-ot-re humán PBL modelen

Vizsgált anyag Koncentráció (pg/ml)	TNF-aktivitás (%)	„R”-érték % x (pg/ml)’1
Intakt heparin	a	nincs hatás	0
Hep/HPLC-F90	a	nincs hatás	0
További heparin frakciók:
F7/HPLC-F86	0,1	lnhmax (26%)	260
F8/HPLC-F84	a	nincs hatás	0
F8/HPLC-F90	a	nincs hatás	0
Hep/PC3 „lé”	0,1-10 x 106	nincs hatás	0
Seph.4B-F9	100	lnhmax (50%)	0,5
Seph.4B-F8	100	lnhmax (40%)	0,4
PC3 (önmagában)	a	nincs hatás	0
Seph.4B-F8	a	nincs hatás	0
Seph.4B-F9	a	nincs hatás	0

* Koncentráció tartomány: 1 pg/ml - 0,01 pg/ml

60.704/SM * · ···· ····

6.18 Különböző anyagok hatása egereken kiváltott DTH-reakcióra in vivő

Több anyagot is teszteltünk in vivő körülmények között egereken kiváltott DTH-reakció gátlására: a gátló hatás mértéke az anyag tisztaságától függően változott. Az egereket az 5.1 és 5.2 pontban leírt módon kezeltük az aktív anyagokkal. Azoknak az anyagoknak, amelyeket lényegében tiszta formában állítottunk elő HPLC-vel, több tízezer volt az „R”-értéke. Egy kísérletsorozat eredményeit a XX. táblázat foglalja össze.

60.704/SM

XX. táblázat: Egerek kezelése hetenként különböző tesztanyagokkal, s ezek hatása az egereken kiváltott DTH-reakcióra

Vizsgált	Dózis	DTH-reakció	DTH-gátlása	„R”-értéke
anyag (pg/gm)'1	(pg/gm egér)	(10’2 mm)	%	%x

nincs	-	17,2 ±2	0	-
(-) kontroll		2	-	-
0,5 M NaCI	-	16,5 ± 1,5	5	-
Intakt Heparin	a	-	nincs hatás	0
Fragmin
mintaszám: 38609	0,2	3 ± 1	85	425
DECM
MM5 „lé”	a	-	nincs hatás	-
Seph.4B-F6	0,032	16,5 ±5	5	-
	0,016	16 ±2	10	-
	0,032	14 ± 2	20	-
	0,006	7,1 ± 1	65 (max)	110,000
F6/HPLC-F9	0,032	11 ± 2	40	-
	0,01	17±2	0	-
	0,002	6 ±0,5	70	-
	0,0006	6± 1,2	70 (max)	120,000
F6/HPLC-F11	0,02	17 ± 3	0
	0,01	13 ± 1	25	-
	0,001	9,5 ±2,5	55	-
	0,0006	2,8 ±0,5	90 (max)	150,000
F6/HPLC-F12	0,02	18 ±2	0
	0,01	15 ± 2	15	-
	0,001	8,2 ± 1,5	60	-
	0,0006	4± 1	80 (max)	130,000

a Dózis-tartomány: 0,04-0,0004 pg/mg egér

60.704/SM

-84 Mint a XX. táblázatból látható, az intakt heparin és a kiindulási ECM + MM5 „lé” in vivő nem volt hatásos. Az utóbbinál ez valószínűleg azért van így, mert az aktivitást gátló és az aktivitást fokozó komponensek hatása kiegyenlítődik. A friss Fragmin (38609 mintaszám) viszont már valamelyes hatásra utaló „R”-értéket adott, mely összemérhető a korábbi kísérletek eredményével (IX. táblázat 1. sor). A Sepharose 4B oszlopon elkülönített frakciók „R”-értéke valamivel gyengébb volt, mint a II. típusú HPLC körülményei között elkülönített megfelelő frakcióké.

Egy másik kísérletsorozat eredményeit a XXI. táblázat mutatja, megerősítve, hogy a kiindulási ECM + MM5 „lé” nem hatásos. Megjegyzendő viszont, hogy az egyik HPLC II frakció (az F6/HPLC-L22), amelyik egereknek szubkután injekcióban beadva igen erős specifikus szabályzó aktivitást mutatott [az „R”-érték = 454.545 % x (pg/gm/¹] nagyobb dózisban ugyan, de orálisan is hatásos [az „R”-érték = 5000 % x (pg/gm)’¹]. A XXI. táblázatból az is kitűnik, hogy az ECM-ből izolált aktív anyagok in vivő specifikus szabályzó hatása erősebb, mint a Fragminból elkülönített anyagoké. Ebből úgy tűnik, hogy a szulfátcsoportok hiánya csökkenti a találmány szerinti aktív anyagok fajlagos gátló hatását. Mindenesetre, in vitro körülmények között aktivitás fokozódásra utaló „R”-értékeket deszulfatált diszacharidok esetében kaptunk.

További kísérletekből az derül ki, hogy a galaktózamin - egy olyan monoszacharid (egyszerű cukor), mely nem tartalmaz szulfátcsoportot - antagonistaként viselkedik a jelen találmány szerinti szulfátéit oligoszacharidok gátló hatásával szemben. Azaz a deszulfatált oligoszacharidok vagy közvetlen aktivitás fokozó komponensként hatnak vagy antagonizálják a karboxilezett és/vagy szulfátéit oligoszacharidok specifikus gátló hatását. Ez a megfigyelésünk összhangban van azzal is, hogy bizonyos anyagok (pl. valamely triszulfatált diszacharid) erősítik egy még azonosítatlan természetes anyag hatását, mely gátolja az aktív TNF-α elválasztást.

60.704/SM

XXI. táblázat: Egerek szubkután kezelése különböző anyagokkal és ezek hatása az in vivő DTH-reakcióra

Vizsgált anyag	Dózis (pg/gm egér)	DTH-reakció (10'2 mm)	(%)	„R”-érték % x (pg/gm)'1
ECM + MM5 „lé”	a	20,4 ±0,7	nincs hatás	0
F5/HPLC-L22	0,008b	13,2 + 1,3	40 ± 12%	5,000
F5/HPLC-L22	0,000132	9,7 ±1,3	60 ± 17%	454,545
FRAGMIN
FR/HPLC-2	0,00048	8,5 ±1,3	70 ± 20%	145,833

^a Dózis-tartomány 0,04-0,0004 pg/gm egér ^b Orális beadásmód

A pozitív kontrollcsoportban a DTH-reakció 20,0 ± 1,1; a negatív kontrollcsoportban a DTH-reakció 2,0 ± 1,0 volt.

6.19 A SAX-HPLC-vel tisztított frakciók és ismert diszacharid markerek in vivő aktivitásainak összehasonlítása

Két diszacharid markert vizsgáltunk in vivő egereken, hogy gátolják-e a relatív DTH-reakciót. Mint azt a XXII. táblázat mutatja, a két vizsgált marker (Η-1020 és Η-9267) szubkután injekcióban beadva mérsékelt hatású: „R”-értékeik 140.000 és 160.000 % x (pg/gm)'¹ között vannak. A H-1020 markert orális teszten is vizsgáltuk és szerény hatást tapasztaltunk: „R”-értéke 531 % x (pg/gm)'¹. A H-1020 marker egy 0,N-diszulfát, a H-9267 marker pedig egy Ο,Ο,Ν-triszulfát, mint azt a megfelelő képletrajz mutatja. A XXII. táblázatból az is látható, hogy a SAX-HPLC-vel tisztított

60.704/SM

-86 L22/SAX-A23/4 (24. ábra) frakció „R”-értéke 630,303 % x (pg/g)'¹, s ez további javulást jelent az F5/HPLC-L22 már amúgy is magas specifikus gátló hatásához képest [,,R”-érték = 454,545 % x (pg/gm)'¹, lásd XXI. táblázat]. Ez az anyag, melynek a SAX-HPLC oszlopon mért retenciós ideje majdnem azonos a H-9267 markerével, szobahőmérsékleten kb. 3,5 pH értéken néhány nap alatt elveszti szulfátcsoportjait. Egy öregített mintát is megvizsgáltunk SAX-HPLC oszlopon, s azt találtuk, hogy az eredeti egy főcsúcs (retenciós idő: 23,10 perc) helyett 3 nagyobb csúcs jelent meg (30. ábra), melyeket 2039/1; 2039/2 és 2039/3 jelzéssel jelöltünk, s mindegyik retenciós ideje rövidebb, mint az A23/4 frakcióé. A 2039/3 csúcsnak megfelelő retenciós idő a H-1020 markeréhez hasonló, s valószínűleg az N-szulfátcsoportját vesztette el. A 2039/1 és 2039/2 csúcsokat adó anyagok valószínűleg monoszulfatált, vagy teljesen deszulfatált diszacharidok (mindkettő retenciós ideje a H-0895 diszacharid markeréhez hasonló, amely egy N-acetil-glukózamino-glukán és nem tartalmaz szulfátcsoportot).

Ezeket a deszulfatált anyagokat in vivő körülmények között DTH-reakció gátlására teszteltük és meglepő módon azt találtuk, hogy a gátlás csak enyhe mértékű vagy egyáltalán nincs gátló hatás (lásd XXII. táblázat). In vitro, humán PBL modellen mind a három csúcsot adó anyag fokozta az aktív TNF-α elválasztást. Az in vitro eredményeket az alábbi táblázat mutatja:

SAX-HPLC	Koncentráció	Augmax	„R’’-érték
csúcs	(pg/ml)	(%)	% x (pg/ml)'1
2039/1	1	5	5
2039/2	1	35	35
2039/3	1	42	42

60.704/SM

XXII. táblázat: Különböző szubkután beadott diszacharidok alkalmazásakor kapott további in vivő eredmények

Vizsgált anyag	Dózis (pg/gm, egér)	DTH reakció (W2 mm)	InhfYigx (%)	„R”-érték % x (pg/gm)’1
PBS	-	18,6 ± 0,7	-	-
pozitív kontroll
Naive	-	1,4 + 0,2	-	-
negatív kontroll
SAX-HPLC
frakciók:
A23/4	0,000132	3 ± 1	83	630,303
2039/3	0,0005	3,1 ± 1,1	83	166,000
2039/1	0,000132	18,5 ± 1,1	nincs hatás	0
Markerek
H-1020	0,0005	4,7 ±0,7	73	146,000
H-1020	0,128a	5,8 + 0,9	68	531
H-9267	0,0005	3,5 + 1	80	160,000

^a Orálisan beadott minta

6.19.1. Néhány diszacharid szabályozó hatása aktív TNF-α in vivő termelődésére

A továbbiakban a Sigma Chemical Co. által forgalmazott néhány diszacharid (ezeket a Sigma katalógusszámokkal azonosítjuk) hatását teszteltük, hogy gátoljáke, illetve fokozzák-e az egereken kísérletesen előidézett DTH-t, s ezzel mintegy jelét adják annak, hogy az emlősökön képesek az aktív TNF-α termelődésének szabályozására.

60.704/SM

-88A kísérletek során 4-12 CD1 egérből (Weizmann Institute Animál Breeding Center, Rehovot, Izrael) álló csoportokat kezeltünk az 5.2 vagy 6.8 pontban leírt módon.

A különböző kísérletek eredményeit a XXIHA táblázat foglalja össze. Eszerint az egerek fülén oxazolon beadás hatására kialakult duzzanatot a tesztelt 11 diszacharid közül 4 gátolta. A T-sejtek közvetítésével létrejött immunválasz (gyulladás) gátlása esetén a nem-záró „R”-érték jelzi, hogy az aktív TNF-oc termelődését az adott diszacharid csökkenti (negatív szabályzás). A táblázatból látható, hogy az „R”-értékek a viszonylag szerény 65000 % x (pg/gm)'¹ értéktől egészen az 1,500,000 % x (pg/gm)'¹ körüli értékig változhatnak. Megjegyezzük, hogy egy adott anyag esetén a magas „R”-érték nem szükségképpen a legkívánatosabb jellemző. Más szóval az a dózis-”ablak” (-tartomány), amelyen belül egy adott vegyület fiziológiailag hatásos, a lehető legtágabb kell hogy legyen, mert így a legkisebb annak a valószínűsége, hogy a beadott adag kívül esik a hatásos dózistartományon. Mint a XXIHA táblázat lábjegyzetében jeleztük, a vizsgált vegyületek közül a H-9392 molekula esetében a legtágabb ez a tartomány (0,000132 - 0,004 pg/gm).

Ugyancsak a táblázatból látható, hogy a vizsgált 11 diszacharid közül 1 meglepő módon fokozta a T-sejt reakción alapuló kísérletes DTH-t (duzzanat). A H-0895 jelű vegyület, mely szulfátcsoportot nem tartalmaz, a duzzadás mértékét már egészen kis dózisban is (1,2 pg diszacharid per gramm egér) nagymértékben fokozta; ezt a példátlanul magas 76,700,000 % x (pg/gm)'¹ körüli „R”-érték fejezi ki.

60.704/SM

- 89 XXIIIA táblázat: Szubkután beadott különböző diszacharid markerek alkalmazásakor kapott további in vivő eredmények

Vizsgált anyag	Dózis (pg/gm, egér)	DTH reakció (10’2 mm)	lnhmax (%)	„R”-érték % x (pg/gm)-1
H-9392a	0,0012	4,2 ± 0,7	78	6,5 χ 104
		(17,8 ± 0,9)
H-1020b	0,0004	6,7 ± 1,1	66	1,65 χ 105
		(19,6 ± 1,2)
H-9267c	0,0004	7,2 ± 1	64	1,60 χ 105
		(19,6 ± 1,2)
H-9517d	0,00004	7,6 ± 1	62	1,55 χ 106
		(20,4 ±0,7)
H-0895®	0,0000012	37,3 ± 0,7	+92	7,67 χ 107
		(18,9 ± 0,7)
H-9017f	nincs hatás			0
H-86429	nincs hatás			0
H-9142h	nincs hatás			0
H-8767'	nincs hatás			0
H-8892j	nincs hatás			0
H-1145k	nincs hatás			0

60.704/SM

^a A H-9392 jelzésű anyag 2-(O-szulfo)-4-dezoxi-iduransav-4-én-(a-1,4)-2dezoxi-2-(N-szulfo)-glukózamin. A csak PBS-t kapott csoport (pozitív kontroll) adatait zárójelben adtuk meg. Az immunizálatlan egereken a duzzadás 2,0 ± 0,5 mm volt. A számításoknál ezt az értéket vettük mindenütt figyelembe. A kontrolihoz képest 50%-ban vagy azt meghaladó mértékben gátló hatásos dózistartomány 0,000132-0,004 pg/gm.

^b A H-1020 jelzésű anyag 4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-szulfo)-6-(O-szulfo)-glukózamin. A kontrolihoz képest 50%-ban vagy azt meghaladó mértékben gátló hatásos dózis-tartomány 0,00004-0,004 pg/gm. Az itt közölt „R”-érték jó egyezést mutat a korábban (XXIII. táblázat) megadottal. Ebből is látszik, hogy az in vivő teszt jól reprodukálható CD1 törzsű egerek különböző csoportjai vonatkozásában.

^c A H-9267 jelzésű anyag 2-(O-szulfo)-4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-szulfo)-6-(O-szulfo)-glukózamin. A kontrolihoz képest 50%-ban vagy ezt meghaladó mértékben gátló hatásos dózistartomány meglehetősen szűk.

^d A H-9517 jelzésű anyag 2-(O-szulfo)-4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-acetil)-6-(0-szulfo)-glukózamin. A kontrolihoz képest 50%-ban vagy ezt meghaladó mértékben gátló hatásos dózis-tartomány 0,00004-0,00012 pg/gm.

^e A H-0895 jelzésű anyag 4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-acetilj-glukózamin. Ez az eredmény a DTH-reakció fokozódását jelzi. A kontrolihoz képest 50%-ban vagy ezt meghaladó mértékben az aktivitást fokozó dózistartomány 0,000001 - 0,00004 pg/gm.

^f A H-9017 jelű anyag a 4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-6-(O-szulfo)-glukózamin. Nincs hatása, azaz a tesztelt dózistartományban (0,000004-4 pg/gm egér) nem észleltünk hatást.

60.704/SM

- 91 ^g A H-8042 jelű anyag a 4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-acetil)-6-(O-szulfo)-glukózamin.

^h A H-9142 jelű anyag a 2-(O-szulfo)-4-dezoxi-iduronsav-4-én-(<x-1,4)-2-dezoxi-glukózamin.

' A H-8767 jelű anyag a 2-(O-szulfo)-4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-acetil)-glukózamin.

¹ A H-8892 jelű anyag a 2-(O-szulfo)-4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-6-(O-szulfo)-glukózamin.

^k A H-1145 jelű anyag a 4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-szulfoj-glukózamin.

A 4 gátló hatású diszacharid tehát a H-9392, H-9517, H-1020 és H-9267 számú, a 6 „semleges” diszacharid a H-9017, H-8892, H-8767, H-9142, H-8642 és H-1145 számú, és a 11 közül az egyetlen, mely erősíti a DTH-reakciót, a H-0895 számú. A vegyület képleteit az ábrák között megadjuk.

A gátló hatású vegyületek egy közös, H-genus jelzésű képletbe foglalhatók.

Ebben a képletben Χτ hidrogénatomot vagy SO³’ csoportot, X2 hidrogénatomot vagy SO³’ csoportot és X3 SO³' vagy COCH3 csoportot jelent, azzal a megszorítással, hogy ha X3 jelentése SO³' csoport, akkor X1 és X₂ közül legalább az egyik SO³’ csoportot jelent és ha X3 jelentése COCH3 csoport, akkor X! és X2 azonosan SO³’ csoportot jelent. Azoknál a vegyieteknél, melyeknél a hatásos dózistartomány megfelelően széles, X1 előnyösen SO³’ csoportot, X₂ előnyösen hidrogénatomot és X₃ előnyösen SO³’ csoportot jelent (azaz a H-9392 jelű vegyület esetében a legszélesebb a hatásos dózistartomány).

60.704/SM

A fentiekből következik, hogy a gátló hatás szempontjából a glukózamin nitrogénjén a szulfát szubsztituens az előnyös. Ha a glukózamin 2-N-helyzetben szulfátcsoportot tartalmaz, (X₃), akkor akár az iduronsav-rész 2-helyzetében, akár a glukózamin 6-os helyzetében van további szulfátcsoport, a gátló hatás észlelhető. Megvan a gátló hatás akkor is, ha mindkét említett hidroxilcsoport szulfátcsoporttal helyettesített, viszont ha nincs további szulfát szubsztituens, a vegyület „semleges” (sem nem gátol, sem nem erősít) lesz, mint a H-1145 esetében is.

Ha a glukózamin-rész 2-N-helyzetében acetilcsoport van, akkor mind az iduronsav 2-helyzetében (XJ, mind a glukózamin 6-helyzetében szulfátcsoport kell, hogy legyen. Ha a glulózamin-rész 2-N-helyzete helyettesítetlen, akkor pozitív töltésű ammóniumcsoport alakul ki, és a gátló hatás megszűnik; ezt bizonyítja, hogy a H-9017, H-8892 és H-9142 jelű vegyületek mind „semlegesek”. Ezen az sem változtat, ha az iduronsav-rész 2-helyzetében vagy a glukózamin 6-helyzetében vagy mindkettőben szulfátcsoport van jelen.

Végül, ha X₃ helyén acetilcsoport van és X! és X₂ helyén nincs szulfátcsoport, akkor a szabályzó hatás nem gátló, hanem fokozó jellegű (H-0895).

Megjegyzendő még az az összefüggés, hogy ha a diszacharidban negatív töltés van, akkor a vegyület képes a TNF-α termelődés gátlására. Ha pozitív töltésű ammónium szubsztituens van a vegyületben, akkor az hatás szempontjából „semleges”, ha nincs töltés - mint a H-0895 jelű vegyület esetében - akkor az aktív TNF-a termelődést fokozza (lásd XXI11B táblázat).

60.704/SM

-93XXIIIB táblázat: A kereskedelmi forgalomban lévő diszacharidokkal végzett in vivő

DTH vizsgálatok eredményéből levonható empirikus szabályok

Az Xn szubsztituensek jelentése a H-genus képletben	Észlelt aktivitás
x3	x2	X1
SO3'	SO3’	so3-	gátló
SO3	so3	H	gátló
so3-	H	SO3-	gátló
so3	H	H	semleges
COCH3	SO3-	SO3-	gátló
COCH3	SO3-	H	semleges
COCH3	H	SO3-	semleges
COCH3	H	H	fokozó
h2+	SO3’	SO3	semleges
h2+	SO3	H	semleges
h2+	H	SO3	semleges

6.19.2 Néhány monoszacharid szabályzó hatása az aktív TNF-α in vivő termelődésére

A továbbiakban néhány, a Sigma által forgalmazott monoszacharidot vizsgáltunk, hogy képesek-e az aktív TNF-α termelődést in vivő szabályozni. Az előző pontban leírt módon CD1 egerek hatos csoportjain kísérletesen DTH-reakciót idéztünk elő, majd szubkután injekcióban adtuk be a vizsgálandó teszt- (ill. kontroll)

60.704/SM

- 94 anyagokat az esetleges hatás megállapítása céljából. Az eredményeket a XXIIIC táblázat foglalja össze.

XXIIIC táblázat: Szubkután beadott különböző monoszacharidok in vivő hatásadatai

Vizsgált anyag	Dózis (pg/gm)	DTH-reakció (10-2 mm)	l^max (%)	„R”-érték % x (pg/gm)’1
GlcNa	0,000012	5 ±0,7	75	6,25 x 106
		(19,7 ± 1,2)
	0,4	2,3 ± 0,9	88	2,2 x 102
		(19,7 ± 1,2)
GlcN-2Sb	nincs hatás			0
GlcN-3Sc	nincs hatás			0
GlcN-6Sd	nincs hatás			0
GlcN-2,3S6	0,0012	6,3 ± 1	68	5,67 x 104
		(19,7 ± 1,2)
GlcN-2,6Sf	1,2	7,7 ± 1	61	5,08 x 10
		(19,7 ± 1,2)
NAc-GIcN9	nincs hatás			0
GalNh	0,00004	8,9 ± 0,6	50	1,25 x 106
		(18,9 ± 0,7)
	0,12	6,5 ± 0,7	67	5,58 x 102

(18,9 ±0,7)

60.704/SM

-95 - .................

^a GIcN jelentése glukózamin vagy 2-amino-2-dezoxi-D-glukóz. A kontrolihoz képest 50%-ban vagy ezt meghaladó mértékben gátló hatásos dózis-tartomány kettő is van, éspedig 0,000004-0,00004 pg/gm és 0,004-4 pg/gm.

^b GlaN-2S jelentése D-glukózamin-2-(N-szulfát). A tesztelt dózis-tartományban (0,000004-4 pg/gm egér) nem észleltünk hatást (a táblázatban ilyenkor „nincs hatás” szerepel).

^c GlcN-3S jelentése D-glukózamin-3-szulfát.

^d GlcN-6S jelentése D-glukózamin-6-szulfát.

^e GlcN-2,3S jelentése D-glukózamin-2,3-diszulfát. A kontrolihoz képest 50%-ban vagy ezt meghaladó mértékben gátló hatásos dózistartomány meglehetősen szűk.

^f GlcN-2,6S jelentése D-glukózamin-2,6-diszulfát. A kontrolihoz képest 50%-ban vagy ezt meghaladó mértékben gátló hatásos dózistartomány meglehetősen szűk.

⁹ NAc-GIcN jelentése N-acetil-glukózamin.

^h GalN jelentése D-galaktózamin. A kontrolihoz képest 50%-ban vagy ezt meghaladó mértékben gátló hatásos dózistartomány kettő is van, éspedig 0,00004-0,00012 pg/gm és 0,04-0,4 pg/gm.

A monoszacharid 4-helyzetü hidroxilcsoportjának térállása szabja meg, hogy az adott cukor glukózamin-e (a-térállás) vagy galaktózamin (β-térállás), mint az az idevonatkozó 44. ábrán látható.

A táblázatból úgy tűnik, hogy az N-acetilezés vagy egy szulfátcsoport jelenléte a monoszacharidban, ellensúlyozza a glukózamin DTH-reakciót gátló hatását egereken.

60.704/SM

- 96 6.19.3. Adjuváns arthritises (AA) patkányok kezelése különböző monoszacharidokkal és diszacharidokkal

6-8 hetes nőstény Lewis patkányokon AA-t idéztünk elő az 5.7 pontban leírt módon. Az 5-10 patkányból álló csoportokat először 1 nappal a kísérleti arthritis előidézését megelőzően, majd azt kővetően hetenként kezeltünk a teszt-anyagokkal szubkután injekció formájában. A hatást az 5.7. pontban leírt módon pontoztuk.

A 3 tesztelt diszacharid közül a H-9392 jelzésű volt az, amely a kontrollcsoporthoz képest (csak 0,1 ml sóoldattal kezelt patkányok) a legnagyobb mértékben csökkentette az AA pontszámot. Mint a 38. ábrán látható, a 120 ng/patkány (vagy 0,6 ng/gm patkány) dózisban beadott H-9392 jelzésű anyag majdnem teljesen (kb. 90%-ban) elnyomta az AA-ra jellemző destruktív gyulladásos folyamatot az AA előidézését követő 24. napon; a H-1020 jelzésű anyag a kontrolihoz képest kb. 30%-ban gátolta az AA-folyamatot a 24. napon. Ugyanakkor az aktivitást fokozó H-0895 jelzésű anyag az AA-indukciót követő kb. 2 héten belül két dózis esetében is (0,1 és 0,4 ng/patkány) elősegítette az AA kifejlődését. Ez a hatás azonban utóbb gyorsan megszűnt, úgyhogy a 24. napon az AA-pontszám már nem különbözött lényegesen a kontroliétól (lásd 38A ábra).

Ezen a kísérleti modellen bizonyos monoszacharidok szintén in vivő gátló hatást mutattak. A 38B ábrán látható, hogy a glukózaminos kezelés három dózisban is kb. 60-80%-ban gátolja az AA-folyamatot a kontrolihoz képest. A galaktózamin ennél sokkal kisebb mértékben ugyan, de szintén gátló hatást mutat (lásd 38C ábra).

A legérdekesebb talán az a megfigyelés volt, hogy ha a H-9392 jelzésű anyagot akár a nulladik naptól (az AA-indukció induló napjától), akár a 12. naptól (a patkányon már kifejlődött az AA) kezdve adagoljuk, minden esetben csökkenti az AA súlyosságát; az adagolási rend lehet hetenkénti vagy napi. A kísérletek eredményeit a 38D ábra (heti adagolás) és a 38E ábra (napi adagolás) szemléltei. A 38D ábrán

60.704/SM

-97 látható, hogy ha a H-9392 jelzésű anyagot heti adagolásban adjuk, akkor a 12. napon kezdett adagolással (a patkányon az AA már kialakult) legalább olyan jó hatást tudunk a kontrolihoz képest elérni, mint a nulladik napon (az AA indukció kezdetén) indított adagolással. A 38E ábrán látható, hogy bár a már beteg patkányok napi kezelése nem olyan hatásos, mint ha a naponkénti kezelést az AA-indukció kezdetén indítjuk, még mindig nagyon hatásosan csökken az AA-pontszám a kontrolihoz képest a már beteg patkányok napi kezelése esetén is.

Ezek az eredmények drámaian szemléltetik, hogy a találmány szerinti anyagok nemcsak a súlyos arthritis kialakulásának megelőzésében, hanem a már kialakult arthritis kezelésében is hatékonyak. Ez a kísérletsor azt is igazolja, hogy míg az előzőekben ismertetett LMWH-típusú anyagok csak heti adagolásban fejtenek ki gátló hatást, addig a találmány szerinti diszacharidok heti vagy napi adagolásban is gátló hatásúak.

A találmány szerinti anyagoknak a kísérletesen előidézett AA kezelésében megmutatkozó előnyei további igazolására egy külön összehasonlító kísérletsorozatot végeztünk. Ennek során Lewis patkányok egy-egy csoportját (5 patkány per csoport) dexamethason-foszfáttal (ismert gyulladásgátló; forgalmazó: Sigma), illetve a H-9392 jelű diszachariddal kezeltük (szubkután injekció). A kezelést 12 nappal az adjuváns arthritis (AA) indukálása után kezdtük kétféle adagolási rendben. Az egyik esetben az ismert gyulladásgátlót naponta, injekcióban adtuk be, a másik esetben hetenként injekcióban adtuk be vagy az ismert gyulladásgátlót vagy a diszacharidot. Az ismert gyulladásgátlóból minden patkány 100 pg-ot kapott 0,1 ml foszfát-pufferoldatban, a diszacharidból pedig 120 ng-ot 0,1 ml foszfát pufferoldatban. A kontrollcsoport 0,1 ml foszfát pufferoldatot kapott injekcióban. Az ismert gyulladásgátló napi adagolása esetén a kezelést az AA-indukció indulásától számított 17. napon fejeztük

60.704/SM • · · · * · · · »*····· « .

-98 - ..................

be, az ismert gyulladásgátló, illetve a diszacharid heti adagolása esetén pedig az AA-indukciótól számított 26. napon ért véget a kezelés.

Ezeknek a kísérleteknek az eredményeit a 38F és 38G ábra mutatja. A 38F ábrából látható, hogy kb. a kezelés első hetében a naponta adott dexamethasonfoszfát és a hetenként beadott H-9392 diszacharid jól összemérhető eredményt adott. A kezelés vége (26. nap) után azonban a dexamethason-foszfáttal kezelt patkányok csoportjában visszaesés következett be, a diszachariddal kezelt csoport javulása viszont folytatódott. Az AA-indukció után 30 nappal a diszachariddal kezelt csoport jobb állapotban volt, mint a dexamethason-foszfáttal kezelt csoport.

Mi több, ha a 38G ábra segítségével összehasonlítjuk a heti adagolásban dexamethason-foszfáttal kezelt csoport eredményeit a heti adagolásban a H-9392 diszachariddal kezelt csoportéval, láthatjuk, hogy 30 nappal az AA-indukció után a hetenként beadott dexamethason-foszfát csak igen mérsékelten csökkentette az AA súlyosságára utaló pontszámot. Ugyanakkor a hetenként beadott diszacharid (H-9392) 30 nappal az AA-indukció után majdnem teljesen elnyomta a kísérletesen előidézett adjuváns arthritist. Ismét érdemes megjegyezni, hogy a hetenkénti kezeléssel lefolytatott dexamethason-foszfát kúra után a patkányokon újra jelentkezett az adjuváns arthritis. Mind korábban említettük, a H-9392 jelzésű diszachariddal kezelt patkányoknál a javulás a diszacharid adagolás megszűntével is folytatódott.

Tehát a H-9392 diszacharid hetenkénti adagolásban és hosszabb időtartamot nézve felülmúlta az akár napi, akár heti adagolásban adott dexamethason-foszfát hatását. A dexamethason-foszfáttal (akár napi, akár heti adagolásban) kezelt patkányokon a kezelés befejezése után a betegség kiújult, a diszacharidokkal kezelt patkányok AA-pontszámai viszont a kezelés végeztével is javultak, azaz a kezelés után is gátolt a betegség kifejlődése.

60.704/SM ·· ··»· ···· ο • · · · · - _v . 9 ··# «»· ₀ ···· * · · · -99 - .............

6.19.4 Patkány szaruhártyán lipopoliszachariddal (LPS) előidézett gyulladás kezelésére vokatkozó eredmények

Vanderhagen, C. és munkatársai (Hollandia) közlésre elfogadott „Kinetics of

Intraocular TNF and IL-6 in Endotoxin-lnduced Uveitis in The Rat” c. munkája szerint az LPS-sel előidézett szaruhártyagyulladás TNF-dependens. Lewis patkányok szaruhártyájába 30-as méretű tűvel 5 ng LPS-t injektáltunk. Egy nappal később két külön patkánycsoport (2 patkány/csoport, 4 szem/csoport) közül az egyik szubkután injekcióban 0,05 ml foszfáttal tompított sóoldatot, a másik 50 ng/patkány (vagy 200 ng/patkány) dózisban H-1020 jelű anyagot kapott. A hatást a következőképpen pontoztuk:

ödéma	0-3 pont
neovascularisatio	0-3 pont
vörösödés	1/0 pont
duzzadás	1/0 pont
bevérzés	1/0 pont
pupillaszűkület	1/0 pont
synaechi	1/0 pont (a szivárványhártya tapadása a lencséhez
	vagy szaruhártyához)
hypopyon	1/0 pont (genny- vagy vér-gyülem a szem elülső
	csarnokában)
szaruhártya homály	1/0 pont

Ezeknek a pontoknak az összegét tekintjük összpontszámnak.

Az eredményeket grafikus ábrázolásban a 39. ábra mutatja; az 50 ng/patkány dózis hatására a helyileg LPS-sel kiváltott gyulladás gátolt a kontrollal összehasonlításban. Ugyanakkor a 200 ng/patkány dózissal nem sikerült szignifikáns eredményt elérni.

60.704/SM ·* ···· ···· ♦ · · * ··«» • ... ... , ···· ···* · · * -100- ..........

6.19.5 Lipopoliszacharidokkal (LPS) előidézett uveitis patkányon és a kezelések eredménye

Az uveitis szisztémás LPS beadás hatására a szem elülső csarnokában kifejlődő gyulladás. Hasonlóan az előző pontban leírt gyulladásos folyamathoz, mely LPS helyi alkalmazása esetén jelentkezett, az uveitis is TNF-dependens. A kísérletet 8-10 hetes Lewis patkányokon végeztük (8 szem/csoport). A kezelt csoport 32 ng/patkány vagy 500 ng/patkány dózisban H-9392 jelű vegyületet, a kontroli-csoport 0,1 ml sóoldatot kapott az 1. napon. A 2. napon a patkányok minden újjbegyükbe 50 pl-t kaptak LPS 2 mg/ml-es oldatából (200 pg LPS/patkány összdózis). A 3. napon minden szemből mintát vettünk és ezek össz-protein tartalmából következtettünk a gyulladás mértékére. Az eredményt az alábbi táblázat mutatja.

Patkány	Kezelés	Átlagos protein mg/ml
LPS-t nem kapott	-	0,36
LPS-t kapott	sóoldat	18,4
LPS-t kapott	32 ng H-9392	5,2
LPS-t kapott	500 ng H-9392	4,8

Látható, hogy a H-9392 vegyületből a két dózis bármelyikét egyszeri adagban beadva sikeresen (a kontroll kb. 70%-ában) gátolható a patkányon szisztémásán beadott LPS-sel kiváltott gyulladás.

60.704/SM

-101 - ..................

6.19.6. Különböző anyagok sugárvédö hatását igazoló kísérletek eredményei hetes nőstény BALB/c egerek 5-10 tagú csoportjain végeztük a kísérletet. A kontroli-csoport 0,1 ml sóoldatot, az egyik kezelt csoport tagjai H-9392 jelű vegyületet (30 ng/egér), a másik kezelt csoport tagjai glukózamint (10.000 ng/egér) kaptak szubkután injekcióban, először a besugárzást megelőző napon, majd azt követően hetenként, a kísérlet befejezéséig (30. nap). Az egerek 700 rád sugárdózist kaptak (⁶⁰Co izotop gamma sugárforrás).

Az egerek mortalitását 30 napos perióduson át pontoztuk. A csak sóoldatot kapott egerek mortalitási aránya a 30. napon 100%, a H-9392 jelzésű anyaggal előkezelt egerek mortalitása ugyanezen időszakban 40%-os. A glukózaminnal injekciózott egerek szintén jobb állapotban voltak, mint a kontroli-csoport, közöttük 20%-os a mortalitás ugyanebben az időszakban.

A találmány szerinti anyagokkal előkezelt egerek egy része tehát túlélte azt a sugárdózist, mely egyébként 30 napon belül 100%-os elhalálozási arányhoz vezetett volna.

Egy másik kísérletsorozatban BALB/c egerek 5-ös csoportjait 750 rád gammasugárral kezeltünk és a besugárzást megelőző napon, majd a besugárzást követő 6. és 13. napon a teszt anyagokból a következő dózisokat adtuk be: sóoldatból 0,1 ml/egér; H-9392 jelű anyagból 0,3, 3, 30 és 300 ng/egér; glukózaminból 1, 10 és 100 pg/egér. A harmadik és egyben utolsó kezeléssel a kísérlet véget ért. Az eredményeket a 39A ábrán (sóoldat és glukózamin), valamint a 39B ábrán (sóoldat és H9392 jelű anyag) tüntettük fel. Innen látható, hogy míg a kontroli-csoportban az öszszes állat elpusztult a besugárzást követő 22. napon, addig a H-9392 anyaggal kezeltek közül csak egy pusztult el a 30 ng-mal kezelt csoporban a besugárzást követő

60.704/SM

-102 30. napon. A 300 ng H-9392 és az 1 pg glukózamin kezelés mérsékelten gátolja a mortalitást a besugárzást követően.

Ezek az eredmények felvetik annak a lehetőségét, hogy a kérdéses anyagokat a rák gyógyításában lehetne hasznosítani: a sugárkezelést kísérő toxicitást ugyanis drámaian lehet csökkenteni ezekkel az anyagokkal. Elképzelhetőnek tartjuk, hogy a sugárdózist úgy lehet a hatásos szintre megemelni, hogy a toxikus mellékhatások elmaradnak. Mint a fent leírt kísérletek mutatják, a találmány szerinti vegyületek már bizonyos igen kis dózisban is igen hatásosak, még akkor is, ha a kúrát háromszori diszacharid beadásra korlátozzuk.

6.19.7. Testidegen transzplantátumok kilökődésének gátlása különböző anyagokkal

A H-9392 jelű anyagot egereken, átültetett bőrszövet kilökődésére kifejtett hatás szempotjából is megvizsgáltuk. C57BL/6 donor egerektől (H-2^b) származó bőrszövetet ültettünk át BALB/c egér recipiensekbe (H-2^d) Baharav, E. és munkatársai módszerével [J. Immunoi. Methods 90:143-144 (1986)]. Kilökődési napnak azt az időpontot tekintettük, amikor a transzplantált bőr levált. A kontroli-csoport tagjai csak sóoldatot kaptak (0,1 ml), a kezelt csoportok pedig 3 ng, ill. 300 ng H-9392 jelű anyagot kaptak szubkután injekcióban egy nappal az átültetés előtt, majd ezt követően hetenként. A 40. és 40A ábrák azt mutatják, hogy a 3 ng/egér dózis beadásával az 50%-os szöveti kilökődést 5 nappal lehet késleltetni. Ugyanakkor azt is láthatjuk, hogy ugyanez a vegyület 300 ng/egér dózisban az 50%-os kilökődési szintet illetően nem mutat szignifikáns különbséget a kontrolihoz képest. Ez az eredmény rendkívül jelentős, lévén, hogy a testidegen bőrszövettel szembeni elutasítás közismerten az egyik legerősebb immunreakció.

60.704/SM

-103 -

6.19.8. Az IDDM kialakulásának gátlása NŐD egereken találmány szerinti anyagokkal

Ismeretes, hogy a NŐD egerek hiteles modellnek tekinthetők a humán diabetes I. típusát illetően. A nálunk lévő NŐD nőstény egér tenyészetben a spontán diabétesz kb. 4-5 hónapos korra alakult ki. Minthogy a diabétesz I. típusa, vagy más néven inzulin-dependens diabetes mellitus (IDDM) az autoreaktív T-sejtek által kiváltott autoimmun betegségként ismert, a találmány szerinti kiválasztott vegyületeket megvizsgáltuk, szabályozzák-e ezt a T-sejtes közvetítéssel létrejövő autoimmun reakciót.

6-12 nőstény NŐD egérből álló csoportoknak szubkután injekcióban 0,1 ml sóoldatot (kontroll), 30 ng/egér dózisban H-9392 jelű vegyületet vagy 10,000 ng/egér dózisban glukózamint adtunk be. Minden egér 3,5 hónapos volt és mint a 41. ábra mutatja, csoportátlagban akkor már 20% volt az IDDM előfordulása. Az IDDM előfordulási gyakoriságát az egerek vércukorszintje alapján állapíthatjuk meg. A nem diabeteszes egerek átlagos vércukorszintje kb. 140 ± 10 mg/ml. Akkor tekintettük diabeteszesnek az egereket, ha a vércukorszintjük eléri vagy meghaladja a 200 mg/ml-t (azaz a „normál”-szint standard deviációjának több mint háromszorosa). A vizelet cukorszintjét egyszerűség kedvéért ClinstixTM szintjelző (Ames) segítségével mértük. Ezzel a teszttel 0 és +3 közötti pontszám lehetséges, és ha a pontszám két külön mérésnél is elérte vagy meghaladta a +2 pontot, akkor ezt pozitív indikációnak tekintettük a diabétesz megállapításához.

Meglepő módon azt találtuk, hogy míg a kontrollcsoportban 4,5 hónapos korra minden egér diabeteszes volt, addig a glukózaminnal kezelt csoportban csak kb. az egerek 65%-a, a H-9392 jelű vegyülettel kezelt csoportban pedig az egerek kevesebb mint 50%-a volt diabeteszes.

60.704/SM

-104 A 41A ábráról az is leolvasható, hogy a kontrollcsoportban lévő egerek 5 hónapos korukra mind elpusztultak diabéteszben. A 10,000 ng glukózaminnal kezelt csoportban viszont csak kb. az egerek fele pusztult el eddig az időpontig. Teljesen meglepő, hogy a 30 ng H-9392 jelű anyaggal kezelt egerek közül eddig az időpontig egy sem pusztult el; azaz a H-9392 jelű vegyület eredményei egybeesnek az X-tengellyel.

6.19.9. TNF-α hatására az endoteliális sejtek (EC) által kifejezett (expreszszált) adhéziós molekulák (ICAM-1 és ELAM-1) termelődésének gátlása a találmány szerinti vegyületekkel

Bizonyos adhéziós molekulák, mint amilyenek az ICAM-1 és ELAM-1 döntő fontosságúak a gyulladásos válaszreakcióban részt vevő leukociták felismerésében és ezt követő körforgásában (megtapadás az érfalon, majd vándorlás az érfalon átlépve). Az aktív TNF-oc hatására az endoteliális sejtek ICAM-1 és ELAM-1 molekulákat expresszálnak. A TNF-α tehát úgy fokozza a gyulladásos folyamatot, hogy felerősíti a leukociták megtapadását és migrációját megindító jelzéseket. Hogy a találmány szerinti diszacharidok hatását a TNF-α által indukált folyamatra (ICAM-1 és ELAM-1 expresszió az EC-ben) megvizsgáljuk, a következő kísérletet végeztük:

Frissen izolált emberi köldökvéna EC-t M-199 táptalajon (Gibco Laboratories) tenyésztettünk. A táptalaj 10% FCS, 8% humán szérum és antibiotikum adalékot, valamint ml-enként 50 pg endoteliális sejt növekedési faktort (EC-GM; Sigma, St. Louis, MO) tartalmazott. Az EC-tenyészetet 0,1 ml EC-GM-oldattal (3,5 x 10⁵ sejt per ml) beoltjuk laposfenekü 96-bemélyedéses lemezen (Nunk Roskilde, Dánia).

Az egybefolyt egyrétegű sejtkultúrát mossuk, majd a vizsgálatra kiválasztott diszacharidok 50 pl M-199 táptalajjal készített különböző koncentrációjú oldataival 37°C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk. Ezután a vegyületeket mosással eltávolít

60.704/SM

-105 juk és a tenyészetet előre elkészített TNF-a-oldattal (200 NE TNF-oc /1 ml EC-GM) egy éjszakán át inkubáljuk. Ezután a sejteket 1% borjú embrió szérumot tartalmazó Hank-oldattal (Hank, 1%-os) 37°C hőmérsékleten 3-szor mossuk, majd 2% glutáraldehidet tartalmazó PBS-oldattal fixáljuk. A sejteket Hank 1%-os oldattal háromszor mossuk, 2,5% BSA-t tartalmazó PBS-oldattal blokkoljuk, majd Hank 1%-os oldattal kétszer újra mossuk. A sejteket ezután anti-ICAM-1 és -ELAM-1 mAb (Genzyme, Cambridge, MA; 1/1000 hígítás PBS-sel) jelenlétében 22°C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk, majd HANK 1%-os oldattal háromszor kimossuk. A sejteket peroxidázhoz kötött goat anti-egér antitesttel (Sigma, 1/1000 hígítás) 1 órán át inkubáljuk, majd kimossuk. Egy o-fenilén-diamin-hidroklorid (OPD) tablettát (OPD egy peroxidáz szubsztrát; Sigma, katalógusszám: p9187) vízben oldunk, a tenyészethez az oldatot hozzadjuk és az abszorpciót ELISA készüléken 492 nm-nél leolvassuk. Minden mintából 3 párhuzamos vizsgálatot végeztünk és az eredményeket átlagoltuk.

60.704/SM

-106 XXIIID táblázat: Diszacharidok hatása előre elkészített TNF-α által az endoteliális sejtekben válaszreakcióként kiváltott adhéziós molekula expresszióra

EC kezelése TNF-a-val	Gátló vegyület [pg/ml]	Rekombináns humán TNF-α hatására kifejlődött adhéziós molekulák (detektálás 492-nél)*:
nincs	nincs	0,12 ±0,01	0,18 ± 0,01
van	nincs	1,2 ± 0,1	2,2 ±0,2
van	9392 [50]	0,6 ± 0,1	1,0 ± 0,04
van	9392 [100]	0,9 ± 0,07	1,4 ± 0,03
van	1020 [50]	0,7 ± 0,05	1,2 ± 0,1
van	1020 [100]	0,9 ± 0,03	1,5 ± 0,07

* ELAM-1 és ICAM-1 expresszió detektálása specifikus monoklonális antitestek kötődé sén alapuló ELISA-val

A fenti kísérletek értelmében a 9392 és 1020 jelű diszacharidokkal előkezelt EC szignifikáns rezisztenciára tesz szert az előre elkészített TNF-a-val szemben. Következésképpen a TNF-α késztetése, hogy az EC fokozott mértékben expreszszáljon adhéziós molekulákat, kb. 50%-ban gátolt. Ezek az eredmények azt is jelentik, hogy a találmány szerinti vegyületek nemcsak a TNF-α termelésért felelős sejtek (így a T-sejtek, makrofágok) működését tudják gátolni, hogy ne termeljenek aktív TNF -α-t, hanem a TNF-α célsejtjeit (pl. EC) is befolyásolni képesek, nevezetesen gátolják ezek hajlandóságát, hogy a TNF-α indukáló hatására válaszoljanak (azaz szabályozzák a citokinin perifériális recepciót). Bizonyos kóros állapotokban tehát a találmány szerinti vegyületek alkalmazásával azért lehet eredményt elérni, mert ezek

60.704/SM

-107- ..................

hozzájárulnak, hogy a TNF-α célsejtek egyfajta rezisztenciára tegyenek szert az aktivált T-sejtek és makrofágok által médiáit sejtes gyulladásos reakcióra késztetéssel szemben.

6.19.10, A H-9392 jelű anyag szupressziv hatása patkányban előidézett allergiás asztmára

Ha patkányokat először injekcióban beadott antigénnel, majd az antigén aeroszolos oldatának belélegeztetése útján provokálunk, akkor azokban azonnal allergiás bronciális asztma fejlődik ki, mint túlérzékenységi reakció. [Edelman és munkatársai: Am. Rév. Resp. Dis. 137:1033-37 (1988)]. Ennek a kísérletesen előidézett betegségnek a kórlefolyása sokban hasonló az emberben természetes körülmények között előforduló betegségéhez.

Kísérleteink során a H-9392 jelzésű anyagot teszteltük asztmás roham megelőzésére való alkalmasság szempontjából. Az antigént 6 hím Brown Norway patkánynak adtuk be a nulladik napon, a túlérzékenységet ovalbuminnal (ÓVA) szemben fejlesztve ki. Az állatok 0,9% sóoldatban szuszpendált 200 mg AI0H/ml és 1 mg ÓVA összetételű injekciót kaptak szubkután, valamint 6 χ 10⁶ elölt Bordetella pertussis baktériumot 1 ml-es oldatban (Pasteur Merieux, S.V.) intraperitoneálisan. Az ismételt provokációt a következőképpen biztosítottuk: 6 liter/perc levegő befúvással működő Devilbiss porlasztóban ÓVA 1 mg/ml-es oldatát aeroszollá alakítottuk, és azt az állatokkal 5 percen át belélegeztettük. A túlérzékenységi válaszreakcióként jelentkező légzési zavart (RD) a következőképpen pontoztuk: 0 fokozat: nincs zavar; 1. fokozat: szapora légvétel; 2. fokozat: közepesen erőltetett légzés; 3. fokozat: nehéz légzés, tátott száj; 4. fokozat: eszméletvesztés, izomgörcs. Az ismételt provokáció (belélegeztetés) a 16. napon történt az összes állat részvételével, s így kaptuk meg a pozitív kontroll eredményeit. A kiértékelést végző megfigyelő nem ismerte az

60.704/SM

-108 állatok kortörténetét. Mindegyik állat érzékeny volt az OVA-ra és mindegyikükben kifejlődött az asztma.

A 30. napon az állatokat két csoportra ossztottuk. A kontroli-csoport („A” csoport) tagjai csak sóoldatot, a kezelt csoport („B” csoport) tagjai 30 ng H-9392 jelű anyagot kaptak szubkután. A 35. napon a belélegeztetéses provokációt a fenti módon megismételtük. Az eredményeket a 42. ábra mutatja. Ebből látható, hogy azok az állatok, amelyek a 30. napon csak sóoldatot kaptak, 3. vagy 4. fokozatú légzési zavarokban szenvedtek. A H-9392 jelű anyaggal kezelt állatoknál csak szapora légvétel volt észlelhető. Tehát, ha az állat 5 nappal a második belélegeztetéses provokációt megelőzően H-9392 jelű anyagot kap, akkor a kiváltott túlérzékenység ellenére sem következik be asztmás roham.

6.20. Forgalomban kapható, heparinból leszármazhatható oligoszacharidok hatása in vitro humán PBL kísérletekben

Heparin-eredetü, kereskedelmi forgalomban lévő di- és poliszacharidok (molekulatömegük 1800 és 18000 közötti) biológiai hatását vizsgáltuk. Az eredményeket a XXIII. táblázat mutatja. Ebből kitűnik, hogy a tesztelt minták - egy kivételével - vagy hatástalanok voltak, vagy a hatásuk nem volt egyértelmű. Mint a táblázat lábjegyzetében megadtuk, akkor jeleztük azt, hogy nem egyértelmű a hatás ha a három párhuzamos vizsgálat nem ugyanazt a kvalitatív eredményt adta (a jelen leírásban közölt összes táblázatban olyan eredményt adtunk meg, mely legalább 3 teszt összevetségéből származott). (A humán PBL alkalmazásán alapuló vizsgálatoknál az egyes minták különböző egyedektől származtak.)

60.704/SM

-109 XXIII. táblázat: Heparin-eredetű, kereskedelmi forgalomban lévő diszacharidok hatása az aktív TNF-α elválasztásra humán PBL modellen

Tesztelt anyag3	Koncentráció pg/ml	Hatás a TNF-iz aktivitásra (%)	„R”-érték % x (pg/ml)'1
H 9517	b	nem egyértelmű0	-
H 8642	b	nem egyértelmű	-
H 8767	b	nem egyértelmű	-
H 0895	b	nem egyértelmű	-
H 8892	b	nincs hatás	0
H 9017	b	nincs hatás	0
H 9142	b	nem egyértelmű	-
H 9267	b	nem egyértelmű	-
H 1020	1	25% - 35%	25-35
H 9392	b	nem egyértelmű	-
MS 1,800d	e	nem egyértelmű	-
MS 2,400	e	nem egyértelmű	-
MS 3,000	e	nem egyértelmű	-
MS 3,600	e	nem egyértelmű	-
MS 4,200	e	nem egyértelmű	-
MS 4,800	e	nem egyértelmű	-
MS 5,400	e	nincs hatás	0
MS 6,000	e	nincs hatás	0
MS 9,000	e	nincs hatás	0
MS 16,000	e	nem egyértelmű	-
MS 18,000	e	nem egyértelmű	-

60.704/SM

-110 Az anyagok jelzését az 1992-es Sigma katalógusszámoknak megfelelően adtuk meg.

^b Tesztelt koncentrációtartomány: 1 pg/ml - 0,01 pg/ml.

^c Minden anyagot 3 különböző egyedből származó PBL-en teszteltünk és „nem egyértelmű” hatást akkor írtunk a táblázatba, ha a 3 mintán nem azonos ha tást (gátlás, aktivitás-fokozás vagy nincs hatás) észleltünk.

^d A különböző heparin-eredetü oligoszacharid frgamensek molekulatömegét az 1991. december 26-i Serbio katalógusnak megfelelően adtuk meg.

^e Tesztelt koncentrációtartomány: 1 pg/ml - 0,01 g/ml.

6.21. A humán PBL alkalmazásán alapuló in vivő eredmények és a monoklonális antitestre épülő kitek alkalmazásával kapott eredmények összehasonlítása

A fentiek szerint humán PBL alkalmazásávalin vitro meghatározott aktivitásadatok és a szokványos, monoklonális antitestekre épülő kitek alkalmazásával kapott eredmények összehasonlításakor azt tapasztaltuk, hogy a vizsgált közegben sokkal több protein van jelen, mint amennyit a humán PBL modellen „aktív” TNF-ként lehet detektálni. Az eredményeket a XXIV. táblázat foglalja össze. Például a kontroll esetében a T-sejtek által termelt protein mennyisége (kb. 200 pg/ml) közti különbség távolról sem olyan drámai, mint az ugyanezen mintákon humán PBL modellen kimutatott aktivitások különbsége (100% a különbség az aktivitásban). A fenti eredményekből azt a következtetést lehet levonni, hogy noha az aktivált immun-effektor sejtek szignifikáns mennyiségű TNF-proteint választanak el a találmány szerinti anyagok jelenlétében, az elválasztott proteinnek csak egy része elég aktív ahhoz, hogy a TNF-szenzitív sejteket elpusztítsa. Ez azt a feltevést támasztja alá, hogy a TNF részben aktív, részben inaktív formában termelődik.

60.704/SM

-111 XXIV. táblázat: A humán PLB-modellen kimutatott TNF-aktivitás és a monokolonális antitestekkel működő immunoassay kittel detektál protein-mennyiség összehasonlítása

Vizsgált TNF-aktivitás PBL-modellen TNF-mennyiség mAb kit

anyag	(elpusztul sejtek %-a)	alkalmazásával (pg/ml)
nincs	45	kontroll	273,9	kontroll
Fragmin
HPLC-F1	72	Augmax (60%)	284,5	Augmax (3,8%)
HPLC-F3	13,5	Inhmax (70%)	224	lnhmax (17,9%)
HPLC-F16	0	lnhmax (100%)	199	lnhmax (27%)
DECM
HPLC-F10	18	lnhmax (60%)	225	lnhmax (17,5%)
HPLC-F14	13,5	lnhmax (70%)	232	lnhmax (15%)
HPLC-F25	63	Augmax (40%)	292	Augmax (6,5%)
HPLC-F37	90	Augmax (100%)	301	Augmax (10%)

6.22. Az ECM-eredetü diszacharid előzetes szerkezet vizsgálati eredményei

A már leírt módon 20 pg ECM-eredetü diszacharidot állítottunk elő HPLC II módszerrel (23. ábra) és sómentesítéssel. Az ezt követő SAX-HPLC tisztítás után a minta 90%-nál nagyobb tisztaságú (24. ábra, A23/4 jelzésű csúcs, 23.10 perc retenciós idő). Ugyanakkor a minta proton NMR-szinképe (31. ábra) arra mutat, hogy a mintában egy ismétlődő alifás -CH₂- rész van jelen. Ennek ellenére a SAX-HPLC tisztítással kapott minta mind in vitro, mind in vivő körülmények között pozitív gátló hatású volt a tesztben.

60.704/SM

-112A proton NMR színképet nehéz vízben 500 MHz-nél 23°C hőmérsékleten vettük fel. Rögzítettük a 2-dimenziós COSY színképet is. A végső mátrix méret 512x512, N-COSY, előzetesen telített, 1536 scan (32. ábra). A cukrokra jellemző szignálok 3-5,5 ppm között észlelhetők mind az egydimenziós, mind a kétdimenziós színképben. Az anomer protonra utaló dublett 5,39 ppm-nél jelenik meg, csatolási állandó: 3 Hz (33. ábra), s ebből α-konfigurációjú glukózamin cukoregység jelenlétére lehet következtetni.

Az anomer protonra jellemző kémiai eltolódás, valamint a placenta-eredetü heparináz feltehetőleg β-glukuronid-specifikus volta arra enged következtetni, hogy a kérdéses diszacharidban a glukózamin rész a nem-redukáló végen «-konfigurációban helyezkedik el, 1-»4 kapcsolatban a redukáló végen elhelyezkedő glukuronsavval. Az, hogy 6 ppm-nél nincs szignál, arra utal, hogy a diszacharid telített (a glukózamin rész C₅ és C₄ helyzetű szénatomjai között nincs kettős kötés). Vagyis a heparináz nem „eliminázként”, hanem hidrolázként működik.

Az FT-IR színképeket Mattson Galaxy 6020 készüléken vettük fel, mely transzmissziós filmdetektorral volt felszerelve; DTGS 2 cm¹-es felbontásnál; ZnSe cella felhasználásával 128 scan. A 34. és 35. ábrák egy szulfátéit vegyület és egy részlegesen deszulfatált analógon jelenlétére utalnak. A 34. ábrán a következő abszorpciós csúcsok láthatók: 3500-3000 (karboxil- és hidroxilcsoportok), 1594 (karbonilcsoport), 1394, 1121, 1107, 1074, 994, 936 és 852 cm'¹; ezek közül legalább egy, főként az utolsó, szulfátcsoporta utal.

Ezután egy metil-származék (mely vélhetőleg legalább részben deszulfatált) tömegspektrumát vettük fel Jeol JMS Hx/110A FAB segítségével (Xenon, E = 6kV; emissziós áramerősség 10 mA; gyorsító feszültség 10 kV). A metilszármazékot az oligoszacharid minta diazometános kezelésével (savas közeg) állítottuk elő, majd etilacetáttal extraháltuk. A molekula ioncsúcs M/Z (M + M⁺) = 531. Vélhetőleg tehát a

60.704/SM

-113 metilezett származék molekulasúlya kb. 530. Az eredményt megerősítendő két különböző mátrixban éspedig 1:1 DTT:tioglicerin elegyben (36A és 36B ábra), illetve metil-nitro-benzil-alkoholban (37A és 37B ábra) felvettük a színképet. Az „A” színképek a mátrix + minta, a „B” színképek az adott mátrix spektrumai.

Ezeknek a tömegspektrumoknak alapján a metilezett (és részben deszulfatált) származék tapasztalati képlete C₁₃H₂3NO₁₇S2 (MS = 529,47).

A következőkben a 4-O-[2-dezoxi-6-O-szulfo-2-(szulfo-amino)-a-D-glukopiranozil]-(2-O-szulfo-S-D-glukopiranozid) uronsav szintézisét ismertetjük.

6.23. 4-0-[2-dezoxi-6-O-szulfo-2-(szulfo-amino)-a-D-glukopiranozil]-(2-Oszulfo-B-D-glukopiranozid)-uronsav előállítása

6.23.1. 6-O-Acetil-2-azido-3,5-di-(O-benzil)-2-dezoxi-B-D-glukopiranozil-klorid előállítása

A 2-O-tozil-1,6:3,4-dianhidro-B-D-galaktopiranózt 1,6-anhidro-p-D-glukopiranózból Cerny és munkatársai módszerével állítottuk elő [Coll. Chech. Chem. Sós. 26:2547 (1961)], majd ebből 2-O-tozil-1,6-anhidro-B-D-glukopiranózt készítettünk [Cherny és munkatársai: Coll. Chech. Chem. Soc. 30:1151 (1965)].

A kapott 2-O-tozil-1,6-anidro-B-D-glukopiranózt ezután Stanek és Cerny módszerével [Synthesis, p. 698 (1972)] 1,6:2,3-dianhidro-B-D-glukopiranózzá alakítottuk, melyből Paulsen és Slenzel módszerével [Chem. Bér. 111:2334 (1978)] acetil-2-azido-3,4-di-(O-benzil)-2-dezoxi- β-D-glukopiranozil-kloridot állítottuk elő.

6.23.2. Metil-(benzil-2-O-acetil-3-O-benzil-B- és a-L-glukopiranozid)-uronát előállítása

Stevens módszerével [Methods Carbohydr. Chem. 6:124 (1978)] D-glukózból

1,2:5,6-di-(O-izoprpilidén)-a-D-glukofuranózt készítünk, majd ebből Whistlerés Laké eljárásával [Methods Carbohydr. Chem. 6:286 (1972)] 3-O-benzil-1,2-O-izopropili

60.704/SM

-114 dén-a-D-glukofuranózt állítunk elő; az utóbbit Jacquinet és munkatársai módszerével [Carbohydr. Rés. 130:221 (1984)] alakítjuk a cím szerinti vegyületekké.

6.23.3. A 6.23.1. és a 6.23.2. példák cím szerinti vegyületeinek összekap csolása

A 6.23.1. és 6.23.2. példák cím szerinti vegyületeit Jacquinet és munkatársai módszerével [Carbohydr. Rés. 174:253 (1988)] kapcsoljuk össze. A kapott kondenzációs terméket ezután Jacquinet és társai 1984-es fenti cikke szerint O-dezacetilezzük, hidrolizáljuk, O-szulfatáljuk, redukáljuk, majd debenzilezzük. A kapott 4-O-[2-dezoxi-6-O-szulfo-2-(szulfo-amino)-a-D-glukopiranozil]-(2-O-szulfo^-D-glukopiranozidj-uronsavat ezután Rice és munkatársai SAX-HPLC módszerével tisztítjuk [Anal. Biochem. 150:325 (1985)]. A termék szerkezeti képletét a 43. ábrán adjuk meg. A vegyűlet hatása vélhetőleg megegyezik az előzőekben leírt egyéb vegyületek biológiai aktivitásával.

A szakember számára nyilvánvaló, hogy azok a készítmények és módszerek is beleértendők az oltalmi körbe, melyekre nem adtunk részletes kitanítást. A találmányt tehát nem korlátozzuk a példákra és a leíró részre, az oltali kört az igénypontok szabják meg.

Megjegyezzük még, hogy az idézett cikkek teljes tartalmát a leírás részének tekintjük.

60.704/SM

Claims (56)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Gyógyszerkészítmény az aktív TNF-α termelődésének gátlására, azzal jellemezve, hogy valamely (I) általános képletű diszacharidot vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza - ebben a képletben X₁ hidrogénatomot vagy szulfátcsoportot, X₂ hidrogénatomot vagy szulfátcsoportot, és X₃ szulfát- vagy acetilcsoportot jelent, azzal a megszorítással, hogy ha X₃ jelentése szulfátcsoport, akkor Xt és X₂ közül legalább az egyik szulfátcsoportot, illetve ha X₃ jelentése acetilcsoport, mind Χ_υ mind X₂ szulfátcsoportot jelent - valamely gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal együtt.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy diszacharidként 2-(0-szulfo)-4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-szulfo)-glukózamint tartalmaz.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy diszacharidként 4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-szulfo)-6-(O-szulfo)-glukózamint tartalmaz.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy diszacharid ként 2-(0-szulfo)-4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-szulfo)-6-(O-szulfo)-glukózamint tartalmaz.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy diszacharidként 2-(O-szulfo)-4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-acetil)-6-(O-szulfo)-glukózamint tartalmaz.
6. 6. Gyógyszerkészítmény az aktív TNF-α termelődésének fokozására, azzal jellemezve, hogy 4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-acetil)-glukózamint

   60.704/SM

   -116 - vagy gyógyászatilag elfogadható sóját valamely gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal együtt tartalmazza.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy parenterális beadásra alkalmas.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy orális beadásra alkalmas.
9. 9. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy helyi kezelésre alkalmas.
10. 10. Gyógyszerkészítmény az aktív TNF-α termelődésének gátlására, azzal jellemezve, hogy valamely N-szulfatált- vagy N-acetilezett-4-dezoxi-4-én-idurono-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza - mely vegyület, ha N-acetilezett, akkor legalább két szulfátcsoportot, ha N-szulfatált, akkor legalább egy további szulfátcsoportot tartalmaz - valamely gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal együtt.
11. 11. Gyógyszerkészítmény az aktív TNF-α termelődésének fokozására, azzal jellemezve, hogy valamely nem-szulfatát N-acetilezett 4-dezoxi-4-én-idurono-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza gyógyászatilag elfogadható vivöanyaggal együtt.
12. 12. Eljárás aktív citokininek termelődésének gátlására, azzal jellemezve, hogy a betegnek valamely (I) általános képletű diszacharidot vagy gyógyászatilag elfogadható sóját adjuk be hatásos mennyiségben - ebben a képletben Χ_ή hidrogénatomot vagy szulfátcsoportot, X₂ hidrogénatomot vagy szulfátcsoportot és X₃ szulfátvagy acetil-csoportot jelent, azzal a megszorítással, hogy ha X₃ jelentése szulfátcsoport, akkor X₁ és X₂ közül legalább az egyik szulfátcsoportot, illetve ha X₃ acetilcsoport, akkor mind Χ_υ mind X₂ szulfátcsoportot jelent.

    60.704/SM

    -117 -
13. 13. Eljárás aktív citokininek termelődésének fokozására, azzal jellemezve, hogy a betegnek 4-dezoxi-iduronsav-4-én-((z-1,4)-2-dezoxi-2-(N-acetil)-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját adjuk be hatásos mennyiségben.
14. 14. A 12. vagy 13. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vegyületet vagy gyógyászatilag elfogadható sóját naponta adagoljuk.
15. 15. A 12. vagy 13. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vegyületet vagy gyógyászatilag elfogadható sóját hetenként adagoljuk.
16. 16. A 12. vagy 13. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vegyületet vagy gyógyászatilag elfogadható sóját parenterálisan, orálisan vagy topikálisan alkalmazzuk.
17. 17. Eljárás aktív citokininek termelődésének gátlására, azzal jellemezve, hogy a betegnek a 10. igénypont szerinti gyógyszerkészítményt adjuk be hatásos mennyiségben.
18. 18. Eljárás aktív citokininek termelődésének fokozására, azzal jellemezve, hogy a betegnek a 11. igénypont szerinti gyógyszerkészítményt adjuk be hatásos mennyiségben.
19. 19. Eljárás a TNF-α nem megfelelő termelődése miatt vagy azzal összefüggésben jelentkező patológiás állapotok megelőzésére és kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként valamely N-szulfatált- vagy N-acetilezett 4-dezoxi-4-én-idurono-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját alkalmazzuk, mely hatóanyag, ha N-szulfatált, akkor legalább egy további szulfátcsoportot, ha N-acetilezett, akkor legalább két szulfátcsoportot tartalmaz.
20. 20. Eljárás a TNF -a termelődés fokozásával rendbehozható patológiás állapotok kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy

    60.704/SM

    -118 - hatóanyagként valamely nem-szulfatált N-acetilezett 4-dezoxi-4-én-idurono-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját alkalmazzuk.
21. 21. Gyógyászati eljárás valamely aktív citokinin nem megfelelő termelődése miatt vagy azzal összefüggésben jelentkező patológiás állapotok megelőzésére vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy a betegnek valamely N-szulfatált vagy N-acetilezett 4-dezoxi-4-én-idurono-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját adjuk be hatásos mennyiségben, mely vegyület, ha N-szulfatált, legalább egy további szulfátcsoportot, illetve ha N-acetilezett, legalább két szulfátcsoportot tartalmaz.
22. 22. Gyógyászati eljárás aktív citokinin termelődés fokozásával rendbehozható patológiás állapotok kezelésére, azzal jellemezve, hogy a betegnek valamely nem-szulfatált N-acetilezett 4-dezoxi-4-én-idurono-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját adjuk be hatásos mennyiségben.
23. 23. A 19. vagy 21. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 4-dezoxi-2-(O-szulfo)-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-szulfo)-glukózamint alkalmazunk.
24. 24. A 19. vagy 21. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemzve, hogy 4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-szulfo)-6-(O-szulfo)-glukózamint alkalmazunk.
25. 25. A 19. vagy 21. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 2-(O-szulfo)-4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-szulfo)-6-(0-szulfo)-glukózamint alkalmazunk.
26. 26. A 19. vagy 21. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 2-(O-szulfo)-4-dezoxi-iduronsav-4-én-(a-1,4)-2-dezoxi-2-(N-acetil)-6-(O-szulfo)-glukózamint alkalmazunk.

    60.704/SM * · · • · «

    -119 -
27. 27. A 20. vagy 22. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 4-dezoxi-iduronsav-4-én-(<z-1,4)-2-dezoxi-2-(N-acetil)-glukózamint alkalmazunk.
28. 28. A 19. vagy 21. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelt patológiás állapot valamely autoimmun betegség.
29. 29. A 19. vagy 21. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelt patológiás állapot inzulin-dependens diabetes mellitus, foggyökérhártya megbetegedés, valamely bélgyulladás, bőrbetegség, uveitis, reumás megbetegedés, krónikus gyulladás, sclerosis multiplex, lupus erythematosus, atherosclerosis, arthritis, vasculitis vagy allergia.
30. 30. A 20. vagy 22. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelt patológiás állapot neoplázia, vírusos fertőzés, bakteriális fertőzés vagy gombás fertőzés.
31. 31. A 20. vagy 22. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelt patológiás állapot bazális bőrrák, pikkelysejt (squamous) karcinóma vagy melanoma.
32. 32. A 12., 13., 17., 18., 21. vagy 22. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve,hogy a kérdéses citokinin IL-1, IL-6, IL-8 vagy TNF-α .
33. 33. Gyógyászati eljárás patológiás állapotok, így inzulin-dependens diabetes mellitus, foggyökérhártya megbetegedés, valamely bélgyullaáds, bőrbetegség, uveitis, reumás megbetegedés, krónikus gyulladás, sclerosis multiplex, lupus erythematosus, atherosclerosis, arthritis, vasculitis vagy allergia kezelésére, azzal jellemezve, hogy a betegnek valamely N-szulfatált vagy N-acetilezett 4-dezoxi-4-én-iduron-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját adjuk be hatásos menynyiségben, mely vegyület, ha N-szulfatált, akkor legalább egy további szulfátcsoportot, ha N-acetilezett, akkor legalább két szulfátcsoportot tartalmaz.

    60.704/SM

    -120 - ·· ·*····»« «· ·· • · · · · » • ··· 4 * · · *
34. 34. Gyógyszerkészítmény patológiás állapotok, így inzulin-dependens diabetes mellitus, foggyökérhártya megbetegedés, valamely bélgyulladás, bőrbetegség, uveitis, reumás megbetegedés, krónikus gyulladás, sclerosis multiplex, lupus erythematasus, atherosclerosis, arthritis, vasculitis vagy allergia kezelésére, azzal jellemezve, hogy valamely N-szulfatált vagy N-acetilezett 4-dezoxi-4-én-idurono-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza - mely vegyület, ha N-szulfatált, akkor legalább egy további szulfátcsoportot, ha N-acetilezett, akkor legalább két szulfátcsoportot tartalmaz - valamely gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal együtt.
35. 35. A 34. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy dózisegységgé alakított formában alkalmazzuk.
36. 36. Eljárás testidegen szövet kilökődésének gátlására, azzal jellemezve, hogy a kezelési alanynak valamely N-szulfatált vagy N-acetilezett 4-dezoxi-4-én-idurono-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját adjuk be hatásos mennyiségben, mely vegyület, ha N-szulfatált, akkor legalább egy további szulfátcsoportot, ha N-acetilezett, akkor legalább két szulfátcsoportot tartalmaz.
37. 37. A 36. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a testidegen szövet egy transzplantált szerv.
38. 38. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzplantált szerv átültetett szív, máj, vese vagy csontvelő.
39. 39. A 36. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a testidegen szövet átültetett bőrszövet.
40. 40. Eljárás valamely adhéziós molekula expressziójával járó patológiás folyamat gátlására, azzal jellemezve, hogy a betegnek valamely N-szulfatált vagy N-acetilezett 4-dezoxi-4-én-idurono-glukózamint vagy gyógyászatilag elfogadható sóját adjuk be hatásos mennyiségben, mely vegyület, ha N-szulfatált, akkor legalább egy

    60.704/SM ·· ···· ···· *· ·· · · · ·««· • ··· ·♦· * V • · F · ·

    -121 további szulfátcsoportot, ha N-acetilezett, akkor legalább két szulfátcsoportot tartalmaz.
41. 41. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adhéziós molekula ICAM-1 vagy ELAM-1.
42. 42. In vitro biológiai méröeljárás teszt anyagoknak az aktív TNF-α elválasztására gyakorolt hatásának kvantitatív meghatározására, azzal jellemezve, hogy humán CD4⁺ T-sejteket a teszt-anyag változó koncentrációi jelenlétében valamely táptalajon elöinkubálunk, a T-sejtek TNF-α elválasztását a teszt-anyagok jelenléte nélkül megindítani képes valamely aktivátort adunk a tenyészethez konstans mennyiségben, s megfelelő idő elteltével a tenyészetben a TNF-α aktivitását meghatározzuk.
43. 43. Gyógyszerkészítmény citokinin aktivitásának szabályására, azzal jellemezve, hogy a készítmény a citokinin aktivitás gátlásához vagy fokozásához szükséges mennyiségben tartalmaz valamely karboxilezett és/vagy szulfátéit oligoszacharidot vagy ennek gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazó anyagot, valamely gyógyászatilag elfogadható vivöanyaggal együtt, s mely oligoszacharidot tartalmazó anyag „R”-értéke zérótól eltérő értékű, ha azt az oligoszacharid tartalmú anyag 0 és 2 pg/gm egér között változó dózisaival kezelt egereken a kísérletesen előidézett DTH viszonylagos mértékét megállapító in vivő biológiai mérőeljárással határozzuk meg.
44. 44. A 43. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként olyan, a citokinin aktivitását gátló anyagot tartalmaz, melynek „R”-értéke zérótól eltérő.

    60.704/SM i

    * ·· ···· ···· 4· ·* ··· · ·»*· • ··· ··· · « • · · · ·

    -122-
45. 45. A 43. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként olyan, a citokinin aktivitását fokozó anyagot tartalmaz, melynek „R”-értéke zérótól eltérő.
46. 46. A 43., 44. vagy 45. igénypontok szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy oligoszacharidként valamely diszacharidot tartalmaz.
47. 47. A 43., 44. vagy 45. igénypontok szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy oligoszacharidként karboxilezett diszacharidot tartalmaz.
48. 48. A 43. vagy 44. igénypontok szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy oligoszacharidként karboxilezett és szulfátéit diszacharidot tartalmaz.
49. 49. A 45. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy oligoszacharidként karboxilezett, nem-szulfatált diszacharidot tartalmaz.
50. 50. A 43., 44. vagy 45. igénypontok szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a szabályozni kívánt citokinin IL-1, IL-6, IL-8 vagy TNF-a.
51. 51. A 46. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a szabályozni kívánt citokinin a TNF-a.
52. 52. A (II) képletű vegyület és gyógyászatilag elfogadható sói.
53. 53. Gyógyszerkészítmény az aktív TNF-α termelődésének gátlására, azzal jellemezve, hogy (II) képletű diszacharidot vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza.
54. 54. Eljárás aktív citokininek termelődésének gátlására, azzal jellemezve, hogy a betegnek az 52. igénypont szerinti vegyületet adjuk be hatásos mennyiségben.
55. 55. Eljárás a TNF-α nem megfelelő termelődése miatt vagy azzal összefüggésben jelentkező patológiás állapotok megelőzésére és kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az 52. igénypont szerinti vegyületet alkalmazzuk.

    60.704/SM

    -123 - ,·· ···· ···· ,··, . .·· ·»· · · f · · · · ···· ··· ··· ···· ·*·*
56. 56. Eljárás a TNF-α gátolt működése miatt fellépő patológiás állapotok kezlésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az 52. igénypont szerinti vegyületet alkalmazzuk.