HRP931389A2

HRP931389A2 - Compositions for the regulation of cytokine activity

Info

Publication number: HRP931389A2
Application number: HR931389A
Authority: HR
Inventors: Irun R Cohen; Ofer Lider; Liora Cahalon; Oded Shoseyov; Raanan Margalit
Original assignee: Cohen, Irun R.; Ofer Lider; Liora Cahalon; Oded Shoseyov; Raanan Margalit
Priority date: 1992-11-10
Filing date: 1993-11-10
Publication date: 1995-04-30
Also published as: CN1093904A; EP0669827B1; FI952267A0; DE69334102D1; DE69330252D1; IL107563A; YU71393A; HUT70945A; HU9501373D0; AU699624B2; CA2149116A1; EP1095657A3; DE69330252T2; EP1095657B1; AU5599394A; EP1095657A2; FI952267A; NO951822L; ATE201327T1; DE69334102T2

Description

Reference prijava u vezi sa sadašnjom prijavom

Sadašnji izum je CIP prijave U.S. No. 08/096,739 podnijete 23. VII 1993., koja je CIP prijave U.S. No. 07/974,750, podnijete 10. IX 1992., koja je opet CIP prijave U.S. No. 07/878,188 podnijete 1. V 1992., čija su kompletna otkrića pomoću referenci uključena u ovu prijavu.

Područje izuma

Sadašnji izum se odnosi na supstancije, njihove preparate i metode za regulaciju djelovanja citokina, na primjer, regulaciju "naviše" i "naniže" djelovanja faktora tumorske nekroze alfa (TNF-α). Posebno su opisane supstance i farmaceutski prihvatljivi preparati koji, kad se daju domaćinu u efektivnim količinama, ili inhibiraju ili povećavaju staničnu sekreciju aktivnog TNF-α. Smatra se da sekrecija aktivnih citokina, na primjer TNF-α, koju vrše domaćinove imunološke efektivne stanice (npr., domaćinovi aktivirani makrofazi), mogu se regulirati metodama sadašnjeg izuma.

Sadašnji izum se također odnosi na metode za prevenciju i/ili tretman patoloških procesa ili, obrnuto - iniciranje djelotvornog odgovora imuno-sustava koje uključuje indukciju stvaranja, sekrecije i/ili: djelovanja citokina. Izabrani preparati sadašnjeg izuma sadrže efektivnu malu dozu heparina male molekularne težine (LMWH, od engl. low molecular weight heparin) za davanje u intervalima od 5-8 dana. Drugi preparati iz sadašnjeg izuma uključuju supstancije koje sadrže karboksilirane i/ili sulfatne oligosaharide u bitno pročišćenom obliku, dobivenom iz različitih primarnih izvora kao što su kromatografska separacija i pročišćavanje LMWH, enzimski razložen heparin i enzimski razložen vanstanični matriks (DECM, od engl. degraded extracellular matrix).

Supstancije, preparati koji ih sadrže i farmaceutski preparati posebno prilagođeni za parenteralno, oralno ili lokalno davanje, pojedinačno inhibiraju ili pojačavaju sekreciju TNF-α, stabilizirajući T stanice i/ili makrofage in vitro, kao odgovor na aktiviranje pomoću aktivatora imunološke efektorske stanice, koji uključuju, između ostalih, antigene specifične za T stanice, mitogene T stanica, aktivatore makrofaga, rezidualni vanstanični matriks (RECM, od engl. residual extracellular matrix), fibronektin, laminin ili slično. Podaci in vivo, koji pokazuju inhibiciju eksperimentalne kasne preosjetljivosti (DTH, od engl. delayed type hypersensitivity), također su prikazani kao potvrda rezultatima in vitro.

Stanje tehnike

Faktor alfa tumorske nekroze

TNF-α, citokin koji stvaraju monociti (makrofazi) i T limfociti, je središnji element u kaskadi faktora koji proizvode upalni odgovor i, kao glavni upravljač bolesnih stanja, ima mnogo plejotropnih efekata (Beutler, B. and Cerami, A., Ann. Rev. Imunnol. (1989) 7:625-655).

Biološki efekti TNF-α ovise o njegovoj koncentraciji i mjestu stvaranja: pri niskim koncentracijama, TNF-α može imati poželjne homeostatske funkcije i obrambene funkcije, ali pri visokim koncentracijama, sistematski ili u određenim tkivima, TNF-α može sinergizirati sa drugim citokinima, naročito s interleukinom-1 (IL-1), da pojača mnoge upalne odgovore.

Pokazano je da TNF-α (zajedno sa IL-1) inducira sljedeće aktivnosti: groznicu, sporovalno spavanje, hemodinamički šok, povećano stvaranje proteina akutne faze, smanjeno stvaranje albumina, aktivaciju vaskularnih endotelnih stanica, povećanu ekspresiju molekula glavnog histokompatibilnog kompleksa (MHC, od engl. major histocompatibility complex), smanjenu lipoproteinsku lipazu, smanjeni citohrom P450, smanjene cink i željezo iz plazme, proliferaciju fibroblasta, povećanje kolagenaze sinovijalnih stanica, povećanu aktivnost ciklo-oksigenaze, aktivaciju T stanica i B stanica, indukciju sekrecije citokina - samog TNF-α, IL-1, IL-6 i IL-8. Zaista, proučavanja su pokazala da su fiziološki efekti ovih citokina međusobno povezani (Philip, R. i Epstein, L. B., Nature (1986) 323 (6083): 86-89; Wallach, D. et al., J. Immunol. (1988) 140(9): 2994-2999).

Kako TNF-α pokazuje svoje efekte ne zna se detaljno, ali za mnoge se misli da su povezani sa sposobnošću TNF-α da stimulira stanice da stvaraju prostaglandine i leukotriene iz arahinske kiseline stanične membrane.

TNF-α, zbog svojih plejotropnih efekata, sudjeluje u nizu patoloških stanja u raznim organima u tijelu. U krvnim sudovima, TNF-α potpomaže hemoragični šok, regulira "naniže" trombomodulin endotelnih stanica i pojačava prokoagulantnu aktivnost. On uzrokuje adheziju leukocita i trombocita za zidove krvnih sudova i na taj način potpomaže procese koji vode u aterosklerozu i vaskulitis.

TNF-α aktivira krvne stanice i uzrokuje adheziju neutrofila, eozinofila, monocita/makrofaga, kao i T i B limfocita. Inducirajući IL-6 i IL-8, TNF-α pojačava hemotaksiju upalnih stanica i njihovu penetraciju u tkiva. Prema tome, TNF-α ima ulogu u oštećivanju tkiva u autoimunim oboljenjima, alergijama i odbacivanju transplantata.

TNF-α također zovu kahektin zato što modulira metaboličke aktivnosti adipocita i pridonosi iscrpljivanju i kaheksiji koja prati rak, kronične infekcije, kroničnu srčanu insuficijenciju i kronične upalne procese. TNF-α može igrati ulogu i u anorexia nervosa inhibirajući apetit i istodobno povećavajući gubitak masnog tkiva.

TNF-α ima metaboličke efekte na mišiće kostura i srca. Ima također vidne efekte na jetru: snižava nivo metabolizma albumina i citohroma P450 i povećava stvaranje fibrinogena, 1-kiselog glikoproteina i drugih proteina akutne faze. Može izazvati i nekrozu mjehura.

U centralnom nervnom sustavu, TNF-α prelazi krvno-moždanu barijeru i inducira groznicu, spavanje i anoreksiju. Povećana koncentracija TNF-α je povezana sa sklerozom multipleks. Zatim, on izaziva adrenalno krvarenje, utječe na stvaranje steroidnih hormona, pojačava aktivnost kolagenaze i PGE-2 u koži i uzrokuje lomljenje kostiju i hrskavice aktivirajući osteoklaste.

Ukratko, TNF-α je umiješan u patogenezu mnogih nepoželjnih upalnih stanja u autoimunim oboljenjima, odbacivanja transplantata, vaskulitisa i ateroskleroze. Moguće je da ima udjela u srčanoj insuficijenciji i u odgovoru na rak. Zbog ovih razloga, traženi su načini da se regulira stvaranje, sekrecija i dostupnost aktivnih formi TNF-α da bi se kontrolirao niz oboljenja.

Primarna funkcija imunološkog sustava je da zaštiti pojedinca od infekcija izazvanih stranim napadačima kao što su mikroorganizmi. Međutim, on može napasti vlastita tkiva pojedinca izazivajući patološka stanja poznata kao autoimuna oboljenja. Agresivne reakcije imunološkog sustava pojedinca na tkiva drugog pojedinca su razlozi koji leže u osnovi neželjenog odbacivanja transplantiranih organa. Hiperreaktivnost sustava na strane supstancije izaziva alergiju sa simptomima kao što su astma, rinitis i ekcem.

Stanice koje upravljaju ovim reakcijama su limfociti, prvenstveno aktivirani T limfociti, i patološki upalni odgovor koji one usmjeravaju ovisi od njihove sposobnosti da se kreću kroz zidove krvnih sudova do i od tkiva koja su im mete. Prema tome, smanjivanjem sposobnosti limfocita za adheziju i penetraciju kroz zidove krvnih sudova, može se spriječiti autoimuni napad, odbacivanje transplantata i alergija. Ovo bi predstavljalo nov terapeutski princip, s izgledima da rezultira u većoj efikasnosti i smanjenim nepoželjnim reakcijama u usporedbi s terapijama koje se danas koriste.

Ateroskleroza i vaskulitis su primjeri kroničnih i akutnih patoloških upala krvnih sudova. Ateroskleroza uključuje zadebljavanje i skrućivanje unutrašnjosti arterija, što vodi u koronarna oboljenja, infarkt miokarda, cerebralni infarkt, oboljenja perifernih krvnih sudova i predstavlja glavni uzrok morbiditeta i mortaliteta u zapadnom svijetu. Patološki, ateroskleroza se razvija polako i kronično, kao oštećenje izazvano masnim i vapnenastim naslagama. Proliferacija fibroznih tkiva vodi konačno do akutnog stanja začepljavajući lumen krvnog suda.

Pokazano je da TNF-α olakšava i pojačava replikaciju HIV virusa in vitro (Matsuyama, T. et al., J. Virol. (1989) 63 (6): 2504-2509; Michihiko, S. et al., Lancet (1989) 1(8648): 1206-1207) i da stimulira ekspresiju gena HIV-1, čime, vjerojatno uključuje razvoj kliničkog AIDS-a u pojedincima latentno zaraženim HIV-1 (Okamoto, T. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses (1989) 5(2): 131-138).

Stoga je TNF-α, kao i upalni odgovor čiji je on dio, mač s dvije oštrice. Možda se razumijevanjem njegove fiziološke funkcije može bolje shvatiti smisao upale u cjelini i steći uvid u okolnosti pod kojima se javlja nedostatak i višak TNF-α. Možda je ovim približen put kako najbolje isplanirati racionalan i specifičan terapeutski pristup oboljenjima koja uključuju stvaranje ovog hormona.

Heparin

Heparin je glikozaminoglikan, polianionski sulfatirani polisaharid, koji se klinički koristi u sprečavanju zgrušavanja krvi kao antitrombotičko sredstvo. U životinjskim modelima je pokazano da heparin reducira sposobnost autoimunih T limfocita da dopru do organa koji im je meta (Lider, O. et al., Eur. J. Immunol. (1990) 20: 493-499). Također je pokazano da heparin potiskuje eksperimentalna autoimuna oboljenja u štakorima i produžava opstanak alografta u modelu transplantacije kože na miševima, kad se ubrizgava jednom dnevno u malim dozama (5 μg za miševe i 20 μg za štakore) (Lider, O. et al., J. Clin. Invest. (1989) 83: 752-756).

Smatra se da mehanizmi koji leže u osnovi promatranih efekata uključuju inhibiciju oslobađanja enzima, neophodnog za penetraciju zidova krvnih sudova, iz T limfocita, prvenstveno enzima heparanaze koja specifično napada glikozaminoglikanski dio subendotelnog izvanstaničnog matriksa (ECM) duž krvnih sudova (Naparstek, Y. et al., Nature (1984) 310: 241-243). Ekspresija enzima heparanaze je povezana sa sposobnošću autoimunih T limfocita da penetriraju kroz zidove krvnih sudova i da napadaju mozak u modelu oboljenja eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa (EAE).

Europska patentna prijava EP 0114589 (Folkman et al.) opisuje preparat za inhibiranje angiogeneze kod sisara, u kojem se aktivno sredstvo sastoji u biti od (1) heparina ili fragmenta heparina koji je heksasaharid ili veći i od (2) kortizona ili hidrokortizona ili 11-α izomera hidrokortizona. Prema opisu, sam heparin ili sam kortizon nisu efektivni; jedino njihova kombinacija daje željene efekte. Mada u literaturi nema dokaza o postojanju veze između angiogeneze i autoimunih oboljenja, opis na stranici 5 patentne prijave povezuje angiogenezu s psorijazom i artritisom, ukazujući na korištenje velikih doza od 25000-47000 jedinica heparina na dan (tj., oko 160-310 mg na dan).

Horvath, J. E. et al., u Aust. N.Z.J. Med. (1975) 5(6): 537-539, opisuje efekt subantikoagulantnih doza subkutanog heparina na ranu renalnu funkciju alografta. Dnevna doza je velika (5000 U (od engl. unit - jedinica) ili oko 33 mg) i zaključak proučavanja je da heparin u subantikoagulantnim dozama nema efekta na ranu funkciju ni na opstanak transplantata i da to može biti povezano sa povećanim hemoragičnim komplikacijama.

Toivanen, M. L. et al., Meth. and Find. Exp. Clin. Pharmacol. (1982) 4(6): 359-363, je proučio efekt velikih doza heparina (1000 j. ili oko 7 mg po štakoru) u inhibiranju adjuvantnog artritisa kod štakora i našao da heparin pojačava ozbiljnost bolesti.

PCT patent: prijava PCT/AU88/00017, objavljena pod brojem WO88/05301 (Parish et al.), opisuje sulfatirane polisaharide koji blokiraju ili inhibiraju aktivnost endoglikozilaze, kao što je heparanaza, za upotrebu kao antimetastatičkih i antiinflamatornih sredstava. Pokazano je da heparin i njegovi derivati, kao što su heparini oksidirani perjodatom, reducirani heparini, koji su imali zanemarivu antikoagulantnu aktivnost, imaju antimetastatičku i antiinflamatornu aktivnost kad se koriste u dozama u okviru opsega 1,6-6,6 mg po štakoru na dan, davanjem neprekidnom infuzijom (ovo odgovara 75-308 mg po odraslom humanom pacijentu na dan).

Heparin i heparan sulfat su blisko povezani s makromolekulama glikozaminoglikana. Proizvodi raspadanja ovih polimernih makromolekula, koji se nazivaju heparini male molekularne težine (LMWH), mogu imati iste ili veće farmakološke efekte na sistem zgrušavanja krvi od svojih roditeljskih makromolekula. Nadalje, kako postoji opsežna, ali nekompletna postsintetička obrada polimerovih osnovnih disaharidnih jedinica, glukuronske kiseline i N-acetilglukozamina, LMWH će biti heterogena smjesa ne samo po veličini, nego i po kemijskom sastavu (vidjeti Goodman-ovu i Gilman-ovu knjigu The Pharmacological Basis of Therapeutics, osmo izdanje, (Pergamon Press, New York, 1990), str. 1313-1315). Metode da se iz heparina dobiju proizvodi malih molekularnih težina, koje su korisne kao antikoagulanti, opisani su u struci. Cilj ovih metoda je da se optimizira istrajnost in vivo ili opseg hemoragičnih pratećih efekata njihovih proizvoda (vidjeti, na primjer, Alpino, R. R. , et al., U. S. Patent No. 5 010 063; Choay, J., et al., U. S. Patent No. 4 990 502; Lopez, L. L., et al., U. S. Patent No. 4 981 955). Drugi saopćavaju upotrebu kromatografskih metoda za dobivanje proizvoda malih molekularnih težina (vidjeti, na primjer, Rosenberg, R. D., et al., U. S. Patent No. 4 539 398 i Jordan, R. E., et al., U. S. Patent No. 4 446 314).

P. Psuja je, kao što je objavljeno u Folio Haematol. (Leipz), (1987) 114: 429-436, proučavao efekt heterogenosti heparina na njihove reakcije sa staničnim površinama. Psuja je objavio da postoje receptori umjerenog afiniteta za LMWH (Dd=5,6 μM) , nađeni na kultiviranim endotelnim stanicama, ali je odredio da je gornja granica frakcije LMWH vezane za ove receptore manja od 1% od ukupnih LMWH.

Drugi istraživači su prikazali efekte LMWH na metabolizam raznih tipova kultiviranih stanica. Asselot-Chapel, C., et al., u Biochem. Pharmacol. (1989) 38: 895-899 i u Biochem. Biophys. Acta, (1989) 993: 240-244, izvješćuju da, u kulturama stanica glatkih mišića, LMWH izazivaju smanjenje odnosa kolagena tipa III prema tipu I i smanjenje sinteze fibronektina. R. Rappaport, u U. S. Patent No. 4 889 808, saopćuje da LMWH može izazvati humane diploidne plućne fibroblaste, uzgajane u kulturi bez seruma, da odgovore na LMWH povećanim lučenjem tkivnog aktivatora plazminogena i srodnih proteina.

Objavljeni su efekti LMWH na kompleksne višestanične sustave. Rad Folkman-a i suradnika i Lider-a i suradnika, u EPO prijavi 0114589 i J. Clin. Invest. (1989) 83: 752-756, je spomenut gore. Pored toga, N. Diferrante, u objavljenoj Međunarodnoj prijavi WO 90/03791, saopćuje da se LMWH može koristiti za inhibiranje reprodukcije HIV u kulturama C8166 transformiranih humanih limfocita (ALL). Međutim, nijedan raniji eksperiment, od onih koji su se bavili efektima LMWH na stanični metabolizam, nije uzimao u obzir da heterogenost LMWH može izazvati antagonističke efekte. Štoviše, nitko nije pokazao ni predložio regulatorni efekt na aktivnost citokina baziran na korištenju bitno čistih oligosaharidnih supstancija.

Sažetak izuma

U sadašnjem izumu, opisane su supstancije koje su u stanju regulirati aktivnost citokina u subjektu sisavaca i koje se sastoje od karboksilnih i/ili sulfatiranih oligosaharida u bitno pročišćenom obliku. Posebno, supstancija pokazuje dosljednu inhibitornu "R" vrijednost od približno 200000% x (μg/g)-1 ili veću, kao što je određeno pomoću biološke probe (bioeseja) in vivo, koja mjeri relativno inhibiranje eksperimentalnih DTH reakcija u miševima koji su tretirani različitim dozama dane supstance u opsegu od 0-2 μg/g t. tež. miša; ili dosljednu augmentativnu "R" vrijednost od približno 0,03% x (pg/ml)-1 ili veću, kao što je određeno pomoću biološke probe in vitro, koja mjeri relativnu aktivnost TNF-α koji izlučuju aktivirane CD4+ T stanice u prisustvu različitih koncentracija date supstance od 0 do približno 1 x 107 pg/ml. Poželjne supstance pokazuju in vivo inhibitorne "R" vrijednosti odabrane iz skupine koja sadrži 300000, 400000, 500000 i 600000% x (μg/g)-1 ili više.

Nadalje, supstancije iz sadašnjeg izuma, koje imaju ihnibitorski utjecaj na sekreciju aktivnog TNF-α, mogu dodatno pokazivati konzistentnu inhibitornu "R" vrijednost od najmanje, približno, 0,4% x (pg/ml)-1 kao što je određeno pomoću biološke probe in vitro, koja mjeri relativnu aktivnost TNF-α koji izlučuju aktivirane CD4+ T stanice u prisustvu različitih koncentracija dane supstance od 0 do približno 1 x 107 pg/ml.

U jednom aspektu sadašnjeg izuma, ugljikovodik ili oligosaharid ima molekularnu težinu od najviše približno 3000 daltona, poželjno u opsegu od približno 400-2000 daltona, a najpoželjnije između približno 400 i 1100 daltona. Općenito, supstancije iz sadašnjeg izuma, koje inhibiraju aktivnost TNF-α, kao što je određeno biološkim probama (detaljnije opisanim niže), sadrže molekule različitih jedinica šećera, od kojih je glavna jedinica aktivnosti vezana uz disaharid. Međutim, veći lanci oligosaharida dužine do približno 10 jedinica, koji sadrže osnovnu disaharidnu jedinicu, također mogu inhibirati aktivnost TNF-α. S druge strane, supstancije sadašnjeg izuma, koje imaju ulogu u pojačavanju aktivnosti TNF-α, općenito se dijele na dva tipa: (i) supstancije relativno veće molekularne težine koje su agregati molekula male molekularne težine i koje u neagregiranom stanju pokazuju inhibitornu aktivnost i (ii) di- i monosaharidne podjedinice koje su izgubile sulfatne skupine (tj. koje su prošle kroz barem djelomično desulfatiranje).

Poslije pročišćavanja, ove supstancije, ili preparati koji ih sadrže, su bitno oslobođene od drugih supstancija koje pokazuju antagonistički efekt. Prema tome, supstancija s inhibitornom ulogom (regulacija "naniže") u bitno pročišćenom obliku bit će oslobođena ne samo od drugih supstancija uopće, nego od drugih supstancija koje pokazuju pojačanje ili koje usporavaju inhibitorsku aktivnost regulatora "naniže". Situacija će, naravno, biti obrnuta u slučaju augmentativne supstancije (tj. regulatora "naviše"), u kojem je supstancija bitno oslobođena od drugih supstancija, posebno onih koje reguliraju "naniže", odnosno, antagoniziraju augmentaciju.

Izraz "regulatorski efekt" uključuje regulacije i naviše i naniže bilo kojeg procesa koji utječe na dostupnost ili rezultirajuću aktivnost citokina in vivo ili in vitro uopće, uključujući IL-1, IL-6, IL-8 i posebno TNF-α. Prema tome, preparati iz sadašnjeg izuma mogu ispoljavati regulatorski efekt na domaćinovo stvaranje TNF-α, na domaćinovu sekreciju TNF-α, na vanstaničnu dostupnost TNF-α ili na aktivne oblike TNF-α u domaćinu. Na primjer, ali ne ograničavajući se teorijom, sadašnji izum može objelodaniti izlučivanje supstancije kao što je protein koji se može vezati za TNF-α, da mu promijeni konformaciju i dosljedno tome, utjecati na njihovu biološku aktivnost. Moguće je i da se preparati iz sadašnjeg izuma, nakon penetracije u aktivirane T stanice ili makrofage, vežu za određene oligonukleotidne sekvence i na taj način utječu na transkripcijske ili translacijske procese koji na kraju mijenjaju sintezu proteina. Preparati mogu također raditi preko vezivanja za receptore na staničnoj površini.

Da bi se pojednostavila sljedeća diskusija, pozivat će se, između ostalog, na "sekreciju aktivnog TNF-α" ili "regulaciju aktivnosti TNF-α" podrazumijevajući mnogo šire značenje ovih izraza koje obuhvaća cijeli mehanizam, odnosno pravi način na koji supstancije i preparati iz sadašnjeg izuma utječu na uočeno pojačavanje ili inhibiciju aktivnosti TNF-α.

Supstancije iz sadašnjeg izuma sadrže karboksilnu i/ili sulfatiranu oligosaharidnu skupinu koja se može dobiti iz prirodnih izvora, uključujući žive organizme. Na primjer, aktivne supstancije su izolirane i pročišćene iz frakcija heparina male molekularne težine (LMWH), kao i iz vanstaničnih matriksa koji su razgrađeni djelovanjem enzima, npr. heparanaze iz životinja (sisavaca) ili mikroorganizama (bakterija). Još jedan izvor aktivne supstancije je heparin obrađen enzimom (npr., heparin razgrađen endoglikozilazom).

Prema tome, izraz "bitno pročišćen oblik" označava da su izvršeni koraci da se otklone neaktivne komponente ili komponente sa suprotnim efektom, od oligosaharidnih supstancija i da se izolira aktivna skupina ili skupine iz smjesa ili supernatanata, kao što su oni dobiveni enzimskom razgradnjom. Konkretno, supstancije iz sadašnjeg izuma su dobivene rigoroznim kromatografskim procesom, u kojem je kromatografija na niskom pritisku s isključivanjem čestica po veličini (tj. kromatografija na Sephadex kolonama) samo početni korak u shemi pročišćavanja. Poslije separacije na niskom pritisku, tehnike tekuće kromatografije pod visokim pritiskom (HPLC, od engl. high pressure liquid chromatography) su korištene za izoliranje pojedinih oligosaharidnih komponenti. Poželjno, ovi koraci su rezultirali u pročišćavanju pojedinačnih aktivnih supstancija do bitne homogenosti.

Takav poželjan korak u pročišćavanju može sadržavati, na primjer, provlačenje smjesa s aktivnim supstancijama (tj. frakcije dobivene pomoću gel kromatografije na niskom pritisku) kroz gel HPLC ili jake anjono-izmjenjivačke (SAX, od engl. strong anion exchange) HPLC stupce. Prema tome, proučene su i izolirane supstancije koje sadrže oligosaharide izabrane iz skupine koja se sastoji od di-, tri-, tetra-, penta- ili heksasaharida, poželjno disaharida. Oligosaharidi iz sadašnjeg izuma su karboksilni i/ili sulfatirani i konzekventno, naelektrizirani su negativno.

Posebni aspekti izuma primarno uključuju disaharide s tri negativno naelektrizirane grupe. Oni koji pokazuju specifično inhibitorsko djelovanje imaju molekularne težine u opsegu od približno 400-2000, poželjno, oko 400-1100.

Sadašnji izum također osigurava biološki test za kvantitativno određivanje efekta supstancije koja se testira na sekreciju aktivnog TNF-α. Biološki test uključuje stupnjeve preinkubiranja humanih CD4+ T stanica u mediju s različitim koncentracijama supstancije koja se testira, dodavanja konstantne količine aktivatora, efektivne da izazove sekreciju TNF-α koju vrše T stanice u odsustvu spomenute supstancije koja se testira, skupljanja medija poslije određenog vremenskog perioda i zatim testiranja aktivnosti TNF-α u mediju. Poželjno, humane CD4+ T stanice se dobivaju iz perifernih krvnih mononuklearnih leukocita (PBL, od engl. peripheral blood leukocytes). Pogodni aktivatori imunoloških efektornih stanica uključuju, ali nisu ograničeni na njih, antigene specifične za T stanice, mitogene, aktivatore makrofaga, rezidualni vanstanični matriks (RECM, definiran u odjeljku 4), laminin, fibronektin i slično.

Sadašnji izum se oslanja na specifičnu regulatornu aktivnost pojedinih supstancija, kao što je određeno biološkim probama in vitro i in vivo, detaljnije opisanim kasnije. Ukratko, supstancije korisne u sadašnjem izumu pokazuju regulatornu aktivnost (bilo inhibitornu ili augmentativnu) koja se odnosi na induciranje sekrecije aktivnog TNF-α, koja je ovisna o dozi. Preciznije, ovisnost inhibicije ili augmentacije u postocima o dozi (npr., pg/ml supstance) je krivulja zvonastog oblika, čiji je maksimum (Inhmax ili Augmax) očigledan. Prema tome, za svaku točku na takvom grafikonu može se izračunati odnos inhibicija ili augmentacija u postocima/koncentracija ili doza. U sadašnjem slučaju, "specifična regulatorna aktivnost" ili "R" vrijednost može se dobiti iz odnosa maksimalne inhibicije (augmentacije) u postocima (tj. Inhmax ili Augmax) i koncentracije ili doze testirane supstancije u pitanju. Štoviše, "R" vrijednost se može dobiti za svaki biološki test. Prema tome, "R" vrijednost se može odrediti iz testa na stanicama slezene miša in vitro, testa na slezeni miša ex vivo, testa na humanim PBL in vitro i testa in vivo zasnovanoj na eksperimentalnoj DTH reakciji. Ako se ne vidi nikakav efekt, dodjeljuje se nula za "R" vrijednost.

Drugi predmet sadašnjeg izuma je metoda koja regulira aktivnost citokina u subjektu sisavaca koja se sastoji od davanja danom subjektu količine supstancije efektivne za inhibiranje ili pojačanje aktivnosti citokina u danom subjektu, pri čemu dana supstancija sadrži karboksilni i/ili sulfatirani oligosaharid u bitno pročišćenom obliku i pokazuje dosljednu: (a) ne-nultu inhibitorsku "R" vrijednost kao što je određeno (i) biološkim testom in vitro koji mjeri relativnu aktivnost TNF-α koji izlučuju aktivirane CD4+ T stanice u prisustvu različitih koncentracija dane supstancije od 0 do približno 1 x 107 pg/ml i/ili (ii) biološkim testom in vivo koji mjeri relativnu inhibiciju eksperimetnalne DTH reakcije u miševima koji su tretirani različitim dozama dane supstancije u opsegu od približno 0-2 μg/g miša; ili (b) ne-nultu augmentativnu "R" vrijednost kao što je određeno biološkim testom in vitro koji mjeri relativnu aktivnost TNF-α koji izlučuju aktivirane CD4+ T stanice u prisustvu različitih koncentracija dane supstancije od 0 do približno 1 x 107 pg/ml.

Još jedan predmet sadašnjeg izuma je metoda korištenja aktivne supstancije za dobivanje farmaceutskih preparata korisnih u tretiranju domaćina, koji se sastoji od kombiniranja supstancije sa farmaceutski prihvatljivim nosačem da osigura jediničnu dozu, poželjno malu, koja ima efektivnu količinu supstancije. Farmaceutski preparat može sadržavati i stabilizirajuće sredstvo, na primjer, protamin, u količini dovoljnoj da očuva znatan, ako ne bitni, dio početne aktivnosti supstancije u dužem razdoblju, npr., približno 100% duže od 3 dana. Na temperaturama uskladištenja nižim od sobne temperature, npr., od oko -10 do oko , poželjno , sačuva se veći dio početne aktivnosti i do 4 mjeseca.

Kako su farmaceutski preparati iz sadašnjeg izuma predviđeni za davanje ljudima, poželjno je da budu sterilni. Sterilizacija se postiže bilo kojim sredstvom dobro poznatim običnim stručnjacima, uključujući korištenje sterilnih sastojaka, sterilizaciju toplinom ili prolaženje preparata kroz sterilni filter.

Također bi trebalo biti očigledno da je primarni predmet sadašnjeg izuma osiguravanje metoda za tretiranje domaćina kao što je subjekt sisavca, koji pati od bolesti, na čiju ozbiljnost može utjecati aktivnost citokina u domaćinu. Metoda se sastoji od davanja takvom domaćinu aktivne supstancije koja sadrži oligosaharide iz sadašnjeg izuma u bitno pročišćenom obliku ili od nje dobivenih farmaceutskih preparata. Ovisno o bolesti pojedinačnog domaćina, mogu se dati supstancije ili preparati koji smanjuju dostupnost ili aktivnost TNF-α ili, naprotiv, koji pojačavaju indukciju TNF-α ili amplificiraju njegovu aktivnost. Takvi farmaceutski preparati mogu se dati u malim dozama i u intervalima od najviše oko 5-8 dana, poželjno, jednom tjedno. Farmaceutski preparati koji sadrže oligosaharidne supstancije (npr., mono-, di-, tri- ili tetrasaharidne, poželjno s disaharidom) za parenteralno, oralno ili lokalno davanje, mogu se davati dnevno u skladu s okolnostima i efektivnošću, u dozama koje običan stručnjak lako određuje rutinskom probom.

Sadašnji izum se također odnosi na farmaceutske preparate za sprečavanje i/ili tretiranje patoloških procesa koji uključuju induciranje sekrecije aktivnog TNF-α. Ovi preparati sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač i LMWH, u maloj efektivnoj dozi za davanje u intervalima od najviše 5-8 dana, koji je sposoban inhibirati sekreciju aktivnog TNF-α in vitro zaustavljajući odgovor T stanica i/ili makrofaga na antigene specifične za T stanice, mitogene, aktivatora makrofaga, rezidualni izvanstanični matriks (RECM), laminin, fibronektin i slično.

U posebnom aspektu sadašnjeg izuma, LMWH iz farmaceutskog preparata ima prosječnu molekularnu težinu od približno 3000-6000 i štoviše, može se davati svakog petog ili sedmog dana.

Cilj sadašnjeg izuma je i da osigura farmaceutski preparat za davanje u intervalima od najviše 5-8 dana za sprečavanje i/ili tretiranje patoloških procesa koji uključuju induciranje sekrecije aktivnog TNF-α. Ovi preparati sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač i LMWH u maloj efektivnoj dozi.

Aktivne supstancije i preparati iz sadašnjeg izuma su sposobni inhibirati reakcije eksperimentalne kasne preosjetljivosti (DTH) na primijenjeni antigen, kao što je dokazano smanjenjem otvrdnjavanja, uočenim poslije primjene antigena na kožu, približno 5-7 dana po davanju supstancije ili odgovarajućeg farmaceutskog preparata, u odnosu na otvrdnjavanje uočeno poslije primjene antigena na kožu u odsustvu ili poslije oporavka od davanja supstancije ili odgovarajućeg farmaceutskog preparata. Primjeri primijenjenog antigena uključuju, ali nisu ograničeni na njih, tetanus, osnovni mijelinski protein, pročišćen derivat proteina, oksazolon i slično.

Štoviše, cilj sadašnjeg izuma je da osigura farmaceutske preparate koji se mogu davati na bilo koji način, diktiran konkretnim slučajem, uključujući, ali ne ograničavajući se na njih, enteralno davanje (uključujući oralno ili rektalno) ili parenteralno davanje (uključujući lokalno ili inhalaciju uz pomoć aerosola). U poželjnim ostvarenjima, farmaceutski preparati iz sadašnjeg izuma se daju oralno, subkutano, intramuskularno, intraperitonealno ili intravenozno.

Prema tome, sadašnji izum je koristan, na primjer, u odlaganju ili sprečavanju odbacivanja alografta i u tretiranju ili sprečavanju niza patoloških procesa, kao što su oni vezani za autoimuna oboljenja, alergiju, upalna oboljenja (posebno, upalno oboljenje mjehura) ili AIDS. Sadašnji izum također ima svoje mjesto u tretiranju dijabetesa tipa I, periodontita, kožnih oboljenja, oboljenja jetre, uvejita, reumatskih oboljenja (posebno, reumatskog artritisa), ateroskleroze, vaskulitisa ili skleroze multipleks.

Pored toga, sadašnji izum je koristan u tretiranju tumora, virusnih i bakterijskih infekcija davanjem supstancije iz izuma tako da pojača sekreciju aktivnog TNF-α. Primjeri tretiranja raka uključuju, ali nisu ograničeni na njih, tretiranje raka dojke, debelog crijeva i prostate, kao i limfoma i drugih karcinoma bazalnih stanica. Tretiranja bakterijskih infekcija uključuju, ali nisu ograničena na njih, tretiranje difterije, streptokoka, upale pluća, gonoreje, lepre i tuberkuloze. Slično, primjeri virusnih infekcija koje se mogu tretirati izumom uključuju, ali nisu ograničeni na njih, tretiranje gripe, hepatitisa, gastroenteritisa, mononukleoze, bronhiolitisa i meningitisa.

U posebnim farmaceutskim preparatima iz sadašnjeg izuma prisutne su male efektivne doze propisane aktivne supstancije LMWH. Tipično, farmaceutski preparat sadrži jednu jedinicu male doze od manje od 5 mg aktivne supstance LMWH, poželjno, od približno 0,3-3 mg i najpoželjnije od 1-1,5 mg.

Sadašnji izum također uvelike razmatra metodu korištenja heparina male molekularne težine (LMWH), koji je sposoban inhibirati sekreciju aktivnog TNF-α in vitro zaustavljajući T stanice i/ili makrofage kao odgovor na aktivatore imunskih efektornih stanica za dobivanje farmaceutskih preparata za davanje u intervalima od najviše 5-8 dana za sprečavanje i/ili tretiranje patoloških procesa koji uključuju induciranje sekrecije aktivnog TNF-α, metode koja se sastoji od kombiniranja male efektivne doze LMWH s farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Još jedan predmet sadašnjeg izuma odnosi se na metode za osiguravanje izvora aktivnih supstancija prema sadašnjem izumu, koji sadrže frakcioniranje heparina male molekularne težine, enzimsku razgradnju intaktnih heparina (DH) ili enzimsku razgradnju izvanstaničnog matriksa (DECM).

Još jedan predmet sadašnjeg izuma se odnosi na osiguravanje metoda za tretiranje subjekta ili domaćina u kome se odvija patološki proces koji uključuje indukciju sekrecije aktivnog TNF-α. Metoda se sastoji od davanja takvom subjektu ili domaćinu farmaceutskog preparata, kao što je opisano gore, u intervalima od najviše približno 5-8 dana, poželjno jednom tjedno. Kao što je dalje opisano gore, farmaceutski preparati s aktivnim oligosaharidima mogu se davati dnevno ili u intervalima i do tjedan dana.

Sadašnji izum također osigurava farmaceutski preparat za inhibiranje stvaranja aktivnog TNF-α koji sadrži disaharid formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu sol

[image]

u kojoj je X1 vodik ili sulfat; X2 je vodik ili sulfat; X3 je sulfat ili acetil, pri čemu je, ako je X3 sulfat, bar jedan od X1 i X2 sulfat, a ako je X3 acetil, onda su oba X1 i X2 sulfati; i farmaceutski prihvatljiv nosač. Konkretno, farmaceutski preparat može sadržavati disaharid koji je 2-0-sulfat-4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(a-1,4)-2-dezoksi-2-N-sulfatglukozamin, 4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(a-1,4)-2-dezoksi-2-N-sulfat-6-0-sulfatglukozamin, 2-0-sulfat-4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(a-1,4)-2-dezoksi-2-N-sulfat-6-0-sulfatglukozamin ili 2-0-sulfat-4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(a-1,4)-2-dezoksi-2-N-acetil-6-0-sulfatglukozamin.

Sadašnji izum dalje predviđa farmaceutski preparat za pojačavanje stvaranja aktivnog TNF-α koji sadrži 4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(a-1,4)-2-dezoksi-2-N-acetilglukozamin ili njegovu farmaceutski prihvatljivu sol i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Takvi farmaceutski preparati mogu, naravno, biti prilagođeni za različite načine davanja uključujući, ali ne ograničavajući se na njih, parenteralno, oralno i lokalno davanje.

Štoviše, osiguran je farmaceutski preparat za inhibiciju stvaranja aktivnog TNF-α koji sadrži spoj koji je N-sulfatiran ili N-acetiliran 4-dezoksi-4-en-glukuronglukozamin ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol. Takav spoj, ako je N-sulfatirano, ima bar još jednu sulfatnu grupu, a ako je N-acetilirano, barem još dvije sulfatne skupine. Treba dodati da, zbog nezasićenosti (tj. dvostruka veza na C-4 do C-5) na dijelu disaharida od interesa koji je "uronska" kiselina, nema stereokemije povezane s C-6 karboksilnom skupinom, koja je bitno u ravnini šestočlanog prstena. Prema tome, kad je prisutna dvostruka veza na C-4 do C-5, iduronska kiselina je ista kao glukoronska. Iz ovoga proizlazi da izraz "uronska" kiselina označava bilo glukoronsku, bilo iduronsku kiselinu. Analogno, "urono" grupa označava ili idurono ili glukurono skupinu.

Još jedan aspekt sadašnjeg izuma se odnosi na farmaceutski preparat za pojačavanje stvaranja aktivnog TNF-α koji sadrži nesulfatiran N-acetiliran 4-dezoksi-4-en-glukuronglukozamin ili njegovu farmaceutski prihvatljivu sol i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Sadašnjim izumom se također predviđa metoda za inhibiciju stvaranja aktivnog citokina u subjektu, koji se sastoji od davanja subjektu, na primjer, sisavcu kao što je humani pacijent, efektivne količine disaharida formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli

[image]

u kojoj je X1, vodik ili sulfat; X2 je vodik ili sulfat; X3 je sulfat ili acetil, pri čemu je, ako je X3 sulfat, bar jedan od X1 i X2 sulfat, a ako je X3 acetil, onda su oba X1 i X2 sulfati. Još se jedna metoda odnosi na pojačavanje stvaranja aktivnog citokina u subjektu, koji se sastoji od davanja subjektu efektivne količine disaharida koji je 4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(a-1,4)-2-dezoksi-2-N-acetilglukozamin, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. U skladu s ciljevima sadašnjeg izuma, takve metode uključuju dnevno ili, poželjno, tjedno davanje odgovarajućih spojeva ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.

Gornje metode mogu se također koristiti za inhibiranje ili pojačavanje stvaranja aktivnog citokina u subjektu i sastoje se od davanja subjektu efektivne količine spojeva iz sadašnjeg izuma.

Sadašnji izum također predviđa metodu korištenja spoja koji je N-sulfatiran ili N-acetiliran 4-dezoksi-4-en-glukoronglukoza-min ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol; koje, ako je N-sulfatirano, ima barem još jednu sulfatnu grupu, a ako je N-acetilirano, bar dvije sulfatne grupe, za dobivanje farmaceutskog preparata za sprečavanje ili tretiranje bolesti izazvane ili povezane s neodgovarajućim stvaranjem TNF-α.

Također je previđena metoda za korištenje spoja koji je nesulfatirani N-acetilirani 4-dezoksi-4-en-glukuronglukozamin ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, za dobivanje farmaceutskog preparata za tretiranje bolesti koja je posljedica povećanog stvaranja TNF-α.

Analogno, osigurane su metode za sprečavanje ili tretiranje oboljenja izazvanog ili povezanog s neodgovarajućim stvaranjem aktivnog citokina u subjektu, koji se sastoje od davanja subjektu efektivne količine spoja koji je N-sulfatiran ili N-acetiliran 4-dezoksi-4-en-glukuronglukozamin ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol i koji, ako je N-sulfatirano, ima barem još jednu sulfatnu grupu, a ako je N-acetilirano, bar dvije sulfatne grupe.

Osigurane su, također, metode za tretiranje oboljenja koje je posljedica povećanog stvaranja aktivnog citokina u subjektu, koji se sastoje od davanja subjektu efektivne količine spoja koji je nesulfatiran N-acetiliran 4-dezoksi-4-en-glukuronglukozamin ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol. Takva tretiranja su naročito korisna u slučajevima kao što su autoimuno oboljenje, neoplastično stanje ili neki oblik infekcije, uključujući one izazvane virusnim, bakterijskim ili gljivičnim agensima.

Drugi predmeti sadašnjeg izuma tiču se metoda za zaštitu subjekta od štetnih efekata izloženosti zračenju koji se sastoje od davanja subjektu efektivne količine spoja koji je N-sulfatiran ili N-acetiliran 4-dezoksi-4-en-glukuronglukozamin ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol i koje, ako je N-sulfatirano, ima barem još jednu sulfatnu grupu, a ako je N-acetilirano, bar dvije sulfatne grupe. Tipično, spojevi iz sadašnjeg izuma se daju subjektu pred izlaganje zračenju. Najpovoljnije, radiacijsko-zaštitne osobine opisanih spojeva mogu se koristiti za vrijeme terapije zračenjem.

Dalje, predviđene su metode za suzbijanje odbacivanja alografta u subjektu, koji se sastoje od davanja subjektu efektivne količine spoja koji je N-sulfatiran ili N-acetiliran 4-dezoksi-4-en-glukuronglukozamin ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol i koji, ako je N-sulfatirano, ima barem još jednu sulfatnu grupu, a ako je N-acetilirano, bar dvije sulfatne grupe. Alograft se može, naravno, odnositi na transplantirani organ, uključujući, ali ne ograničavajući se na njih, srce, jetru, bubreg ili koštanu srž. Opisane metode se mogu također primijeniti na transplantate kože.

Još jedan predmet se odnosi na metodu snižavanja nivoa ekspresije adhezivne molekule u subjektu koja se sastoji od davanja subjektu efektivne količine spoja koji je N-sulfatiran ili N-acetiliran 4-dezoksi-4-en-glukuronglukozamin ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol i koje, ako je N-sulfatirano, ima barem još jednu sulfatnu grupu, a ako je N-acetilirano, barem dvije sulfatne grupe. Primjeri takvih adhezionih molekula uključuju, ali nisu ograničeni na njih, ICAM-1 i ELAM-1.

Opisan je i biološki test in vitro za kvalificiranje efekta testirane supstancije na sekreciju aktivnog TNF-α, koji se sastoji od prethodnog inkubiranja humanih CD4 + T stanica u mediju s različitim koncentracijama testirane supstancije, dodavanja konstantne količine aktivatora, efektivne za izazivanje sekreciju TNF-α koju vrše T stanice u odsustvu spomenute testirane supstancije, skupljanja medija poslije određenog vremenskog perioda i zatim testiranja aktivnosti TNF-α u mediju.

Daljnji predmeti sadašnjeg izuma bit će jasni stručnjaku iz daljnjeg pregleda sljedećeg opisa, koji uključuju detaljne opise konkretnih ostvarenja iz sadašnjeg izuma.

Kratki opis slika

Slika 1 ilustrira stupanj adjuvantnog artritisa (AA) kod skupina štakora, koje su tretirane tjednim davanjem Fragmina u različitim dozama, u odnosu na kontrolnu grupu koja je primila samo slanu otopinu puferiranu fosfatom (PBS, od engl. phosphate buffered saline).

Slika 2 ilustrira stupanj AA kod skupina štakora kojima je dana konstantna doza od 20 μg Fragmina u različitim režimima davanja, koji uključuju jedno davanje, dnevno davanje, petodnevne intervale i tjedno davanje.

Na Slici 3 je uspoređena efektivnost tjednog davanja Fragmina u odnosu na heparin i kontrolu (PBS).

Slika 4 ilustrira rezultate dnevnog davanja Fragmina, Heparina i PBS.

Slika 5 ilustrira stupanj AA kod skupina miševa koji su tretirani, bilo tjedno, bilo dnevno, različitim LMWH, uključujući Fraxiparin, Fraxiparine i Lovenox.

Slika 6 prikazuje stupanj preživljavanja u postocima štakora koji su bili podvrgnuti alogenskoj transplantaciji srca i primili ili tjednu dozu Fragmina ili PBS.

Slika 7 prikazuje histograme koji ilustriraju nivoe glukoze u krvi dviju skupina NOD miševa, od kojih je jedna primila Fragmin, a druga samo PBS.

Slika 8 ilustrira rezultate eksperimenta sa DTH na humanom dragovoljcu.

Slika 9 prikazuje krivulju zvonastog oblika koja ilustrira ovisnost odgovora od doze aktiviranog Fragmina.

Slika 10 ilustrira gubitak inhibitorske aktivnosti korištenjem neaktiviranog Fragmina.

Slika 11 pokazuje apsorpciju na 206 nm različitih frakcija neaktiviranog Fragmina dobivenih filtracijom na gelu, između ostalih, frakcije F2, F8, F10 i F15.

Slike 12, 12A i 12B ilustriraju efekte različitih doza aktivnog Fragmina, frakcija F15 i F10, respektivno, na osjetljivost miševa na DTH reakciju.

Slika 14 ilustrira apsorpciju na 206 nm različitih frakcija, dobivenih razdvajanjem Fragmina i ECM-a razgrađenog heparanazom na stupcu Sepharose 4B.

Slike 13 i 15 prikazuju usporedbu profila eluiranja frakcija, dobivenih separacijom Fragmina i ECM razgrađenog heparanazom na stupcu Sepharose 4B.

Slika 16 pokazuje da oligosaharidni proizvod (frakcija 5 sa Sl. 13) ima sličnu krivulju zvonastog oblika na grafiku doza/odgovor, tj. sličnu sposobnost da inhibira sekreciju aktivnog TNF-α.

Slika 17 pokazuje da subfrakcija između 5.65 i 5.8, približno, pokazuje najveći anti-TNF-α.

Slike 18 i 18A prikazuju kromatogram dobiven HPLC separacijom Fragmina i ECM razgrađenog heparanazom.

Slika 19 ilustrira apsorpciju na 206 nm dviju frakcija, F5 i F8, dobivenih separacijom ECM razgrađenog heparanazom na stupcu Sepharose 4B.

Slike 20A i 20B, s druge strane, ilustriraju apsorpciju na 206 i 232 nm, respektivno, pika dobivenog HPLC separacijom frakcije F5.

Slike 21A i 21B ilustriraju UV apsorpciju dodatnih HPLC frakcija, dobivenih iz frakcije F5.

Slika 22 ilustrira UV apsorpciju frakcija F7 i F8, dobivenih separacijom ECM razgrađenog heparanazom na stupcu Sepharose 4B.

Slika 23 ilustrira bitno čisti pik, dobiven iz kombiniranih frakcija F7 i F8 pomoću SAX-HPLC kromatografije.

Slika 24 ilustrira još jedan pik, obilježen sa "A23/4" dobiven odsoljavanjem preparata pika "1" sa Sl. 23.

Slike 25A, 25B i prikazuju kromatograme dobivene separacijom na SAX-HPLC disaharidnih standarda, dobivenih od Sigme i obilježenih sa H-0895, H-1020 i H-9267, respektivno.

Slika 26 ilustrira razdvajanje na koloni Sepharose 4B smjese dobivene iz Heparina obrađenog heparanazom (MM 5) s visokim prinosom frakcija F7 i F8.

Slika 27 ilustrira apsorpciju na 206 nm različitih frakcija, dobivenih iz same heparanaze PC3 i iz Heparina + PC3, kromatografijom na stupcu Sepharose 4B.

Slike 28A i 28B ilustriraju dodatne frakcije dobivene separacijom uz pomoć HPLC frakcije F7 sa Slike 26.

Slika 29 ilustrira frakciju F90, dobivenu iz Fragmina separacijom uz pomoć HPLC.

Slika 30, s druge strane, prikazuje kromatogram dobiven separacijom uz pomoć SAX-HPLC uzorka A23/4, podvrgnutog starenju.

Slika 31 ilustrira protonski NMR spektar uzorka disaharida iz ECM od 20 μg, dobivenog uz pomoć HPLC, kao što je pokazano na Sl. 23.

Slika 32 ilustrira dvodimenzionalni COSY spektar uzorka sa Sl. 31.

Slika 33 ilustrira uvećani dio NMR spektra sa Sl. 31, koji pokazuje signal anomjernog protona.

Slike 34 i 35 ilustriraju FTIR spektre dva različita uzorka, od kojih jedan ukazuje na prisustvo sulfatnog spoja (Sl. 34), a drugi djelomično desulfatiranog analoga (Sl. 35).

Slika 36A ilustrira maseni spektar metiliranog derivata uzorka sa Sl. 23 u matrici rastvaraču koja se sastoji od DTT i tioglicerola (1:1).

Slika 36B ilustrira maseni spektar čiste matrice rastvarača.

Slike 37A i 37B ilustriraju maseni spektar istog uzorka u različitim matricama rastvaračima, pri čemu je uzorak metilnitrobenzil alkohol; Sl. 37A je maseni spektar uzorka i matrice rastvarača zajedno, a Sl. 37B je masen spektar čiste matrice rastvarača.

Slika 38 ilustrira rezultate eksperimenata koji uspoređuju efektivnost disaharida 9392 i 1020 u smanjenju vrijednosti AA kod ženki štakora Lewis, koje pate od eksperimentalno induciranog adjuvantnog artritisa.

Slika 38A ilustrira efekt disaharida 0895 na stupanj AA kod štakora, koji pate od eksperimentalno induciranog AA, u odnosu na kontrolu (PBS).

Slika 38B ilustrira efekte tretmana glukozaminom na smanjenje stupnja AA kod štakora Lewis, pri različitim dozama glukozamina.

Slično, Slika pokazuje efekt galaktozamina na stupanj AA kod štakora Lewis, pri različitim dozama.

Slike 38D i 38E ilustriraju rezultate daljnjih eksperimenata sa disaharidom 9392, u kojima je disaharid davan bilo tjedno, bilo dnevno, s početkom nultog dana (tj. s početkom indukcije AA) ili dvanaestog dana (tj. kad štakor već pati od AA).

Slike i 38G ilustriraju rezultate odvojenog komparativnog skupa eksperimenata, koji su vršeni na grupama štakora Lewis, za određivanje efektivnosti disaharida 9392 pri tjednom davanju u usporedbi sa efektivnošću poznatog antiinflamatornog sredstva, deksametazon fosfata, u suzbijanju eksperimentalno induciranog adjuvantnog artritisa.

Slika 39 ilustrira efektivnost subkutano ubrizganog disaharida 1020 protiv upale rožnice štakora, induciranog liposaharidom (LPS).

Slika 39A prikazuje rezultate eksperimenata koji se odnose na radiacijsko-zaštitne osobine glukozamina, pri različitim dozama, u odnosu na kontrolu (PBS).

Slika 39B prikazuje rezultate sličnih eksperimenata sa zračenjem koji uključuju davanje disaharida 9392 u različitim dozama, u odnosu na kontrolu (PBS).

Slike 40 i 40A ilustriraju rezultate eksperimenata koji prikazuju sposobnost izabranih supstancija iz sadašnjeg izuma da suzbiju odbacivanje alogenog transplantata. Rezultati na Sl. 40 pokazuju da je doza od 3 ng disaharida 9392, ubrizgana subkutano dan pred presađivanje, a kasnije jednom tjedno, odložila 50% odbacivanja transplantata kože za 5 dana. Međutim, doza od 300 ng istog disaharida nije pokazala značajnu razliku za 50% odbacivanja u odnosu na kontrolu (PBS).

Slika 41 ilustrira učestalost IDDM u skupinama ženki NOD miševa, od kojih je svaka bila posebno tretirana ili disaharidom 9392 ili glukozaminom ili slanom otopinom.

Slika 41A prikazuje brzinu mortaliteta ženki miševa NOD koje su, opet, bile tretirane ili disaharidom 9392 ili glukozaminom ili slanom otopinom. Treba dodati da su ženke NOD miševa, sa obje slike 41 i 41A, bile stare približno 3-3,5 mjeseci, što znači da su miševi kao skupina već imali 20% slučajeva IDDM.

Slika 42 ilustrira nivo respiratornog distresa (RD) kod šest imuniziranih štakora, testiranih aerosolom antigena, sa (B1, B2 i B3) i bez (A1, A2 i A3) tretmana supstancijom H-9392. Vidjeti tekst za detalje.

Slika 43 prikazuje strukturu 4-0-(2-dezoksi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozil)-(2-0-sulfo-α-D-glukopiranozid) uronske kiseline, dobivene sintezom opisanom u Primjeru 6.23.

Detaljan opis izuma

U jednom aspektu sadašnjeg izuma, nađeno je da tretiranje pomoću heparina male molekularne težine smanjuje sposobnost T stanica i makrofaga da izlučuje aktivni TNF-α. U drugom aspektu sadašnjeg izuma, opisane su druge supstancije, koje sadrže karboksilne i/ili sulfatirane oligosaharide u bitno pročišćenom obliku i zajedno predstavljaju sredstvo za regulaciju biološke aktivnosti citokina, kao što je TNF-α, u domaćinu. Radi jednostavnosti, koristit će se izraz "supstancija" ili "aktivna supstancija" da označi LMWH (kao što je već korišteno u opisu metoda tretiranja), kao i supstancije koje sadrže karboksilne i/ili sulfatirane oligosaharide u bitno pročišćenom obliku, ako se ne naznači drukčije.

Jedan funkcionalni izraz ovog efekta može se vidjeti u inhibiranju DTH raekcije kod miševa i ljudi, inflamatorne reakcije koja ovisi od T stanica, a koju mogu aktivirati i makrofazi, kao i druge inflamatorne stanice. Tretman aktivnim supstancijama u dozama koje utječu na stvaranje aktivnog TNF-α, također je mogao inhibirati i model autoimunog artritisa koji se zove adjuvantni artritis (AA). Tretman aktivnim supstancijama također je produžio opstanak alogenih transplantata srca u štakorima i zaustavio je diabetes mellitus ovisan o insulinu (IDDM, od engl. insulin dependent diabetes mellitus) u miševima NOD. Pored toga, sličan tretman je spriječio indukciju stvaranja aktivnog TNF-α koje vrše T stanice i makrofazi kao odgovor na poticaj oštećenog ili rezidualnog subendotelnog vanstaničnog matriksa. Ovaj rezidualni vanstanični matriks (RECM), koji je odgovoran za davanje znaka za početak indukcije TNF-α (i rezultirajuće upale) treba razlikovati od enzimski razgrađenog vanstaničnog matriksa (DECM), čije su odabrane komponente ovdje izolirane i za koje je pokazano da ili gase ili pojačavaju aktivnost TNF-α.

Kako TNF-α vjerojatno ima ulogu u procesu ateroskleroze na mjestu vaskularne povrede, inhibiranje aktivnosti TNF-α, na mjestu oštećenog subendotelnog ECM, popravit će patogeni proces ateroskleroze. Najčudniji aspekt tretmana aktivnim supstancijama (LMWH) je taj, da je tretman najefektniji kad se daje u malim dozama u tjednim razmacima. Visoke doze LMWH ili doze LMWH davane dnevno nisu efektivne u inhibiranju sekrecije TNF-α, ni imunih reakcija.

Heparini male molekularne težine, dobiveni frakcioniranjem ili kontroliranom depolimerizacijom heparina, pokazuju poboljšane antitrombotičke osobine, ali i drukčije performance farmakokinetičke osobine u odnosu na heparin: poluživot im je udvostručen i biološka dostupnost je veća promatrano prema antikoagulantnom efektu poslije subkutanog ubrizgivanja (Bratt, G. et al., Thrombosis and Haemostasis (1985) 53: 208; Bone, B. et al., Thrombosis Research (1987) 46: 845) .

Prema sadašnjem izumu, nađeno je da su aktivne supstancije, LMWH, davane u dozama manjim od antikoagulantnih, u razmacima od nekoliko dana, efektivni u sprečavanju i/ili liječenju patoloških procesa koji uključuju indukciju aktivnog TNF-α. Pored toga, sada je pronađeno da se mogu identificirati različite supstancije, koje sadrže oligosaharide od 1-10 jedinica šećera, poželjno 2-4 jedinice, i koje ili inhibiraju ili pojačavaju aktivnost TNF-α. Ove različite supstancije mogu se dobiti, na primjer, iz tkiva živog organizma, recimo, iz rastvorljivih proizvoda razgradnje supstratnog ECM.

Izvori aktivnih supstancija

Heparini male molekularne težine, za korištenje prema izumu, dobiveni su iz LMWH prosječne molekularne težine od 3000-6000, kao što su, na primjer, LMWH opisani u europskom patentu EP 0014184. Neki LMWH se mogu komercijalno nabaviti pod različitim trgovačkim imenima, npr., Fragmin®, Fraxiparin®, Fraxiparine®, Lovenox®/Clexane®.

Heparini male molekularne težine mogu se dobiti na nekoliko različitih načina: obogaćivanjem frakcioniranjem pomoću etanola i/ili molekularnih sita, tj. filtracijom kroz gel ili membranu LMWH prisutnih u standardnom heparinu i kontroliranom kemijskom (dušičnom kiselinom, β-eliminacijom ili oksidacijom perjodatom) ili enzimskom (heparinazama) depolimerizacijom. Uvjeti za depolimerizaciju mogu biti pažljivo kontrolirani da bi se dobili proizvodi željenih molekularnih težina. Obično se koristi depolimerizacija dušičnom kiselinom. Također se upotrebljava depolimerizacija benzil estera heparina β-eliminacijom, koja daje isti tip fragmenata kao enzimska depolimerizacija pomoću heparinaza. LMWH s niskom antikoagulantnom aktivnošću, a koji zadržavaju osnovnu kemijsku strukturu, mogu se dobiti depolimerizacijom pomoću oksidacije perjodatom ili uklanjajući frakciju LMWH (dobivenih drugim metodama) koja vezuje antitrombin pomoću adsorpcije na imobiliziranom antitrombinu.

Fragmin® je heparin male molekularne težine sa prosječnom molekularnom težinom od 4000-6000 daltona, dobiven depolimerizacijom natrij heparina iz svinjske crijevne sluznice, kontroliranom dušičnom kiselinom. Proizvodi ga Kabi Pharmacia iz Švedske pod imenom Fragmin®, za upotrebu kao antitrombotičnog sredstva, u vidu slane otopine za ubrizgavanje, u špricama s pojedinačnim dozama od 2500 IU/0,2 ml i 5000 IU/0,2 ml, koje odgovaraju dozama od 16 mg i 32 mg, respektivno.

Fraxiparin® i Fraxiparine® su LMWH s prosječnom molekularnom težinom od približno 4500 daltona, dobiveni frakcioniranjem ili depolimerizacijom kalcij heparina iz svinjske crijevne sluznice, kontroliranom dušičnom kiselinom. Proizvodi ga Sanofi (Choay Laboratories) za upotrebu kao antitrombotično sredstvo u pojedinačnim dozama koje sadrže cca. 36 mg, što odgovara 3075 IU/0,3 ml vode.

Lovenox® (Enoxaparin/e), fragment LMWH dobiven depolimerizacijom natrij heparina iz svinjske crijevne sluznice, uz korištenje β-eliminacije, proizvodi Pharmuka SF iz Francuske, a distribuira ga Rhone-Poulenc pod imenima Clexane® i Lovenox® za upotrebu kao antitrombotično sredstvo, u špricama s pojedinačnim dozama koje sadrže 20 mg/0,2 ml i 40 mg/0,4 ml vode.

Kao što je pokazano u sadašnjoj prijavi, nove osobine LMWH koje su otkrivene i opisane ovdje, zajedničke su za sve LMWH bez obzira na proces proizvodnje, strukturne razlike (stvorene depolimerizacijom ili one koje ovise o varijaciji heparina korištenog kao sirovine) ili antikoagulantnu aktivnost, pod uvjetom da je korišteni LMWH sposoban za inhibiranje sekrecije aktivnog TNF-α in vitro, zaustavljajući T stanice i/ili makrofage, kao odgovor na aktivaciju kontaktom s antigenima specifičnim za T stanice, mitogenima, aktivatorima makrofaga, RECM ili njegovim proteinskim komponentama, kao što su fibronektin, laminin i slične.

Još jedan test koristan za identificiranje LMWH, efektivnih za namjenu sadašnjeg izuma, je inhibiranje reakcija eksperimentalno DTH kože na niz antigena (na primjer, antigen tetanusa, mijelinski osnovni protein (MBP, od engl. myelin basic protein) pročišćeni proteinski derivat (PPD, od engl. purified protein derivative) i oksazolon), ovisnih o T limfočitima. LMWH također inhibiraju adheziju T stanica za ECM i njegove proteinske komponente.

LMWH, efektivni prema sadašnjem izumu, ugrađeni su u farmaceutske preparate, na primjer, kao vodene otopine koje mogu sadržavati natrijev klorid, stabilizatore i druge rastvorljive neaktivne sastojke. Poželjan način davanja je subkutanoznim ili intravenoznim ubrizgavanjem, ali i bilo koji drugi pogodan način davanja je obuhvaćen izumom, uključujući oralno davanje.

Prema izumu, LMWH treba davati u razmacima od najviše oko 5-8 dana, poželjno jednom tjedno. Druge supstancije iz sadašnjeg izuma, posebno oligosaharidi male molekularne težine (ispod 2000), mogu se davati na bilo koji uobičajen, efektivan način (npr. ubrizgavanjem, oralno ili lokalno) u režimima doziranja koji mogu uključiti dnevno ili tjedno davanje.

Gubitak aktivnosti LMWH preparata tijekom vremena. Utjecaj dodatnog stabilizatora

Proučavanja ponašanja tijekom vremena, koja su obavili izumitelji, pokazuju da uzorci LMWH, kao što je Fragmin®, gube sposobnost da inhibiraju aktivnost TNF-α u roku od 72 h na sobnoj temperaturi ili u roku od nekoliko mjeseci na niskoj temperaturi (npr. ).

Tablica XI, odjeljak 6.1., pokazuje da se nakon jednog dana na sobnoj temperaturi izgubi oko 53% aktivnosti Fragmina®. Nakon približno dva dana, izgubljeno je oko 87% aktivnosti, a nakon približno tri dana, više nema aktivnosti. Kao što je pokazano u Tablici XII, odjeljak 6.2, eksperimenti su pokazali da Fragmin® gubi svoju anti-DTH reaktivnost čak i na nižim temperaturama (); proces samo zahtijeva više vremena. Uobičajeni nefrakcionirani heparini, naprotiv, ne gube svoje klasične anti-koagulantne aktivnosti na .

U naporima da otkriju sredstvo sposobno za stabiliziranje ili očuvanje aktivnosti opisanih LMWH preparata, izumitelji su se okrenuli dobro poznatom aditivu heparina. Poznato je da protamin sulfat neutralizira antikoagulantne efekte heparinskih molekula i klinički se koristi u tu svrhu (vidjeti Goodman-ovu i Gilman-ovu knjigu The Pharmacological Basis of Therapeutics, osmo izdanje, (Pergamon Press, New York, 1990), str. 1317). Prema izumu, otkriveno je, međutim, da dodani protamin sulfat ne neutralizira inhibiciju aktivnosti TNF-α koju vrši LMWH; u stvari, protamin sulfat stabilizira ovu aktivnost LMWH (vidjeti podatke za dodani protamin sulfat u Tablici XII).

Rezimirajući, može se zaključiti da (i) razblažene otopine LMWH gube aktivnost na brzo, a na sporije (treba primijetiti da gubitak aktivnosti na nije karakteristika standardnih antikoagulantnih i antitrombičnih aktivnosti heparina ili LMWH); (ii) dodani protamin sulfat, klasični neutralizator standardnih aktivnosti heparina, ne utječe na nove aktivnosti LMWH protiv TNF-α, opisane ovdje. Stvarno, izumitelji su pokazali da protamin sulfat, zapravo, stabilizira ovu novu aktivnost.

Frakcioniranje LMWH i dobivanje razgrađenog ECM ili razgrađenog heparina. Otkriće posebnih pojačavajućih i inhibitorskih aktivnosti za i protiv aktivnosti TNF-α

Kao što je već gore diskutirano, LMWH (Fragmin) inhibira sekreciju aktivnog TNF-α. Maksimalna inhibicija ili Inhmax (90%), nađena je za koncentraciju od 1 pg/ml (vidjeti Sl. 9).

Naprotiv, neaktivirani Fragmin nema efekta na stvaranje TNF-α (vidjeti Sl. 10) . Međutim, frakcioniranje neaktiviranog materijala kromatografijom na niskom pritisku uz izdvajanje čestica određene veličine na gelu, koristeći čvrstu podlogu Sepharose 4B (vidjeti Sl. 11 - apsorbanca na 206 nm ovisno o broju frakcije) otkrilo je aktivne frakcije oba efekta, inhibitornog (F15) i pojačavajućeg (F8, F2) (vidjeti Sl. 11 i Tablicu XIII). Inhibitorska frakcija neaktiviranog Fragmina (F-15) također inhibira DTH reakciju (vidjeti Sl. 12; u vezi s aktivnim Fragminom®, 12A; u vezi s frakcijama F15 i 12B; u vezi s frakcijom F10). Frakcija F10 nije imala efekta na stvaranje TNF-α, ni na DTH reaktivnost.

Kromatografska separacija na selektivnom gelu i podlozi Sepharose 4B je također vršena na proizvodima razgrađivanja, dobivenim iz ECM, tretiranog heparanazom, obilježenog sulfatnim grupama sa 35S. Nekoliko tipova enzima heparanaze je korišteno u sadašnjem istraživanju. Ovi enzimi uključuju MM5 (heparanaza sisavaca iz humanih placenti, dobivena komercijalno od Rad-Chemicals, Weizmann Industrial Park, Ness Ziona, Izrael), PC3 (bakterijska endoglikozidaza, koja je opisana u Shoseiov, O. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1990) 169: 667-672) i enzim iz bakterijskog izvora, dobiven od IBEX Technologies, Quebec, Canada). Grafikon radioaktivnosti (CPM) ovisno o broju frakcije prikazan je na Sl. 13. Drugi grafikon, koji pokazuje profile eluiranja frakcioniranog Fragmina i frakcionirane ECM-heparanaze, prikazan je na Sl. 14. Uvjeti za separaciju na niskom pritisku i Sepharose 4B, navedeni su u Tablici I.

Tablica I. Uvjeti za kromatografiju na Sepharose 4B

[image]

Različite frakcije su testirane na stvaranje TNF-α i ovi rezultati su prikazani u Tablici XV. Nađeno je da frakcije sličnih eluivnih osobina, iz dva izvora (tj., F-39 i F-42 iz Fragmina i ECM, razgrađenog heparanazom), imaju slične kvalitativne efekte na stvaranje i/ili aktivnost TNF-α, što je zanimljivo.

Slike 15 i 13 ilustriraju jedan način prikazivanja eluivnih profila dobivenih na stupcima Sepharose 4B LMWH (Fragmin) i oligosaharida iz ECM obilježenih 35S-sulfatom, dobivenih pomoću pročišćene MM5 heparanaze, respektivno. Može se vidjeti na Slici 13 da je heparan sulfat iz ECM (supstrat heparanaze) razgrađen enzimom da bi se dobili fragmenti heparan sulfata s osobinama eluiranja usporedivim s onima frakcioniranog LMWH.

Slika 16 pokazuje da oligosaharidni proizvod (frakcija #5 na Sepharose 4B, Sl. 13), dobiven iz "juhe" ECM + heparanaza (tj., smjesa dobivena razgradnjom ECM pomoću heparanaze), ima sličnu doza/odgovor karakteristiku kao LMWH u svojim efektima na sekreciju aktivnog TNF-α: odnosno, oba pokazuju zvonastu doza/odgovor krivulju i oba pokazuju maksimalnu inhibiciju od približno 90% u koncentraciji od 1 pg/ml, sa smanjenom aktivnošću i u manjoj i većoj koncentraciji. Podobno je, prema tome, da davanje ovih aktivnih supstanci uključi doze koje upadaju u lako odrediv "prozor" fiziološkog efekta.

Slika 17 pokazuje da je anti-TNF-α efekt proizvoda razgradnje ECM najveći u području subfrakcije (između približno 5,65 i 5,80) fragmenata pod pikom broj 5 sa Slike 13.

Prema tome, na heparan sulfat može se djelovati heparanazom da bi se dobili proizvodi razgradnje koji, kao i LMWH, djeluju povratnom spregom na T stanice i makrofage isključujući stvaranje aktivnog TNF-α i, posljedično, njegovo posredovanje u upali.

Također je otkriveno da oligosaharidni fragmenti male molekularne težine, dobiveni tretiranjem intaktnog heparina pomoću endoglikozilaze, pokazuju željeni regulatorni efekt na aktivnost TNF-α.

Razdvajanje fragmenata LMWH i fragmenata dobivenih iz DECM i DH pomoću HPLC

HPLC tehnike su korištene kako bi se dobila bolja rezolucija frakcija iz uzoraka LMWH (npr. Fragmina), razgradnje ECM i razgradnje heparina. Početno su korištena dva tipa uvjeta HPLC.

SHEMA REGULACIJE CITOKINA

[image]

Pod uvjetima iz prvog skupa, jedan broj pojedinačnih frakcija je bio izdvojen i izoliran, a zatim je ispitana njihova sposobnost da reguliraju sekreciju aktivnog TNF-α. Na veliko iznenađenje prisutnih izumitelja, otkriveno je da izabrane frakcije mogu povećati aktivnosti TNF-α u domaćinu, dok druge inhibiraju ovu aktivnost. Zatim je korišten drugi skup uvjeta HPLC za bolje razdvajanje različitih komponenata po molekularnim težinama.

U prvom skupu, korišten je stupac TSK-GEL® G-Oligo-PW ( x u.p.). Uvjeti ("HPCL I") su prikazani u Tablici II. Tipičan kromatogram HPLC I separacije Fragmina i ECM + MM5 Heparanaze je ilustriran na Slikama 18A i 18B, respektivno.

Tablica II. Uvjeti za kromatografiju HPCL I

[image]

Drugi skup uvjeta HPLC ("HPLC II") opisan je u Tablici III, pri čemu su korišteni uvjeti slični koje je opisao Rice, K. G. et. al. u Analytical Biochem. (1985) 150:325-331. Dakle, korištena su dva stupca, vezana u red: Toyo Soda TSK-Gel G3000SW ( x ) i G2000SW ( x ). Ovi stupci, zajedno s zaštitnom ( x ), spojenom za kraj umetka stupca G2000, nabavljena su od Phenomenex-a. Više eksperimentalnih detalja opisano je u odjeljcima 6.11, 6.14 i 6.15.

Tablica III. Uvjeti za kromatografiju HPLC II

[image]

Pod ovim uvjetima, manje supstancije su zadržane duže nego veće molekule.

Pod uvjetima iz trećeg skupa uvjeta HPLC ("HPLC III"), čistoća odabranih HPLC frakcija je ispitana pomoću jakog anjono-izmjenjivačkog (SAX) stupca HPLC. Takvi HPLC stupci su poznati da razdvajaju molekule sličnih dimenzija po broju negativno naelektriziranih skupina u molekulama. Što je veći broj negativno naelektriziranih skupina u supstanciji, to se ona duže zadržava na stupcu. Uvjeti HPLC III su istaknuti u Tablici IV.

Običnom stručnjaku također će biti očigledno, poslije razmatranja ovdašnjeg opisa, da se i drugi uvjeti za HPLC mogu zamisliti i primijeniti na razdvajanje i pročišćavanje aktivnih supstancija iz sadašnjeg izuma. Posebno, uvjeti obrnute faze mogu biti pogodni za korištenje. Vidi, na primjer, Rice, K. G. et al. supra.

Tablica IV. Uvjeti za kromatografiju HPLC III

[image]

Ponovno, uz ogradu od teoretskog ograničenja, čini se da se aktivnost TNF-α pojačava povećanjem unutarstaničnog aktivnog TNF-α povećanjem količine aktivnog TNF-α kojeg luče domaćinove imunološke efektorne stanice ili pojačanjem aktivnosti citokina kroz djelovanje agonista.

Također slijedi da se biološka aktivnost TNF-α može inhibirati obrnutim procesima, uključujući ne samo kompeticiju od strane aktivne inhibitorne supstancije za receptore TNF-α (npr., inhibitorne supstancije koja djeluje kao antagonist TNF-α ili inducira stvaranje antagonista TNF-α), nego i stvaranje kompleksa TNF-α s inhibitornom supstancijom, koji je manje aktivan od slobodnog TNF-α i pojačivača aktivnosti može biti odgovoran za uočeno povećanje aktivnosti TNF-α.

Određivanje aktivnosti

Aktivne supstancije iz sadašnjeg izuma, i one koje inhibiraju i one koje pojačavaju djelovanje TNF-α, su izolirane i pročišćene iz smjesa koje ih sadrže. U nekim slučajevima, ove aktivne supstancije su pročišćene do bitne homogenosti snažnim tehnikama HPLC, opisanim ovdje.

Da bi se dalje ispitala čistoća ovih aktivnih supstancija, određivana je njihova specifična regulatorna aktivnost.

Najprije je, međutim, napravljena karbazolska proba, na način sličan onome koji je opisa Carney, S. L. u Proteoglycan Analysis, A Practical Approach, Chalpin, M. F. and Kennedy, J. F. (Eds.) IRL Press, Oxford, Washington, D. C. (1986), str. 129, da bi se odredila količina oligosaharidnog materijala (tj. šećera) u danom uzroku koji se testira. Na ovaj način mogu se kvantitativno odrediti pikogramske (pg) količine šećera. Test je vršen kako je pisano u odjeljku 5, niže.

Zatim, vidljiva aktivnost vezana za tu količinu supstancije je određena biološkim testovima, opisanim vrlo detaljno u odjeljku 5, niže, da bi se dobila ovisnost odgovora od doze. Ovi biološki testovi mogu se provoditi bilo pod in vitro, bilo pod in vivo uvjetima.

Otuda je nađeno da uočena inhibicija ili pojačanje aktivnosti TNF-α, izražena u postocima aktivnosti TNF-α u odsustvu supstancije iz sadašnjeg izuma, ovisi o koncentraciji, odnosno dozi te supstancije, prisutne u testiranom uzorku. Profil očigledne aktivnosti koji se dobiva je približno zvonastog oblika, kao što je prikazano na Slikama 9 i 16. Maksimalna vrijednost inhibicije ili pojačanja u postocima, nađena za svaku supstanciju označena je s Inhmax i Augmax, prema slučaju.

Kako je opisano dalje u tekstu, biološki test, korišten da se ustanovi "idealna" jedinična doza (tj. ona koja odgovara Inhmax ili Augmax), može se zasnovati na in vitro ili in vivo inhibiciji ili pojačanju aktivnosti TNF-α ili DTH testa na miševe. Alternativno, in vitro test, napravljen na humanim stanicama (opisan niže) može se također koristiti. Specifična regulatorna ili "R" vrijednost je, kao što je ovdje definirano, odnos Inhmax ili Augmax i "idealne" doze koja daje maksimalnu postotnu inhibiciju ili pojačanje. Za in vitro testove, "R" vrijednost se tipično izražavaju u jedinicama % x (pg/ml)-1.

Kako je gore rečeno, specifična regulatorna aktivnost se može također utvrditi pod in vivo uvjetima, prateći inhibiciju eksperimentalne DTH reakcije kod miševa ili ljudi. Utvrđeno je da je sposobnost određene doze inhibitornog spoja da inhibira sekreciju aktivnog TNF-α izravno proporcionalno njegovoj sposobnosti da inhibira DTH reakciju, mada jedan te isti spoj može biti sposobniji u jednom testu nego u drugom (tj. u in vitro ili in vivo testu). Inhibitorna ili pojačavajuća aktivnost u ovoj in vivo inflamatornoj reakciji, u kojoj posreduju stanice, je vrlo važna, jer je DTH reakcija izraz procesa koji su uključeni u autoimunološka oboljenja, odbacivanje transplantata, neke tipove upale krvnih sudova i alergije. Prema tome, aktivnost u ovom testu ukazuje na upotrebljivost u ovim tipovima oboljenja, a moguće i u drugim, kao što će biti opisano u daljnjem tekstu.

Štoviše, nova veličina, specifična regulatorna aktivnost, koja je definirana kao odnos Inhmax ili Augmax vrijednosti i količine ili koncentracije supstancije ("idealna" doza) koja daje maksimalnu postotnu vrijednost, može služiti za razdvajanje nove aktivne supstancije iz sadašnjeg izuma od onih supstancija koje su možda već poznate, ali za čiju se regulatornu aktivnost prema citokinima ne zna u struci. Ovaj specifični odnos se ovdje kratko naziva "R" vrijednost. Prema tome, nove supstancije ili preparati iz sadašnjeg izuma mogu biti opisani preko minimalne "R" vrijednosti, koja se može izračunati ovisno o vidljivoj aktivnosti doze, a koja će nadići "R" vrijednost vezanu za poznate preparate.

Tipovi poremećaja za koje sadašnji izum može biti koristan

Poremećaji koji mogu biti spriječeni ili tretirani u skladu s izumom su svi poremećaji vezani uz patološke procese koji obuhvaćaju indukciju sekrecije aktivnog TNF-α, uključujući aterosklerozu i vaskulitis i patološke procese u vezi s njima; autoimune bolesti, npr. reumatski artritis, dijabetes tipa I (IDDM), multipleks skleroza, lupus erythematosus, Gravesova bolest; alergija; odbacivanje transplantata; akutna i kronična inflamatorna oboljenja, npr. uveit, upala mjehura; anorexia nervosa; hemoragični šok izazvan septicemijom i infekcija HIV-om u AIDS-u. U AIDS-u, aktivne supstancije će potisnuti replikaciju HlV-a, sprečavajući time razvoj kompleksa vezanog uz AIDS (ARC, od engl. AIDS-related complex). Drugi poremećaji, za koje može koristiti tretman namijenjen reguliranju aktivnosti citokina, uključuju, ali nisu ograničeni na njih, psorijazu, pemfigus, astmu, bubrežna oboljenja, oboljenja jetre, insuficijenciju koštane srži, vitiligo, alopeciju i miozitis.

Dalje, povećanje aktivnosti TNF-α je korisno u tretiranju tumora, bakterijskih i virusnih infekcija. Parenteralno, oralno ili lokalno davanje supstancija iz sadašnjeg izuma, koje povećavaju stvaranje aktivnog TNF-α, u farmaceutski prihvatljivom nosaču, može također pomoći u borbi protiv raka kože, kao što je rak bazalnih stanica, rak skvamoznih stanica ili melanom.

Prilikom kliničke primjene aktivnih supstancija, treba imati u vidu da se uspješno liječenje određenih tipova bolesti dobrim dijelom sastoji od obnavljanja homeostaze. Za endokrinologa, ovo implicira razumno davanje ili antagonizam specifičnih hormona. Na primjer, na dijabetes ovisan o insulinu može se efektivno primijeniti terapija zamjene insulina; pacijentu s Gravesovom bolešću može se pomoći farmakološkim mjerama koje inhibiraju oslobađanje tiroksina. Samo se ponekad bolest može ublažiti davanjem hormona čiji nedostatak nije postojao.

Upotreba citokina, kao što je TNF-α, u svojstvu neoplastnih sredstava, pruža jedan takav primjer. Obrazloženje za davanje imunomodulatornih sredstava pacijentima oboljelim od raka može biti prilično neuvjerljivo. Mnogi citokini, kao što je TNF-α, su toksični u mjeri koja ograničava dozu mnogo prije nego je postignut cilj terapije. U takvom slučaju, povećanje aktivnosti endogenog TNF-α može pružiti mogućnost koja je i nova, a koja se, eventualno, može pokazati efektivnijom od bilo kojeg ranije smišljenog terapeutskog režima.

Jasno, naše razumijevanje uloge TNF-α se još uvijek razvija i nesumnjivo će se otkriti nove i korisne upotrebe ovog hormona i supstancija sposobnih da reguliraju njegovu aktivnost. Iako se podrazumijeva da sve primjene prijavljenih spojeva i farmaceutskih preparata ulaze u okvire sadašnjeg izuma, posebno su predviđene primjene u ublažavanju simptoma, sprečavanju početka i liječenju bolesti.

Lokalne primjene oligosaharidnih supstancija iz sadašnjeg izuma

Supstancije iz sadašnjeg izuma također nalaze primjenu u preparatima za lokalno davanje, kao što su preparati za tretiranje edema ili upala. Stvarno, pored i izvan sasvim terapeutske primjene, supstancije iz sadašnjeg izuma mogu biti korisne kao dodaci kozmetičkim preparatima u njihovom zaštitnom djelovanju, na primjer, losionima za sunčanje i zaštitu od sunca. Ako ih uopće ima, onda je vrlo malo preparata za zaštitu od sunca koji potpuno zaklanjaju štetne valne dužine (npr., 290-320 nm) iz UV područja elektromagnetskog spektra. Zbog toga, suvišno izlaganje suncu često uzrokuje akutno stanje poznato kao erythema solare, a produženo ili ponavljano izlaganje može, naravno, dovesti do ogrubljivanja kože ili, još gore, do raka kože.

Zbog toga, ugrađivanje aktivnih supstancija iz sadašnjeg izuma u kozmetičke preparate ima dva specifična cilja: očuvanje i zaštitu kože i ublažavanje medicinskog stanja kao što je erythema solare. Bilo bi poželjno da se u preparate za sunčanje i zaštitu od sunca uključi efektivna količina oligosaharaida iz sadašnjeg izuma zajedno s uobičajenim sredstvima za zaštitu od sunca. Općenito, trebalo bi dodati količinu aktivne supstancije toliku, da osigura dozu od oko 1 μg do oko 100 mg po kilogramu subjekta, poželjno od oko 0,01-10 mg po kilogramu subjekta, a najpoželjnije od oko 0,1-1 mg po kilogramu subjekta.

Kozmetički preparati mogu sadržavati uobičajene sastojke, poznate običnim stručnjacima, kao što su oni opisani u Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, Third Edition (1979), 7, str. 143-176. U preparatima za zaštitu od sunca, dodatak aktivnih supstancija iz sadašnjeg izuma povećava minimalnu eritemsku dozu (MED) i shodno tome faktor zaštite od sunca (SPF, od eng. sun protection factor). Specifični sastojci, koji uključuju tipične štitnike od sunca, nabrojani su u Kirk-Othmer, supra na stranicama 153-154. Pored toga, lokalni preparati i kozmetičke formulacije mogu se dobiti kao što je opisano u U. S. Patent Nos. 4,199,576, 4,136,165 i 4,248,861, čiji su potpuni opisi ovdje navedeni referencijom. Naravno, svakom stručnjaku kozmetologije bit će jasno da dobiveni spojevi mogu postojati u mnogim oblicima, uključujući, ali ne ograničavajući se na njih, otopine, losione, kreme, paste, emulzije, sprejeve i aerosole.

Tipični režimi doziranja

Ustanovljeno je prema izumu da najniža doza LMWH po kilogramu, koja uzrokuje inhibiciju TNF-α, stvaranje ili inhibiciju reaktivnosti DTH za najmanje 50%, bude 12 inhibitornih jedinica po kg miša (12 j/kg). Zbog razlika u površini i metabolizmu između miševa i ljudi, za ljude je potrebna niža doza LMWH i ustanovljeno je da 12 j/kg kod miševa odgovara 1 j/kg kod ljudi. Na primjer, doza Fragmina® serije 38609, efektivna u inhibiranju i sekrecije TNF-α i reaktivnosti DTH, je 5 μg po mišu tjedno. Kako svaki miš teži oko , doza Fragmina® 38609 koja odgovara 12 j/kg je 200 μg/kg miša. Doza od 1 j/kg, podobna za ljude, je, prema tome, 200 μg/kg : 12 = 16,67 μg/kg. Tako bi čovjek, težine oko , bio tretiran dozom od oko 1,2 mg, danom u jednoj dozi subkutano jednom u 7 dana.

Kako pojedini ljudi biološki variraju, optimalna doza ne mora biti 1,2 mg, ali će se u općem slučaju nalaziti ispod 5 mg, posebno unutar opsega od 0,3-3 mg.

Otuda slijedi grubo pravilo za konverziju mišjih doza u humane: humana doza/kg = mišja doza/kg : 10 ili 12. Doza LMWH koja bi trebala biti efektivna u štakorima može izvesti iz činjenice da je doza LMWH po kg štakora jedna polovica doze po kg miša, tj . 6 j/kg. Na primjer, ako je 12 jedinica Fragmina® serije 38609 200 μg/kg, onda 6 jedinica doze, podobnih za štakore, treba biti 100 μg/kg ili 20 μg na štakora, dano jednom tjedno.

Za većinu oligosaharidnih supstancija iz sadašnjeg izuma, izoliranih iz LMWH, razgrađenog heparina i razgrađenog ECM, način za određivanje efektivne doze ovih oligosaharidnih supstancija u tretiranju ljudi, pomoću in vivo DTH bioloških testova, je sljedeći.

Slika 12A pokazuje da izolirana frakcija (F15) in vivo inhibira DTH u miševima, u opsegu od 0,1-5,0 μg/miš tjedno. Kako naši miševi teže 25 mg, in vivo doza je približno (0,1 : ) 4-200 μg/kg miša tjedno (ekvivalent 0,01-10 pg/ml in vitro).

Da bismo ispravili razliku u površini između miševa i ljudi, moramo podijeliti mišju dozu/kg s 12 : 4-200 μg/kg miša - 0,33-16,67 μg/kg čovjeka. Prema tome, čovjek od treba primiti do oko 1,2 mg (oko 1200 μg) . Da bismo bili sigurni da pokrivamo razlike među ljudima, možemo povećati ovu dozu do oko 5 mg, što je količina znatno manja od bilo koje doze heparinoida koji se koriste zbog svojih efekata na koagulaciju ili trombozu. Dakle, doza za čovjeka od će biti oko 5 mg ili manje, poželjno 3 mg ili manje, poželjnije oko 1,5 mg ili manje, a najpoželjnije oko 1 mg ili manje.

Ustvari, za visoko pročišćene materijale iz sadašnjeg izuma, uključujući one dobivene HPLC kromatografijom, poželjne doze mogu biti čak i manje. Na primjer, nađeno je da disaharidi, opisani detaljnije u daljnjem tekstu, pokazuju inhibitorno djelovanje kad su dani injekcijom, u količini od oko 0,1-0,5 μg/kg miša. Odatle slijedi procjena doza pročišćenih disaharida za ljude na oko 0,01-0,05 μg/kg čovjeka ili oko 0,7-3,5 μg za čovjeka od . Opći opseg doza za čovjeka od onda može biti od oko 0,1-100 μg, poželjno od oko 1-10 μg za disaharide. Doze mogu biti nešto veće za poznate disaharidne "markere", diskutirane u daljnjem tekstu.

Doze navedene gore mogu se davati više puta dnevno ili u dnevnim, tjednim ili čak većim intervalima, u ovisnosti od reakcije pojedinca. Za LMWH, međutim, poželjno je da interval doziranja bude tjedni, kao što je ranije rečeno.

Izum će sada biti ilustriran sljedećim neograničavajućim primjerima.

Eksperimenti isključivo s LMWH (Fragmin)

Biološki test na inhibiciju sekrecije aktivnog TNF-α uz korištenje stanica mišje slezene

Supernatanti stanica slezene, kultiviranih u prisustvu ili odsustvu LMWH, ili stanica slezene dobivenih iz miševa tretiranih ili netretiranih sa LMWH in vivo, su analizirani na njihovu sposobnost da izlučuju aktivni TNF-α. Bioliški test na TNF-α je zasnovan na citotoksičnom efektu TNF-α na stanice senzitivirane na cikloheksimid (CHI) i na kvantizaciji ovog efekta pomoću "red uptake" (uzimanje crvenog) probe, kao što je opisao Wallach D., u J. Immunol. (1984) 132:1464-1469. Ukratko, mjereno je ubijanje CHI-senzitiviranih HeLa stanica koje vrši TNF-α, prisutan u supernatantima stanica, pri čemu je koncentracija TNF-α određivana usporedbom s titracionim krivuljama egzogeno dodanog TNF-α. Sposobnost stanica za život je određivana dvosatnim inkubiranjem s neutralnim crvenim, poslije čega je izvršeno ispiranje viška boje, ekstrakcija neutralnog crvenog koje su uzele stanice pomoću Sorensonove smjese citratnog pufera i etanola, i njegova kalorimetrijska kvantizacija na 570 nm pomoću Microelisa Autoreader.

Stanice iz miševa tretiranih pomoću LMWH dobivene su na sljedeći način: ženkama miševa vrste BALB/c (, 2 mjeseca stare), najmanje po 5 miševa u skupini, subkutano su ubrizgane različite doze LMWH, obično u opsegu od 0,5 - 20 μg po mišu. Poslije pet dana, miševi su ubijeni dislokacijom cerviksa, uklonjene su slezene i stanice slezena bez crvenih krvnih stanica, su testirane na stvaranje TNF-α kao odgovor na indukciju pomoću RECM, Concavalina A (Con A) ili lipopolisaharida (LPS).

In vivo biološka proba inhibicije eksperimentalne DTH reaktivnosti

Skupine inbred BALB/c (Jackson Laboratories, Bar Harbour, ME) ili autbred (outbred) CD1 (Weizmann Institute Animal Breeding Center, Rehovot, Israel) miševa su senzitivirane sa 100 μl 2% oksazolona (OX) u smjesi aceton/maslinovo ulje (4/1, zapr.), primijenjenim lokalno na obrijanu kožu abdomena. DTH senzitivnost je izazvana 5 dana kasnije na sljedeći način: miševima je dano po 20 μl 0,5% OX u smjesi aceton/maslinovo ulje (po 10 μl lokalno u svaku stranu uha). Konstantna površina uha je mjerena sasvim pred davanje, zatim 24 i 48 h kasnije inženjerskim mikrometrom Mitutoyo. Pojedinačna mjerenja otoka uha su normalizirana na jedinicu skupina miševa. Povećanje (Δ) otoka uha je izraženo kao srednja vrijednost u jedinicama od 10- ili 10-4 inča ( + standardna greška), u ovisnosti od korištenog mikrometra. Postotna inhibicija je izračunana na sljedeći način:

[image]

Miševi su tretirani s LMWH kao u Primjeru 5.1, ubrizgan im je dan pred senzitizaciju na OX. Petog dana nakon senzitizacije na OX, miševima je izazvana inducirana DTH reakcija, kao što je opisano gore.

Pozitivna kontrola je DTH reakcija izazvana kod imuniziranih miševa u odsustvu tretmana sa LMWH. Negativna kontrola je početni otok izazvan antigenom u naivnim (neimuniziranim) miševima.

Indukcija sekrecije TNF-α pomoću T stanica i makrofaga in vitro

Mikrotitarske ploče su pripremljene na sljedeći način: fibronektin (FN), ili laminin (LN) (Sigma), je dodan ravnim pločama s 96 ležišta (mjesta) (Costar) u koncentraciji od 1 μg/50 ul PBS po mjestu, a zatim je uklonjen poslije 16 sati. Preostala mjesta za vezanje su blokirana pomoću BSA/PBS (10 mg/ml), koji je dodan ležištima i ispran nakon dva sata.

Ležišta, prevučena ECM, su pripremljena na sljedeći način: endotelne stanice iz rožnice goveda su kultivirane na ravnim pločama sa 96 ležišta. Konfluentni slojevi endotelnih stanica su rastvoreni i ECM je ostao intaktan, oslobođen od staničnih ostataka. (Gospodarowicz, D. et al., J. Biol. Chem. (1978) 253: 3736). Istrgan ili rezidualni ECM (RECM) je dobiven blagim struganjem ECM tri puta iglom za špric 27G i otkrivena mjesta su zatim prevučena s BSA/PBS. Ostale klonirane CD4+ T stanice štakora, označene sa K1, koje prepoznaju mijelinski osnovni protein (MBP), su razmnožene i ostavljene u kulturi, a onda stavljene u ležišta, 105 stanica po ležištu sa ili bez 3 x 105 singenskih makrofaga slezene, u 100 μl po ležištu RPMI 1640 (Gibco), obogaćenog 1%-nim BSA i antibioticima.

Makrofazi slezene su pročišćeni uklanjanjem T i B stanica pomoću specifičnih monoklonskih antitijela (mAb). Mišji anti-TNF-α-mAb je dobiven od Genzyme (Cambridge, MA) i razblažen 300 puta. Deset μl alikvota ove razblažene otopine je dodano svakom ležištu. MBP (100 μg/ml), Con A (2,5 μg/ml), LPS (1 μg/ml), FN (5 μg/ml) i LN (5 μg/ml) su dodani ležištima po potrebi.

Pločice su inkubirane 3 sata na u inkubatoru s povećanom vlažnošću. Zatim su sadržaji ležišta (4 ležišta po eksperimentalnoj grupi) pokupljeni, centrifugirani i mediji su testirani na sekreciju aktivnog TNF-α, kao u primjeru opisanom u odjeljku 5.1. Odnosno, supernatanti kultiviranih makrofaga i limfocita su dodani kulturama HeLa stanica, koje ubija TNF-α i umiranje ovih stanica u prisutnosti testiranih medija je kalibrirano u odnosu na titracione krivulje egzogeno dodanog TNF-α. Umiranje stanica je provjeravano oslobađanjem neutralne crvene boje iz prethodno inkubiranih HeLa stanica. Rezultati pokazani ovdje predstavljaju podatke dobivene iz svih šest eksperimenata, koji su dali suštinski podudarne rezultate.

Tablica V pokazuje da T stanice i makrofazi, kultivirani zajedno, mogu inducirani lučiti TNF-α kontaktom sa specifičnim antigenom MBP (skupina 4) , mitogenom Con A (skupina 6) ili sa LPS (skupina 8). Međutim, u odsutnosti antigenskog ili mitogenskog stimulusa, izlučivanje TNF-α je također inducirano rezidualnim izvanstaničnim matriksom (RECM; skupina 10) ili komponentama ECM, fibronektinom (FN; skupina 12) ili lamininom (LN; skupina 14). Intaktni ECM je slab induktor TNF-α (skupina 16).

Tablica V. Izlučivanje TNF-α koje vrše T stanice i makrofazi je inducirano specifičnim antigenom MBP, Con A, LPS, RECM ili komponentama ECM

[image]

Regulacija sekrecije TNF-α pomoću LMWH

Kulture T stanica i pomoćnih stanica su pripremljene kao što je opisano u odjeljku 5.3. LMWH je dodan ležištima na početku kultiviranja. Nivoi TNF-α su ispitani nakon 3 sata inkubacije.

Tablica VI pokazuje da prisutnost LMWH (Fragmin® serije 38609) in vitro inhibira sekreciju aktivnog TNF-α, induciranu specifičnim antigenom (MBP; skupina 4), mitogenima (Con A i LPS; skupine 6 i 8), RECM ili komponentama ECM (skupine 10, 12 i 14). Budući da izgleda da sekrecija TNF-α, inducirana pomoću RECM, sudjeluje u aterosklerozi, inhibicija TNF-α pomoću LMWH će biti blagotvorna u slučaju ateroskleroze.

Tablica VI. Indukcija sekrecije TNF-α in vitro je inhibirana pomoću LMWH (Fragmin® serije 38609)

[image]

Ex vivo eksperimenti sa BALB/c miševima tretiranim LMWH

Da bi se ispitao efekt LMWH, danog miševima in vivo, na sekreciju TNF-α koju vrše stanice slezene in vitro, proveden je sljedeći eksperiment. Miševi BALB/c, po 5 u grupi, tretirani su različitim dozama LMWH (Fragmin® serije 38609), razblaženog u slanoj otopini, ubrizganim subkutano. Nakon tjedan dana, životinje su ubijene i stanice njihove slezene, bez crvenih krvnih stanica, su ispitane na sposobnost da luče TNF-α kao odgovor na kontrolna ležišta bez RECM (A) ili na ležišta prevučena RECM (B). Mjerenje nivoa sekrecije TNF-α je izvršeno kao što je opisano u odjeljku 5.1. Tablica VII pokazuje rezultate koji ukazuju na to da je jedna injekcija od 5 μg LMWH, dana 7 dana prije mjerenja, inhibirala sekreciju TNF-α, induciranu pomoću RECM. Veće ili manje doze LMWH bile su manje efektivne. Prema tome, optimalna doza LMWH, data in vivo tjedan dana ranije, je bila efektivna.

Tablica VII. Ex vivo inhibicija sekrecije TNF-α u kojoj sudjeluju T stanice, kao odgovorna RECM

[image]

Tablica VIII. pokazuje da je doza od 5 μg LMWH (Fragmin® serije 38609), dana in vivo, također efektivna u inhibiranju sekrecije TNF-α, inducirane pomoću LPS. BALA/c miševi (4 miša po eksperimentalnoj grupi) su tretirani naznačenim količinama LMWH, razblaženim u slanoj otopini i ubrizganim subkutano. Poslije tjedan dana, miševima je intraperitonealno ubrizgano po 10 mg LPS, a 4 sata kasnije su ubijeni. Stanice njihovih slezena, oslobođene crvenih krvnih stanica, su zatim kultivirane 3 sata u ležištima prevučenim RECM, u inkubatoru s povećanom vlažnošću. Nivoi TNF-α, izlučenog kao odgovor na RECM, su mjereni u supernatantima kultura. Rezultati su dani u Tablici VIII.

Tablica VIII. Tretman miševa pomoću LMWH inhibira sekreciju aktivnog TNF-α, stimuliranu LPS-om koju vrše makrofazi.

[image]

Eksperimenti s različitim izvorima LMWH

Da bi se ispitao efekt različitih LMWH na inhibiciju sekrecije aktivnog TNF-α i na DTH odgovore, miševi su tretirani naznačenim LMWH, danim subkutano u različitim koncentracijama. Poslije tjedan dana, neki od miševa su ubijeni i mjerena je indukcija sekrecije aktivnog TNF-α kao odgovor na aktivaciju pomoću Con A in vitro (Tablica IX). Preostali miševi su ispitani na sposobnost da odgovore na antigen oksazolon (Tablica X) . Rezultati su u Tablicama izraženi kao inhibicija u postocima u odnosu na odgovore miševa netretiranih pomoću LMWH.

Proučavanjem rezultata iz Tablica IX i X, mogu se izvući dva zaključka:

1. Različite serije LMWH, koje daju sličan antitrombotički efekt (proba na Faktor X) , imaju različite optimalne doze za inhibiciju sekrecije aktivnog TNF-α. Štoviše, ima preparata LMWH, kao što su Clexane® serije 4096, koji nemaju inhibitorni efekt na sekreciju aktivnog TNF-α niti u jednoj od probanih doza. Prema tome, može se zaključiti da antitrombotički efekt preparata LMWH nije u vezi s njegovom jačinom kao inhibitora sekrecije aktivnog TNF-α. U dva različita biološka testa sudjelovali su različiti faktori, prisutni u preparatima.

2. Sposobnost određene doze LMWH da inhibira sekreciju aktivnog TNF-α je direktno srazmjerna njenoj sposobnosti da inhibira DTH reakciju, i doza preparata LMWH optimalno efektivna u inhibiranju sekrecije aktivnog TNF-α je također optimalno efektivna u inhibiranju DTH reakcije.

Tablica IX. Tjedni tretman miševa različitim LMWH inhibira DTH senzitivnost miševa.

[image]

Tablica X. Tjedni tretman miševa različitim LMWH inhibira ex vivo sekreciju aktivnog TNF po rezultatima biološkog testa na stanicama mišje slezene

[image]

Tretiranje adjuvantnog artritisa (AA) u štakorima malim dozama LMWH

Adjuvantni artritis je eksperimentalna bolest, koja se može inducirati u nekim vrstama štakora tako što se oni imuniziraju na antigene Mycobacteriuma tuberculosisa (Pearson, C. M., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1956) 91:91). Ova eksperimentalna bolest se uzima za model humanog reumatskog artritisa (Pearson, C. M., Arthritis Rheum. (1964) 7:80). Izgleda da artritis uzrokuju T limfociti koji prepoznaju antigen M. tuberculosisa koji reagira i sa strukturama u tkivima zglobova (Cohen, I. R., Arthritis Rheum. (1985) 28:841).

Štakori Lewis su imunizirani M. tuberculosisom (1 mg) u ulju da bi se inducirao adjuvantni artritis (Pearson, C. M., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1956) 91:91). Poslije pet dana, subkutano su im ubrizgane naznačene doze LMWH i/ili heparina i ocijenjen je razvoj artritisa na skali od 0 - 16, kao što je opisano (Holoshitz, J., et a ., Science (1983) 219:56). U svim eksperimentima je korišten Fragmin® serije 38609.

Da bi se ispitao odgovor na dozu Fragmina® (Sl. 1) , štakorima, imuniziranim da bi se inducirao AA, tjedno je ubrizgano subkutano 0,5 µg (○), 1µg (♦), 2 µg (•), 10 µg (◊), 15 µg (∆), 20 µg (■), 30 µg (▲), 40 µg (x) i PBS kontrola (□), s početkom petog dana poslije injekcije. Doza od 20 µg se pokazala najefektivnijom u inhibiranju artritisa.

Efekt doze od 20 µg Fragmina® na tok AA je pokazan na Slici 2: PBS kontrola (□) ; pojedinačni tretman petog dana (▲); dnevno (•); svakog petog dana (○); tjedno (■). Pokazano je da davanje Fragmina, i na 5 i na 7 dana, inhibira artritis.

Slika 3 pokazuje efekt na AA tjednog davanja Fragmina® (serija 38609) u usporedbi s standardnim heparinom. Štakori Lewis su imunizirani da bi se inducirao AA. S početkom petog dana, štakorima je, u tjednim intervalima, subkutano ubrizgavana doza od 20 µg Fragmina® (•), heparina (○) ili fosfatno puferirane slane otopine (PBS kontrola) (□). Rezultati pokazuju dramatičnu razliku sposobnosti Fragmina® i heparina: Fragmin® potpuno inhibira artritis, dok heparin nema inhibitorni efekt.

Inhibitorni efekt na AA nije nađen prilikom dnevnog davanja doze od 20 µg LMWH, mada je začuđujuće da je inhibitorni efekt heparina bio veći od efekta Fragmina® u dnevnom davanju, kao što je pokazano na Slici 4 (Fragmin® (serija 38609) (•), heparin (○), PBS kontrola (□)).

Sličan inhibitorni efekt je primijećen kod nekoliko drugih LMWH, datih štakorima Lewis, imuniziranim da bi se inducirao AA. Slika 5 pokazuje rezultate ubrizgavanja doze od 20 µg Fraxiparina® (dnevno (□); tjedno (■)), Fraxiparine®-a (dnevno (∆); tjedno (▲)); Lovenox®/Clexane®-a (dnevno (•); tjedno (○)) i PBS kontrole (x). Sva tri različita tipa LMWH, i iz različitih izvora, pokazala su značajnu inhibiciju artritisa kad su davana tjedno, ali ne i dnevno.

Tretiranje pomoću LMWH sprečava odbacivanje alogenog transplantata

Štakori Wistar su podvrgnuti transplantaciji alogenog BN srca (Ono, K. and Linsay, E. S., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (1969) 45: 225-229). Od dana pred transplantaciju, štakorima je subkutano ubrizgavano po 20 µg Fragmina® ili PBS kontrole (Sl. 6, • i o, respektivno), u sedmodnevnim intervalima i promatrano je preživljavanje. Kao dan odbacivanja računat je dan kad bi transplantirano srce prestalo kucati, što je utvrdivano palpacijom abdomena. Slika 6 pokazuje da je kod štakora, tretiranih tjednim dozama LMWH, značajno veći stupanj opstajanja alogenog transplantata srca.

Biološki efekt LMWH na diabetes mellitus ovisan o insulinu (IDDM) kod NOD miševa

Kod miševa vrste NOD, spontano se razvija jedan oblik diabetes mellitus ovisan o insulinu tipa I (IDDM) koji je prihvaćen kao model za humani IDDM (Castano, L. and Eisenbarth, G. S., Annu. Rev. Immunol. (1990) 8: 647-679). Bolest počinje u starosti od 4-5 tjedana pojavom insulitisa, upale pankreasnog otočića. Insulitis progresivno oštećuje beta stanice koje stvaraju insulin, a koje su senzitivne na oštećivanje pomoću TNF-α. U starosti od oko 4-5 mjeseci, dovoljan broj beta stanica je uništen, tako da dijabetes postaje očigledan.

Da bi se testiralo da li tretiranje pomoću LMWH može utjecati na proces IDDM, skupina od 10 ženki NOD miševa je tjedno tretirana subkutanim injekcijama od po 5 µg Fragmina® (serija 38609) po mišu, dozom koja predstavlja 12 mišjih jedinica po kg. Kontrolna skupina od 10 miševa je tretirana injekcijama slane otopine. U starosti od 5 mjeseci, svim miševima je puštena krv da bi se odredio razvoj IDDM korištenjem standardnog postupka (Elias, D. et al., Proc. Natl . Acad. Sci. U.S.A. (1990) 87: 1576-1580). Slika 7 pokazuje da su kontrolni miševi ("bez") imali abnormalnu glukozu u krvi (400 mg/dl). Naprotiv, miševi tretirani pomoću LMWH, imali su normalnu glukozu u krvi (100 mg/dl). Prema tome, tretiranje pomoću LMWH zaista može izliječiti IDDM.

Tretiranje alergije pomoću LMWH

Mnogim alergičnim pacijentima, intradermalno djelovanje specifičnim antigenima ili anti-IgE inducira trenutačno izbijanje modrica i upaljenih mjesta na koži, a 4-8 sati kasnije, počinje razdoblje upornog oticanja i prodiranja leukocita, označeno kao kutana reakcija kasne faze. Reakcije kasne faze (LPR, od engl. late phase reactions)2 su prvobitno opisane na koži (Solley, G. O. et al., J. Clin. Invest. (1976) 58: 408-420). Međutim, sada je jasno da se kasnije posljedice reakcija ovisnih o IgE, svakako uključujući infiltraciju reakcijskih mjesta leukocitima, donijetim krvlju, također javljaju u respiratornom traktu i drugim anatomskim lokacijama (Lemanski, R.F. i Kaliner, M., u Allergy: Principles and Practise, Vol. 1 (1988), Middleton, Jr., E. et al. (Eds.), str. 224-226). Stvarno, ima uvjerljivih argumenata da mnoge od klinički značajnih posljedica reakcija ovisnih o IgE, kako na koži, tako i u respiratornom sustavu, reflektiraju djelovanja leukocita "regrutiranih" na ova mjesta za vrijeme LPR, prije nego izravne efekte medijatora oslobođenih u ranim intervalima poslije izazivanja antigenom (Kay, A. B., J. Allergy Clin. Immunol. (1991) 87:893-910).

U posljednje vrijeme je široko priznato da u osnovi kroničnih alergijskih oboljenja, kao što su astma i atopički dermatitis, leži upalni proces koji uključuje infiltraciju i aktivaciju uglavnom eozinofila i T stanica (Kay, A.B., J. Allergy Clin. Immunol (1991) 87:893-910).

Dokazi s više strana podržavaju hipotezu da se infiltracija leukocitima, povezana s LPR, javlja kao rezultat degranulacije "mast" stanica. I u čovjeku i u eksperimentalnim životinjama, sredstva koja induciraju degranulaciju "mast" stanica bilo mehanizmom ovisnim o IgE, bilo nekim drugim, također mogu izazvati prodiranje leukocita u reakcijska mjesta (Solley, G. O. et. al., J. Clin. Invest. (1976) 58:408-420; Lemanski, R. F. i Kaliner, M., u Allergy: Principles and Practice, Vol. 1 (1988), Middleton, Jr., E. et al. (Eds.), str. 224-226; Kay, A. B., J. Allergy Clin. Immunol. (1991) 87:893-910). Pregled medijatora, koji može biti proširen za aktivirane "mast" stanice, otkriva mnoge koji možda pridonose infiltraciji leukocita u LPR, uključujući lipidne medijatore kao što su LTB4, LTC4, LTD4, PGD2 i PAF (od engl. platelet activating factor - faktor aktiviranja krvnih pločica), kao i nekoliko peptidnih ili proteinskih hemotaksičnih faktora (Holgate, S. T. et. al., Allergy: Principles and Practice, Vol. 1 (1988), Middleton, Jr., E. et. al. (Eds.) , str. 135-178). Ova druga sredstva variraju u veličini od tetrapeptidnih "eozinofilnih hemotaksičnih faktora anafilaksisa" do "neutrofilnih hemotaksičnih faktora" vrlo velike molekularne težine.

Nedavno je identificirano još eventualnih medijatora u infiltraciji leukocita, vezanih za "mast" stanice, koji uključuju citokine slične ili istovjetne s INF-α, IL-1α, i četiri člana genetske obitelji malih izlučenih peptida MIP-1 (Gordon, J. R. et al. Immunol. Today (1990) 11:458-464). Pokazano je da četiri od ova citokina (TNF-α, IL-1α, MIP-1α i MIP-1β) imaju sposobnost da potpomognu prodiranja leukocita.

Još prije, Wershil, B. K. et. al. (u J. Clin. Invest. (1991) 87:446-453) su prikazali, koristeći miševe sa nedostatkom "mast" stanica, da angažiranje leukocita za vrijeme LPR, zavisne od IgE, ovisi od "mast" stanica i da je ovu inhibiciju djelomično blokiralo lokalno davanje anti-TNF-α antiseruma. Danas je široko prihvaćeno da je inhibicija stanične infiltracije/aktivacije, povezana s LPR ovisnim o IgE, suštinski teorijski prilaz u ublažavanju raznih alergijskih oboljenja (Barnes, P. J., N. Eng. J. Med. (1989) 321: 1517-1527).

Na iznenađenje prijavilaca ovog izuma, nađeno je da LMWH u znatnoj mjeri inhibiraju infiltraciju leukocita za vrijeme kutane LPR ovisne o IgE u miševima podvrgnutim pasivnoj kutanoj anafilaksi (PCA, od engl. passive cutaneous anaphylaxis).

Miševi su primili i.d. injekciju (u uši) monoklonskog IgE anti DNP Ab (≈20 ng). Dan kasnije, miševima je intravenozno ubrizgan DNP30-40-HSA u slanoj otopini. Oticanje uha je određivano kao mjerenje debljine uha mikrometrom prije i u različitim intervalima poslije davanja DNP-HSA. U svim eksperimentima, tkiva sa mjesta PCA reakcija su dobivena poslije žrtvovanja dislokacijom cerviksa i obrađena su u odnosu na Giemsa-obilježene dijelove. LMWH je miševima dat jednom, subkutanom injekcijom (5 μg/miš) drugog dana.

Rezultati

Oticanje je brzo napredovalo na mjestima PCA reakcija (Δ=35 x 10-4 inča za 15 minuta), a ne i na kontrolnim mjestima (na ušima gdje je ubrizgan sam razblaživač). Otoci na mjestima PCA su se znatno smanjili između 2 i 4 sata nakon intravenoznog davanja antigena.

Kontrolna i PCA mjesta su histološki određena 6-8 sati nakon i.v. davanja antigena. Većina "mast" stanica je pokazivala ekstenzivnu ili umjerenu degranulaciju. Naprotiv, < 5% "mast" stanica na kontrolnim mjestima je pokazivalo primjetnu degranulaciju. Značajna neutrofilna infiltracija je bila samo na mjestima PCA 6 sati poslije davanja antigena. Ova infiltracija je primjetno reducirana (za 60%) u miševima koji su bili tretirani sa LMWH 2 dana unaprijed. Nije bilo efekta ovog lijeka na stupanj degranulacije "mast" stanica. Nije bilo efekta lijeka na ukupni i diferencijalni broj leukocita u perifernoj krvi ovih životinja. Može se zaključiti da LMW heparin inhibira staničnu infiltraciju povezanu sa kasnom kutanom reakcijom zavisnom od IgE. Pored toga, prijavioci također očekuju da će davanje LMWH imati djelotvoran učinak na kutanu LPR u životinjama s aktivnim kutanim anafilaksisom (stvaranje specifičnih IgE će biti inducirano pomoću DNP-HSA Alum). Također se predviđaju slični terapeutski efekti na pulmonalnu alergijsku upalu (Tarayre, J. P. et al., Int. J. Immunopharacol. (1992) 14(5): 847-855).

Tretiranje humane DTH pomoću LMWH

Slika 8 pokazuje eksperiment u kojem je četrdesetogodišnji muški dobrovoljac, težine , testiran na DTH reaktivnost na antigen tetanusa (kožna proba Merieux). Izmjereno je zadebljanje od poslije 24 i 48 sati. Zatim je dobrovoljac tretiran subkutanom injekcijom od 3 mg Fragmina® (serija 38609). Nakon 5 dana, dobrovoljac je ponovno testiran na DTH odgovor na tetanus i zadebljanje se smanjilo na oko . Dobrovoljac je testiran ponovno na DTH poslije 3 tjedna ("obnavljanje") i test je pokazao pozitivnu reaktivnost (zadebljanje od na 24 i 48 sati). Dobrovoljac je zatim tretiran Fragminom® kao i ranije i DTH. Reaktivnost je mjerena opet nakon 7 dana ("7 dana poslije"). Ponovno je DTH inhibirana do oko zadebljanja. Obnavljanje DTH je ponovno nađeno poslije 3 tjedna. Prema tome, LMWH može inhibirati DTH kod ljudi, tretmanom u peto- i sedmodnevnim intervalima, u dozi manjoj od 5 mg.

Eksperimenti u kojima se koristi LMWH (Fragmin®) i druge aktivne supstancije

Proučavanje stabilnosti inhibitornog djelovanja LMWH-a (Fragmin®) na TNF-α

Fragmin® serije 38609 je razblažen normalnom slanom otopinom do koncentracije od 5 μg/0,l ml. Jedan dio je pomiješan sa ekvivalentnom količinom protamin sulfata (5 μg) i bočice su čuvane na sobnoj temperaturi () od 0-72 sata (Tablica XI) ili su ostavljene na u toku od 1-4 mjeseca (Tablica XII) . Fragmin sa ili bez protamin sulfata je onda korišten in vivo da inhibira DTH reakciju T stanica u BALB/c miševima, kao što je prije opisano. U ovim eksperimentima, pozitivna kontrola DTH je bila 17.5 ± 1.2 x 10- (0% inhibicije), a potpuno inhibirani DTH je bio 2.6 ± 0.5 x 10- (100%-na inhibicija). Rezultati inkubacije LMWH na su nabrojani u Tablici XI. Očigledno je iz Tablice XI da LMWH gubi svoje inhibitorno djelovanje na DTH reakciju, u kojoj sudjeluju T stanice i koja ovisi o TNF-α, inkubiranjem na sobnoj temperaturi preko 72 sata. Naprotiv, heparin i LMWH sporo gube svoje antikoagulantno djelovanje na sobnoj temperaturi.

Tablica XI. Stabilnost inhibitornog djelovanja na DTH reakciju Fragmina® (serije 38609, 5 μg/0,1 ml), bez protamin sulfata, na .

[image] * nema inhibicije

** potpuna inhibicija

Gubitak antiDTH reaktivnosti na niskoj temperaturi i stabilizirajući efekt dodanog protamin sulfata

Tablica XII pokazuje da Fragmin gubi svoju sposobnost da inhibira DTH reaktivnost T stanica miša u razblaženoj otopini tijekom 4 mjeseca na . Dodatak ekvivalentne koncentracije protamin sulfata ne interferira sa inhibicijom DTH reakcije, nego upravo čuva ovu aktivnost intaktnu poslije 4 mjeseca na . Da ponovimo, ovaj rezultat je suprotan normalnoj ulozi protamin sulfata koji, kad se doda heparinu ili Fragminu, neutralizira antikoagulantne efekte heparinoidnih supstanci.

Tablica XII. Gubitak anti-DTH aktivnosti tijekom vremena, na niskoj temperaturi i stabilizirajući efekt dodanog protamin sulfata

[image] * nema inhibicije

** potpuna inhibicija

Dobivanje pločica prevučenih ECM

Ležišta, prevučena ECM, dobivena su na sljedeći način. Svježe izvađene goveđe oči su nabavljene iz klaonice, nekoliko sati poslije klanja. Oči su secirane u kapeli da bi se odstranila rožnica. Rožnica je zatim ostrugana skalpelom da bi se dobile endotelne stanice iz nje. Ove stanice su kultivirane na pločama za tkivne kulture sa približno 5 ml medija koji je sadržavao DMEM, obogaćen 10% fetalnim telećim serumom, 5% telećim serumom sa antibioticima, kao što je 1% streptomicin ili 1% neostatin, zajedno s 1% glutaminom kao stabilizatorom. Nakon približno 2 dana zasijavanja stanice su se staložile, medij im je mijenjan na svaka 4 dana i inkubirane su na u inkubatorima sa 5% CO2 i povećanom vlažnošću. Po želji, može se dodati neki faktor rasta iz fibroblasta (FGF, od engl. fobroblast growth factor), premda dodatak FGF nije bitan. Kad su stanice konfluentne (poslije približno 2 tjedna), supernatant je usisan sa njih i stanice su tripsinizirane sa 1-2 ml tripsina.

Osamdeset posto ovih primarnih stanica (sudbina ostalih 20% je opisana odmah ispod) je uzeto i podijeljeno na 5 ravnih ploča s po 96 ležišta. Stanice su kultivirane u DMEM, obogaćenom 4% dekstranom T-40, 10% fetalnim telećim serumom i 5% telećim serumom. Nakon oko 7 dana inkubacije na u inkubatorima sa 10% CO2 i s povećanom vlažnošću, dobiveni konfluentni slojevi endotelnih stanica su lizirani. Pufer za liziranje, koji sadrži NH4OH sa 0,25% Tritona X u PBS, je ostavljen preko stanica 10 minuta, onda je dekantiran. Sadržaj ploča je zatim ispran tri puta PBS-om, ohlađenim do . Prethodni postupak je ostavio ECM intaktan, čvrsto vezan za cijelu površinu ležišta. Dobiveni ECM je također bio bez jedara i staničnih ostataka. Ploče prevučene ECM-om mogu se čuvati na najmanje 3 mjeseca.

Preostalih 20% primarnih stanica su ostavljene na jednoj ploči i kultivirane u približno 5 ml medija koji je obogaćen 10% fetalnim telećim serumom, 5% telećim serumom i antibioticima, kao što je opisano gore. Ovaj sekundarni prinos stanica je ostavljen da postane konfluentan, pa je tretiran tripsinom, kao što je opisano gore. Ponovno, tripsinizirane stanice su podijeljene, 80% je kultivirano na 5 ploča u medijumu sa 4% Dextrana T-40 i 20% je kultivirano na jednoj ploči, kao ranije. Moguće je još jednom izvesti ovu 80/20 diobu sa jedne ploče.

Razgradnja sulfatiranih proteoglikana

ECM, obilježen pomoću 35(S)O4, je inkubiran sa 5 μl MM5 heparanaze (4 j/ml) u 1 ml PBS i 100 μl fosfatno-citratnog pufera (pH 6,2) 48 sati na . Medij je zatim pokupljen, centrifugiran na 5 minuta (po izboru) i analiziran filtracijom na gelu na kolonama Sepharose 4B. Dva ml frakcija je eluirano PBS-om sa brzinom protoka od 5 ml/h i izmjerena im je radioaktivnost pomoću tekućine Bio-Flour Scintillation.

Ovaj eksperiment s obilježavanjem pomoću 35(S)O4 pokazuje da je ECM u stvari razgrađen, da su dobiveni proizvodi razgradnje uspješno oslobođeni i, čak da su pravilno filtrirani kroz stupce Sepharose 4B. Sljedeći eksperimenti, u vezi razgradnje sulfatiziranih proteoglikana, vršeni su na neobilježenom ECM-u uz praćenje proizvoda razgradnje po apsorpciji na 206 ili 232 nm.

Eksperimenti sa razgradnjom enzima su vršeni kao gore i, dodatno, proizvodi razgradnje (DECM) su dalje pročišćeni stavljanjem razgrađenih proteiglikana, koji su eluirani sa stupaca Sepharose, na HPLC stupce. HPLC analiza frakcija sa stupaca Sepharose provedena je na način opisan u odjeljku 6.11 et seq. Proizvodi razgradnje su detektirani apsorpcijom na 206 nm.

Slične rezultate su pokazali dodatni eksperimenti sa razgradnjom enzima koji su vršeni uz korištenje enzima PC3 i heparanaze, nabavljene iz IBEX-a.

Pročišćavanje humanih CD4+ T stanica

CD4+ T stanice su dobivene iz leukocita sa jednim jedrom iz periferne krvi zdravih humanih donatora na sljedeći način. Stanice sa jednim jedrom su izolirane na gradijentu Ficoll-a, oprane u RPMI, obogaćenom 10% fetalnim telećim serumom i antibioticima, u petri šalicama i inkubirane na u inkubatorima sa 10% CO2 i s povećanom vlažnošću. Nakon 1 sat, neadherirane stanice su uklonjene i inkubirane na stupcima od najlonske vune (Fenwall, IL) 45-60 minuta na u inkubatorima sa 10% CO2 i s povećanom vlažnošću. Neadherirane stanice su eluirane i oprane. CD4+ T stanice su negativno selektirane izlaganjem eluiranih stanica smjesi sljedećih monoklonskih antitijela (mAb): anti-CD8, CD19 i CD14, vezanih za magnetne kuglice (Advanced Magnetics, Cambridge, MA). Slobodne stanice su pokupljene i njihovi fenotipovi su ispitani. Dobivene pročišćene stanice su pretežno bile CD3 + CD4, što je određeno FACScan analizom.

Biološki test aktivnosti TNF-α pomoću humanih CD4+ T stanica dobivenih iz PBL

Dvjesto pedeset tisuća humanih CD4+ T stanica je prvo inkubirano sa 150 μl proizvoda razgradnje ECM-a različitih koncentracija, 1,5 sat na u inkubatorima u atmosferi sa 7% CO2. Zatim je dodano 100 μl PHA (Wellcome Co., England, 1 μg/ml) na još tri sata inkubacije u ravnim pločama sa 96 ležišta (Costar). Zatim je sadržaj ležišta (3-6 ležišta po eksperimentalnoj skupini) skupljen, centrifugiran i mediji su testirani na sekreciju TNF-α, kao što je ranije opisano u odjeljku 5.1. Ukratko, supernatanti kultiviranih limfocita su dodani kulturama staničnih klonova fibrosarkom miša (BALB/c.CL7). BALB/c. CL7 stanice ubija TNF-α u prisutnosti aktinomicina D (0,75 μg/ml) , Noophar, Y. et al., J. Immunol. (1988) 140(10): 3456-3460. Umiranje ovih stanica u prisutnosti testiranog medija, je kalibrirano u odnosu na titracione krivulje dodanog egzogenog TNF. Preživljavanje stanica je određivano inkubiranjem sa MTT tetrazolijumom (Sigma, Cat. No. M2128) 2 sata, ekstrahirajući boju, koju su uzele stanice, pomoću izopropanol-HCl smjese i kalorimetrijskim kvantificiranjem (na 570 nm) pomoću Microelisa Autoreader. Određivanje tipa TNF-α je urađeno ispitivanjem neutralizirajućeg efekta anti-mišjeg TNF-α mAb (razblaženog 1/400; Genzyme, MA).

Razgradnja heparina

Jedan ml heparina (Sigma) u 1 ml PBS i 100 μl fosfatno-citratnog pufera (pH 6,2) je inkubirano sa 20 μl MM5 (5 j/ml) na 48 sati. Produkti reakcije su zatim analizirani gel filtracijom na stupcima Sepharose 4B. Dvomililitarske frakcije su eluirane PBS-om pri brzini protoka od 5 ml/h. Da bi se bliže okarakterizirali proizvodi razgradnje, pikovi eluirani sa stupca Sepharose 4B su podvrgnuti HPLC razdvajanju uz korištenje Toyo Soda-Gel G3000SW i G20000SW HPLC stupaca, kao što je opisano u odjeljku 6.11. i sljedećim.

Dodani eksperimenti su vršeni korištenjem 20 μl PC3. Enzimska reakcija PC3 je vršena sa 1 mg heparina pod istim uvjetima kao što je opisano za MM5, osim što je reakcija inkubirana 24, umjesto 48 sati. Produkti reakcije su zatim analizirani gel filtracijom na stupcima Sepharose 4B (Sl. 29). Rezultati biološkog testa in vitro su prikazani u Tablici XIX, niže.

Izazivanje DTH odgovora u miševima i ispitivanje inhibitornih efekata

BALB/c miševi (najmanje 5 miševa u skupini) su senzitivirani 3%-nim 4-etoksimetilen-2-fenil oksazolonom (OX; BDH Chemicals, GB) u smjesi aceton/maslinovo ulje, primijenjenim lokalno na obrijani abdomen. DTH senzitivnost je izazvana poslije 5 dana na sljedeći način. Miševima je dan 0,5% OX u smjesi aceton/maslinovo ulje. Uho je mjereno tik pred davanje i 24 sata kasnije pomoću inžinjerskog mikrometra Mitutoyo (Japan). Pojedinačna mjerenja otoka uha su usmjerena po skupinama miševa. Da bi sudjelovale u DTH odgovoru, LMW imuno-regulatorne frakcije, razblažene u PBS, su davane tretiranim miševima subkutano u leđa, u određena vremena i u određenim koncentracijama. Pregledima tretiranih miševa, za vrijeme i poslije (> 2 mjeseca) tretmana, nisu nađeni nikakvi veći popratni efekti.

Razdvajanje LMWH (Fragmina) na stupcu (Sepharose 4B) kromatografijom sa isključivanjem čestica po veličini

Fragmin (serije 38609) i neaktivni Fragmin su frakcionirani gel filtracijom na stupcima Sepharose 4B (Pharmacia). Frakcije od 0,5 ml su eluirane PBS-om pri brzini protoka od 5 ml/h i praćena im je apsorbanca na 206 nm. (Na 280 nm nije detektirana apsorpcija). Na Sl. 11 je dan grafikon koji prikazuje broj frakcije prema apsorpciji na 206 nm. Rezultati bioloških testova za izabrane frakcije su prikazani u tablicama XIII i XIV, niže.

Tablica XIII. Efekt cijelog Fragmina, Sepharose 4B-frakcija Fragmina i HPLC-frakcije od Sepharose 4B-frakcije na sekreciju aktivnog TNF, pomoću PBL biološkog testa

[image]

a - u opsegu koncentracija 1 μg/ml - 0,001 pg/ml

b - u opsegu koncentracija 1 μg/ml - 0,01 pg/ml

Tablica XIV. Efekt cijelog Fragmina i Sepharose 4B-frakcija fragmina na DTH senzitivnost kod miševa

[image]

Dodatni eksperimenti sa frakcioniranjem Fragmina i ECM, degradiranog heparanazom

Fragmin i ECM, degradiran heparanazom su frakcionirani gel filtracijom na stupcima Sepharose 4B. Frakcije od 0,2 ml su eluirane PBS-om pri brzini protoka od 5 ml/h i praćena im je apsorbanca na 206 nm. (Nije detektirana nikakva apsorbanca na 280 nm). Na Sl. 14 predstavljen je grafikon ovisnosti broja frakcija od apsorpcije na 206 nm. Rezultati bioloških testova za izabrane frakcije dani su u Tablici XV.

Tablica XV. Efekt Sepharose 4B-frakcija Fragmina i DECM na sekreciju aktivnog TNF prema biološkom testu na humanim PBL.

[image] a - u opsegu koncentracija 1 μg/ml - 0,001 pg/ml

Izdvajanje aktivnih supstancija iz Fragmina pomoću HPLC

Provedena su dva eksperimenta koristeći dva skupa uvjeta HPLC. Početni tip stupca koji je korišten je bio TSK-GEL® G-Oligo-PW, x u.p., sa zaštitnim stupcem, x u.p. Stupac je eluiran fosfatnim puferom, pH 7,0, pri protoku od 0,5 ml/min. Svaka od pokupljenih frakcija je zauzimala 0,5 ml.

Drugi tip HPLC koji je korišten je bio sastavljen od Toyo Soda TSK-Gel G3000SW ( x ) i G20000SW ( x ) stupaca (redno vezanih), sa zaštitnim stupcem od x od Phenomenex-a. Stupac je eluiran pri 1 ml/min. uz pažljivo degazirani NaCl. Pokupljene su frakcije od 0,5 ml. Detektor je namješten na 232 nm sa 0,02 AUFS i vremenima retencije mjerenim do ± 0,1 s. Prazna i ukupna zapremina su mjerene pomoću plavog dekstrana i natrij azida. Frakcije su promatrane i na 206 nm, pod istim uvjetima kao i na 232 nm.

Na Sl. 18A dan je grafikon broja HPLC-frakcija Fragmina prema apsorpciji na 206 nm. Rezultati bioloških testova za odabrane frakcije predstavljeni su u Tablici XVI. Očigledno je iz prikazanih rezultata da su određene supstancije sposobne inhibirati aktivnost TNF-α, dok su druge sposobne pojačati ih.

Tablica XVI. Efekt cijelog Fragmina i HPLC-frakcija Fragmina na sekreciju aktivnog TNF prema biološkom testu na humanim PBL.

[image]

a Ovaj uzorak cijelog Fragmina je stario 90 dana na .

Izdvajanje aktivnih supstancija iz ECM pomoću HPLC

Izdvajanje aktivnih supstancija iz ECM pomoću HPLC je izvođeno kao što je opisano u odjeljku 6.11.

Na Sl. 18B dan je grafikon broja HPLC-frakcija ECM prema apsorpciji na 206 nm. Rezultati bioloških testova za izabrane frakcije prikazani su u Tablici XVI. Očigledno je iz prikazanih rezultata da su određene supstancije, izolirane iz razgrađenog ECM pomoću heparanaze, sposobne inhibirati aktivnost TNF-α, dok su druge sposobne pojačati je. Rezultati također pokazuju da određene frakcije dobivene izdvajanjem pomoću HPLC nemaju nikakav efekt na aktivnost TNF.

Tablica XVII. Efekt HPLC-frakcija DECM na sekreciju aktivnog TNF prema biološkom testu na humanim PBL.

[image] a - u opsegu koncentracija 1 μg/ml - 0,001 pg/ml

Karbazolski kvantitativni test šećera

Ukratko, 1500 μl reagensa borsumporne kiseline je ohlađeno u ledenoj kupki. Testirana otopina (250 μl sa 20 μg uronske kiseline/ml) je zatim pažljivo lijevana na površinu reagensa borne kiseline i ostavljena da difundira 10 minuta, a zatim ohlađena u ledenoj kupki. Ohlađeni karbazol (50 ul) je zatim dodan smjesi, promiješan na vorteksu i stavljen u kipuću kupku na 15 minuta. Otopina je onda ohlađena i izmjerena joj je apsorbanca na 525 nm. Rezultati su uspoređeni sa kalibriranim otopinama.

Izoliranje disaharida iz proizvoda razgradnje ECM

Disaharidna supstancija je izolirana pomoću HPLC iz goveđeg endotelnog ECM rožnice, koji je prethodno podvrgnut heparanazi sisavaca (MM5). Preciznije:

Ploča prevučena ECM-om je inkubirana sa 20 μl heparanaze sisavaca (0,5 mg/ml) u 1 ml PBS pufera (koji je prethodno podešen na pH 6,2 pomoću limunske kiseline) na , 48 sati. Medij je zatim prikupljen i stavljen na stupac Sepharose 4B ( x u.p.). Mobilna faza je bio PBS pufer sa brzinom protoka od 5 ml/h. Frakcije od 2,2 ml su sakupljene i praćene na 206 nm (Sl. 19). Uzorak (100 μl) iz Sepharose 4B-frakcije br. 5 (8,8-11 ml elucionog pufera) je ubrizgan u HPLC stupcu (Toyo Soda TSK-Gel F3000SW ( x ) i G2000SW ( x ), redno vezane, sa zaštitnim stupcem od x od Phenomenex-a). Mobilna faza je bila NaCl sa brzinom protoka od 1 ml/min. Jednomililitarske frakcije su skupljane i praćene na 206 i 232 nm (Sl. 20A i 20B). Pik br. 1 (P1) je osušen smrzavanjem u balonu od 25 ml. Uzorak sadrži oko 20 μg oligosaharida (određeno karbazolskim testom) u 60 mg NaCl.

Uzorak ima elucioni profil sličan disaharidnom standardu ili "markeru" molekularne težine, dobivenom komercijalnom depolimerizacijom heparina (Sigma).

Vrijednost Inhmaxove supstancije, bazirana na slično dobivenim uzorcima (vidjeti, na primjer, pik F73 na Sl. 21A (vrijeme eluiranja priblično 44 minute) i vrijednost za F5/HPLC-F73 u Tablici XVIII) , je procijenjena na 87% u in vitro testu na inhibiciju TNF-α pomoću humanih PBL, pri koncentraciji od približno 10 pg/ml. Biološki test je rađen kao što je prije opisano. Ovaj uzorak se može dalje pročišćavati na SAX-HPLC stupcu, kao što je opisano dolje.

Izoliranje disaharida iz proizvoda razgradnje ECM korištenjem SAX-HPLC kromatografije

Ploča prevučena ECM-om je inkubirana sa 20 μl heparanaze sisavaca (0,5 mg/ml) u 1 ml PBS pufera (koji je prethodno podešen na pH 6,2 pomoću limunske kiseline) na , 48 sati. Medij je zatim prikupljen i stavljen na stupac Sepharose 4B ( x u.p.). Mobilna faza je bio PBS pufer sa brzinom protoka od 5 ml/h. Frakcije od 1,6 ml su skupljene i praćene na 206 nm (Sl. 22). Frakcije 7-8 su kombinirane i osušene smrzavanjem; prah je ponovo suspendiran u 1/10 početne zapremine. Jednomililitarske frakcije su skupljene i praćene na 206 i 232 nm (Sl. 23). Pik označen sa "1" je skupljen iz deset identičnih ponavljanja. Suštinski homogene frakcije su kombinirane i osušene smrzavanjem.

Materijal je ponovo suspendiran u 2 ml dva puta deionizirane vode i odsoljen na Sephadex g-10 stupcu (26 x ), eluiran pri 1,6 ml/min dva puta deioniziranom (DD) vodom. Jednomililitarske frakcije su skupljane i praćene na 232 nm i mjerena im je konduktivnost (da bi se odredio sadržaj NaCl). Odsoljene frakcije su kombinirane, osušene smrzavanjem i ponovo suspendirane u 1 ml DD H2O. Jednomililitarski uzorak, pripremljen kombiniranjem 100 μl ove suspenzije i 900 μl NaCl na pH 3,5, je ubrizgan u analitički SAX-HPLC stupac (4,6 x , sa Spherisorb-om, veličina čestica 5 μ). Brzina protoka je 1,5 ml/min i primijenjen je program linearnog gradijenta NaCl na sljedeći način:

[image] A = NaCl, pH = 3,5

B = NaCl, pH = 3,5

C = H2O

Eluent na stupcu je praćen na 232 nm (Sl. 24) , a pik A23/4 je skupljen i testiran na inhiiciju TNF. Nađeno je da je Inhmax za ovu SAX-HPLC frakciju 60% pri koncentraciji od 0,1 pg/ml, što rezultira u "R" vrijednosti od 600% x (pg/ml)-1.

Standardi heparinskih disaharida sa različitim stupnjem sulfatacije su ubrizgani u SAX-HPLC stupcu pod istovjetnim uvjetima. Elucijski profili ovih standarda su predstavljeni na Sl. 25A-C. Kao što se može vidjeti iz ovih slika, disaharidni standardi su dali različita vremena retencije, s najbržom eluacijom (Sl. 25A) nesulfatiranog disaharida (Sigma Product No. H-0895), eluacijom disulfatiranog disaharida (Sigma Product No. H-1020) za manje od 20 minuta (Sl. 25B) i najsporijom eluacijom trisulfatiranog disaharida (Sigma Product No. H-9267) (Sl. ). Standard sa trisulfatiranim disaharidom H-9267 daje vrijeme retencije koje je vrlo slično onom za pik A23/4 (tj. 23,07 min vs i 23,10 min, respektivno).

Rezultati in vitro bioloških testova pomoću humanih PBL za različite supstancije

Rezultati in vitro bioloških testova pomoću humanih PBL za različite aktivne supstancije i polazne "smjese" su prikazani u Tablici XVIII za proizvode razgradnje ECM, uključujući pik P1 sa Slike 20. Dok je "R" vrijednost pika P1 10% x (pg/ml)-1 početna DECM "juha" daje "R" vrijednost od 0,000053% x (pg/ml)-1.

Tablica XVIII. Efekt ECM + MM5 heparanaze (DECM "juha"), Sepharose 4B frakcija "juhe" i HPLC frakcija od Sepharose 4B frakcija na sekreciju aktivnog TNF prema biološkom testu na humanim PBL

[image]

Izoliranje oligosaharida iz proizvoda razgradnje heparina

Na sličan način onom za razgradnju ECM, intaktni heparin je tretiran heparanazom iz različitih izvora, označenom ovdje s MM5 i PC3 (vidjeti, Shoseyov, O. et al., Biochem., Biophys. RES. COMM.(1990) 169: 667-672, za pripremu enzima PC3). Neke od početnih smjesa za razgradnju su razdvojene na Sepharose 4B (vidjeti Sl. 26 za Sepharose 4B frakcije heparina + MM5, F7 i F8, a Sl. 27 za Sepharose 4B-kromatografiju heparina + PC3 i samog PC3) . Još neke frakcije su dalje izdvojene HPLC II metodama, opisanim gore (vidjeti Sl. 28A i 28B za frakcije F7/HPLC-F86, -F84 i -F90). "Intaktni" heparin i Fragmin su također podvrgnuti direktnim HPLC II uvjetima i izabrane frakcije su na isti način izolirane (HPLC-F90 iz Fragmina je pokazana na Sl. 29) . Rezultati in vitro bioloških testova pomoću humanih PBL za različite aktivne supstance i polazne "smjese" su prikazani u Tablici XIX, uključujući proizvode razgradnje heparina.

Tablica XIX. Efekt intaktnog heparina, heparina + MM5 ili PC3 "juha" i odabranih Sepharose 4B frakcija i HPLC frakcija istih na sekreciju aktivnog TNF prema biološkom testu na humanim PBL.

[image]

a - u opsegu koncentracija 1 μg/ml - 0,001 pg/ml

Rezultati in vivo DTH reaktivnosti kod miševa, tretiranih različitim supstancijama

Niz supstancija je testiran po in vivo uvjetima bioloških testova i nađeno je da inhibiraju eksperimentalnu DTH senzitivnost miševa do različitih nivoa, u ovisnosti o stupnju pročišćenosti. Miševi su tretirani aktivnom supstancijom kao što je opisano u odjeljcima 5.1. i 5.2. U načelu, supstancije pročišćene do bitne homogenosti pomoću HPLC daju "R" vrijednost reda veličine 104. Rezultati jedne skupine eksperimenata su prikazani u Tablici XX.

Tablica XX. Tjedni tretman miševa različitim supstancijama i njihov efekt na DTH senzitivnost

[image]

a - u opsegu koncentracija 0,04 - 0,0004 μg/g miša.

Kao što se vidi iz Tablice XX, intaktni heparin i početna "juha" od ECM i MM5 ne pokazuju nikakav efekt in vivo. U ovom drugom slučaju, efektna nema najvjerojatnije zato što se poništavaju efekti inhibitornih i pojačavajućih komponenata. Svjež uzorak Fragmina (serije 38609) pokazao je skromnu "R" vrijednost, usporedivu s onom dobivenom u prijašnjim eksperimentima (pogledaj prvi red u Tablici IX). Sepharose 4B frakcija je pokazala nešto nižu "R" vrijednost nego odgovarajuće frakcije dobivene pod HPLC II uvjetima.

Rezultati iz drugog skupa eksperimenata, nabrojani u Tablici XXI, potvrđuju odsutnost bilo kakvog efekta u početnoj "juhi" ECM + MM5. Značajno je da je HPLC II frakcija br. F5/HPLC-L22, koja pokazuje vrlo visoku specifičnu regulatornu aktivnost kad se subkutano ubrizga miševima ("R" vrijednost = 454 545 % x (μg/g)-1), također pokazala aktivnost pri oralnom davanju, premda u većoj dozi ("R" vrijednost = 5000 % x (μg/g)-1). Također je očigledno iz Tablice XXI da aktivne supstancije, izolirane iz ECM, imaju veću specifičnu regulatornu aktivnost in vivo nego one dobivene iz Fragmina. Prma tome, prividna desulfatacija reducira specifičnu regulatornu aktivnost aktivnih supstanci iz sadašnjeg izuma. Ustvari, pod in vitro uvjetima biološkog testa pojačavajuće "R" vrijednosti se dobivaju iz takvih "desulfatiziranih" disaharida.

I drugi eksperimenti su također demonstrirali da je galaktozamin, monosaharid ili jednostavan šećer koji nema sulfatne skupine, sposoban djelovati kao antagonist inhibitorne aktivnosti sulfatiziranih oligosaharida iz sadašnjeg izuma. Prema tome, moguće je da desulfatizirani oligosaharidi djeluju kao direktne pojačavajuće komponente ili kao antagonisti specifične inhibitorne aktivnosti karboksiliranih i/ili sulfatiziranih oligosaharida. Zapažanja istraživača su također u suglasnosti s mehanizmom, po kome se određene supstancije (npr. trisulfatizirani disaharid) ponašaju kao agonisti još neidentificiranog prirodnog inhibitora sekrecije aktivnog TNF-α.

Tablica XXI. In vivo DTH reaktivnost kod miševa tretiranih subkutano različitim supstancijama

[image]

a - u opsegu doza od 0,04 - 0,0004 μg/g miša

b - dano oralno

Pozitivna kontrolna skupina je imala DTH odgovor od 20,0 ± 1,1, a negativna kontrolna skupina 2,0 ± 1,0.

Usporedba aktivnosti in vivo SAX-HPLC frakcija i poznatih disaharidnih markera

Dva disaharidna markera su testirana pod in vivo uvjetima da bi se odredila njihova sposobnost da inhibiraju relativnu DTH reaktivnost miševa. Kao što je pokazano u Tablici XXII, dva markera (H-1020 i H-9267) su pokazala umjerenu aktivnost s "R" vrijednostima između 140000 i 160000 % x (μg/g)-1 kad su subkutano ubrizgana miševima. Marker H-1020 je također testiran pri oralnom davanju i nađeno je da ima skromnu aktivnost ("R" vrijednost = 531% x (μg/g)-1). Marker H-1020 je O,N-di-sulfat, dok je H-9267 O,O,N-tri-sulfat. Njihove strukture su prikazane niže.

[image]

H-1020 H-9267

Kao što je prikazano u Tablici XXII, SAX-HPLC frakcija L22/SAX-A23/4 (Sl. 24) je pružila daljnji napredak u odnosu na već visoku specifičnu inhibitornu aktivnost F5/HPLC-L22, s "R" vrijednošću od 630303 % x (μg/g)-1 u usporedbi s "R" = 454545 % x (μg/g)-1 za F5/HPLC-L22 (Tablica XXI). Otkriveno je, međutim da ova disaharidna supstancija, s retencijskim vremenom kroz SAX-HPLC stupac skoro identičnim kao za H-9267, gubi svoje sulfatne skupine na pH ≈ 3,5 tijekom nekoliko dana na sobnoj temperaturi. Tako je ponovna analiza kroz SAX-HPLC stupac ostarjelog uzorka otkrila da su se iz originalnog pika na 23,10 min. stvorila tri glavna pika, označena s 2039/1, 2039/2 i 2039/3 na Slici 30, i sva tri imaju vrijeme retencije kraće nego A23/4. Pik 2039/3, s vremenom retencije sličnim kao marker H-1020, izgleda da je izgubio N-sulfatnu skupinu.

Pikovi 2039/1 i 2039/2 izgleda da odgovaraju monosulfatiranim ili potpuno desulfatiranim disaharidima. (Njihova vremena retencije su usporediva s disaharidnim markerom H-0895, koji je N-acetilglikozmainoglikan bez sulfatnih skupina.)

Ove "desulfatirane" supstancije su skupljene i testirane pod in vivo uvjetima biološkog testa za DTH i nađeno je neočekivano da imaju samo umjerenu ili nikakvu inhibitornu aktivnost (vidjeti Tablicu XXII). Zaista, pod uvjetima in vitro biološkog testa uz korištenje humane PBL, sva tri pika su ispoljila pojačanje sekrecije aktivnog TNF-α. Ovi in vitro rezultati su dani niže:

[image]

Tablica XXII. Dodatni in vivo rezultati subkutanog davanja niza saharida

[image]

a - dano oralno

Daljnji rezultati o sposobnosti odabranih disaharida da reguliraju in vivo stvaranje aktivnog TNF-α

Vršeni su dodatni eksperimenti u kojima su molekule izabranih disaharida, komercijalno nabavljene od Sigma Chemicals, Co. i identificirane ovdje po svojim odgovarajućim komercijalnim kataloškim brojevima, testirane su na sposobnost da inhibiraju ili pojačaju eksperimentalnu DTH reakciju u miševima i da s tim ukazu na svoju sposobnost da reguliraju stvaranje aktivnog TNF-α u ovim sisavcima.

Konkretno, CD1 miševi (dostupni iz Weizmann Institute Animal Breeding Center, Rehovot, Israel), 4-12 miševa u skupini, su tretirani kao što je opisano u odjeljku 5.2 ili 6.8.

Rezultati različitih eksperimenata su sumirani u Tablici XXIIIA. Kao što se vidi, 4 od 11 testiranih disaharida je pokazalo inhibitorni efekt na oticanje ušiju miševa kao odgovor na dani oksazolon. Inhibicija inflamatornog odgovora koji daju T stanice je, prema tome, indikacija da disaharidi s nenultom "R" vrijednošću mogu regulirati nadolje stvaranje aktivnog TNF-α. Iz rezultata u Tablici, "R" vrijednosti se kreću u opsegu od relativno skromne 65000 % x (μg/g)-1 do preko 1500000 % (μg/g)-1. Treba naglasiti da visoka "R" vrijednost nije nužno najpoželjnija karakteristika aktivnog spajanja od interesa. Konkretno, "prozor" doza, unutar kojeg određeni spoj pokazuje fiziološke efekte, treba biti što veći, tako da vjerojatnost da dana doza ispadne iz efektivnog opsega bude što manja. Kao što je naznačeno u fusnoti Tablice XXIIIA, izgleda da molekula H-9392 ima najširi prozor doza, 0,000132-0,004 μg/g testiranog spoja.

Isto tako je iz rezultata očigledna zapanjujuća sposobnost jednog od 11 testiranih disaharida da pojača oticanje izazvano eksperimentalnom DTH reakcijom T stanica. Spoj H-0895, koji nema sulfatne skupine, pokazuje ogroman efekt na nivo oticanja pri vrlo niskim dozama od oko 1,2 pg disaharida po gramu miša. Dobivena "R" vrijednost od oko 76700000 % x (μg/g)-1 za sada nema konkurenciju.

Tablica XXIIIA. Dodatni in vivo rezultati subkutanog davanja niza disaharidnih markera

[image]

a H-9392 je 2-O-sulfat-4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-sulfatglukozamin. PBS (pozitivna kontrola) vrijednost za ovaj skup podataka je prikazan u zagradi. Oticanje naivnih (neimuniziranih) miševa je 2,0 ± . Ova vrijednost je korištena za sva gornja izračunavanja. Opseg efektivnih doza za inhibiciju ≥ 50% kontrole je 0,000132-0,004 μg/g.

b H-1020 je 4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-sulfat-6-O-sulfatglukozamin. Opseg efektivnih doza za inhibiciju ≥ 50% kontrole je 0,00004-0,0004 μg/g. "R" vrijednost prikazana u ovoj Tablici je nešto veća od prijašnje "R" vrijednosti, navedene u Tablici XXII. Ovi rezultati ukazuju na sjajnu reproducibilnost metoda in vivo testa u različitim skupinama vrste CD1 miševa.

c H-9267 je 2-O-sulfat-4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-sulfat-6-O-sulfatglukozamin. Opseg efektivnih doza za inhibiciju ≥ 50% kontrole je mali.

d H-9517 je 2-O-sulfat-4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-aceti1-6-O-sulfatglukozamin. Opseg efektivnih doza za inhibiciju ≥ 50% kontrole je 0,00004-0,00012 μg/g.

e H-0895 je 4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-acetilglukozamin. Ovaj rezultat ukazuje na pojačanje DTH reakcije. Opseg efekivnih doza za pojačanje ≥ 50% kontrole je 0,000001-0,00004 μg/g.

f H-9017 je 4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-6-O-sulfatglukozamin. "n.e." znači da nije bilo efekta u testiranom opsegu doza od 0,000004-4 μg/g miša.

g H-8642 je 4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-aceti1-6-0-sulfatglukozamin.

h H-9142 je 2-O-sulfat-4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezosiglukozamin.

i H-8767 je 2-O-sulfat-4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-acetilglukozamin.

j H-8892 je 2-O-sulfat-4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-6-O-sulfatglukozamin.

k H-1145 je 4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-sulfatglukozamin.

Strukture 4 inhibitorna disaharidna spoja, H-9392, H-9517, H-1020 i H-9267, su prikazane dolje.

INHIBITORI

[image]

Od 11 testiranih disaharida, 6 nije pokazalo nikakve konzistentne efekte i, prema tome, oni se mogu klasificirati kao "neutralni". Strukture ovih "neutralnih" spojeva su prikazane niže.

NEUTRALNI

[image]

Od 11, 1 disaharid pojačava efekte eksperimentalne DTH reakcije. Ovaj spoj H-0895, ima strukturu pokazanu dolje.

[image]

Iz svega slijedi da je moguće predložiti generičku formulu koja obuhvaća strukturne karakteristike inhibitornih spojeva. Ova generička formula (H-GENUS) je prikazana dolje.

[image]

u kojoj je X1 H ili SO3- ili COCH3, uz uvjet da ako je X3 SO3, onda je barem jedan od X1 i X2 SO3-, a ako je X3 COCH3, onda su oba X1 i X2 SO3-. Kad su u pitanju spojevi koji imaju relativno širok prozor efektivnih doza, poželjno je da X1 bude SO3-, X2H i X3 SO3- (tj. H-9392 ima najveći prozor inhibitornh efektivnih doza).

Može se također uočiti iz prikazanih rezultata da je, u slučaju inhibicije, poželjni supstituent na N-glikozaminu sulfat. Sa sulfatom u 2-N položaju glukozamina (X3), uočava se inhibitorna aktivnost kad je još jedan sulfat prisutan bilo u položaju 2 ostatka iduronske kiseline ili u položaju 6 glikozamina. Efekt bi se postigao i s dva dodatna sulfata u oba hidroksilna položaja, a odsustvo svih dodatnih sulfata (kao u H-1145) stvara "neutralni" spoj.

Naprotiv, uvođenje acetil skupine u 2-N položaj glukozamina zahtijeva prisutnost dva dodatna sulfata, jedan za položaj 2 iduronske kiseline (X1) i drugi za položaj 6 glukozamina (X2). Potpuna odsutnost supstituenata u 2-N položaju glukozamina, dajući pozitivno naelektiziranu amonij skupinu, efektivno ukida svaki inhibitorni efekt, što je potkrijepljeno činjenicom da su svi testirani spojevi, H-9017, H-8892 i H-9142, bili "neutralni". Prisutnost jedne ili dvije sulfatne skupine u položaju 2 iduronske kiseline ili u položaju 6 glikozamina nije imalo nikakav vidni efekt.

Konačno, prisutnost acetil skupine u X3, kombinirano s odsutnošću sulfatnih skupina u X1, i X2, daje pojačavajuću regulatornu aktivnost (H-0895).

Treba spomenuti jaku korelaciju između negativnih naelektriziranja prisutnih u disaharidu i njegove sposobnosti da inhibira stvaranje TNF-α. Prisutnost pozitivno naelektiriziranog amonij supstituenta rezultira u "neutralnosti", dok elektroneutralni spoj H-0895 pojačava stvaranje aktivnog TNF-α.

Tablica XXIIIB. Empirijska pravila izvedena iz rezultata in vivo DTH studija s komercijalno dostupnim disaharidima.

[image]

Rezultati sposobnosti odabranih monosaharida da reguliraju in vivo stvaranje aktivnog TNF-α

Vršeni su dodatni eksperimenti u kojima su izabrani monosaharidi, komercijalno dostupni od Sigma, testirani na sposobnost da reguliraju stvaranje in vivo aktivnog TNF-α. Koristeći bitno isti postupak kao u prethodnom odjeljku, miševi CD1, po 6 u skupini, su inokulirani i tretirani nizom kontrolnih i probnih supstancija da bi se odredio efekt, ako ga ima, subkutano ubrizganih supstancija na eksperimentalnu DTH reakciju u eksperimentalnim životinjama. Rezultati ovih eksperimenata su prikazani u Tablici dolje.

[image]

Tablica XXIIIC. Dodatni in vivo rezultati subkutanog davanja različitih monosaharida.

[image]

a GlcN je glukozamin ili 2-amino-2dezoksi-D-glukoza. Dva opsega efektivnih doza je nađeno za inhibiciju ≥ 50% kontrole: 0,000004-0,00004 μg/g i 0,004-4 μg/g.

b GlcN-2S je D-glukozamin-2-N-sulfat. "n.e." znači da nije bilo efekta u testiranom opsegu doza od 0,000004-4 μg/g miša.

c GlcN-3S je D-glukozamin-3-sulfat.

d GlcN-6S je D-glukozamin-6-sulfat.

e GlcN-2,3S je D-glukozamin-2,3-disulfat.

f GlcN-2,6S je D-glukozamin-2,6-disulfat. Opseg efektivnih doza za inhibiciju ≥ 50% kontrole je malen.

g NAc-GlcN je N-acetilglukozamin.

h GalN je D-galaktozamin. Dva opsega efektivnih doza je nađeno za inhibiciju ≥ 50% kontrole: 0,00004-0,00012 μg/g i 0,04-0,4 μg/g.

Stereokemija hidroksila u položaju 4 monosaharida određuje da li je šećer glukozamin (α oblik) ili galaktozamin (β oblik), kao što je prikazano dolje.

Izgleda da se N-acetilacija u prisustvu jednog sulfata u monosaharidu miješa u sposobnost glukozamina da inhibira DTH reakciju kod miševa.

Tretman adjuvantnog artritisa (AA) kod štakora pomoću monosaharida i disaharida

AA je induciran u ženkama štakora Lewis, 6-8 tjedana starih, kao što je opisano u odjeljku 5.7. Skupine štakora, 5-10 štakora po skupini, su tretirane subkutanim ubrizgavanjem testiranom supstancijom dan prije nego što im je induciran eksperimentalni artritis i tretman je kasnije nastavljen u tjednim intervalima. Efekti, kad ih je bilo, su mjereni kao što je opisano u odjeljku 5.7.

Od tri testirana disaharida, H-9392 je pokazao najizraženiji efekt u poboljšavanju ishoda AA u odnosu na kontrolne skupine štakora koji su dobili samo slanu otopinu (0,1 ml). Kao što se vidi na Sl. 38, H-9392, dan u dozi od 120 ng/štakor ili 0,6 ng/g štakora, je suzbio destruktivnu upalu AA skoro potpuno (i do 90%) 24 dana poslije indukcije, a H-1020 je inhibirao razvoj AA za oko 30% u odnosu na kontrolu,24-og dana. Naprotiv, pojačivač, H-0895, daje povećani nivo razvoja AA tijekom 2 tjedna od indukcije pri 2 nivoa doza: 0,1 i 0,4 ng/štakor. Ovaj efekt se, međutim, gubio brzo dok, 24-og dana, vrijednost AA nije bila bitno različita od nivoa kontrola (vidjeti Sl. 38A).

S druge strane, nađeno je da i određeni monosaharidi pokazuju in vivo inhibitorne efekte u ovom štakorskom modelu. Kao što je prikazano na Sl. 38B, tretman glukozaminom u tri nivoa doza inhibira razvoj AA za oko 60 - 80% kontrolnih nivoa. Galaktozamin također pokazuje inhibitorne efekte, ali mnogo manje nego glukozamin (vidjeti Sl. ).

Najinteresantniji su rezultati daljnjih eksperimenata s H-9392, u kojima su disaharidi davani bilo tjedno bilo dnevno, s početkom nultog dana (početak indukcije AA) ili 12-og dana (štakor već pati od AA), koji pokazuju pozitivno suzbijanje jačine AA u svim slučajevima. Ovi rezultati su pokazani na Slikama 38D (tjedno) i 38E (dnevno). Kao što je ukazano na Slici 38D, tjedno davanje H-9392 s početkom 12-og dana, tj. čak i kad je štakor već pogođen AA, je bar isto toliko efektivno kao tjedni tretman od početka indukcije (nultog dana) u odnosu na kontrolu. Sl. 38E pokazuje da, mada dnevni tretman oboljelih štakora nije toliko efektivan kao dnevni rtman od početka indukcije, on je ipak vrlo efektivan u snižavanju stupnja oboljelosti od AA u odnosu na kontrolnu skupinu.

Ovi rezultati dramatično pokazuju da su supstancije iz sadašnjeg izuma efektivne ne samo u sprečavanju razvoja teškog artritisa, nego i u tretiranju ovog oboljenja u odmakloj fazi. Štoviše, sadašnji rad također prikazuje da dok prethodno opisani LMWH pokazuju inhibitorne osobine samo kad se daju tjedno, disaharidi iz sadašnjeg izuma su sposobni manifestirati korisnu inhibitornu aktivnost i pri tjednom i pri dnevnom davanju.

Kao daljnja ilustracija superiornosti spoja iz sadašnjeg izuma u tretiranju eksperimentalno induciranog AA, odvojen, komparativni skup eksperimenata je sproveden, u kome su skupine štakora Lewis (5 štakora po skupini) tretirane subkutanim injekcijama deksametazon fosfata (od Sigme, poznato antiinflamatorno sredstvo) ili disaharida 9392. Tretmani su započeti 12 dana poslije indukcije AA i podijeljeni su u dva dijela: prvi se sastojao od dnevnog ubrizgavanja poznatog antiinflamatornog sredstva; drugi se sastojao od tjednog ubrizgavanja poznatog antiinflamatornog sredstva ili disaharida. U svim slučajevima, 100 μg poznatog antiinflamatornog sredstva u 0,1 ml otopine fosfatnog pufera je dano svakom štakoru, dok je 120 ng disaharida, također u 0,1 ml otopine fosfatnog pufera, dano po štakoru. Kao kontrola, skupini štakora je injektirano samo 0,1 ml otopine fosfatnog pufera. Za režime dnevnog doziranja poznatih antiinflamatornih sredstava, tretmani su završavani nakon 17-og dana od indukcije, a za režime tjednog doziranja poznatog antiinflamatornog sredstva ili disaharida, tretmani su završavani nakon 26-og dana od indukcije.

Rezultati gornjih eksperimenata su ilustrirani na Sl. i 38G. Proučavanjem Slike , može se vidjeti da je tjedno davanje disaharida 9392 usporedivo s dnevnim davanjem deksametazon fosfata približno tijekom prvog tjedna tretmana. Treba primijetiti, međutim, da po završetku tretmana, skupina štakora koja je dnevno primala deksametazon fosfat, trpi recidiv, dok se "disaharidna" skupina nastavlja oporavljati. Trideset dana poslije indukcije AA, "disaharidna" skupina je u boljem stanju nego "deksametazon fosfatna" skupina.

Pored toga, uspoređujući efektivnosti tjednog deksametazon fosfata i tjednog disaharida 9392 sa Sl. 38G, vidi se da 30 dana poslije indukcije AA, tjedno davanje deksametazon fosfata rezultira samo u umjerenom ublažavanju jačine AA. Naprotiv, tjedno davanje disaharida 9392 trideset dana poslije indukcije AA rezultira gotovo potpunim suzbijanjem eksperimentalno induciranog AA. Ponovno, posebno treba naglasiti da se, poslije završenog tjednog tretmana deksametazon fosfatom, kod štakora javlja recidiv AA. Kao što je ranije naglašeno, štakori tretirani disaharidom 9392, nastavljaju se oporavljati i po završetku davanja disaharida.

Prema tome, tjedno davanje disaharida 9392 je vidno superiorno nad dnevnim ili tjednim davanjem deksametazon fosfata, za dugi period. Dok su štakori, tretirani deksametazon fosfatom, bilo dnevno bilo tjedno, trpili recidiv bolesti po svršetku tretmana, pacovi tretirani disaharidom 9392, nastavljaju se oporavljati, odražavajući produljenu post-tretman inhibiciju bolesti.

Rezultati eksperimenata koji se odnose na lipopolisaharidno (LPS)-induciranu upalu rožnice štakora

LPS-inducirana upala rožnice je ovisna o TNF, kao što je prikazano u radu "Kinetika intraokularnog TNF i IL-6 u endotoksin-induciranom uveitu štakora", Vanderhagena, C. i suradnika u Nizozemskoj, predanog u štampu. Koristeći kalibriranu iglu br. 30, LPS (5 ng) je injektirano u rožnicu štakora Lewis. Nakon jednog dana, odvojenim skupinama štakora, po 2 u skupini (ili 4 oka/skupina), je zatim subkutano injektiran fosfatno-puferirana slana otopina (0,05 ml) ili H-1020 (u dozi od 50 ili 200 ng/štakor). Efekti, kad ih je bilo, su ocijenjeni na sljedeći način:

[image]

Kao što se može vidjeti iz grafičkog predstavljanja rezultata (Sl. 39), doza od 50 ng/štakor je efektivna za suzbijanje efekta lokalne LPS-inducirane upale, u odnosu na kontrolu. Zanimljivo je da doza od 200 ng/štakor ne pokazuje značajan efekt.

Rezultati eksperimenata koji se odnose na lipopolisaharidno (LPS)-induciran uveit kod štakora.

Uveit je upala prednje komore oka, kao odgovor na sistematsko davanje LPS. Kao i upala izazvana u prethodnom odjeljku lokalnim davanjem LPS, uveit je ovisan o TNF. U sadašnjem eksperimentu, skupine štakora Lewis, 8-10 tjedana starih, 8 očiju po skupini, je tretirano prvog dana pomoću H-9392 (u dozi od 32 ili 500 ng/štakor) ili slanoj otopini (0,1 ml). Drugog dana, 2 mg/ml otopine LPS (50 μl) je injektirano svakom u jastučić stopala; svaki štakor je primio ukupno 200 μg LPS. Trećeg dana, svako oko je obrisano i koncentracija ukupnih proteina je mjerena kao kvantitativni test stupnja upale. Rezultati ovih eksperimenata su dani odmah ispod.

[image]

Prema tome, jedno davanje H-9392, u bilo kojoj dozi, je bilo efektivno da suzbije upalu izazvanu sistematskim davanjem LPS kod štakora i do preko 70% u odnosu na kontrolu.

Rezultati eksperimenata koji se odnose na radiacijsko-zaštitne efekte odabranih supstancija

Skupine ženki miševa BALB/c, starih 8 tjedana, primile su subkutano slanu otopinu (0,1 ml, kontrola), H-9392 (32 ng/miš) ili glukozamin (10000 ng/miš) 1 dan prije ozračivanja, a poslije u tjednim intervalima sve do svršetka eksperimenta 30-og dana. Svi miševi su ozračeni dozama od 700 rad pomoću 60Co izvora gama zračenja.

Smrtnost u okviru različitih skupina miševa je zatim izračunata za razdoblje od 30 dana. Rezultati su pokazali da je kod miševa koji su primili samo slanu otopinu stopa smrtnosti 100% do 30-og dana, dok je kod miševa prethodno tretiranih s H-9392 mortalitet svega 40% u istom razdoblju. Skupina miševa, kojoj je ubrizgan glukozamin, također je prošla bolje nego kontrolna skupina, pokazujući stopu smrtnosti od 20% u istom razdoblju.

Prema tome, prethodni tretman testiranim supstancijama iz sadašnjeg izuma omogućio je miševima da prežive režim zračenja koji bi obično rezultirao u 100% mortalitetu u tijeku 30 dana.

U odvojenom eksperimentu, skupine miševa BALB/c (5 miševa po skupini), su izložene gama radijaciji od 750 rad na isti način, osim što su ove skupine miševa tretirane testiranim supstancama (slana otopina, 0,1 ml po mišu; H-9392 u dozama od 0,3,3, 30 i 300 ng/miš; i glukozaminom u dozama od 1, 10 i 100 μg/miš) 1 dan pred ozračivanje, a zatim 6-og i 13-og dana po ozračivanju. Svaki tretman je završen nakon trećeg i posljednjeg davanja. Rezultati ovog eksperimenta su ilustrirani na Sl. 39X (slana otopina i glukozamin) i 39Y (slana otopina i H-9392) i pokazuju da, dok su sve životinje iz kontrolne skupine uginule 22-og dana nakon ozračivanja, samo je jedan miš u skupini "30 ng H-9392" uginuo 30-og dana nakon ozračivanja. Tretmani sa 300 ng H-9392 i 1 μg glukozamina su pokazali umjerenu aktivnost u smanjivanju mortaliteta nakon ozračivanja.

Ovi rezultati, prema tome, ukazuju na moguće korištenje supstancija od interesa u terapiji raka, u kojoj se toksičnost povezana s tretmanom zračenjem može dramatično smanjiti prethodnim davanjem ovih spojeva. Ovaj prilaz možda može omogućiti povećanje doze zračenja do viših, efektivnijih nivoa bez toksičnih popratnih efekata.

Kao što je ilustrirano eksperimentima opisanim gore, spojevi iz sadašnjeg izuma su visoko efektivni u određenim vrlo malim dozama, čak i kad je tretman ograničen na tri davanja disaharida.

Sposobnost odabranih supstancija da suzbiju odbacivanje alogenskog transplantata.

Efekt H-9392 je također testiran u eksperimentima na miševima u vezi s odbacivanjem transplantata kože. Konkretno, transplantati kože sa C57BL/6 miševa donatora (H-2b) su stavljeni recipijentima BALB/c miševima (H-2d) prema metodi Baharava, E. et al., J. Immunol. Methods (1986) 90: 143-144. Broj dana do odbacivanja je mjeren prema stvaranju krasta na transplantatu. Broj dana do odbacivanja je određivan za kontrolnu skupinu (samo slana otopina, 0,1 ml) i za testirane skupine koje su primili 3 ng ili 300 ng H-9392 subkutanim ubrizgavanjem 1 dan prije presađivanja, a kasnije tjedno. Rezultati, koji su grafički predstavljeni na Sl. 40 i 40A, otkrivaju da je doza od 3 ng/miš odložila nivo odbacivanja transplantata kože od 50% za 5 dana! Međutim, isti spoj, dan u dozi od 300 ng/miš, nije napravio značajnu razliku u odbacivanju od 50% u odnosu na kontrolu. Ovi rezultati su vrlo značajni znajući da je odbacivanje potpuno alogenskog transplatata kože jedan od najsnažnijih imunih odgovora za koje se zna.

Sposobnost izabranih supstancija da suzbiju razvitak IDDM u NOD miševima.

Dobro je poznato da NOD miševi služe kao vjeran model humanog dijabetesa tipa I. Stvarno, kod svih ženki NOD miševa u našoj koloniji, dijabetes se spontano razvija tijekom prvih 4-5 mjeseci starosti. Kako se dijabetes tipa I ili diabetes mellitus ovisan o insulinu (IDDM) smatra autoimunom bolešću koju mogu stimulirati autoreaktivne T stanice, testira se sposobnost odabranih supstancija iz sadašnjeg izuma da reguliraju ovu autoimunu reakciju u kojoj sudjeluju T stanice.

Prema tome, skupine ženki NOD miševa, 6-12 u skupini, su tretirane subkutanim ubrizgavanjem slane otopine (0,1 ml), H-9392 (30 ng/miš) ili glukozaminom (10000 ng/miš). Svi miševi su bili stari oko 3,5 mjeseci, kao što je prikazano na Sl. 41, što znači da je kod miševa kao skupine već postojalo 20% slučajeva IDDM. Slučajevi IDDM mogu se pratiti preko nivoa glukoze u krvi miševa. Neoboljeli miševi imaju srednji nivo glukoze u krvi od oko 140 ± 10 mg/ml. Miš se smatra dijabetičnim ako mu je nivo glukoze u krvi jednak ili veći od 200 mg/ml (tj. veći od trostruke vrijednosti standardne devijacije od "normalnog" nivoa). Zbog veće podobnosti, nivoi glukoze u urinu su mjereni pomoću ClinstixTM dipstick (Ames). Ovaj test se izražava na skali od 0 do + 3, pri čemu se vrijednost od +2 ili više u dva odvojena mjerenja smatra pozitivnim indikatorom dijabetesa.

Bilo je vrlo iznenađujuće vidjeti da i H-9392 i glukozamin inhibiraju početak dijabetesa u NOD miševima, tako da je sa 4,5 mjeseci, kad su svi kontrolni miševi registrirani kao dijabetični, svega oko 65% miševa tretiranih glukozaminom postalo dijabetično, dok je među miševima tretiranim pomoću H-9392, manje od 50% pogođeno bolešću.

Izraženo drukčije, Sl. 41A pokazuje da su do starosti od 5 mjeseci svi kontrolni miševi uginuli od svog dijabetičnog stanja. Naprotiv, svega je oko pola miševa tretiranih s 10000 ng glukozamina uginulo u istom razdoblju. Prilično iznenađujuće, niti jedan od miševa tretiranih s 30 ng H-9392 nije uginuo u tom razdoblju; tj. grafikon rezultata sa H-9392 se poklapa s x-osom.

Efekt odabranih disaharida na ekspresiju adhezivnih molekula, ICAM-1 i ELAM-1, induciranu pomoću TNF-α u endotelnim stanicama

Adhezivne molekule, kao što su ICAM-1 i ELAM-1, su kritične u prepoznavanju i daljnjem "kotrljanju" (tj. adheriranje za endotelij i migracija kroz endotelij) leukocita, uključenom u upalni odgovor. Kao odgovor na aktivan TNF-α, endotelne stanice (EC, od engl. endothelial cells) eksprimiraju ICAM-1 i ELAM-1. Prema tome, TNF-α može pojačati upalu regulirajući nagore signale za adheriranje i migraciju leukocita. Da bi se odredio efekt disaharida iz sadašnjeg izuma na ekspresiju ICAM-1 i ELAM-1, induciranu pomoću TNF-α u EC, proveden je sljedeći eksperiment.

Svježe izolirane humane umbilikalne venske EC eu uzgajaju na M-199 (Gibco Laboratories), obogaćenom 10% FCS, 8% humanim serumom, antibioticima i s 50 μg/ml faktora rasta EC (EC-GM; Sigma, St. Luis, MO). EC su zasijane dodavanjem 0,1 ml medija EC-GM (3,5 x 105 ćel./ml) ravnim pločama s 96 ležišta (Nunk Roskilde, Danska).

Konfluentne jednoslojne kulture su oprane i inkubirane s odabranim disaharidnim spojevima u različitim koncentracijama u 50 μl M-199 1 sat na . Spojevi su zatim isprani, a kulture su preko noći inkubirane s TNF-α, 200 IU/ml, na EC-GM. Stanice su zatim oprane tri puta na Hank-ovom otopinom sa 1% FCS (Hank-ov 1%) i fiksirane s 2% glutaraldehida u PBS. Stanice su zatim oprane tri puta Hank-ovim 1%, blokirane pomoću 2,5% BSA u PBS i ponovno oprane dva puta Hank-ovim 1%. Anti-ICAM-1 i ELAM-1 mAb (Genzyme, Cambridge, MA; razblažena 1/1000 pomoću PBS) su inkubirana sa stanicama 1 sat na , a onda isprana tri puta Hank-ovim 1%. Kozja anti-mišja Ab vezana za peroksidazu (Sigma; razblažena 1/1000) su inkubirana sa stanicama 1 sat, a zatim isprana.

Poslije dodavanja ofenilendiamina (OPD), dobivenog otapanjem tablete OPD hidroklorida u vodi (OPD je supstrat za peroksidazu i može se dobiti od Sigme, Cat. No. p9187), izmjerena je apsorbancija na 492 nm u čitaču ELISA. Uzorci su testirani u triplikatu i izračunana je srednja vrijednost iz najmanje tri različite probe.

Tablica XXIIID. Efekt disaharida na ekspresiju adhezivnih molekula u endotelnim stanicama, kao odgovor na prethodno formiran TNF-α

[image]

* ekspresija ELAM-1 i ICAM-1, detektirana vezanjem specifičnih monoklonskih antitijela pomoću ELISA

Gore opisani eksperimenti demonstriraju da prethodni tretman EC disaharidnim spojevima 939*2 i 1020 pruža endotelnim stanicama značajnu otpornost prema prethodno formiranom TNF-α. Shodno tome, regulacija nagore ekspresije adhezivnih molekula u EC inducirane pomoću TNF-α je inhibirana i do 50%. Ovi rezultati znače da spajanja iz izuma mogu utjecati na ciljne stanice TNF-α (npr. na EC), kao i na stanice koje stvaraju TNF-α (npr. na T stanice, makrofage), da inhibiraju ne samo stvaranje aktivnog TNF-α, nego i sklonost ciljnih stanica da odgovore na TNF-α (tj. regulacija perifernog prihvaćanja citokina). Određena bolesna stanja se, dakle, mogu poboljšati davanjem supstancija iz sadašnjeg izuma tako što se ciljnim stanicama TNF-α omogućava vid otpornosti prema staničnom inflamatornom odgovoru, iniciranom pomoću aktiviranih T stanica makrofaga.

Sposobnost supstancije H-9392 đa suzbije znakove eksperimentalne alergijske astme kod štakora

Eksperimentalna alergijska bronhijalna astma je hipersenzitivna reakcija trenutnog tipa kod štakora koji su imunizirani, a zatim testirani inhalacijom početnog antigena u aerosolnoj otopini (Edelman, et al. Am. Rev. Resp. Dis. (1988) 137: 1033-37). Etiologija i patofiziologija ovog eksperimentalnog oboljenja je vrlo slična analogu koji se prirodno javlja kod ljudi.

Da bi se odredila sposobnost supstancije H-9392 da spriječi napad bronhijalne astme, 6 mužjaka smeđeg norveškog štakora je imunizirano na ovalbumin (OVA) subkutanim ubrizgavanjem 1 mg OVA u suspenziji s 200 mg AlOH/ml 0,9% slane otopine, praćenim intraperitonealnom injekcijom 1 ml otopine koja sadrži 6 106 bakterija Bordetella pertussis, ubijenih toplinom (Pasteur Merieux, S.V.), nultog dana. Sljedeće probe su se sastojale od petominutnog inhaliranja aerosola OVA (1 mg/ml otopine), napravljenog u Devilbiss Nebulizer pri radnom protoku zraka od 6 l/min. Odgovor u vidu respiratornog distresa (RD) je kvantificiran na sljedeći način: stupanj 0 - nema znakova distresa; stupanj 1 - tahipneja; stupanj 2 - umjereno otežano disanje; stupanj 3 - jako otežano disanje otvorenih usta; stupanj 4 - gubitak svijesti i tonusa mišića. Šesnaest dana po primarnoj imunizaciji, sve životinje su izložene početnom izazivanju aerosolom da bi se odredila pozitivna kontrola. Sve životinje su bile pod šifrom, tako da promatrač nije mogao znati povijest životinja. Svi štakori su bili osjetljivi na OVA i astma je uniformno inducirana u svim životinjama.

Tridesetog dana, životinje su podijeljene u 2 skupine i dana im je slana otopina (kontrolna skupina A) ili 30 ng supstance H-9392, subkutano, (skupina B) i 35-og dana im je vršena imunizacija kao gore. Rezultati su prikazani na Sl. 42. Kao što se vidi, životinje koje su primile samo slanu otopinu, 30-og dana imaju stupanj 3 ili 4 respiratornog distresa. Životinje koje su tretirane supstancijom H-9392, pokazale su neznatnu tahipneju. Rezultati pokazuju da davanje supstance H-9392 (5 dana prije sekundarne imunizacije) životinji, s ustaljenom hipersenzitivnošću, blokira astmatični napad.

Rezultati in vitro biološkog testa pomoću humanih PBL na oligosaharide izvedene iz komercijalnog heparina

Komercijalno dostupni uzorci disaharida i polisaharida, s varijacijama u molekularnoj težini od 1800 do 18000, su testirani na biološku aktivnost. Rezultati su prikazani u Tablici XXIII. Kao što se vidi iz dobivenih podataka, svi testirani uzorci, s jednim izuzetkom, nisu pokazali nikakve efekte ili su oni bili nekonzistentni. Kao što je objašnjeno u fusnoti Tablice, rezultat testa za pojedini uzorak je označen kao nekonzistentan ako se u sva tri ponavljanja testa nije dobio isti kvalitativni rezultat.

(Svaki podatak u svim tablicama u ovoj prijavi, koji prikazuje rezultat biološkog testa, je dobiven iz barem tri ponavljanja testa. U biološkom testu pomoću humanih PBL, u svakom izvođenju je korištena krv druge osobe.)

Tablica XXIII. Efekt disaharida izvedenih iz komercijalnog heparina na sekreciju aktivnog TNF određen biološkim testom pomoću humanih PBL.

[image]

a Broj proizvoda je iz kataloga Sigma Chemical Co. Product Catalog (1992).

b U opsegu koncentracija od 1 μg/ml - 0,01 pg/ml.

c Tri biološka testa pomoću PBL iz tri različita pojedinca su izvedena na svakom testiranom materijalu. Rezultat testa za svaki dani materijal je označen sa "nekonzistentan" ako se u sva tri ponavljanja testa nije dobio isti rezultat (tj. inhibicija, pojačavanje ili bez efekta).

d MT - oznake za molekularne težine različitih oligosaharidnih fragmenata heparina.

e U opsegu koncentracija od 1 μg/ml - 0,01 pg/ml.

Rezultati in vitro biološkog testa pomoću humanih PBL u odnosu na komplet za testiranje, temeljen na mAb

Usporedba podataka dobivenih iz in vitro biološkog testa pomoću humanih PBL, opisanih ovdje, i rezultata konvencionalnog kompleta za testiranje, temeljenog na monoklonskim antitijelima pokazuje da u testiranom mediju ima mnogo više proteina nego što je otkriveno biološkim testom pomoću humanih PBL kao "aktivni" TNF. Rezultati su prikazani u Tablici XXIV. Na primjer, razlika između količine proteina stvorenih T stanicama u "kontrolnim" nivoima (ca. 274 pg/ml) i kad je Fragmin HPLC-F16 prisutan (cea. 200 pg/ml) nije ni izbliza tako dramatična, kao razlika u aktivnosti detektirana humanim PBL testom u istim uzorcima (100% promjena aktivnosti). Prema tome, može se zaključiti iz ovih rezultata da, iako aktivirane imunske efektorne stanice možda izlučuju znatne količine proteina TNF, čak i u prisutnosti aktivnih supstancija iz sadašnjeg izuma, samo mali dio izlučenih proteina je dovoljno aktivan da ubije stanice senzitivne na TNF. Ovaj zaključak podržava predstavu da se TNF stvara i u aktivnom i u neaktivnom obliku.

Tablica XXIV. Usporedbe aktivnosti TNF detektirane biološkim testom pomoću humanih PBL i količine proteina detektirane pomoću kompleta za testiranje, temeljenog na mAB

[image]

Rezultati preliminarnih istraživanja strukturnih osobina disaharida iz ECM

Uzorak od 20 μq disaharida iz ECM je dobiven poslije HPLC II kromatografije (Sl. 23) i odsoljavanja, kao što je prije opisano. Sljedeće pročišćavanje, pod SAX-HPLC uvjetima pokazalo je da je ovaj uzorak čišći od 90% (Sl. 24, pik A23/4 na 23,10 min.). Međutim, protonski NMR spektar ovog uzorka (Sl. 31) pokazuje da je u uzorku prisutan zagađivač koji ima ponovljene alifatične -CH2- skupine. Važno je napomenuti, ipak, da je testiranje SAX-HPLC pročišćavanja na inhibiciju dalo pozitivne rezultate i u in vitro i u in vivo uvjetima biološkog testa.

Protonski NMR spektar je snimljen u D2O na 500 MHz na . Dvodimenzionalni COSY spektar je također snimljen. Konačne dimenzije matrice su bile 512 x 512, N-COSY s prethodnom saturacijom, 1536 slika (skanova) (Sl. 32). Signali tipični za šećere su očigledni između 3 i 5,5 ppm i u jedno- i u dvodimenzionim spektrima. Signal dubleta za anomerni proton je nađen pri 5,39 ppm, s faktorom kupliranja od 3 Hz (Sl. 33), koji odgovara jedinici šećera glukozamina u α konfiguraciji.

Kemijsko pomicanje anomernog protona, zajedno s onim za što se vjeruje da je β-glukuronska specifičnost heparanaze placente, dovodi do sumnjivog zaključka da disaharid ima glukozamin na nereducirajućem kraju, u α konfiguraciji, spojen 1-4 s ostatkom glukuronske kiseline na reducirajućem kraju. Štoviše, odsutnost signala pri 6 ppm ukazuje da je disaharid zasićen (tj. nema dvostruke veze na C4-C5 glukozaminskog ostatka). Prema tome, heparanaza nije eliminaza, već hidrolaza.

FTIR spektri su snimljeni na Mattson Galaxy 6020, opremljenom transmisionim filmskim detektorom; DTGS s rezolucijom od 2 cm-1; 128 slika (skanova) pomoću ZnSe prozora. Slike 34-35 ukazuju na prisutnost sulfatiziranog spoja i djelomično desulfatiziranog analoga, respektivno. Slika 34, konkretno, pokazuje apsorpcije na 3500-3000 (karakteristične za karboksilnu i hidroksilnu skupinu), 1594 (karbonilna), 1394, 1121, 1107, 1074, 1005, 993, 936 i 852 cm-1, od kojih su barem neke, posebno posljednje, povezane s sulfatom.

Maseni spektar metil derivata, za koji se smatra da je izgubio neki sulfat, je dobiven na Jeol JMS HX/110A FAB. Xe zrak je korišten pri E = 6 kV, emisijskoj struji od 10 mA, napon ubrzanja je bio 10 kV. Prvo, metil derivat je dobiven obradom oligosaharidnog uzorka diazometanom u kiseloj sredini. Proizvod metilacije je zatim ekstrahiran etil acetatom. Karakteristični jon je uočen iznad fona, sa M/Z (M + H+) = 531. Prema tome, smatra se da podaci odgovaraju molekularnoj težini metiliranog derivata odoko 530. Da bi se potvrdili rezultati, korištene su dvije različite matrice: DTT:tioglicerol (1:1) i metilnitrobenzil alkohol (Sl. 36A, B i 37A, B). "A" spektri odgovaraju uzorku + matrica, dok se "B" spektri odnose na samu specifičnu matricu.

Na osnovi takvih maseno spektralnih podataka, može se predložiti probna kemijska formula za metilirani (djelomično desulfatirani) derivat: C13H23NO17S2, MT = 529,47 4-O-(2-dezoksi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glukopiranozil)-(2-O-sulfo-β-D-glukopiranozid) uronska kiselina je sintetizirana prema sljedećem protokolu.

6.23. Sinteza 4-O-(2-dezoksi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glukopiranozil) - (2-O-sulfo-β-D-glukopiranozid) uronske kiseline

6.23.1 Dobivanje 6-O-acetil-2-azido-3,5-di-O-benzil-2-dezoksi -β-D-glukopiranozil klorida

2-O-tosil-1,6:3,4-dianhidro-β-D-galaktopiranoza (2) je dobivena iz 1,6-anhidro-µ-D-glukopiranoze (1), prema Cerny et al. (1961) Coll. Chech. Chem. Soc. 26: 2547. 2-O-tosil-1,6-anhidro-β-D-glukopiranoza (3) je dobivena iz 2-O-tosil-1,6 : 3,4-dianhidro-β-D-galaktopiranoze (2) prema Cerny et al. (1965) Coll. Chech. Chem. Soc. 30: 1151.

1,6: 2,3-dianhidro-β-D-manopiranoza (4) je dobivena iz 2-O-tosil-1,6-anhidro-β-D-glukopiranoze (3) prema Stanek and Cerny (1972) SYNTHESIS, str. 698. 6-O-acetil-2-azido-3,4-di-O-benzil-2-dezoksi-β-D-glukopiranozil klorid (A) je dobiven iz 1,6:2,3-dianhidro-β-D-manopiranoze (4) prema Paulsen and Slenzel (1978) Chem. Ber. 111: 2334.

6.23.2 Dobivanje metil - (benzil-2-O-acetil-3-O-benzil-β i α-L-glukopiranozid)-uronata

l,2:5,6-di-O-izopropilden-α-D-glukofuranoza (6) je dobivena iz D-glukoze (5) prema Stevens (1978), Methods Carbohydr. Chem. 6: 124. 3-O-benzil-1,2-O-izopropilden-α-D-glukofuranoza (7) je dobivena iz 1,2:5,6-di-O-izopropilden-α-D-glukofuranoze (6) prema Whistler and Lake (1972), Methods Carbohydr. Chem. 6: 286.

Metil-(benzil-2-O-acetil-3-O-benzil-β i α-L-glukopiranozid)-uronat je dobiven iz 3-O-benzil-1,2-O-izopropilden-α-D-glukofuranoze (7) prema Jacquinet et al., (1984), Carbohydr. Res. 130: 221.

Kondenzacija proizvoda iz 6.23.1 i 6.23.2.

Spajanje proizvoda iz odjeljaka 6.23.1. i 6.23.2. je vršeno prema Jacquinet et al., (1988), Carbohydr. Res. 174: 253. O-deacetilacija, hidroliza, O-sulfatacija, redukcija i debenzilacija su vršene prema Jacquinet et al., (1984), (supra) da bi se dobila 4-O-(2-dezoksi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glukopiranozil) - (2-O-sulfo-β-D-glukopiranozid) uronska kiselina, koja je dalje pročišćena pomoću SAX-HPLC, prema Rice et al. (1985), Anal. Biochem. 150: 325. Struktura ovog proizvoda je dana na Sl. 43 i smatra se da on ima istu biološku aktivnost kao ostali spojevi opisani ovdje.

Stručnjacima bi trebalo biti jasno da su i drugi preparati i metode, koji nisu konkretno opisani u ovoj prijavi, ipak obuhvaćeni njom. Smatra se da su takvi drugi preparati i metode u okviru i u duhu sadašnjeg izuma. Stoga, izum ne bi trebao biti ograničen opisom konkretnih ostvarenja iznijetim ovdje, već jedino sljedećim zahtjevima.

Otkrića iz svih ovdje navedenih referenci su u cjelini ugrađena ovdje pomoću referenci.

Claims

1. Farmaceutski preparat za inhibiciju stvaranja aktivnog TNF-α, naznačen time, što se sastoji od disaharida formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli [image] u kojoj je X1 vodik ili sulfat; X2 je vodik ili sulfat; X3 je sulfat ili acetil, uz uvjet da ako je X3 sulfat, onda je barem jedan od X1 i X2 sulfat, a ako je X3 acetil, onda su oba X1, i X2 sulfati; i farmaceutski prihvatljiv nosač.

2. Farmaceutski preparat iz zahtjeva 1, naznačen time, što je u njemu navedeni disaharid 2-O-sulfat-4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-sulfatglukozamin.

3. Farmaceutski preparat iz zahtjeva 1, naznačen time, što je u njemu navedeni disaharid 4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-sulfat-6-O-s u sulfatglukozamin.

4. Farmaceutski preparat iz zahtjeva 1, naznačen time, što je u njemu navedeni disaharid 2-O-sulfat-4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-sulfat-6-O-sulfatglukozamin.

5. Farmaceutski preparat iz zahtjeva 1, naznačen time, što je u njemu navedeni disaharid 2-O-sulfat-4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-acetil-6-O-sulfatglukozamin.

6. Farmaceutski preparat iz zahtjeva 1 za pojačavanje stvaranja aktivnog TNF-α, naznačen time, što se sastoji od 4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-acetilglukozamina ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i farmaceutski prihvatljivog nosača.

7. Farmaceutski preparat iz zahtjeva od 1 do 6, naznačen time, što je prilagođen za parenteralno davanje.

8. Farmaceutski preparat iz zahtjeva od 1 do 6, naznačen time, što je prilagođen za oralno davanje.

9. Farmaceutski preparat iz zahtjeva od 1 do 6, naznačen time, što je prilagođen za lokalno davanje.

10. Farmaceutski preparat za inhibiranje stvaranja aktivnog TNF-α, naznačen time, što se sastoji od spoja koji je N-sulfatirani ili N-acetilirani 4-dezoksi-4-en-iduronoglukozamin ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, pri čemu, ako N-sulfatiran, ima makar još jednu sulfatnu skupinu, a ako je N-acetiliran, ima makar dvije sulfatne skupine i farmaceutski prihvatljiv nosač.

11. Farmaceutski preparat iz zahtjeva 1 za pojačavanje stvaranja aktivnog TNF-α, naznačen time, što se sastoji od nesulfatiziranog N-acetiliranog 4-dezoksi-4-en-iduronoglukozamina ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i farmaceutski prihvatljivog nosača.

12. Metoda inhibiranja stvaranja aktivnog citokina u subjektu, naznačena time, što se sastoji od davanja spomenutom subjektu efektivne količine disaharida formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli [image] u kojoj je X1 vodik ili sulfat; X2 je vodik ili sulfat; X3 je sulfat ili acetil, uz uvjet da ako je X3 sulfat, onda je barem jedan od X1, i X2 sulfat, a ako je X3 acetil, onda su oba X1 i X2 sulfati.

13. Metoda pojačavanja stvaranja aktivnog citokina u subjektu, naznačena time, što se sastoji od davanja spomenutog subjektu efektivne količine disaharida koji je 4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-l,4)-2-dezoksi-2-N-acetilglukozamin ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

14. Metoda prema zahtjevu 12 ili 13, naznačena time, što se u njoj navedeni spoj ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol daje dnevno.

15. Metoda prema zahtjevu 12 ili 13, naznačena time, što se u njoj navedeni spoj ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol daje tjedno.

16. Metoda prema zahtjevu 12 ili 13, naznačena time, što se u njoj navedeni spoj ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol daje parenteralno, oralno ili lokalno.

17. Metoda za inhibiranje stvaranja aktivnog citokina u subjektu, naznačena time, što se sastoji od davanja spomenutom subjektu efektivne količine farmaceutskog preparata iz zahtjeva 10.

18. Metoda za pojačavanje stvaranja aktivnog citokina u subjektu, naznačena time, što se sastoji od davanja spomenutom subjektu efektivne količine farmaceutskog preparata iz zahtjeva 11.

19. Metoda za korištenje spoja koji je N-sulfatirani ili N-acetilirani 4-dezoksi-4-en-iduronoglukozamin ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, pri čemu, ako je N-sulfatiran, ima makar još jednu sulfatnu skupinu, a ako je N-acetiliran, ima makar dvije sulfatne skupine, naznačena time, što je za dobivanje farmaceutskog preparata za sprečavanje ili tretiranje medicinskog stanja, prouzrokovanog ili povezanog s neodgovarajućim stvaranjem TNF-α.

20. Metoda za korištenje spoja koji je nesulfatirani N-acetilirani 4-dezoksi-4-en-iduronoglukozamin ili njegova prihvatljiva sol, naznačena time, što je za dobivanje farmaceutskog preparata za tretiranje medicinskog stanja koje odgovara povećanom stvaranju TNF-α.

21. Metoda za sprečavanje ili tretiranje medicinskog stanja, prouzrokovanog ili povezanog s neodgovarajućim stvaranjem aktivnog citokina u subjektu, naznačena time, što se sastoji od davanja spomenutom subjektu efektivne količine spoja koji je N-sulfatirani ili N-acetilirani 4-dezoksi-4-en-iduronoglukoazmin ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, pri čemu, ako je N-sulfatiran, ima makar još jednu sulfatnu skupinu, a ako je N-acetiliran, ima makar dvije sulfatne skupine.

22. Metoda za tretiranje medicinskog stanja koje odgovara povećanom stvaranju aktivnog citokina u subjektu, naznačena time, što se sastoji od davanja spomenutom subjektu efektivne količine spoja koji je nesulfatirani N-acetilirani 4-dezoksi-4-en-iduronglukozamin ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

23. Metoda iz zahtjeva 19 ili 21, naznačena time, što je u njoj navedeni spoj 2-O-sulfat-4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-sulfatglukozamin.

24. Metoda iz zahtjeva 19 ili 21, naznačena time, što je u njoj navedeni spoj 4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-sulfat-6-O-sulfatglukozamin.

25. Metoda iz zahtjeva 19 ili 21, naznačena time, što je u njoj navedeni spoj 2-O-sulfat-4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-6-O-sulfatglukozamin.

26. Metoda iz zahtjeva 19 ili 21, naznačena time, što je u njoj navedeni spoj 2-O-sulfat-4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-1,4)-2-dezoksi-2-N-acetil-6-O-sulfatglukozamin.

27. Metoda iz zahtjeva 20 ili 22, naznačena time, što je u njoj navedeni spoj 4-dezoksi-4-en-iduronska kiselina-(α-l,4)-2-dezoksi-2-N-acetilglukozamin.

28. Metoda iz zahtjeva 19 ili 21, naznačena time, što je u njoj navedeno medicinsko stanje autoimuno oboljenje.

29. Metoda iz zahtjeva 19 ili 21, naznačena time, što je u njoj navedeno medicinsko stanje izabrano iz skupa koji čine insulinski diabetes mellitus, periodontit, upalno oboljenje mjehura, kožna oboljenja, uveitis, reumatska oboljenja, kronična upala, skleroza multipleks, lupus erythematosus, ateroskleroza, artritis, vaskulitis i alergija.

30. Metoda iz zahtjeva 20 ili 22, naznačena time, što je u njoj navedeno medicinsko stanje neoplazija, virusna infekcija, bakterijska infekcija ili gljivična infekcija.

31. Metoda iz zahtjeva 20 ili 22, naznačena time, što je u njoj navedeno medicinsko stanje bazalni rak kože, rak skvamoznih stanica ili melanom.

32. Metoda iz zahtjeva 12, 13, 17, 18, 21 ili 22, naznačena time, što je u njoj navedeni citokin izabran iz skupine koji čine IL-1, IL-6, IL-8 ili TNF-α.

33. Metoda za tretiranje subjekta zbog medicinskog stanja izabranog iz skupa koji čine insulinski diabetes mellitus, periodontit, upalno oboljenje mjehura, kožna oboljenja, uveitis, reumatska oboljenja, kronična upala, skleroza multipleks, lupus erythematosus, ateroskleroza, artritis, vaskulitis i alergija, naznačena time, što se sastoji od davanja spomenutom subjektu efektivne količine spajanja koji je N-sulfatirani ili N-acetilirani 4-dezoksi-4-en-iduronoglukozamin ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, pri čemu, ako je N-sulfatiran, ima makar još jednu sulfatnu skupinu, a ako je N-acetiliran, ima makar dvije sulfatne skupine.

34. Farmaceutski preparat za tretiranje medicinskog stanja izabranog iz skupa koji čine insulinski diabetes mellitus, periodontit, upalno oboljenje mjehura, kožna oboljenja, uveitis, reumatska oboljenja, kronična upala, skleroza multipleks, lupus erythematosus, ateroskleroza, artritis, vaskulitis i alergija, naznačena time, što se sastoji od spoja koji N-sulfatirani ili N-acetilirani 4-dezoksi-4-en-iduronoglukozamin ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, pri čemu, ako je N-sulfatiran, ima makar još jednu sulfatnu skupinu, a ako je N-acetiliran, ima makar dvije sulfatne skupine; i od farmaceutski prihvatljivog nosača.

35. Farmaceutski preparat iz zahtjeva 34, naznačen time, što je u obliku jedinične doze.

36. Metoda za suzbijanje odbacivanja alogenog transplantata u subjektu, naznačen time, što se sastoji od davanja spomenutom subjektu efektivne količine spoja koje je N-sulfatirani ili N-acetilirani 4-dezoksi-4-en-iduronoglukozamin ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, pri čemu, ako je N-sulfatiran, ima makar još jednu sulfatnu skupinu, a ako je N-acetiliran, ima makar dvije sulfatne skupine.

37. Metoda iz zahtjeva 36, naznačena time, što je u njoj spomenuti alogenski transplantat organ.

38. Metoda iz zahtjeva 37, naznačena time, što je u njoj spomenuti organ srce, jetra, bubreg ili koštana srž.

39. Metoda iz zahtjeva 36, naznačena time, što je u njoj spomenuti alogeni transplantat kože.

40. Metoda za suzbijanje ekspresije adhezivne molekule u subjektu, naznačena time, što se sastoji od davanja spomenutom subjektu efektivne količine spoja koji je N-sulfatirani ili N-acetilirani 4-dezoksi-4-en-iduronoglukozamin ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, pri čemu, ako je N-sulfatiran, ima makar još jednu sulfatnu skupinu, a ako je N-acetiliran, ima makar dvije sulfatne skupine.

41. Metoda iz zahtjeva 37, naznačena time, što je u njoj spomenuta adhezivna molekula ICAM-1 ili ELAM-1.

42. Biološki test in vitro za kvantificiranje efekta testirane supstancije na sekreciju aktivnog TNF-α, naznačena time, što se sastoji od prethodnog inkubiranja humanih CD4+ T stanica u mediju s različitim koncentracijama testirane supstancije, dodavanja konstantne količine aktivatora, efektivne da izazove sekreciju TNF-α u navedenim T stanicama u odsustvu testirane supstancije, skupljanja navedenog medija poslije dovoljno dugog vremenskog razdoblja i testiranja aktivnosti TNF-α u navedenom mediju.

43. Farmaceutski preparat za regulaciju aktivnosti citokina u subjektu, naznačen time, što sadrži količinu supstancije efektivnu da inhibira ili pojača aktivnost citokina u navedenom subjektu, gdje se navedena supstancija sastoji od karboksiliranog i/ili sulfatiranog oligosaharida ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i gdje navedena supstancija pokazuje nenultu "R" vrijednost, određenu pomoću biološkog testa in vivo, koji mjeri relativnu eksperimentalnu DTH reakciju kod miševa, koji su tretirani različitim dozama navedene supstancije, u opsegu od 0 do približno 2 μg/g miša; i farmaceutski prihvatljiv nosač.

44. Farmaceutski preparat iz zahtjeva 43, naznačen time, što je u njemu navedena supstancija efektivna da inhibira aktivnost citokina u navedenom subjektu i što pokazuje nenultu inhibitornu "R" vrijednost.

45. Farmaceutski preparat iz zahtjeva 43, naznačen time, što je u njemu navedena supstancija efektivna da pojača aktivnost citokina u navedenom subjektu i koja pokazuje nenultu augmentativnu "R" vrijednost.

46. Farmaceutski preparat iz zahtjeva 43, 44 ili 45, naznačen time, što je u njemu navedeni oligosaharid disaharid.

47. Farmaceutski preparat iz zahtjeva 43, 44 ili 45, naznačen time, što je u njemu navedeni oligosaharid disaharid koji je karboksiliran.

48. Farmaceutski preparat iz zahtjeva 43 ili 44, naznačen time, što je u njemu navedeni oligosaharid disaharid koji je karboksiliran i sulfatiran.

49. Farmaceutski preparat iz zahtjeva 45, naznačen time, što je u njemu navedeni oligosaharid disaharid koji je karboksiliran, ali nije sulfatiran.

50. Farmaceutski preparat iz zahtjeva 43, 44 ili 45, naznačen time, što je u njemu navedeni citokin izabran iz skupa koji čine IL-1, IL-6, IL-8 ili TNF-α.

51. Farmaceutski preparat iz zahtjeva 46, naznačen time, što je u njemu navedeni citokin TNF-α.

52. Spoj formule II, naznačen time, što je [image] ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

53. Farmaceutski spoj za sprečavanje proizvodnje aktivnog TNF-α, naznačen time, što sadrži disaharid formule II [image] ili njegovu farmaceutski prihvatljivu sol.

54. Metoda sprečavanja proizvodnje aktivnog citokina u subjektu, naznačena time, što uključuje dodjeljivanje efektivne količine spoja iz zahtjeva 52 spomenutom subjektu.

55. Metoda korištenja spoja, naznačena time, što je spoj iz zahtjeva 52 za pripravu farmaceutskog spoja za sprečavanje ili liječenje medicinskog stanja uzrokovanog ili u vezi s neprikladnom proizvodnjom TNF-α.

56. Metoda korištenja spoja, naznačena time, što je spoj iz zahtjeva 52 za pripravu farmaceutskog spoja za liječenje medicinskog stanja koje stoji u korelaciji sa spriječenom proizvodnjom TNF-α.