SE528407C2 - Borföreningar användbara vid BNCT - Google Patents

Description

25 30 35 528 407 2 idealiskt > 5) och med låg toxicitet, för erhållande av högt terapeutiskt förhållande. Ett angreppssätt har varit användning av borinnehållande nukleosider, nukleotider (EP 1 113 020 A2). Ett annat angreppssätt har varit användning av nukleosider och oligonukleotider som innefattar ett borerat fosforamidat (WO 94/01440 A1). Vidare har karboranylpyrimidiner fram- ställts för användning vid BNCT. Purin- och pyrimidin- nukleosider som innehåller en karboranylgrupp bunden till purin- eller pyrimidinbasen har också rapporterats. eller oligonukleotider Syntes av nidokarboran-kobalaminkonjugat som skulle kunna vara användbara vid neutroninfångningsterapi har också utförts (H.P.C. Hogenkamp et al., Nuclear Medicine and Biol0gY (2000): Q7, 89-92).

Två neutroninfångningsmedel med bor, vilka för när- varande befinner sig i kliniska prövningar i fas I/II, är dinatriummerkapto-closo-dodekaborat (BSH) och l-4-di- hydroxiborylfenylalanin (BPA). Fastän BSH och BPA har visats vara säkra och verksamma i djurmodeller, har dessa båda medel endast måttlig selektivitet för tumörceller och korta retentionstider i tumörer. Vidare gäller att BSH har begränsad kemisk stabilitet på grund av sin benägenhet för luftoxidering och att BPA, även om den är kemiskt icke-toxisk, endast innehåller låg viktprocent bor (5 %) så att stora mängder av detta läkemedel behövs för uppnâende av terapeutiska borkoncentrationer i tumörvävnad.

Leamon, C.P. och Reddy, J.A., Advanced Drug Delivery 56 (2004) 1127-1141, diskuterar folatreceptorn och folat-läkemedel-konjugat för terapeutiska ändamål.

Reviews, WO 00/45857 visar användning av en fysiologiskt kompatibel förening som utgörs av en Gdæ-komplexenhet och en tumörspecifik enhet av biologiskt eller syntetiskt ursprung för framställning av preparat för neutron- infångnings- och fotonaktiveringsterapi. 10 15 20 25 528 407 3 Sammanfattning av uppfinningen Ett av föreliggande uppfinnings ändamål är till- handahållande av föreningar som är användbara vid neutroninfàngningsterapi med bor (BNCT).

Ett annat ändamål är tillhandahållande av sådana föreningar, vilka har hög vikthalt av bor och/eller är selektiva för tumörceller. Ett annat ändamål är till- handahållande av sådana föreningar, vilka är stabila och/eller icke-toxiska.

Ytterligare ett annat av föreliggande uppfinnings ändamål är tillhandahållande av farmaceutiska kompositioner som innefattar nämnda föreningar och tillhandahållande av användning av nämnda föreningar vid terapi.

Ett ytterligare ändamål är tillhandahållande av ett förfarande för framställning av nämnda föreningar från kända utgângsmaterial.

Såväl ovannämnda ändamål som andra ändamål med uppfinningen, vilka torde stå klara för en fackman efter studium av beskrivningen nedan, uppnås med hjälp av en förening enligt formel (I) R2 °§/ N.

H (I) vari en av R1 och R2 är -NH-X-Y-Z, -O-X-Y-Z eller -S-X-Y-Z, och den andra är -OH, -NH-X-Y-Z, -O-X-Y-Z eller -S-X-Y-Z; vari i 2- 2 . rífgc 10 15 20 25 30 35 528 407 4 X är -(Cflflm-, vari m är 0, 1, 2, 3 eller 4, eller -(CHQP-O-(Cflflq-, vari p och q oberoende av varandra är 1, 2, 3 eller 4; Y är en boran eller en karboran, vari åtminstone en boratom är WB; och Z är H eller en hydrofiliserande grupp, såsom aminometyl, 2-aminoetyl, 3-aminopropyl, l,3-propandiol- 2-yl-metoxyl, etylenglykoxyl eller dietylenglykoxyl; och farmaceutiskt accepterbara salter, solvat och stereoisomerer därav.

Företrädesvis är abundansen av NB i boranen eller karboranen enligt Y högre än den naturliga isotop- abundansen av wB. Exempelvis kan mer än 10 % eller mer än 20 %, företrädesvis mer än 25 %, hellre mer än 50 % eller mer än 75 %, av de i boranen eller karboranen enligt Y förekommande boratomerna vara mB.

Föreningarna enligt formel (I) kan föreligga i form av ett farmaceutiskt accepterbart salt. Sådana salter är exempelvis salter bildade med mineralsyror, såsom salt- ammoniumsalter bildade med aminer, såsom trietyl- alkalimetallsalter, eller salter av syra: amin eller ett basiskt läkemedel; såsom natrium- eller kaliumsalter; alkaliska jordartsmetaller, såsom kalcium- eller magnesiumsalter.

Föreningarna enligt formel (I) kan föreligga såväl i form av farmaceutiskt accepterbara solvat, exempelvis hydratiserade, som i icke-solvatiserade former.

När ett eller flera stereocenter förekommer i molekylen, kan föreningarna enligt formel (I) föreligga i form av en farmaceutiskt accepterbar stereoisomer blandning, t.ex. en blandning av diastereomerer och/eller en blandning av enantiomerer. Diastereomerer är stereo- isomerer, vars molekyler inte är spegelbilder av varandra. Enantiomerer är stereoisomerer, vars molekyler är spegelbilder av varandra. Föreningarna enligt formel (I) kan vidare föreligga i form av en enda farmaceutiskt dvs. en enda enantiomer accepterbar stereoisomer, l 1 EZ êznezxcieeßïppl ic-.at í.f3~r:,':ezt Tš-'i-ï . tio/s, 10 15 20 25 30 35 528 407 5 och/eller diastereomer. Föreningarna enligt formel (I) kan också föreligga i form av en farmaceutiskt accepter- bar racemisk blandning, dvs. en ekvimolär blandning av enantiomerer.

Boran definieras häri som en polyedrisk boran, se Gmelin Handbook of Inorganic and Organometallic Chemistry (8 utg. 1991). Karboran definieras häri som en förening vari åtminstone en kolatom är införlivad i en polyedrisk boran. Karboraner kan syntetiseras enligt beskrivningar i Carboranes (R. Grimes red. 1970), Gmelin Handbook of Inorganic and Organometallic Chemistry (8 utg. 1991) och Science 1972, 78, 462.

Föreningarna enligt formel (I) är användbara vid BNCT. Föreningar enligt formel (I) innefattar en folsyra- enhet, dvs. en signifikant del av folsyramolekylen.

Nämnda föreningar innefattar vidare en borinnehàllande enhet samt eventuellt en förbindelselänk. Förbindelse- länken definieras som en enhet som är belägen mellan fol- syraenheten och den borinnehållande enheten. Den borinne- hàllande enheten definieras som en borinnehàllande grupp och kan vara en boran eller en karboran. Snabbväxande celler, såsom tumörceller, uppvisar ökat upptag av fol- syra och strukturellt besläktade föreningar.

BNCT kan användas för terapi av ett stort urval tumörer. Tumörer kan klassificeras histologiskt enligt principer som definierats av World Health Organization (World Health Organization, International Histological Classification of Tumours, 1967-1978). behandlas med hjälp av BNCT med föreningar enligt formel Tumörtyper som kan (I) ovan, innefattar tumörer som härrör från centrala nervsystemet, företrädesvis gliom såsom glioblastom, gliosarkom, anaplastiskt astrocytom, låggradigt astro- cytom, pilolytiskt astrocytom, oligodendrogliom eller hjärnstamsgliom; meningiom; perifert neuroepiteliom; primitiv neuroektodermal tumör; neuroblastom; germinom; hypofystumör; metastatisk hjärntumör; eller arteriovenös missbildning. Föreningarna enligt formel (I) kan också 10 15 20 25 528 407 6 användas vid BNCT för terapi av bl.a. maligna tumörer eller metastatiska tumörprocesser, företrädesvis melanom, prostatacancer, levercancer, lungcancer, bröstcancer eller sarkom.

Formuleringen ”neutroninfàngningsterapi med bor” (BNCT, ”boron neutron capture therapy”) definieras vid användning häri som ett förfarande för tumörterapi, vilket innefattar stegen administration av en borinne- hållande förening till en individ som skall utsättas för terapi samt bestrålning av nämnda individ med termiska neutroner.

Termen ”tumör” definieras vid användning häri i enlighet med Dorland's Illustrated Medical Dictionary, 26 utgåva, 1985, Saunders, dvs. som en tillväxt av vävnad i vilken mångfaldigandet av celler är okontrollerat och progressivt. Okontrollerat mångfaldigande definieras som ett tillstànd som skiljer sig från normalt mångfaldigande t.ex. ett tillstànd i vilket hastigheten för mångfaldigande av celler är signifikant ökad. Termen av celler, ”progressivt” definieras i detta sammanhang som påskyndat eller ökande i svårighetsgrad. En tumörcell definieras som en cell i nämnda vävnad.

Termen ”terapi” definieras vid användning häri i enlighet med Dorland's Illustrated Medical Dictionary, 26 utgåva, 1985, Saunders, dvs. som behandling av sjuk- dom. Termerna ”terapeutisk” och ”terapeutiskt” skall tolkas i enlighet därmed. Formuleringen ”tumörterapi” definieras således vid användning häri som behandling av sjukdom orsakad av eller förknippad med en tumör. 1. cíatiåpg; i zztit-ïiß. . .riff-c 528 407 7 .

Den boran eller karboran som utgör Y enligt formel (I) kan vara 10 528 407 eller vari * indikerar belägenhet av en bindning till X eller Z; M är kobolt, kobolt-57 eller järn; och X är så som definieras ovan.

Exempel på föreningar enligt formel (I) är AF-(4- {[(2-amino-4-oxo-3,4-dihydropteridin-6-yl)metyl]amino}- bensoyl)-N>{3-[(lR,9S)-2,3,4,5,6,7,8,l0,1l,l2-dekabora- bicyklo[7.2.1]dodec-l-yl]propyl}-d-glutamin och AF-(4- {[(2-amino-4-oxo-3,4-dihydropteridin-6-yl)metyl]amino}- 10 15 20 25 30 35 528 407 9 bensoyl)-N=[3-(2,3,4,5,6,7,8,l0,ll,l2-dekabora- bicyklo[7.2.1]dodec-1-yl)propyl]-L-glutamin.

Enligt en utföringsform är, i föreningen enligt (I), Rl -NH-x-Y-z, -o-x-Y-z eller -s-x-Y-z, R2 OH. En sådan förening är mycket lik strukturen hos folsyra och kan således bibehålla samtliga eller en del formel 0Ch är av de biologiska aktiviteter som uppvisas av folsyra.

Enligt en utföringsform är, i föreningen enligt formel (I), åtminstone en kolatom HC. En sådan utförings- form möjliggör detektion av föreningen med positron- emissionstomografitekniker (PET-tekniker).

Alternativt kan Y-enheten hos en förening enligt formel (I) vara en gadoliniuminnefattande enhet.

Föreliggande uppfinnings ändamål ástadkoms vidare genom ett förfarande för framställning av en förening enligt formel (I), i vilket en förening enligt formel NH2-X-Y-Z, OH-X-Y-Z eller SH-X-Y-Z, vari X, Y och Z är Så (I), som definieras med avseende på formel omsätts med folsyra.

Farmaceutiska formuleringar Föreliggande uppfinnings ändamål âstadkoms också genom en farmaceutisk komposition som innefattar en förening enligt formel (I) och en farmaceutiskt accepter- bar bärare, ett farmaceutiskt accepterbart spädningsmedel eller ett farmaceutiskt accepterbart adjuvans.

För klinisk användning formuleras på lämpligt sätt (I) i enlighet med föreliggande uppfinning i farmaceutiska de borinnehållande föreningarna enligt formel kompositioner för parenteral administration. Även rektal, oral eller någon annan administrationsväg kan övervägas av en fackman inom området formuleringar. De borinne- hållande föreningarna enligt formel (I) formuleras således med åtminstone en farmaceutiskt och farmakof logiskt accepterbar bärare eller ett farmaceutiskt och farmakologiskt accepterbart adjuvans. Bäraren kan före- . .i åk _F-':~."..cn~fía,d.='1.;:pfë. 11:10.. :i 31313; sz; . 10 15 20 25 30 35 528 407 10 ligga i form ett fast, halvfast eller flytande spädningsmedel.

Lösningar för parenteral administration kan fram- ställas som en lösning av en uppfiningsenlig förening i ett farmaceutiskt accepterbart lösningsmedel. Dessa lösningar kan också innehålla stabiliserande bestånds- delar och/eller buffrande beståndsdelar och fördelas i enhetsdoser i form av ampuller eller flaskor. Lösningar för parenteral administration kan också framställas som en torr beredning för rekonstituering med lämpligt lösningsmedel direkt före användning.

Vid framställning av orala farmaceutiska kompositioner enligt uppfinningen, blandas den/de borinnehàllande förening(ar) som skall formuleras med såväl fasta, pulveriserade beståndsdelar, såsom laktos, sackaros, sorbitol, mannitol, stärkelse, amylopektin, cellulosaderivat, gelatin, eller andra lämpliga bestånds- delar, som med sprängmedel och smörjmedel, såsom magnesiumstearat, kalciumstearat, natriumstearylfumarat och polyetylenglykolvaxer. Blandningen bearbetas sedan till granuler eller komprimeras till tabletter.

Mjuka gelatinkapslar kan framställas med kapslar innehållande en blandning av den aktiva föreningen eller de aktiva föreningarna enligt uppfinningen, vegetabilisk olja, fett eller annan lämplig bärare för mjuka gelatin- kapslar. Hårda gelatinkapslar kan innehålla den aktiva föreningen i kombination med fasta, pulveriserade beståndsdelar, mannitol, potatisstärkelse, majsstärkelse, amylopektin, såsom laktos, sackaros, sorbitol, cellulosaderivat eller gelatin.

Dosenheter för rektal administration kan framställas (i) i form av stolpiller som innehåller den eller de aktiva substanserna i blandning med en neutral fettbas; (ii) i form av rektala gelatinkapslar som innehåller den aktiva substansen i en blandning med en vegetabilisk olja, paraffinolja eller annan lämplig bärare för rektala gelatinkapslar; (iii) i form av ett färdiggjort mikro- .ä rffs:.à.=.'.1:'-.<.irrpp 'L t; e t . d 10 15 20 25 30 35 528 407 ll lavemang; eller (iv) i form av en torr mikrolavemangs- formulering för rekonstituering i lämpligt lösningsmedel omedelbart före administration.

Flytande beredningar för oral administration kan framställas i form av sirapar eller suspensioner, t.ex. lösningar eller suspensioner, innehållande den aktiva föreningen och resten av formuleringen bestående av socker eller sockeralkoholer, och en blandning av etanol, vatten, glycerol, propylenglykol och polyetylenglykol. Om så önskas, kan sådana flytande beredningar innehålla färgämnen, smakämnen, sackarin och karboximetylcellulosa eller annat förtjockningsmedel. Flytande beredningar för oral administration kan också framställas i form av ett torrt pulver för rekonstituering med ett lämpligt lösningsmedel före användning.

Enligt en aspekt av föreliggande uppfinning kan den borinnehàllande föreningen enligt formel (I) administreras inom 24 timmar före neutronbestrålning av den individ som skall behandlas, typiskt 30-60 minuter före neutronbestràlning. Enligt en ytterligare aspekt av uppfinningen kan doseringen av den borinnehållande föreningen vara i pulser. En typisk dos av den borinne- hàllande föreningen enligt formel (I) ligger i inter- vallet 0,01-100 mg per kg kroppsvikt.

Terapier Föreliggande uppfinnings ändamål åstadkoms också av en förening enligt formel (I) för användning vid terapi, eller genom användning av en förening enligt formel (I) för tillverkning av ett läkemedel för användning vid tumörterapi.

Enligt en utföringsform kan läkemedlet vara för terapi av tumörer som härrör från centrala nervsystemet, företrädesvis gliom såsom glioblastom, gliosarkom, anaplastiskt astrocytom, làggradigt astrocytom, pilolytiskt astrocytom, oligodendrogliom eller hjärnstamsgliom; meningiom; perifert neuroepiteliom; 10 15 20 25 30 35 528 407 12 primitiv neuroektodermal tumör; neuroblastom; germinom; hypofystumör; metastatisk hjärntumör; eller arteriovenös missbildning.

Alternativt kan läkemedlet vara för terapi av maligna tumörer eller metastatiska tumörprocesser, företrädesvis melanom, prostatacancer, levercancer, lungcancer, bröstcancer eller sarkom.

En användbar utföringsform av föreliggande upp- finning ástadkoms också av en förening enligt formel (I), vari åtminstone en kolatom är HC, för användning vid diagnostik, eller genom användning av en förening enligt formel (I), vari åtminstone en kolatom är HC, för till- verkning av ett läkemedel för användning vid positron- emissionstomografi (PET). Ändamålen ástadkoms vidare genom ett förfarande för tumörterapi, i vilket en farmaceutiskt och farmakologiskt verksam mängd av en förening enligt formel (I) administreras till en individ i behov av sådan behandling i samband med neutroninfàngningsterapi med bor.

Nämnda tumörterapi kan vara terapi av tumörer som härrör från centrala nervsystemet: företrädesvis gliom såsom glioblastom, gliosarkom, anaplastiskt astrocytom, låggradigt astrocytom, pilolytiskt astrocytom, oligodendrogliom eller hjärnstamsgliom; meningiom; perifert neuroepiteliom; primitiv neuroektodermal tumör; neuroblastom; germinom; hypyfystumör; metastatisk hjärntumör; eller arteriovenös missbildning.

Alternativt kan nämnda tumörterapi vara terapi av maligna tumörer eller metastatiska tumörprocesser, företrädesvis melanom, prostatacancer, levercancer, lungcancer, bröstcancer eller sarkom.

En användbar utföringsform av föreliggande upp- finning ástadkoms vidare genom ett förfarande för tumör- diagnostik, i vilket en farmaceutiskt och farmakologiskt verksam mängd av en förening enligt formel (I), åtminstone en kolatom är HC, administreras till en vari 10 15 20 25 30 35 528 407 13 individ som skall diagnosticeras i samband med positronemissiontomografi.

Ovan nämnda terapier kan användas som enda terapi eller kan innefatta, i tillägg till neutroninfàngnings- terapi med bor, konventionell kirurgi eller kemoterapi.

Sådan kemoterapi kan innefatta en eller flera av följande kategorier av antitumörmedel: (i) antiproliferativa/antineoplastiska läkemedel och kombinationer därav, som de som används vid medicinsk onkologi, såsom alkylerande medel (exempelvis cis-platin, karboplatin, cyklofosfamid, kvävesenap, melfalan, _ klorambucil, busulfan och nitrosourea); antimetaboliter (exempelvis antifolater, såsom fluoropyrimidiner som 5- fluorouracil och tegafur, raltitrexed, metotrexat, cytosinarabinosid och hydroxiurea; antitumörantibiotika (exempelvis antracykliner som adriamycin, bleomycin, doxorubicin, daunomycin, epirubicin, idarubicin, mitomycin-C, dactinomycin och mitramycin); antimitotiska medel (exempelvis vinkaalkaloider som vinkristin, vinblastin, vindesin och vinorelbin samt taxoider som taxol och taxoter); och topoisomerasinhibitorer (exempelvis epipodofyllotoxiner som etoposid och teniposid, amsakrin, topotekan och kamptotecin); (ii) cytostatiska medel, såsom antiöstrogener (exempelvis tamoxifen, droloxifen och toremifen, raloxifen, iodoxyfen), östrogenreceptornedreglerare (exempelvis fulvestrant), antiandrogener (exempelvis bikalutamid, flutamid, nilutamid och cyproteronacetat), LHRH- antagonister eller LHRH-agonister (exempelvis goserelin, leuprorelin och buserelin), progestogener (exempelvis megestrolacetat), aromatasinhibitorer (exempelvis anastrozol, letrozol, vorazol och exemestan) och inhibitorer av 5a-reduktas, såsom finasterid; (iii) medel som inhiberar cancercellinvasion (exempelvis metalloproteinasinhibitorer som marimastat och inhibitorer av urokinasplasminogenaktivatorreceptor- funktion); ëïc-'ezxzic-íëpísfl:içtatziontrfivf Tf-:rhoïnxj 10 15 20 25 30 35 528 407 14 (iv) inhibitorer av tillväxtfaktorfunktion, exempelvis innefattar sådana inhibitorer tillväxtfaktorantikroppar, tillväxtfaktorreceptorantikroppar (exempelvis antikroppen mot erbb2 trastuzumab [flerceptinfl] och antikroppen mot erbbl cetuximab), farnesyltransferasinhibitorer, tyrosin- kinasinhibitorer och serin/treoninkinasinhibitorer, exempelvis inhibitorer som tillhör epidermal tillväxt- faktor-familjen (exempelvis inhibitorer av tyrosinkinas som tillhör EGFR-familjen, såsom §-(3-kloro-4-fluoro- fenyl)-7-metoxi-6-(3-morfolinopropoxi)kinazolin-4-amin (gefitinib), Q-(3-etynylfenyl)-6,7-bis(2-metoxietoxi)- kinazolin-4-amin (erlotinib) och 6-akrylamido-Q-(3-klore- 4-fluorofenyl)-7-(3-morfolinopropoxi)kinazolin-4-amin), exempelvis inhibitorer som tillhör trombocytrelaterad tillväxtfaktor-familjen och exempelvis inhibitorer som tillhör hepatocyttillväxtfaktor-familjen; (v) antiangiogena medel, såsom sådana som inhiberar verkningarna av vaskulär endoteltillväxtfaktor, (exempel- vis antikroppen mot vaskulär endotelcelltillväxtfaktor bevacizumab [Avastin“], föreningar såsom de som beskrivs i internationella patentansökningar WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 och WO 98/13354) och föreningar som verkar enligt andra mekanismer (exempelvis linomid, inhibitorer av integrin-avß3-funktion och angiostatin); kärlskadande medel, föreningar som visas i internationella patentansökningar WO 99/02166, WO 00/40529, WO OO/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 och WO 02/08213; (vii) antisensterapier, exempelvis sådana som är riktade (Vi) såsom Combretastatin A4 och mot ovan angivna mål, såsom ISIS 2503, en antisensmolekyl mot ras; (viii) genterapeutiska tillvägagångssätt, innefattande exempelvis tillvägagångssätt för ersättning av aberranta gener, såsom aberrant p53 eller aberrant BRCAI eller BRCA2, tillvägagångssätt med GDEPT (genriktad enzymför- läkemedelsterapi, "gene-directed enzyme pro-drug therapy”), såsom sådana som utnyttjar cytosindeaminas, kr ,. r~ ' w 10 15 20 25 30 35 528 407 15 tymidinkinas eller ett bakteriellt nitroreduktasenzym, och tillvägagångssätt för ökning av patienttoleransen för kemoterapi eller radioterapi, såsom genterapi mot fler- läkemedelsresistens; och (ix) immunoterapeutiska tillvägagångssätt, innefattande exempelvis tillvägagångssätt ex vivo och in vivo för ökning av immunogeniciteten hos patienters tumörceller, såsom transfektion med cytokiner såsom interleukin 2, interleukin 4 eller granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor, tillvägagångssätt för minskning av T-cell-anergi, tillvägagångssätt med användning av transfekterade immun- celler såsom cytokin-transfekterade dendritceller, till- vägagângssätt med användning av cytokin-transfekterade tumörcellinjer och tillvägagångssätt med användning av anti-idiotypa antikroppar.

Exemgel Framställning av uppfinningsenliga föreningar Samtliga använda lösningsmedel var av analyskvalitet och kommersiellt tillgängliga vattenfria lösningsmedel användes rutinmäsigt för reaktionerna. Reaktionerna utfördes typiskt i en inert kvävgas- eller argonatmosfär. lH-NMR-spektra registrerades med en Varian Unity+ 400 NMR spektrometer utrustad med ett 5 mm BBO sondhuvud med Z-gradienter, eller en Varian Gemini 300 NMR spektrometer utrustad med ett 5 mm BBI sondhuvud, eller en Bruker Avance 400 NMR spektrometer utrustad med ett sondhuvud med 60 ul dubbelt inverterat flöde med Z- gradienter, eller en Bruker DPX40O NMR spektrometer utrusted med ett sondhuvud med 4 kärnor utrustat med Z- gradienter. Om inget specifikt anges i exemplen, registrerades spektra vid 400 MHz för proton. Följande referenssignal användes: medellinjen för CDCl3 ö 7,26 (ln).

Masspektra registrerades med en Waters LCMS bestående av en Alliance 2795 (LC), Waters PDA 2996 och 10 15 20 25 30 35 528 407 16 en ZQ singelkvadrupolmasspektrometer. Masspektrometern var utrustad med en elektrosprejjonkälla (ESI) som användes i positivjon- eller negativjonläge. Kapillär- spänningen var 3 kV och konspänningen var 30 V.

Masspektrometern svepte över m/z 100-700 med en sveptid av 0,3 s. Separationer utfördes på antingen Waters X- Terra MS C8 (3,5 um, 50 eller 100 mm x 2,1 mm i.d.) eller en ACE 3 AQ (100 mm x 2,1 mm i.d.) erhållen från ScantecLab. Flödena reglerades till 1,0 respektive 0,3 ml/min. Kolonntemperaturen ställdes in på 40 °C. En linjär gradient tillämpades under utnyttjande av ett neutralt eller surt system för den rörliga fasen, vilket började vid 100 % A (A: 10 mM NH4OAc i 5 % MeCN eller 8 mM HCOOH i 5 % MeCN) och slutade vid 100 % B (MeCN).

Alternativt registrerades masspektra med en Waters LCMS bestående av en Alliance 2690 separationsmodul, Waters 2487 Dual 1 absorbansdetektor (220 and 254 nm) en Waters ZQ singelkvadrupolmasspektrometer. Masspektro- (ESI) användes i positivjon- eller negativjonläge. Kapillärs- och metern var utrustad med en elektrosprejjonkälla som pänningen var 3 kV och konspänningen var 30 V.

Masspektrometern svepte över m/z 97-800 med en sveptid av 0,3 eller 0,8 s. Separationer utfördes med en Chromolith Performance RP-18e (100 x 4,6 mm). En linjär gradient tillämpades, vilken började vid 95 % A (A: 0,1 % HCOOH (aq.)) och slutade vid 100 % B (MeCN), Flöde: 2,0 ml/min.

HPLC-analyser utfördes med ett Agilent HPlO00-system Gl312A binär- pump, Gl367A automatisk provtagare från brunnplattor, Gl316A termostaterat kolonnutrymme och Gl315B diodupp- ställningsdetektor. Kolonn: X-Terra MS, Waters, 3,0 x 100 mm, 3,5 um. Kolonntemperaturen ställdes in på 40 °C och flödet på 1,0 ml/min. Dioduppställningsdetektorn svepte över 210-300 nm, steg- och toppbredd ställdes in på 2 nm respektive 0,05 min. En linjär gradient tillämpades, under 5 minuter. bestående av G1379A mikrovakuumavgasare, 4 _.ï-faïnen-fle-.~§.fx'g>ï.~.li:1:ati.<:n': . 10 15 20 25 30 35 528 407 17 vilken började vid 100 % A (A2 10 mM NH40AC i 5 % MGCN) och slutade vid 100 % B (B: MeCN), under 4 min.

En typisk upparbetningsprocedur efter en reaktion bestod av extraktion av produkten med ett lösningsmedel, såsom etylacetat, och tvättning med vatten, följt av torkning av den organiska fasen över MgSO4 eller Na2SO4, filtrering och koncentrering av lösningen i vakuum.

Tunnskiktskromatografi (TLC) utfördes med Merck TLC- plattor (Silikagel 60 F34) och fläckarna UV- visualiserades. Snabbkromatografi utfördes med en Combi Flash@ Companion” med hjälp av RediSep“ normalfassnabb- kolonner. Typiska för snabbkromatografi använda lösnings- medel var blandningar av kloroform/metanol, dikloro- metan/metanol, heptan/etylacetat, kloroform/metanol/NH; (aq.) och diklorometan/metanol/NH; (aq.).

Preparativ kromatografi kördes med en Waters auto- renings-HPLC med en dioduppställningsdetektor. Kolonn: XTerra MS C8, 19 x 300 mm, 10 um. Gradient med MeCN/0,1 M NH4OAc i 5 % MeCN i MilliQ-vatten kördes från 20 % till 60 % MeCN under 13 min. Flöde: 20 ml/min. Alternativt uppnàddes rening med en semipreparativ Shimadzu LC-8A HPLC med en Shimadzu SPD-10A UV-vis.-detektor utrustad med en Waters Symmetry® kolonn (C18, 5 um, 100 mm X 19 mm). Gradient med MeCN /0,1 % trifluoroättiksyra i MilliQ-water kördes från 5 % till 100 % MeCN under 15 min. Flöde: 10 ml/min.

Följande förkortningar används: DMAP 4-dimetylaminopyridin; DMF N,N-dimetylformamid; EDC l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid; EtOAc etylacetat; HCl väteklorid; CH2Cl2 diklorometan; CDCl3 deuterad kloroform; Eter dietyleter; MeCN acetonitril; Na2CO3 natriumkarbonat; J ftaztfzïzf.. . 528 407 18 NaOH natriumhydroxid: Na2SO4 natriumsulfat; QHSO4 tetrabutylammoniumvätesulfat; r.t. rumstemperatur. 5 Använda utgângsmaterial var antingen tillgängliga från kommersiella källor eller framställdes enligt litteraturprocedurer och hade experimentella data i enlighet med vad som rapporterats. 10 Exempel l. Framställning av di-tert-butyl [3- (2,3,4,5,6,7,8,10,ll,12-dekaborabicyklo[7.2.l]dodec-l- yl)propyl]imidodikarbonat i å/OYN 0 O B H \l l/ H B /l \ HB k? BH B 15 Till en omrörd blandning av QHSO4 (3,04 g, 8,96 mmol) och NaOH 1 M vattenbaserad lösning (18 ml) sattes CH2Cl2 (20 ml) följt av droppvis tillsats av 1-(3-bromopropyl)-2,3,4,5,6,7,8,10,11,l2- 20 dekaborabicyklo[7.2.1]dodekan (Tetrahedron Lett. 1996, 37(38), 6905-6908) (2,16 g, 8,15 mmol) i CH2Cl2 (15 ml).

Den resulterande lösningen värmdes under àterflöde under 2 h och kyldes till r.t. Vatten (10 ml) tillsattes. Den vattenbaserade fasen extraherades med CH2Cl2 (30 ml). De 25 sammanslagna organiska faserna tvättades med vatten 10 15 20 25 528 407 19 (10 ml), torkades över Na2SO4 och koncentrerades. Åter- stoden omrördes med eter (30 ml). Fällningen extraherades med torr eter (2 x 20 ml) och de sammanslagna extrakten koncentrerades under vakuum. Ráprodukten renades med snabbkromatografi.

Utbyte: 62 % (2,2l g). la-NMR (400 MHz, coc13)= a ppm 3,35 (t, zu, J=7,o7 Hz), 2,62 (s, 1H), 1,68-1,56 (m, 4H), 1,49-1,44 (m, 18H).

Lc/Ms (ESI) m/z 402 (M+1).

Exempel 2. Framställning av 3-(2,3,4,5,6,7,8,l0,11,l2' dekaborabicyklo[7.2.l]dodec-1-yl)-propan-1-amin Hy Di-tert-butyl-[3-(2,3,4,5,6,7,8,10,11,12- dekaborabicyklo[7.2.1]dodec-1-yl)propyl]imidodikarbonat från exempel 1 (2,2l g, 5,50 mol) löstes i en mättad lösning av HCl i EtOAc (100 ml). natten vid r.t. och indunstades sedan.

Fällningen löstes Lösningen omrördes över Den vita fluffiga fällningen tvättades med torr eter. sedan i vatten, varpå lösningen gjordes basisk med en vattenbaserad mättad lösning av Na2CO3 (40 ml). Den vattenbaserade fasen extraherades med eter och de samman- slagna organiska extrakten tvättades med saltlösning (3 x 10 ml). Avlägsnande av lösningsmedlet under vakuum gav den fria aminen. (841 mg).

Utbyte: 76 % -2 i=11rreñzleciàf=pp3..v_=::¿1t',.ïf_>!1tezt ïšrïämíøf: 528 407 zo ln-NMR (400 MHz, coci3>= ö ppm 2,62 (s, ln), 2,54-2,42_ (m, zu), 1,e9-1,ss (m, za), 1,44-1,33 (m, zu).

LC/MS (ESI) m/z 202 (M+l). 5 Exempel 3. Framställning av AF-(4-{[(2-amino-4-oxo-3,4- dihydropteridin-6-yl)metyl]amino}bensoyl)-N>{3~[(lR,9S)- 2,3,4,5,6,7,8,10,11,12-dekaborabicyklo[7.2.l]dodec-l- yl]propyl}-a-glutamin och AF-(4-{[(2-amino-4-oxo-3,4- dihydropteridin-6-yl)metyl]amino}bensoyl)-N=[3- 10 (2,3,4,5,6,7,8,10,11,12-dekaborabicyklo[7.2.l]dodeo-1- yl)propyl]-L-glutamin 15 och o§§,oH ”w N o HN \ N Å | f" HN Folsyra (1,84 g, 4,17 mmol), EDC (799 mg, 4,17 mmol) 20 och DMAP (509 mg, 4,17 mmol) löstes i torr DMF (200 ml).

Lösningen omrördes under 3 h vid 20 °C i argonatmosfär. 10 15 20 25 30 35 528 407 21 Därefter tillsattes en lösning av 3- (2,3,4,5,6,7,8,l0,11,12-dekaborabicyklo[7.2.l]dodec-l- yl)-propan-l-amin från exempel 2 (839 mg, 4,17 mmol) i DMF (40 ml), varpå blandningen omrördes under l dag.

Lösningsmedlet avlägsnades under vakuum. Återstoden tvättades tvâ gånger med en blandning eter/CH2Cl2.

Råmaterialet renades med preparativ HPLC.

Utbyte: 7,5 % (190 mg).

Lc/Ms (ESI) m/z 623 Retentionstid med en 12 min.-metod: 8,48 och 8,78 min. (en isokratisk metod användes i detta fall med en 2,5 mM (M-1) för båda isomererna. vattenbaserad lösning av ättiksyra).

In vitro-studier av uppfinningsenliga föreningar Fyra olika tumörcellinjer av humanursprung, inne- fattande humangliomcellinje U343mga, humanhepatokarcinom- cellinje Hep3B, humanbröstadenokarcinomcellinje MCF7 och humansarkomcellinje 4SS, användes för in vitro-under- sökning av det renade materialet från exempel 3 (hädan- efter benämnt BF). Celler ströks ut pà obelagda Vävnads- odlingsplastvaror och odlades vid 37 °C i inkubatorer med befuktad luft, jämviktsinställd med 5 % C02. De odlades i rekommenderat vävnadsodlingsmedium, kompletterat med 10 % FCS och PEST (penicillin 100 IU/ml och streptomycin 100 mg/ml). För cellpassage trypsinerades cellerna med trypsin-EDTA (0,25 % trypsin, 0,02 % EDTA i fosfatbuffrad (PBS) Sammanfattningsvis har BF, vilket kommer att visas saltlösning utan kalcium och magnesium). nedan i exempel 4-6, uppvisat lovande resultat i in vitro-studier och därvid visat sig överlägset BPA med avseende på tumörcellsupptag, ackumulering och retention, utan några tecken på toxicitet.

Exempel 4. Cellupptag av BF U343mga-celler ströks ut på petriskàlar vid 75 % celldensitet och inkuberades med en av borsyra (BA), vitamin En-konjugerat bor (BB), l-4-dihydroxiboryl- f é l i: 0,11: t . Jfsc 10 15 20 25 528 407 22 fenylalanin (BPA) eller BF löst i vävnadsodlingsmedium under 6 timmar. Samtliga fyra borerade föreningar sattes till och löstes i vävnadsodlingsmediet vid ekvimolära koncentrationer med avseende på borhalten (5 X 10% M bor). Inkuberingarna avbröts genom avlägsnande av det borhaltiga vävnadsodlingsmediet och genom tillsats av kall PBS-buffert för tvättning av överskott av medium från cellerna. Cellerna skördades omedelbart genom att de skrapades av från plastskålarna med en gummicellskrapa.

De samlades upp i kall PBS och pelletiserades genom centrifugering. 2 Cellprover togs för totalproteinanalys enligt en standardiserad Bradford-procedur. Cellpelletarna bearbetades för boranalys med likströmsplasma- (DCP-AES, ”Direct Current Plasma-Atomic Emission Spectroscopy”). Proverna (50- 130 mg) sönderdelades vid 60 °C med svavelsyra/salpeter- syra (l/l). Triton X-100 och vatten tillsattes för erhållande av koncentrationerna 50 mg vävnad/ml, 15 % total syra vol/vol och 5 % Triton X-100 vol/vol. Bor- koncentrationerna baserades på ett känt referensprov. atomemmisionsspektroskopi Resultaten visas i tabell l nedan. Kovalent bindning av folat till bor i form av BF resulterar i aktivt upptag i humanglioblastomcellinje U343mga, vilket är överlägset upptaget av bor som borsyra (BA), bor-fenylalanin (BPA) eller vitamin Bn-konjugerat bor (BB). 10 15 20 25 528 407 23 Tabell 1. Cellupptag av olika borerade föreningar.

Borhalten uttryckt som funktion av totalt cellprotein (ug bor/g cellprotein) i U343mga-celler för olika borerade föreningar i två parallella experiment (försök 1 och försök 2) (7,2 och 7,7 ug bor/ml odlingsmedium i försök l respektive 2).

Borerad förening Försök l Försök 2 BA _ 8 " BB - 60 BPA 65 38 BF 560 440 Exempel 5. BF-upptag av olika tumörceller Fyra olika tumörcellinjer av humanursprung, U343mga, Hep3B, MCF7 och 4SS, ströks ut pà petriskålar vid 40-50 % (låg) och 90-100 % (hög) celldensitet inkuberades med BF löst i cellodlingsmedium under (konfluens) och 6 timmar, som beskrivet. Inkuberingarna avbröts genom avlägsnande av det borhaltiga mediet och tillsats av kall PBS-buffert för tvättning av överskott av medium från cellerna. Cellerna skördades omedelbart genom att de skrapades av från plastskálarna med en gummicellskrapa, samlades upp i kall PBS och pelletiserades genom centrifugering. Totalprotein- och boranalys utfördes enligt standardförfaranden (se ovan).

Resultaten visas i tabell 2 nedan. BF befanns vara en mycket verksam borbärare i samtliga fyra undersökta humantumörcellinjer (glioblastom (U343mga), heptokarcinom (Hep3B), bröstcancer (MCF7), sarkom (4SS)) vid làg och' hög celldensitet. 10 15 20 25 30 528 407 24 Tabell 2. Cellupptag av BF. Borhalt uttryckt som en funktion av totalt cellprotein (pg bor/g cellprotein).

Cellinje Låg celldensitet Hög celldensitet U343mga los 172 Hep3B 171 219 MCF7 108 169 4SS 263 367 Exempel 6. Intracellulär retention av BF U343mga-cells ströks ut på petriskålar vid 75 % celldensitet och inkuberades med en av 1-4-dihydroxi- boryl-fenylalanin (BPA) eller BF i vävnadsodlingsmedium under 18 timmar. Båda de borerade föreningarna sattes till vävnadsodlingsmediet vid ekvimolära koncentrationer med avseende på borhalten (5 x 104 M bor). Inkuberingarna avbröts genom ersättning av det borhaltiga mediet med odlingsmedium utan bor. Cellprover skördades vid tid- punkterna O, 2 och 7 timmar, där tidpunkten O innebär omdelbart efter 18 timmar inkubering med borerad förening.

Cellerna tvättades med kall PBS och skördades genom att de skrapades av från plastskålarna med en gummicell- skrapa, samlades i kall PBS och pelletiserades genom centrifugering. Cellpelletarna analyserades med avseende på totalprotein och borhalt som beskrivits.

Resultaten visas i tabell 3 nedan. Efter intra- cellulärt upptag förblev BF i tumörcellerna med 40 % av det totala upptaget närvarande 7 timmar efter total utarmning av BF i odlingsmediet.

Tabell 3. Borhalt (ug bor/g cellpellet) i U343mga-celler vid 0, 2 och 7 timmar efter avlägsnande av borhaltigt medium.

Borerad förening O timmar 2 timmar 7 timmar BPA 0,075 O 0 BF 0,79 0,59 0,3 tank/f . :í-'r-z:

Claims (14)

10 15 20 528 407 25 PATENTKRAV

1. Förening enligt formel (I) Rz Ošš/ . A N H (I > HN N\~ N O Ik I TH - R1 \\ 1/ PQN N N . vari en av Rl och RZ är -NH-x-Y-z, -o-x-Y-z eller -s-x-Y-z, -Nn-x-Y-z, -o-x-Y-z eller -S-X-Y-Z; vari X är -(CH2)m-, 3 eller 4, -(CHQP-O-(CHflq-, vari p och q oberoende av varandra är l, 2, 3 eller 4; Y är en boran eller en karboran, och den andra är -OH, vari m är 0, 1, 2, eller vari åtminstone en boratom är mB; och Z är H, aminometyl, 2-aminoetyl, 3-aminopropyl, 1,3- propandiol-2-yl-metoxyl, etylenglykoxyl eller dietylenglykoxyl; och farmaceutiskt accepterbara salter, solvat och stereoisomerer därav. 528 407 26

2. Förening enligt krav l, vari Y är 4. zzzen-cïedàïp,ï; j. qfatxi-'sn t: AT. _ d m: 10 528 407 eller vari * indikerar belägenhet av en bindning till X eller Z; M är kobolt, kobolt-57 eller järn; och X är så som definieras i krav l.

3. Förening enligt krav 2, vilken är AF-(4-{[(2- amino-4-oxo-3,4-dihydropteridin-6- yl)metyl]amino}bensoyl)-N>{3-[(lR,9S)- 2,3,4,5,6,7,8,10,ll,l2-dekaborabicyklo[7.2.l]dodec-l- yl]propyl}-g-glutamin eller AF-(4-{[(2-amino-4-oxo-3,4- . ,. Z ul-ïzriezfxfçie-rišzpp l Så a i c-n ä; ë;_É='.P-.,ï*! . cl <1- :x 10 15 20 25_ 30 35 528 407 28 dihydropteridin~6-yl)metyl]amino}bensoyl)-N@[3- (2,3,4,5,6,7,8,10,11,12-dekaborabicyklo[7.2.1]d0deC-l- yl)propyl]-L-glutamin.

4. Förening enligt krav 1 eller 2, vari RI är -NH-x-Y-z, -o-X-Y-z eller -s-x-Y-z, och R* är on.

5. Förening enligt något av krav 1 till 4, vari åtminstone en kolatom är HC.

6. Förening enligt något av krav l till 5 för användning vid terapi.

7. Förening enligt krav 5 för användning vid diagnostik.

8. Farmaceutisk komposition innefattande en förening enligt något av krav 1 till 5 samt en farmaceutiskt accepterbar bärare, ett farmaceutiskt accepterbart spädningsmedel eller ett farmaceutiskt accepterbart adjuvans.

9. Användning av en förening enligt formel (I) enligt definition i något av krav 1 to 5 för tillverkning av ett läkemedel för användning vid tumörterapi.

10. Användning enligt krav 9, varvid nämnda tumör- terapi är neutroninfångningsterapi med bor av en tumör.

11. ll. Användning enligt krav 9 eller 10, varvid tumören härrör från centrala nervsystemet, företrädesvis gliom såsom glioblastom, gliosarkom, anaplastiskt astrocytom, låggradigt astrocytom, pilolytiskt astrocytom, oligodendrogliom eller hjärnstamsgliom; meningiom; perifert neuroepiteliom; primitiv neuroektodermal tumör; neuroblastom; germinom: 10 15 528 407 29 hypofystumör; metastatisk hjärntumör; eller arteriovenös missbildning.

12. Användning enligt krav 9 eller 10, varvid tumören är en malign tumör eller metastatisk tumör- process, företrädesvis melanom, prostatacancer, lever- cancer, lungcancer, bröstcancer eller sarkom.

13. Användning av en förening enligt formel (I) enligt definition i krav 5 för tillverkning av ett läke- medel för användning vid positronemissionstomografi.

14. Förfarande för framställning av en förening enligt formel (I) enligt defintion i något av krav 1 till 5, i vilket en förening enligt formel NH;-X-Y-Z, OH-X-Y-Z eller SH-X-Y-Z, vari X, Y and Z är så som definieras i något av krav 1 till 5, omsätts med folsyra.