SE437160B - Sett att framstella 3-oxo-6-halo-delta?724-11-hydroxisteroidforeningar tillhorande pregnan-serien - Google Patents

Description

8205170-7 ortoformiat i ett lämpligt lösningsmedel, t.ex. dioxan, i när- varo av en syrakatalysator, t.ex. p-toluensulfonsyra. Då man emellertid utgår från en lätt tillgänglig förening, t.ex. kortisol (hydrokortison, llß,l7a,2l-trihydroxi-3,20-dioxopregn- -4-en), som har en reaktionsbenägen hydroxigrupp vid 21- och llß-ställning, har det tidigare visat sig att det är fördel- aktigt att först bringa kortisol (med nedanstående formel I) att reagera med formaldehyd och metylenklorid i klorvätesyra för att framställa en bismetylendioxi-(BMD)-förening som anges här nedan med II, dvs. oH av o c=o *_ // H20 \ Ho » - "OH 0 _'°\ Ho. _ r/CH2 o -r / o o r (I) (II) Se exempelvis de amerikanska patentskrifterna 2 888 456 och 2 888 457. ll(9)-derivat vid den För att därvid förhindra bildning av ett A efterföljande reaktionen med det lägre alkylortoformiatet i syra genom dehydratisering av OH vid ställningen llß och H vid ställ- ningen 9, så oxiderar man först OH i ställningen llß med exempel- vis kromsyra i svavelsyra i dimetylformamid, dvs. /°\_ H2c\ O \\\~___.

(II)__._' o / _ (III) 8205170-7 Man behandlar därefter föreningen med formeln III med det lägre alkylortoformiatet och syra för att framställa den önskade enol- etern med formeln IV, vilken därefter kan behandlas såsom er- fordras, dvs.

(III) --)~Ro där R betecknar lägre alkyl..

I den amerikanska patentskriften 3 002 224 har föreslagits, att dehydratiseringsproblemet kan lösas genom att man bringar en kortisol eller kortisol-2l-eter att reagera med ett lägre alkyl- ortoformiat i ett lösningsmedel bestående endast av motsvarande lägre alkanol och en syrakatalysator. Genom att använda detta förfarande kan dehydratiseringen enligt uppgift reduceras till mindre än 10 % och man kan erhålla 3-enoletern med utbyten av 65 ~ 90 %.

I en annan patentskrift, amerikanska patentskriften 3 087 927, diskuteras framställning av 3-enoletermellanprodukten av den här ovan nämnda typen. I den där angivna reaktionssekvensen utgöres utgångsmaterialet av exempelvis 16-hydroxikartisol eller 16- -hydroxi-kortison. Patentskriften anger, att dessa material kan bringas att reagera i närvaro av en mineralsyra med en ortoester med formeln R3c (oR4)3 i vilken R3 betecknar väte eller lägre alkyl (C l-3 kolatomer) och R4 betecknar lägre alkyl, t.ex. metyl eller etyl, varvid man erhåller en reaktionsprodukt med formeln P G91» _ ¿§ - QUÃLÉT? 8205170-7 4 CHZOH = O HQ I __ -O /OR4 '“ " _' '_ R Exemplen visar specifikt att reaktionen utföres i dioxan med en ringa mängd metanol och svavelsyra med trimetylortoformiat. Ingen- ting nämnes i patentskriften om dehydratiseringsproblem, som diskuteras i den amerikanska patentskriften 3 082 224.

Teknikens ståndpunkt antyder således, att man kan bringa ll- -hydroxi-A4-pregnen-3-oner att reagera för att framställa motf svarande enoletrar genom att använda: (1) trialkylortoformiat med användning av en större mängd av ett lösningsmedel, t.ex. dioxan, och en mindre mängd av motsvarande lägre alkanol (dvs. trimetylortoformiat med metanol eller tri- etylortoformiat med etanol), (2) trietylortoacetat med användning av en större mängd av ett lösningsmedel, t.ex. dioxan, med en mindre mängd etanol eller (3) trietylortoformiat med användning av etanol som enda lös- ningsmedel.

I vart och ett av dessa fall använder man en syrakatalysator för att tillåta reaktionen att förlöpa med önskad hastighet. Det har visat sig, att i första fallet utgöres den största produkten av A9(ll)-dehydratiseringsprodukten, i andra fallet reagerar icke reaktionskomponenterna och i tredje fallet förekommer en viss de- hydratisering, som äger rum mellan ll- och 9-ställningen, och reaktionen blir icke fullständig. I varje reaktion, som är känd inom facket, är således utbytena av önskad enoleter låga och i en k=ömfattande stegsekvens kommer detta utbyte givetvis att släpa med och reducera den totala produktionen av den önskade slutprodukten. 8205170-7 Det har nu visat sig, att genom att använda förfaringssättet enligt föreliggande uppfinning för att framställa en 3-enoleter av en 3-oxo-A4-llB-hydroxisteroid kan man uppnå följande fördelar: 1) dehydratisering vid 9(ll)-ställningen är i huvudsak full- ständigt eliminerad, 2) på grund av ovanstående under 1) föreligger inget tvång att först oxidera ll-hydroxigruppen till en oxo-grupp för att skydda denna, 3) utbytet av enoletern ökas (delvis på grund av ovanstående punkterna l) och 2) och även delvis på grund av tendensen hos reaktionsförloppet enligt uppfinningen att bli fullständigt), 4) man kan använda billiga syrehaltiga kolväte-samlösningsmedel, t.ex. glymer, tillsammans med etanol, 5) det är icke nödvändigt att, då man bringar steroider med 17d,2l-hydroxidelar, skydda dessa delar via bismetylendioxiföre- ning (BMD) eller genom andra förfaranden och 6) ovanstående 5 fördelar bidrager alla till ett enklare för- faringssätt än vad som tidigare är känt inom facket.

Andra fördelar med sättet enligt uppfinningen kommer att framgå för fackmannen vid läsningen av följande beskrivning.

Uppfinningen avser ett sätt att framställa 3-oxo-6-halo-Å4-ll- -hydroxisteroidföreningar med formeln CHZR C=O 1 PÜU» ¥"~'**“àf_.f.- 8205170-7 i vilken R betecknar H, OH, lägre alkyleter med l-6 kolatomer eller lägre alkylester med l-6 kolatomer, Rl betecknar H, OH eller lägre alkylester med l-6 kolatomer, R2 betecknar H, a-CH3 eller ß-CH3, X betecknar H, F, Cl eller Br och Rl och R2 kan till- sammans beteckna 4 --o\\C//,R ___0// \\\R5 där R4_och RS betecknar kolväten med l-4 kolatomer, som känne- tecknas av att man bringar en 3-oxo-A4-steroid med ovanstående formel, men i vilken X betecknar H, att reagera med trietylorto- acetat i närvaro av en katalytisk mängd av en stark syra i ett lösningsmedel, som består huvudsakligen av minst 40 vikt-% och högst 60 vikt-% av en fördragbar alifatisk eller cyklisk eter och därefter på i och för sig känt sätt halogenerar den bildade 3-enol- etern 1 6-ställning för ett framställa en 3-exo-6ß-ne1o-A4-etere1d- förening. Lösningsmedlet utgöres företrädesvis av en 50/50-bland- ning av etanol och etylenglykoldimetyleter (glyme) och katalysa- torn är en stark organisk syra, t.ex. p-toluensulfonsyra eller trifluorättiksyra. Förfarandet är särskilt användbart för korti- sol och kortisol-21-alkylestrar, t.ex. 21-acetat.

Den bildade 6ß-halo-A4-pregnen-3-onen utgör mellanprodukt, som kan behandlas, varvid man erhåller en 6-halo-3-enoleter, som där- A4,6 A1,4,6y efter_omvandlas till en 6-halo- - (eller -pregnadien (eller -trien)-3-on såsom beskrives i det följande.

Föredragna utföringsformer.

Framställning av 3-enoleter.

Det är viktigt att använda trietylortoacetat som reaktionskompo- nent i förfaringssättet enligt uppfinningen. Trietylortoacetat .1° skiljer sig från-det analoga trietylortoformiatet. Trietylorto- acetat representeras genom följande struktur: _ CH3C (0CVH2CH3) 3 , under det att trietylortoformiat vanligtvis kan karakteriseras med följande formel: 8205170-7 Hc(ocH2cH3)3.

Kemiska förhållanden, såsom framställning och allmänna reaktioner av alifatiska ortoestrar, diskuteras i en bok med titeln "The Chemistry of Aliphatic 0rthoesters“, American Chemical Society Monograph av H.W. Post, publicerad av Rienhold. Trietylortoace- tat kan vanligtvis framställas på olika sätt, varvid de två popu- läraste anges i följande reaktioner: cH3c-oc2H5 + 2c2H5oH à NH4c1 + cH3c(oc2H5)3 (1) NH-Hcl CH2=C(OC2H5) + C 2H5oH -> cH3c (oczns) 3 (2) Ytterligare framställningsförfaranden finns angivna på sid. 40 i ovanstående monograf. Framställningssätt med användning av reaktionskomponenterna enligt det första av ovanstående schema beskrives i en artikel i Journal of the American Chemical Society, äg, 516 (1928) av P. sah.

Ehuru teoretiskt mängden trietylortoacetat, som är nödvändig för att bilda 3-enoletern genom reaktion med 3-oxo-A4-steroiden, är 1 mol ortoacetat för varje mol steroid, så synes - på grund av den speciella reaktionstypen - åtminstone ca 2 mol trietyl- ortoacetat per mol steroid erfordras för att reaktionen skall fort- löpa och företrädesvis åtminstone ca 3 mol ortoacetat per mol steroid användes. Man använder icke mera än ett förhållande av ca 5 till l, enär ett högre förhållande icke medför någon spe- ciell fördel ifråga om reaktionshastighet etc.

För att förfarandet enligt uppfinningen skall fungera på ett rik- tigt sätt, är det viktigt att det använda lösningsmedelssystemet är ett system, i vilket en väsentlig mängd av lösningsmedlet ut- göres av etanol, dvs. mera än minst ca 40 vikt-X, företrädesvis ca 50 vikt-% av lösningsmedelssystemet är etanol. Man kan använda upp till 100 % etanol, ehuru det är lämpligt att använda ett sam- lösningsmedel, såsom anges i det följande. Systemet bör även vara i huvudsak vattenfritt. Andra fördragbara lösningsmedel, som kan användas i systemet, är lösningsmedel som är fritt blandbara med etanol i alla proportioner. Dessa lösningsmedel inkluderar syre- ~_~__._.-..._..__ få nå* ø 1? a 8205170-7 haltiga kolväten, exempelvis alifatiska etrar och cykliska etrar, t.ex. glykoletrar, dioxan, tetrahydrofuran och tetrahydropyran.

Särskilt användbara är i detta avseende dimetylerade polyetylen- glykoler representerade genom formeln CH3O(CH2CHO)nCH2, där n är ett helt tal l-4. Dessa föreningar anges vanligen som “glymes", dvs. glyme (n=l), diglyme(n=2), triglyme (n=3) och tetraglyme (n=4). *Vilken som helst av dessa föreningar ensam eller i kombination kan användas som ett fördragbart samlösningsmedel med etanol i förfarandet enligt uppfinningen. En särskilt använd- bar blandning är ca 50 vikt~% etanol med ca 50 vikt-% glyme.

Det är dessutom nödvändigt att inkludera en katalysatisk mängd av en stark syra, såsom en organisk syra eller svavelsyra som katalysa- tor vid sättet enligt uppfinningen. Lämpliga organiska syrakata- lysatorer inkluderar p-toluensulfonsyra, 2,4-dinitrobensensulfonsyra, trifluorättiksyra etc.

Man använder företrädesvis paratoluensulfonsyra eller trifluor- ättiksyra. En katalysatisk mängd av katalysatorn är den mängd, som är nödvändig för att möjliggöra att reaktionen fortlöper med 'en.rimlig hastighet. Denna mängd uppgår vanligtvis till ca 0,1 till ca 20 % av steroidens totalvikt och ligger företrädesvis vid ca 10 vikt-%.

De reaktionsförhållanden, under vilka reaktionen kan äga rum, är icke kritiska, men är vanligtvis kända inom facket. Temperaturen kan sålunda sträcka sig från 0 till l00°C, men ligger företrädes- vis mellan ca 20 och 40°C, enär högre temperaturer tenderar att minska det totala utbytet på grund av nedbrytningsförluster.

Trycket på reaktionsblandningen kan vara atmosfärtryck, under atmosfärtryck eller över atmosfärtryck, men reaktionen utföres vanligtvis vid atmosfärsförhållanden. _Den tid, som erfordras för att sättet enligt uppfinningen i huvudsak skall slutföras full- ständigt, beror på reaktionstemperaturen. Då reaktionen försig- går långsammare vid lägre temperaturer, så erfordras vanligtvis något från 5 minuter till ca 3 timmar, men vid 20 - 40°C åtgår icke mer än ca l/2 timme för att den totala reaktionen skall äga rum. 9 8205170-7 Reaktionskärlet, som kan användas i sättet enligt uppfinningen, kan vara antingen ett kärl av satstyp eller ett kärl för konti- nuerlig drift. Kärlet är företrädesvis av vanlig satstyp, i vil- ket de olika materialen, som är nödvändiga för utförandet av sät- tet enligt uppfinningen, anbringas och materialen bringas i reak- tionskontakt med varandra, så att reaktionen kan äga rum.

De enligt uppfinningen framställda 3-enoletrarna är mellanproduk- ter för bildning av aktiva steroidföreningar, som har antiin- flammatorisk, antiandrogen, östrogen eller annan verkan, sådana som anges i den amerikanska patentskriften 3 232 965.

Det bör bemärkas, att sättet för framställning av en 3-enoleter enligt uppfinningen kan exempelvis användas med en 3-oxo-pregn-4- -en som är icke-substituerad vid 6u-ställningen eller som är halo- -substituerad vid 6ß-ställningen. Då förfaringssättet användes i sistnämnda situation, anbringar man 6ß-halosteroiden i lösnings- medlet vid ungefär rumstemperatur i närvaro av syrakatalysatorn men i frånvaro av trietylortoacetatet under en tid tillräcklig för att bilda 6u-halo-steroiden (vanligtvis ca 10 minuter till l timme, företrädesvis ca 20-40 minuter, vid rumstemperatur). Därefter sätter man trietylortoacetatet i reaktionskontakt med 6u-haloste- roiden i lösningsmedlet för att bilda 3-enoletern.

Då strukturen av utgångssteroiden har en hydroxigrupp vid både 21- och l7-ställningen, så bildas en 3-enoleter med strukturen CH O C C=O -_“M -- - o \*~\M~ aïqllnp e z* 8205170-7 10 i vilken X och R2 betecknar detsamma som ovan. Närvaro av en sådan struktur är icke menlig, enär 17,21-ortoestern delvis hydroly- seras under efterföljande steg, exempelvis klorering eller bro- mering, och kan fullständigt omvandlas till l7,2l-dihydroxi- grupper genom omförestring eller under-basiska förhållanden.i En dylik reaktion använder emellertid ytterligare trietylorto- acetat och av ekonomiska skäl föredrager man att en alkylester, t.ex. acetat, föreligger vid 2l-ställningen.

Reaktioner med 3-enoletrar.

Halogeneringen, dvs. företrädesvis bromering och klorering, kan utföras medelst vilket som helst inom facket känt sätt för halo- genering i 6-ställning. Halogeneringsmedel inkluderar N-klor- succinimid, N-bromsuccinimid, N,N'-diklorhydantoin etc.

Vid utförandet av halogeneringssteget isolerar man först 3-enol- etern från reaktionskomponenterna och lösningsmedlet i det första steget, varefter man anbringar halogeneringsmedlet.i reaktions- kontakt med 3-enoletern i ett lämpligt inert lösningsmedel under förhållanden som är tillräckliga för att åstadkomma bildning av 6-halo-A4-föreningen. Ett lämpligt inert lösningsmedel är ett lösningsmedel som icke reagerar med 3-enoletern eller halogene- ringsmedlet på ett sätt som är menligt för reaktionen. Använd- bara lösningsmedel inkluderar syrehaltiga kolväten, t.ex. tetra- hydrofuran, dioxan och dietyleter, aceton, ättiksyra eller bland- ningar därav. Reaktionen utföres företrädesvis under neutrala förhållanden, dvs. ca pH 7, och vid temperaturer från ca -5°C till 25°C, företrädesvis vid ca 0°C. ' Halogeneringen kan mera specifikt utföras genom att man bringar enoletern att reagera med dimetyl-N,N'-diklorhydantoin i en buffrad acetonlösning vid temperaturer från -5°C till ca 5°C under 60 minuter.

Uppfinningen är tillämpbar och kan ingå i en totalsyntes för fram- ställning av 6-halo-A4'6-pregnadien-llß,l7u,2l-triol-3,20-dioner och 6-halo-Al'4'6 synnerhet 6-klorföreningar angivna i den amerikanska patentskrif- -pregnatrien-llß,l7a,21-triol-3,20-dioner, i _ __ :fl V 'sv-F ' F: d: L .H-(IA V d _ av? ß få ufmiifšï.. g g ' 8205170-7 ll ten 3 232 965. Såväl dienerna som trienerna har antiinflammato- risk verkan med ett minimum av saltretention. Förfaringssättet är även användbart för framställning av föreningar i l6a,l7a-ace- tonidserien och andra serier med användning av de här ovan an- givna utgângsföreningarna.

Syntesen enligt uppfinningen kan i stort sett åskådliggöras med hänvisning till reaktionsschemat och följande sammanfattning. l) Det första steget innefattar förestring av utgångssteroiden vIII (där Rl gruppen för att framställa motsvarande 21-alkylester IX. och R2 betecknar detsamma som ovan) vid 2l-hydroxi- 2) Man bringar därefter 21-alkylestern IX att reagera i överens- stämmelse med den primära aspekten i sättet enligt uppfinningen med trietylortoacetat i etanol och företrädesvis glyme med en syrakatalysator för att framställa en 3-enoleter med formeln X. 3) Man halogenerar, dvs. klorerar eller bromerar, 3-enoletern X i sin tur för att framställa exempelvis en 6-klor-A4-pregnen-3-on med formeln XI. 4) Man bringar därefter föreningen med formeln XI att reagera med trietylortoacetat i närvaro av en syrakatalysator i etanol och företrädesvis glyme för att framställa en enoleter med for- meln XII.

Sa) Man kan därefter behandla 3-enoletern XII för att direkt framställa Al'4'6-pregnatrien med formeln XIV eller 5b) först bringa 3-enoletern med formeln XII att reagera för att framställa A4'6-pregnadien med formeln XIII. 5c) Man dehydrerar därefter A4'6-pregnadienen XIII i sin tur medelst vilket som helst inom facket känt sätt vid l-ställningen l'4'6-pregnatrien med formeln XIV. för att framställa motsvarande A 6a) Man kan därefter behandla Ål'4'6-pregnatrienen för att av- lägsna 21-alkylestern och framställa motsvarande 2l-hydroxiföre- ning med formeln XV, där Z är en dubbelbindning eller 820517047 12 6b) behandla föreningen med formeln XIII för att framställa föreningen med formeln XV, där Z är en enkelbindning, > som i sin tur kan omvandlas till Al'4'6 I -pregnatrien. 8205170-7 CHZOR XIII 8205170-7 14 Här nedan diskuteras vart och ett av stegen i totalsyntesen. l) I det första steget förestrar man en förening representerad genom formeln VIII, företrädesvis kortisol, för att framställa en 2l-lägre alkylester med ca 2 - 4 kolatomer i esterdelen.

Denna förestring kan utföras medelst vilket som helst inom facket känt sätt för förestring vid 21-ställningen. Förestringen ut- föres vanligtvis genom att man bringar föreningen att reagera med en lägre alkylenhydrid i ett lämpligt lösningsmedel, exempel- vis bringar kortisol att reagera med ättiksyraanhydrid i pyridin vid temperaturer understigande 30°C. ,Reaktionen förlöper rent och fullständigt och därvid bildas en förening med formeln IX, som företräaesvis är kortisoi-zl-acetat. i man kan i stället för ättiksyraanhydrid använda propionsyra- eller smörsyraanhydrid. 2) I det andra steget isolerar man först den i steg 1 bildade 21-estern och bringar den att reagera med trietylortoacetat, i överensstämmelse med den primära aspekten i sättet enligt uppfin- ningen sâsom angivits här ovan, för att framställa motsvarande 3-enoletyleter med formeln X. Den föredragna föreningen med for- meln X är 3-enoletern av kortisol-21-acetat.

Ehuru man föredrager att först bringa en förening med en struktur sådan som visas i formeln VIII, t.ex. kortisol, att reagera med ättiksyraanhydrid för att framställa motsvarande 21-acetat, kan man bringa föreningen representerad genom formeln VIII att reagera med trietylortoacetat från början utan att behöva gå via bild- ningen av 21-acetat-mellanprodukten.

Då man bringar en förening med formeln VIII att reagera med tri- etylortoacetat, så bildas en ringa mängd, dvs. 10 - 15 %, av en 17,2l-ortoestermellanprodukt tillsammans med enoletern med formeln X, där R är väte. Närvaro av 17,21-ortoestern är icke menlig för den totala reaktionen, enär den hydrolyseras vid det efterföljande kloreringssteget under sura förhållanden. Då emel- lertid bildning av 17,21-ortoester innefattar reaktion med ytter- ligare trietylortoacetat och_då reaktionen av en förening, t.ex. kortisol, med ättiksyraanhydrid i pyridin är så ren och bildning- en av motsvarande 3-enoletyleter är fullständig och snabb i steg 2, föredrager man att först framställa 21-estern, innan man utför' . _ _ s '“ ~u _ "flfï ,..-v J -1 8205170-7 15 reaktionen med trietylortoacetat. Detta föredragna tillväga- gångssätt visas således i reaktionsschemat. 3) Sedan man isolerat 3-enoletern X, halogenerar man den för att framställa en 6-haloförening med formeln XI.

Halogeneringssteget är antingen ett klorerings- eller bromerings- steg, såsom beskrives här ovan. 4) Föreningen med formeln XI är en 6B-halosubstituerad förening.

Innan man kan bringa denna att reagera med trietylortoacetat för att på ett effektivt sätt framställa en 3-enoleter med formeln XII, måste halogenen omvandlas till en 6d-halogen.

Detta åstadkommes genom att man anbringar den 63-substituerade föreningen XI i ett inert lösningsmedel vid ca rumstemperatur (20 - 25°C), tillsätter en ringa mängd sur katalysator och håller temperaturen under l timme eller mindre, företrädesvis 30 minu- ter eller mindre. Detta utföres företrädesvis i ett lösnings- medel, t.ex. etylenglykoldimetyleter (glyme), i närvaro av l vikt-% eller mindre av en stark organisk syrakatalysator, t.ex. trifluorättiksyra eller p-toluensulfonsyra.

Omvandlingen till 6d-haloföreningen är fullständig inom mindre än l timme, vanligtvis inom mindre än 1/2 timme. Därefter sätter man etanol och trietylortoacetat till reaktionsblandningen och låter komponenterna reagera i överensstämmelse med den primära aspekten enligt uppfinningen för att framställa 3-enoletern med formeln XII.

Sedan man isolerat mellanprodukten med formeln XII kan man om- vandla den till den önskade slutprodukten på olika sätt. 5a) Man kan bringa föreningen med formeln XII att reagera för att direkt framställa A1'4'6-pregnatrienen med formeln XIV.

Man kan i ett-steg-förfarande bringa föreningen med formeln XII att reagera exempelvis med 2,3-diklor-4,5-dicyanobensokinon och ett i huvudsak vattenfritt, lämpligt syrehaltigt kolvätelösnings- medel, t.ex. dioxan, vid rumstemperatur för att framställa 8205170-7 16 Al'4'6-pregnatrien-21-estern med formeln XIV som man i sin tur kan hydrolysera under basiska förhållanden eller omförestra för att framställa 21-hydroxisteroiden med formeln XV, där Z är en dubbelbindning.

Sb) På grund av högre utbyten föredrager man att använda ett tvåstegsförfarande, varvid en förening med formeln XIII först bildas, som i sin tur dehydreras vid l-ställningen, varvid man erhåller en förening med formeln XIV.

Man kan därefter hydrolysera vilken som helst av föreningarna med formeln XIII eller XIV för att framställa en förening med formeln XV, där Z kan vara antingen en enkel- resp. dubbelbind- ning. Föreningen med formeln XIII framställes först genom att man bringar föreningen med formeln XII att reagera med ett lämp- ligt oxidationsmedel (en tetrasubstituerad 1,4-bensokinon) vid låga temperaturer (dvs. ca O - l0°C) i ett vått syrehaltigt lös- ningsmedel, t.ex. dioxan eller aceton, med 25 vol-% eller mindre vatten.

Ett särskilt lämpligt oxidationsmedel är 2,3-diklor-ö,6-dicyano- bensokinon. Denna reaktion är vanligtvis fullständig inom 2 timmar eller mindre.

Sc) Man isolerar 4,6-pregnadienen med formeln XIII och dehydre- rar den därefter i 1-ställning för att framställa en förening I med formel XIV.

Dehydreringen kan utföras på kemiska eller mikrobiologiska sätt, som är kända inom facket. Man isolerar först 4,6-pregnadienen med formeln XIII innan man dehydrerar den i överensstämmelse med nästa steg. Vid den selektiva kemiska dehydreringen i l-ställ- ning bringar man föreningen med formeln XIII att reagera med ett lämpligt oxidationsmedel under i huvudsak vattenfria förhållan- den i ett lämpligt lösningsmedel, t.ex. ett syrehaltigt kolväte, exempelvis i alkohol, dioxan eller aceton, vid temperaturer över- stigande rumstemperatur upp till återflödestemperaturen. Ett lämpligt oxidationsmedel är 2,3-diklor-5,6-dicyanobensokinon, och lämpliga lösningsmedel inkluderar xylen, toluen, amylalkohol, dioxan och aceton. Man föredrager att upphetta föreningen med _ _-.-v-~”'_ í-øø cvvfw-o-fl' ß- 'f _, -Já- ' .Å f, va» - 8205170-7 17 återflöde i lösningsmedlet under en tidsperiod tillräcklig för att åstadkomma dehydreringen. Denna tid är vanligtvis l timme till 20 timmar med kloranil i amylalkohol eller ca 12 till 16 timmar i xylen. Då man använder 2,3-diklor-5,6-dicyanobenso- kinon i vattenfri aceton, erfordras endast ca 4 timmar vid åter- flödestemperatur.

De kemiska förfarandena för dehydrering i Al-ställningen utföres företrädesvis medelst ett bromeringsförfarande i 2-ställning och dehydrobromering mellan ställningarna 1 och 2,varvid en dubbelbindning bildas. Man bromerar genom att bringa ett lämp- ligt bromeringsmedel att reagera med A4'6 -pregnadienen i ett lämpligt lösningsmedel under en tid tillräcklig för att fullborda reaktionen. Lämpliga bromeringsmedel inkluderar brom i kombina- tion med bromväte och kan användas i ättiksyra vid rumstempera- tur under en reaktionstid av ca 10 min., varvid man erhåller en reaktionsprodukt med ett utbyte av ca 85 % eller bättre.

Ett särskilt värdefullt bromeringsmedel för bromering i 2-ställ- ning är pyridiniumhydrobromidperbromid eller trimetylfenylammo- niumtribromid i tetrahydrofuran, då man utför bromeringen vid temperaturer av 30°C eller lägre, företrädesvis ca 20 till 25°C.

Man dehydrobromerar därefter den bildade i 2-ställning bromerade föreningen genom att bringa denna förening att reagera med ett dehydrobromeringsmedel. Typiska dehydrobromeringsreaktioner be- skrivs på sid. 213 - 218 i Steroid Reactions, An Outline For Organic Chemists av Carl Djerassi, Holden-Day, 1963. De däri be- skrivna reaktionerna, som är tillämpliga, inneslutes här såsom en hänvisning. Ett särskilt föredraget förfaringssätt innefattar 4'6-pregnadienen med litiumkarbonat och att man upphettar 2-brom-A litiumbromid i dimetylformamid under 5 timmar eller mindre, före- trädesvis mindre än 3 timmar, vid temperaturer av ca 100 till ll0°C. 5d) Man kan alternativt dehydrera föreningen med formeln XIII med användning av mikrobiologiska förfaringssätt, dvs. man behandlar föreningen medelst en fermenteringsprocess, varvid man kan använda antingen a) växande mikroorganismer, t.ex. Arthobacter simplex, eller b) cellfritt enzympreparat eller lägre alkanol- eller alka- non-torkade celler i närvaro av en väteacceptor. Då mikroorga- ~\\S3$2%ï á)¿[§]:[27 .\\\\\\šT 8205170-7 18 nismer och enzympreparat emellertid även har en viss esterasakti- vitet, föredrager man att först framställa 21-hydroxiföreningen genom hydrolys eller omförestring och därefter behandla denna förening för att framställa Al'4'6 -föreningen.

Ett representativt förfarande för en process med användning av en växande mikroorganism beskrives i den amerikanska patentskrif- ten 2 837 464, som kännetecknas av att man underkastar en A4-3- -ketopregnen en inverkan av en kultur av en medlem av en grupp bestående av Corynebacterium simplex (som även betecknas som Arthobacter simplex) och Corynbacterium hoatii. Det som i denna patentskrift är tillämpligt innefattas här såsom hänvisning. In- förandet av en Al-dubbelbindning förlöper vanligtvis på ett till- fredsställande sätt vid ett pH-värde av 7,6 till ca 8 vid en temperatur av 32 till ca 37°C. I' Ett representativt förfarande med ett cellfritt enzympreparat i närvaro av väteacceptorer är det förfarande, som beskrives i den amerikanska patentskriften 3 047 469. I detta~förfarande under- kastas en steroid, som är mättad i 1,2-ställningen, inverkan av en blandning av ett ring A dehydrogenasextrakt av en mikro- organism, t.ex. Corynbacterium, varvid extraktet är i huvudsak fritt från levande celler.

Andra organismer, som kan extraheras, inkluderar Nocardia, Coryn- bacterium, Mycobacterium, Cylindrocarpon och Bacterium. Väte-~ bärare, som kan användas tillsammans med det cellfria extraktet i överensstämmelse med den uppfinningen, inkluderar oxidation- -reduktion-reaktionskomponenter, exempelvis färgämnen, t.ex. kaliumferrocyanid, tiaziner och iminderivat, exemplifierade genom metylenblått, fenazinmetosulfat etc., bensokinoner och iminderivat, t.ex. ortokinon, toluylenblåklorid, naftokinoner, t.ex. kresyl- blått etc., och indofenoler, i synnerhet 2,6-diklorindofenol.

I det cellfria extraktförfarandet kan extraktet blandas direkt med steroidutgångsmaterialet och vätebäraren sättes därefter till blandningen eller extraktet kan först blandas med vätebäraren och därefter anbringas i kontakt med steroiden. Koncentrationen av vätebäraren är icke kritisk och vilken som helst mängd från en katalytisk mängd till en stökiometrisk mängd motsvarande koncent- 8205170-7 19 rationen av steroiden kan användas. Det under dehydreringen an- vända pH-värdet och den använda temperaturen är icke kritiska.

Temperaturerna kan ligga inom omrâdet 20 till ca 45°C, optimal- temperaturen ligger omkring 25 till ca 35°C. Blandningens pH- värde kan vara surt, alkaliskt eller neutralt och ligger före- trädesvis inom omrâdet 6,0 till 8,0. Man kan, för att eventuellt hålla pH-värdet vid ett visst värde, i reaktionsblandningen in- föra en buffertförening, exempelvis ett oorganiskt fosfat, t.ex. natriumfosfat. Då reaktionsblandningen får stå under en lämplig tidsperiod tills ring A-dehydreringen har blivit fullständig, vilket vanligtvis sker inom en tidsperiod av l - 20 timmar.

'Ett särskilt effektivt dehydreringsförfarande har tidigare be- skrivits, där en A4'6-förening, sådan som föreningen med formeln XV, där Z är en enkelbindning, selektivt dehydreras med använd- ning av Arthobacter simplex (även betecknad som Corynebacterium simplex) i närvaro av en väteacceptor, t.ex. kinoner eller kinon- derivat. Detta förfaringssätt är i synnerhet värdefullt för 1' 4' ïpregnatrien-ilß, nu, zntriol- framställning av 6-klor-A -3,20-dion av motsvarande A4'6-pregnadien. En föredragen stam Arthobacter simplex, NRRL nr V~8055 är allmänt tillgänglig och kan erhållas från Northern regional research laboratory, 1815 North University Street, Peoria, Illinois.

Väteacceptorer, som är användbara, väljs från kinonföreningar och derivat därav och inkluderar bensokinoner, t.ex. tetrametyl-p- -bensokinon och 2-isopropyl-5-metyl-p-bensokinon, naftokinoner, t.ex. menadion och 2-hydroxi-l,4-naftokinon, indofenoler, t.ex. 2,6-diklorindofenol, och menadionnatriumbisulfit. Det är en för- del att hålla pH-värdet inom området ca 7,5 - 8,5 under Al-de- hydreringen, under det att temperaturen bör vara ca 23 till ca 33°C, företrädesvis ca 28°C. Sedan man erhållit ett lämpligt tillväxtmedium, sättes en mängd av substratet till mediet, som kan vara så stor som 0,7 g per liter medium. Den föredragna substratkoncentrationen är dock 0,5 g per liter medium. Mängden väteacceptor kan variera över ett stort område, dvs. molförhål- landet av substrat till väteacceptor kan variera från 30:l till l0:l. Då man använder menadionnatriumbisulfit som väteacceptor, är det föredragna förhållandet av substrat till acceptor l5:l. "soon 8205170-7 20 Steroiden kan sättas till mediet i form av en suspension i ett lämpligt lösningsmedel, t.ex. vatten, som en lösning i ett lös- ningsmedel, t.ex. etanol, aceton eller dimetylformamid, eller i finfördelad form, t.ex. som fasta, mikroniserade partiklar.

Väteacceptorn sättes till mediet som en lösning i ett lösnings- medel, t.ex. etanol eller dimetylformamid, eller ifråga om mena- dionnatriumbisulfit som en vattenlösning.

Sedan substratet och väteacceptorn tillsatts, fortsätter man om- rörningen och luftningen av mediet under en tidsperiod av 3 - 7 timmar eller tills dehydreringen är fullständig. Förloppet av dehydreringsförfarandet kan under fermenteringsreaktionen följas medelst tunnskiktskromatografering på silikagel av med lösnings- medel extraherade prov.

Då dehydreringen är fullständig, avlägsnar man produkten, 6-klor- Al,4,6 mediet genom extraktion med ett lämpligt lösningsmedel, t.ex. -pregnatrien-llß,l7a,21-triol-3,20-dion, från fermenterings- kloroform, metylenklorid, metylisobutylketon etc. Lösningsmedels- lösningen indunstas, varvid man erhåller en halvkristallinisk produkt, som man renar medelst kromatografering på silikagel.

Produkten kan ytterligare renas genom omkristallisering från ett lämpligt lösningsmedel, t.ex. isopropylacetat, etylacetat, en blandning av aceton och vatten, etc.

Följande exempel anges för att belysa sättet enligt uppfinningen liksom för att skilja sättet enligt uppfinningen från kända för- faranden, vilka idag förekommer inom facket. Exemplen avses endast att vara belysande för representativa föreningar och för- hållanden och avser icke att begränsa uppfinningen.

Exempel l 20 g kortisol-21-acetat sättes till 100 ml abs. etanol och l00 ml etylenglykoldimetyleter '(glyme) . Lösningen upphettas till 40°C och 2 g p-toluensulfonsyra tillsättes följt av 24 g trietylorto- acetat. Reaktionsblandningen omröres vid 40°C, tills en lösning bildats. Blandningen omröres_vid 40°C ytterligare 20 min., kyles till rumstemperatur och 2 ml pyridin tillsättes. Reaktionsbland- ningen hälles långsamt till en blandning av 520 ml vatten och l 52 m1 hexen. Produkten evfiltrerae efter so min. vid o _ 5°c 8205170-7 21 och tvättas med vatten, därefter med 50 ml hexan och torkas i vakuum vid 4o°c. utbytet är 90 _ 104 vikt/vikt-x.

Detta är ett exempel på sättet enligt uppfinningen, som visar att utbytena är i huvudsak kvantitativa för detta speciella för- faringssätt. I Exempel 2 Detta exempel utföres för att visa skillnaden ifråga om utbyte och produkt mellan sättet enligt uppfinningen och ett sätt, som är känt inom facket.

I detta särskilda exempel sättes 10 g kortisol-21-acetat till 100 ml abs. etanol, 10 ml trietylortoformiat och 0,300 g 2,4- -dinitrobensensulfonsyra. Blandningen omröres vid rumstemperatur tills en lösning bildats. B1andningen_omröres ytterligare 15 min. och l ml pyridin tillsättes. Lösningen koncentreras till halva volymen och 10 ml vatten tillsättes. Därefter koncentrerar man blandningen tills en kristallisering börjar. 100 ml vatten tillsättes och produkten avfiltreras, tvättas väl med vatten och torkas, varvid man erhåller motsvarande 3-enoleter. I detta speciella fall synes en viss mängd dehydreringsprodukt förekomma, som var fullständigt frånvarande i exempel 1 och ca 10 % icke reagerat material återstår vid detta förfarande liksom en ringa mängd av andra icke önskvärda produkter i jämförelse med exempel l, i vilket exempel en betydligt mindre mängd icke reagerat mate- rial kvarstod enligt en bestämning med tunnskiktskromatografi.

Exempel 3 Detta exempel visar nödvändigheten av att trietylortoacetat före- kommer för att sättet enligt uppfinningen skall förlöpa.

I detta exempel användes exakt samma teknik och samma mängder som i exempel 1 med undantag av att trietylortoacetatet ersättes med trietylortoformiat. En analys av slutprodukterna medelst tunn- skiktskromatografi visar, att det fortfarande föreligger en ringa mängd utgàngsmaterial och att det förekommer en betydande mängd mellanprodukter och ca 10 - 15 % av All'(9)-dehydreringsprodukt.

Exempel 4 8205170-7 22 I detta exempel sättes 20 g kortisol till 100 ml abs. etanol och 100 ml etylenglykoldimetyleter såsom i exempel l. Man följer därefter samma förfarande som i exempel l med undantag av att man använder 0,3 g 2,4-dinitrobensensulfonsyra och 10 g trietylorto- acetat. Resultaten visar en i huvudsak fullständig reaktion, varvid ca 15 % av en 17,21-ortoester av 3-enoletern bildats. När- varon av denna produkt är icke menlig för sättet enligt uppfin- ningen, enär produkten ytterligare kan bringas att reagera och vid slutet av reaktionsserien kan l7f2l-drtoestern lätt hydroly- seras till motsvarande llß,l7a,21-trihydrokisteroid.

Exempel 5 Man upprepar samma förfarande som i exempel 3 med undantag av att man icke använder någon etylenglykoldimetyletér. Vid slutet av reaktionssekvensen återstår fortfarande en betydande mängd, dvs. 'ca 10 % av det ursprungliga utgångsmaterialet, som icke hade rea- gerat. Detta framhâller sålunda på nytt nödvändigheten av att. trietylortoacetat är närvarande för att förfarandet enligt upp- finningen kan helt slutföras.

Exempel 6 _ Detta exempel visar, att sättet enligt den amerikanska patent- skriften 3 087 927 icke ger den önskade föreningen.

För att ytterligare fastställa betydelsen av närvaron av trietyl- ortoacetat och även betydelsen av att en större del av lösnings- medlet utgöres av etanol i detta exempel, suspenderar man 30 g kortisol-21-acetat i en lösning bestående av 300 ml dioxan, 30,0 ml trimetylortoformiat och 1,20 ml abs. metanol. Till den snabbt omrörda suspensionen sätter man droppvis 0,60 ml konc. svavelsyra. Suspensionen förtunnas kontinuerligt under de första minuterna och en fullständig lösning erhålles inom 6 min. 1,80 ml pyridin tillsättes, varvid en svagt röd färgning omedel- bart försvinner och den bildade lösningen får en ljusgul färg.

Hela förfaringssättet utföres hittills vid rumstemperatur. Den kylda reaktionslösningen anbringas i en skiljetratt, vars skaft doppar ned under ytan av 300 ml av en vatten-is-blandning i en stor Vbägare. Reaktionsblandningen sättes långsamt under en tidsperiod av 2 -¿3 timmar till den kraftigt omrörda is-vatten-blandningen.

Den fasta substans, som bildas, får stå i lösningen vid 5°C över 23 8205170-7 natten och avfiltreras därefter. Produkten tvättas väl med vat- ten och lufttorkas, varvid man erhåller 28,7 g produkt. En tunn- skiktsanalys av produkten visar att hela produkten utgöres av A9(ll)-21-acetat.

Exempel 7 I detta exempel upprepas samma förfarande som i exempel 6 med undantag av att man använder abs. etanol i stället för metanol och trietylortoacetat användes i stället för trimetylortoformiat.

Det visar sig genom att man följer förfarandet enligt exempel 6, att i huvudsak ingen reaktion äger rum. Detta visar betydelsen av att man använder en större mängd av etanol och att vad som beskrives i den amerikanska patentskriften 3 087 927 icke är ut- förbart.

Det framgår sålunda av de här ovan angivna exemplen och vad som angives i nedanstående tabell I, att sättet enligt uppfinningen, i vilket man bringar steroiden att reagera med trietylortoacetat i ett lösningsmedel, som innefattar en större mängd etanol och en mindre mängd av ett syrehaltigt kolvätelösningsmedel, t.ex. glyme, ger resultat, som är överlägsna och som icke kan förutses av teknikens ståndpunkt. 8205170-7 24 Ucflsmummmmcwmuø Eom unw>nm Homfluuox | X Hmflumumš mwsmum>nwnm Hmflumvmä wwsmëëoxmumm | =N= Hmmëmxm 0wum> mm .umumfium> \uoumm>HmumMmuhm | vmO+m Hoflmvw I ÉOMH umflšnomounoflæumflnu | moms umumumouuofihumfluu 1 domsxx Hmwmëmucflflmmfi ømcmñ wuumum Eom #nm>cm :mxoflfl «^mom2v.H0amv0E unwooum cm cm muønfië ~umflEuowo»uofihvwEfluu I mozßw ^ßwm ßmo m wmflmë .n¥mu:mvmm_mxmnmxfiuwEm cofluxmøu Qmmnm X _ cmxoflw muwnfiš nxflømwcwum mnmxflflxwßv HH> Aßmm ßmo m .nxwunmumm uxfiwonmmwnflumm Umflmš mxmsmxflHwEm uxcnm |flumnUM:mU1^mVflH< ummwcm x smxoflw wuwcflä moäß lwsmum mcwwficxwßv x H> cofiwxmwu mfløcmpmflfismø N N x fiuxnfimwnwum wcmxflaxwav > ^mflHcmE wxoflv nwflmmouu0|flN_>H mmfl> \:ofiuxmwn mflwcmvmafiswo x X x Awflflccfiummbv >HR _uxøw0um |wwQfinwwflumuwhn0©|^mVHH < mcofluxmmn mfiwcmvmfifismo X x x x Auxcømøcwum mcwxficxwav HHH s0fluxmmu mflwnmpmfifisuo x X x Auxcflmwcwum wcmxfløxmav HH _cofluxmmu mflwcmuwfiflsfi x X X 1 ^UGficcHmmmDV H flmßflflwmm B H Hflwflmü ,._»@' ' " _.. 8205170-7 '25 Exempel 8 Följande reaktionsserie anger ett särskilt effektivt förfarings- ll4l sätt för framställning av 6-klor-A '6-pregnatrien-llB,l7u,21- -triol-3,20-dion av kortisol.

Reaktionsförhållandena är representativa för förhållanden lämp~ liga för användning inom både den snäva och breda aspekten i sättet enligt uppfinningen och har visat sig vara att föredraga.

De representativa reaktionsförhållanden, som anges i detta exem- pel, skall, ehuru föredragna, icke tolkas som en begränsning av uppfinningen.

Framställning av kortisol-21-acetat.

Reaktion: Förfarande: Till en l liter kolv sättes 400 ml pyridin och 100 g (0,276 mol) hydrokortison (kortisol), tills kortisolen delvis går i lösning.

Man tillsätter, allt under det man håller temperaturen under 30°C, inom en tidsperiod av 10 min. 163,3 g (l,59 mol) ättiksyraan- hydrid. Blandningen får stå l timme vid rumstemperatur, tills reaktionen är fullständig. Därefter sättes långsamt 3000 ml vatten till reaktionsblandningen, varvid man håller temperaturen under 40°C. Reaktionsblandningen får stå 20 min. och överföres därefter till en 3-liter kolv. Man tillsätter under 20 min. 1500 ml mättad natriumklorid-vattenlösning. Blandningen kyles till l0°C, får stå 1 timme och filtreras. Den avfiltrerade pro- dukten tvättas med vatten och torkas i vakuumugn vid 50 - 60°C.

Utbyte: 110,4 g (11o,4 vikt/vikt, 99,2 % av det teoretiska).

Reaktion med trietylortoacetat för framställning av 3-enoleter och därpå följande 68-klorering.

I. I __ V I > q ,-\l fl i > I OR '°:.ï_i-i».e - ¿EE;»““””WW - 8205170~7 26 Reaktioner: CHZOAC =O ...OH CR3C(OC2H5)3 0 P+ ) CHZOAC =0 . G0 en fialane no ...os ° 1 Cl Förfarande: Till en 2-liter kolv sättes 550 ml etanol, 330 ml l,2-dimetoxi- etan (glyme) och llO,4 g (0,272 mol) kortisol-21-acetat. Bland- ningen upphettas till 40 - 42°C och därtill sättes en lösning av 9 g p-toluensulfonsyra i 200 ml 1,2-dimetoxietan, följt av 116 g trietylortoacetat. Blandningens temperatur hâlles vid 38 - 42°C. 2,5 g p-toluensulfonsyra tillsättes efter 20 min. Blandningen får stå ao min. vid ss _ 42°c och kyler därefter till s _ 1o°c, varefter 12 ml pyridin tillsättes följt av en lösning av 2,7 g natriumacetat i 50 ml vatten. Den svagt gula lösningen tillsättes till en blandning av 14 g natriumacetat i 2,450 ml vatten och 268 ml hexan, kyles därefter till l0°C, får stå 20 min., filtre- ras och tvättas med 800 ml vatten innehållande l g natriumacetat följt av en tvättning med 220 ml hexan.

Den våta kakan (ca 200 g) sättes till en kall (l0°C) blandning av -|=-f”f""" í-'q ”W fr: vocïaïfazfifiàhl 8205170-7 27 13,7 g natriumacetat i.l84 ml vatten och 440 ml aceton och bland- ningen kyles till 0 - 500. Därpå tillsättes en lösning av 27 g Halane (ett registrerat varumärke för 1,3-diklor-5,5-dimetyl- hydantoin) i 120 ml aceton, varvid man håller temperaturen under 5°C. Blandningen får stå 45 min. vid 0 - 5°C och därefter till- sättes en lösning av 9,2 g natriumbisulfit i 132 ml vatten och blandningen hälles långsamt i 2200 ml vatten under en tidsperiod av 30 min. och kyles till O - 5°C. Blandningen får stå l timme, filtreras och den avfiltrerade fasta substansen torkas i vakuum- ugn via 45 _ 5o°c. utbyte: 167,2 'g (97,1 vikt/vikt, 89,5 x av det teoretiska).

Reaktion med trietylortoacetat för att framställa en 3~enoleter och följande A4'6-bildning.

Reaktion: DDQ -*f dioxan Förfarande: Till en 2-liter kolv sättes 104 g (0,237 m0l) 6B-kl0r-llß,l7U,2l- _trihydr0gipregna-4-en-3,20-dion-21-acetat (från föregående steg), * Äüfšlšåšfflßlw ___. ,_______' s2o517o¿7 28 500 ml 1,2-dimetoxietan och 3,03 g p-toluensulfonsyra och bland- ningen får stå 30 min. vid 20 - 25°C. Därpå tillsättes 500 ml etanol följt av 91,4 g (0,563 mol) trietylortoacetat. blandningen antar en mörkröd färg och får stå 40 min. vid 20 - Reaktions- 25°C och kyles därpå till l5°C, varefter en lösning av l3 g natriumacetat i 640 ml vatten tillsättes. under 20°C och 220 ml metylenklorid tillsättes följt av en lång- Temperaturen hålles sam tillsättning av 1000 ml vatten, varvid temperaturen hålles under 25°C. skiktet avskiljes.

Blandningen omröres 15 min. och det lägre organiska Det övre vattenskiktet extraheras med tre portioner på 75 ml av metylenklorid. De organiska fraktionerna förenas och tvättas med en lösning av 1,3 g natriumacetat i 260 ml vatten. Metylenkloridextraktet (totalt ca 900 ml) avskiljes och koncentreras i vakuum till ungefär 400 ml och, under destillering, tillsättes en blandning av 850 ml dioxan och l,3 ml nyridin, varvid volymen hålles vid ca 400 - 450 ml. Blandningen destille- ras till en slutvolym av 400 ml (ingen metylenklorid bör före- finnas i denna punkt) och 300 ml dioxan tillsättes. Blandningen kyles till l0°C och 65 ml vatten tillsättes, varefter blandning- en kyles till o _ s°c. ning av 75 g 2,3-diklor-4,5-dicyanobensokinon (DDQ) i 300 ml Tillsätt- ningstratten tvättas med 30 ml dioxan och blandningen får stå so min. vid o _ s°c. natriumbisulfit i 87 ml vatten, varvid man håller blandningens Därefter tillsättes under l timme en lös- dioxan, varvid man håller temperaturen vid 0 - 5°C.

Därpå tillsättes en lösning av 30,4 g temperatur under l0°C. Uppslamningen_koncentreras i vakuum till 600 ml. ning 3000 ml vatten, varefter blandningen kyles till l0°C och Till uppslamningen sättes långsamt med kraftig omrör- får stå 3 timmar. Blandningen filtreras och tvättas med vatten.

Den våta fasta substansen sättes till 1500 ml metylenklorid, om- röres l timme, filtreras och tvättas med 100 ml metylenklorid.

Den fasta substansen sättes till 400 ml metylenklorid, omröres 20 min., filtreras och tvättas med 100 ml metylenklorid. Mety- lenkloridlösningarna förenas och omröres med 1000 ml vatten.

Det organiska skiktet avskiljes och vattenskiktet extraheras med 50 ml metylenklorid. Metylenkloridextrakten koncentreras till 400 ml och under destillering tillsättes 1000 ml aceton, så att volymen hålles vid ungefär 360 - 400 ml. Uppslamningen destille- ras till en slutvolym av 300 ml och kyles till 0 - 5°C. Den får 8205170-7 29 därefter stå 30 min., filtreras och tvättas med 82 ml kall (O - SOC) aceton. Produkten torkas i vakuum vid 50°C. Utbyte: 80/3 9 (77/2 Vikt/vikt, 77,5 % av det teoretiska).

Al-bildning och följande hydrolys.

Reaktioner: CHZOAC - CHZOAC =O H0 i . . .om / + n.

O I/ /f C5HSNHBr3.

Cl I THF Li2CO3/LiBr DMF cflzoa cH.,oA= =O ' =0 Förfarande: 50 g RS-4232-acetat (från föregående steg med ca 10 % aceton) sättes till 350 ml metylenklorid. 30 g neutral aluminiumoxid tillsättes och blandningen omröres l timme. Aluminiumoxiden avfiltreras och lösningen koncentreras till en volym av 50 ml. 400 ml tetrahydrofuran tillsättes och destillationen fortsättes fi-ïgfišålïïiïïifzgt -._~1 *H-fl-naq, 3205170-7 30 tilksen kokpunkt av ca 65°C uppnås. Blandningen kyles till 2500 och en lösning av 34 g pyridiniumhydrobromid per bromid i 130 ml tetrahydrofuran tillsättes. Reaktionsblandningen om- röres 20 min. vid 25°C och 3 ml aceton tillsättes. Reaktions- _b1andningen filtreras och filtratet koncentreras till en volym av 50 ml. Därpå tillsättes 400 ml dimetylformamid följt av 22,5 g litiumkarbonat och 8,1 g litiumbromia.

Systemet genombubblas med kväve och reaktionsblandningen upp- hettas vid l05°C under 2 l/2 timme. Blandningen koncentreras därefter i vakuum till 200 ml, kyles till 60°C och 50 ml ättik- syra tillsättes, följt av 70 ml vatten. Reaktionsblandningen hålles långsamt i l600 ml vatten. Produkten avfiltreras efter l timme vid 25°C och tvättas med vatten. Produkten torkas ir vakuum vid 60°C. Utbyte: 41,5 g (83 vikt/vikt). Produkten* kristalliseras två gånger från aceton. Utbyte efter rening: 78,8 vikt/vikt. 6-klor-llß,l7a,21-trihydroxipregna-1,4,6-trien-3,20-dion fram- ställes genom omförestring i vattenfri metanol_i närvaro av en ” ringa mängd kaliumkarbonat.

Exempel 9 Man upprepar förfarandet enligt exempel 8 för att framställa 6-klor-llß,l7a,21-trihydroxipregna-4,6-dien-3,20-dion-21-acetat, som omförestras till motsvarande 21-hydroxiförening genom att man bringar den att reagera med vattenfri metanol i närvaro av en ringa mängd kaliumkarbonat.

Exempel 10 Detta exempel visar ett förfaringssätt för Al-bildning med an- vändning av mikrobiologiska förfaranden (dvs. växande celler med en väteacceptor).

A. Fermentering.

En kultur av Arthobacter simplex NRRLB-8055 odlas 6 dagar vid 28°C på lutande agar med följande sammansättning: (A): 8205170-7 31 Näringsagar (Difco) 20 g Glukos 10 g Jästextrakt (Difco) 10 g Dest. vatten l liter En full ögla av tillväxten på ytan av den lutande agarn användes för att inokulera var och en av 2300 ml nephlo-kulturkolvar (Bellco Inc.), där var och en av kolvarna innehåller 50 ml av följande sterila näringsmedium (B): Majsstöpvätska 5 g Jästextrakt l g Cerelose (praktiskt taget 0,5 g glukosmonohydrat) Dest. vatten l liter pH 7 Kolvarna inkuberas vid 28°C på en roterande skakanordning med 280 varv/minut med användning av en 2,54 cm rörelse. Inkube- ringen är fullständig inom 24 timmar eller då kulturens grumlig- het uppnår l65 - 180 Klett-enheter, bestämt med en Klett-Summer- son-fotoelektrisk kolorimeter försedd med ett filter nr 66 och inställd på nolläge med sterilt medium. Därefter användes det totala innehållet i båda kolvarna för att inokulera 900 ml ny- steriliserat medium B, som föreligger i en 2 liter glasfermen~ teringsflaska. Inkuberingen av fermenteringsflaskan fortsättes vid 28°C, varunder en luftning sker med l/2 volymer luft/volym- medium/minut och omrörning med 300 varv/minut. 500 mg 6-klor- -llB,l7a,2l-trihydroxipregna-4,6¿fien-3,20-dion (framställd så- som beskrives i exemplen 8 och 9) sättas efter 24 timmar i form av en etanollösning (25 mg/0,4 ml etanol) till fermente- ringsblandningen. Vid samma tidpunkt sättes även 26,4 mg menadionnatriumbisulfit i form av en filtrerad, steriliserad vattenlösning (26,4 mg/l0 ml) till blandningen. Inkuberingen fortsättes som tidigare. Reaktionen är fullständig inom 3 - 5 timmar.

B. Isolering och karakterisering. _ Fermenteringsbuljongen extraheras tre gånger med 500 ml portio- ner kloroform. De förenade kloroformextrakten torkas över vat- Pom: Cëlfiñfiïïir 7.... _ n..- amd-w.. 8205170-7 32 tenfritt natriumsulfat och indunstas i vakuum till torrhet. Den bildade halvkristalliniska återstoden renas genom kromatografe- ring på silikagel. Produkten elueras med blandningar av kloro- form och aceton._ De fraktioner, som innehåller den önskade produkten, förenas och indunstas till torrhet, varvid man er- håller 475 mg (utbyte: 95 % av det teoretiska) 6-klor- š'4'6- -pregnatrien-llß,l7a,21-triol-3,20-dion, som man därefter kris- talliserar från isopropylacetat.

'På samma sätt utför man, genom att byta ut menadionnatriumbisulfit mot menadion och tetrametyl-p-bensokinon, en liknande omvandling av 6-klor-A4'6_pregnaaien_11ß,17u,21-trial-3,2o_ai°n till e_k10r- Al'4'6_pregnatrien-11ß,17a,21-trial-3,2o_ai°n.

Exempel ll Ett inokulum av Arthobacter simplex framställes såsom beskrives i exempel l0.

Därpå användes 5 ml av den under 24 timmar odlade kulturen för att inokulera fyra erlenmeyer-kolvar på 250 ml, vardera innehål- lande 50 ml medium B (exempel 1). 'Kolvarna inkuberas vid 28°C på en roterande skakanordning med 280 varv/minut med användning av en 2,54 cm rörelse. 25 mg 6-klor-A4'6-pregnadien-llß,l7a,21- -triol-3,20-dion (framställd såsom beskrives i exemplen 8 och 9) löst i 0,4 ml etanol sättes efter 24 timmar till varje kolv.

Vid samma tid sättes till en kolv 0,78 mg 2-isopropyl-5-metyl-p- 1-bensokinon i 0,2 ml etanol. Till en andra kolv sättes 0,83 mg 2-hydroxi-1,4-naftokinon och till en tredje kolv sättes 1,2 mg natriumsalt av 2,6-diklorindofenol löst i 0,5 ml vatten. Till den fjärde kolven sättes icke någon väteacceptor, utan denna kolv tjänar som kontroll. Analyser med tunnskiktskromatografi av med lösningsmedel extraherade prov, som tagits efter en kontakttid av 7 och 24 timmar, visar en ökad hastighet och procentuell bild- ning av föreningen 6-klor-A1'4'6-pregnadien-llB,l7a,2l-triol- -3,20-dion i jämförelse med det obehandlade kontrollprovet.

Exempel 12 Man upprepar i detta exempel förfarandet enligt exempel l med undantag av att man använder 2"g trifluorättiksyra i stället för p-toluensulfonsyra som syrakatalysator. Man erhåller liknande utbyten. 8205170-7 33 Exempel 13 Man upprepar i detta exempel förfarandet enligt exempel l med undantag av att man använder 2 g svavelsyra i stället för p-toluensulfonsyra som syrakatalysator. Man erhåller liknande utbyten.

Eg ¿ .w i! u.

Claims (7)

8205170-7 79* Patentkrav

1. Sätt att framställa 3-oxo-6-halo-A4-11-hydroxisteroidföre- ningar med formeln X i vilken R betecknar -H, -OH, lägre alkyleter med 1-6 kol- atomer eller lägre alkylester med 1-6 kolatomer, R1 betecknar -H, -OH eller lägre alkylester med 1-6 kolatomer, R2 beteck- nar -H, u-CH3 eller B-CH3, X betecknar F, Cl eller Br och R1 och R2 kan tillsammans beteckna --O R4 \c/ 0/ \Rs där R4 och R5 betecknar kolväten med 1-4 kolatomer, k ä n- n e t e c k n a t av att man bringar en 3-oxo-A4-steroid med ovanstående formel men i vilken X betecknar H att reagera med trietylortoacetat i närvaro av en katalytisk mängd av en stark syra i ett lösningsmedel som består huvudsakligen av minst 40 vikt-% etanol och högst 60 vikt-% av en fördragbar, alifatisk eller cyklisk eter, och därefter på i och för sig känt sätt halogenerar den bildade 3-enoletern i 6-ställning för att framställa en 3-oxo-6B-halo-A4-steroidförening.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att R betecknar en lägre alkylester, R1 betecknar OH och R2 beteck- nar H.

3. Sätt enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t av att lös- ningsmedelssystemet består av minst cirka 50 vikt-% eller 55 8205170-7 mera av etanol och ca 50 vikt-% eller mindre av etylenglykol- dimetyleter, R är acetat och syrakatalysatorn är p-toluen- sulfonsyra eller trifluorättiksyra.

4. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att den första föreningen är en kortisol-21-alkylester, lösningsmedlet är en blandning av ca 50 vikt-% etanol och 50 vikt-% etylen- glykoldimetyleter, katalysatorn är trifluorättiksyra eller p-toluensulfonsyra och den bildade 3-enoletern bringas att reagera med ett kloreringsmedel, som utgöres av N-klor- succinimid eller 1,3-di-klor-5,5-dimetylhydantoin.

5. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att man a) bringar kortisol-21-acetat att reagera med trietylorto- acetat i närvaro av en katalytisk mängd av en stark syra- katalysator i ett lösningsmedel som består huvudsakligen av ca 40 vikt-% eller mera av etanol och ca 60 vikt-% eller mindre av en fördragbar, alifatisk eller cyklisk eter för att framställa en reaktionsprodukt, som utgöres av en 3-enoleter, b) därefter bringar 3-enoletern från a) att reagera med ett halogeneringsmedel för att framställa ett 6ß~halo-kortisol- -21-acetat.

6. Sätt enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t av att den starka syrakatalysatorn i steget a) utgöres av trifluorättik- syra eller p-toluensulfonsyra, halogeneringsmedlet i steg b) utgöres av ett kloreringsmedel och de fördragbara etrarna i steget a) utgöres av etylenglykoldimetyleter.

7. Sätt enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t av att klore- ringsmedlet utgöres av N-klorsuccinimid eller 1,3-dik1or-5,5- -dimetylhydantoin. m: š/..'.-,._ 1% ~ - ..............,...._, -..mm