SE435388B - Sett att framstella 3-oxo-delta?724?72,?726- och delta?721?72,?724?72,?726-11-hydroxi-pregnanderivat - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 79B5861~6 z Ett viktigt steg i många reafitionssekvenser för att fram- ställa en 6-halo-¿34'6- eller.¿Ä1'4'6-pregnatrien innefattar omvandling av en "kortisolliknande" förening med en 3-oxowAé- -grupp till en enoleter (d.v.s. bildning av en 3=alkoxi1¿33'5- -mellanprodukt) genom att bringa 3-keto1¿§4-steroiden att rea- gera med ett lägre alkylortoformiat i ett lämpligt lösnings- medel, t.ek. dioxan, i närvaro av en syrakatalysator, t.ex. p~to1uen-sulfonsyra. Då man emellertid utgår från en lätt till- gänglig förening, t.ex. kortisol (hydrokortison, 11ß , 17 21-trihydroxi-3,20-dioxopregn~4-en), som har en reaktionsbenägen hydroxigrupp vid 21-'och 11ß«-ställning, har det tidigare visat sig att det är fördelaktigt att först bringa kortisol (med ne- danstående formel I) att reagera med formaldehyd och metylen- klorid i klorvätesyra för att framställa en bismetylendioxi- -(BMD)-förening som angives här nedan med II, d.v.s.

(I) 'l (II) Se exempelvis de amerikanska patentskrifterna 2 888 456 och 2 888 457.

För att aätvia förhindra bildning av ett A11(9)-aerivat vid den efterföljande reaktionen med det lägre alkylortoformiatet i syra genom dehydratisering av OH vid ställningen 11ß och H vid ställningen 9, så oxiderar'man först OH i ställningen 11fi med exempelvis kromsyra i svavelsyra i dimetylformamid, d.v.s. 10 15 20 25 30 35 7905861-6 .O *m2 (n) *__*"_'> o! (III) Man behandlar därefter föreningen med formeln III med det lägre alkylortoformiatet och syra för att framställa den önskade enol- etern med formeln IV, vilken därefter kan behandlas såsom er- fordras d.v.s. ' 1/'O ___7' H C 2 (III) ---> där R betecknar lägre alkyl.

I den amerikanska patentskriften 3 082 224 har föreslagits, att dehydratiseringsproblemet kan lösas genom att man bringar 'en kortisol eller kortisol-21-eter att reagera med ett lägre alkylortoformiat i ett lösningsmedel bestående endast av mot- svarande lägre alkanol och en syrakatalysator. Genom att an- vända detta förfarande kan dehydratiseringen enligt uppgift reduceras till mindre än 10'% och man kan erhålla 3-enoletern med utbyten av 65 - 90 %.

I en annan patentskrift, amerikanska patentskriften 3 087 927, diskuteras framställning av 3-enoletermellanprodukten av den här ovan nämnda typen. I den där angivna reaktionssekvensen utgöres utgångsmaterialet av exempelvis 16-hydroxikortisol eller 16-hydroxi-kortison. Patentskriften angiver, att dessa 10 15 20 25 30 35 l19øsas1-e Lf material kan bringas att reagera 1 närvaro av en mineralsyra med en ortoester med formeln R3c .(0124) 3 i vilken R3 betecknar väte eller lägre alkyl (C 1 - 3 kolatomer) ochjR4 betecknar lägre alkyl, t.ex._metyl och-etyl, varvid man erhåller en reaktionsprodukt.med formeln I 2 CH20H (V) Exemplen visar specifikt att reaktionen utföres i dioxan med en ringa mängd metanol och svavelsyra med trimetylortoformiat.

Ingenting nämnes i patentskriften om dehydratiseringsproblem, som diskuteras i den amerikanska patentskriften 3 082 224.

Teknikens ståndpunkt antyder således, att man kan bringa 11- -hydroxi-¿§f-pregnen-3-oner att reagera för att framställa motsvarande enoletrar genom att använda:_ (1) trialkylortoformiat med användning av en större mängd av ett lösningsmedel, t.ex. dioxan, och en mindre mängd av mot- svarande lägre alkahol (d.v.s. trimetylortoformiat med metanol eller trietylortoformiat med etanol).a (2) trietylortoacetat med användning-av en större mängd av ett lösningsmedel, t.ex. dioxan, med en mindre mängd etanol eller .(3) trietylortoformiat med användning av etanol som enda lös- ningsmedel.

I vart och ett av dessa fall använder man en syrakatalysator för att tillåta reaktionen att förlöpa med-önskad hastighetf Det har visat sig, att i första fallet utgöres den största produkten av [S9(11)-dehydratiseringsprodukten, i andra fallet 10 15 20 25 30 '35 790586156 5 reagerar icke reaktionskomponenterna och i tredje fallet förekommer en viss dehydratisering, som äger rum mellan 11- och 9-ställningen, och reaktionen blir icke fullständig. I varje reaktion, som är känd inom facket, är således utbytena av önskad enoleter låga och i en omfattande stegsekvens kom- mer detta utbyte givetvis att släpa med och reducera den to- tala produktionen av den önskade slutprodukten.

Det har nu visat sig, att genom att använda förfaringssättet enligt föreliggande uppfinning för att framställa en 3-enol- eter av en 3-oxo-A4-11p -hydroxisteroid kan man uppnå föl- jande fördelar: 1) dehydratisering vid 9(11)-ställningen är i huvudsak full- ständigt eliminerad, . _ 2) på grund av ovanstående under 1) föreligger inget tvång att först oxidera 11-hydroxigruppen till en oxo-grupp för att skydda denna, _ ' 3) utbytet av enoletern ökas (delvis på grund av ovanstående punkterna 1 och 2 och även delvis på grund av tendensen hos reaktionsförloppet enligt uppfinningen att bli fullständigt), 4) man kan använda billiga syrehaltiga kolväte-samlösnings- medel, t.ex. glymer, tillsammans med etanol, 5) det är icke nödvändigt att, då man bringar steroider med 17 u,21-hydroxidelar, skydda dessa delar via bismetylendioxi- förening (BMD) eller genom andra förfaranden och 6) ovanstående 5 fördelar bidraga alla till ett enklare för- faringssätt än vad som tidigare är känt inom facket.

Andra fördelar med sättet enligt uppfinningen kommer att fram- gå för fackmannen vid läsningen av följande beskrivning.

Föreliggande uppfinning avser ett synnerligen effektivt total- förfarande för framställning av 6-halo-zåfl'G-pregnadien-3-oner och 6-halo-¿š1'4'6-pregnatrien-3-oner.

Sättet enligt uppfinningen för framställning av 3-oxo,lÄ4'6- och¿§1'4'6-11-hydroxisteroidföreningar med formeln, 10 15 20 25 30 35 -s _ ß W 1 X i vilken R betecknar H, OH, lägre alkyleter med 1 - 6 kolatomer eller lägre alkylester med 1 - 6 kolatomerf R1 betecknar H, OH »eller lägre alkylester med 1 - 6 kolatomer, R2 betecknar H, d-CH3 eller ß -CH3-,> X betecknarF, Cl eller Br och R1 och R2 kan tillsammans beteckna -*'*'O\\ c*,.R4 in __ _ _ X ' där RF och R5 oberoende av varandra betecknar kolväten med 1 - - 4 kolatomer, och 3:3: betecknar en enkel- eller dubbelbind- ning, kännetecknas av att man bringar en_3-oxo-43?-steroid med ovanstående formel, i vilken X betecknar väte, att reagera med trietylortoacetat i närvaro av en katalytisk mängd av en stark syra i ett lösningsmedel som består huvudsakligen av minst 40 viktprocent etanol och högst 60 viktprocent av en fördragbar, alifatisk eller cyklisk eter, och därefter påai och för sig känt sätt halogenerar den bildade 3-enoletern i 6-ställning för att framställa en°6ß -halogenförening, som man överför till motsvarande 60:-halogenförening, exempelvis genom inverkan av en sur katalysator i ett inert lösningsmedel, bringar 6 m-halo- genföreningen att reagera med trietylortoacetat under ovan- stående förhållanden för att framställa motsvarande 3-eno1- eter, vilken man därefter bringar att reagera med ett lämpligt oxidationsmedel vid låg temperatur t.ex. en tetrasubstituerad 1,4-bensokinon, varvid man erhåller en 4,6-dienförening med .ovanstående formel, och eventuellt därefter på i och för sig _känt sätt dehydrerar dienföreningen i 1-ställning, exempelvis mikrobiologiskt eller medelst bromering i 2-ställning följt av dehydrobromering i 1,2-ställning, varvid man erhåller motsva- rande 1,4,6-trienförening, och eventuellt hydrolyserar en i 17- eller 21-ställning befintlig estergrupp. 10 15 20 25 30 35 7905861-6 Föredragna utföringsformer.

Framställning av 3-enoleter. _ Det är viktigt att använda trietylortoacetat som reaktions- komponent i förfaringssättet enligt uppfinningen. Trietylorto- acetat skiljer sig från det analoga trietylortoformiatet.

Trietylortoacetat representeras genom följande struktur: cH3c(ocH2CH3)3, under det att trietylortoformiat vanligtvis kan karakteriseras med följande formel: Hc(0cH2cH3)3 Kemiska förhållanden, såsom framställning och allmänna reaktioner av alifatiska ortoestrar, diskuteras i en bok med titeln "The Chemistry of Aliphatic Orthoesters", American Chemical Society Monograph av H.W. Post, publicerad av Rienhold. Trietylorto- acetat kan vanligtvis framställas på olika sätt, varvid de två populäraste angives i följande reaktioner: cH3c-oc2H5 + zczasofl a NH4c1 + cH3c(oc2H5)3 ~ _ (1ï NH-Hcl cH2=c(oc2H5) + cznson + cH3c(oc2H5)3 (2) Ytterligare framställningsförfaranden finns angivna på sid. 40 i ovanstående monograf. Framställningssätt med användning av reaktionskomponenterna enligt den första av ovanstående schema beskrives i en artikel i Journal of the American Chemical Society, âg, 516 (1928) av P. Sah.

Ehuru teoretiskt mängden trietylortoacetat, som är nödvändig för att bilda 3-enoletern genom reaktion med 3-oxo-134-steoriden, är 1 mol ortoacetat för varje mol steroid, så synes - på grund av den speciella reaktionstypen - åtminstone ca 2 mol trietyl- ortoacetat per mol steroid erfordras för att reaktionen skall fortlöpa och företrädesvis åtminstone ca 3 mol ortoacetat per 10 15 20 25 30 35 wiasa16-1 -flses- i -representerade genom formeln íš mol steroid användes. Man använder icke mera än ett förhal- lande av ca 5 till 1, enär ett högre förhållande icke medför någon speciell fördel ifråga om reaktionshastighet etc.

För att förfarandet enligt uppfinningen skall fungera på ett riktigt sätt,-är det viktigt att det använda-lösníngsmedels- .systemet är ett system, i vilket en väsentlig mängd av lös- ningsmedlet utgöres av etanol, d.v.s. mera än minst ca 40 eviktprooent, företrädesvis ca 50 viktprocent, av lösnings- medelssystemet är etanol. Man kan använda upp till 100 % etanol; ehuru det är lämpligt att använda ett samlösningsmedel, såsom angives i det följande. Systemet bör även vara i huvud- sak vattenfritt. Dessa samlösningsmedel utgöres av fördragbara alifatiska etrar och cykliska etrar, t.ex. glykoletrar, dioxan, tetrahydrofuran och tetrahydropyran. Särskilt använd- bara är i detta avseende dimetylerade polyetylenglykoler C330 (cflzcno) ncn3 där n är ett helt tal 1 -_4. Dessa-föreningar angivas vanligen som "glymesV, d.v.s..glyme.(n=})q diglyme (n=2), triglyme (n= =3) och tetraglyme . (ns24) . Vilken .som helst .av dessa föreningar ensam eller i kombination kan användas som ett fördragbart samlösningsmedel med etanol i förfarandet.enligt uppfinningen.

En särskilt användbar blandning är ca 50 viktprocent etanol med ca 50 viktprocent glyme.

Det är dessutom nödvändigt att inkludera en katalytisk mängd av en stark organisk syra eller svavelsyra som en katalysator i sättet.enligt uppfinningen. Lämpliga organiska syrakataly- satorer inkluderar p-toluensulfonsyra, 2,4-dinitrobensensul- fonsyra, trifluorättiksyraletc.

Man använder företrädesvis paratoluensulfonsyra eller tri- fluorättiksyra. En katalytisk mängd av katalysatorn är den mängd som är nödvändig för att möjliggöra att reaktionen fort- löper med en rimlig hastighet. Denna mängd uppgår vanligtvis från ca 0,1 till ca 20 % av steroidens totalvikt och ligger 10 15 20 25 30 35 'íššššsllfe v företrädesvis vid ca 10 viktprocent.

De reaktionsförhållanden, under vilka reaktionen kan äga rum, är icke kritiska, men är vanligtvis kända inom facket. Tempe- raturen kan sålunda sträcka sig från 0 till 100°C, men ligger företrädesvis mellan ca 20 och 40°C enär högre temperaturer tenderar att minska det totala utbytet på grund av nedbryt- ningsförluster. Trycket på reaktionsblandningen kan vara at- mosfärtryck, under atmosfärtryck eller över atmosfärtryck, men reaktionen utföres vanligtvis vid atmosfärförhållanden. Den tid, som erfordras för att sättet enligt uppfinningen i huvud- sak skall slutföras fullständigt, beror på reaktionstempera- turen. Då reaktionen försiggår långsamt vid lägre tempera- turer, så erfordras vanligtvis nagot från 5-min. till ca 3 tinnar, men vid 20 - 4ø°c åtgår icke mer än ea 3 timme för att den totala reaktionen skall äga rum.

Reaktionskärlet, som kan användas i sättet enligt uppfinningen, kan vara antingen ett kärl av satstyp eller ett kärl för kon-e tinuerlig drift. Kärlet är företrädesvis av vanligt satstyp, i vilket de olika materialen, som är nödvändiga för utförandet av sättet enligt uppfinningen, anbringas och materialen bringas i reaktionskontakt med varandra, så att reaktionen kan äga rum.

De steroider, till vilka sättet enligt uppfinningen är tillämp- ligt, inkluderar 11-hydroxi-¿34-pregnen-3-oner, som kan under- gå dehydratisering mellan kolatomerna i 11- och 9-ställning i steroidstrukturen. De steroider, som sålunda är användbara vid sättet enligt uppfinningen, har följande struktur: _ ïH2R C=O H0 10 15 26 25 " 30 35 'F'C5r R e='/fsvs bfl:=:»ssv1a-ess 10 i vilken R betecknar -OH, H, lägre alkyleter med 1 - 6 kol- -atomer, eller lägre alkylester med 1 - 6 kolatomer, R1 be- tecknar -H, OH eller en lägre alkylester med 1 - § kolatomer och kan vara rak eller grenad, R2 betecknar -H, CX-CH3 eller 1 och.R2 kan tillsammans beteckna ---Q\\ ;,.R4 , C -å--Û/ ¶R5 I 4 där R och RS oberoende av varandra betecknar kolväten med 1 - 4 kolatomer och X betecknar H.

Föreningar, för vilka sättet enligt unpfinningen är särskilt användbart för framställning av motsvarande 3-enoletyletrar, inkluderar sålunda följande föreningar: 1lp,1TM-dihydroxi-progesteron, 11p,17*-dihydroxi-1Gß-metyl-progesteron 11g, 17d-dihydroxi-16u-metyl-progesteron, 11p,17m-dihydroxi-1öd-metyl-progesteron-17-acetat, korticosteron-(11ß,21-dihydroxij3,20-dioxopregn-4~en)1 korticosteron-21-acetat, ' korfisal- (1 m , 17«, 21 -trihyaroxi-à , 2u-aioxqpregn-4-èn) , 16u-hydroxifkortisol-16,17-acetonid, 16«-hydroxi-kortisol-16,17-acetonid-21-acetat, kortisol-17q,21-diacetat, 7 ïfip-metyl-kortisol, 16d-metyl-kortisol, 16u-metyl-kortisol-21-acetat, kortisol-21-metyleter, 1Ga-metyl-kortisol-21-hexyleter, 16u-metyl-kortisol-21-acetat, 1Gm-metyl-kortisol-21-pivalat, kortiso1v21-acetat, kortisol-21-propionat, kortisol-21-butyrat.

Då strukturen av ntgângssteroiden har en hydroxigrupp vid både 21- och 17-ställningen, så bildas en 3-enoleter med strukturen 10 15 20 25 30 35 7965861-6 2 i vilken X och R betecknar detsamma som ovan. Närvaro av en sådan struktur är icke menlig, enär 17,21-ortoestern delvis hydrolyseras under efterföljande steg, exempelvis klorering eller bromering, och kan fullständigt omvandlas till 17,21- -dihydroxigrupper genom omförestring eller under basiska för- hållanden.

En dylik reaktion använder emellertid ytterligare trietylorto- acetat och av ekonomiska skäl föredrager man att en alkylester, t.ex. acetat, föreligger vid 21-ställningen.

Halogenering av 3-enoletern, d.v.s. bromering och företrädesvis klorering, kan utföras medelst vilket som helst inom facket känt sätt för halogenering i 6-ställning. Halogeneringsmedel inkluderar N-klorsuccínimid, N-bromsuccinimid, N,N'-diklor- hydantoin etc.

Vid utförandet av halogeneringssteget isolerar man först 3-enoletern från reaktionskomponenterna och lösningsmedlen i det första steget, varefter man anbringar halogeneringsmedlet i reaktionskontakt med 3-enoletern i ett lämpligt inert lös- ningsmedel under förhållanden som är tillräckliga för att åstad- komma bildning av 6-halo-¿§f-föreningen. Ett lämpligt, inert lösningsmedel, är ett lösningsmedel som icke reagerar med 3-enoletern eller halogeneringsmedlet på ett sätt som är men- ligt för reaktionen. Användbara lösningsmedel inkluderar syre- haltiga kolväten, t.ex. tetrahydrofuran, dioxan och dietyleter, aceton, ättiksyra eller blandningar därav. Reaktionen utföres företrädesvis under neutrala förhållanden, d.v.s. ca pH 7, och 10 15 20 ö1;a=u^sns- s 1«-se a lå- vid temperaturer från ca -5°C till 25°C, företrädesvis vid ca 0°C.

Halogeneringen kan mera:s§ecifikt utföras genom att man bring- 'ar enoletern att reagera-med dimetyl-N,N'-diklorhydantoin i en-buffrad acetonlösning vid'temperaturer från -SQC till ca SQC under 60,min.7 Ö I U Uppfinningen-utgör äyen en-totalsyntes för framställning av :G-halo-ÅÄ4'6-pregnadien-1ïß,-T7u,21-triolf312G-dióner och s-nalo-Aïí' 4 ' 6-pregna1-.rien-t1 1p,1 7«.,,.2~1--a1=rin1--3 ,.2o -ai<>n¿r,, i »synnerhet 6~klorföreningar angivna i den amerikanska patent- skriften 3 232 965. Sâvä1 jflammatorisk verkan med ett minimum av saltretention. Förfa- ringssättet är även användbart.för framstäl1ning:av föreningar i 16q,JWu-acetonidserien.och andra serier med användning av de här ovan.angivna.utgångsföreningarna.

Syntesen enligt-uppfinningen-kan i stort sett åskâdliggöras smed'hänvisning till följande reaktionsschema óch därpå följan- ~de,diskussion. ' 7905861-6 "' 'flCff-.Oïš L ß x-II cl xlv cl l/ (så) 10 15 20 25 30 35 _.ringa manga, a.v.s. 10 --15 s, av.en 17,21-artoesterme11an- ; .produkt tillsammans med-enoletern med.formeln X, där R är >7.-9»B'5 861 -116 _ , N " Här nedan diskuteras vart och ett av stegen i totalsyntesen.

Ehuru man föredrager att först bringa en förening_med en struk- tur sådan som visas i formeln VIII, i vilken R betecknar OH, t-ex. kortisol, att reagera med ättiksyraanhydrid för att framställa motsvarande 21-acetat, kan man bringa föreningen representerad genom formeln VIII att reagera med trietylorto- acetat från början.utan att behöva.gâ via bildningen av 21- -acetat-mellanprgdukten. Då man bringar en förening med for- meln VIII att reagera med-trietylortoacetat,_sâ bildas en väte. Närvaro av 17,21-ortoestern är icke menlig för den to- stala reaktionen, enär den nydrolyseras vid det efterföljande ekloreringssteget under.sura-förhållanden,.Då emellertid bild- ningen av 17,21-ortoester innefattar reaktion med ytterligare trietylortoacetat och då reaktionen av en förening, t.ex. kortisói, med srtiksyraannyaria 1 pyriain,ar så ren och bila- ,ningen av motsvarande 3-enoletyleter är fullständig och snabb i-steg 2,-föredrager.man att först framställa 21-estern innan man.utför reaktionen med trietylortoacetat..Detta föredragna tillvägagångssätt visas således i reaktionsschemat. 1) Man kan således i ett försök stegförestra en förening representerad genom formeln VIII, i vilken R betecknar OH, företrädesvis kortisol, för att framställa en 21-lägre alkyl- ester med ca 2 - 4 kolatomer i esterdelen. Denna förestring kan utföras medelst vilket som helst.inom facket känt sätt- för förestring vid 21-ställningen. Förestringen utföres van- ligtvis genom att.man bringa:-föreningen att reagera med en lägre alkylanhydrid i ett lämpligt lösningsmedel, exempelvis bringa: kortisol att reagera med ärriksyraanhydrid i pyridin vid temperaturer understigande 30°C. Reaktionen förlöper rent och fullständigt och därvid bildas en förening med formeln IX, som företrädesvis är kortisol-21-acetat. Man kan i stället för ättiksyraanhydrid använda propionsyra- eller smörsyraanhydrid. a2) I det andra steget isolerar man först den i steg 1 bildaded 21-estern och bringar den"att reagera med trietylortoacetat, 10 _15 20 25 30 35 S I 7995861-*6 i överensstämmelse med aspekten i sättet enligt uppfinningen såsom angivits här ovan, för att framställa motsvarande 3-enoletyleter med formeln X. Den föredragna föreningen med formeln X är 3-enoletern av kortisol-21-acetat. 3) Sedan man isolerat 3-enoletern X, halogenerar man den för att framställa en 6-haloförening med formeln XI. Halogenerings- steget är antingen ett klorerings- eller bromeringssteg, såsom beskrives här ovan. I I 4) Föreningen med formeln XI är en 66-halosubstituerad förening.

Innan man kan bringa denna att reagera med trietylortoacetat för att på ett effektivt sätt framställa en 3-enoleter med for- meln XII, måste halogenen omvandlas till en Gm-halogen. Detta åstadkommas genom att man anbringar den qß-substituerade före- ningen XI i ett inert lösningsmedel vid ca rumstemperatur (20 - - 25°C), tillsätter en ringa mängd sur katalysator och håller temperaturen under 1 timme eller mindre, företrädesvis 30 min. eller mindre. Detta utföres företrädesvis i ett lösningsmedel, t.ex. glyme, i närvaro av 1 viktprocent eller mindre av en stark organisk syrakatalysator, t.ex. trifluorättiksyra eller p-toluensulfonsyra. Omvandlingen till Gcfihaldföreningen är fullständig inom_mindre än 1 timme, vanligtvis inom mindre än à timme. Därefter sätter man etanol och trietylortoacetat till reaktionsblandningen och låter komponenterna reagera i överens- stämmelse med aspekten enligt uppfinningen för att framställa 3-enoletern med formeln XII.

Sedan man isolerat mellanprodukten med formeln XII, kan man omvandla den till den önskade slutprodukten på olika sätt. 5a) Man kan bringa föreningen med formeln XII att reagera för att direkt framställa A1'4',6 Man kan i ett-steg-förfarande bringa föreningen med formeln XII att reagera exempelvis med 2,3-diklor-4,5-dicyanobenso~ kinon och ett i huvudsak vattenfritt, lämpligt syrehaltigt kolvätelösningsmedel t.ex. dioxan, vid rumstemperatur för att framställa ZÄ1'4'6-pregnatrien-21-estern med formeln XIV som man i sin tur kan hydrolysera under basiska förhållanden eller -pregnatrienen med formeln XIV. 10 15 20 25 30 35 40 75!nÉi8Å$1'"6 _ lb omförestra för att framställa 21-hydroxisteroiden med formelnf XV, där Z är en dubbelbindning.* 5b) Pâ grund av högre utbyten föredrager man att använda ett tvåstegsförfarande, varvid en förening.med formeln XIII först bildas, som i sin tur dehydreras vid.1-ställningen, varvid man erhåller en förening med formeln XIV. Man kan därefter hydro- lysera vilken som helst av föreningarna.med formeln XIII eller XIV för att framställa en förening med formeln XV, där Z kan vara antingen en enkel- resp. dubbelbindning. Föreningen med 'formeln-XIII framställes först genom att man bringar förening- en med formeln XII att reagera med ett lämpligt oxidationsmedel (en tetrasubstituerad 1,4-bensokinon) vid låga temperaturer (d.v.s. ca O - 10°C) i ett vått syrehaltigt lösningsmedel, t.ex. dioxan eller aceton, med 25 vol-% .eller mindre vatten. Ett särskilt lämpligt,oxidationsmede1.är.2,3-diklor-5,6-dicyano- bensokinon. Denna reaktion är vanligtvis fullständig inom 2 .timmar eller mindre.

Sc)-Man isolerar 4,6-pregnadienen med formeln XIII och dehydre- rrar.den.därefter i 1-ställning för att framställa en förening med formeln XIV. Dehydreringen kan utföras på kemiska eller mirohiologiska sätt, som är kända inom facket. Man isolerar först 4,6-pregnadienen med formeln XIII innan man dehydrerar den i överensstämmelse med nästa steg. Vid den selektiva ke- miska dehydreringen i 1-ställning bringar man föreningen med formeln XIII att reagera med ett lämpligt oxidationsmedel under i huvudsak vattenfria förhållanden i ett lämpligt lös- ningsmedel, t.ex. ett syrehaltigt kolväte, exempelvis i al- kohol, dioxan eller aceton, vid temperaturer överstigande rums- temperatur upp till återflödestemperaturen. Ett lämpligt oxida- tionsmedel är 2,3-diklor-5,6-dicyanobensokinon, och lämpliga lösningsmedel inkluderar xylen, toluen, amylalkoholg dioxan och aceton. Man föredrager att upphetta föreningen med åter- flöde i lösningsmedlet under en tidsperiod tillräcklig för att åstadkomma dehydreringen. Denna tid är vanligtvis 1 timme till 20 timmar med kloranil i amylalkohol eller ca 12 till 16 timmar i xylen. Då man använder 2,3-diklor-5,6-dicyanobensoki- non i vattenfri aceton erfordras endast 4 timmar vid återflö- destemperatur. 10 15 20 25 30 35 g 7905861-6 Uk " De kemiska förfarandena för dehydrering i A1-ställningen utföres företrädesvis medelst ett bromeringsförfarande i 2-ställning och dehydrobromering mellan ställningarna 1 och _2, varvid en dubbelbindning bildas. Man bromerar genom att bringa ett lämpligt bromeringsmedel att reagera med ¿Ä4'6- -pregnadienen i ett lämpligt lösningsmedel under en tid till- räcklig för att fullborda reaktionen. Lämpliga bromeringsmedel inkluderar brom i kombination med bromväte och kan användas i ättiksyra vid rumstemperatur under en reaktionstid av ca 10 min., varvid man erhåller en reaktionsprodukt med ett utbyte av ca 85 % eller bättre..

Ett särskilt värdefullt bromeringsmedel för bromering i 2- -ställning är pyridiniumhydrobromidperbromid eller trimetyl- fenylammoniumtribromid i tetrahydrofuran, då man utför brome- ringen vid temperaturer av 30°C eller lägre, företrädesvis ca 20 till 2s°c.

Man dehydrobromerar därefter_den bildade i 2-ställning brome- rade föreningen genom att bringa denna förening att reagera med ett dehydrobromeringsmedel. Typiska dehydrobromerings- reaktioner beskrivas på sid. 213 - 218 i Steroid Reactions, An Outline For Organic Chemists av Carl Djerassi, Holden-Day, 1963. De däri beskrivna reaktionerna, som är tillämpliga, inneslutes här såsom en hänvisning. Ett särskilt föredraget förfaringssätt innefattar att man upphettar 2-brom-¿Ä4'6- -pregnadienen med litiumkarbonat och litiumbromid i dimetyl- formamid under 5 timmar eller mindre, företrädesvis mindre än 3 timmar, vid temperaturer av ca 100 till 110°C. 5d) Man kan alternativt dehydrera föreningen med formeln XIII med användning av mikrobiologiska förfaringssätt, d.v.s. man behandlar föreningen medelst en fermenteringsprocess, varvid man kan använda antingen a) växande mikroorganismer, t.ex.

Arthobacter simplex, eller b) cellfritt enzympreparat eller lägre alkanol- eller alkanon-torkade celler i närvaro av en väteacceptor. Då mikroorganismer och enzympreparat emellertid även har en viss esterasaktivitet, föredrager man att först framställa 21-hydroxiföreningen genom hydrolys eller omförest- 10 -15 20 25 30 35 1~9re¿5ïs-6vr1 -rf se r \K ring och därefter behandla denna förening för att framställa ¿Ä1'4'6-föreningen.

Ett representativt förfarande för en process med användning av.en växande mikroorganism beskrives i den amerikanska pa- tentskriften 2 837 464, som kännetecknas av att man underkastar en_¿&4-3-ketopregnen en inverkan av en kultur av en medlem av en grupp bestående av Corynebacterium simple: (som även kan betecknas som Arthobacter simplex) och Corynbacterium hoatii.

Det som i denna patentskrift är tillämpligt innefattas här såsom hänvisning. Införandet av en -A1-dubbelbindning förlö- _per vanligtvis på ett tillfredsställande sätt vid ett pH-värde av 7,6 till ca 8 vid en temperatur av 32 till ca 379C.

Ett representativt förfarande med ett cellfritt enzympreparat i närvaro av väteacceptorer är det förfarande, som beskrives É i den amerikanska patentskriften 3 047 469. I detta förfarande 1 underkastas en steroid, som är mättad i 1,2-ställningen, in- verkan av en blandning av ettring-A dehydrogenasextrakt av en mikroorganism, t.ex. Corynbacterium, varvid extraktet är i nuvuasaxt fritt från ievanae celler.

Andra organismer, som kan extraheras, inkluderar Nocardia, Corvnbacterium, Mycobacterium, Cylindrocarpon och Bacterium.

Vätebärare, som kan användas tillsammans med det cellfria extraktet i överensstämmelse med den uppfinningen, inkluderar oxidation-reduktion-reaktionskomponenter, exempelvis färg- ämnen, t.ex. kaliumferrocyanid, tiaziner och iminderivat, exemplifierade genom metylenblått, fenazinmetosulfat etc., bensokinoner och iminderivat, t.ex. ortokinon, toluylenblå- klorid, naftokinoner, t.ex. kresylhlått etc.,_och indofenoler, i synnerhet 2,6-diklorindofenol.

I det cellfria extraktförfarandet kan extraktet blandas direkt med steroidutgångsmaterialet och vätebäraren_sättes därefter till blandningen eller extraktet kan först blandas med väte- rbäraren och därefter anbringas i kontakt med steroiden. Kon- centrationen av vätebäraren är icke kritisk och vilken som helst mängd från en katalytisk mängd till en stökiometrisk 10 15 20 25 30 35 7905861*- 6 14 mängd motsvarande koncentrationen av steroiden kan användas.

Det under dehydreringen använda pH-värdet och den använda temperaturen är icke kritiska. Temperaturerna kan ligga inom området 20 till ca 45°C, optimaltemperaturen ligger omkring 25 till ca 35°C. Blandningens pH-värde kan vara surt, alkaliskt eller neutralt och ligger företrädesvis inom området 6,0 till 8,0. Man kan, för att eventuellt hålla pH-värdet vid ett visst värde, i reaktionsblandningen införa en buffertförening exem- pelvis ett oorganiskt fosfat, t.ex. natriumfosfat. Då reaktions- blandningen får stå under en lämplig tidsperiod tills ring A- -dehydreringen har blivit fullständig, vilket vanligtvis sker inom en tidsperiod av 1 - 20 timmar. I Ettsärskilt effektivt dehydreringsförfarande har tidigare beskrivits, där en ¿Ä4'6~förening, sådan som föreningen med formeln XV, där Z är en enkelbindning, selektivt dehydreras med användning av Arthobacter simplex (även betecknad som Corynebacteriüm simplex) i närvaro av en väteacceptor, t.ex. kinoner eller kinonderivat. Det som härvid sammanhänger med föreliggande uppfinning inkluderas här som hänvisning. Detta förfaringssätt är i synnerhet värdefullt för framställning av 6-klor- A1'4'6-pregnatrien-11ß,17d,21-triol-3,20-dion av mot- svarande ¿>4'6-pregnadien. En föredragen stam Arthobacter simplex, NRRL nr V-8055 är allmänt tillgänglig och kan erhållas från Northern regional research laboratory, 1815 North Univer- sity Street, Peoria, Illinois.

Väteacceptorer, som är användbara i förfaringssättet enligt uppfinningen, väljas från kinonföreningar och derivat därav och inkluderar bensokinoner, t.ex. tetrametyl-p-bensokinon och 2-isopropyl-5-metyl-p-bensokinon, naftokinoner, t.ex. menadion och 2-hydroxi-1,4-naftokinon, indofenoler, t.ex. 2,6-diklorindofenol, och menadionnatriumbisulfit. Det är en fördel att hålla pH-värdet inom omrâdet ca 7,5 - 8,5 under ¿l1-dehydreringen, under det att temperaturen bör vara ca 23 och. ca 33°C, företrädesvis ca 2$°C. Sedan man erhållit ett lämpligt tillväxtmedium, sättes en mängd av substratet till mediet, som kan vara så stor som 0,7 gram per liter medium. Den föredragna substratkoncentrationen är dock 10 15 20 25 30 35 -ett lösningsmedel, t.ex. etanol, aceton eller dimetylformamid, -eller i finfördelad form, t-ex. som fasta, mikroniserade par- rtiklar. Väteacceptorn sättes till mediet som en lösning i-ett .lösningsmedel, t.ex. etanol eller dimetylformamid, eller ifråga ¿ - teringsmediet genom extraktion med ett lämpligt lösningsmedel, ;sz9sasa st-1+s . 7 ap 7 7 É Q,5 gram per liter medium. Mängden väteacceptor kan variera över ett stort område, d.v.s. molförhâllandet av substrat till ! rväteacceptor kan variera från 30:1 till 10:1. Då man använder É š menadionnatriumbisulfit som väteacceptor, är det föredragna »förhållandet av substrat till acceptor»15:1. . e : -Steroiden kan sättas till mediet i form av en suspension i ett lämpligt lösningsmedel, t.ex. vatten, som en lösning i om menadionnatriumbisulfit som en vattenlösning.

Sedan substratet och väteacceptorn tillsätts fortsätter man omrörningen och_luftningen av mediet under en tidsperiod av 3 - 7 timmar eller tills dehydreringen är fullständig. För- loppet av dehydreringsförfarandet kan under fermenterings- reaktionen följas medelst tunnskiktskromatografering på silika- gel av med,lösningsmedelrextraherade prov.

Då denwngpnrpn är fullständig avlägsnar man produkten, 6-klor- -¿ß1'4'6-pregnatrien-113,17«,21-triol-3,20-dion, från fermen- t.ex. kloroform, metylenklorid, metylisobutylketon etc. Lös- rningsmedelslösningen indunstas, varvid man erhåller en halv- kristallinisk produkt, som man renar medelst kromatografering på silikagel. Produkten kan ytterligare renas genom omkristal- lisering från ett lämpligt lösningsmedel, t.ex. isopropylacetat, etylacetat, en blandning av aceton och vatten etc. I _Följande exempel angivas för att belysa sättet enligt uppfin- - ningen liksom för att skilja sättet enligt uppfinningen från kända förfaranden, vilka i dag förekomma inom facket. Exemplen avses endast att vara belysande för representativa föreningar och förhållanden och avser icke att_begränsa uppfinningen.Sâ- lunda visar exemplen 1 - 9 skillnaderna mellan sättet enligt uppfinningen och tidigare kända förfaranden för framställning gav 3-enol-etrar och exemplen 10 - 13 åskådliggör framställning 10 15 20 25 30 35 7905861-46 M av 3-oxo- A4'6- och A1'4'6-11-hydroxiföreningar enligt upp- finningen. - Exempel 1 20 gram kortisol-21-acetat sättes till 100 ml abs. etanol och 100 ml etylenglykoldimetyleter (glyme). Lösningen upp- hettas till 40°C och 2 gram p-toluensulfonsyra tillsättes följt av 24 gram trietylortoacetat. Reaktionsblandningen om- röres vid 40°C tills en lösning bildats. Blandningen omröres vid 40°C ytterligare 20 min., kyles till rumstemperatur och ,2 ml pyridin tillsättes. Reaktionsblandningen hälles långsamt till en blandning av 520 ml vatten och S2 ml hexan. Produkten oavfiltreras efter 30 min. vid 0 - 5°C och tvättas med vatten, därefter med 50 ml hexan och torkas i vakuum vid 40°C. Utbytet är 90 - 104 vikt/viktprocent.

Detta är ett exempel på sättet enligt uppfinningen, som visar att utbytena är i huvudsak kvantitativa för detta speciella förfaringssätt.

Exempel 2 Man upprepar i detta exempel förfarandet enligt exempel 1 med undantag av att man använder 2 gram trifluorättiksyra i stället för p-toluensulfonsyra som syrakatalysator. Man er- håller liknande utbyten. f Exempel 3 Man upprepar i detta exempel förfarandet enligt exempel 1 med undantag av att man använder 2 gram svavelsyra i stället för p-toluensulfonsyra som syrakatalysator. Man erhåller lik- nande utbyten.

Exempel 4 Detta exempel utföres för att visa skillnaden ifråga om ombyte och produkt mellan sättet enligt uppfinningen och ett sätt, som är känt inom facket.

I detta särskilda exempel sättes 10 gram kortisol-21-acetat till 100 ml abs. etanol, 10 ml trietylortoformiat och 0,300 10 15 20 25 30. 35 7919 5861 '-6 i 19./ gram 2,4-dinitrobensensulfonsyra. Blandningen omröres vid rumstemperatur tills en lösning bildats. Blandningen omrö- res ytterligare 15 min. och 1 ml pyridin tillsättes. Lösning- en koncentreras till halva volymen och 10 ml vatten tillsättes.

Därefter koncentrerar_man blandningen tills en kristallisering börjar. 100 ml vatten tillsättes och produkten avfiltreras, tvättas väl med vatten och torkas, varvid man erhåller mot- svarande 3-enoleter. I detta speciellt fall synes en viss mängd dehydreringsprodukt förekomma, som var fullständigt frånvarande i exempel 1 och ca 10 % icke reagerat material återstår vid detta förfarande liksom en ringa mängd av andra icke önskvärda produkter i jämförelse med exempel 1, i vilket exempel en betydligt mindre mängd icke reagerat material kvar- stod enligt en bestämning med tunnskiktskromatografi.

Exempel 5 _ Detta exempel visar nödvändigheten av att trietylortoacetat förekommer för att sättet enligt uppfinningen skall förlöpa.

I detta exempel användes exakt samma.teknik och samma mängder som i exempel 1 med undantag av att trietylortoacetatet ersät- tes med trietylortoformiat. En analys av slutprodukterna medelst tunnskiktskromatografi visar, att det fortfarande föreligger en ringa mängd utgångsmaterial och att det-förekommer en be- tydande mängd mellanprodukter och ca 10-- 15 % av- AÛ1'(9)- É -dehydreringsprodukt. 1 É Exempel 6 I detta exempel sättes 20 gram kortisol till 100 ml abs. etanol och 100 ml etylenglykoldimetyleter såsom i exempel 1. Man följer därefter_samma förfarande som i exempel 1 med undantag av att man använder 0,3 gram 2,4-dinitro-bensensulfonsyra och 10 gram trietylortoacetat. Resultaten visar en i huvudsak fullständig reaktion, varvid ca 15 % av en 17,21-ortoester av 3-enoletern .bildats. Närvaron av denna produkt är icke menlig för sättet enligt uppfinningen, enär produkten ytterligare kan bringas att reagera och vid slutet av reaktíonsserien kan 17,21-orto- estern lätt hydrolyseras till motsvarande 11ß,1¶u,21-trioxif steroid. 10 15 20 25 30 35 19@ses1+e 13 Exempel 7 Man upprepar samma förfarande som i exempel 5 med undantag av att man icke använder någon etylenglykoldimetyleter. vid slutet av reaktionssekvensen återstår fortfarande en bety- dande mängd, d.v.s. ca 10 % av det ursprungliga utgångsmate- rialet, som icke hade reagerat. Detta framhåller sålunda på nytt nödvändigheten av att trietylortoacetat är närvarande för att förfarandet enligt uppfinningen kan helt slutföras.

Exempel 8 Detta exempel visar att sättet enligt den amerikanska patent- skriften 3 087 927 icke ger den önskade föreningen.

För att ytterligare fastställa betydelsen av närvaron av tri- etylortoacetat och även betydelsen av att en större del av lösningsmedlet utgöres av etanol i detta exempel, suspenderar- man 30 gram kortisol-21-acetat i en lösning bestående av 300 ml dioxan, 30,0 ml trimetylortoformiat och 1,20 ml abs. meta- nol. Till den snabbt omrörda suspensionen sätter man droppvis 0,60 ml konc. svavelsyra. Suspensionen förtunnas kontinuerligt under de första min. och en fullständig lösning erhålles inom 6 min. 1,80 ml pyridin tillsättes, varvid en svagt röd färg- ning omedelbart försvinner och den bildade lösningen får en ljusgul färg. Hela förfaringssättet utföres hittills vid rums- temperatur. Den kylda reaktionslösningen anbringas i en skilje- tratt, vars skaft doppar ned under ytan av 300 ml av en vatten- -is-blandning i en stor bägare. Reaktionsblandningen sättes långsamt under en tidsperiod av 2 - 3 timmar till den kraftigt omrörda is-vatten-blandningen. Den fasta substans som bildas, får stå i lösningen vid 5°C över natten och avfiltreras där- efter. Produkten tvättas väl med vatten och lufttorkas, varvid man erhåller 28,7 gram produkt. En tunnskiktsanalys av produk- ten visar att hela produkten utgöres av ¿Ä9(11)21-acetat.

Exempel 9 I detta exempel upprepas samma förfarande som i exempel 8 med undantag av att man använder abs. etanol i stället för metanol och trietylortoacetat användes i stället för trimetylorto- formiat. Det visar sig genom att_man följer förfarandet en- 10 ßgglš-ä 611 P 6 i f” ,ligt exempel 8, att i huvudsak ingen reaktion äger rum. Detta visar betydelsen av att man använder en större mängd av etanol -øçh.att vad som beskrives i den amerikanska patentskriften 3 087 927.icke är utförbart.

Det framgår sålunda av de här ovan angivna exemplen och vad som angives i nedanstående tabell, att sättet.enligt upp- finningen, i vilket man.bringar steroiden att reagera med trietylortoacetat i ett lösningsmedel, som innefattar en större mängd etanol och en mindre mängd av ett syrehaltigt kolvätelösningsmedel, t.ex; glyme, ger resultat, som är över- lägsna och som icke kan förutses av teknikens-ståndpunkt. is, 7905861-6 mflfiøwnmuwmcmmßø Eow unw>nm Homwuuox I ¶x Hmwuøumë wwnmnm>:mHu | =|= flmfiuwumë mwnmâäoxmumm 1 =N= Awmëmxw wfiHm> mm .umuwflum> .noßmmæfimvmxmuæm | umM+m.

.HOfiMßw I wOufH umfiamomoßuoflæawflnu | moms »muwomounoflæumwuu .. moms: Hmwmäwmaflcmæfi wmflmä muumum Eon unw>nm cmxoflw «^mOw2V¶HoGmuwE ucmooum Gm mm muwflfië .umflenomouuoflæuwëwuuzl moäaa ¶ .»~mM>w° m Umcmfi .uxmucwumm mxmcmwfiuwäm . ccfluxmmu :masa x _nmxoHø wuwcwfi x vxcømwamßw mcmxflcxmav m .www ßmc m uxnwoum Umcmä .uxmunmvmm mxmcmxflumëm |mm:flHwwflumHfl>:ww|AmvP- ummwbm N nmxoflu mumøfiš møäü | uxnømøcmum wmwxficxmfivx m nofivxmwn mfiwnwumflfismo x x x | Auxnsmøawum mcwxflnxway ß Amwanwš wxufiv Hwumw0uHo|~m.>~ . wmfl> .coflvxmwu mflwnmumflflsm x x x x _w=fl:øHwmmø. mk noflvxmwn mflwcmuwfiHßwO N X x x | Auxcsmøflmvw mnmxflcxwav m nofluxmmu wfivnwumflfisuo x x x 1 Auxssmønmum mcwxflcxma. w cofivxmwn m«wnw»wHHøm x x x | x .maflcøflwmmav F umfismwm »ärm wešum movm moms momaï, Émswxm Hfiwnmß 10 15 20 25 30 35 71-9058-6 1- 6 gu, Exempel 10 Följande reaktionsserie angiver ett särskilt effektivt förfaringssätt-för framställning av 6-klor-,A1'4'6 É trien-11ß,17d,-21-triol-3,20-dion av-kortisol. --pregna- Reaktionsförhâllandena är representativa för förhållanden lämpliga för användning inom både den snäva och breda aspek- ten i sättet enligt uppfinningen och har visat sig vara att föredraga. De representativa reaktionsförhâllanden, som an- gives i detta exempel, skall, ehuru föredragna, icke tolkas som en begränsning av uppfinningen.

Framställning av kortisol-21-acetat.

Reaktion: ' OH.

Förfarande: ïïLLen1-Lugr kolv sättes 400 ml pyridin och 100 g (0,276 mol) hydrokortison (kortisol) tills kortisolen delvis går i lösning.

Man tillsätter; allt under det man håller temperaturen under 30°C, inom.en tidsperiod av 10 min. 163,3 gram (1,59 mol) ättik- syraanhydrid. Blandningen får stå 1 timme vid rumstemperatur tills reaktionen är fullständig. Därefter sättes långsamt 3000 ml vatten till reaktionsblandningen, varvid man håller tempera- .turen under 40°C. Reaktionsblandningen får stå 20 min. och över- föres därefter till en Bfliter kolv. Man tillsätter under 20 min. '1500 ml mättad natriumklorid-vattenlösning. Blandningen kyles till 10°C, får stå 1 timme och filtreras. Den avfiltrerade pro- dukten tvättas med vatten och torkas i vakuumugn vid 50 - 60°C.

Utbyte: 110,4 gram (110,4'vikt/vikt, 99,2 % av det teoretiska). 7905861-6 _10- Reaktion med trietylortoacetat för framställning av 3-enoleter och därpå följande 66-klorering.

Reaktioner: _ _ CHZOAC I" 1 CHZOAC 5 =o HO - OH V HO ÄKVOH 10 O/í/ _<_2H3C(oc21aš)3 CZHSO H* _ I i i 15 Halane® ---> 20 25 Förfarande: ïïll en 2-liter kolv sättes 550 ml etanol, 330 ml 1,2-dimetoxietan (glyme) och 110,4 gram (0,272 mol) kortisol-21-acetat. Bland- ningen upphettas till 40 - 42°C och därtill sättes en lösning av 9 g p-toluensulfonsyra i 200 ml 1,2-dimetoxietan, följt av 30 116 gram trietylortoacetat. Blandningens temperatur hâlles vid 38 - 42°C. 2,5 gram p-toluensulfonsyra tillsättes efter 20 min; Blandningen får stå 30 min. vid 38 4 4200 och kyles därefter till s - 1o°c, varefter 12 ml pytldin tillsättes följt av en lösning av 2,7 gram natriumacetat i 50 ml vatten. Den svagt gula lösning- 35 en tillsättes till en blandning av 14 gram natriumacetat i 2 450 ml vatten och 288 ml hexan, kyles därefter till 10°C, får stå 20 min., filtreras och tvättas med 800 ml vatten innehållande 1 gram natriumacetat följt av en tvättning med 220 ml hexan. 10 15 Qzo 25 30 35 »19fisas1-6 i 1% Den våta kakan (ca 200 gram) sättes till en kall (10°C) bland- ning av 13,7 gram natriumacetat i 184 ml vatten och 440 ml aceton och blandningen kyäíf till 0 - 5°C. Därpå tillsättes en lösning av 27 gram Halane (ett registrerat varumärke för 1,3~diklor-5,5-dimetylhydantoin) 1 120 ml aceton, varvid man I håller temperaturen under 5°C. Blandningen får stå 45 min. vid O - 5°C och därefter tillsättes en lösning av 9,2 gram natriumbisulfit i-132 ml vatten och blandningen hälles långsamt i 2200 ml vatten under en tidsperiod av 30 min. och kyles till 0 - 5?C. Blandningen får stâ_1 timme, filtreras och den av- filtrerade fasta substansen_torkas i vakuumugn vid 45 - 50°C.

Utbyte: 107,2 gram (97,1 vikt/vikt, 89,5 % av det teoretiska).

Reaktion med trietylortoacetat för att framställa en 3-enoleter och följande A4'6-bi1aning.

-Reaktion: DDQ dioxan 10 15 20 25 30 35 7905861-6 Of) Förfarande: Till en 2-liter kolv sättes 104 gram (0,237 mol) 6ß-klor- -11ß,17G;21-trihydroxipregna-4-en-3,20-dion-21-acetat (frân föregående steg), 500 ml 1,2-dimetoxietan och 3,03 gram p-toluensulfonsyra och blandningen får stå 30 min. vid 20 - - 25°C. Därpå tillsättes 500 ml etanol följt av 91,4 gram (0,563 mol) trietylortoacetat. Reaktionsblandningen antager en mörkröd färg och får stå 40 min. vid 20 - 25°C och kyles därpå till 15°C, varefter en lösning av 13 gram natriumacetat i 640 ml vatten tillsättes. Temperaturen hålles under 20°C och 220 ml metylenklorid tillsättes följt av en långsam tillsätt- ning av 1000 ml vatten, varvid temperaturen hâlles under 25°C.

Blandningen omröres 15 min. och det lägre organiska skiktet av- skiljes. Det övre vattenskiktet extraheras med 3 portioner på 75 ml av metylenklorid. De organiska fraktionerna förenas och tvättas med en lösning av 1,3-gram natriumacetat i 260 ml vat- ten. Metylenkloridextraktet (totalt ca 900 ml) avskiljes och koncentreras i vakuum till ungefär 400 ml och, under destille- ring, tillsättes en blandning av 850 ml dioxan och 1,3 ml pyri- din, varvid volymen hålles vid ca 400 - 450 ml. Blandningen destilleras till en slutvolym av 400 ml (ingen metylenklorid bör förefinnas i denna punkt) och 300 ml dioxan tillsättes.

Blandningen kyles till 10°C och 65 ml vatten tillsättes, var- efter blandningen kyles till 0 - 5°C. Därefter tillsättes under 1 timme en lösning av 75 g 2,3-diklor-4,5-dicyanobensokinon (DDQ) i 300 ml dioxan, varvid man håller temperaturen vid 0 - - 5°C. Tillsättningstratten tvättas med 30 ml dioxan och bland- ningen får stå 30 min. vid 0 - 5°C. Därpå tillsättes en lösning av 30,4 g natriumbisulfit i 87 ml vatten, varvid man håller blandningens temperatur under 10°C. Uppslamningen koncentreras' i vakuum till 600 ml. Till uppslamningen sättes långsamt med kraftig omrörning 3000 ml vatten, varefter blandningen kyles till 10°C och får stå 3 timmar. Blandningen filtreras och tvät- tas med vatten. Den våta fasta substansen sättes till 1500 ml metylenklorid, omröres 1 timme, filtreras och tvättas med 100 ml metylenklorid. Den fasta substansen sättes till 400 ml mety- lenklorid, omröres 20 min., filtreras och tvättas med 100 ml metylenklorid. Metylenkloridlösningarna förenas och omröres med 1000 ml vatten. Det organiska skiktet avskiljes och vatten- 10 15 20 25 30 35 l7i3ßi5_¿8:-61W-:»6 ¶ l 30 skiktet extraheras med 50 ml metylenklorid. Metylenklorid- extrakten-koncentreras till 400 ml och under destillering tillsättes 1000 ml àceton så.att volymen hålles vid ungefär .36O --400 ml. Ufipslamningen destilleras till en slutvolym av .3oo.m1 och kyles till o - s°c. Den får därefter sta so min., filtreras och tvättas med az m1ika11_(o - s°c) aceton. Produk- :en torkas 1 vakuum vid so°c..utbyte= eo,s gram (11,2 vikt/ vikt, 77,5-% av det teqretiska).l - ¿:1fbi1aning och följande-hyarolysï Reaktionerí 'CHZOAC Li co3/Lier 2 DMF 10 15 20 25 30 35 40 7905861-6 s: Förfarande: 50 gram RS-4232-acetat (från föregående steg med ca 10 % aceton) sättes till 350 ml metylenklorid. 30 gram neutral' aluminiumoxid tillsättes och blandningen omröres 1 timme.

Aluminiumoxiden avfiltreras och lösningen koncentreras till en volym av 50 ml. 400 ml tetrahydrofuran tillsättes och destillationen fortsättes till en kokpunkt av ca 659C uppnås.

Blandningen kyles till 25°C och en lösning av 34 gram pyri- diniumhydrobromidperbromid i 130 ml tetrahydrofuran tillsät- tes. Reaktionsblandningen omröres 20 min. vid 25°C och 3 ml aceton tillsättes. Reaktionsblandningen filtreras och filt- ratet koncentreras till en volym av 50 ml. Därpå tillsättes 400 ml dimetylformamid följt av 22,5 gram litiumkarbonat och 8,1 gram litiumbromid.

Systemet genombubblas med kväve och reaktionsblandningen upp- hettas till 105°C under 2§ timme. Blandningen koncentreras därefter i vakuum till 200 ml, kyles till 60°C och 50 ml ättik- syra tillsättes, följt av 70 ml vatten. Reaktionsblandningen hälles långsamt i 1600 ml vatten. Produkten avfiltreras efter 1 timme vid 25°C och tvättas med vatten. Produkten torkas i vakuum i 60°C. Utbyte: 41,5 gram (83 vikt/vikt). Produkten kristalliseras tvâ gånger från aceton. Utbyte efter rening: 78,8 vikt/vikt. 6-klor-11p,170021-trihydroxipregna-1,4,6-trien-3,20-dion framställes genom förestring i vattenfri metanol i närvaro av en ringa mängd kaliumkarbonat.~ Exempel 11 Man upprepar förfarandet enligt exempel 10 för att framställa 6-klor-1ya,170921-trihydroxipregna-4,6-dien-3,20-dion-21-acetat, som omförestras till motsvarande 21-hydroxiföreningen genom att man bringar den att reagera med vattenfri metanol i närvaro av en ringa mängd kaliumkarbonat.

Exempel 12 Detta exempel visar ett förfaringssätt för 131-bildning med an- vändning av mikrobiologiska förfaranden (d.v.s. växande celler med en väteacceptor). 10 015 20 25 30 35 79015861” 6 32 A. Fermentering. g En kultur av Arthobacter simplex NRRLB*8055 odlas 6 dagar vid 28°C på lutande agar med följande sammansättning: (A): Näringsagar (Difco) 20 gram Glukos 10 gram Jästextrakt (Difco) t10 gram Dest. vatten 1 liter En full ögla av tillväxten på ytan av den lutande agarn användes för att inokulera var och en av 2300 ml nephlokulturkolvar (Bellco Inc.), där var och_en av kolvarna innehåller 50 ml av följande sterila näringsmedium (B): 5 gram Majsstöpvätska Jästextrakt 1 gram Cerelose (praktiskt taget 0,5 gram glukosmonohydrat) Dest, vatten 1tliter pH 7 " Kolvarna inkuberas vid 28°C_pâ en roterande skakanordning med 280 varv per min. med användning av en 2,54 cm rörelse. Inku- beringen är fullständig inom 24 timmar eller då kulturens grum- lighet uppnår 165 - 1so Klett-enheter, bestämt med en Klett- Summerson-fotoelektrisk kolorimeter försedd med ett filter nr 66 och inställd på nolläge med sterilt medium. Därefter användes det totala innehållet i båda kolvarna för att inokulera 900 ml nysteriliserat medium B som föreligger i en 2 liter glasfer- menteringsflaska. Inkuberingen av fermenteringsflaskan fort- sättes vid 28°C, varunder en luftning sker med å volymer luft/volymmedium/minut och omrörning med 300 varv per minut. 500 mg 6-klor-11¿»l7K,21-trihydroxípregna-4,6-dien-3,20-dion (framställd såsom beskrivas i exemplen 10 och 11) sättes efter 24 timmar i form av en etanollösning (25 mg/0,4 ml etanol) tills fermenteringsblandningen. Vid samma tidpunkt sättes även 26,4 mg menadionnatriumbisulfit i form av en filtrerad, steriliserad vattenlösning (26,4 mg/10 ml) till blandningen. Inkuberingen 10 15 20 25 30 as E 79Û5861*6 aa; fortsättes som tidigare. Reaktionen är fullständig inom 3 - 5 timmar.

B.Isolering och karakterisering.

Fermenteringsbuljongen extraheras tre gånger med 500 ml por- tioner kloroform. De förenade kloroformextrakten torkas över vattenfritt natriumsulfat och indunstas i vakuum till torrhet.

Den bildade halvkristalliniska återstoden renas genom kromato- grafering på silikagel. Produkten elueras med blandningar av kloroform och aceton. De fraktioner, som innehåller den önskade produkten, förenas och indunstas till torrhet, varvid man er- håller 475 mg (utbyta 95 t av det teoretiska) e-kler-ÄAW- -pregnatrien-11p,1¶X,21-triol-3,20-díon, som man därefter kristalliserar från isopropylacetat.

Pâ samma,sätt utför man, genom att byta ut menadionnatriumbi- sulfit mot menadion och tetrametyl-n-bensokinon, en liknande omvandling av 6-klor-¿L4'6-pregnadien-1L6,17w,21-triol-3,20- -aien till s-kler- A1'4'6-pregnatrlen-11(¿,17q,21-triel-3,2o- -dion.

Exemgel 13 Ett inokulum av Arthobacter simplex framställes såsom beskrives i exempel 12.

Därpå användes 5 ml av den under 24 timmar odlade kulturen för att inokulera fyra erlenmeyerkolvar på 250 ml, vardera inne- hållande 50 ml medium B (Exempel 12). Kolvarna inkuberas vid 28°C på en roterande skakanordning med 280 varv per minut med användning av en 2,54 cm rörelse. 25 mg 6-klor-.A4'6-pregnadien- -11ß,170921-triol-3,20-dion (framställd såsom beskrives i exemplen 10 och 11) löst i 0,4 ml etanol sättes efter 24 timmar till varje kolv. Vid samma tid sättes till en kolv 0,78 mg 2-iso- propyl-5-metyl-p-bensokinon i 0,2 ml etanol. Till en andra kolv sättes 0,83 mg 2-hydroxi-1,4-naftokinon och till en tredje kolv sättes 1,2 mg natriumsalt av 2,6-diklorindofenol löst i 0,5 ml vatten. Till den fjärde kolven sättes icke någon väteacceptor utan denna kolv tjänar som kontroll. Analyser med tunnskikts- kromatografi av med lösningsmedel extraherade prov som tagits 2,195B6-1-6 91 ¶ 34 f efter en kontakttid av 7 och 24 timmar visar en ökad hastig- hetgochàprocentuell bildning av föreningen G-klor- A1'4'6- -pregnadien-n1 1p,17<><,21-trio1-3,20-dion i jämförelsq med det obehandlacle kontrollprovet. '

Claims (2)

7965861-6 ' SS' Patentkrav 1,4

1. Sätt att framställa s-oxo- , ß4'6- och A '6-11-hyaroxi- steroidföreningar med formeln i: i vilken R betecknar -H, -OH, lägre alkyleter med 1 - 6 kolatomer eller lägre alkylester med 1 - 6 kolatomer, R1 betecknar -H. -OH eller lägre alkylester med 1-- 6 kolatomer, R2 betecknar -H, 0(-CH3 eller /5-CH3, X betecknar F, Cl eller Br och R1 och R2 kan tillsammans beteckna ---0\ ,R4 f/C\5 ---O R där R4 och R5 betecknar kolväten med 1 - 4 kolatomer och---- beteck- nar en enkel-_eller dubbelbindning, k_§ n n e t e_c kDn_a"t av _ att man bringar en 3-oxo- A4-steroid med ovanstående formel, i vilken X betecknar väte, att reagera med trietylortoacetat i när- varo av en katalytisk mängd av en stark syra i ett lösningsmedel som består huvudsakligen av minst 40 vikt-% etanol och högst 60 vikt-% av en fördragbar, alifatisk eller cyklisk eter, och där- efter på i och för sig känt sätt halogenerar den bildade 3~enol- etern i 6-ställning för att framställa en 6 ß-halogenförening, som man överför till motsvarande 604-halogenförening, exempelvis genom inverkan av en sur katalysator i ett inert lösningsmedel, bringar 6°L-halogenföreningen att reagera med trietylortoacetat under ovanstående förhållanden för att framställa motsvarande 3-enoleter, vilken man därefter bringar att reagera med ett lämpligt oxídationsmedel vid låg temperatur t.ex. en tetrasub- stituerad 1,4~bensokinon, varvid man erhåller en 4,6-dienföre- ning med ovanstående formel, och eventuellt därefter på i och wnisarsñ-a i a, för sig känt sätt dehydrerar dienföreningen i 1-ställning, exem- pelvis mikrobiologiskt eller medelst bromering i 2-ställning följt av dehydrobromering i 1,2-ställning, varvid man erhåller motsvarande 1,4,6-trienförening, och eventuellt hydrolyserar en i 17- eller 21-ställning befint- lig estergrupp.

2. Sätt enligt krav 1, k ä-n n e t e c k n a t av att X betecknar klor, R betecknar OH eller metylester, R1 betecknar OH och R2 betecknar väte.