SE432875B - Anvendning av tarm-saltlake fran djurtarmar som ramaterial for isolering av heparin - Google Patents

Description

7712732-2 tan inför orlmliga problem på grund av därmed förenad lukt- I den tyska patentskriften 1 253 868 beskrives en samman- fattning av några brukliga förfaranden för utvinning av heparin.

I enlighet därmed hringar man djurvävnaden i begynnelsesteget i kontakt med en het saltvattenlösning för att lösa ut heparinet från cellerna. Den heparinandel, som därvid erhålles i mediet, är ytterst ringa.

Det har nu visat sig, att dc-n i :wlnkteric-x' cndyl. t-rhållna saltlaken innehåller heparin. Denna saltlake bildas, då man strör in i djurtarmar, som dessförinnan befriats från tarmslemhinna och tvättats, fast koksalt för konservering och avvattning. Saltningen företas skiktvis i samlingsspjälverk. Den efter 2 timmar till 2 dagar bildade tarmsaltlaken uppsamlas, i stället för att som ti- digare bortkastas. Upparbetningen (isoleringen) av heparinet från saltlaken företas på i och för sig känt sätt.

Det är således med hänsyn till den tyska patentskriften 1 253 868 ytterst överraskande, att den genom endast insaltning av djurtarmar bildade saltlaken innehåller större mängder heparin. Ran kunde icke heller vänta sig, att detta heparin föreligger nästan fullständigt fritt från kemiskt närbesläktade biprodukter, så att saltlake, som hittills endast är känd som en miljöbelastande av- fallsprodukt, utgör en ny råvarukälla för det genom ringa råvara- tillgång redan i mycket begränsad mängd förekommande heparinvt. Upp- arbetningen till råheparin kan genom den vittgående avsaknaden av föroreningar åstadkommas på ett synnerligen skonsamt sätt och där- vid borifaller de enligt teknikens ståndpunkt kända kostsamma iso- lerinçsfïrfarandena (se amerikanska patentskriften 5 H51 996 och brittiska patvntskrïften 1 ?21 78U). Man kommer.slutligen fram till heparinkvaliteter, som långt ifrån uppnås med de heparinpreparat som står till buds i marknaden. Det enligt kända upparhetnings- förfaranden av tarmsaltlake som råmaterial enligt uppfinningen isolerade råheparinet föreligger redan i en sådan renhet, att den därefter följande reningen för till hepariner med långt över P00 USP-enheter/mg. De hittills i handeln tillgängliga heparinprepa- raten har i regel heparinkvaliteter av 150 USP-enheter/mg, och i några få fall även 155_USP-enheter/mg. Med USP-enhet/mg avser man den specifika aktivitet, som erhålles med en USP-bestämning, var- vid man mäter hämningen av bildningen av små klumpar i konserve- rad fârplasma. 1 USP-enhet motsvarar ca 1,1 internationella enhe- lira i QUAflf-y i 71127s2~2 ter (UJ). Då aktivitetsvärdena av de i handeln förekommande he- parinpreparaten trots talrika ytterligare förbättringar av för- farandena icke är tillfredsställande, så anger exempelvis USP, att heparinpreparat (från tarmslomhinna) måste innehålla minst IMO USP~enheter. Endast i laboratoriet har det hittills lyckats L.W. Kananagh och L.B. Jaqucs fArzneimittel-forschung (Drug Res.) gå (12), 19U2 (197U)] att isolera heparin genom upprepad kristalli- sation som bariunsalt med maximalt 175 USP-enheter/mg.

Genom användning av tarmraltlake enligt uppfinningen som rå~ mwterial har det lyckats att isolera heparin i teknisk skala med en renhet, så att en nästan färglös substans föreligger. Alla rå- hopariner, som hittills föreligger av andra råmaterial, måste där~ emot först avfärgas genom kostsamma och färlusthringande förfaran- den (amerikanska patentskriften 5 179 566).

Saltlake är dessutom genomgående ett lagringsdugligt, nästan luktloßt råmaterial, som icke undergår nåï~n kvalítetsförlust un~ der län¿re iawrfng. Därigenom tortfaller kemiska och andra konser- aerïngsfïrfaranden. i: Uppfinningen hänför sügsålefe- till användning av tarmsalt- lake som råmaiwrinllälla för framställninfl av rent heparin.

Fx lrfiii l Till 600 liter saltlake sättes i ett 1500 liter rörverk vid rumstemperatur med omrörning inom 1/2 timme 600 liter metanol. Man rör om under lika lång tid, varefter blandningen får stå ca 1 tim- me. Man dekanterar nu det överliggande grumliga skiktet till ett n~¿ra karl och låter de utskilda saltkaknrna vara kvar. Den erhåll- na suepensionen får stå 2 dagar. Därefter uekanterar man på nytt, kastar bort det överliggande skiktet och isolerar fällningen genom cenlrifugering. Man erhåller efter torkning i vakuum 1,68 kg av en pr~dnk1, som hur ll UST-enhrtvr/mn. Produkien innehåller fortfaran- de ua o0% koksalt. sflflrfiil ii liter saltlake surgöres enligt den brittiska patentskrif- ten /LH 985 med omrörning medelst ättikoyra till ett pH-värde av ,1-5,3 (ca 50 ml). Blandwingen dekanteras efter några timmar och återstoden centrifugeras. Fällningen bortkastas och de förenade lïsningarna neutraliseras med natronlut. Till blandningen sattes under omrörning långsamt samma volym metanol. Det utskilda kok- saltet dekanteras efter US minuter. Man låter denna suspension stå flera timmar, dekanterar det överliggande skiktet och oentrifuge~ 7712732-2 rar återstoden. Fällningen torkas i vakuum, varvid man erhåller 3,76 g av en produkt med 23 USP-enheter/mg.

Exempel 3 3 liter saltlake spädes med 14 liter vatten. Därefter till- sättes 50 g kiselgur och en lösning av 7 g benzetonium-klorid (= Hyamin 1622, Rohm & Haas) i 100 ml vatten.Man dekanterar bland- ningen efter några timmar och suger av återstoden. Den efter tvätt- ning med vatten ännu fuktiga fällningen extraheras tre gånger en- ligt det i den tyska patentskriften 1 228 241 beskrivna förfarandet med 200 ml 2-molar koksaltlösning varje gång. De förenade extrakten fälles med 2 volymdelar metanol. Den isolerade och torkade fällnin- gen väger 560 mg och har en aktivitet av 163 USP-enheter/mg.

Exempel 4 3 liter saltlake bringas medelst ättiksyra och under omröring till ett pH-värde av 3,1-3,2. Blandningen dekanteras efter flera timmar och återstoden centrifugeras. De förenade lösningarna spädes med vatten till 15,5 liter och därtill sättes 40 g kiselgur och 7 g benzetonium-klorid (Hyamin 1622) i 100 ml vatten. Blandningen får stå några timmar, varefter fällningen isoleras såsom beskrives i exempel 3 och upparbetas vidare. Man erhåller slutligen 796 mg pro- dukt med 105 USP-enheter/mg.

Exempel 5 3 liter saltlake spädes med 13 liter vatten (jfr tyska patent- skriften 1 156 938). Därefter surgöres blandningen med ca 50 ml ät- tiksyra till ett pH-värde av 3,2. Blandningen får stå några timmar, varunder en fällning avskiljes, som efter dekantering av det klara överliggande skiktet avcentrifugeras. Man erhåller efter torkning 16,6 g râheparin med 5,5 USP-enheter/mg.

Exempel 6 liter saltlake spädes med 50 liter vatten. Denna lösning pumpas genom ett filter med en jonbytarkolonn med en diameter av 26 mm och en längd av 380 mm (ca 3 l/tim.). Man använder ett medelbe- siskt makroporöst anjonbytarharts i Cl--form (Lewatit®CA 9249). Man kan även använda andra jonbytarhartser, exempelvis det i den tyska patentskriften 1 253 868 beskrivna Dowex®1-X-1.

Därefter avlägsnar man hartset från kolonnen, tvättar det tvâ gånger med 500 ml 0,9-molar koksaltlösning och eluerar med 400 ml 2-molar koksaltlösning 5 timmar vid 40°C. Denna lösning fälles med 7712752-2 1,5 volymdelar metanol. Den isolerade och torkade fällningen väger 1,5 g och har 152 USP-enheter/mg.

Exempel 7 En alikvot mängd râheparin från exempel 1, motsvarande 425 000 USP-enheter eller 38,65 g extraheras tre gånger med 200 ml 2-molar koksaltlösning varje gång, varvid man varje gång rör om blandningen 1 timme vid 60OC. De förenade extrakten spädes med vatten tills lös- ningen innehåller ca 0,9 mol/l kloridjoner. Därtill sättes nu 200 ml av en anjonbytare (Lewatit CA 9249) i kloridform och man rör om bland- ningen 1 timme. Därefter suger man av och tvättar med ca 200 ml 0,9-molar koksaltlösning. Man rör därefter om jonbytaren 5 timmar med 2-molar koksaltlösning vid 40°C, suger av den och tvättar med 2-mo- lar koksaltlösning. Elueringslösningen förenas med tvättlösningen och fälles med 1,5-dubbla volymen metanol. Fällningen avcentrifuge- ras, tvättas först med ca 50 ml vatten-metanol (1 + 1,5 volymdelar) och därefter med ca 50 ml metanol och torkas. Man erhåller 1,91 g natriumheparinat med 202 USP-enheter per mg.

Exempel 8 g av ett enligt exempel 7 framställt natriumheparinat med ca 200 USP-enheter/mg löses i 200 ml 2-molar koksaltlösning. Lösning- en avsuges på ett sugfilter och återstoden tvättas först med 30 ml 2-molar koksaltlösning och därefter med ca 250 ml fullständigt avsal- tat vatten. De förenade lösningarna bringas därefter med fullstän- digt avsaltat vatten till en klorid-molaritet av 0,9. Man upprepar därefter analogt med exempel 7 reningen med 1 liter Lewatit CA 9249.

De förenade eluerings~ och tvättlösningarna upparbetas vidare som ovan. Man erhåller efter tvättning och torkning av fällningen 11,1 g natriumheparinat, som har en aktivitet av 254 USP-enheter/mg.

Claims (1)

1. 7712732-2 Patentkrav Användning av tarm-saltlake, som erhållits genom att strö in fast koksalt i djurtarmar, vilka dessförinnan befriats från tarmslem~ hinna, som råmaterial för isolering av rent heparin.