SE1350584A1 - Cellmobilisering - Google Patents

Abstract

37 SAMMANDRAG Dextransulfat anvands for att mobilisera celler, sasom stam- och/eller progenitorceller och vissa vita blodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i perifert blod hos en patient. Dextransulfat bar en mycket snabb cellmobiliserande effekt som nnedfor att cellskordande kan starta nastan omedelbart efter dextransulfatsadministrering.

Description

1 CELLMOBILISERING TEKNISKT OMRADE De foreliggande uppfinningarna avser allmant mobilisering av celler in i en patients blodbana.

BAKGRUND Stamceller och progenitorceller ar omogna celler med fornnaga att dela Sig och utvecklas till att bilda vilken celltyp som heist i det mogna systennet. Hematopoetiska stamceller (HSC) kan producera cellerna i immunsystemet och benmargen. HSC-transplantation (HSCT) anvands for att aterskapa normal hematopoes i en patient for att behandla olika sjukdomar efter kemoterapi eller bestralning. Under de senaste artiondena har HSCT blivit en rutinmassig klinisk behandling f6r en mangfald av tillstand inklusive multipelt myelom (MM), non-Hodgkins lymfom (NHL) och tillstand som kraver allotransplantation. Trots de uppenbara forbattringarna under de senaste aren är forfarandet fortfarande behaftat med en forhallandevis hog sjuklighet och dodlighet pa grund av komplikationer och aterfall av den underliggande sjukdomen. Det finns ocksa ett standigt behov av forbattrade stamcellskallor, cellskordande forfaranden, konditioneringsregimen och innmunosuppressiv behandling. Det finns tva huvudsakliga former av HSCT, antingen allogen — med stamceller som harror fran en kompatibel frisk donator, eller autolog — nar stamceller samlas in fran och sedan ges tillbaka samma patient efter konditioneringsterapi med h6gdosig kemoterapi/radioterapi. I allogen och sarskilt autolog HSCT har perifert blod idag nastan uteslutande ersatt benmarg som kallan for stamceller. Perifert blod som cellkalla är foredraget eftersom det innefattar ett nnindre invasivt forfarande for donatorn och inympning av transplanterade celler är snabbare jamfort med att anvanda benmarg som cellkallan.

Trots de uppenbara forbattringarna under de senaste aren ar forfarande fortfarande behaftat med en forhallandevis h6g sjuklighet och dodlighet pa grund av transplantationsrelaterade komplikationer (huvudsakligen allogen) och aterfall av den underliggande sjukdomen (huvudsakligen autolog). Det finns saledes ett standigt behov av att forbattra stamcellskallor, cellskordande protokoll, konditioneringsregimer och immunosuppressiv behandling. ldag mobiliseras stamceller till perifert blod via behandling av donatorn med granulocytkolonistimulerande faktor (G-CSF) och cellerna sk6rdas med aferes f6r efterfoljande transplantation. Efter infusion i mottagarens blodbana vandrar de friska hematopoetiska cellerna till benmargen dar de kan differentiera f6r att ge mogna blodceller och aterskapa hematopoes. Nyligen har plerixafor 2 (MOZOBILTm, AMD3100, 1,1'41,4-fenylenbis(metyleq-bis-1,4,8,11-tetraazacyklotetradekan) godkants i kombination med G-CSF for att 6ka mobilisering av progenitorceller i MM- och NHL-patienter.

En vasentlig begransning med kombinationsbehandlingen med G-CSF och plerixafor är den langsamma stamcellsmobiliseringen. Fastan experimentell data i moss indikerar pa en topp i mobiliserade stamceller 1 timma efter plerixaforadministrering (Broxmeye 2005) intraffar den motsvarande toppen i manniska forst runt 9 timmar efter plerixaforadministrering (MozobilTm Product Monograph). Skordandet av mobiliserade stamceller fordrojs saledes till ungefar 11 timmar efter plerixaforadministreringen, vilket medfor langa sjukhusvistelser (MozobilTm Product Monograph). Det är 10 darfor praxis att plerixafor behover administreras dagen f6re sjalva cellskordandet.

Sweeney 2000 och Sweeney 2002 unders6ker effekterna hos sulfaterade polysackarider, inklusive 10 kDa dextransulfat, i mobiliseringen av stam-/progenitorceller i moss och apa. I moss och apa resulterade dextransulfat i mobilisering av kolonibildande celler (CFC) efter 3 timmar respektive 6 timmar fran dextransulfatsadministrering. De resultat som presenteras i Sweeney 2000 och Sweeney 2002 verkar saledes antyda att dextransulfat är ungefar tre ganger langsammare jamfort med plerixafor i termer av att mobilisera stann-/progenitorceller.

SAMMANFATTNING Det är ett allmant syfte att tillhandahalla en effektiv mobilisering av malceller in i en patients blodbana.

Det ar ett annat allmant syfte att tillhandahalla en hog niva av mobiliserade malceller i en patients blodbana.

Dessa och andra syften uppnas av utforingsformer beskrivna had.

En aspekt av utforingsformerna avser dextransulfat med en medelnnolekylvikt inom ett interval! pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, for anvandning i mobilisering av progenitor- och/eller stamceller in i perifert blod hos en patient. En beslaktad aspekt av utforingsformerna avser anvandningen av dextransulfat med en medelmolekylvikt inom ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, for tillverkningen av ett lakemedel for mobilisering av progenitor- och/eller stamceller in i perifert blod hos en patient. En annan beslaktad aspekt av utforingsformerna avser en metod for att mobilisera progenitor- och/eller stamceller in i perifert blod hos en patient. Metoden innefattar administrering av en effektiv mangd av dextransulfat 3 med en medelmolekylvikt inom ett interval! pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, till patienten.

En annan aspekt av utforingsformerna avser dextransulfat med en medelmolekylvikt inom ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, for anvandning i mobilisering av vita malblodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i en patients blodbana. En beslaktad aspekt av utforingsformerna avser anvandningen av dextransulfat med en medelmolekylvikt inom ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, for tillverkningen av ett lakemedel f6r mobilisering av vita malblodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i en patients blodbana. En annan 10 beslaktad aspekt av utforingsformerna avser en metod for att mobilisera vita malblodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i en patients blodbana. Metoden innefattar administrering av en effektiv nnangd av dextransulfat med en medelmolekylvikt inom ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, till patienten.

En ytterligare aspekt av utforingsfornnerna avser en cellmobiliserande sannmansattning innefattande dextransulfat med en medelmolekylvikt inom ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutisk acceptabelt salt darav, och granulocyt-kolonistimulerande faktor (G-CSF). Andra beslaktade aspekter av utforingsformerna avser en cellnnobiliserande sammansattning innefattande dextransulfat med en medelmolekylvikt inom ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutisk acceptabelt salt darav, och G-CSF for anvandning i mobilisering av progenitor- och/eller stamceller in i perifert blod hos en patient och/eller for anvandning i mobilisering av vita malblodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i en patients blodbana. Ytterligare beslaktade aspekter av utforingsformerna avser anvandning av en cellmobiliserande samnnansattning innefattande dextransulfat med en medelmolekylvikt inom ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutisk acceptabelt salt darav, och G-CSF for tillverkningen av ett lakemedel f6r mobilisering av progenitor- och/eller stamceller in i perifert blod hos en patient och/eller fOr mobilisering av vita malblodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i en patients blodbana. Annu andra beslaktade aspekter av utforingsformerna avser en metod for att mobilisera progenitor- och/eller stamceller in i perifert blod hos en patient eller mobilisera vita malblodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i en patients blodbana. Metoden innefattar administrering av en effektiv mangd, till patienten, av en cellmobiliserande sammansattning innefattande dextransulfat med en medelmolekylvikt inom ett interval! pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutisk acceptabelt salt darav, och G-CSF. 4 Uppfinnarna har funnit att dextransulfat med ett snavt intervall med avseende pa medelmolekylvikten uppnar en signifikant fordel inom cellmobilisering jamfort med dextransulfatsmolekyler som har mindre eller store medelmolekylvikter.

Dextransulfatsmolekyler som har en medelmolekylvikt under intervallet for de foreliggande utforingsformerna har inte flagon signifikant effekt i termer av mobilisering av progenitor- och/eller stamceller eller vita blodkroppar. Dextransulfatsmolekyler med en medelmolekylvikt over intervallet for de foreliggande utforingsformerna verkar inte ha nagon additiv effekt och ingen synergistisk effekt da de anvands tillsammans med andra cellmobiliserande foreningar, sasonn G-CSF, och verkar ha langsammare mobiliseringseffekt *fort med de foreliggande utforingsformerna.

De foreliggande utforingsformerna tillhandahaller en effektiv cellmobilisering med en ovantad mobiliseringsprofilsomsatterigangcellmobiliseringnastanomedelbartefter dextransulfatsadministrering med en topp i mobiliserade celler redan inom 7,5-30 minuter efter dextransulfatsadministrering i moss och inom 30-120 minuter i manniska. Dextransulfatsmolekyler enligt utforingsformerna kan dessutonn synergistiskt konnbineras med andra cellmobiliserande f6reningar for att ytterligare Oka antalet mobiliserade celler.

KORT BESKRIVNING AV RITNINGARNA Utforingsformerna, tillsannmans med ytterligare syften och fordelar med dessa, kan bast forstas genom hanvisning till den efterfoljande beskrivningen last tillsammans med de medfoljande ritningarna, i vilka: Fig. 1 visar leukocytnnobilisering inducerad av en s.c. injektion av dextransulfat (LMW-DS) eller AMD3100 jannfort med kontroll (citronsyramonohydrat (CAM)). Blod togs efter 3 timnnar (LMW-DS) eller 1 timma (AMD3100). Medel ± SEM visas. Statisk analys jamforde LMW-DS eller AMD3100 med kontrollgruppen (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001) eller LMW-DS jamfort med AMD3100 (tp<0,05, ttp<0,01, tttp<0,001).

Fig. 2 visar effekten av LMW-DS pa blodkoncentrationen av HGF. Djuren behandlades med en s.c. injektion av LMW-DS eller AMD3100. CAM anvandes som mediumkontroll. Blod togs efter 3 timmar (LMW-DS) eller 1 timma (AMD3100). Medel ± SEM visas. Statisk analys jamforde LMW-DS eller AMD3100 med kontrollgruppen (*p<0,05, ***p<0,001) eller LMW-DS jamfOrt med AMD3100 (fftp<0,001).

Fig. 3 visar leukocytmobilisering till perifert blod med en i.v. injektion av LMW-DS och AMD3100. CAM anvandes som mediumkontroll. Blod togs efter 30 minuter (LMW-DS och medium) eller 1 timma (AMD3100). Medel ± SEM visas. Statisk analys jamforde LMW-DS eller AMD3100 med kontrollgrupp (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001) eller LMW-DS jamfort med AMD3100 (tp<0,05, ttp<0,01, tttp<0,001).

Fig. 4A och 4B visar effekten av en i.v. injektion av LMW-DS eller s.c. injektion av AMD3100 p5 mobilisering av hematopoetiska kolonibildande celler (CFC) i perifert blod. CAM-buffert (i.v.) anvandes som mediumkontroll. Blod togs efter 30 minuter (LMW-DS och medium) eller 1 timma (AMD3100). Medel ± SEM visas. Statisk analys jamforde LMW-DS eller AMD3100 med kontrollgrupp (*p<0,05, **p<0,01) eller LMW-DS jamfort med AMD3100 (tp<0,05).

Fig. 5 visar en 5tskillnad i progenitorsubtyp (CFU-GM, CFU-GEMM och BFU-E) hos mobiliserade progenitorceller (CFC) efter en i.v. injektion med LMW-DS eller CAM (kontroll). CAM-buffert anvandes som kontroll och detta varde anvands som ett 0-varde (negativ kontroll). Medel ± SEM visas. Statisk analys jamforde LMW-DS med kontrollgrupp (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

Fig. 6 visar leukocytnnobilisering inducerad av kombination av G-CSF och LMW-DS eller AMD3100 *fort med CAM-buffert (medium). Blod togs efter 30 minuter (LMW-DS och medium) eller 1 timma (AMD3100). Medel ± SEM visas. Statisk analys jamforde G-CSF + LMW-DS eller AMD3100 med kontrollgrupp (G-CSF + CAM) (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001) eller G-CSF + LMW-DS jamfort med GCSF + AMD3100 (tp<0,05, ttp<0,01, tttp<0,001).

Fig. 7A och 7B visar kombinationsbehandling med G-CSF och LMW-DS eller AMD3100 pa nnobiliserade progenitorceller i perifert blod. CAM-buffert anvandes som mediumkontroll. Blod togs efter 30 minuter (LMW-DS och medium) eller 1 timma (AMD3100). Medel ± SEM visas. Statisk analys jamforde G-CSF + LMW-DS eller AMD3100 med kontrollgrupp (G-CSF + CAM) (*p<0,05, **p<0,01) eller G-CSF + LMW-DS famfort med G-CSF + AMD3100 (tp<0,05, ttp<0,01).

Fig. 8 är en oversikt over mobilisering av progenitorceller efter enstaka injektioner i moss av 100 mg/kg LMW-DS, G-CSF, G-CSF + LMW-DS, G-CSF + AMD3100 (5 mg/kg) eller CAM (medium). Kombinationsbehandling med G-CSF och LMW-DS okad signifikant antalet CFC jamfort med CAM-buffed, LMW-DS, och G-CSF. Felstaplar visar SEM, n=6-10. 6 Fig. 9 är en oversikt aver mobilisering av lymfocyter efter enstaka injektioner i moss av 100 mg/kg LMW-DS, G-CSF, G-CSF + LMW-DS, G-CSF + AMD3100 (5 mg/kg) eller CAM (medium). LMW-DSadministrering okade lymfocyter i perifert blod jannfort med enkelterapi med G-CSF eller AMD3100 och i kombination med G-CSF var okningen signifikant jannfort med G-CSF + AMD3100. Felstaplar visar SEM, n=6-10.

Fig. 10 visar effekterna av dextransulfat pa vita blodkroppar i perifert blod. Djuren behandlades med en iv. injektion av dextransulfat med olika medelmolekylvikter (DS3 eller DS5) i doser pa 50 mg/kg. Buffrad saltlosning (NaCI) anvandes som nnediumkontroll. Vissa djur bedovades med pentanatriumbarbital (PNB) istallet for isofluran for att *fora effekten av olika anestesimetoder. Felstaplar visar SEM. Student t-test anvandes for att utvardera statistiskt signifikanta skillnader jamfort med kontrollgrupp (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

Fig. 11 visar effektiviteten hos dextransulfat pa mobilisering av hemtopoetiska progenitorceller in i perifert blod. Djuren behandlades med en i.v. injektion av DS med olika medelmolekylvikter (DS3 eller DS5) eller med medium (NaCI). Felstaplar visar SEM. Student t-test anvandes for att utvardera statistiskt signifikanta skillnaderjamfort med kontrollgrupp (*p<0,05).

Fig. 12 visar effekten hos dextransulfat pa okningen av HGF-nivaer i perifert blod. Djur behandlades med en iv. injektion av dextransulfat med olika medelmolekylvikter (DS3 eller DS5) eller med medium (NaCI). Felstaplar visar SEM. Student t-test anvandes for att utvardera statistiskt signifikanta skillnader *fort med kontrollgrupp (***p<0,001), DETALJERAD BESKRIVNING De foreliggande utforingsformerna avser allmant cellmobilisering i djur, foretradesvis daggdjur och sarskilt manniska. UtfOringsformerna avser sarskilt mobilisering av stam- eller progenitorceller och/eller vissa vita blodkroppar som kan anvandas i celltransplantation, inklusive hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT).

Utforingsformerna är baserade pa ovantade karakteristiker hos dextransulfat avseende mobilisering av celler i en patient, foretradesvis en daggdjurspatient och annu hellre manniskopatient.

En aspekt av utfOringsformerna avser darfor dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, for anvandning i mobilisering av 7 progenitor- och/eller stamceller, typiskt sett fra'n benmargen (BM), in i perifert blod (PB) hos en patient, foretradesvis en daggdjurspatient och 5nnu hellre en manniskopatient.

I det perifera blodet är stam- och eller/progenitorcellerna tillgangliga for skordande och kan darigenom anvandas i celltransplantation, inklusive HSCT. Alternativt sett kan mobiliseringen av stam- och/eller progenitorcellerna in i det perifera blodet uppn5 fordelaktiga effekter utan att skordas frAn patienten, till exempel cirkulerar in vivo f6r vavnads- eller organlakning, s5som lakning av hjartmuskel.

En utf6ringsform av denna aspekt avser darfor en nnetod f6r att mobilisera progenitor- och/eller stamceller, foretradesvis fr5 n benmargen, in i perifert blod hos en patient, foretradesvis en manniskopatient. Metoden innefattar administrering av en effektiv mangd dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall p5 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, till patienten. En annan utforingsform av denna aspekt avser anvandningen av dextransulfat med en medelmolekylvikt inom ett intervall p5 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt salt darav, for tillverkningen av ett lakemedel for mobilisering av progenitor- och/eller stamceller, foretradesvis fr5n benmargen, in i perifert blod hos en patient, foretradesvis en manniskopatient.

Uttrycket "progenitorceller" avser had vissa celler som kan bilda differentierade hematopoetiska eller myeloida celler som svar p5 stimuli. Progenitorceller i ett prov kan identifieras via deras formaga att bilda kolonibildande enheter (CFU) av olika typer. Sadana CFU-typer innefattar bland annat CFUgranulocyt, -makrofag (CFU-GM), CFU-granulocyt, -erytrocyt, -monocyt, -nnegakarocyt (CFU-GEMM), BFU-E ("burst forming unit"-erytrocyt). "Stamcell" är mindre differentierade former av progenitorceller och uttrycker typiskt sett men inte alltid cellyteglykoproteinet CD34 i manniska.

Experimentell data sasonn presenteras h5ri visar att det finns en undre grans med avseende p5 dextransulfats medelmolekylvikt for att ha nagon cellmobiliserande effekt, se Fig. 10 och 11. Dextransulfatsmolekyler med en medelmolekylvikt under de foreliggande utforingsformernas intervall uppvisar Aledes inte n5gon positiv effekt med avseende p5 mobilisering av progenitor- och/eller stamceller, eller inte heller med avseende p5 mobilisering av vita blodkroppar, sarskilt lymfocyter, eller inducering av hepatocyttillvaxtfaktor (HGF), se Fig. 10-12.

Dextransulfatsmolekyler med en medelmolekylvikt Over de foreliggande utforingsformernas intervall har ocks5 sarnre effekt med avseende p5 cellmobilisering. 8 Sweeney 2000 och Sweeney 2002 indikerar att 10 kDa dextransulfat var ungefar tre g5nger I5ngsammare an plerixafor i moss i termer av mobilisering av progenitor-/stannceller med en sk6rdetid foreslagen till att vara 3 timmar efter dextransulfatsadministrering jamfort med skordande efter 1 timma efter plerixaforadministrering (Broxmeyer 2005). Experimentell data sasom presenteras hari indikerar att dextransulfat med en medelnnolekylvikt enligt utf6ringsformerna orsakar nastan omedelbart en okning i antalet mobiliserade kolonibildande celler (CFC) och att toppen sker 7,5-30 minuter efter dextransulfatsadministrering i moss jamfort med 1 timma f6r plerixafor och 3 timmar f6r 10 kDa dextransulfat. P5 motsvarande sett kommer toppen i CFC-mobilisering i manniskopatienter att ske ungefar 0,5 till 3 timmar, s 5som ungefar 1 timma efter dextransulfatsadministrering. CFC-mobilisering med dextransulfat verkar aedes vara ungefar 6-9 ganger langsammare i manniska an i moss. Detta är liknande for plerixafor dar toppen i CFC-mobilisering sker ungefar 9 timmar efter plerixaforadministrering i manniska.

Dextransulfat enligt utfOringsformerna verkar s5ledes ha signifikant snabbare cellmobiliserande effekt an vad som indikeras i den kande tekniken for store dextransulfatsmolekyler, se Sweeney 2000 och Sweeney 2002.

Han 1998 undersokte dextransulfat med en molekylvikt p5 10 kDa och G-CSF med avseende p5 mobilisering av vita blodkroppar (WBC), mononukleara celler (MNC) och CFU-GM i moss. Forfattarna diskuterade att topparna i perifert WBC, MNC och CFU-GM sker 2-5 timmar efter iv. injektion av 15-30 mg dextransulfat 10 kDa i moss. Den omnannnda tidsperioden är liknande den pa tre timmar som foreslagits av Sweeney 2000 och Sweeney 2002.

Han 1998 jamforde vidare nivaema av perifert WBC, MNC och CFU-GM efter administrering av pg/kg G-CSF givet varje dag under fern dagar (G-CSF-grupp), 15 mg/kg dextransulfat 10 kDa givet en g5ng (DS-grupp) och 10 pg/kg G-CSF givet varje dag under fern dagar och 15 mg/kg dextransulfat 10 kDa givet en gang pa dag 5 (DS+GCSF-grupp). Det fanns ingen signifikant skillnad i n5gon av de tre grupperna med avseende p5 WBC och MNC. DS-gruppen hade en CFU-GM-niv5 pa 12,9±1,6 kolonier med > 50 celler, G-CSF-gruppen hade en CFU-GM-niv5 pa 17,1±1,9 kolonier medan den kombinerade behandlingen med DS och G-CSF (DS+GCSF-grupp) hade en CFU-GM-nivA pa 19,8±2,3, dvs. *of Over den niv5 som uppn5ddes med enbart G-CSF-behandling.

Han 1998 indikerade saledes att dextransulfat med en medelmolekylvikt pa 10 kDa resulterade i en mobiliseringstopp efter 2-5 timmar fran tiden f6r administrering i moss och att kombinationen av detta 9 dextransulfat med G-CSF knappast hade nagon ytterligare effekt over enbart G-CSF-behandling i moss, Dextransulfatet med en medelmolekylvikt enligt utforingsfornnerna har en signifikant annorlunda administreringsprofil och effekt jamfort med vad som visas for dextransulfat 10 kDa i Han 1998. For det forsta verkar dextransulfatet enligt utforingsformerna ha signifikant snabbare cellmobiliserande effekt an vad som indikeras i den kanda tekniken for st6rre dextransulfatsmolekyler. Far det andra har dextransulfatet enligt utforingsformerna en synergistisk effekt med avseende pa cellmobilisering da det kombineras med G-CSF. Konnbinationen av dextransulfat och G-CSF-behandling sasom visas hari 10 resulterade saledes i en okning i mobiliserade progenitorceller och lymfocyter i perifert blod som var store an den kombinerade effekten med att endast anvanda dextransulfat eller endast anvanda GCSF, se Fig. 6-9. Dextransulfat med en medelmolekylvikt inom de foreliggande uppfinningarnas intervall har saledes en sann synergistisk effekt da det konnbineras med G-CSF.

Det utvalda intervallet med avseende pa medelmolekylvikt hos dextransulfatet tillhandahaller som en 1610 en signifikant effektivare cellmobilisering jamfort med dextransulfatsmolekyler med en medelmolekylvikt som ligger utanfor de foreliggande utforingsformernas intervall.

Experimentell data sasom presenteras hari visar att dextransulfat enligt utforingsformerna inte bara mobiliserar ungefar samma antal progenitor- och stamceller i termer av totalt antal CFC som plerixafor, utan dextransulfatsadministrering kan synergistiskt konnbineras med andra substanser, sasom G-CSF, for att uppna signifikant hogre nivaer av totalt antal CFC jannfort med motsvarande kombinationer av plerixafor och G-CSF. Dextransulfats CFC-mobiliseringsprofil skiljer sig vidare fran CFC-mobiliseringen med plerixafor. Dextransulfat enligt utf6ringsformerna kan sarskilt uppna hogre nivaer av CFU-GEMM och BFU-E CFC-typer jamfort med plerixafor.

Den mycket snabba cellmobilisering som initieras av administrering med dextransulfat enligt utf6ringsformerna nnojliggor en fundamentalt annorlunda administrering-kontra-effekt-profil jamfort med plerixafor pa grund av den nnycket snabbare CFC-mobiliseringen. I denna aspekt sá koordineras och synkroneras saledes administreringen av dextransulfatet enligt utforingsformerna foretradesvis med avseende pa den onskade tidpunkten for att uppna en topp i mobiliserad CFC. Till exempel, om de mobiliserade CFC ska skordas fran perifert blod i en patient sa koordineras och synkroneras foretradesvis administreringen av dextransulfat till att ske fran ungefar 0 timmar till ungefar 8 timmar, annu hellre fran ungefar 0 timmar till ungefar 6 timmar innan starten av CFC-sk6rdandet f6r en manniskopatient. Dextransulfatsadministreringen sker annu hellre fran ungefar 0 timmar till ungefar 4 timmar innan starten av CFC-skordandet.

Skordande av CFC-celler efter en kombinerad behandling med plerixafor och G-CSF sker under ungefar 4 timmar per skordningstillfalle och koordineras darfor fran 9 timmar upp till 13 timmar efter plerixaforadministrering.

Ett motsvarande skordningsprotokoll enligt utf6ringsformerna skulle da kunna utfora ett 4 timmars CFC-skordande fran 0 upp till 4 timmar, fran 0,25 upp till 4,25 timmar, fran 0,5 upp till 4,5, fran 0,7 upp till 4,75 timmar, fran 1 upp till 5 timmar, fran 1,25 upp till 5,25 timmar, fran 1,5 upp till 5,5 timmar, fran 1,75 upp till 5,75 timmar, fran 2 upp till 6 timmar, fran 2,25 upp till 6,25 timmar, fran 2,5 upp till 6,5 timmar, fran 2,75 upp till 6,75 timmar eller fran 3 upp till 7 timmar efter dextransulfatsadministrering. I en sarskild utforingsform är saledes sk6rdandet av stam- och/eller progenitorceller med dextransulfatsinducerad cellmobilisering fordelaktigt redan avslutat innan CFC-sk6rdandet ens har startats med anvandning av plerixafor som mobiliseringsinducerade annne.

Preliminara humandata indikerar att CFC-mobilisering med dextransulfat toppar vid ungefar 1 timma efter dextransulfatsadministrering och borjar klinga av ungefar 6 timmar efter dextransulfatsadministrering och är tillbaka till normala nivaer atminstone ungefar 24 timmar efter dextransulfatsadministrering.

Dextransulfatsadministrering leder saledes till en mycket snabbare och effektivare mobilisering av celler jamfort med plerixafor och darfor kommer antalet aferesdagar som kravs f6r att f fram den 6nskade mangden mobiliserade celler att minska. F6r patienter med otillrackligt cellantal vid schemalagt aferesbesok siktar behandling med dextransulfat pa att sakra omedelbar mobilisering av celler och aferesen kan startas sasom planerat. Det kommer att underlatta planeringen i aferescentren och minska antalet patienter som maste genomga flera mobiliseringsforfaranden.

Studier utforda med dextransulfat s8som presenterade han har dokumenterat en omedelbar mobilisering av progenitorceller. Antalet CFC toppar gedes redan 7,5 minuter efter administrering med en langlivad topp som bestar i atminstone 1 timma i moss. Mobiliseringen av HSC med anvandning av dextransulfat verkar vara snabbare jamfort med den nuvarande mobiliseringsregimen som innefattar plerixaforbehandling, som har en distinkt topp vid 1 timma i moss. 11 En snabb, effektiv och forutsagbar mobilisering av HSC skulle minska sjukhusvistelsetiden far patienten. Detta skulle aven gynna aferescentren pa grund av farre aferesm6ten och lagre antal installda sessioner pa grund av for laga cellantal.

En mojlig mekanism bakom de snabbare mobiliseringseffekterna hos dextransulfat som skiljer sig jamfOrt med plerixafor presenteras nedan. Kortfattat sa binder dextransulfat till den heparinbindande domanen hos BM-stromala celler, vilka frislapper SDF-1 ("stromal cell-derived factor 1") och HSC in i perifert bled. Plerixafor paverkar andra sidan SDF-1-gradienten genom att verka som en SDF-1- antagonist vilket leder till okade mangder HSC i perifert bled. Skillnaden i tid att bryta SDF gradienten antyder olika mekanismer for de mobiliserande substanserna. Den foreslagna mekanismen for dextransulfat kan forklaras genom bindning till en specifik sekvens av positivt laddade aminosyror benamnd den heparinbindande domanen pa den annars negativt laddade heparansulfaten (HS). Detta nnedfor en frislappning av SDF-1 till cirkulation och forhOjd serumkoncentration (Sweeney 2002 och Pablos 2003).

De exakta mekanismerna som styr malsokning och mobilisering av HSC till och fran benmargen är inte kanda men sarskilt cytokinen SDF-1 och dess receptor CXCR4 spelar en avgoranderoll. HSC uttrycker CXCR4 och SDF-1 produceras av benmargen. SDF-1 f6rankras i proteoglykaner (PG) pa membranet hos stronnala celler, endotelceller och den extracellulara nnatrisen.

Dextransulfat star SDF-1-gradienten med okade nivaer i bled och minskade nivaer i BM bade i moss och icke-humana primater. Okningen i SDF-1 är troligen pa grund av konkurrensundantrangandet med dextransulfat fran heparansulfatproteoglykaner (HSPG) som isolerar kemokinen pa endotelcellsytor eller extracellular matris i BM och andra vavnader. I apa resulterade en injektion med dextransulfat i maximala nivaer av perifert SDF-1 efter 6 timmar som atergick till basniva efter 24 timmar (Sweeney 2002). Plerixafor binder a andra sidan till receptorerna far SDF-1, CXCR4 och CXCR7 (Kalatskaya 2009) och star saledes bindningen till SDF-1 i benmargens stroma och frisatter cellerna. Plerixafor paverkar denna SDF-1-gradient genom att verka som en SDF-1-antagonist vilket leder till okade mangder HSC i perifert bled (Broxmeyer 2005 och Lapidot 2003).

F6rutom att uppna en signifikant snabbare cellmobilisering jamfort med plerixafor uppnar dextransulfatsadministrering ocksa andra stann- eller progenitorcellsmobiliseringsprofiler. Dextransulfat tillhandahaller sarskilt h6gre nivaer av CFC-typerna BFU-E och CFU-GEMM jamfort med plerixafor. Denna cellmobiliseringsprofil enligt utforingsformerna kan ha flera kliniska fordelar. Till exempel har det 12 faststallts att antalet tillforda CFU-GEMM till patienten korrelerar med tiden for aterfaende av neutrofiler och blodplattar (Roodman 1987). Transplantation av HSC med okat CFU-GEMM-innehall skulle saledes minska den kritiska tidsperioden med forhOjd risk for infektioner hos patienten och skulle kunna vara till stor fordel for patienten. Aven 6kade nivaer av BFU-E i de mobiliserade cellerna kommer att vara fordelaktig i celltransplantationer. Det har visats att ant alet tillforda BFU-E-celler under celltransplantationen forbattrade aterfaende av neutrofiler och blodplattar samt hematopoetiskt aterstallande (Cooper 1997 och Hassan 1997).

Stann- och/eller progenitorceller mobiliserade med dextransulfatsadministrering enligt denna aspekt 10 kan skordas enligt tekniker valkanda inom teknikomradet, sasonn aferes. Kortfattat kopplas intravenosa slangar till patienten for att kontinuerlig cirkulera patientens blod genom en aferesnnaskin och sedan tillbaka till patienten. Aferesmaskinen separerar da olika typer av blod- och immunceller.

De sk6rdade stam- och/eller progenitorcellerna kan anvanda i allogen eller autolog transplantation, sasom HSCT.

De skordade stam- och/eller progenitorcellerna kan da tillforas en donator som antingen ar patienten sjalv (autolog transplantation) eller en annan patient (allogen transplantation). ldag finns det flera sjukdomar och tillstand dar stam- och/eller progenitorcelltransplantation är en terapi. Till exempel har allogen transplantation foreslagits f6r att behandla olika turnorer och cancersjukdomar inklusive akut myeloid leukemi (AML), akut lymfoblastisk leukemi (ALL), kronisk myeloid leukemi (CML), myelodyplastiska syndrom (MDS), myeloproliferativa sjukdomar (MPD), non-Hodgkins lymfom (NHL), Hodgkins sjukdom (HD), kronisk lymfocytisk leukemi (CLL), multipelt myelom (MM) och juventil kronisk myeloid leukemi. Pa motsvarande sett har autolog transplantation foreslagits f6r foljande cancersjukdomar MM, NHL, HD, AML, neuroblastom, aggstockscancer och germinalcellsturnorer. Andra cancersjukdomar innefattar harcellsleukenni (HCL), akut promyelocytisk leukemi (APL) och andra myelom, leukemier och lymfom.

Aven om HSCT är en terapi som framst anvands for hematologisk och lymfoid cancer ar det ett alternativ i en mangfald av andra forvarvade och medf6dda tillstand inklusive aplastisk anemi, paroxysmal nattlig hemoglobinuri, Fanconis anemi, Blackfan-Diamond anemi, Thalassemi major, sicklecellanenni, svar kombinerad imnnunobrist, Wiskott-Aldrich syndrom, medfodda metabola sjukdomar, autoimmuna sjukdomar och amyloidos (CopeIan 2006). 13 Dessutom eftersom dextransulfat har en okad mobiliseringseffekt pa blodceller och utf6r dess effekter genom en annan nnekanism an for narvarande anvant mobiliseringsamne, plerixafor, sa kan behandling med dextransulfat vara anvandbart i alla HSCT-patienter saval som i icke-svarande patienter som inte uppnar tillracklig mobilisering av stamceller med nuvarande terapier.

Dextransulfatsadministrering orsakar inte bara en mycket snabb och signifikant okning i mobilisering av progenitor- och/eller stamceller, typiskt sett fran benmargen, in i perifert blod hos en patient. Dextransulfat enligt utforingsformerna har dessutom positiva effekter pa flera blodparametrar omedelbart efter administrering och inducerar en snabb mobilisering av vita blodkroppar (WBC). WBC- mobilisering kan vara en sarskilt fordelaktig aspekt hos utf6ringsformerna eftersom de mobiliserade WBC kan reducera risken for infektion och den kritiska tiden efter en utford HSCT.

En mycket intressant karakteristik hos dextransulfatet enligt utforingsformerna är att dextransulfatet sarskilt orsakar en hog mobilisering av lymfocyter, signifikant hogre jamfort med plerixafor.

En annan aspekt av utforingsformerna avser daft- dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, for anvandning i mobilisering av vita malblodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i en patients blodbana, foretradesvis en daggdjurspatient och annu hellre en manniskopatient.

En utforingsform av denna aspekt avser en metod for mobilisering av lymfocyter in i perifert blod hos en patient, sarskilt manniskopatient. Metoden innefattar adnninistrering av en effekt mangd av dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, till patienten. En annan utf6ringsform av denna aspekt avser anvandningen av dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, for tillverkningen av ett lakemedel for mobilisering av vita malblodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i en patients blodbana.

Dextransulfatet enligt utforingsformerna kan anvandas enligt denna aspekt for att mobilisera lymfocyter forutom progenitor- och/eller stamceller fran en patient. Dextransulfatet skulle emellertid alternativt sett kunna anvandas huvudsakligen for mobilisering av lymfocyter som malceller som ska anvandas i olika tillampningar eller terapier dar lymfocyter behovs. 14 Eventuell sk6rdande av lymfocyter och administreringen av dextransulfatet koordineras och synkroneras foretradesvis sasom tidigare beskrivit hari for stam- och/eller progenitorcellmobilisering. Dextransulfatadministrering koordineras och synkroneras saledes foretradesvis till att ske fran ungefar 0 till ungefar 8 timmar, foretradesvis fran ungefar 0 till ungefar 6 timmar och annu hellre fran ungefar 0 timmar till ungefar 4 timmar innan starten av lymfocytskordande f6r en manniskopatient. De tidigare visade foredragna skordningsintervallen relativt dextransulfatsadministrering kan med fordel aven anvandas for lymfocytskordning.

Hogre tillford lymfocytmangd har flera fordelar i samband med HSCT. Till exempel kommer okad mangd lymfocyter tillforda en patient tillsammans med tidigare skordade stam- och/eller progenitorceller att nninska risken for infektioner och forbattra helhetsresultatet. Hogre tillford lymfocytdos predikterar hogre lymfocytaterstallande, vilket i sin tur predikterar overlagsen overlevnad efter autolog hemtopoetisk stamcellstransplantation for MM- och NHL-patienter, Okad lymfocytdos omsatts till absolut lynnfocytantal vid dag 15 (ACL-15). Man har kommit fram till att total nnedianoverlevnad och overlevnad fri fran NHL-utbredning an signifikant bate f6r NHL-patienter som mottar 0,68x9 lymfocyter/kg jamfort med de som mottar 0,34x9 lymfocyter/kg, och liknande fordelar med hogre lymfocytutbyte i MM-patienter (Porrata 2004b).

I kliniska forsoka utforda med plerixafor upplevde mellan 20-25 % av HSCT-patienterna infektioner efter transplantation (CHMP Assessment Report Mozobil (plerixafor) Procesure No. EMEA/H/C/001030). Samhallsforvarvade respiratoriska virus har erkants som en mojlig orsak till allvarliga infektioner, sarskilt i patienter som genomgar HSCT. HSCT-mottagare med symptomatisk ovre respiratorisk infektion har dessutom en hogre tendens att utvecklas till allvarlig lunginflammation med en dadlighet sa hag som 50-70 % (Chemaly 2006). Dextransulfat enligt utf6ringsformerna kan minska dessa risker for infektioner pa grund av de 6kade nivaerna av lymfocyter.

Mekanismen for forbattrad total overlevnad foreslas vara snabbare inympning och ateruppbyggnad av lymfocyter, vilket resulterar i en starkare transplantat-mot-tumor-effekt (GVT-effekt), vilket minskar kvarvarande cancer (Porrata 2004a, 2004b, 2009 och Hiwase 2008). Sasonn presenteras i de experimentella resultaten atminstone dubblerar en administration av dextransulfat frisattningen av lymfocyter i enkelterapi jamfort med en administration av G-CSF eller plerixafor. Dextransulfat i kombination med G-CSF är ungefar tva ganger sa effektivt i att mobilisera lymfocyter jannfort med kombinationen av G-CSF och plerixafor.

De inducerade effekterna p5 WBC och sarskilt lymfocyter skulle kunna beror p5 den underliggande mekanismen att dextransulfat har visats st6ra SDF-1-gradienten med 6kade nivaer av celler i blod och minska niv5er i BM i bade moss och icke-humana prinnater (Sweeney 2002). Okningen i SDF-1 är troligen p5 grund av konkurrensundantrangandet med dextransulfat frk heparansulfatproeoglykaner som isolerar kemokinen p5 endotelcellsytor eller extracellular matris i BM och andra vavnader. En annan nnojlig mekanisk Sr att dextransulfat interfererar med leukocyter via cell-till-cell-interaktioner, t.ex. leukocytrullning och selektinformedlad leukocytadhesion.

Dextransulfat enligt utf6ringsformerna kan darfor anvandas i samband med donatorlymfocytinfusion (DLI). DLI Sr en adoptiv imnnunoterapi som ibland anvands efter HSCT. I DLI tillfors lymfocyter fr5n den ursprungliga stamcellsdonatorn efter stam- och/eller progenitorstamcellstransplantation f6r att forstarka eft anti-turnorimmunsvar eller sakerstalla att donatorstamcellerna forblir inympade. Wet med denna terapi Sr att inducera en minskning av patientens cancer via GVT-effekten. Donatorlymfocyterna kan darigenom attackera och kontrollera tillvaxten av restcancerceller.

Dextransulfatet enligt utforingsformerna anvands med fordel i kombination med G-CSF for att behandla patienter och forbattra utbytet av mobiliserade celler. SAsom visas i experinnentavsnittet akar den konnbinerade behandlingen med dextransulfat och G-SCF synergistiskt antalet mobiliserade celler, bkle stam- och progenitorceller och olika WBC, jamfort med enbart dextransulfat. Dessutom leder kombinationen av dextransulfat och G-CSF till signifikant hogre nivAer av mobiliserade celler jamfort med kombinationen av plerixafor och G-CSF. Denna synergistiska effekt s'asom ses mellan plerixafor och G-CSF verkar vara annu tydligare f6r kombinationen av dextransulfat och G-CSF. Detta var ovantat sarskilt i sken av Han 1998 dar kombinationen av dextransulfat 10 kDa och G-CSF gay vasentligen samma resultat som att enbart anvanda G-CSF.

En ytterligare aspekt avser darfor en cellmobiliserande sammansattning som innefattar dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall p5 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt salt darav, och G-CSF. Beslaktade utforingsformer av denna aspekt definierar den kombinerade anvandningen av dextransulfat enligt utforingsformerna och G-CSF for nnobilisering av Geller, sarskilt stam- och/eller progenitorceller och/eller WBC och sarskilt lymfocyter i en patient, foretradesvis en manniskopatient.

Den cellmobiliserande sammansattningen innefattar foretradesvis en barare, sasom ett vattenhaltigt losningsmedel. 16 En utforingsform av denna aspekt avser darfor en metod for mobilisering av celler, sasom stannoch/eller progenitorceller och/eller lymfocyter, in i perifert blod hos en patient, foretradesvis manniskopatient. Metoden innefattar administrering av en effektiv mangd dextransulfat enligt utforingsformerna och en effektiv mangd G-CSF eller administrering av den ovan omnamnda cellmobiliserande sannmansattningen till patienten. En annan utforingsform av denna aspekt definierar en kombination av dextransulfat enligt utf6ringsformerna och G-CSF eller den ovan omnamnda cellnnobiliserande samnnansattningen for anvandning i mobilisering av celler, foretradesvis stamoch/eller progenitorceller och/eller lymfocyter, in i perifert blod hos en patient, foretradesvis en manniskopatient. En ytterligare utforingsform av denna aspekt avser anvandningen av en kombination av dextransulfat enligt utforingsformerna och G-CSF eller den ovan omnamnda cellmobiliserande sannnnansattningen for tillverkningen av ett lakemedel for mobilisering av celler, foretradesvis stamoch/eller progenitorceller och/eller lymfocyter, in i perifert blod hos en patient, foretradesvis en manniskopatient.

G-CSF som anvands enligt denna aspekt kan vara fran vilken lamplig G-CSF-kalla som heist inklusive rekombinant eller renat G-CSF. Icke-begransade exennpel innefattar NEUPOGEN® (filgrastinn som är en G-CSF-analog), NEUTROGIN® (lenograstim som är ett rekombinant G-CSF), NEULASTA® (pegfilgrastim som är en polyetylenglykolform av filgrastim). Biologiskt aktiva fragment, variant, derivat eller fusionsmolekyler kan alternativt sett eller dessutom anvandas som G-CSF-kalla om de har fornnagan att mobilisera celler liknande naturligt G-CSF.

For narvarande administreras G-CSF (10 pg/kg) till patienten vane morgon i 4 dagar innan aferes och darefter pa varje aferesmorgon. Detta administreringsprotokoll kan anvandas aven i samband med dextransulfat enligt utforingsformerna, G-CSF administreras saledes foretradesvis till patienten vid en eller nagra tillfallen innan dextransulfatsadministrering och cellskordande, sasom en gang eller tva ganger 1-7 dagar, sasom en gang eller tva ganger 2-4 dagar innan aferes och foretradesvis dessutom pa morgonen pa aferesdagen.

Kombinationen av dextransulfat med G-CSF okar synergistiskt antalet CFC i perifert blod upp till 18000 CFC/ml blod, dvs. mer an 100-faldigt Over kontroll och till synes effektivare jannfort med plerixafor i kombination med G-CSF. I vissa patienter mobiliserar behandling med G-CSF i kombination med plerixafor inte tillrackliga mangder HSC for en efterfoljande transplantation. Att kombinera G-CSF med dextransulfat kan forbattra utbytet av HSC i dessa refraktarpatienter och mojliggora den planerade 17 transplantationen. Den synergistiska okningen i antalet CFC i perifert blod med dextransulfat och GCSF kommer att vara fordelaktig far patienter som genonng5r autolog stamcellstransplantation dar det är problematiskt att erhalla berattigade cellantal fran patienten far att fortsatta med den efterfoljande transplantationen.

I allmanhet maste ett tillrackligt antal HSC erhallas fr5n donatorn i aferesforfarandet far en efterfoljande lyckad transplantation. I den kliniska situationen mats antalet HSC-celler som mangden CD34+-celler i aferesprodukten. Denna mark& har visat vara en konsekvent och stark prediktor p5 inympning efter kemoterapi. Populationen av C034÷-celler är emellertid heterogen och CD34+-markaren är endast en surrogatmarkor for HSC-funktion. I allmanhet är <2,5x6 CD34+-celler per kilo otillrackligt for HSCT och transplantation av >20x6 CD34+-celler kan orsaka inympningssyndrom som är en toxicitet av stamcellstransplantation som sker ovantad och kan ibland vara dodlig. MeIlan dessa antal finns det dokumentation som stadjer att ju fler celler som aterfas desto battre transplantationsutfall eftersom inympning är snabbare, sjukhusvistelsetiden reduceras och darigenom minskas kostnader.

For att lyckas med hematopoetisk stamcellstransplantation, dvs. sakra effektiv och snabb inympning for att undvika infektioner och forhindra sjukdomsaterfall, är det darfor viktigt att mobilisera tillrackliga mangder stamceller i perifert blod.

Oavsett am det är autolog och allogen transplantation är det huvudsakliga malet att uppn5 lyckad inympning. Att misslyckas med detta kommer att resultera i en kritisk situation som kan leda till en patient utan hematologiska och immunologiska system. For att undvika en sadan livshotande situation mAste det sakerstallas att transplantatet inneha'ller tillrackligt med celler for att sakerstalla lyckad inympning. Om cellantalet är far I5gt m5ste den myeloablativa terapin skjutas fram och vardefull tid forloras. Aven efter den myeloablativa terapin kan transplantationen med hogre antal progenitorceller leda till snabbare inympning, vilket kan resultera i ett minskat behov av sjukhusvistelse och stadjande yard. S5som onnnamnts är standardmetoden for att Oka antalet cirkulerande hematopoetiska progenitorceller i blodet att behandla donatorn med G-CSF under flera dagar. Aven med nuvarande behandling (plerixafor och G-CSF) uppnk inte alla patienter tillrackligt cellantal for att berattiga transplantation. Efter transplantationen finns det dessutom en risk for infektion och sjukdomsaterfall. For dessa patienter har dextransulfat potential att fungera som undsattande terapi eller som ett alternativ till plerixafor och G-CSF. 18 Forutom dess effekter pa mobilisering utovar dextransulfatet enligt utforingsformerna ytterligare effekter som skulle kunna ha gynnsamma konsekvenser for HSCT-utfallet. Dextransulfat inducerar omedelbara och forhojda plasmanivaer av hepatocyttillvaxtfaktor (HGF), som är ett hormon med nnitogen effekt pa olika celltyper och som gynnar inympning av transplanterade Geller (Roos 1995 och Zioncheck 1995). HGF fungerar aven som en synergistisk poliferativ faktor pa HSC-tillvaxt da den kombineras med granulocyt/makrofag-kolonistimulerande faktor (GM-CSF) (Kmiecik 1992 och Weimar 1998) saval som kolonibildande av mansklig ryggmarg-blodharrorande HSC inducerad av GM-CSF, GCSF eller M-CSF (Goff 1996). HGF har aven visats delvis aterskapa hematopoes i moss som saknar ckit/SCF, ett signalsystem som är viktigt for tillvaxten och celldelningen av ursprungliga hematopoetiska celler (Yu 1998). HGF i narvaron av erytropoietin inducerar bildandet av BFU-E-kolonier ("erythroid burst-forming unit') fran CD34+-celler (Galimi 1994). Vara resultat visar att dextransulfat inducerar signifikant mer BFU-E jamfort med plerixafor, vilket kan bero pa den tydligare forhojningen i HGF jamfort med plerixafor.

Dextransulfat har, jamfort med nuvarande behandling, potentialen att forbattra mobiliseringen av progenitorceller och andra blodceller och utfallet for den efterfoljande transplantationen pa flera satt, vilket skulle vara av signifikant fordel f6r patienten. Dextransulfat har i allmanhet visats Oka utbytet av cirkulerande WBC, lynnfocyter, HGF och progenitorceller.

En okad mobilisering av dessa specifika celler och tillvaxtfaktorer skulle starkt forbattra utfallet for patienten eftersom det skulle forbattra resultatet av transplantationen pa grund av en bate och snabbare inympning av de transplanterade cellerna. Dextransulfatsbehandling kan reducera risken for infektioner eftersom lymfocytinnehallet och CFU-GEMM verkar Oka, vilket kan f6rkorta neutropenitiden. Detta kommer ocksa att medfora en kortare sjukhusvistelsetid f6r patienten. Mobilisering med dextransulfa kan dessutom mojliggora att fler patienter far HSCT.

En effektivare mobilisering kommer att nninska behovet av upprepat cellskordande fran patienten och minskar darfor risken f6r bieffekter (huvudsakligen fran administrering av G-CSF under rang tid) eftersom behandlingsperioden är forkortad. Dextransulfat akar det totala utbytet av HSC, vilket gynnar patienten genom att uppna den minimala mangden mobiliserade HSC for att berattiga transplantation saval som Oka prediktionen for cellskordande lnympning och malsokning av dextransulfatbehandlade stamceller har visats vara effektivare an obehandlade stamceller i moss (Hayakawa 2009). Detta antyder att f6rutom mojliggora fler 19 transplantationer har dextransulfat potentialen att oka framgansfrekvensen far HSCT genom att aka prediktionsmojligheten for HSC-transplantation, reducera komplikationer efter HSCT, minska behovet av upprepat cellskordande, hjalpa fler patienter na den minimala mangden Geller fOr att berattiga en HSCT och 6ka antalet patienter som far lyckad inympning efter HSCT.

Mekanismen for forbattrad total overlevnad foreslas vara snabbare inympning och ateruppbyggnad av lymfocyter, vilket resulterar i en starkare GVT-effekt, vilket minskar kvarvarande cancer (Porrata 2009). Administrering av dextransulfat atnninstone dubblerar frislappningen av lymfocyter i enkelterapi jamfort med en administrering av G-CSF eller plerixafor. Dextransulfat i kombination med G-CSF dubblerar frisattningen av mobiliserade lymfocyter jannfort med kombinationen av G-CSF och plerixafor.

Dessutonn kommer ett Okat utbyte av lymfocyter aven att vara anvandbart i DLI, vilket är anvandbart for allogen transplantation dar upprepade infusioner med lymfocyter anvands far att forbattra resultatet av transplantationen.

Dessutom orsakar dextransulfat mer an 100-faldig okning av HGF jamfort med baslinjenivaer och 25 ganger mer an plerixafor, vilket ger uttryck i en omedelbar forhojning i HGF (fran < 160 till 16000 pg/ml) redan efter 15 minuter. Dessa nivaer är tillrackligt hoga for att inducera celldelning.

Tabell 1 nedan sammanfattar nagra av de fordelaktiga effekter som uppnas med dextransulfat.

Tabell 1 — fordelar med dextransulfatsbehandling Antagen signifikant fordel f6r patienten Prekliniska effekter med dextransulfat Okadcellinympning,transplantationsutfalloch total overlevnad. Okatantalprogenitorceller.

Dextransulfatsbehandlade celler uppvisar okad inympning.TillsynesmerCFU-GEMM- progenitorceller.

Minskad risk f6r infektioner. Nat antal lymfocyter. Nat antal progenitorceller.

Prediktionsformagaf6rnnobiliseringoch cellskordande. Snabb mobilisering. Okat antal progenitorceller.

Kortare sjukhusvistelsetid. Okat antal lymfocyter. Okat antal progenitorceller. Till synes mer CFU-GEMM-progenitorceller.

Mindre G-CSF-bieffekter. Okat antal progenitorceller. bkad GVT-effekt.bkat antal lymfocyter.

Dextransulfatet enligt utforingsformerna är ett lagmolekylart dextransulfat (LMW-DS) med en medelmolekylvikt inom intervallet 3500 och 9500 Da.

I en sarskild utforingsform har dextransulfatet en medelmolekylvikt i ett intervall pa 4500 och 7000 Da. Foretradesvis har dextransulfatet en medelmolekylvikt i ett intervall pa 4500 och 5500 Da, sasom en medelmolekylvikt pa 4,6 kDa, 4,7 kDa, 4,8 kDa, 4,9 kDa, 5,0 kDa, 5,1 kDa, 5,2 kDa, 5,3 kDa eller 5,4 kDa.

Ett exempel pa dextransulfat som kan anvandas enligt utforingsformerna har en medelmolekylvikt pa 5139 Da och ett polydispersitetsindex (PDI) pa 1,2009.

I en sarskild utforingsform har dextransulfatet en vasentligt smal molekylviktsfordelning. I en sadan utforingsform har de fiesta dextransulfatsnnolekyler en respektive molekylvikt inom det f6redragna intervallet pa 3500 och 9500 Da. I en exempelutforingsform har mindre an 20 % av dextransulfatsmolekylerna en molekylvikt Over 8000 Da, foretradesvis mindre an 15 %, sasom mindre an 10 % eller mindre an 5 % av dextransulfatsmolekylema har en molekylvikt over 8000 Da. Dessutom, eller alternativt sett, har mindre an 40 % av dextransulfatsmolekylerna en molekylvikt under 3000 Da, foretradesvis mindre an 35 %, sasom mindre an 30 % eller mindre 25 % av dextransulfats nnolekylerna en molekylvikt under 3000 Da.

Dextransulfat är ett polyanjoniskt derivat av dextran och innehaller svavel. Medelsvavelinnehallet f6r dextransulfat är foretradesvis 15 till 20 % och annu hellre ungefar 17 %, vilket i allmanhet motsvarar ungefar tva svavelgrupper per glukosylrest. I en sarskild utfOringsform är svavelinnehallet i dextransulfatet foretradesvis lika med eller atminstone nara den maximala mojliga graden av svavelinnehall for dextransulfatsmolekylerna.

Dextransulfatet enligt utf6ringsformerna kan tillhandahallas som ett farmaceutiskt acceptabelt derivat av dextransulfat. Sadana farmaceutiskt acceptabla derivat innefattar salter och solvat av dextransulfat, t.ex. ett natrium- eller kaliumsalt.

Dextransulfat eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav administreras foretradesvis genom injektion till patienten och sarskilt via intravenos (iv.) injektion, subkutan (s.c.) injektion eller 21 intraperitoneal (i.p.) injektion, foretradesvis iv. eller s.c. injektion. Andra parenterala administreringsrutter som kan anvandas innefattar intramuskular och intraartikular injektion. For dessa administreringsrutter är dextransulfatet foretradesvis tillhandahallet i en formulering i vatskeform med ett utvalt losningsmedel eller excipient. Losningsmedlet är foretradesvis ett vattenhaltigt losningsmedel och sarskilt en buffertlosning. Ett icke-begransande exempel pa en sadan buffertlosning är en citronsyrabuffert, sasom citronsyramonohydratbuffert (CAM-buffert), eller en fosfatbuffert. Till exempel kan dextransulfat enligt utforingsformerna losas upp i saltlosning, sasom 0,9 % NaCI-saltlosning, och darefter valfritt buffras med 75 mM CAM och justering av pH till ungefar 5,9 med anvandning av natriumhydroxid. Aven icke-buffrade losningar är mojliga, inklusive vattenhaltiga injektionslosningar 10 sasom saltlosning. Vidare skulle andra buffertsystem an CAM kunna anvandas om en buffrad losning onskas.

Utforingsforrnerna är into begransade till injektioner och andra administreringsrutter kan alternativt sett anvandas inklusive oralt, nasalt, buckalt, rektalt, dermalt, trakealt, bronkialt eller topikalt. Den aktiva foreningen, dextransulfat, fornnuleras da med en lamplig excipient eller barare sonn valjs baserat pa den sarskilda administreringsrutten.

Lampliga dosintervall far dextransulfatet kan variera enligt storleken och vikten pa patienten, tillstandet for vilket patienten ska behandlas och andra overvaganden. Sarskilt for manniskopatienter skulle ett mojligt dosintervall vara fran 1 pg/kg till 150 mg/kg kroppsvikt, foretradesvis fran 1 mg/kg till 50 mg/kg kroppsvikt, och annu hellre fran 5 mg/kg till 25 mg/kg kroppsvikt, sasom fran 5 mg/kg till 20 mg/kg kroppsvikt eller fran 5 mg/kg till 15 mg/kg kroppsvikt. Aven lagre koncentration skulle kunna anvandas sasom 0,5-5 mg/kg kroppsvikt.

Dextransulfatet enligt utforingsformerna kan administreras vid ett enda administreringstillfalle sasom i form av en enda bolusinjektion. Donna bolusdos kan da injiceras ganska snabbt till patienten men kan med fordel ges Over tid sa att dextransulfatlosningen ges Over nagra minuter till patienten sasom under 5 till 10 minuter. Det forvantas allmant att en enda dos och injektion eller infusion (eller faktiskt annan administrering) är tillracklig for att uppna terapeutisk effekt i patienten enligt utforingsformerna. Det är emellertid mojligt att administrera dextransulfatet i flera doser vid olika administreringstillfallen. Till exempel kan en bolusinjektion kompletteras med en forlangd infusion av en dextransulfatslosning.

EXPERIMENT 22 En serie med experiment i moss utfordes far att karakterisera dextransulfats effekter pa mobilisering och f ytterligare kunskap om lampliga doser, skordetid, administreringssatt och effekten jannfort med nuvarande behandling plerixafor (AMD3100) i konnbination med G-CSF (NEUPOGENC).

Moss DBA/2 mosshonor erholls fran Harlan Laboratories (Nederlanderna) och Charles River laboratories (Tyskland). Alla djur hods vid djurenheten pa Uppsala universitet, forvarades under standardforhallanden och tillhandaholls mat och vatten ad libitum enligt institutionens riktlinjer. Djur som var 7-40 veckor gamla och som vagde 17-31 g anvandes. Alla experiment godkandes av den lokala djuretikkommitten, Uppsala, Sverige.

Mobiliseringsprotokoll G-CSF (NEUPOGEN®, Amgen, Holland) anskaffades som steril isoton vattenlosning vid 0,3 nng/mloch spaddes ut i normal saltlosning till en koncentration pa 50 pg/ml. G-CSF administrerades vid en dos pa 2,5 mg som en subkutan injektion, morgon och kvall Dag -2 och Dag -1. Dextransulfat med olika medelmolekylvikter anvandes: Meito — en medelmolekylvikt pa 6 939 Da tillhandahallen av Meito Sangyo co Ltd (Tokyo, Japan) och upplost i citronsyramonohydratbuffert (CAM-buffer!); pKC — en medelmolekylvikt pa 5 139 Da tillhandahallen av pK Chemicals A/S (Kopenhamn, Danmark) och upplost i CAM-buffer! eller 0,9 % NaCI (Fresenius Kabi); samt TdB — en medelmolekylvikt pa 3,3 kDa tillhandahallen av TdB Consultancy (Uppsala, Sverige) och upplost i 0,9 % NaCI (Fresenius Kabi).

AMD3100 k6ptes fran Sigma Aldrich (Tyskland) och lostes upp i normal saltlosning till en koncentration pa 2 mg/ml. Dag 0 administrerades moss 100 mg/kg dextransulfat I.v, eller s.c. eller 5 mg/kg AMD3100 s.c. savida inte annat specificeras. I kontrollgruppen administrerades djuren CAM-buffer! eller NaCI iv. eller s.c. Alla djur fick ungefar 50-100 pl av vardera losning (2,5-5 ml/kg).

Meito Sangyo co Ltd sats N-3188 hade foljande molekylviktsfordelning: Mw 0-300010,61 % Mw 3000-800061,05 % Mw 8000-1200019,38 % Mw 12000-200008,15 % Mw 20000-300000,79 % Mw 30000-400000,01 % 23 Mp5664 Da Mn5240 Da AMw6939 Da PDI1,3242 pK Chemicals A/S sats 31497 hade foljande molekylviktsfordelning: Mw 0-20003,75 % Mw 2000-400030,62 % Mw 4000-600036,64 % Mw 6000-800019,94% Mw 8000-120008,94 % Mw 12000-20000 Mw 20000-30000 Mw 30000-40000 Mp4690 Da Mn4279 Da AMw5139 Da PDI1,2009 TdB Consultancy sats 20341 hade foljande molekylviktsfordelning: Mw 0-200019,26% Mw 2000-400052,01 % Mw 4000-600026,71 % Mw 6000-80002,01 % Mw 8000-12000 Mw 12000-20000- Mw 20000-30000 Mw 30000-40000 Mp3341 Da Mn2557 Da AMw3305 Da PDI1,2924 Mp = toppmedel-molekylvikt 24 Mn = antalmedel-molekylvikt AMw = viktmedel-molekylvikt Kolonibildande cellforsok Perifert blod togs med hjartpunktion under isofluranbedovning med anvandning av EDTA-spolade (0,2 M EDTA framstalld fran en stannlOsning pa 0,5 M EDTA (franntagen av Rudbeck laboratoriet) utspadd 1:2,5 i 0,9 % NaC1) sprutor och overfordes till polypropylenror innehallande 1,6 mg EDTA (Sarstedt, Landskrona, Sverige).

Blod (100-200 pl) overfordes till polypropylenror innehallande heparin (slutlig koncentration 17,5 IE/m1). Erytrocyter f6rbrukades med anvandning av ammoniumkloridlosning (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Kanada). Aterstaende celler aterupplostes i lscoves modifierade Dulbeccos Medium med 2 % fetalt bovinserum (StemCell Technologies) och blandades med 2 ml metylcellulosamedium innehallande tillagg med en cocktail av rekonnbinanta cytokiner (MethoCult 3434; StemCell Technologies) och penicillin-streptomycin enligt tillverkarens instruktioner. Kulturer pa 1,1 ml innehallande HPC spreds ut pa 35 mm diskar (Sarstedt, Landskrona, Sverige) och placerades i en luftfuktad kammare med 5 % CO2 vid 37°C. Totalt antal kolonier raknades pa dag 12 av odling.

Hematologisk analys Perifert blod togs med hjartpunktion under isofluranbedovning med anvandning av EDTA-spolade sprutor och overfordes till EDTA-innehallande polypropylenror (Sarstedt), Fullstandiga blodrakningar erholls med anvandning av en autonnatiserad cellraknare (Advia 2120 hematology systems; Simens healthcare diagnostics Inc, Illinois, USA) vid Sveriges lantbruksuniversitetet (SLU), Uppsala, Sverige.

HGF-ELISA Perifert blod togs med hjartpunktion under isofluranbedovning (savida inget annat anges) med anvandning av EDTA-spolade (0,2 M EDTA framstalld enligt ovan Plasma preparerades genom centrifugering av EDTA blod i 5 minuter vid 3000 g och fros ned vid 20°C tills analys. HGF-ELISA-analys (RnD systems, Minneapolis, USA) utfordes enligt instruktioner fran tillverkaren.

Statistisk Data uttrycks som nnedelvarden plus och minus SEM. Jamforelse nnellan grupper utfordes med anvandning av Students t-test (tvasvandad, sannma varians). Statistiska analyser utfordes med anvandning av Microsoft Excel. Skillnader vid ett p-varde mindre an 0,05 ansags vara statistiskt signifikant.

Dextransulfat, s.c. dosfinnande studie pa cellmobilisering i perifert blod Moss (DBA/2N, 8-14 veckor, Charles River) behandlades med s.c. injektioner av dextransulfat (10, 50, 150 och 500 mg/kg, pKC), AMD3100 (5 mg/kg, positiv kontroll) eller CAM-buffert (negativ kontroll). Den anvanda dosen for AMD3100 och 1 timma f6r cellskordande hade rapporterats sonn optimal dosregimen for detta lakemedel i moss (Broxmeyer 2005). Blod analyserades med anvandning av hematologisk analys enligt ovan. I mer detalj offrades moss 3 tinnnnar efter sista injektionen (1 tinnma for AMD3100) och hematologisk differentiell analys utfordes i perifert blod. Serum- och/eller plasmaprov samplades in och lagrades i -20°C tills analys. Blod samlades in via hjartpunktion med EDTA-spolade sprutor och blandades med EDTA och lepirudin for cellrakningsanalysen och endast EDTA for HGF-analysens.

Det var en dosberoende 6kning i cirkulerande vita blodkroppar (WBC), huvudsakligen lymfocyter (Fig. 1) och HGF (Fig. 2) 3 timnnar efter dextransulfatsadministrering. Doser pa 10-50 mg/kg dextransulfat och AMD3100 5 mg/kg visade liknande effekter medan effekterna hos 150 och 500 mg/kg dextransulfat var signifikant okade (p<0,001 respektive p<0,01) jamfort med AMD3100-effekt. Adnninistrering av dextransulfat vid bade 150 och 500 mg/kg gay upphov till signifikant (p<0,001) okade nivaer (Fig. 2) av cirkulerande HGF, vilka var tydligare an AMD3100.

Tabell 2 sammanfattar blodparametrarna efter administrering av dextransulfat (LMW-DS) respektive AMD3100. Tabellen indikerar de hematologiska variablerna i perifert blod efter administrering av LMWDS eller AMD3100 *fort med kontroll (CAM, *p< 0,05, **p< 0.01, ***p< 0.001) eller jamfort med AMD3100 (tp< 0.05, ttp< 0.01, tttp< 0.001).

Tabell 2 — Hemato ogiska variabler i perifert blod efter administering av LMW-DS Kontroll LMW-DS LMW-DS LMW-DS LMW-DS AMD3100 mg/kg mg/kg 150 mg/kg 500 mg/kg Erytrocyter 9,1 ±0,1 9,0± 9,2 ± 0,4t 8,3 ± 0,6 9,4 ± 0,2ttt 8,0 ± 0,0*** 26 0,0ttt Hemoglobin 127,5± 122,0± 127,8 ± 5,0t 113,3 ± 8,2 130,3± 112,5± 1,9 1,711 3,1tt 0,9*** Hennatokrit 0,4 ± 0,0 0,4 ± 0,0t 0,4 ± 0,0t 0,3 ± 0,0 0,4 ± 0,0tt 0,3 ± 0,0*" MCV 42,6 ± 0,3 41,9 ± 0,1 42,6 ± 0,3 41,7 ± 0,4 42,4 ± 0,3 42,7 ± 0,6 MCHC 329,3 ± 323,7 ± 324,3 ± 1,4t 329,3 ± 4,9 327,3 ± 2,332,0 ± 2,0 1,8 3,8 Retikulocyter 202,9 ± 222,7 ± 230,1 ± 64,6 243,7 ± 224,5 ± 186,3 ± 73,6,3 23,7 35,2 23,7 Blodplattar 946,8 ± 1083,3 ± 902,0 ± 96,4 893,5 ± 893,5 ± 706,8 ± 37,1 116,3t 60,8t 61,0tt 30,7** MPV 8,0 ± 0,1 7,7 ± 0,2 7,9 ± 0,1 7,2 ± 0,7,9 ± 0,1 8,0 ± 0,1 Leukocyter 5,2 ± 0,7 9,0 ± 1,2* 9,4 ± 0,7** 15,7± 21,8± 7,8 ± 0,6* (WBC) 0,4***/ttt 2,5***/tt Neutrofiler 1,0 ± 0,1 1,9 ± 0,4 1,5 ± 0,2 2,4 ± 0,3** 2,7± 1,8 ± 0,2* 0,3**/t Eosinofiler 0,1 ±0,0 0,2 ± 0,01- 0,2 ± 0,0 0,3 ± 0,1* 0,4 ± 0,1* 0,3 ± 0,0* Lymfocyter 3,8 ± 0,6,1 ± 0,5** 7,3 ± 0,6**/t 12,4 ± 17,9 ± 5,3 ± 0,4 0,2***/t11 2,2***At Monocyter 0,3 ± 0,0* 0,6 ± 0,0tt 0,3 ± 0,1 0,4± 0,5 ± 0,1*/t 0,3 ± 0,0 0,0*/tt LUC 0,03 ± 0,1 ± 0,0* 0,1 ± 0,0* 0,1 ± 0,3 ± 0,2 0,05 ± 0,0* 0,0* 0,0***/tt Basofiler 0,01 ± 0,0 0,02 ± 0,0 0,03 ± 0,0 0,1 ± 0,0" 0,1 ± 0,0* 0,03 ± 0,0 n= 4 3 4 4 4 4 MCV: medelkorooskularvolvm MCHC: medelkorbuskular hennoalobinkoncentration MPV: medelblodplattsvolumWBC: vita blodkropparLUC: lukocyter Enheter: Erytrocyter 12 celler/l, andra celler 9 celler/l, MCV (f1), MCHC (g/l), HOT (g/1) Dextransulfat, i.v. dosfinnande studie pa cellmobilisering i perifert blod Mobilisering utfordes pa DBA/201aHsd-moss (7-12 veckor, Harlan) med anvandning av 25-200 mg/kg dextransulfat (Meito) iv. Som positiva och negativa kontroller anvandes AMD3100 (5 ring/kg, s.c.) eller 27 CAM-buffert (i.v.). Blod analyserades med anvandning av CFC-analys och hematologisk analys enligt ovan.

Jamfort med AMD3100 (5 mg/kg) och kontroll-CAM-buffert inducerade enstaka i.v.-injektioner av dextransulfat (25, 50, 100 och 200 mg/kg, Meito) en signifikant 6kning i WBC (p<0,01), huvudsakligen lymfocyter (p<0,001) i perifert blod redan 30 minuter efter dextransulfatsinjektion (Fig. 3). Mobiliseringsnivaerna erhallna med de fyra dextransulfatsdoserna var signifikant 6kade jannfort med AM 03100.

Dextransulfats mobiliseringseffekt pa CFC var ocksa signifikant pataglig redan vid den lagsta givna dosen (25 mg/kg, p<0,001). Effekten verkade 6ka pa ett dosberoende sat, Effekten efter 200 mg/kg dextransulfat var liknande den hos AMD3100, 5 mg/kg, med avseende pa total CFC (Fig. 4A och 4B).

Okningen i CFC efter endosadnninistrering av AMD3100 (s.c.) och dextransulfat (i.v.) var h6gre (6-12 ganger aver kontroll) *fort med den allmanna 6kningen av WBC (3-5 ganger over kontroll). Detta kan antyda en specifik mekanism pa mobilisering av progenitorceller (Fig. 4A och 4B).

Mobiliseringseffekten pa olika subtyper av progenitorceller, CFU-GM, CFU-GEMM och BFU-E studerades ocksa (Fig. 4A och 4B) och dextransulfat verkade 6ka BFU-E mer an AMD3100.

Dextransulfat, effekt av administreringsrutt pa cellmobilisering till perifert blod Mobilisering utfordes pa DBA/2N-moss (9-10 manader, Charles River) med anvandning av 100 mg/kg dextransulfat (Meito i.v. och s.c.). Blod analyserades med anvandning av CFC-analys och hematologisk analys enligt ovan.

Effekterna pa perifera blodceller efter administrering av 100 mg/kg dextransulfat i.v. och s.c. jamfordes (n=5). Celler sk6rdades 30 minuter efter administrering for !Dada administreringsrutter. Det fanns inga signifikanta skillnader pa cirkulerande WBC, lymfocyter, CFC eller CFC-subtyper 30 minuter efter de olika administreringsrutterna, se Tabell 3.

Tabell 3 — jamforelse pa blodparametrar for s.c. och i.v. administrering s.c. LMW-DSi.v. LMW-DS WBC, *9/112,5± 1,116,2 ± 1,8 28 Lymfocyter, *9/1 9,9 ± 1,2 12,6 ± 1,7 CFC, *9/1 692 ± 111 712 ± 17 CFC-GM, *9/1 604 ± 83 592 ± 172 CFC-GEMM, *9/1 28 ± 28 ± BFU-E, *9/1 60 ±22 92± 12 Dextransulfat, tid-effektforhallande pa cellmobilisering i perifert blod Mobilisering utfordes pa DBA/2N-nnoss (8-14 veckor, Charles River) med anvandning av 50 mg/kg dextransulfat (pKC, iv.) eller 100 mg/kg dextransulfat (Meito, iv.). Som negativ kontroll anvandes CAM-buffert (iv). Blod analyserades med anvandning av CFC-analys, hematologisk analys och HGFELISA.

Mobiliseringseffekten av iv. administrerad dextransulfat (100 mg/kg) uppvisade de h6gsta antal WBC och lymfocyter runt 30 minuter och sjonk men var fortfarande forhojda vid 3 timmar efter administreringen. En mycket snabb 6kning av CFC med en topp som borjar redan vid 7,5 minuter efter administrering (Fig. 5) kunde ses. De olika subtyperna av progenitorceller toppade vid nagot olika tidpunkter BFU-E vid 7,5 minuter och CFU-GM/CFU-GEMM mellan 15-30 minuter efter administrering. HGF okade till den h6gsta nivan efter 15 minuter (15960 pg/ml) och avtog darefter. HGF uppmattes emellertid i ett annat exempel och mattes inte vid 7,5 minuter (se Tabell 4). AMD3100 okade HGF- nivaer till 650±230 pg/ml en timma efter administrering Tabell 4 - cellmobilisering efter iv. administrering av dextransu fat (LMW-DS) CAM LMW-DS 7,5 min LMW-DS min LMW-DS min LMW-DS 1 timma LMW-DS 3 timmar WBC,*9/I 3,9 ± 0,5,6 ± 0,5* 10,2 ± 0,7*** 14,6 ± 1,3*** 11,2 ± 0,6*** 6,8 ± 1,0* Lymf,*9/I 2,2 ± 0,2 4,6 ± 0,5*** 8,9 ± 0,7*** 12,3 ± 1,1*** 8,8 ± 0,5*** 5,2 ± 0,8** PLT, *9/1 998± 34 1034 ± 31 1122 ± 58 978± 64 965 ± 23 936± 26 HGF, pg/ml <160 n.a. 15960± 1450*** 13800± 1100*** 7740 ± 510*** 710± 230** Saledes okade iv, administrering av dextransulfat (100 mg/kg) i mass snabbt antalet WBC och sarskilt lymfocyter (Lymf) i perifert blod jamfort med kontroll (CAM). Dextransulfat paverkade inte antalet blodplattar (PLT). Dextransulfat okade ocksa snabbt nnangden HGF i plasma. Resultat rapporteras i 29 Tabell 4 som medel ± SEM, n.a. = inte analyserad. Statistik presenteras jamfort med CAM-buffert, *p<0.05, "p<0.01, and ***p<0.001.

Dextransulfat I kombination med G-CSF pa cellmobilisering i perifert blod Standardbehandling av patienter innan aferes är baserad pa dagliga injektioner av G-CSF fran upp till en vecka. Kliniskt skulle dextransulfat kunna anvandas i kombination med G-CSF. I en studie i moss administrerades 2,5 pg/djur G-CSF tva ganger dagligen (8 timmar emellan) i 2 dagar (Broxmeyer 1999). F6r att undersoka effekten av kombinationen av G-CSF och dextransulfat behandlades DBA/20IaHsd-nnoss (10-15 veckor, Harlan) med G-CSF 12 dagar (Neupogen, 2x2,5 pg/dag, s.c.) och injicerades pa dag 3 antingen med dextransulfat (100 mg/kg, Meito, iv), CAM (negativ kontroll, iv.) eller AMD3100 (positiv kontroll, 5 mg/kg, s.c.). Blod analyserade med anvandning av CFC-analys och hematologisk analys.

G-CSF okade antalet WBC jamfort med normalt (se Fig. 1 och 3 far endast CAM-administrering) och tillsats av dextransulfat (25 och 100 mg/kg) 6kade WBC- och lymfocytantalet synergistiskt. Okningen i WBC och lymfocyter var signifikant mer markant an efter AMD3100-administrering (5 mg/kg) (Fig. 6).

Tillsats av dextransulfat i en dos pa 100 mg/kg till G-CSF medf6r en omfattande och synergistisk okning i progenitorceller i perifert blod och dextransulfat verkade vara effektivare som mobiliseringsamne an AMD3100 (Fig. 7A och 7B). Kombinationen av dextransulfat och G-CSF mobiliserade mer CFU-GEMM- och BFU-E-progenitorceller (Fig. 73) jamfort med konnbinationen av GCSF och AMD3100.

De utforda experimenten visade ett dos-effekt-forhallande f6r dextransulfat pa mobilisering av WBC, lymfocyter och CFC bade efter s.c. och iv. administrering. Okningen av CFC verkade vara h6gre (6-12 ganger over kontroll) jamfort med den allmanna okningen i WBC (4-5 ganger over kontroll). Tidseffekten av iv. administrerat av dextransulfat (100 mg/kg) var en snabb okning i CFC, WBC och lymfocyter. Toppen b6rjade redan efter 7,5 minuter, vilket var signifikant tidigare an for AMD3100. Kombinationen av dextransulfat med G-CSF visade en ovantad och markant okning i CFC i perifert blod till upp till 18000 CFC (mer an 100-faldigt Over kontroll) och till synes effektivare jamfort med AMD3100 i kombination med G-CSF, se Fig. 8. Dextransulfatsadministrering resulterade i en signifikant hogre mobilisering av WBC och lymfocyter och verkade aven mobilisera mer BFU-E i monoterapi jannfort med en optimal dos av AMD3100. Dextransulfatsadministrering i kombination med G-CSF resulterade i en signifikant h6gre mobilisering av WBC och lymfocyter och verkade aven mobilisera mer CFU, BFU-E och CFU-GEMM jamfort med AMD3100, se Fig. 7A, 7B, 8 och 9. Dextransulfat okade HGF i plasma till h6ga nivaer (fran <160 till 16000 pg/nnl) 15 nninuter efter administrering, 25-faldigt mer an AMD3100 efter 1 timma.

Jamforelse pa mobilisering av hematopoetiska celler med lagmolekylart dextransulfat med olika medelmolekylvikter Djur DBA/20Ia-mosshonor (Harlan, Holland) halls vid djurenheten pa Uppsala universitet, forvarades under standardforhallanden och tillhandaholls mat och vatten ad libitum. Djur som vagde 17-22 g anvandes.

Experimentuppsattning DBA/2-honor grupperades i fyra grupper: 1) medium (NaCI-vattenlosning) (n=8), 2) 50 mg/kg dextransulfat DS3 (n=5), 3) 50 mg/kg dextransulfat DS5 (n=5) och 4) 50 mg/kg dextransulfat DS5 PNB (n=5). Grupp 4) bedovades med natriumpentobarbital (PNB) istallet for isofluran for att utvardera om en andring i anestesiprotokoll Overkar mobilisering.

Administrering av substans DS5 (medel-Mw 5,1 kDa, pKC Danmark, sats 31497) och DS3 (medel-Mw 3,3 kDa, TdB Consultancy. Uppsala Sverige, sats 20341) lostes upp i 0,9 % NaCI (Fresenius Kabi) till 20 mg/ml och filtrerades genom 20 pm filter for att erhalla en steril losning. Djuren fick 2,5 ml/kg (ungefar 50 pl) intravenost genom svansvenen.

Hematologisk analys Resultaten visas i Fig. 10 och Tabell 6. DS3 uppvisade inte nagon signifikant forandring i total WBC eller lymfocyter medan en svag minskning i neutrofiler rapporterades.

Tabell 6 — hematologiska variabler i perifert blod efter administrering av dextransulfatsubstanser Enhet Medium DS3 DSDS5 PNB Blodplattar 9/I 943±925±950±31 980±11 Hemoglobin g/I 128±2 128±4 129±3 135±2* Erytrocyter 12/I 10±0,1 9,6±0,2 9,7±0,2 10,1±0,2* Hematokrit (EFV) 0,42±0,000,42±0,008 0,43±0,008 0,44±0,01* MCV fl 44±0,3 44±0 44±0,4 44±0,3 31 MCHC g/I 308±1 302±6 305±1 304±4 Retikulocyter 9/1 3±0,4 3±0,4 4±0,6 4±0,4 Leukocyter (WBC) 9/1 3±0,2 3,0±0,4 10,1±1,0*** 8,5±0,7*** Neutrofiler 9/1 1,0±0,1 0,7±0,1* 1,4±0,2* 0,8±0,2 Eosinofiler 9/1 0,1±0,02 0,1±0 0,1±0 0,1±0 Basofiler 9/1 0,1±0 0,1±0 0,1±0 0,1±0 Lymfocyter 9/1 2±0,1 2,2±0,4 8,5±0,9*** 7,4±0,7*** Monocyter 9/1 0,05±0,02 0,02±0,02 0,1±0 0,06±0,02 Tid for blodprov efter DS min 31±0,3 32±0,4 31±0,2 33±1,4 MVC=Medelkorpuskularvolym; MCHC=Medelkorposkular hemoglobinkoncentration Hematologiska variabler *fort nned medium (NaCI): *p <005, **p <0.01. ***p <0.001 Kolonibildande cellanalys Resultaten visas i Fig. 11. DS3 inducerade inte en signifikant okning i antalet CFC.

Hepatocyttillvaxtfaktor DS5 inducerade en signifikant okning i HGF oberoende anvandningen av bedovningsmedel. Substansen med lagre molekylvikt (DS3) uppvisade ingen signifikant okning i HGF, se Fig. 12.

Sammanfattning Data som presenteras had visar att DS3 är ett daligt mobiliseringsamne jamfort nned DS5. DS3 'akar inte HGF i n5gon utstrackning bortom medium De utforingsformer som beskrivs ovan ska forstas som n5gra f5 belysande exempel p5 den foreliggande uppfinningen. Det kommer att forstAs av fackmannen att olika modifieringar, kombinationer och forandringar kan g6ras f6r utf6ringsformerna utan att avvika fran den foreliggande uppfinningens onnfattning. Sarskilt s5 kan olika dellosningar i olika utforingsformer kombineras i andra konfigurationer dar tekniskt mojligt.

REFERENSER Broxmeyer et al. (1999) "Dominant myelopoietic effector functions mediated by chemokine receptor CCR1" J Exp Med 189(12): 1987-92 32 Broxmeyer et al. (2005) "Rapid mobilization of murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with AMD3100, a CXCR4 antagonist" J Exp Med 201(8): 1307-18 Chemaly et al. (2006) "Respiratory viral Infections in adults with hematologic malignancies and human stem cell transplantation recipients" Medicine 85(5): 278-287 CHMP Assessment Report Mozobil (plerixafor) Procedure No. EMEA/H/C/001030, 2009 Cooper et al. (1997) "Erythroid burst-forming units (BU-E) predict hematopietic recovery after 10 peripheral blood progenitor cell transplantation in patients with advanced breast cancer" Bone Marrow Transplantation 19: 1089-94 CopeIan (2006) "Hematopoietic Stem-cell Transplantation" N Engl J Med 354: 1813-26 Galimi et al. (1994) "Hepatocyte growth factor induces proliferation and differentiation of multipotent and erythroid hematopoietic progenitors" J Cell Biol 127(6 Pt 1): 1743-54 Goff et al. (1996) "Synergistic effects of hepatocyte growth factor on human cord blood CD34+ progenitor cells are the result of c-met receptor expression" Stem Cells 14(5): 592-602 Han et al. (1998) "Effect of combination of DS and G-CSF on mobilization of peripheral hematopoietic progenitors in mice" Journal of Experimental Hematology 6: 29-31 Hassan et al. (1997) "Factors influencing hematological recovery after allogeneic bone marrow transplantation in leukaemia patients treated with methotrexate-containing GVHD prophylaxis" Support Care Cancer 5: 299-306 Hayakawa et al. (2009) "Dextran sulfate and stromal cell derived factor-1 promote CXCR4 expression and improve bone marrow homing efficiency of infused hematopoietic stem cells" J Nippon Med Sch 76(4): 198 Hiwase et al. (2008) "Higher infused lymphocyte dose predicts higher lymphocyte recovery, which in turn, predicts superior overall survival following autologous hematopoietic stem cell transplantation for multiple myeloma" Biol Blood & Marrow Transpl 14: 116-24 33 Kalatskaya et al. (2009) "AMD3100 is a CXCR7 ligand with allosteric agonist properties" Mol Pharmacol 75(5): 1240-7 Kmiecik et al. (1992) "Hepatocyte growth factor is a synergistic factor for the growth of hematopoietic progenitor cells" Blood 80(10): 2454-7 Lapidot et al. (2003) "Current understanding of factors influencing stem cell mobilization" Hematology (Am Soc Hematol Educ Program), 419-37 MozobilTM Product Monograph, moZoBilTM (plerixafor injection), genzyme Pablos et al. (2003) "Synoviocyte-derived CXCL12 is displayed on endothelium and induces angiogenesis in rheumatoid arthritis" J Immunol 170: 2147-52 Porrata et al. (2004a) "Infused peripheral blood autograft absolute lymphocyte count correlates with day 15 absolute lymphocyte count and clinical outcome after autologous peripheral hematopoietic stem cell transplantation in non-Hodgkin's lymphoma" Bone Marrow Transpl 33: 291-8 Porrata et al. (2004b) "The dose of infused lymphocytes in the autograft directly correlates with clinical outcome after autologous peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation in multiple myeloma" Leukemia 18: 1085-92 Porrata (2009) "Clinical Evidence of Autologous Graft versus Tumor Effect" Am J lmnnunol 5(1): 1-7 Roodman et al. (1987) "CFU-GEMM correlate with neutrophil and platelet recovery in patients receiving autologous marrow transplantation after high-dose melphalan chemotherapy" Bone Marrow Transpl 2: 195-73 Roos et al. (1995) "Induction of liver growth in normal mice by infusion of hepatocyte growth factor/scatter factor" Am J Physiol 268(2 Pt 1): 380-6 Sweeney et al. (2000) "Mobilization of stem/progenitor cells by sulfated polysaccharides does not require selectin presence" PNAS 97(12): 6544-49 34 Sweeney et al. (2002) "Sulfated polysaccharides increase plasma levels of SDF-1 in monkeys and mice: involvement in mobilization of stem/progenitor cells" Blood 99(1): 44-51 Weimar et al. (1998) "Hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) is produced by human bone marrow stromal cells and promotes proliferation, adhesion and survival of human hematopoietic progenitor cells (CD34+)" Exp Hematol 26(9): 885-94 Yu et al. (1998) "Stimulatory effects of hepatocyte growth factor on hennopoiesis of SCF/c-kit system-10 deficient mice" Stem cells 16(1): 66-77 Zioncheck et al. (1995) "Sulfated oligosaccharides promote hepatocyte growth factor association and govern its mitogenic activity" J Biol Chem 270(28): 16871-8

Claims (14)

PATENTKRAV

1. Dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall p5 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, for anvandning i mobilisering av progenitor- och/eller stamceller in i perifert blod hos en patient.

2. Dextransulfatet enligt patentkrav 1, van progenitor- och/eller stamcellerna är kolonibildande celler valda fran en grupp som bestar av kolonibildande enhet — granulocyt, erytrocyt, monocyt, megakarocyt (CFU-GEMM) och BFU-E ("burst forming unit-erythtrocyte"). 10

3.Dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt derivat darav, for anvandning i mobilisering av vita blodkroppar, sarskilt lynnfocyter, in i en patients blodbana. 4. Dextransulfatet enligt n5got av patentkrav 1 till 3 med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 4500 och 7000 Da. 5. Dextransulfatet enligt patentkrav 4 med en medelmolekylvikt i ett intervall p5 4500 och 5500 Da. 6. Dextransulfatet enligt nAgot av patentkrav 1 till 5, van i dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla derivatet darav, har ett medelsvavelinneh511 i ett intervall fran 15 till 20 %, och foretradesvis ungefar 17%. 7. Dextransulfatet enligt n5got av patentkrav 1 till 6, van i dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla derivatet darav, är formulerat som en vattenhaltig injektionslosning. 8. Dextransulfatet enligt n5got av patentkrav 1 till 7, van i dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla derivatet darav, är formulerat for att administreras vid en dos i ett intervall fran 1 till 50 mg/kg kroppsvikt hos patienten, foretradesvis fran 5 till 25 mg/kg kroppsvikt hos patienten och annu hellre fr5n 5 till 15 mg/kg kroppsvikt hos patienten, 9. Dextransulfatet enligt n5got av patentkrav 1 till 8, van i dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla derivatet clarav, ska administreras till en manniskopatient inom ett interval] frail ungefar 0 timmar till ungefar 6 timmar innan en tidpunkt for mobilisering av cellerna in i manniskopatientens blodbana. 36 10. Dextransulfatet enligt patentkrav 9, van i dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla derivatet darav, ska administreras till manniskopatienten inom ett intervall fran ungefar 0 timnnar till ungefar 4 timmar innan tidpunkten f6r mobilisering av cellerna in i manniskopatientens blodbana. 11. Dextransulfatet enligt nagot av patentkrav 1 till 10, van i dextransulfatet, eller det farmaceutiskt acceptabla derivatet darav, är formulerat for kombinerad anvandning med granulocytkolonistimulerande faktor (G-CSF) i mobilisering av cellerna in i perifert blod hos patienten. 10 12.Dextransulfatet enligt patentkrav 11, van i G-CSF ska administreras till patienten en eller tva ganger 2-4 dagar innan en tidpunkt for mobilisering av cellerna in i patientens blodbana och foretradesvis dessutom pa en dag f6r tidpunkten f6r mobilisering av cellerna in i patientens blodbana. 13. En cellmobiliserande sammansattning innefattande dextransulfat med en medelmolekylvikt i ett intervall pa 3500 och 9500 Da, eller ett farmaceutiskt acceptabelt salt darav, och granulocytkolonistimulerande faktor (G-CSF). 14. Sammansattningen enligt patentkrav 13, vidare innefattande ett vattenhaltigt losningsnnedel. 15. En cellmobiliserande sammansattning enligt patentkrav 13 eller 14 f6r anvandning som ett lakennedel. 16. En cellmobiliserande sammansattning enligt patentkrav 13 eller 14 f6r anvandning i mobilisering av progenitor- och/eller stamceller in i perifert blod hos en patient. 17. En cellmobiliserande sammansattning enligt patentkrav 13 eller 14 for anvandning i mobilisering av vita malblodkroppar, sarskilt lymfocyter, in i en patients blodbana. BMiatil 00S 1 OOTECINV .6!d OMPaw: OSIalOu-WS 50. --MiAtiSCI-MA1 8)1/13w 0IOAIVD) Sa -AAN1aPtlaA nEr * 0 4441* 0101 e*** slItidoy,tnaNs a:IA.)0g dDOM. 0,0E 1/60 1, silo° HGF concentration (pg/mL) 25000 15000 10000 t**:*.t tit *** r 4. Ad•-,fr-

4. MWDS LMW-DS LMW-DS IMW-DS AMD3100 mg/kg 50 mg/kg 150 mg/kg 500 mg./kg