BR112015028270B1 - Composição de mobilização de células para uso na mobilização de células progenitoras e/ou células tronco - Google Patents

Abstract

SULFATO DE DEXTRANO PARA USO NA MOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS O sulfato de dextrano numa faixa de 3500 e 9500 Da é utilizado para mobilizar células, tais como as células estaminais e/ou progenitoras e certos leucócitos, particularmente linfócitos, para dentro do sangue periférico de um indivíduo. O sulfato de dextrano tem um efeito de mobilização de células muito rápido que implica que qualquer colheita de células pode ser iniciada quase imediatamente após a administração de sulfato de dextrano.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] As modalidades geralmente se referem a mobilização de células na corrente sanguínea de um sujeito.

FUNDAMENTOS

[0002] Células tronco e células progenitoras são células imaturas, com capacidade para se dividirem e desenvolverem para formar qualquer tipo de célula do sistema maduro. Células tronco hematopoiéticas (HSC) são capazes de produzir as células do sistema imunológico e medula óssea. Transplante de HSC (TCTH) é usado para restaurar a hematopoiese normal em um paciente para tratar diversas doenças após quimioterapia ou radioterapia. Durante as últimas duas décadas, TCTH tornou-se um tratamento clínico de rotina para uma variedade de condições, incluindo mieloma múltiplo (MM), Linfoma não-Hodgkin (NHL) e condições que exigem transplante de enxerto. Apesar das aparentes melhorias nos últimos anos, o procedimento ainda é associado a uma taxa comparativamente alta de morbidade e mortalidade devido a complicações e recidiva da doença subjacente. Há também uma necessidade contínua para melhorar as fontes de células tronco, procedimentos de colheita de células, regimes de condicionamento e tratamento imunossupressor. Existem dois tipos principais de TCTH, ou alogênico - com células tronco provenientes de um doador saudável compatível, ou autólogo - quando as células tronco são coletadas e depois devolvidas ao mesmo paciente após terapia de condicionamento de quimioterapia/radioterapia de alta dose. Em TCTH alogênico e particularmente autólogo, sangue periférico hoje substituiu quase completamente a medula óssea como fonte de células tronco. Sangue periférico como fonte de células é preferencial, uma vez que envolve um procedimento menos invasivo para o doador e enxerto de células transplantadas é mais rápido em comparação ao uso da medula óssea como a fonte de células.

[0003] Apesar das aparentes melhorias nos últimos anos, o procedimento ainda é associado a uma taxa comparativamente alta de morbidade e mortalidade devido a complicações relacionadas a transplantação (principalmente alogênica) e recidiva da doença subjacente (principalmente autóloga). Portanto, há uma necessidade contínua para melhorar as fontes de células tronco, protocolos de colheita de célula, regimes de condicionamento e tratamento imunossupressor.

[0004] Hoje, células tronco são mobilizadas para o sangue periférico por tratamento do doador com fator de estimulação de colônias de granulócitos (G-CSF) e as células são colhidas por aférese para transplante posterior. Após a infusão na corrente sanguínea do receptor, as células hematopoiéticas saudáveis migram para a medula óssea, onde eles podem se diferenciar para produzir células sanguíneas maduras e restaurar a hematopoiese. Recentemente plerixafor (MOZOBIL™, AMD3100, 1,1'- [1,4-fenilenobis (metileno)]-bis-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano) foi aprovado em combinação com G-CSF para aumentar a mobilização de células progenitoras em pacientes com MM e NHL.

[0005] Uma limitação significativa com o tratamento combinatório com G-CSF e plerixafor é a lentidão na mobilização de células tronco. Embora dados experimentais em camundongos indiquem um pico em células tronco mobilizadas depois de 1 hora após a administração de plerixafor (Broxmeyer 2005), o pico correspondente em humanos começa primeiro por volta das 9 horas após a administração de plerixafor (Monografia de Produto Mozobil™). Desse modo, a colheita de células tronco mobilizadas é adiada até cerca de 11 horas após a administração de plerixafor, implicando longos períodos de hospitalização (Monografia de Produto Mozobil™). É, portanto, a prática que o plerixafor precisa para ser administrado no dia anterior ao da verdadeira colheita de células.

[0006] Sweeney 2000 e Sweeney 2002 investigaram os efeitos de polissacarídeos sulfatados, incluindo 10 kDa de sulfato de dextrano, na mobilização de células tronco/progenitoras em camundongos e macacos. Em camundongos e macacos, sulfato de dextrano resultou na mobilização de células formadoras de colônia (CFC) após 3 horas e 6 horas, respectivamente, a partir da administração de sulfato de dextrano. Os resultados apresentados em Sweeney 2000 e Sweeney 2002, portanto, parecem indicar que sulfato de dextrano é cerca de três vezes mais lento em comparação ao plerixafor em termos de mobilização de células tronco/progenitoras.

RESUMO

[0007] É um objetivo geral prover uma mobilização eficiente de células-alvo na corrente sanguínea de um sujeito.

[0008] É outro objetivo geral prover um alto nível de células-alvo mobilizadas na corrente sanguínea de um sujeito.

[0009] Estes e outros objetivos são atendidos por modalidades divulgadas neste documento.

[00010] Um aspecto das modalidades se refere a sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio em um intervalo de 3500 e 9500 Da, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso na mobilização de células tronco e/ou progenitoras no sangue periférico de um sujeito. Um aspecto relacionado das modalidades define o uso de sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio em um intervalo de 3500 e 9500 Da, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, para a fabricação de um medicamento para a mobilização de células tronco e/ou progenitoras no sangue periférico de um sujeito. Outro aspecto relacionado às modalidades define um método de mobilização de células tronco e/ou progenitoras no sangue periférico de um sujeito. O método compreende a administração de uma quantidade eficaz de sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio em um intervalo de 3500 e 9500 Da ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, para o sujeito.

[00011] Outro aspecto das modalidades se refere ao sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio em um intervalo de 3500 e 9500 Da ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso na mobilização de glóbulos brancos alvo, em particular linfócitos, na corrente sanguínea de um sujeito. Um aspecto relacionado das modalidades define o uso de sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio em um intervalo de 3500 e 9500 Da, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, para a fabricação de um medicamento para a mobilização de glóbulos brancos alvo, em particular linfócitos, na corrente sanguínea de um sujeito. Outro aspecto relacionado das modalidades define um método de mobilização de glóbulos brancos alvo, em particular linfócitos, na corrente sanguínea de um sujeito. O método compreende a administração de uma quantidade eficaz de sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio em um intervalo de 3500 e 9500 Da ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, para o sujeito.

[00012] Um aspecto adicional das modalidades se refere a uma composição de mobilização de célula compreendendo sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio em um intervalo de 3500 e 9500 Da, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo e fator de estimulação de colônias de granulócitos (G-CSF). Outros aspectos relacionados às modalidades definem uma composição de mobilização de célula compreendendo sulfato de dextrano tendo uma média molecular dentro de um intervalo de 3500 e 9500 Da, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo e G-CSF para uso na mobilização de células tronco e/ou progenitoras no sangue periférico de um sujeito e/ou para uso na mobilização de glóbulos brancos alvo, em particular linfócitos, na corrente sanguínea de um sujeito. Aspectos relacionados adicionais das modalidades definem o uso de uma composição de mobilização de célula compreendendo sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio com um intervalo de 3500 e 9500 Da, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, e G-CSF para a fabricação de um medicamento para a mobilização de células tronco e/ou progenitoras no sangue periférico de um sujeito e/ou para a mobilização de glóbulos brancos alvo, em particular linfócitos, na corrente sanguínea de um sujeito. Ainda outros aspectos relacionados às modalidades definem um método de mobilização de células tronco e/ou progenitoras no sangue periférico de um sujeito ou mobilizar glóbulos brancos alvo, em particular linfócitos, na corrente sanguínea de um sujeito. O método compreende administrar uma quantidade eficaz, ao sujeito, de uma composição de mobilização de célula compreendendo sulfato de dextrano tendo uma média molecular dentro de um intervalo de 3500 e 9500 Da, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo e G-CSF.

[00013] Em uma modalidade, o derivado farmaceuticamente aceitável é preferencialmente um sal farmaceuticamente aceitável de sulfato de dextrano.

[00014] Os inventores observaram que sulfato de dextrano de um intervalo estreito no que se refere ao peso molecular médio atinge uma melhoria significativa na mobilização de célula em comparação com as moléculas de sulfato de dextrano tendo pesos moleculares médios menores ou maiores.

[00015] Moléculas de sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio abaixo do intervalo das presentes modalidades não têm qualquer efeito significativo em termos de mobilização de células tronco e/ou progenitoras ou glóbulos brancos. Moléculas de sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio acima do intervalo das presentes modalidades não parecem ter qualquer efeito aditivo e nenhum efeito sinérgico quando usadas em conjunto com outros compostos de mobilização de célula, tais como G-CSF, e parecem ter efeito de mobilização mais lento em comparação às presentes modalidades.

[00016] As presentes modalidades proveem uma mobilização de célula eficiente com um perfil de mobilização inesperado provocando a mobilização de células quase imediatamente após a administração de sulfato de dextrano com um pico em células mobilizadas começando já dentro de 7,5 a 30 minutos após a administração de sulfato de dextrano em camundongos e dentro de 30 a 120 minutos em seres humanos. Adicionalmente, as moléculas de sulfato de dextrano das modalidades podem ser combinadas sinergicamente com outros compostos de mobilização de células para aumentar ainda mais o número de células mobilizadas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00017] As modalidades, juntamente com objetos e vantagens adicionais das mesmas, podem ser mais bem entendidas fazendo referência à seguinte descrição tomada juntamente com as figuras anexas, nas quais:

[00018] A Fig. 1 ilustra a mobilização de leucócitos induzida pela injeção subcutânea única de sulfato de dextrano (BPM-DS) ou AMD3100 em comparação ao controle (ácido cítrico monoidratado (CAM)). Sangue foi amostrado após 3 horas (BPM-DS) ou 1 hora (AMD3100). Média ±SEM é mostrada. Análise estatística comparou BPM-DS ou AMD3100 ao grupo de controle (*p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001) ou BPM-DS em comparação com AMD3100 (tp< 0,05, ttp< 0,01, tttp< 0,001).

[00019] A Fig. 2 ilustra o efeito de BPM-DS na concentração sanguínea de HGF. Os animais foram tratados com uma única injeção subcutânea de BPM-DS ou AMD3100. CAM foi usado como controle de veículo. Sangue foi amostrado

[00020] após 3 horas (BPM-DS) ou 1 hora (AMD3100). Média ±SEM é mostrada. Análise estatística comparou BPM-DS ou AMD3100 ao grupo de controle (*p< 0,05, ***p< 0,001) ou BPM-DS em comparação com AMD3100 (tttp< 0,001).

[00021] A Fig. 3 ilustra a mobilização de leucócitos para sangue periférico por injeção intravenosa única de BPM-DS e AMD3100. CAM foi usado como controle de veículo. Sangue foi amostrado após 30 minutos (BPM-DS e veículo) ou 1 hora (AMD3100). Média ±SEM é mostrada. Análise estatística comparou BPM-DS ou AMD3100 ao grupo de controle (*p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001) ou BPM-DS em comparação com AMD3100 (tp< 0,05, ttp< 0,01, tttp< 0,001).

[00022] As Figs. 4A e 4B ilustram o efeito da injeção intravenosa única de BPM-DS ou de injeção subcutânea de AMD3100 sobre a mobilização de células formadoras de colônias hematopoiéticas (CFC) no sangue periférico. Tampão de CAM (i.v.) foi usado como controle de veículo. Sangue foi amostrado após 30 minutos (BPM-DS e veículo) ou 1 hora (AMD3100). Média ±SEM é mostrada. Análise estatística comparou BPM-DS ou AMD3100 ao grupo de controle (*p< 0,05, **p< 0,01) ou BPM- DS em comparação com AMD3100 (tp< 0,05).

[00023] A Fig. 5 ilustra uma distinção do subtipo progenitor (CFU- GM, CFU-GEMM e BFU-E) de células progenitoras mobilizadas (CFC) após injeção intravenosa única com BPM-DS ou CAM (controle). Tampão de CAM foi usado como controle e esse valor foi usado como um valor 0 (controle negativo). Média ±SEM é mostrada. Análise estatística comparou BPM-DS ao grupo de controle (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001)

[00024] A Fig. 6 ilustra a mobilização de leucócitos induzida pela combinação de G-CSF e BPM-DS ou G-CSF e AMD3100 em comparação ao tampão de CAM (veículo). Sangue foi amostrado após 30 minutos (BPM- DS e veículo) ou 1 hora (AMD3100). Média ±SEM é mostrada. Análise estatística comparou G-CSF + BPM-DS ou G-CSF e AMD3100 ao grupo de controle (G-CSF + CAM) (*p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001) ou G-CSF + BPM-DS em comparação com G-CSF + AMD3100 (tp< 0,05, ttp< 0,01, tttp< 0,001).

[00025] As Figs. 7A e 7B ilustram tratamento de combinação de G-CSF e BPM-DS ou G-CSF e AMD3100 na mobilização de células progenitoras no sangue periférico. Tampão de CAM foi usado como controle de veículo. Sangue foi amostrado após 30 minutos (BPM-DS e veículo) ou 1 hora (AMD3100). Média ±SEM é mostrada. Análise estatística comparou G-CSF + BPM-DS ou G-CSF e AMD3100 ao grupo de controle (G-CSF + CAM) (*p< 0,05, **p< 0,01) ou G-CSF + BPM-DS em comparação com G-CSF + AMD3100 (tp< 0,05, ttp< 0,01).

[00026] A Fig. 8 é uma visão geral de mobilização de células progenitoras após injeções únicas em camundongos de 100 mg/kg de BPM-DS, G-CSF, G-CSF + BPM-DS, G-CSF + AMD3100 (5 mg/kg) ou CAM (veículo). Tratamento combinatório com G-CSF e BPM-DS aumentou significativamente o número de CFC em comparação ao tampão de CAM, BPM-DS e G-CSF. Barras de erro mostram a média, n=6-10.

[00027] A Fig. 9 é uma visão geral de mobilização de linfócitos após injeções únicas em camundongos de 100 mg/kg de BPM-DS, G-CSF, G-CSF + BPM-DS, G-CSF + AMD3100 (5 mg/kg) ou CAM (veículo). Administração de BPM-DS aumentou os linfócitos no sangue periférico em comparação à única terapia de G-CSF ou AMD3100 e, em combinação com G-CSF, o aumento foi significativo em comparação ao G-CSF + AMD3100. Barras de erro mostram a média, n=6-10.

[00028] A Fig. 10 ilustra os efeitos do sulfato de dextrano sobre os glóbulos brancos no sangue periférico. Os animais foram tratados com uma injeção intravenosa única de sulfato de dextrano de diferentes pesos moleculares médios (DS3 ou DS5) em doses de 50 mg/kg. Solução salina tamponada (NaCI) foi usada como controle de veículo. Alguns animais foram sedados usando pentobarbital sódio (PNB) em vez de isoflurano para comparar o efeito de diferentes métodos de anestesia. Barras de erro mostram a média SEM. Teste t de Student foi usado para avaliar diferenças estatisticamente significativas em comparação ao grupo de controle (*p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001).

[00029] A Fig. 11 ilustra a eficácia de sulfato de dextrano sobre a mobilização de células progenitoras hematopoiéticas em sangue periférico. Animais foram tratados com uma injeção intravenosa única de sulfato de dextrano de diferente peso molecular médio (DS3 ou DS5) ou com o veículo (NaCl). Barras de erro mostram a média SEM. Teste t de Student foi usado para avaliar diferenças estatisticamente significativas em comparação ao grupo de controle (*p< 0,05).

[00030] A Fig. 12 ilustra a eficácia de sulfato de dextrano no aumento dos níveis de HGF no sangue periférico. Animais foram tratados com uma injeção intravenosa única de sulfato de dextrano de diferente peso molecular médio (DS3 ou DS5) ou com o veículo (NaCl). Barras de erro mostram a média SEM. Teste t de Student foi usado para avaliar diferenças estatisticamente significativas em comparação ao grupo de controle (***p< 0,001).

[00031] A Fig. 13 ilustra a mobilização de linfócitos no sangue periférico em humanos recebendo uma infusão intravenosa de 10 min de 15 mg/kg de BPM-DS (painel superior), 18 mg/kg de BPM-DS (painel central) ou 24 mg/kg de BPM-DS (painel inferior) no tempo 0. A linha preta representa os níveis médios de linfócitos e linhas cinza representam níveis de linfócitos em humanos individuais.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00032] As presentes modalidades se referem geralmente a mobilização celular em animais, preferencialmente de mamíferos e, em particular, seres humanos. Em particular, as modalidades se referem à mobilização de células tronco e/ou progenitoras e/ou determinados glóbulos brancos que podem ser usados, por exemplo, no transplante de células, incluindo o transplante de células tronco hematopoéticas (TCTH).

[00033] As modalidades são baseadas em características inesperadas do sulfato de dextrano relativas à mobilização de células em um sujeito, preferencialmente um sujeito mamífero e mais preferencialmente humano.

[00034] Um aspecto das modalidades se refere, portanto, a sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio em um intervalo de 3500 e 9500 Da, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso na mobilização de células tronco e/ou progenitoras, tipicamente a partir de medula óssea (BM), no sangue periférico (PB) de um sujeito, preferencialmente um sujeito mamífero e mais preferencialmente um sujeito humano.

[00035] No sangue periférico, as células tronco e/ou progenitoras estão disponíveis para a colheita e podem, desse modo, ser utilizadas no transplante de células, incluindo o TCTH. Alternativamente, a mobilização das células tronco e/ou progenitoras no sangue periférico pode alcançar efeitos vantajosos sem serem colhidas do sujeito, por exemplo, circuladas in vivo para reparo de tecido ou órgão, tal como o reparo do miocárdio.

[00036] Uma modalidade deste aspecto, portanto, refere-se a um método de mobilização de células tronco e/ou progenitoras, preferencialmente a partir da medula óssea, para o sangue periférico de um sujeito, preferencialmente um sujeito humano. O método compreende a administração de uma quantidade eficaz de sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio em um intervalo de 3500 e 9500 Da ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, para o sujeito. Outra modalidade deste aspecto se refere ao uso do sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio em um intervalo de 3500 e 9500 Da, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, para a fabricação de um medicamento para a mobilização de células tronco e/ou progenitoras, preferencialmente a partir da medula óssea, para o sangue periférico de um sujeito, preferencialmente um sujeito humano.

[00037] A expressão "células progenitoras" refere-se neste documento a certas células que podem formar células hematopoiéticas diferenciadas ou células mielóides em resposta a estímulos. Células progenitoras em uma amostra podem ser identificadas por sua capacidade de formar unidades formadoras de colônia (CFUs) de diversos tipos. Tais tipos de CFU incluem granulócitos de CFU, macrófagos (CFU-GM), granulócitos de CFU, eritroides, monócitos, megacarócitos (CFU-GEMM), de unidade formadora de bursts eritroides (BFU-E), dentre outros. "Células tronco"são formas menos diferenciadas de células progenitoras e tipicamente, embora não sempre, expressam a glicoproteína de superfície de células CD34 em seres humanos.

[00038] Dados experimentais como apresentados neste documento demonstram que há um limite inferior no que se refere ao peso molecular médio de sulfato de dextrano a fim de ter qualquer efeito de mobilização de célula, vide as Figs. 10 e 11. Assim, as moléculas de sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio abaixo do intervalo das presentes modalidades não mostram qualquer efeito positivo significativo no que se refere à mobilização de células tronco e/ou progenitoras, ou com efeito no que se refere à mobilização de glóbulos brancos sanguíneos, em particular linfócitos ou à indução do fator de crescimento de hepatócito (HGF), vide as Figs. 10-12.

[00039] Moléculas de sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio acima do intervalo das presentes modalidades também têm efeitos inferiores no que se refere à mobilização de células.

[00040] Sweeney 2000 e Sweeney 2002 indicaram que 10 kDa de sulfato de dextrano foi cerca de três vezes mais lento que o plerixafor em camundongos em termos de mobilização de células tronco/progenitoras com um período de colheita sugerido para ser 3 horas após a administração de sulfato de dextrano em comparação à colheita após 1 hora após a administração de plerixafor (Broxmeyer 2005). Os dados experimentais apresentados neste documento indicam que sulfato de dextrano tendo peso molecular médio de acordo com as modalidades quase que imediatamente provocam um aumento no número de células formadoras de colônias mobilizadas (CFC), e que o pico ocorre 7,5 a 30 minutos após a administração de sulfato de dextrano em camundongos em comparação com 1 hora para plerixafor e 3 horas para 10 kDa de sulfato de dextrano. Correspondentemente, em pacientes humanos o pico na mobilização de CFC ocorrerá em cerca de 0,5 a 3 horas, tal como cerca de 1 hora após a administração de sulfato de dextrano. Assim, mobilização de CFC por sulfato de dextrano realizada em seres humanos parece ser cerca de 6 a 9 vezes mais lenta em humanos do que em camundongos. Esta relação entre as espécies é similar ao plerixafor onde o pico na mobilização de CFC ocorre em cerca de 9 horas após a administração de plerixafor em seres humanos em comparação com 1 hora após a administração de plerixafor em camundongos.

[00041] Assim, o sulfato de dextrano das modalidades parece ter efeito de mobilização de célula significativamente mais rápido do que o que está indicado no estado da técnica para moléculas maiores de sulfato de dextrano, vide Sweeney 2000 e Sweeney 2002.

[00042] Han 1998 investigou sulfato de dextrano tendo um peso molecular de 10 kDa e G-CSF no que se refere à mobilização de glóbulos brancos sanguíneos (WBC), células mononucleares (MNC) e CFU-GM em camundongos. Os autores discutiram que os picos em WBC periférico, MNC e CFU-GM ocorreram de 2 a 5 horas após injeção intravenosa de 15 a 30 mg de sulfato de dextrano de 10 kDa em camundongos. Assim, o período de tempo mencionado é similar para as três horas sugeridas por Sweeney 2000 e Sweeney 2002.

[00043] Han 1998 comparou adicionalmente os níveis pós- administração de WBC periférico, MNC e CFU-GM após 10 g/kg de G-CSF dado todos os dias por cinco dias (grupo de G-CSF), 15 mg/kg de sulfato de dextrano de 10 kDa dado uma vez no dia 5 (grupo DS) e 10 g/kg de G-CSF dado todos os dias por cinco dias e 15 mg/kg de sulfato de dextrano de 10 kDa dado uma vez no dia 5 (grupo de DS+G-CSF). Não houve diferença significativa em qualquer um dos três grupos no que se refere a WBC e MNC. O grupo DS teve um nível de CFU-GM de 12,9±1,6 colônias com > 50 células, o grupo de G-CSF teve um nível de CFU-GM de 17,1 ±1,9 colônias, enquanto o tratamento combinado de DS e G-CSF (grupo DS+G- CSF) teve um nível de CFU-GM de 19,8±2,3, ou seja, ligeiramente acima do nível alcançado apenas com tratamento de G-CSF.

[00044] Assim, Han 1998 indicou que sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio de 10 kDa resultou em um pico de mobilização após 2 a 5 horas a partir do tempo de administração em camundongos e que a combinação deste sulfato de dextrano com G-CSF teve quase nenhum efeito adicional sobre o único tratamento de G-CSF em camundongos.

[00045] O sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio das modalidades tem um perfil e efeito de administração significativamente diferente em comparação ao que é divulgado para sulfato de dextrano de 10 kDa em Han 1998. Primeiramente, o sulfato de dextrano das modalidades parece ter efeito de mobilização de célula significativamente mais rápido do que o que está indicado no estado da técnica para moléculas maiores de sulfato de dextrano (7,5 a 30 minutos versus 2 a 5 horas). Em segundo lugar, o sulfato de dextrano das modalidades tem um efeito sinérgico no que se refere à mobilização da célula quando combinado com G-CSF. Assim, a combinação de sulfato de dextrano e tratamento de G-CSF, como divulgado neste documento, resultou em um aumento de células progenitoras mobilizadas e linfócitos no sangue periférico que era maior do que o efeito combinado de apenas usar sulfato de dextrano e apenas usar o G-CSF, vide Figs. 6 a 9. Assim, o sulfato de dextrano com um peso molecular médio dentro do intervalo das presentes modalidades tem um verdadeiro efeito sinérgico quando combinado com G-CSF.

[00046] Como consequência, o intervalo selecionado no que se refere ao peso molecular médio entre o sulfato de dextrano provê uma mobilização de célula significativamente mais eficiente em comparação às moléculas de sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio fora do intervalo inventivo das presentes modalidades.

[00047] Dados experimentais como apresentados neste documento demonstram que sulfato de dextrano das modalidades não só mobiliza cerca do mesmo número total de células tronco e progenitoras, em termos de número total de CFCs, como plerixafor, mas a administração de sulfato de dextrano pode ser combinada em sinergia com outras substâncias, tais como G-CSF, para alcançar níveis significativamente mais elevados do número total de CFCs comparado a

[00048] combinações correspondentes de plerixafor e G-CSF. Além disso, o perfil de mobilização de CFC do sulfato de dextrano difere da mobilização de CFC com plerixafor. Em particular, sulfato de dextrano das modalidades é capaz de alcançar níveis mais elevados dos tipos BFU-E CFC e CFU-GEMM em comparação com o plerixafor.

[00049] A mobilização de células muito rápida desencadeada pela administração de sulfato de dextrano das modalidades permite uma administração fundamentalmente diferente versus o perfil de efeitos em comparação com plerixafor devido à mobilização de CFC muito mais rápida. Assim, neste aspecto, a administração de sulfato de dextrano das modalidades é preferencialmente coordenada e sincronizada no que se refere ao momento desejado de alcançar um pico em CFC mobilizado. Por exemplo, se o CFC mobilizado é colhido a partir do sangue periférico de um sujeito, a administração de sulfato de dextrano é preferencialmente coordenada e sincronizada para ocorrer de cerca de 0 horas a cerca de 8 horas, mais preferencialmente de cerca de 0 horas a cerca de 6 horas antes do início da colheita de CFC para um sujeito humano. Mais preferencialmente, a administração de sulfato de dextrano ocorre de cerca de 0 horas a cerca de 4 horas antes do início da colheita de CFC.

[00050] Colheita de células de CFC, seguindo um tratamento combinado com plerixafor e G-CSF ocorre durante cerca de 4 horas por ocasião de colheita e, portanto, é coordenada de 9 horas até 13 horas após a administração de plerixafor.

[00051] Um protocolo de colheita correspondente de acordo com as modalidades pode ser então realizar uma colheita de CFC de 4 horas de 0 até 4 horas, de 0,25 até 4,25 horas, de 0,5 até 4,5 horas, de 0,75 até 4,75 horas, de 1 até 5 horas, de 1,25 até 5,25 horas, de 1,5 até 5,5 horas, de 1,75 até 5,75 horas, de 2 até 6 horas, de 2,25 até 6,25 horas, de 2,5 até 6,5 horas, de 2,75 até 6,75 horas, de 3 até 7 horas, de 3,25 até 7,25 horas, de 3,5 até 7,5 horas, de 3,75 até 7,75 horas, de 4 até 8 horas, de 4,25 até 8,25 horas, de 4,5 até 8,5 horas , de 4,75 até 8,75 horas, de 5 até 9 horas, de 5,25 até 9,25 horas, de 5,5 até 9,5 horas, de 5,75 até 9,75 horas, de 6 até 10 horas, de 6,25 até 10,25 horas, de 6,5 até 10,5 horas, de 6,75 até 10,75 horas, de 7 até 11 horas, de 7,25 até 11,25 horas, de 7,5 até 11,5 horas, de 7,75 até 11,75 horas ou de 8 até 12 horas após a administração de sulfato de dextrano. Em uma modalidade preferencial, o início da colheita de célula ocorre preferencialmente cerca de 0,5 horas, 0,75 horas, 1 hora, 1,25 horas, 1,5 horas, 1,75 horas, 2 horas, 2,25 horas, 2,5 horas, 2,75 horas, 3 horas, 3,25 horas, 3,5 horas, 3,75 horas ou 4 horas após a administração do sulfate de dextrano.

[00052] Assim, em uma modalidade particular, a colheita de células tronco e/ou progenitoras com mobilização celular induzida por sulfato de dextrano já é vantajosamente concluída antes da colheita de CFC ter começado ao usar plerixafor como agente induzindo mobilização.

[00053] Dados humanos preliminares indicam que mobilização celular com picos de sulfato de dextrano em cerca de 1 hora após administração de sulfato de dextrano e começa a diminuir em cerca de 6 horas após a administração de sulfato de dextrano e retorna aos níveis normais pelo menos cerca de 24 horas após a administração de sulfato de dextrano. Assim, o pico na mobilização celular começa cerca de 1 hora após a administração de sulfato de dextrano, a qual é mostrada na Fig. 15 exemplificada pela mobilização de linfócitos após administração de diferentes doses de sulfato de dextrano para seres humanos no tempo 0 horas. Assim, o efeito de pico na mobilização celular em seres humanos ocorre tipicamente dentro das três primeiras horas após a administração de sulfato de dextrano.

[00054] Assim, a administração de sulfato de dextrano conduz a uma mobilização mais rápida e mais eficiente de células em comparação ao plerixafor e, portanto, diminuirá o número de dias de aférese necessários para recuperar a quantidade desejada de células mobilizadas. Para sujeitos com contagem de células insuficiente, em visita agendada de aférese, o tratamento com sulfato de dextrano visa garantir mobilização imediata de células e a aférese pode ser iniciada conforme planejado. Isso vai facilitar o planejamento nos centros de aférese e reduzir o número de sujeitos que devem ser submetidos a múltiplos procedimentos de mobilização.

[00055] Estudos realizados com sulfato de dextrano como apresentados neste documento têm documentado uma mobilização imediata de células progenitoras. Assim, o número de CFC atinge um ápice já 7,5 minutos após a administração com um pico duradouro persistindo por pelo menos 1 hora em camundongos. A mobilização de HSC usando sulfato de dextrano parece ser mais rápida em comparação com o atual regime de mobilização, incluindo tratamento com plerixafor, que tem um pico distinto em 1 hora em camundongos:

[00056] Uma resposta rápida, eficiente e previsível de mobilização de HSC reduziria o tempo de internação para o paciente. Isto beneficiaria também os centros de aférese devido a menor número de consultas de aférese e menos sessões canceladas devido à contagem de células muito baixas.

[00057] Um possível mecanismo de ação por trás dos efeitos de mobilização mais rápidos de sulfato de dextrano, que é diferente em comparação com o plerixafor, é apresentado abaixo. Brevemente, sulfato de dextrano se liga ao domínio de ligação à heparina em células estromais de BM, que liberam o fator derivado de células estromais 1 (SDF-1) e HSC no sangue periférico. Plerixafor, por outro lado, afeta o gradiente de SDF-1 ao atuar como um antagonista de SDF-1, levando a maiores quantidades de HSC no sangue periférico. A diferença de tempo na ruptura do gradiente de SDF-1 sugere diferentes mecanismos de ação para as substâncias mobilizadoras. O mecanismo sugerido para sulfato de dextrano pode ser explicado por ligação a uma sequência específica de aminoácidos de carga positiva denominada como domínio de ligação à heparina em sulfato de heparano de outra forma carregado negativamente (HS). Isso causa uma liberação de SDF-1 na circulação e concentração de soro elevada (Sweeney 2002 e Pablos 2003).

[00058] Os mecanismos exatos que controlam endereçamento (homing) e mobilização de HSC para e a partir da medula óssea não são conhecidos, mas particularmente a citocina SDF-1 e seu receptor CXCR4 desempenham um papel crucial. HSC expressa CXCR4 e SDF-1 é produzido pela medula óssea. SDF-1 está ancorado a proteoglicanos (PG) na membrana de células estromais, células endoteliais e a matriz extracelular.

[00059] Sulfato de dextrano interrompe o gradiente de SDF-1 com níveis maiores no sangue e níveis menores em BM em ambos camundongos e primatas não humanos. O aumento de SDF-1 é provavelmente devido ao deslocamento competitivo com sulfato de dextrano a partir de proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPG) que sequestram a quimiocina sobre superfícies de células endoteliais ou matriz extracelular em BM e outros tecidos. Em macacos, uma única injeção de sulfato de dextrano resultou em níveis máximos de SDF-1 periférico após 6 horas que retornou à linha de base após 24 horas (Sweeney 2002). Plerixafor, por outro lado, liga-se aos receptores de SDF-1, CXCR4 e CXCR7 (Kalatskaya 2009) e, desse modo, interrompe a ligação a SDF-1 no estroma da medula óssea e liberando as células. Plerixafor afeta este gradiente de SDF-1 ao atuar como um antagonista de SDF-1, levando a quantidades maiores de HSC no sangue periférico (Broxmeyer 2005 e Lapidot 2003).

[00060] Além de alcançar uma mobilização celular significativamente mais rápida em comparação ao plerixafor, administração de sulfato de dextrano também alcança diferentes perfis de mobilização de células tronco ou progenitoras. Em particular, o sulfato de dextrano provê níveis mais elevados dos tipos de CFC BFU-E e CFU-GEMM em comparação ao plerixafor. Este perfil de mobilização de célula das modalidades pode ter vários benefícios clínicos. Por exemplo, estabeleceu- se que o número de CFU-GEMM infundido ao paciente é correlacionado ao tempo para a recuperação de neutrófilos e plaquetas (Roodman 1987). Assim, o transplante de HSC com maior conteúdo de CFU-GEMM diminuiria o período de tempo crítico com maior risco de infecções para o paciente e seria de grande benefício para o paciente. Também o aumento dos níveis de BFU-E nas células mobilizadas será benéfico em transplantes de células. Demonstrou-se que o número de células de BFU-E infundidas durante o transplante de células melhorou a recuperação hematopoiética e recuperação de neutrófilos e plaquetas (Cooper 1997 e Hassan 1997).

[00061] Células tronco e/ou progenitoras mobilizadas pela administração de sulfato de dextrano de acordo com este aspecto podem ser colhidas de acordo com técnicas bem conhecidas na técnica, tais como a aférese. Brevemente, tubos intravenosos são conectados ao paciente, a fim de fazer circular continuamente o sangue do paciente através de uma máquina de aférese e depois de volta para o paciente. A máquina de aférese então separa diferentes tipos de células sanguíneas e imunológicas.

[00062] As células tronco e/ou progenitoras colhidas podem ser usadas em transplante alogênico ou autólogo, tal como o TCTH.

[00063] As células tronco e/ou progenitoras colhidas podem então ser infundidas para um destinatário, que é também o paciente mesmo (transplante autólogo) ou outro paciente (transplante alogênico). Hoje, existem várias doenças e distúrbios onde o transplante de células tronco e/ou progenitoras é uma terapia. Por exemplo, transplante alogênico têm sido sugeridas para o tratamento de diversas malignidades e doenças cancerosas, incluindo leucemia mielóide aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mielóide crônica (CML), síndromes mielodisplásicas (MDS), distúrbios mieloproliferativos (MPD), Linfoma não- Hodgkin (NHL),a doença de Hodgkin (HD), leucemia linfocítica crônica (CLL), mieloma múltiplo (MM) e leucemia mielóide crônica juvenil. Correspondentemente, o transplante autólogo foi sugerido para as seguintes malignidades MM, NHL, HD, AML, neuroblastoma, câncer de ovário e tumores de células germinativas. Outras doenças cancerosas incluem leucemia de células pilosas (HCL), leucemia promielocítica aguda (APL) e outros mielomas, leucemias e linfomas.

[00064] Apesar de TCTH ser uma terapia utilizada principalmente para cânceres hematológicos e linfoides, ela é uma alternativa em uma variedade de outras condições adquiridas e congênitas, incluindo anemia aplástica, hemoglobinúria paroxística noturna, anemia de Fanconi, anemia de Blackfan-Diamond, Talassemia major, anemia falciforme, imunodeficiência combinada grave, síndrome de Wiskott-Aldrich, erros inatos do metabolismo, doenças autoimunes e Amiloidose (Copelan 2006).

[00065] Além disso, uma vez que sulfato de dextrano tem um efeito de maior mobilização de células do sangue e realiza seus efeitos através de um mecanismo de ação diferente do agente de mobilização atualmente usado, plerixafor, tratamento com sulfato de dextrano pode ser útil em todos os pacientes do TCTH, bem como em pacientes refratários que não alcançam suficiente mobilização de células-tronco com terapias atuais.

[00066] A administração de sulfato de dextrano não só ocasiona um aumento muito rápido e significativo na mobilização das células progenitoras e/ou tronco, normalmente a partir da medula óssea, para o sangue periférico de um sujeito. Além disso, o sulfato de dextrano das modalidades adicionalmente tem efeitos positivos em vários parâmetros do sangue imediatamente após a administração e induz a uma rápida mobilização de células sanguíneas brancas (WBC). Mobilização de WBC pode ser um determinado aspecto benéfico das modalidades uma vez que as WBC mobilizadas podem reduzir o risco de infecção e o momento crítico após um TCTH realizado.

[00067] Uma característica muito interessante do sulfato de dextrano, de acordo com as modalidades é que o sulfato de dextrano em particular provoca uma elevada mobilização de linfócitos, significativamente maiores em comparação com plerixafor.

[00068] Outro aspecto das modalidades, desse modo, se refere ao sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio em um intervalo de 3500 e 9500 Da ou um derivado farmaceuticamente aceitável dos mesmos, para uso na mobilização de glóbulos brancos alvo, em particular linfócitos, na corrente sanguínea de um sujeito, preferencialmente um sujeito mamífero, e mais preferencialmente um sujeito humano.

[00069] Uma modalidade deste aspecto diz respeito a um método de mobilização de glóbulos brancos alvo, em particular linfócitos, na corrente sanguínea de um sujeito, preferencialmente um sujeito humano. O método compreende a administração de uma quantidade eficaz de sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio em um intervalo de 3500 e 9500 Da ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, para o sujeito. Uma outra modalidade deste aspecto diz respeito ao uso de sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio em um intervalo de 3500 e 9500 Da, ou um derivado farmaceuticamente aceitável dos mesmos, para a fabricação de um medicamento para a mobilização de glóbulos brancos alvo, em particular linfócitos, na corrente sanguínea de um sujeito.

[00070] O sulfato de dextrano das modalidades pode ser usado de acordo com este aspecto para mobilizar os linfócitos além de células progenitoras e/ou tronco de um sujeito. No entanto, o sulfato de dextrano alternativamente pode ser utilizado principalmente para mobilizar os linfócitos como as células alvo a serem usadas em várias aplicações ou terapias em que os linfócitos são necessários.

[00071] Qualquer colheita dos linfócitos e a administração de sulfato de dextrano são preferencialmente coordenadas e sincronizadas como descrito anteriormente neste documento para mobilização de células tronco ou progenitoras. Consequentemente, administração de sulfato de dextrano preferencialmente é coordenada e sincronizada para ocorrer a partir de cerca de 0 a cerca de 8 horas, preferencialmente a partir de cerca de 0 a cerca de 6 horas e mais preferencialmente a partir de cerca de 0 horas a cerca de 4 horas antes do início da colheita de linfócitos para um sujeito humano. Os intervalos de colheita preferenciais anteriormente divulgados com relação à administração de sulfato de dextrano vantajosamente também podem ser utilizados para colheita de linfócitos.

[00072] Maior teor de linfócitos infundidos tem várias vantagens benéficas em conexão com o TCTH. Por exemplo, quantidade aumentada de linfócitos infundidos a um sujeito juntamente com células progenitoras e/ou tronco anteriormente colhidos reduzirá o risco de infecções e melhorará o resultado global. Dose mais alta de linfócitos infundidos prevê maior recuperação de linfócitos, que por sua vez, prevê sobrevivência global superior após o transplante de células-tronco hematopoiéticas autólogas para pacientes MM e NHL. Dose de linfócitos aumentada traduz em contagem absoluta de linfócitos no dia 15 (ALC-15). Concluiu-se que a sobrevivência global mediana e sobrevivência livre de progressão para os pacientes de NHL são significativamente melhores para os pacientes que receberam 0,68x109linfócitos/kg em comparação com aqueles recebendo 0,34x109linfócitos/kg e benefícios similares com maior rendimento de linfócitos em pacientes de MM (Porrata, 2004b).

[00073] Em ensaios clínicos realizada com plerixafor, entre 2025% dos pacientes de TCTH apresentaram infecções após transplante (CHMP Assessment Report Mozobil (plerixafor) Procedure No EMEA/H/C/001030). Vírus respiratórios comunitários foram reconhecidos como uma possível causa de infecções graves, especialmente em pacientes submetidos a TCTH. Além disso, receptores de TCTH com infecção respiratória superior sintomática têm uma tendência maior ao progresso para pneumonia grave com uma mortalidade tão alta quanto 5070% (Chemaly 2006). Sulfato de dextrano das modalidades pode reduzir esses riscos para infecções devido aos níveis aumentados de linfócitos.

[00074] O mecanismo para a sobrevivência global melhorada é sugerido como sendo de enxerto e de reconstituição de linfócitos mais rápidos, resultando em um efeito mais forte do enxerto-versus-tumor (GVT), diminuindo o câncer residual (Porrata 2004a, 2004b, 2009 e Hiwase 2008). Conforme apresentado nos resultados experimentais, única administração de sulfato de dextrano pelo menos dobrou a liberação de linfócitos em terapia única em comparação com a administração única de G-CSF ou plerixafor. Sulfato de dextrano em combinação com G-CSF é aproximadamente duas vezes mais eficiente na mobilização de linfócitos em comparação com a combinação de G-CSF e plerixafor.

[00075] Os efeitos indutores na WBC e especialmente de linfócitos podem basear-se no mecanismo subjacente em que se mostrou que sulfato de dextrano interromper o gradiente de SDF-1 com níveis aumentados de células no sangue e níveis diminuídos em BM tanto em ratos quanto em primatas não humanos (Sweeney 2002). O aumento de SDF-1 é provavelmente devido ao deslocamento competitivo com sulfato de dextrano a partir de proteoglicanos de sulfato de heparano que sequestram a quimiocina sobre superfícies de células endoteliais ou matriz extracelular em BM e outros tecidos. Outro mecanismo possível é que sulfato de dextrano interfere com leucócitos por interações de célula para célula, por exemplo, rolamento de leucócitos e a adesão dos leucócitos mediada por selectina.

[00076] Sulfato de dextrano de acordo com as modalidades, portanto, pode ser usado em conexão com a infusão de linfócitos do doador (DLI). DLI é uma imunoterapia adotiva que às vezes é usada após o TCTH. No DLI, são infundidos linfócitos do doador de células-tronco original, após o transplante de células tronco e/ou progenitoras, para aumentar a resposta imune antitumoral ou certificar que as células-tronco do doador permanecer enxertadas. O objetivo desta terapia é induzir uma remissão de câncer do paciente pelo efeito da GVT. Os linfócitos do doador, assim, podem atacar e controlar o crescimento das células cancerosas residuais.

[00077] O sulfato de dextrano das modalidades vantajosamente é usado em combinação com G-CSF para tratar sujeitos e melhorar o rendimento das células mobilizadas. Conforme é divulgado na seção experimental, o tratamento combinado de sulfato de dextrano e G-CSF, sinergicamente aumentou o número de células mobilizadas, tanto as células tronco e as progenitoras quanto vários WBC, em comparação com o tratamento com sulfato de dextrano sozinho. Além disso, a combinação de sulfato de dextrano e G-CSF conduz a níveis significativamente mais elevados de células mobilizadas em comparação com a combinação de plerixafor e G-CSF. O efeito sinérgico como pode ser visto entre plerixafor e G-CSF parece ser ainda mais proeminente para a combinação de sulfato de dextrano e G-CSF. Isso foi interessante, particularmente à luz de Han 1998 onde a combinação de sulfato de dextrano 10 kDa e G-CSF basicamente deu o mesmo resultado que usando apenas o G-CSF.

[00078] Desse modo, um aspecto adicional se refere a uma composição de mobilização de célula compreendendo sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio em um intervalo de 3500 e 9500 Da, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, e (G-CSF). Modalidades relacionadas deste aspecto define o uso combinado de sulfato de dextrano das modalidades e G-CSF para a mobilização de células, em particular células estaminais e/ou progenitoras e/ou WBC e em particulares linfócitos em um sujeito, preferencialmente um sujeito humano.

[00079] A composição de mobilização de célula preferencialmente também compreende um veículo, tais como um solvente aquoso.

[00080] Uma modalidade deste aspecto, portanto, diz respeito a um método de mobilização de células, tais como células tronco e/ou progenitoras e/ou linfócitos, no sangue periférico de um sujeito, preferencialmente um sujeito humano. O método compreende a administração de uma quantidade eficaz de sulfato de dextrano de acordo com as modalidades, ou um derivado farmaceuticamente aceitável e do mesmo e uma quantidade eficaz de G-CSF ou administração da composição de mobilização de célula acima mencionada, ao sujeito. Uma outra modalidade deste aspecto define uma combinação de sulfato de dextrano de acordo com as modalidades, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, e G-CSF ou a composição de mobilização de célula acima mencionada para uso na mobilização de célula, preferencialmente células tronco e/ou progenitoras e/ou linfócitos, no sangue periférico de um sujeito, preferencialmente um sujeito humano. Uma modalidade adicional deste aspecto refere-se ao uso de uma combinação de sulfato de dextrano de acordo com as modalidades, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, e G-CSF ou a composição de mobilização de célula acima mencionada para a fabricação de um medicamento para a mobilização de células, preferencialmente células tronco e/ou progenitoras e/ou linfócitos, no sangue periférico de um sujeito, preferencialmente um sujeito humano.

[00081] O G-CSF usado de acordo com este aspecto pode ser de qualquer fonte de G-CSF adequada incluindo G-CSF recombinante ou purificado. Exemplos não limitantes incluem NEUPOGEN ® (filgrastim que é um análogo de G-CSF), NEUTROGIN ® (lenograstim que é um G-CSF recombinante), NEULASTA ® (pegfilgrastim que é uma forma de polietilenoglicol de filgrastim). Fragmentos biologicamente ativos, variantes, derivados ou moléculas de fusão podem alternativamente ou adicionalmente, ser usadas como fonte de G-CSF, se elas tiverem a capacidade de mobilização de células semelhante ao G-CSF nativo.

[00082] Atualmente, G-CSF (10 pg/kg) é administrado ao sujeito cada manhã por 4 dias antes de aférese e, em seguida, em todas as manhãs de aférese. Este protocolo de administração pode ser usado também em conexão com sulfato de dextrano das modalidades. Consequentemente, G-CSF é preferencialmente administrado ao sujeito em uma ou poucas ocasiões antes da administração de sulfato de dextrano e colheita da célula, tais como uma ou duas vezes por 1-7 dias, como uma ou duas vezes por 2-4 dias antes de aférese e preferencialmente adicionalmente na manhã do dia de aférese.

[00083] Alternativamente, ou adicionalmente, administração de sulfato de dextrano pode ocorrer antes da administração de G-CSF. Por exemplo, o sulfato de dextrano de acordo com as modalidades tem o efeito benéfico adicional de indução de HGF quando administrado a um sujeito como adicionalmente discutido aqui abaixo. Desse modo, poderia ser benéfico ter níveis de HGF aumentados no sangue periférico do sujeito quando o G-CSF é administrado a um sujeito. Em uma modalidade preferencial, o sulfato de dextrano é então administrado não só antes, ou mesmo junto com G-CSF, mas preferencialmente também é administrado após o fim do protocolo de administração de G-CSF mencionado acima.

[00084] A combinação de sulfato de dextrano com G-CSF em sinergia aumentou o número de CFC no sangue periférico até 18000 CFC/mL de sangue, ou seja, mais do que 100 vezes que o controle e aparentemente mais eficiente em comparação com plerixafor em combinação com G-CSF. Em alguns pacientes, o tratamento com G-CSF em combinação com plerixafor não mobiliza quantidades suficientes de HSC para um transplante a seguir. Combinação do G-CSF com sulfato de dextrano pode melhorar o rendimento do HSC nesses pacientes refratários e permitir o transplante planejado. O aumento sinérgico do número de CFC no sangue periférico com sulfato de dextrano e G-CSF será vantajoso para os pacientes submetidos a transplante de células-tronco autólogas em que é problemático obter contagens celulares garantidas do paciente para prosseguir com o transplante seguinte.

[00085] Em geral, um número suficiente de HSC deve ser obtido do doador no procedimento de aférese para um transplante bem sucedido subsequente. Na situação clínica, o número de células HSC é medido como a quantidade de células CD34 + no produto de aférese. Este marcador mostrou ser um preditor consistente e forte de enxerto após a quimioterapia. No entanto, a população de células CD34 +é heterogênea e o marcador de CD34 +é apenas um marcador substituto da função de HSC. Em geral < 2,5x106 de células CD34 + por quilo, é insuficiente para um TCTH e transplante de > 20 x 106 de células CD34 +células pode gerar síndrome de enxertia, que é uma toxicidade do transplante de células- tronco que ocorre inesperadamente e é ocasionalmente fatal. Entre esses números há documentação que suporta que quão mais células obtidas, melhor o resultado de transplante, uma vez que a enxertia é mais rápida, tempo de internação é reduzido e, assim, os custos são diminuídos.

[00086] A fim de ter sucesso com transplante de células-tronco hematopoiéticas, ou seja, garantir a enxertia rápida e eficaz para evitar infecções e prevenir a reincidência da doença, mobilização de quantidades suficientes de células-tronco do sangue periférico, portanto, é importante.

[00087] Independentemente de se é um transplante autólogo e alogênico, o principal objetivo é conseguir a enxertia bem sucedida. Falha ao fazer isso resultará em uma situação crítica que pode levar a um paciente sem sistemas hematológicos e imunológicos. A fim de evitar tal situação fatal, é preciso ter certeza de que o transplante contém células suficientes para garantir enxerto bem sucedido. Se a contagem de células é muito baixa, a terapia mieloablativa tem que ser adiada, e tempo valioso é perdido. Também após a terapia mieloablativa, o transplante com maior número de células progenitoras pode levar a enxerto mais rápido, que pode resultar em uma diminuição da necessidade de hospitalização e de cuidados de suporte. Como mencionado, o método padrão de aumento do número de células progenitoras hematopoiéticas no sangue que circula é tratar o doador com G-CSF durante vários dias. Mesmo com o tratamento atual (plerixafor e G-CSF) todos os pacientes não atingem a contagem de células suficiente para justificar o transplante. Além disso, após o transplante, há um risco de infecção e de reincidência da doença.

[00088] Para estes pacientes, sulfato de dextrano tem o potencial de atuar como terapia de resgate ou como uma alternativa ao plerixafor e G-CSF.

[00089] Além de seus efeitos na mobilização, o sulfato de dextrano das modalidades exerce efeitos adicionais que podem ter implicações favoráveis para o resultado do TCTH. Sulfato de dextrano induz níveis plasmáticos imediatos e elevados de fator de crescimento hepatócito (HGF), um hormônio com efeito mitogênico em diferentes tipos de células e isso favorece a enxertia das células transplantadas ( Roos 1995 e Zioncheck 1995). HGF também funciona como um fator sinérgico proliferativo no crescimento de HSC quando combinado com o fator de estímulo de colônia de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) (Kmiecik 1992 e Weimar, 1998), bem como formação de colônia de HSC derivado de sangue de cordão umbilical humano induzida pela GM-CSF, G-CSF ou M- CSF (Goff 1996). HGF também mostrou parcialmente restaurar a hematopoiese em camundongos deficientes em c-kit/SCF, um sistema de sinalização importante para o crescimento e proliferação de células hematopoiéticas primitivas (Yu 1998). HGF na presença da eritropoietina induz a formação de colônias de unidade formadora de explosão eritroide (BFU-E) de células CD34 + (Galimi 1994). Nossos resultados mostram que o sulfato de dextrano induz significativamente mais BFU-E em relação ao plerixafor, que pode ser devido à elevação mais pronunciada no HGF, em comparação com plerixafor.

[00090] Sulfato de dextrano tem, em comparação com o tratamento, o potencial para melhorar a mobilização de células progenitoras e outras células do sangue e o seguinte resultado de transplante de várias maneiras, o que seria um benefício significativo para o paciente. Em geral, sulfato de dextrano mostrou aumentar o rendimento de WBC, linfócitos, HGF e células progenitoras circulantes.

[00091] Uma maior mobilização destas células específicas e fatores de crescimento melhorariam consideravelmente o resultado para o paciente uma vez que melhorariam o resultado de transplante devido a uma melhor e mais rápida enxertia das células transplantadas. Tratamento de sulfato de dextrano pode reduzir o risco de infecções uma vez que o conteúdo de linfócitos e CFU-GEMM parece estar aumentado, o que pode encurtar o tempo de neutropenia. Isto também implica um menor tempo de internação para o paciente. Além disso, a mobilização com sulfato de dextrano pode permitir que mais pacientes recebam TCTH.

[00092] Uma mobilização mais eficiente vai reduzir a necessidade de colheitas repetidas de células do paciente e, portanto, reduzir o risco de efeitos colaterais (principalmente da administração de longo prazo de G-CSF), uma vez que o período de tratamento é encurtado. Sulfato de Dextrano aumenta o rendimento total de linfócitos, o que beneficia o paciente ao atingir a quantidade mínima de HSC mobilizada a fim de garantir a transplantação, bem como aumentar a previsão da colheita de célula.

[00093] Enxertia e orientação de células-tronco tratadas com sulfato de dextrano tem demonstrado ser mais eficiente do que células- tronco não tratadas em camundongos (Hayakawa 2009). Isto sugere que, além de habilitar mais transplantes, sulfato de dextrano tem o potencial de aumentar a taxa de sucesso de TCTH, ao aumentar a previsibilidade da transplantação de HSC, reduzindo complicações pós TCTH, reduzindo a necessidade de colheita de células repetidas, ajudando mais pacientes a atingir a quantidade mínima de células para justificar um TCTH e aumentando o número de pacientes que recebem a enxertia bem sucedida após TCTH.

[00094] É proposto que o mecanismo para a sobrevivência global melhorada seja a enxertia e a reconstituição de linfócitos mais rápidas, resultando em um efeito mais forte da GVT, diminuindo o câncer residual (Porrata 2009). Administração de sulfato de dextrano pelo menos dobra a liberação de linfócitos em terapia única em comparação com a administração única de G-CSF ou plerixafor. Sulfato de dextrano em combinação com G-CSF dobra a liberação de linfócitos em comparação com a combinação de G-CSF e plerixafor.

[00095] Além disso, um aumento de rendimento de linfócitos também será útil no DLI, útil para transplante de enxerto em que repetidas infusões de linfócitos são utilizadas para melhorar o resultado do transplante.

[00096] Além disso, sulfato de dextrano provoca um aumento demais do que de 100 vezes do HGF em comparação com os níveis de base e 25 vezes mais do que plerixafor, indicando uma elevação imediata de HGF (a partir de < 160 a 16000 pg/mL) já após 15 minutos. Estes níveis são altos o suficiente para induzir a proliferação celular.

[00097] A tabela 1 abaixo resume alguns dos efeitos benéficos alcançados com sulfato de dextrano. Tabela 1 - vantagens de tratamento com sulfato de dextrano

[00098] A mobilização de células-tronco e/ou progenitoras e/ou glóbulos brancos alvo, opcionalmente em conjunto com HGF, usando sulfato de dextrano de acordo com as modalidades pode ter usos médicos e clínicos além da colheita das células do sujeito recebendo a administração de sulfato de dextrano. Assim, a mobilização das células no sangue periférico do sujeito pode ser utilizada de acordo com várias aplicações médicas, como mencionado no que segue. Por exemplo, HSC mobilizado em sangue periférico de um ser humano pode ser usado para tratar, prevenir ou pelo menos reduzir os sintomas de uma variedade de doenças autoimunes, incluindo, mas não se limitando a, artrite reumatoide (AR ou RA), lúpus eritematoso sistêmico (SLE ou LES), diabetes tipo 1, esclerose múltipla (EM ou MS), a esclerose lateral amiotrófica (ELA ou ALS), síndrome de Sjogren e doença inflamatória do intestino. Outros usos de células tronco e/ou progenitoras imobilizadas em sangue periférico podem ser para induzir o reparo de tecidos e órgãos, incluindo reparação de coração.

[00099] Também pode ser usada em várias aplicações médicas a mobilização de células brancas do sangue alvo, tais como linfócitos, no sangue periférico de um sujeito. Por exemplo, a elevação do nível de linfócitos no sangue periférico pode ser usada para tratar, prevenir ou pelo menos reduzir os sintomas de uma variedade de cânceres sólidos e hematológicos incluindo, mas não se limitando a leucemia linfocítica crônica (CLL) e câncer de mama.

[000100] Assim, administração de sulfato de dextrano de acordo com as modalidades não tem necessariamente de ser usada a fim de mobilizar as células com a finalidade de colheita das células do sujeito. A administração de sulfato de dextrano, em vez disso, pode ser usada com o objetivo de alcançar um aumento do nível ou da quantidade de células desejadas no sangue periférico do sujeito, em que as células podem exercer uma função desejada no sujeito.

[000101] O sulfato de dextrano, de acordo com as modalidades é um sulfato de dextrano de baixo peso molecular (LMW -DS) tendo um peso molecular médio dentro do intervalo de 3500 e 9500 Da.

[000102] Em uma determinada modalidade, o sulfato de dextrano tem uma massa molecular média em um intervalo de 4500 e 7000 Da. Mais, preferencialmente, o sulfato de dextrano tem uma massa molecular média em um intervalo de 4500 e 5500 Da, tal como um peso molecular médio de 4,6 kDa, 4,7 kDa, 4,8 kDa, 4,9 kDa, 5,0 kDa, 5,1 kDa, 5,2 kDa, 5,3 kDa ou 5,4kDa.

[000103] Um exemplo de sulfato de dextrano que pode ser usado de acordo com as modalidades tem um peso molecular médio de 5139 Da e um índice de polidispersividade (PDI) de 1.2009.

[000104] Em uma determinada modalidade, o sulfato de dextrano tem uma distribuição substancialmente estreita de peso molecular. Em tal modalidade, a maioria das moléculas de sulfato de dextrano tem peso molecular respectivo dentro da faixa preferencial de 3500 e 9500 Da. Em uma modalidade exemplar, menos de 20% das moléculas de sulfato de dextrano têm peso molecular acima de 8000 Da, preferencialmente menos de 15%, tal como menos de 10% ou menos de 5% das moléculas de sulfato de dextrano tem um peso molecular acima de 8000 Da. Além disso, ou, alternativamente, menos de 40% das moléculas de sulfato de dextrano têm um peso molecular inferior a 3000 Da, preferencialmente inferior a 35%, tal como menos de 30% ou menos de 25% das moléculas de sulfato de dextrano tem um peso molecular inferior a 3000 Da.

[000105] Sulfato de dextrano é um derivado polianiônico de dextrano e contém enxofre. O teor médio de enxofre para sulfato de dextrano é, preferencialmente, de 15 a 20% e mais preferencialmente de cerca de 17%, geralmente correspondente a cerca de dois grupos de sulfato por resíduo de glucosil. Em uma modalidade particular, o teor de enxofre do sulfato de dextrano é preferencialmente igual a, ou pelo menos perto do máximo grau possível de teor de enxofre das moléculas de dextrano.

[000106] O sulfato de dextrano de acordo com as modalidades pode ser provido como um derivado farmaceuticamente aceitável de sulfato de dextrano. Tais derivados farmaceuticamente aceitáveis incluem sais e solvatos do sulfato de dextrano, por exemplo, um sal de sódio ou potássio.

[000107] Sulfato de dextrano ou um derivado farmaceuticamente aceitável é preferencialmente administrado por injeção ao sujeito e, em particular por injeção intravenosa (i.v.) injeção subcutânea (s.c.) ou (i. p.) injeção intraperitoneal, preferencialmente, injeção intravenosa (i.v.) ou subcutânea (s.c.). Outras vias de administração parenteral que podem ser usadas incluem a injeção intramuscular e intra-articular. Para essas rotas de administração, o sulfato de dextrano preferencialmente é provido em uma formulação em forma líquida com um solvente ou excipiente selecionado. O solvente é vantajosamente um solvente aquoso e em particular uma solução tampão. Um exemplo não limitante de tal solução tampão é um tampão de ácido cítrico, tal como tampão de ácido cítrico mono-hidratado (CAM), ou um tampão de fosfato. Por exemplo, sulfato de dextrano das modalidades pode ser dissolvido em solução salina, tal como solução salina de NaCl 0,9% e em seguida, opcionalmente, tamponado com 75 mM de CAM e ajustando o pH para cerca de 5,9 usando hidróxido de sódio. Também soluções não tampão são possíveis, incluindo as soluções aquosas de injeção, como soro fisiológico. Além disso, outros sistemas de tampão que não CAM podem ser usados se uma solução tamponada é desejável.

[000108] As modalidades não são limitadas a injeções e outras vias de administração podem ser usadas alternativamente, incluindo por via oral, nasal, bucal, por via retal, dérmica, traqueal, bronquial ou tópica. O composto ativo, o sulfato de dextrano, então é formulado com um excipiente ou veículo adequado que é selecionado com base na rota de administração particular.

[000109] Intervalos de dose adequados para o sulfato de dextrano podem variar de acordo com o tamanho e peso do paciente, a condição a que o paciente está sendo tratado e outras considerações. Em particular para sujeitos humanos, uma gama de dosagem possível pode ser de 1 μg/kg a 150 mg/kg de peso corporal, preferencialmente de 0,1 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal, mais preferencialmente de 0,25 a 50 mg/kg de peso corporal. Exemplos ilustrativos incluem de 0,3 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal e mais preferencialmente de 5 mg/kg a 25 mg/kg de peso corporal, tal como de 5 mg/kg a 20 mg/kg de peso corporal ou de 5 mg/kg a 15mg/kg de peso corporal. Além dessas, pode ser usada uma menor concentração, como 0,5-5 mg/kg de peso corporal.

[000110] O sulfato de dextrano das modalidades pode ser administrado em uma ocasião única de administração, como na forma de uma única injeção em bolo. Esta dose em bolo pode ser injetada no paciente de maneira bastante rápida, porém, e de forma vantajosa, é infundida ao longo do tempo de modo que a solução de sulfato de dextrano é infundida no paciente ao longo de alguns minutos, como, por exemplo, ao longo de 5 a 10 minutos. Tipicamente, espera-se que uma única dose e uma injeção ou infusão (ou, com efeito, qualquer outro tipo de administração) sejam suficientes para obter um efeito terapêutico no paciente de acordo com as modalidades. No entanto, é possível administrar o sulfato de dextrano em múltiplas doses em diferentes ocasiões de administração. Por exemplo, uma única injeção em bolo pode ser complementada por uma infusão prolongada de uma solução de sulfato de dextrano.

[000111] Opcionalmente, o sulfato de dextrano pode ser também administrado em múltiplas ocasiões de administração, como, por exemplo, anteriormente à administração de G-CSF em acréscimo a na data de mobilização celular, ou anterior e juntamente à administração de G-CSF em acréscimo a na data de mobilização celular, ou juntamente à administração de G-CSF em acréscimo a na data de mobilização celular. As dosagens específicas de sulfato de dextrano usados em diferentes ocasiões de administração podem ser diferentes ou idênticas. Por exemplo, uma dose menor de sulfato de dextrano poderia ser usada em ocasiões de administração anteriores a e simultâneas à administração de G-CSF, em comparação à dose utilizada na data de mobilização celular.

EXPERIMENTOS

[000112] Foi desempenhada uma série de experimentos em camundongos no intuito de caracterizar os efeitos do sulfato de dextrano sobre a mobilização e obter conhecimento adicional acerca de dosagens adequadas, tempo de coleta, modo de administração e o efeito comparado ao atual tratamento utilizando plerixafor (AMD3100) em combinação com G- CSF (NEUPOGEN®).

Camundongos

[000113] Camundongos fêmea DBA/2 foram obtidos dos Laboratórios Harlan (Países Baixos) e Laboratórios Charles River (Alemanha). Todos os animais foram mantidos em instalações para animais na Universidade de Uppsala, acomodados segundo condições padrão e fornecidos com água e alimento ad libitum, de acordo com as diretrizes institucionais. Foram utilizados animais com idade de entre 7 a 40 semanas, pesando de 17 a 31 g. Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal local de Upssala, Suécia.

Protocolo de Mobilização

[000114] Forneceu-se G-CSF (NEUPOGEN®, Amgen, Holland) como uma solução aquosa isotônica estéril a 0.3 mg/mL e foi diluído em solução salina normal em concentração de 50 μg/mL. Administrou-se G- CSF em dosagem de 2.5μg como uma única injeção subcutâneos, manhã e noite do Dia -2 e Dia -1. Sulfato de dextrano de diferentes massas moleculares médias foi utilizado: Meito - uma massa molecular média de 6 939 Da provido por Meito Sangyo co Ltd (Tóquio, Japão) e foi dissolvido em tampão de ácido cítrico monoidratado (CAM); pKC - uma massa molecular média de 5 139 Da provido por pK Chemicals A/S (Copenhague, Dinamarca) e foi dissolvido em tampão de CAM ou NaCl a 0,9% (Fresenius Kabi); e TdB - massa molecular média de 3.3 k Da provido por TdB consultancy (Uppsala, Suécia) e foi dissolvido em NaCI a 0.9 % (Fresenius Kabi).

[000115] AMD3100 da Sigma-Aldrich (Alemanha) foi comprado e dissolvido em solução salina normal a uma concentração de 2 mg/mL. Dia 0, foi administrado aos camundongos 100 mg/kg de sulfato de dextrano, intravenoso ou subcutâneo, ou 5 mg/kg de AMD3100 subcutâneo, salvo especificação em contrário. No grupo controle, administrava-se aos animais tampão de CAM ou NaCI a 0.9%, intravenoso ou subcutâneo. Todos os animais receberam aproximadamente 50 a 100 μl de cada solução (2.5-5 mL/kg).

[000116] Meito Sangyo co Ltd, lote N-3188, teve a seguinte distribuição de massa molecular: Mw 0-3000 10.61 % Mw 3000-8000 61.05 % Mw 8000-12000 19.38 % Mw 12000-20000 8.15 % Mw 20000-30000 0.79 % Mw 30000-40000 0.01 % Mp 5664 Da Mn 5240 Da AMw 6939 Da PDI 1.3242 pK Chemicals A/S, lote, 31497, teve a seguinte distribuição de massa molecular: Mw 0-2000 3.75 %Mw 2000-4000 30.62 % Mw 4000-6000 36.64 % MW 6000-8000 19,94% Mw 8000-12000 8.94 % Mw 12000-20000 Mw 20000-30000 Mw 30000-40000 Mp 4690 Da Mn 4279 Da AMw 5139 Da PDI 1.2009 TdB consultancy, lote 20341, teve a seguinte distribuição de massa molecular: Mw 0-2000 19.26 % Mw 2000-4000 52.01 % Mw 4000-6000 26.71 % Mw 6000-8000 2.01 % Mw 8000-12000 Mw 12000-20000 Mw 20000-30000 Mw 30000-40000 Mp 3341 Da Mn 2557 Da AMw 3305 Da PDI 1.2924 MP = massa molecular média de pico MN = massa molecular numérica média AMw = massa molecular ponderal média

Ensaio De Células Formadoras de Colônia

[000117] Sangue periférico foi testado por punção terminal do coração sob isoflurano anestésico usando siringas mergulhadas em EDTA (0.2 M EDTA preparado a partir de uma solução padrão de 0.5 M EDTA (preparada pelo Laboratório Rudbeck) diluída a 1 :2.5 em NaCI 0.9 %).

[000118] Sangue (100-200 μi) foi transferido a tubos de polipropileno contendo heparina (concentração final: 17.5 IE/mL). Eritrócitos foram esgotados usando-se solução de coloreto de amônia (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canadá). As células remanescentes foram suspensa outra vez no Meio de Dulbecco modificado da Iscove com 2 % de soro fetal bovino (StemCell Technologies) e misturado a 2 mL de meio metilcelulósico complementado com um coquetel de citocinas recombinantes (MethoCult 3434; StemCell Technologies) e penicilina- estreptomicina de acordo com a instruções do fabricante. Culturas de 1.1 mL contendo HPCs foram postas à maneira de placas em pratos de 35 mm (Sarstedt, Landskrona, Suécia) e posicionados em uma câmara umidificada com 5 % de CO2 a 37°C. O número total de colônias foi contado no dia 12 da cultura.

Análise Hematológica

[000119] Sangue periférico testado por punção terminal do coração sob isoflurano anestésico usando-se seringas mergulhadas em EDTA e transferido a tubos de polipropileno contendo 1,6 mg de EDTA (Sarstedt, Landskrona, Suécia).

[000120] Hemogramas completos foram obtidos usando-se um analisador hematológico automatizado (Sistemas Hematológicos Advia 2120 Seimens Healthcare Diagnostics Inc, Illinois, EUA) na Universidade Sueca de Ciências da Agricultura (SLU), Upssala, Suécia. HGF-ELISA

[000121] Sangue periférico foi testado por punção terminal do coração sob isoflurano anestésico (salvo especificação em contrário) usando siringas mergulhadas em EDTA (0.2 M EDTA preparado tal como acima descrito).

[000122] Plasma foi preparado mediante centrifugação sangue EDTA por 5 minutos a 3000 g, e congelado a 20°C até a análise. Exame HGF-ELISA (RnD systems, Minneapolis, EUA) foi realizado de acordo com as instruções do fabricante.

Estatísticas

[000123] Dados são expressos como valores médios mais e menos SEM. A comparação entre grupos foi desempenhada usando-se teste t de Student (bicaudal, variância igual). Análises estatísticas foram desempenhadas usando Microsoft Excel. Diferenças em um valor p inferior a 0.05 foram consideradas estatisticamente significativas.

Sulfato de dextrano, estudo de avaliação de dose subcutânea em mobilização de hemácias periféricas

[000124] Camundongos (DBA/2N, 8 a 14 semanas, Charles River) foram tratados com injeções subcutâneas de sulfato de dextrano (10, 50, 150, e 500 mg/kg, pKC), AMD3100 (5 mg/kg, controle positiva ) ou tampão de CAM (controle negativo). A dose usada de AMD3100 e 1 hora para colheita celular foi o regime ideal relatado para esta droga em camundongos (Broxmeyer 2005). Sangue foi analisado usando análise hematológica tal como acima descrita. Mais detalhadamente, os camundongos foram sacrificados 3 horas após a última injeção (1 hora para AMD3100), determinando-se em seguida análise de diferenciação hematológica em sangue periférico. Amostras de soro e/ou plasma foram coletadas e armazenadas a -20°C até a análise. O sangue foi coletado mediante punção no coração por seringas mergulhadas em EDTA e misturado a EDTA e lepirudina para a análise hematológica, e para a análise HGF apenas em EDTA.

[000125] Houve aumento dependente de dosagem de células brancas sanguíneas (WBC) circulantes, sobretudo linfócitos (Fig. 1), e HGF (Fig. 2), 3 horas após a administração de sulfato de dextrano. Doses de 10 a 50 mg/kg de sulfato de dextrano e AMD3100 5 mg/kg apresentarem efeitos similares, ao passo que os efeitos de 150 e 500 mg/kg de sulfato de dextrano mostraram-se significativamente aumentados (p<0.001 e p<0.01, respectivamente) em comparação ao efeito de AMD3100. A administração de sulfato de dextrano a 50, 150 e 500 mg/kg ensejou níveis marcadamente superiores (p<0.001) (Fig. 2) de HGF circulante, os quais mostraram-se mais pronunciados que AMD3100.

[000126] A Tabela 2 resume os parâmetros sanguíneos após a administração de sulfato de dextrano (LMW-DS) e AMD3100, respectivamente. A tabela indica as variáveis hematológicas no sangue periférico após administração de LMW-DS ou AMD3100, em comparação ao controle (CAM, *p< 0.05, **p< 0.01 , ***p< 0.001) ou em comparação ao AMD3100 (tp< 0,05, ttp< 0.01 ,tttp< 0.001). Tabela 2 - Variáveis Hematológicas No Sangue Periférico Após Administração de LMW-DS MCV: volume corpuscular médio hemoglobina corpuscular média MPV: volume de plaquetas médio brancas LUC: leucócitos Unidades: Eritrócitos 1012células/L, demais células 109células/L, MCV (fl), MCHC (g/L), HCT (g/L)

Sulfato de Dextrano, estudo de descoberta de dose i.v. em mobilização hematológica periférica

[000127] A mobilização foi desempenhada em camundongos BA/2OlaHsd (7 a 12 semanas, Harlan) usando 25-200 mg/kg de sulfato de dextrano (Meito) intravenosamente. Como controles positivo e negativo foram usados AMD3100 (5 mg/kg, s.c.) ou tampão de CAM (intravenoso). Sangue foi analisado usando exame CFC e análise hematológica tal como descrito acima.

[000128] Em comparação ao AMD3100 (5 mg/kg) e ao controle de tampão de CAM, injeções intravenosas únicas de sulfato de dextrano (25, 50, 100, e 200 mg/kg, Meito) induziram notável aumento de WBC (p<0.01), sobretudo de linfócitos (p<0.001), em sangue periférico tão rapidamente quanto 30 minutos após a injeção de sulfato de dextrano (Fig. 3). Os níveis de mobilização alcançados com as quatro doses de sulfato de dextrano mostraram-se significativamente aumentados versus AMD3100.

[000129] O efeito de mobilização de sulfato de dextrano sobre CFC foi igualmente significativamente, tal como evidente já na menor dose administrada (25 mg/kg, p<0.001). O efeito pareceu aumentar de maneira dependente da dosagem. O efeito, após 200 mg/kg de sulfato de dextrano, mostrou-se semelhante ao do AMD3100, 5 mg/kg, no que se refere ao CFC total (Figuras 4A e 4B).

[000130] O aumento de CFC após administrações de dose única de AMD3100 (subcutânea) e sulfato de dextrano (intravenoso) foi superior (6 a 12 vezes o controle) em comparação ao aumento geral das WBC (3 a 5 vezes o controle). Isto pode sugerir um mecanismo específico de ação na mobilização de células progenitoras (Figuras 4A e 4B).

[000131] O efeito de mobilização sobre os diferentes subtipos de células progenitoras, CFU-GM, CFU-GEMM e BFU-E, foi igualmente estudado (Figuras. 4A e 4B) e o sulfato de dextrano pareceu aumentar BFU-E mais que AMD3100.

Sulfato de dextrano, efeito de via de administração na mobilização de hemácias periféricas

[000132] Realizou-se mobilização em camundongos DBA/2N (9 a 10 meses, Charles River) usando 100 mg/kg de sulfato de dextrano (Meito, intravenoso e subcutâneo). Sangue foi analisado usando-se exame CFC e análise hematológica segundo acima descrito.

[000133] O efeito sobre hemácias periféricas após administração de 100 mg/kg de sulfato de dextrano, intravenoso ou subcutâneo, foi comparado (n = 5). As células foram colhidas 30 minutos após a administração para ambas as vias de administração. Não houve diferença significativa nas WBC circulantes, linfócitos, subtipos CFC ou CFC 30 minutes após a administração para as diferentes vias de administração, ver Tabela 3. Tabela 3 - comparação de parâmetros sanguíneos para administração subcutânea e intravenosa

Sulfato de dextrano, relações tempo-efeito sobre a mobilização de hemácias periféricas

[000134] Realizou-se mobilização em camundongos DBA/2N (8 a 14 semanas, Charles River) usando 50 mg/kg de sulfato de dextrano (pKC, intravenoso) ou 100 mg/kg de sulfato de dextrano (Meito, intravenoso). Tampão de CAM foi usado como controle negativo (intravenoso). Sangue foi analisado usando-se exame CFC, análise hematológica e HGF-ELISA.

[000135] O efeito de mobilização do sulfato de dextrano administrado intravenosamente (100 mg/kg) apresentou os maiores números de WBC e linfócitos em torno de 30 minutos depois; diminuíram, mas permaneceram ainda elevados, 3 horas após administração. Foi possível ver um aumento muito rápido de CFC com pico principiando já 7.5 minutos após administração (Fig. 5). Os diferentes subtipos de células progenitoras tiveram picos a momentos ligeiramente diferentes: BFU-E a 7.5 minutos e CFU-GM/CFU-GEMM entre15 e 30 minutos após a administração. HGF aumento ao nível mais alto após 15 minutos (15960 pg/mL) e posteriormente diminuiu. No entanto, HGF foi medida em outro experimento e não testado a 7.5 minutos (ver Tabela 4). AMD3100 aumento níveis de HGF a 650±230 pg/mL uma hora após a administração. Tabela 4 - Mobilização Celular Após Administração Intravenosa de Sulfato de Dextrano (LMW-DS) Table 4 - cell mobilization following dextran sulfate (LMW-DS) i.v. administration

[000136] Portanto, a administração intravenosa de sulfato de dextrano (100 mg/kg) a camundongos elevou rapidamente o número de WBC e, especificamente, linfócitos (Linfa) no sangue periférico em comparação ao controle (CAM). O sulfato de dextrano não afetou o número de plaquetas (PLT). O sulfato de dextrano elevou também a quantidade de HGH no plasma. Os resultados são relatados na Tabela 4 como Média ± SEM, n.a. = não analisados. As estatísticas apresentadas em comparação ao tampão de CAM, *p<0.05, **p<0.01 , e ***p<0.001.

Sulfato de dextrano em combinação com G-CSF na mobilização de hemácias periféricas

[000137] Tratamento padrão de pacientes anterior a aférese baseia-se em injeções diárias de G-CSF por um período de até uma semana. Clinicamente, sulfato de dextrano pode ser usado em combinação com G-CSF. Em um estudo em camundongos, 2,5 μg/animal de G-CSF foi administrado duas vezes ao dia (a intervalos de 8 horas) por 2 dias (Broxmeyer 1999). Para investigar o efeito da combinação de G-CSF e sulfato de dextrano, camundongos DBA/2OlaHsd (10 a 15 semanas, Harlan) foram tratados com G-CSF durante 2 dias (NEUPOGEN ®, 2x2.5 pg/dia, subcutâneo) e no dia 3, ou injetados com sulfato de dextrano (5, 25, 100 mg/kg, Meito, intravenoso), CAM (controle negativo, intravenoso) ou AMD3100 (controle positivo, 5 mg/kg, subcutâneo). O sangue foi analisado usando-se exame CFC e análise hematológica.

[000138] O G-CSF elevou o número das WBC em comparação ao normal (ver Figuras 1 e 3 para a administração exclusiva de CAM) e a adição de sulfato de dextrano (25 e 100 mg/kg) elevou as WBC e o número de linfócitos de modo sinergístico. O aumento das WBC e linfócitos mostrou-se significativamente mais pronunciado do que após a administração de AMD3100 (5 mg/kg) (Fig. 6).

[000139] O acréscimo de sulfato de dextrano em uma dose de 100 mg/kg de G-CSF resulta em vasto e sinergístico aumento de células progenitores no sangue periférico, e o sulfato de dextrano pareceu mais eficiente como agente de mobilização que AMD3100 (Figuras 7A e 7B). A combinação de sulfato de dextrano e G-CSF mobilizou mais progenitoras CFU-GEMM e BFU-E (Fig. 7B) em comparação à combinação de G-CSF e AMD3100.

[000140] Os experimentos conduzidos apresentaram relação dose-efeito de sulfato de dextrano sobre a mobilização das WBC, linfócitos e CFC, tanto depois da administração subcutânea quanto da administração intravenosa. O aumento de CFC pareceu ser superior (6 a 12 vezes o controle) em comparação ao aumento geral das WBC (4 a 5 vezes o controle). O efeito temporal de sulfato de dextrano administrado de maneira intravenosa (100 mg/kg) foi um rápido aumento em CFC, WBC e linfócitos. O pico principiou já após 7.5 minutos, significativamente mais cedo que para AMD3100. A combinação de sulfato de dextrano com G-CSF apresentou aaumento inesperado e pronunciado de CFC no sangue periférico de até 18000 CFC (mais de 100 vezes o controle), e ao que parece, mais eficiente em comparação ao AMD3100 em combinação com G-CSF, ver Figura 8. A administração de sulfato de dextrano resultou em uma mobilização significativamente mais elevada de WBC e linfócitos, e pareceu também mobilizar mais BFU-E em mono-terapia versus uma dose ideal de AMD3100. A administração de sulfato de dextrano em combinação com G-CSF resultou em uma mobilização significativamente mais alta de WBC e linfócitos, e pareceu também mobilizar mais CFC, BFU-E, e CFU- GEMM versus AMD3100, ver Figuras 7A, 7B, 8 e 9. O sulfato de dextrano aumentou a HGF no plasma a níveis elevados (de < 160 a 16000 pg/mL) 15 minutos após a administração, 25 vezes mais do que AMD3100 depois de 1 hora.

Comparação na mobilização de células hematopoiéticas por sulfato de dextrano de baixa massa molecular de diferentes médias de massa molecular Animais

[000141] Camundongos DBA/2Ola fêmea (Harlan, Holanda) foram mantidas na instalação para animais da Universidade de Uppsala, acomodados segundo condições padrão e fornecidos com água e alimento ad libitum. Foram utilizados animais pesando de 17 a 22 g.

Concepção Experimental

[000142] Fêmeas DBA/2 foram agrupadas em quatro grupos: 1) veículo (NaCl aquoso) (n = 8), 2) 50 mg/kg de sulfato de dextrano DS3 (n = 5), 3) 50 mg/kg de sulfato de dextrano DS5 (n = 5) e 4) 50 mg/kg de sulfato de dextrano DS5 PNB (n = 5). Grupo 4) foi sedado com pentobarbital de sódio (PNB) em vez isoflurano, de modo a avaliar se uma alteração no protocolo anestésico afetaria a mobilização.

Administração da substância

[000143] DS5 (média de Mw 5.1 kDa, pKC Dinamarca, lote 31497) e DS3 (média de Mw 3.3 kDa, TdB Consultancy, Uppsala Suécia, lote 20341) foram dissolvidos em NaCI a 0.9 % (Fresenius Kabi), a 20 mg/mL e filtrados por um filtro de 20 μmde modo a obter-se uma solução estéril. Os animais receberam 2,5 mL/kg (app. 50 μL) por via intravenosa na veia de cauda.

Análise Hematológica

[000144] Os resultados são apresentados na Fig. 10 e na Tabela 6. DS3 não apresentou nenhuma alteração significativa nos linfócitos ou WBC tomadas em sua totalidade, ao passo que foi relatada uma leve diminuição em neutrófilos. Tabela 6 - variáveis hematológicas em sangue periférico após administração de substâncias com sulfato de dextrano MCV=volume corpuscular médio; MCHC= concentração de hemoglobina corpuscular média Variáveis hematológicas comparadas ao veículo (NaCI): *p < 0,05, **p < 0.01. ***p < 0.001

[000145] DS3 não induziu um aumento significativo no número de CFC, tal como representado na Fig. 11. DS5 induziu um aumento significativo em HGF independentemente do uso de anestesia, ao passo que a substância de massa molecular menor (DS3) não apresentou nenhum aumento significativo em HGF, ver Figura 12. Os dados apresentados neste documento mostra que DS3 é um agente de mobilização ineficaz em comparação a DS5. DS3 não aumenta HGF a nenhum grau além do veículo.

[000146] As modalidades descritas acima devem ser entendidas como alguns exemplos ilustrativos da presente invenção. Será compreendido por indivíduos versados na técnica que diversas modificações, combinações e alterações podem ser impostas às modalidades sem que se incorra em afastamento do escopo da presente invenção. Especificamente, soluções de diferentes partes em diferentes modalidades podem ser combinadas em outras configurações, onde for tecnicamente possível. REFERÊNCIAS Broxmeyer et al. (1999) "Dominant myelopoietic effector functions mediated by chemokine receptor CCR1" J Exp Med 189(12): 1987-92 Broxmeyer et al. (2005) "Rapid mobilization of murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with AMD3100, a CXCR4 antagonist" J Exp Med 201 (8): 1307-18 Chemaly et al. (2006) "Respiratory viral Infections in adults with hematologic malignancies and human stem cell transplantation recipients" Medicine 85(5): 278-287 CHMP Assessment Report Mozobil (plerixafor) Procedure No. EMEA/H/C/001030, 2009 Cooper et al. (1997) "Erythroid burst-forming units (BU-E) predict hematopietic recovery after peripheral blood progenitor cell transplantation in patients with advanced breast cancer" Bone Marrow Transplantation 19: 1089-94 Copelan (2006) "Hematopoietic Stem-cell Transplantation" N Engl J Med 354: 1813-26 Galimi et al. (1994) "Hepatocyte growth factor induces proliferation and differentiation of multipotent and erythroid hematopoietic progenitors" J Cell Biol 127(6 Pt 1): 1743-54 Goff et al. (1996) "Synergistic effects of hepatocyte growth factor on human cord blood CD34+ progenitor cells are the result of c-met receptor expression" Stem Cells 14(5): 592-602 Han et al. (1998) "Effect of combination of DS and G-CSF on mobilization of peripheral hematopoietic progenitors in mice" Journal of Experimental Hematology 6: 29-31 Hassan et al. (1997) "Factors influencing hematological recovery after allogeneic bone marrow transplantation in leukaemia patients treated with methotrexate-containing GVHD prophylaxis" Support Care Cancer 5: 299306 Hayakawa et al. (2009) "Dextran sulfate and stromal cell derived factor-1 promote CXCR4 expression and improve bone marrow homing efficiency of infused hematopoietic stem cells" J Nippon Med Sch 76(4): 198 Hiwase et al. (2008) "Higher infused lymphocyte dose predicts higher lymphocyte recovery, which in turn, predicts superior overall survival following autologous hematopoietic stem cell transplantation for multiple myeloma" Biol Blood & Marrow Transpl 14: 116-24 Kalatskaya et al. (2009) "AMD3100 is a CXCR7 ligand with allosteric agonist properties" Mol Pharmacol 75(5): 1240-7 Kmiecik et al. (1992) "Hepatocyte growth factor is a synergistic factor for the growth of hematopoietic progenitor cells" Blood 80(10): 2454-7 Lapidot et al. (2003) "Current understanding of factors influencing stem cell mobilization" Hematology (Am Soc Hematol Educ Program), 41937 Mozobil™ Product Monograph, moZoBil™ (plerixafor injection), genzyme Pablos et al. (2003) "Synoviocyte-derived CXCL12 is displayed on endothelium and induces angiogenesis in rheumatoid arthritis" J Immunol 170: 2147-52 Porrata et al. (2004a) "Infused peripheral blood autograft absolute lymphocyte count correlates with day 15 absolute lymphocyte count and clinical outcome after autologous peripheral hematopoietic stem cell transplantation in non-Hodgkin's lymphoma" Bone Marrow Transpl 33: 291-8 Porrata et al. (2004b) "The dose of infused lymphocytes in the autograft directly correlates with clinical outcome after autologous peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation in multiple myeloma" Leukemia 18: 1085-92 Porrata (2009) "Clinical Evidence of Autologous Graft versus Tumor Effect" Am J Immunol 5(1): 1-7 Roodman et al. (1987) "CFU-GEMM correlate with neutrophil and platelet recovery in patients receiving autologous marrow transplantation after high-dose melphalan chemotherapy" Bone Marrow Transpl 2: 195-73 Roos et al. (1995) "Induction of liver growth in normal mice by infusion of hepatocyte growth factor/scatter factor" Am J Physiol 268(2 Pt 1): 380-6 Sweeney et al. (2000) "Mobilization of stem/progenitor cells by sulfated polysaccharides does not require selectin presence" PNAS 97(12): 6544-49 Sweeney et al. (2002) "Sulfated polysaccharides increase plasma levels of SDF-1 in monkeys and mice: involvement in mobilization of stem/progenitor cells" Blood 99(1): 44-51 Weimar et al. (1998) "Hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) is produced by human bone marrow stromal cells and promotes proliferation, adhesion and survival of human hematopoietic progenitor cells (CD34+)" Exp Hematol 26(9): 885-94 Yu et al. (1998) "Stimulatory effects of hepatocyte growth factor on hemopoiesis of SCF/c-kit system-deficient mice" Stem cells 16(1): 66-77 Zioncheck et al. (1995) "Sulfated oligosaccharides promote hepatocyte growth factor association and govern its mitogenic activity" J Biol Chem 270(28): 16871-8.

Claims (5)

1. Composição de mobilização de células caracterizada pelo fato de que compreende sulfato de dextrano com um peso molecular médio numa faixa de 4500 e 7000 Da, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um fator de estimulação de colônias de granulócitos, G-CSF.

2. Composição de mobilização de células, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende, adicionalmente, um solvente aquoso.

3. Composição de mobilização de células, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de ser para uso como um medicamento.

4. Composição de mobilização de células, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de ser para uso na mobilização de células progenitoras e/ou células tronco para dentro do sangue periférico de um indivíduo.

5. Composição de mobilização de células, para uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que as referidas células progenitoras e/ou tronco são capazes de restaurar hematopoiese normal após quimioterapia ou radioterapia quando infundidas em um indivíduo sofrendo de uma doença cancerosa selecionada a partir do grupo consistindo em leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide crônica (CML), síndromes mielodisplásicas (MDS), distúrbios mieloproliferativos (MPD), Linfoma não-Hodgkin (NHL), doença de Hodgkin (HD), leucemia linfocítica crônica (CLL), mieloma múltiplo (MM), mieloide crônico juvenil, neuroblastoma, câncer de ovário, tumores de células germinativas, leucemia de células pilosas (HCL) e leucemia promielocítica aguda (APL).